JP2008295326A - Nanoparticle-labeled probe, method for forming thereof, and method for detecting nucleic acid - Google Patents
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Description
本発明は核酸を検出するためのナノ粒子標識プローブ及びその形成方法に関する。また本発明は当該ナノ粒子標識プローブを用いた核酸検出方法に関する。 The present invention relates to a nanoparticle-labeled probe for detecting a nucleic acid and a method for forming the same. The present invention also relates to a nucleic acid detection method using the nanoparticle-labeled probe.
遺伝子検査では検出に特異性を持たせるために、標的核酸に選択的にハイブリダイズすることが可能なプローブを用いるのが一般的である。プローブを用いた検出には様々な手法が存在し、蛍光分子を利用するもの、酵素を利用するもの、ナノ粒子を利用するもの、電気信号を検出するものなど、多種多様に及ぶ。その中でも、ナノ粒子を利用するものは、高い光学特性を有するため、検出が容易という利点がある。このようなナノ粒子を利用した核酸の検出は液相法（例えば特許文献１参照）及び固相法（例えば特許文献２参照）で行われている。 In genetic testing, a probe that can selectively hybridize to a target nucleic acid is generally used in order to provide specificity for detection. There are various methods for detection using a probe, such as those using fluorescent molecules, those using enzymes, those using nanoparticles, and those detecting electric signals. Among them, those using nanoparticles have an advantage of easy detection because they have high optical properties. Nucleic acid detection using such nanoparticles is performed by a liquid phase method (for example, see Patent Document 1) and a solid phase method (for example, Patent Document 2).
しかしながら、ナノ粒子はサイズが１〜１００ｎｍとプローブに対して巨大であるため、固相法に適用したときに反応効率が低くなるという欠点があり、プローブにナノ粒子を直接標識したものを用いた検出は、溶液中でハイブリダイズが行われていた（特許文献１参照）。そして固相法に用いる場合は、核酸を固定化した後、ナノ粒子以外の標識がされたプローブを用いて一旦ハイブリダイズさせ、続いて、標識をナノ粒子で再度標識するという３段階のステップを取っていた（特許文献２及び図１参照）。しかし、このような複数のステップを経て検出する方法では、検出に時間と手間がかかるという問題があった。
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、遺伝子検査等において、より簡単で短時間に核酸検出を可能とするナノ粒子標識プローブ及びその形成方法を提供することである。また、当該ナノ粒子標識プローブを用いた核酸検出方法を提供することである。 The present invention has been made in view of the above problems, and its solution is to provide a nanoparticle-labeled probe and a method for forming the same that enable nucleic acid detection in genetic testing and the like in a simpler and shorter time. is there. Moreover, it is providing the nucleic acid detection method using the said nanoparticle labeled probe.
本発明に係る上記課題は下記の手段により解決される。 The above-mentioned problem according to the present invention is solved by the following means.
１．核酸を認識し、ハイブリダイズすることが可能なプローブの一端に抗原抗体反応又はアビジン・ビオチン相互作用を介してナノ粒子を結合させたことを特徴とするナノ粒子標識プローブ。 1. A nanoparticle-labeled probe, wherein a nanoparticle is bound to one end of a probe capable of recognizing and hybridizing a nucleic acid through an antigen-antibody reaction or an avidin-biotin interaction.
２．前記ナノ粒子が金コロイド粒子であることを特徴とする前記１に記載のナノ粒子標識プローブ。 2. 2. The nanoparticle-labeled probe according to 1 above, wherein the nanoparticle is a colloidal gold particle.
３．前記１又は２に記載のナノ粒子標識プローブの形成方法であって、核酸を認識し、ハイブリダイズすることが可能なプローブに、抗原抗体反応又はアビジン・ビオチン相互作用を介してナノ粒子を結合させるステップ１と、前記ナノ粒子と結合しなかったプローブを除去するステップ２と、を有することを特徴とするナノ粒子標識プローブの形成方法。 3. 3. The method for forming a nanoparticle-labeled probe according to 1 or 2, wherein a nanoparticle is bound to a probe capable of recognizing and hybridizing a nucleic acid through an antigen-antibody reaction or an avidin-biotin interaction. A method for forming a nanoparticle-labeled probe, comprising: Step 1; and Step 2 of removing a probe that has not bound to the nanoparticle.
４．核酸を基盤に固定化するステップ１と、前記基盤に固定化されなかった核酸を除去するステップ２と、前記３に記載のナノ粒子標識プローブの形成方法で形成したナノ粒子標識プローブを加えて前記基盤に固定化した核酸にナノ粒子標識プローブをハイブリダイズさせるステップ３と、前記基盤に固定化した核酸にハイブリダイズしなかったナノ粒子標識プローブを除去するステップ４と、前記基盤に固定化した核酸にハイブリダイズしたナノ粒子標識プローブのナノ粒子が有する光学特性を検出することにより前記基盤に固定化した核酸を検出するステップ５と、を有することを特徴とする核酸検出方法。 4). A step 1 of immobilizing a nucleic acid on a substrate, a step 2 of removing nucleic acid not immobilized on the substrate, a nanoparticle labeled probe formed by the method for forming a nanoparticle labeled probe according to 3 above, Step 3 for hybridizing a nanoparticle-labeled probe to a nucleic acid immobilized on a substrate, Step 4 for removing a nanoparticle-labeled probe that has not hybridized to the nucleic acid immobilized on the substrate, and a nucleic acid immobilized on the substrate And detecting the nucleic acid immobilized on the substrate by detecting the optical properties of the nanoparticles of the nanoparticle-labeled probe hybridized to (5).
５．前記ナノ粒子標識プローブの分散液が、標識前と比べて、ナノ粒子の濃度換算で、３〜５倍に濃縮されていることを特徴とする前記４に記載の核酸検出方法。 5. 5. The nucleic acid detection method according to 4 above, wherein the dispersion of the nanoparticle-labeled probe is concentrated 3 to 5 times in terms of nanoparticle concentration compared to before the labeling.
６．前記ナノ粒子が有する光学特性が吸光度であることを特徴とする前記４又は５に記載の核酸検出方法。 6). 6. The method for detecting a nucleic acid according to 4 or 5, wherein the optical property of the nanoparticles is absorbance.
本発明の上記手段により、遺伝子検査等において、より簡単で短時間に核酸検出を可能とするナノ粒子標識プローブ及びその形成方法を提供することができる。また、当該ナノ粒子標識プローブを用いた核酸検出方法を提供することができる。 By the above means of the present invention, it is possible to provide a nanoparticle-labeled probe and a method for forming the same that enable nucleic acid detection in genetic testing and the like in a simpler and shorter time. In addition, a nucleic acid detection method using the nanoparticle-labeled probe can be provided.
すなわち、本発明においては、ナノ粒子を予めプローブに反応させておくことで、従来よりも反応ステップが削減できる。これによって従来よりも検出時間の短縮が可能となる。また、従来のナノ粒子に直接プローブを結合させる方法と異なり、抗原・抗体又はアビジン・ビオチンを間に設けることによって、ナノ粒子−プローブ間の距離が広がり、固相法で反応効率が落ちるのを抑えることができるとともに、ナノ粒子−プローブ間の相互作用でナノ粒子やプローブの反応性が低下することを防ぐことができる。 That is, in the present invention, the reaction steps can be reduced as compared with the prior art by allowing the nanoparticles to react with the probe in advance. As a result, the detection time can be shortened as compared with the prior art. Also, unlike the conventional method in which the probe is directly bonded to the nanoparticle, by providing the antigen / antibody or avidin / biotin between them, the distance between the nanoparticle and the probe is increased, and the reaction efficiency is lowered by the solid phase method. While being able to suppress, it can prevent that the reactivity of a nanoparticle or a probe falls by the interaction between a nanoparticle and a probe.
さらに、プローブをナノ粒子で標識する工程を最適な条件で予め行うことによって、反応効率が向上し、検出感度が向上する。加えて、ナノ粒子は遠心分離機によって容易に沈降させることが可能であるため、プローブと反応後、任意の濃度に濃縮することができ、濃度によって検出感度を調整することが可能となる。 Furthermore, the reaction efficiency is improved and the detection sensitivity is improved by previously performing the step of labeling the probe with nanoparticles under optimum conditions. In addition, since the nanoparticles can be easily precipitated by a centrifuge, the nanoparticles can be concentrated to an arbitrary concentration after the reaction with the probe, and the detection sensitivity can be adjusted depending on the concentration.
本発明のナノ粒子標識プローブは、核酸を認識し、ハイブリダイズすることが可能なプローブの一端に抗原抗体反応又はアビジン・ビオチン相互作用を介してナノ粒子を結合させたことを特徴とする。この特徴は、請求項１〜６に係る発明に共通する技術的特徴である。 The nanoparticle-labeled probe of the present invention is characterized in that nanoparticles are bound to one end of a probe capable of recognizing and hybridizing with a nucleic acid through an antigen-antibody reaction or an avidin / biotin interaction. This feature is a technical feature common to the inventions according to claims 1 to 6.
なお、本願において、「ナノ粒子」とは、１〜１００ｎｍの直径を持つ微粒子をいう。 In the present application, “nanoparticles” refer to fine particles having a diameter of 1 to 100 nm.
また、「ハイブリダイズする」とは、一本鎖核酸同士が、相補性をもつ塩基対間の水素結合により二本鎖核酸を形成することをいう。 “Hybridize” means that single-stranded nucleic acids form double-stranded nucleic acids by hydrogen bonding between complementary base pairs.
以下、本発明とその構成要素等について詳細な説明をする。 Hereinafter, the present invention and its components will be described in detail.
（ナノ粒子標識プローブ）
本発明のナノ粒子標識プローブは、核酸を認識し、ハイブリダイズすることが可能なプローブの一端に抗原抗体反応又はアビジン・ビオチン相互作用を介してナノ粒子を結合させたことを特徴とする。
(Nanoparticle labeled probe)
The nanoparticle-labeled probe of the present invention is characterized in that nanoparticles are bound to one end of a probe capable of recognizing and hybridizing with a nucleic acid through an antigen-antibody reaction or an avidin / biotin interaction.
本発明に係る「ナノ粒子」とは、上述のように、本願では、１〜１００ｎｍの直径を持つ微粒子をいう。本発明においては、種々のナノ粒子を用いることが可能であるが、例えば金属ナノ粒子（Ａｕ，Ａｇ，Ｃｕ，Ｐｔ）、半導体ナノ粒子（例えばＣｄＳ，ＣｄＳｅ，ＺｎＳ，ＺｎＳｅ）などが挙げられる。 As described above, the “nanoparticle” according to the present invention means a fine particle having a diameter of 1 to 100 nm in the present application. In the present invention, various nanoparticles can be used, and examples include metal nanoparticles (Au, Ag, Cu, Pt), semiconductor nanoparticles (for example, CdS, CdSe, ZnS, ZnSe).
本発明では、金属ナノ粒子、特に金コロイド粒子を用いることが好ましい。金コロイド粒子の直径は１〜１００ｎｍであることを要するが、１０〜８０ｎｍの範囲にあることが好ましい。更には、当該直径を１０〜４０ｎｍであること、特に、おおよそ２０ｎｍとすることが、検出感度、保存安定性等の観点から好ましい。 In the present invention, it is preferable to use metal nanoparticles, particularly gold colloid particles. The diameter of the colloidal gold particles needs to be 1 to 100 nm, but is preferably in the range of 10 to 80 nm. Furthermore, it is preferable that the diameter is 10 to 40 nm, particularly about 20 nm, from the viewpoint of detection sensitivity, storage stability, and the like.
なお、本発明において使用される金コロイド粒子は、種々の方法で調整することができるが、塩化金酸とクエン酸３ナトリウムを一定の比率、例えば、０．１ｍｇ／ｍｌの塩化金酸水溶液１００ｍｌに対して１％クエン酸ナトリウムを１．１ｍｌを混合することにより、極めて容易かつ安価に調製される（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，２５，１１８７−１２００（１９７７），Ｇｏｏｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．ｍａｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，１２３，２０１−２１３（１９８１），Ｄｅ Ｗａｅｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３１，３７６−３８１（１９８３），Ｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３０，６９１−６９６（１９８２））。 The colloidal gold particles used in the present invention can be prepared by various methods, but chloroauric acid and trisodium citrate are mixed at a certain ratio, for example, 100 ml of 0.1 mg / ml chloroauric acid aqueous solution. Can be prepared very easily and inexpensively by mixing 1.1 ml of 1% sodium citrate (Geoghegan et al, J. Histochem. Cytochem., 25, 1187-1200 (1977), Goodmann et al. , J. macroscopic, 123, 201-213 (1981), De Waele et al, J. Histochem. Cytochem., 31, 376-381 (1983), Roth et al., J. Histochem. Cytochem., 30, 691. − 96 (1982)).
本発明に係る「ハイブリダイズすることが可能なプローブ」とは、被検物質中の核酸を認識しハイブリダイズさせ得る相補的配列を有する核酸プローブをいう。ここで核酸とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡのことを指す。 The “probe capable of hybridizing” according to the present invention refers to a nucleic acid probe having a complementary sequence capable of recognizing and hybridizing a nucleic acid in a test substance. Here, the nucleic acid refers to DNA, RNA, PNA, and LNA.
なお、本発明では、当該プローブの一端に抗原抗体反応又はアビジン・ビオチン相互作用を介してナノ粒子を結合させたことを特徴とする。 The present invention is characterized in that nanoparticles are bound to one end of the probe via an antigen-antibody reaction or an avidin / biotin interaction.
なお、前記抗原及び前記抗体としては、例えばＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）と抗ＦＩＴＣの組み合わせを用いることができる。 As the antigen and the antibody, for example, a combination of FITC (fluorescein isothiocyanate) and anti-FITC can be used.
（ナノ粒子標識プローブの形成方法）
本発明のナノ粒子標識プローブの形成方法は、核酸を認識し、ハイブリダイズすることが可能なプローブに、抗原抗体反応又はアビジン・ビオチン相互作用を介してナノ粒子を結合させるステップ１と、前記ナノ粒子と結合しなかったプローブを除去するステップ２と、を有することを特徴とする。
(Method of forming nanoparticle-labeled probe)
The method for forming a nanoparticle-labeled probe of the present invention comprises a step 1 of binding a nanoparticle to a probe capable of recognizing and hybridizing a nucleic acid via an antigen-antibody reaction or an avidin / biotin interaction, And step 2 for removing the probe that has not bound to the particles.
ナノ粒子を結合するステップ１では、抗原または抗体で標識されたプローブと、プローブの標識に対応する抗体または抗原で標識されたナノ粒子を混合し、抗原抗体反応に適した温度条件で反応が十分進行する時間反応させれば良い。 In step 1 for binding nanoparticles, a probe labeled with an antigen or an antibody is mixed with an antibody or an antigen-labeled nanoparticle corresponding to the label of the probe, and the reaction is sufficiently performed under temperature conditions suitable for the antigen-antibody reaction. What is necessary is just to make it react for the time to advance.
又は、ビオチン若しくはビオチン親和性タンパク質（たとえばアビジン）で標識されたプローブと、プローブの標識と結合が可能なビオチン親和性タンパク質（たとえばアビジン）又はビオチンで標識されたナノ粒子を混合し、アビジン・ビオチン相互作用に適した温度条件で反応が十分進行する時間反応させれば良い。 Alternatively, a probe labeled with biotin or a biotin-affinity protein (for example, avidin) and a biotin-affinity protein (for example, avidin) capable of binding to the probe label or a nanoparticle labeled with biotin are mixed, and avidin-biotin What is necessary is just to make it react for the time which reaction advances sufficiently on the temperature conditions suitable for interaction.
ステップ２では、ステップ１においてナノ粒子と結合しなかった未反応のプローブを除去する。ナノ粒子が遠心分離によって容易に沈降することを利用して、未反応のプローブを溶液とともに分離する方法を用いることができる。この際、遠心分離による沈降を利用することで、プローブ・ナノ粒子の反応物濃度を任意に調整することができる。 In step 2, unreacted probes that did not bind to the nanoparticles in step 1 are removed. A method of separating unreacted probes together with a solution can be used by utilizing the fact that nanoparticles easily settle by centrifugation. At this time, the concentration of the reaction product of the probe nanoparticle can be arbitrarily adjusted by utilizing sedimentation by centrifugation.
なお、前記抗原および前記抗体には、種々の抗原抗体を用いることが可能であり、例えばＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）と抗ＦＩＴＣの組み合わせを用いることができる。 Various antigens and antibodies can be used as the antigen and the antibody. For example, a combination of FITC (fluorescein isothiocyanate) and anti-FITC can be used.
（ナノ粒子標識プローブを用いた核酸検出法）
本発明に係る核酸検出方法は、核酸を基盤に固定化するステップ１と、前記基盤に固定化されなかった核酸を除去するステップ２と、上記のナノ粒子標識プローブの形成方法で形成したナノ粒子標識プローブを加えて前記基盤に固定化した核酸にナノ粒子標識プローブをハイブリダイズさせるステップ３と、前記基盤に固定化した核酸にハイブリダイズしなかったナノ粒子標識プローブを除去するステップ４と、前記基盤に固定化した核酸にハイブリダイズしたナノ粒子標識プローブのナノ粒子が有する光学特性を検出することにより前記基盤に固定化した核酸を検出するステップ５と、を有することを特徴とする。
(Nucleic acid detection method using nanoparticle-labeled probe)
The nucleic acid detection method according to the present invention includes a step 1 for immobilizing a nucleic acid on a substrate, a step 2 for removing a nucleic acid not immobilized on the substrate, and a nanoparticle formed by the method for forming a nanoparticle-labeled probe described above. Adding a labeled probe and hybridizing the nanoparticle-labeled probe to the nucleic acid immobilized on the substrate; removing the nanoparticle-labeled probe that did not hybridize to the nucleic acid immobilized on the substrate; and And detecting the nucleic acid immobilized on the substrate by detecting the optical properties of the nanoparticles of the nanoparticle-labeled probe hybridized with the nucleic acid immobilized on the substrate.
なお、前記ナノ粒子標識プローブの分散液が、標識前と比べて、ナノ粒子の濃度換算で、３〜５倍に濃縮されていることが好ましい。また、前記ナノ粒子が有する光学特性が吸光度であることが好ましい態様である。 In addition, it is preferable that the dispersion liquid of the said nanoparticle labeled probe is concentrated 3-5 times in conversion of the density | concentration of a nanoparticle compared with before labeling. Moreover, it is a preferable aspect that the optical property of the nanoparticles is absorbance.
本発明に係る核酸検出法は、複数ステップを要する検出において、ナノ粒子の標識のステップ（図１参照；ステップ３）を予め行っておくことにより、ステップ数を減らし、検出時間の削減を図ったものである。 In the nucleic acid detection method according to the present invention, in the detection that requires a plurality of steps, the step of labeling the nanoparticles (see FIG. 1; step 3) is performed in advance, thereby reducing the number of steps and reducing the detection time. Is.
前記抗原および前記抗体には、ＦＩＴＣと抗ＦＩＴＣの組み合わせを用いることができる。また前記ナノ粒子には、前述したように、種々のナノ粒子を用いることが可能であるが、特におおよそ２０ｎｍの金コロイドを用いることが好ましい。 A combination of FITC and anti-FITC can be used for the antigen and the antibody. As described above, various nanoparticles can be used as the nanoparticles, but it is particularly preferable to use a gold colloid of about 20 nm.
なお、前記核酸を基盤に固定化する方法として、ポリスチレンにストレプトアビジンを固定化した基盤を用い、末端にビオチンを導入した核酸を接触させて固定化する方法を用いることができる。 In addition, as a method for immobilizing the nucleic acid on the substrate, a method can be used in which a substrate in which streptavidin is immobilized on polystyrene is used and a nucleic acid having biotin introduced at the end is brought into contact with the substrate.
また、ナノ粒子標識プローブの分散液が、標識前と比べて、ナノ粒子の濃度換算で、３〜５倍に濃縮しておくことで、検出感度を高めることができるのでより好ましい。濃縮は前述したように、遠心分離等を用いてナノ粒子の沈降を利用することにより、プローブ・ナノ粒子の反応物濃度を任意に調整することができる。 Further, it is more preferable that the dispersion of the nanoparticle-labeled probe is concentrated 3 to 5 times in terms of the concentration of nanoparticles compared to before the labeling, because the detection sensitivity can be increased. As described above, the concentration of the reactant of the probe nanoparticle can be arbitrarily adjusted by utilizing the sedimentation of the nanoparticle using centrifugation or the like.
以下、従来の核酸検出方法と本発明に係る核酸検出方法の相異点について図を参照して説明をする。 Hereinafter, differences between the conventional nucleic acid detection method and the nucleic acid detection method according to the present invention will be described with reference to the drawings.
図１は、従来の固相法における核酸検出方法を示す概念図である。 FIG. 1 is a conceptual diagram showing a nucleic acid detection method in a conventional solid phase method.
図１において、ステップ１は、ビオチンとビオチン親和性タンパク質（例えばアビジンなど）の相互作用などを利用してビオチン親和性タンパク質が結合した基盤に核酸を固定化するステップである。 In FIG. 1, step 1 is a step of immobilizing a nucleic acid on a substrate to which a biotin affinity protein is bound by utilizing an interaction between biotin and a biotin affinity protein (for example, avidin).
ステップ２は、核酸とハイブリダイズ可能な、標識されたプローブを用いてハイブリダイゼーションを行うステップである。 Step 2 is a step of performing hybridization using a labeled probe capable of hybridizing with a nucleic acid.
ステップ３は、プローブの標識を認識する抗体などで標識された金コロイドを用いてプローブをナノ粒子で標識するステップである。 Step 3 is a step of labeling the probe with nanoparticles using a gold colloid labeled with an antibody or the like that recognizes the label of the probe.
なお、各ステップのあとには未反応物を取り除くステップが入る（図には記載なし）。 Each step is followed by a step of removing unreacted substances (not shown in the figure).
図２は、本発明の実施例を示した概念図である。 FIG. 2 is a conceptual diagram showing an embodiment of the present invention.
ステップ１はビオチンとストレプトアビジンの相互作用を利用してビオチン親和性タンパク質が結合した基盤に核酸を固定化するステップである。 Step 1 is a step of immobilizing a nucleic acid on a substrate to which a biotin affinity protein is bound by utilizing the interaction between biotin and streptavidin.
ステップ２は核酸とハイブリダイズ可能な、抗原抗体反応を介して金コロイドが標識されたプローブを用いてハイブリダイゼーションを行うステップである。 Step 2 is a step of performing hybridization using a probe labeled with gold colloid through an antigen-antibody reaction that can hybridize with a nucleic acid.
各ステップのあとには未反応物を取り除くステップが入る（図には記載なし）。 Each step is followed by a step to remove unreacted material (not shown in the figure).
以下、本発明の好ましい実施形態を説明する。なお本発明はかかる実施形態に限定されるものではなく、その他種々の形態で実施可能である。 Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described. The present invention is not limited to such an embodiment, and can be implemented in various other forms.
実施例１：抗ＦＩＴＣ標識金コロイドの調製
金コロイド（シグマアルドリッチジャパン株式会社製、粒径２０ｎｍ、Ａ520（５２０ｎｍの吸光度）＝０．７５）１０ｍｌに対して、抗ＦＩＴＣ溶液（フナコシ株式会社製）１ｍｌを混合し、１０分間撹拌した後、メトキシ−ＰＥＧ−ＳＨ（分子量５０００、濃度０．３ｍＭ）１ｍｌを加え、更に１時間撹拌した。その後遠心分離（８５００ｒｐｍ、２０分、４℃）を３回繰り返して精製を行い、最後にＳＳＣ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｓａｌｔ Ｃｉｔｒａｔｅ：０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ クエン酸バッファ）１５０ｕｌに分散させた。（ＰＥＧ：Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）
実施例２：プローブと抗ＦＩＴＣ標識金コロイドの反応
プローブとして５′端にＦＩＴＣ標識がされたＤＮＡプローブ（配列：ＣＴＡＡＧＴＴＧＴＧＡＣＴＣＡＴＡ、５０ｎＭ、バッファＳＳＣ）１００ｕｌと、実施例１で調製した、抗ＦＩＴＣ標識金コロイド１００ｕｌを混合した。３７℃において１時間反応させ、抗原抗体反応を進行させた。反応後遠心分離機を用いて（８５００ｒｐｍ、２０分、４℃）金コロイドを沈降させ、上清とともに未反応のプローブを除去した。その後除去した液量と等量のＳＳＣを加えて金コロイドを再懸濁させた。前記遠心、上清の除去、再懸濁を４回繰り返し、最後に加えるＳＳＣの量を調整することで初期金コロイド濃度と比べて１〜５倍のプローブ・金コロイド反応液が得られた。
Example 1: Preparation of anti-FITC-labeled gold colloid Anti-FITC solution (manufactured by Funakoshi Co., Ltd.) against 10 ml of gold colloid (manufactured by Sigma Aldrich Japan Co., Ltd., particle size 20 nm, A 520 (absorbance at 520 nm) = 0.75) ) 1 ml was mixed and stirred for 10 minutes, then 1 ml of methoxy-PEG-SH (molecular weight 5000, concentration 0.3 mM) was added, and the mixture was further stirred for 1 hour. Thereafter, centrifugation (8500 rpm, 20 minutes, 4 ° C.) was repeated three times for purification, and finally, the mixture was dispersed in 150 ul of SSC (Sodium Salt Citrate: 0.75 M NaCl, 0.075 M citrate buffer). (PEG: Polyethylene Glycol)
Example 2: Reaction of probe and anti-FITC-labeled gold colloid 100 ul of a DNA probe (sequence: CTAAGTTGTACTACTATA, 50 nM, buffer SSC) labeled with FITC at the 5 'end as a probe and the anti-FITC-labeled gold prepared in Example 1 100 ul of colloid was mixed. The reaction was allowed to proceed at 37 ° C. for 1 hour to proceed with the antigen-antibody reaction. After the reaction, the gold colloid was precipitated using a centrifuge (8500 rpm, 20 minutes, 4 ° C.), and the unreacted probe was removed together with the supernatant. Thereafter, the same amount of SSC as that of the removed liquid was added to resuspend the gold colloid. Centrifugation, removal of the supernatant, and resuspension were repeated four times, and the amount of SSC added last was adjusted to obtain a probe / gold colloid reaction solution of 1 to 5 times the initial gold colloid concentration.
実施例３：ストレプトアビジン標識金コロイドの調製
金コロイド（シグマアルドリッチジャパン株式会社製、粒径２０ｎｍ、Ａ520＝０．７５）１０ｍｌに対して、ストレプトアビジン溶液（シグマアルドリッチジャパン株式会社製、２ｕＭ）１ｍｌを混合し、１０分間撹拌した後、メトキシ−ＰＥＧ−ＳＨ（分子量５０００、濃度０．３ｍＭ）１ｍｌを加え、更に１時間撹拌した。その後遠心分離（８５００ｒｐｍ、２０分、４℃）を３回繰り返して精製を行い、最後にＳＳＣ１５０ｕｌに分散させた。
Example 3: Preparation of streptavidin-labeled gold colloid Streptavidin solution (Sigma-Aldrich Japan, 2 uM) against 10 ml of gold colloid (Sigma-Aldrich Japan, particle size 20 nm, A 520 = 0.75) After 1 ml was mixed and stirred for 10 minutes, 1 ml of methoxy-PEG-SH (molecular weight 5000, concentration 0.3 mM) was added, and the mixture was further stirred for 1 hour. Thereafter, centrifugation (8500 rpm, 20 minutes, 4 ° C.) was repeated three times for purification, and finally dispersed in SSC 150 ul.
実施例４：プローブとストレプトアビジン標識金コロイドの調製
プローブとして５′端にビオチン標識がされたＤＮＡプローブ（配列：ＣＴＡＡＧＴＴＧＴＧＡＣＴＣＡＴＡ配列、５０ｎＭ、バッファＳＳＣ）１００ｕｌと、実施例３で調整したストレプトアビジン標識金コロイド１００ｕｌを混合した。３７℃において１時間反応させ、アビジン・ビオチン相互作用を進行させた。反応後遠心分離機を用いて（８５００ｒｐｍ、２０分、４℃）金コロイドを沈降させ、上清とともに未反応のプローブを除去した。その後除去した液量と等量のＳＳＣを加えて金コロイドを再懸濁させた。前記遠心、上清の除去、再懸濁を４回繰り返し、最後に加えるＳＳＣの量を調整することで初期金コロイド濃度と比べて１〜５倍のプローブ・金コロイド反応液が得られた。
Example 4: Preparation of probe and streptavidin-labeled gold colloid 100 ul of a DNA probe (sequence: CTAAGTTGTACTACTATA sequence, 50 nM, buffer SSC) labeled with biotin at the 5 'end as a probe and streptavidin-labeled gold prepared in Example 3 100 ul of colloid was mixed. The reaction was allowed to proceed at 37 ° C. for 1 hour to allow the avidin / biotin interaction to proceed. After the reaction, the gold colloid was precipitated using a centrifuge (8500 rpm, 20 minutes, 4 ° C.), and the unreacted probe was removed together with the supernatant. Thereafter, the same amount of SSC as that of the removed liquid was added to resuspend the gold colloid. Centrifugation, removal of the supernatant, and resuspension were repeated four times, and the amount of SSC added last was adjusted to obtain a probe / gold colloid reaction solution of 1 to 5 times the initial gold colloid concentration.
実施例５
上記プローブを評価するために、ストレプトアビジンを固定化したポリスチレン上（検出部）で検出反応を行った。ポリスチレンにストレプトアビジンを固定化する方法は以下の通り。ポリスチレンシートをストレプトアビジン（シグマアルドリッチジャパン株式会社製、２ｕＭ）溶液に浸し、４℃で１日静置した。その後、３７℃に昇温し２時間インキュベートした。次にポリスチレンシートを１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン、シグマアルドリッチジャパン株式会社製）溶液（０．１Ｍリン酸バッファ）に浸して３７℃、２時間インキュベートした。このストレプトアビジン固定ポリスチレンを用いて検出反応を行った。
Example 5
In order to evaluate the probe, a detection reaction was performed on polystyrene (detector) on which streptavidin was immobilized. The method for immobilizing streptavidin on polystyrene is as follows. The polystyrene sheet was immersed in a streptavidin (Sigma Aldrich Japan Co., Ltd., 2 uM) solution and allowed to stand at 4 ° C. for 1 day. Then, it heated up at 37 degreeC and incubated for 2 hours. Next, the polystyrene sheet was immersed in 1% BSA (bovine serum albumin, Sigma-Aldrich Japan Co.) solution (0.1 M phosphate buffer) and incubated at 37 ° C. for 2 hours. A detection reaction was performed using this streptavidin-immobilized polystyrene.
まず、５′端にビオチンが導入されたＤＮＡ溶液（ＡＧＡＣＴＴＧＴＧＡ ＣＡＴＧＣＴＣＧＣＣ ＧＡＧＴＡＴＧＡＧＴ ＣＡＣＡＡＣＴＴＡＧ ＣＴＡＴＡＣＧＧＡＣ ＣＡＧＴＴＡＣＴＣＡ）を検出部に導入した。４２℃、２分間反応させた後、ＤＮＡ溶液を検出部から除去した。続いて、実施例２又は実施例４で調製したプローブ・金コロイド反応液を検出部に導入した。５０℃、３分間反応させた後、プローブ・金コロイド反応液を除去し、ＳＳＣを用いて検出部の洗浄を行った。その後、吸光度変化を検出するために、反応を行ったポリスチレンに対し５２５ｎｍの波長の光を照射し、透過光強度を測定した。ＳＳＣ溶液の透過光を標準（ｂｌａｎｋ）とし、吸光度を算出した。 First, a DNA solution in which biotin was introduced at the 5 'end (AGACTTTGA CATGCTCGCC GAGTATGGATC CACAACTTAG CATACGGAC CAGTTACCA) was introduced into the detection part. After reacting at 42 ° C. for 2 minutes, the DNA solution was removed from the detection part. Subsequently, the probe / gold colloid reaction solution prepared in Example 2 or Example 4 was introduced into the detection unit. After reacting at 50 ° C. for 3 minutes, the probe / gold colloid reaction solution was removed, and the detector was washed using SSC. Thereafter, in order to detect a change in absorbance, the reacted polystyrene was irradiated with light having a wavelength of 525 nm, and the transmitted light intensity was measured. Absorbance was calculated using the transmitted light of the SSC solution as a standard.
測定の結果、３倍濃縮液で従来の約１．５倍の、５倍濃縮液で従来の約２倍の感度が得られることが判明した。 As a result of the measurement, it was found that a sensitivity of about 1.5 times that of the conventional solution was obtained with the 3-fold concentrated solution and about twice that of the conventional solution was obtained with the 5-fold concentrated solution.
なお、上記実施例により、本発明に係る核酸検出方法は、従来法より検出に要するステップ数が少なく、より簡単で短時間に核酸検出が可能であることが分かる。 In addition, it can be seen from the above examples that the nucleic acid detection method according to the present invention requires fewer steps for detection than the conventional method, and can detect nucleic acids more easily and in a short time.
Ｓｐ１ ステップ１：核酸固定化
Ｓｐ２ ステップ２：ハイブリダイゼーション
Ｓｐ３ ステップ３：ナノ粒子標識
１ ビオチン親和性タンパク質
２ 核酸
３ ビオチン
４ プローブ
５ 標識
６ ナノ粒子
７ 標識認識抗体
８ ナノ粒子標識プローブ
９ 基盤
Sp1 Step 1: Immobilization of nucleic acid Sp2 Step 2: Hybridization Sp3 Step 3: Nanoparticle labeling 1 Biotin affinity protein 2 Nucleic acid 3 Biotin 4 Probe 5 Label 6 Nanoparticle 7 Label recognition antibody 8 Nanoparticle labeling probe 9 Base
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