JP2008298642A - 電気泳動装置および電気泳動方法 - Google Patents

Abstract

【課題】泳動槽内に導電体を備えている電気泳動装置において、泳動速度の低下を抑制する。
【解決手段】電気泳動装置１００は、分離部１０３上に導電体（ストライプ電極１０６）が設けられており、該導電体上に被分離物質を含んでいる第１媒体１２０が載置される。電極１０４および１０５は、ストライプ電極１０６が備える個々の導電体のうち、隣接する導電体間の電位差が０．３Ｖ以下となるように電圧を印加する。
【選択図】図１

Description

本発明は電気泳動装置および方法に関するものであり、特に、媒体中の被分離物質を分離する電気泳動装置および方法に関するものである。

ライフサイエンスの分野において、電気泳動技術は非常に有用な分離および分析技術の一つである。生体高分子であるタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の分離に用いられる他、細胞等を分離することも可能である。これまで、ゲルを用いた代表的な電気泳動法の他にも、ポリマーを含む緩衝液を用いたキャピラリー電気泳動法、自由溶液中で泳動を行うフリーフロー電気泳動法等が実施されている。

特許文献１には、電気泳動技術を改良するための技術として、泳動槽内にワイヤ状の導電物を設けて、泳動電界のむらによる泳動パターンの乱れを解消することが記載されている。また、特許文献２には、泳動槽内に中間電極を設けて、泳動槽内部の電界および電位の分布を能動的に制御することが記載されている。
実開平５−４００４号公報（平成５年１月２２日公開） 実開平５−４００３号公報（平成５年１月２２日公開）

しかしながら、本発明者らが検討した結果、特許文献１および２に記載されているような、泳動槽内に導電体を備えている電気泳動装置を用いた電気泳動方法では、泳動速度が遅くなるという問題があることを見出した。

本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、泳動槽内に導電体を備えている電気泳動装置において、泳動速度の低下を抑制することを目的とする。

本発明者らは、鋭意検討の結果、泳動速度の低下の原因は、泳動槽内の導電体において発生した気泡が、ゲルを該導電体から剥離させて、該ゲルと該導電体との間に緩衝液が侵入することにより緩衝作用が阻害されるという、従来全く知られていなかった現象が原因であることを見出した。

そして、本発明者らはさらに検討を重ね、泳動槽内の隣接する導電体間の電位差が一定値以下であれば気泡が生じないことを見出し、発明を完成させた。

すなわち、本発明に係る電気泳動装置は、複数の導電体に接して配置された媒体中の被分離物質を分離する電気泳動装置であって、該媒体に電圧を印加する電圧印加手段を備えており、該電圧印加手段は、隣接する該導電体間の電位差が、０Ｖよりも大きくかつ０．３Ｖ以下となるように、該電圧を印加することを特徴としている。

上記の構成によれば、電圧印加手段は、隣接する上記導電体間の電位差が、０Ｖよりも大きくかつ０．３Ｖ以下となるように電圧を印加する。隣接する該導電体間の電位差が０．３Ｖ以下であれば、後述する実施例に示すように、気泡が発生しない。そのため、上記の構成によれば、気泡の発生に起因する泳動速度の低下を抑制することができる。

上記電気泳動装置では、上記電圧印加手段は、上記各導電体に上記電圧を印加してもよい。

上記の構成によれば、上記電圧印加手段が、上記各導電体に電位を直接与えるので、隣接する該導電体間の電位差を、０Ｖよりも大きくかつ０．３Ｖ以下となるように容易に設定することができる。

上記電気泳動装置では、上記複数の導電体が、２５０個以上であることが好ましい。

上記の構成によれば、電気泳動に通常用いられる範囲のゲルに対する印加電圧（５０〜５００Ｖ）でも、隣接する導電体間の電位差を０．３Ｖ以下に容易にすることができる。

上記電気泳動装置では、上記導電体が、線状の導電体であることが好ましい。

上記の構成によれば、幅が狭い線状の導電体を用いるので、多くの導電体を並べることができ、隣接する導電体間の電位差を０．３Ｖ以下に容易にすることができる。

上記電気泳動装置では、上記線状の導電体が、上記電圧印加手段が上記媒体に電圧を印加する方向に直行して互いに平行に配置されていることが好ましい。

上記の構成によれば、上記線状の導電体は、上記電圧印加手段が上記媒体に電圧を印加する方向に直行して互いに平行に配置されている。そのため、上記導電体は、第１方向へ向かう電位勾配にほとんど影響を及ぼさない。したがって、上記媒体に含まれる被分離物質を好適に分離することができる。

上記電気泳動装置では、上記線状の導電体の幅が、１００μｍ以下であることが好ましい。

上記の構成によれば、上記線状の導電体の幅が狭いので、小規模な装置であっても、数多くの導電体を配置し得、隣接する導電体間の電位差を０．３Ｖ以下に容易にすることができる。

上記電気泳動装置では、上記線状の導電体同士の間隔が、１００μｍ以下であることが好ましい。

上記の構成によれば、上記線状の導電体同士の間隔が狭いので、小規模な装置であっても、数多くの導電体を配置し得、隣接する導電体間の電位差を０．３Ｖ以下に容易にすることができる。

上記電気泳動装置では、上記導電体が、白金、亜鉛、および銅からなる群から選ばれる金属からなることが好ましい。

上記の構成によれば、上記導電体が劣化し難いので、本発明に係る電気泳動方法を繰り返し行い得る。

上記電気泳動装置は、等電点電気泳動装置であってもよい。

上記構成によれば、等電点電気泳動装置において、媒体内に均一なｐＨの勾配を形成することができる。

本発明に係る電気泳動方法は、複数の導電体に接して配置された媒体中の被分離物質を分離する電気泳動方法であって、隣接する該導電体間の電位差が、０Ｖよりも大きくかつ０．３Ｖ以下となるように、該媒体に電圧を印加する工程を包含することを特徴としている。

上記の構成によれば、電圧印加工程では、隣接する上記導電体間の電位差が、０Ｖよりも大きくかつ０．３Ｖ以下となるように電圧が印加される。隣接する該導電体間の電位差が０．３Ｖ以下であれば、後述する実施例に示すように、気泡が発生しない。そのため、上記の構成によれば、気泡の発生に起因する泳動速度の低下を抑制することができる。

本発明によれば、泳動槽内の導電体における電気泳動中の気泡の発生を抑制し、泳動速度の低下を抑制することができる。

本発明に係る電気泳動装置の一実施形態について、図１に基づいて説明する。

本実施形態に係る電気泳動装置１００は、緩衝液槽１０１および１０２、分離部１０３、電極１０４および１０５（電圧印加手段）、ストライプ電極１０６（導電体）、ならびに蓋部材１０７を備えている。緩衝液槽１０１および１０２には、電極１０４および１０５がそれぞれ配置され、緩衝液で充填されている。また、分離部１０３は、緩衝液槽１０１および１０２に挟まれて存在する。分離部１０３上にはストライプ電極１０６が設けられており、分離部１０３のストライプ電極１０６上に媒体１２０が載置される。

上記緩衝液としては、一般に電気泳動に用いられる組成の緩衝液を用いればよい。また、媒体１２０は、例えば、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル等、一般に電気泳動に用いられるゲルからなり、被分離物質を含んでいる。被分離物質は、電気泳動および転写によって分離または分析すべき物質であればよく、生物材料（例えば、生物個体、体液、細胞株、組織培養物、または組織断片）からの調製物を好適に用いることができる。

電極１０４および電極１０５は、ストライプ導電体１０６の各導電体間の電位差が０．３Ｖ以下となるように媒体１２０に電圧を印加する。これにより気泡の発生を防ぐことができる。電極１０４および電極１０５が印加する電圧は、具体的には、ストライプ電極１０６が備える導電体の本数から定められ、次の式（１）に従う。なお、必ず０Ｖを超える電圧を印加するものとする。

印加電圧（Ｖ） ≦ （導電体の本数 − １） × ０．３（Ｖ）・・・（１）
一つの局面において、本実施形態に係る電気泳動装置１００は、ストライプ導電体１１３のそれぞれ導電体の電位を制御する図示しない電位制御手段（電圧印加手段）を有している。上記電位制御手段は、例えば、電源と、導電経路とを備えており、電源から上記各導電体へ、それぞれ異なる抵抗値を有する経路または従電源等を介して導電接続されていることにより、各導電体へ異なる電位を与える。なお、必ずしもすべての上記導電体の電位を制御する必要はなく、いくつかの導電体（以後、これらを中間電極と呼ぶ）の電位だけを制御してもよい。この場合、中間電極に挟まれたその他の導電体は、中間電極同士が形成する電位勾配に従って電位を有することになる。いずれの場合であっても、隣接する上記導電体間の電位差が、０．３Ｖ以下になるように電位が与えられていればよく、これにより気泡の発生を防ぐことができる。

なお、上記電位制御手段を用いれば、上記の効果を有するほかにも電気泳動を好適に実施することができる。例えば、媒体１２０内の被分離物質のうち、分離され難い高分子量の物質の分離の幅が大きくなるように、低電位領域の電位の勾配を大きく、移動が早い低分子量の物質が媒体１２０から離脱しないように、高電位領域の電位の勾配を小さくすることにより、含まれる物質の分子量に大きな幅がある被分離物質を好適に分離することができる。すなわち、電気泳動では、低電位側から高電位側へと物質が泳動されるが、高分子量の物質は低電位側に留まり、低分子量の物質は高電位側まで移動する傾向にある。ここで、上記のように、低電位領域の電位の勾配を大きく、高電位領域の電位の勾配を小さくすれば、高分子量の物質の分離度を大きくし、かつ、低分子量の物質の移動を抑えることができる。

他の実施形態において、本発明に係る電気泳動装置は等電点電気泳動装置である。本実施形態に係る等電点電気泳動装置２００の斜視図を図２に、上面図を図３に、側面図を図４に示す。等電点電気泳動装置２００は、分離槽２０１、電極２０２および２０３（電圧印加手段）、ストライプ電極２０４および２０５、ならびに蓋部材２０６を備えている。媒体２２０は、分離槽２０１内に、ストライプ電極２０４および２０５に挟まれて保持される。

媒体２２０は、ｐＨ勾配を形成するためのアンフォライトを含んでいることが好ましい。電極２０２および電極２０３が媒体２２０に電圧を印加したとき、ストライプ電極２０４および２０５における個々の導電体は、それぞれ一つの電位を有し、電極からの距離が等しいストライプ電極２０４の導電体と、ストライプ電極２０５の導電体とも同一の電位を有する。そのため、両ストライプ電極の個々の導電体が存在する近傍では電位が均一となっており、これに従って、媒体２２０内のアンフォライトも移動し、ｐＨの勾配が均一となる。

このとき、電極２０２および電極２０３は、ストライプ導電体２１３および２１４の各導電体間の電位差を０．３Ｖ以下となるように電圧を印加するので、気泡の発生を防ぐことができる。

さらに他の実施形態において、本発明に係る電気泳動装置３００はストライプ電極３０１および３０２を用いて媒体３２０に電圧を印加する。図５は、本実施形態に係る電気泳動装置３００の動作の説明図である。図５に示すように、電気泳動装置３００では、ストライプ電極３０１および３０２の対応する隣り合う導電体間にのみ電圧を印加し、電圧を印加する導電体を順次ずらすことによって電気泳動を行う。

導電体へ電圧印加は、隣り合う導電体毎に電圧印加する以外にも、導電体ピッチが細かい場合などには、複数本間の導電体に対して所定の間隔を隔てて数Ｖ〜１０Ｖ程度の電圧を印加し、順次ずらすようにしてもよい。例えば、１０Ｖを印加する場合は、３４本間以上の間隔を設定することで、実質的に隣り合う導電体間の電位差が０．３Ｖ以下となるように印加することできる。

このとき、隣り合う導電体間の電位差を０．３Ｖとすることにより気泡の発生を防ぐことができる。なお、本実施形態においては、限られた電極にのみ電位を与えるので、気泡の発生によって生じる問題は、他の実施形態に比べれば少ない。ただし、０．３Ｖ以下とすることが好ましいのはいうまでも無い。

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されない。

〔実施例１：ストライプ電極の作製〕
６ｃｍ×５ｃｍで厚み３ｍｍのガラス板上にスパッタ装置を用いＣｒのバインダーを成膜した後、約２０００ÅのＰｔを成膜した。次に、１００μｍ幅のブレードをセットしたダイシングソー（Ｄｉｓｃｏ）を用いてＰｔ電極幅および電極間が約１００μｍおよび約１００μｍとなるように作製した。また、レーザーパワーが７％、加工スピードが６％、３０００Ｈｚの切断条件にてＣＯ_２レーザー彫刻機を用いてＰｔ線幅１００μｍおよびＰｔ線間が１００μｍのストライプ電極基板とＰｔ線幅５０μｍおよびＰｔ線間が５０μｍのストライプ電極基板を作製することができた（図６）。また、このときの条件ではガラス面はほとんどレーザーによる加工を受けていなかった。

〔実施例２：基板の比較検討〕
６ｃｍ×５ｃｍのゲル板（ガラス板）を１ｍｍのスペーサーを挟んで組み立て、ゲル作製容器に設置した。一方のゲル板としてはガラス基板を用い、もう一方のゲル板として、Ｐｔ線幅１００μｍおよびＰｔ線間幅が１００μｍのストライプ電極基板、基板全面がＰｔで成膜された基板を用いた場合、またはガラス基板（陽性対照）を用いた。

次に、調整した分離ゲル溶液（１３％アクリルアミドミックス（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝２９．２：０．８）、３７８ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．０５％ＡＰＳ、０．１％ＴＥＭＥＤ）を先端から７ｍｍのところまで添加後に、水を重層した。分離ゲル溶液が重合した後、水を除去し、調整した濃縮ゲル溶液（４％アクリルアミドミックス（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝２９．２：０．８）、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．０５％ＡＰＳ、０．２％ＴＥＭＥＤ）を添加した後、サンプルコームをセットした。また、陰極の電気泳動バッファー組成は２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシンおよび０．１％ＳＤＳ、陽極の電気泳動バッファー組成は１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）を用いた。サンプルは溶解した等量の０．５％のアガロースゲルと混合してサンプルウェルに滴下して凝固後にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離するサンプルとして、可視染色されたＳｅｅＢｌｕｅ ｐｌｕｓ２ Ｍ．Ｗ．Ｍａｒｋｅｒ（インビトロジェン社）と蛍光標識されたＤｙＬｉｇｈｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｒｋｅｒｓ（ＰＩＥＲＣＥ）を使用した。

２０ｍＡ定電流で４５分間電圧印加した結果、一方のゲル板をストライプ電極基板にした場合でも明瞭なタンパク質バンドが検出された（図７）。一方、基板全面がＰｔで成膜された基板ではタンパク質がまったく移動せず、電圧を印加できないことが確認できた（図８）。また、移動度はストライプ電極基板を用いた場合の方が遅くなった。

さらに、ストライプ電極基板ではＳＤＳ−ＰＡＧＥ中にストライプ電極基板上に気体が発生した。この気体の発生によりゲルがストライプ電極基板から剥離してバッファーが侵入し、バッファー力が奪われた結果、タンパク質の移動度が遅くなったと推察された。また、この気泡はタンパク質の分離度には大きな影響はないが、続く転写ではストライプ電極上の均一な電圧印加を妨げるために、気泡の発生を抑制する方法の検討を行った。

〔実施例３：気泡の発生を抑制する方法の検討〕
気泡の発生は、ストライプ電極の各電極（線）間で生じる電位差により、各電極上で水の電気分解が起こっていると推測された。そこで、各電極間で生じる電位差を水の分解電圧である１Ｖ以下にすることによって気泡の発生を防ぐことができると予測した。

そこで、Ｐｔ線幅１００μｍおよびＰｔ線間が１００μｍのストライプ電極基板を用いて印加電圧を変化させた場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中の気泡の発生を検討した。検討した電圧とそのときの各電極間の電圧の計算値を表１に示す。各電極間の電圧はゲルへの印加電圧とストライプ本数の商である。

その結果、各電極間の電圧が０．４Ｖ以上（ゲル印加電圧は１００Ｖ以下）の時には気泡が発生するのに対して０．３Ｖ以下（ゲル印加電圧は７５Ｖ以下）の時に気泡が発生しないことが明らかになった。さらに、Ｐｔ線幅５０μｍおよびＰｔ線間が５０μｍのストライプ電極基板を用いた場合にはゲル印加電圧を１５０Ｖ（各電極間の電圧は０．３Ｖ）にした場合でも気泡が発生しなかった。以上から、気泡の発生を抑制し得る条件は各電極間の電圧が０．３Ｖ以下であることが明確になった。

また、水の分解電圧は電極の材料やバッファー内の成分などに影響される。Ｐｔよりもより過電圧の低い亜鉛や銅を用いることにより各電極間の印加電圧を増加することができると推測される。

〔実施例４：市販装置による実施〕
ミニゲルサイズのゲル板（１０ｃｍ×８．２ｃｍで厚さ３ｍｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に対して実施例１の記載と同様の手順によりストライプ電極を作製した。ストライプの本数は１０ｃｍの基板内にＬ／Ｓ＝８０μｍ／１２０μｍとなるように５００本作製した。このとき、ストライプ電極間の電位差は０．２Ｖである。両方ともストライプ電極基板、片方がストライプ電極基板、両方がガラス基板にしてゲルを重合してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはミニプロティアン３セル（日本バイオ・ラッド・ラボラトリー株式会社）装置を用いて標準方法のように行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは１００Ｖで１時間行った。この条件でストライプ電極基板上に気泡が発生することはなかった。片方または両方のゲル板がストライプ電極基板の場合でもシャープなバンドが得られ、移動速度も低下しなかった。

本発明は、改良された電気泳動技術を提供するので、生体材料の分離および分析を行う分野において利用可能である。

本発明の一実施形態に係る電気泳動装置の構造を示す模式図である。 本発明の一実施形態に係る等電点電気泳動装置の構造を示す斜視図である。 本発明の一実施形態に係る等電点電気泳動装置の構造を示す平面図である。 本発明の一実施形態に係る等電点電気泳動装置の構造を示す側面図である。 本発明の一実施形態に係る電気泳動方法の説明図である。 本発明の一実施形態に係る複数の導電体の写真である。 本発明の一実施形態に係る電気泳動方法の結果を示す写真である。 本発明の一実施形態に係る電気泳動方法の結果を示すグラフである。

符号の説明

１００ 電気泳動装置
１０１、１０２ 緩衝液槽
１０３ 分離部
１０４、１０５ 電極（電圧印加手段）
１０６ ストライプ電極（導電体）
１２０ 媒体
２００ 等電点電気泳動装置
２０１ 分離槽
２０２、２０３ 電極（電圧印加手段）
２０４、２０５ ストライプ電極（導電体）
２０６ 蓋部材
２２０ 媒体

Claims (10)

1. 複数の導電体に接して配置された媒体中の被分離物質を分離する電気泳動装置であって、
   該媒体に電圧を印加する電圧印加手段を備えており、
   該電圧印加手段は、隣接する該導電体間の電位差が、０Ｖよりも大きくかつ０．３Ｖ以下となるように、該電圧を印加することを特徴とする電気泳動装置。
2. 上記電圧印加手段は、上記各導電体に上記電圧を印加することを特徴とする請求項１に記載の電気泳動装置。
3. 上記複数の導電体が、２５０個以上であることを特徴とする請求項１または２に記載の電気泳動装置。
4. 上記導電体が、線状の導電体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の電気泳動装置。
5. 上記線状の導電体が、上記電圧印加手段が上記媒体に電圧を印加する方向に直行して互いに平行に配置されていることを特徴とする請求項４に記載の電気泳動装置。
6. 上記線状の導電体の幅が、１００μｍ以下であることを特徴とする請求項４または５に記載の電気泳動方法。
7. 隣接する上記線状の導電体同士の間隔が、１００μｍ以下であることを特徴とする請求項４〜６のいずれか１項に記載の電気泳動方法。
8. 上記導電体が、白金、亜鉛、および銅からなる群から選ばれる金属からなることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の電気泳動方法。
9. 等電点電気泳動装置であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の電気泳動装置。
10. 複数の導電体に接して配置された媒体中の被分離物質を分離する電気泳動方法であって、
    隣接する該導電体間の電位差が、０Ｖよりも大きくかつ０．３Ｖ以下となるように、該媒体に電圧を印加する工程を包含することを特徴とする電気泳動方法。