JP2008297384A

JP2008297384A - グルカンの機能化方法

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Publication number: JP2008297384A
Application number: JP2007143054A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Takaba; 鷹羽武史; Yoshinobu Terada; 寺田喜信; Yoshiyo Hosoya; 細谷佳代
Original assignee: Ezaki Glico Co Ltd
Current assignee: Ezaki Glico Co Ltd
Priority date: 2007-05-30
Filing date: 2007-05-30
Publication date: 2008-12-11

Abstract

【課題】共有結合による置換基導入を伴わない、多糖の機能化方法、機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカン、およびその製造方法の提供。
【解決手段】少なくとも重合度５０以上のα−１，４−Ｄ−グルカンのへリックス構造内部に、脂肪族炭化水素鎖を有する化合物の脂肪族炭化水素鎖を包接させ、包接化合物を形成させることにより、機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカンを得る。機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカンは、本来のα−１，４−Ｄ−グルカンにはない機能や性質を有する。
【選択図】図１

Description

本発明は、機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカン、及び機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカンの製造方法に関する。

多糖は生分解性に優れ、生態や環境への親和性にも優れる、環境調和型高分子材料として、近年さまざまな産業分野への利用が検討され始めている。これら多糖の中で、最も安価かつ、多量に入手できる多糖は、澱粉とセルロースである。澱粉とセルロースはともにグルコースを構成糖とする中性多糖であり、化学的な修飾を行わない未修飾の状態でも、非常に広範囲な産業分野で利用されている。

しかし、澱粉やセルロースが有している水酸基を、完全に、もしくは部分的に化学修飾し、置換其を導入することにより、物理化学的性質を改変したり、新たな機能を付与することが可能となり、さらに応用範囲を広げることが可能である。このように、多糖の性質を改変したり、新たな機能を付与する方法として、化学修飾が広く利用されている（非特許文献１参照）。

しかしながら、共有結合で導入された置換基は容易に分解されないため、多糖本来が有している環境や生体内での優れた分解性や安全性を損なう可能性がある。また、その使用に当たっては、化学修飾により生じているかの知れない新たな毒性リスクを回避するため、動物を利用した安全性試験を実施しなくてはならない。このように化学修飾による多糖の機能改変にはメリットとともにデメリットが存在していた。
谷原正夫ら, アミロースの酵素合成と医療用途への応用、BioInd., 2005, Vol. 22, No.8, p. 58-66

本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、共有結合による置換基導入を伴わない、多糖の機能化方法、および機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカンを提供すること、およびその製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、少なくとも重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンのへリックス構造内部に、脂肪族炭化水素鎖を有する化合物の脂肪族炭化水素鎖を包接させ、包接化合物を形成させることにより、機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカンを得ることができることを見出し、本発明を完成させた。

さらに本発明の機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカンでは、本来のα−１，４−Ｄ−グルカンにはない機能や性質を付与することができることを確認した。

上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する：
（項目１）
（A）少なくとも重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンに（B）脂肪族炭化水素鎖を有する化合物、が非共有結合により結合し、かつ(A)と（B）の結合定数が、５０００Ｍ^-1
以上であることを特徴とする、機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカン。
（項目２）
脂肪族炭化水素鎖を有する化合物が、脂肪族炭化水素鎖およびカチオン基を有する化合物であり、機能化が擬似カチオン化である、請求項１に記載の機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカン。
（項目３）
脂肪族炭化水素鎖を有する化合物が、脂肪族炭化水素鎖およびアニオン基を有する化合物であり、機能化が擬似アニオン化である、請求項１に記載の機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカン。
（項目４）
脂肪族炭化水素鎖を有する化合物が、脂肪族炭化水素鎖、アニオン基及びカチオン基を有する化合物であり、機能化が擬似イオン化である、請求項１に記載の機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカン。
（項目５）
脂肪族炭化水素鎖を有する化合物が、脂肪族炭化水素鎖および第二の疎水基を有する化合物であり、機能化が疎水化である、請求項１に記載の機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカン。
（項目６）
脂肪族炭化水素鎖を有する化合物が、脂肪族炭化水素鎖および第二の疎水基を有する化合物を有する高分子化合物であり、機能化が擬似架橋化である、請求項１に記載の機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカン。
（項目７）
脂肪族炭化水素鎖を有する化合物が、脂肪族炭化水素鎖を有する高分子化合物であり、機能化が擬似高分子グラフト化である、請求項１に記載の機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカン。
（項目８）
脂肪族炭化水素鎖を有する化合物が、脂肪族炭化水素鎖に低分子リガンドが結合した化合物であり、機能化が擬似低分子リガンド化である、請求項１に記載の機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカン。
（項目９）
脂肪族炭化水素鎖を有する化合物が、脂肪族炭化水素鎖を有する担体であり、機能化が擬似担体固定化である、請求項１に記載の機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカン。
（項目１０）
機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカンの製造方法であって、該方法は、少なくとも重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンと脂肪族炭化水素鎖を有する化合物を混合する工程；
重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンと脂肪族炭化水素鎖を有する化合物の包接化合物を形成させる工程；
を包含する、方法。
（項目１１）
機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカンの製造方法であって、該方法は、少なくとも重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンと脂肪族炭化水素鎖を有する化合物を混合する工程；
重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンと脂肪族炭化水素鎖を有する化合物の包接化合物を形成させる工程；
重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンと脂肪族炭化水素鎖を有する化合物の包接化合物を回収する工程；
を包含する、方法。
（項目１２）
機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカンの製造方法であって、該方法は、少なくとも重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンの酵素合成反応液に脂肪族炭化水素鎖を有する化合物を混合する工程；
重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンと脂肪族炭化水素鎖を有する化合物の包接化合物を形成させる工程；
を包含する、方法。
（項目１３）
機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカンの製造方法であって、該方法は、少なくとも重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンの酵素合成反応液に脂肪族炭化水素鎖を有する化合物を混合する工程；
重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンと脂肪族炭化水素鎖を有する化合物の包接化合物を形成させる工程；
重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンと脂肪族炭化水素鎖を有する化合物の包接化合物を回収する工程；
を包含する、方法。

本発明によりα−１，４−Ｄ−グルカンの機能化方法、および機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカンが提供される。本発明により提供される、機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカンは、脂肪族炭化水素鎖を有する化合物を、非共有結合によりα−１，４−Ｄ−グルカンに結合させることにより提供される。非共有結合であるため、α−１，４−Ｄ−グルカンの本来持つ性質を失うことなく、新たな機能を付加することが可能である。

また必要に応じて脂肪族炭化水素鎖を有する化合物を乖離し、当該機能を排除することも可能である。本発明は、化学修飾により多糖の機能を改変するという従来技術とは、思想の異なる、新たな概念に基づくものである。本発明の機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカンは、食品、医薬品、化粧品、化学、日用品、農薬など、α−１，４−Ｄ−グルカンを利用可能な広範囲な産業に分野で利用可能である。

以下、本発明を詳細に説明する。
（１．少なくとも重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカン）
本発明において、少なくとも重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンとは、少なくとも５０のグルコースがα−１，４−グルコシド結合を介して連続して結合しているα−１，４−Ｄ−グルカン、もしくは少なくとも５０のグルコースがα−１，４−グルコシド結合を介して連続して結合しているα−１，４−Ｄ−グルカンが少なくともひとつ結合している物質をいう。具体的には、少なくとも重合度５０以上のリニアなα−１，４−Ｄ−グルカン、少なくとも重合度５０以上の環状α−１，４−Ｄ−グルカン、少なくとも重合度５０以上のリニアなα−１，４−Ｄ−グルカンが少なくとも一つ結合している物質が含有される。

（２．脂肪族炭化水素鎖を有する化合物）
本発明において、脂肪族炭化水素鎖とはアルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、炭素環基および置換された炭素環基などが挙げられるが、これらに限定されない。

（３．結合定数）
本発明において結合定数は、少なくとも重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンと脂肪族炭化水素鎖を有する化合物の、水溶媒中、摂氏30度における結合定数をいう。このような結合定数を正しく算出可能な方法により求めることができるが、好ましくは等温滴定型熱量計により、よりこのましくは、MICROCAL社製の等温滴定型熱量計（VP-ITC）により求めることができる。

（４．少なくとも重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンの酵素合成反応液）
本発明における少なくとも重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンの酵素合成反応液は、少なくとも重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンが酵素反応により生成される反応が進行するよう、酵素、基質、プライマー物質などその他成分が溶解している液体をいう。具体的には、このような酵素合成反応液の例としては、グルカンホスホリラーゼ（ＧＰ）、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）、スクロース、プライマーを含有する反応液（ＳＰ-ＧＰ法反応液という）、グルカンホスホリラーゼ（ＧＰ）、グルコース−１−リン酸、プライマーを含有する反応液（ＧＰ法反応液）、グルカンホスホリラーゼ（ＧＰ）、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ（ＣＰ）、β−１，４−グルカン、プライマーを含有する反応液（ＣＰ-ＧＰ法反応液）が好適に用いられる。なお、ここでいう、プライマーとは、グルカンホスホリラーゼのグルカン合成反応におけるグルコシル基転移反応の受容体になりうる物質をいい、具体的にはマルトオリゴ糖、デキストリン、澱粉、グリコーゲン、及びそれらの化学修飾物をいう。特にマルトオリゴ糖、デキストリン、澱粉、グリコーゲンの還元末端アルデヒドに他の物質が結合しているものも好適に用いられる。

（実施例１）（擬似カチオン化α−１，４−Ｄ−グルカンの調製）
重量平均分子量１１８，０００、数平均分子量１１０，０００のSP-GP法により酵素合成されたα−１，４−Ｄ−グルカン（酵素合成アミロース）を、１０％（W/V）となるようにDMSOに溶解し、ここに終濃度が１０ｍMとなるように、ドデシルアミンを溶解した。酵素合成アミロースとドデシルアミンを含む溶解液に、9倍の量の蒸留水を加え、ドデシルアミンを非共有結合により結合させた、擬似カチオン化酵素合成アミロース溶解液を得た。

（実施例２）（擬似アニオン化α−１，４−Ｄ−グルカンの調製）
重量平均分子量１１８，０００、数平均分子量１１０，０００のSP-GP法により酵素合成されたα−１，４−Ｄ−グルカン（酵素合成アミロース）を、１０％（W/V）となるようにDMSOに溶解し、ここに終濃度が１０ｍMとなるように、ラウリン酸を溶解した。酵素合成アミロースとラウリン酸を含む溶解液に、9倍の量の蒸留水を加え、ラウリン酸を非共有結合により結合させた、擬似アニオン化酵素合成アミロース溶解液を得た。

（実施例３）
実施例１の擬似カチオン化酵素合成アミロース溶解液と、実施例２の擬似アニオン化酵素合成アミロース溶解液を、等量混合すると、粘度が著しく増加しゲルを形成した。比較として行った、擬似カチオン化していない酵素合成アミロースと擬似アニオン化していない酵素合成アミロースを用いた同様の実験では、このようなゲル化は認められなかった。

（実施例４）
各種重合度の酵素合成アミロースと炭素数１２の直鎖アルキル基と硫酸基を有するゲスト物質の結合定数を、等温滴定型熱量計（ITC）を用いた熱力学的手法により求めた。
重合度の異なる酵素合成アミロースの水溶液（0.2
mg / ml）をMicloCal社製 ITC（機種名：VP-ITC）の試料セル（容量1.4 ml）に満たし、310 RPMで回転しているシリンジから、SDS水溶液（1.44 mg / ml）を一定間隔で滴下し、生じた熱量変化を繰り返し測定した。グルカンを含まない場合の熱量変化も同様に測定し、希釈熱のデータとした。グルカン水溶液の熱滴定データから希釈熱のデータを差し引いた後、専用解析ソフト（ITC Data Analysis In Origin）を用いて、１サイト結合モデル（同等でそれぞれが独立した結合サイトをn個有するホスト分子に、ゲスト分子がn個結合すると仮定した結合モデル）で解析した。重合度の異なる酵素合成アミロースとSDSの結合定数（K）及び熱力学的パラメータ（ΔHおよび-TΔS）を求めた結果を表１に示す。
（表１）

結合定数は酵素合成アミロースの分子量が大きくなるとともに上昇した。重合度が５０以下の酵素合成アミロース（Mw：４，７００、５，２３０）の場合、結合定数は５，０００M^-1以下の低い値を示したが、重合度が５０以上となる酵素合成アミロース（Mw：８，１００、１１，９００）の場合、結
合定数は５，０００M^-1以上の高い値を示した。

本発明の機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカンは、食品、医薬品、化粧品、化学、日用品、農薬など、α−１，４−Ｄ−グルカンを利用可能な広範囲な産業に分野で利用可能である。

図１は、本発明の機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカンのイメージ図である。上図はα−１，４−Ｄ−グルカン、下図は本発明の機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカンを示す。実線の曲線は、α−１，４−Ｄ−グルカンを、下図中の白抜き丸と太い直線の物質は、脂肪族炭化水素鎖を有する化合物を示す。太い直線部分が脂肪族炭化水素鎖部分に対応し、この部分はα−１，４−Ｄ−グルカンのへリックス内部に包接される。白抜き丸で示される脂肪族炭化水素鎖以外の部分はα−１，４−Ｄ−グルカンのへリックス外部に露出し、α−１，４−Ｄ−グルカンに種々の機能を付与する。

Claims

（A）少なくとも重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンに（B）脂肪族炭化水素鎖を有する化合物、が非共有結合により結合し、かつ(A)と（B）の結合定数が、５０００Ｍ^-1
以上であることを特徴とする、機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカン。
脂肪族炭化水素鎖を有する化合物が、脂肪族炭化水素鎖およびカチオン基を有する化合物であり、機能化が擬似カチオン化である、請求項１に記載の機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカン。
脂肪族炭化水素鎖を有する化合物が、脂肪族炭化水素鎖およびアニオン基を有する化合物であり、機能化が擬似アニオン化である、請求項１に記載の機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカン。
脂肪族炭化水素鎖を有する化合物が、脂肪族炭化水素鎖、アニオン基及びカチオン基を有する化合物であり、機能化が擬似イオン化である、請求項１に記載の機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカン。
脂肪族炭化水素鎖を有する化合物が、脂肪族炭化水素鎖および第二の疎水基を有する化合物であり、機能化が疎水化である、請求項１に記載の機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカン。
脂肪族炭化水素鎖を有する化合物が、脂肪族炭化水素鎖および第二の疎水基を有する化合物を有する高分子化合物であり、機能化が擬似架橋化である、請求項１に記載の機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカン。
脂肪族炭化水素鎖を有する化合物が、脂肪族炭化水素鎖を有する高分子化合物であり、機能化が擬似高分子グラフト化である、請求項１に記載の機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカン。
脂肪族炭化水素鎖を有する化合物が、脂肪族炭化水素鎖に低分子リガンドが結合した化合物であり、機能化が擬似低分子リガンド化である、請求項１に記載の機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカン。
脂肪族炭化水素鎖を有する化合物が、脂肪族炭化水素鎖を有する担体であり、機能化が擬似担体固定化である、請求項１に記載の機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカン。
機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカンの製造方法であって、該方法は、少なくとも重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンと脂肪族炭化水素鎖を有する化合物を混合する工程；
重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンと脂肪族炭化水素鎖を有する化合物の包接化合物を形成させる工程；
を包含する、方法。
機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカンの製造方法であって、該方法は、少なくとも重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンと脂肪族炭化水素鎖を有する化合物を混合する工程；
重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンと脂肪族炭化水素鎖を有する化合物の包接化合物を形成させる工程；
重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンと脂肪族炭化水素鎖を有する化合物の包接化合物を回収する工程；
を包含する、方法。
機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカンの製造方法であって、該方法は、少なくとも重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンの酵素合成反応液に脂肪族炭化水素鎖を有する化合物を混合する工程；
重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンと脂肪族炭化水素鎖を有する化合物の包接化合物を形成させる工程；
を包含する、方法。
機能化されたα−１，４−Ｄ−グルカンの製造方法であって、該方法は、少なくとも重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンの酵素合成反応液に脂肪族炭化水素鎖を有する化合物を混合する工程；
重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンと脂肪族炭化水素鎖を有する化合物の包接化合物を形成させる工程；
重合度50以上のα−１，４−Ｄ−グルカンと脂肪族炭化水素鎖を有する化合物の包接化合物を回収する工程；
を包含する、方法。