JP2008292422A - Preparation method of mass spectrometry sample, ionization method of ribonucleic acid, mass spectrometry method of ribonucleic acid, and this mass spectrometry method of low molecule ribonucleic acid of cell provenance - Google Patents

Preparation method of mass spectrometry sample, ionization method of ribonucleic acid, mass spectrometry method of ribonucleic acid, and this mass spectrometry method of low molecule ribonucleic acid of cell provenance Download PDF

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method of preparation of sample for mass spectrometry making possible for mass analysis of RNA of concentration of sub-pico order. <P>SOLUTION: The method of preparation of mass spectrometry sample is composed of following steps: the step S106 for supplying and drying the matrix solution containing 3-hydroxy picolinic acid of 10 to 50 mg/ml concentration on the sample plate, the step S107 for further supplying and drying the matrix solution to the place where the matrix solution has dried, the step S108 for supplying and drying the sample solution containing the ribonucleic acid to the place where the matrix solution has been supplied and dried two times, and the step S109 for supplying and drying the additive agent solution containing ammonium citrate to the place where the sample solution has been dried. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は質量分析技術に関し、特に質量分析サンプルの調製方法、リボ核酸のイオン化方法、リボ核酸の質量分析方法、及び細胞由来の低分子リボ核酸の質量分析方法に関する。   The present invention relates to mass spectrometry technology, and more particularly to a method for preparing a mass spectrometry sample, a method for ionizing ribonucleic acid, a method for mass spectrometry of ribonucleic acid, and a method for mass spectrometry of low molecular ribonucleic acid derived from cells.

マトリックス支援レーザ脱離イオン化法(MALDI: Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization)は生体分子等の高分子のイオン化が可能であるため、注目を集めている（例えば、特許文献1参照。）。さらに近年はMALDIによってデオキシリボ核酸(DNA)をイオン化し、飛行時間型質量分析法(TOF-MS: Time of Flight Mass Spectrometry)によってDNAを検出し、高い精度で解析する試みがされている。一方、極微量のリボ核酸(RNA)をMALDI-TOF-MSで検出するのは困難であるとされ、1×10-12molのRNAを検出したとの報告があるのみである。近年、非コードRNA(ncRNA: non-coding RNA)の機能解明の必要性が高まっているが、ncRNAはサブピコモルからフェムトモルオーダでしか臓器等から回収できず、MALDI-TOF-MSによる解析は不可能であった。そのため、サブピコモルオーダ以下のRNAをMALDI-TOF-MSで検出するための技術の確立が望まれていた。
特開2006-196190号公報 Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization (MALDI) attracts attention because it can ionize macromolecules such as biomolecules (see, for example, Patent Document 1). Furthermore, in recent years, attempts have been made to ionize deoxyribonucleic acid (DNA) by MALDI, detect DNA by time of flight mass spectrometry (TOF-MS), and analyze it with high accuracy. On the other hand, it is said that it is difficult to detect a very small amount of ribonucleic acid (RNA) by MALDI-TOF-MS, and there is only a report that 1 × 10 −12 mol of RNA has been detected. In recent years, the need to elucidate the function of non-coding RNA (ncRNA: non-coding RNA) has increased, but ncRNA can be recovered from organs only in sub-picomolar to femtomolar order, and analysis by MALDI-TOF-MS is not possible. It was possible. Therefore, it has been desired to establish a technique for detecting RNA below sub-picomolar order by MALDI-TOF-MS.
JP 2006-196190 A

本発明は、サブピコモルオーダの濃度のリボ核酸の質量分析を可能とする質量分析サンプルの調製方法、リボ核酸のイオン化方法、リボ核酸の質量分析方法、及び細胞由来の低分子リボ核酸の質量分析方法を提供することを目的とする。   The present invention relates to a method for preparing a mass spectrometry sample capable of mass spectrometry of ribonucleic acid at a sub-picomolar order concentration, a method for ionizing ribonucleic acid, a mass spectrometry method for ribonucleic acid, and mass spectrometry of a low molecular ribonucleic acid derived from a cell. It aims to provide a method.

本発明の第1の特徴は、（イ）10乃至50mg/mlの濃度で3-ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、（ロ）マトリックス溶液が乾燥した部分にマトリックス溶液を更に供給し乾燥させるステップと、（ハ）マトリックス溶液が2回供給され乾燥した部分にリボ核酸を含むサンプル溶液を供給し乾燥させるステップと、（ニ）サンプル溶液が乾燥した部分にクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給し乾燥させるステップとを含む質量分析サンプルの調製方法であることを要旨とする。   The first feature of the present invention is that (b) supplying a matrix solution containing 3-hydroxypicolinic acid at a concentration of 10 to 50 mg / ml on a sample plate and drying; and (b) a portion where the matrix solution is dried. (C) supplying the matrix solution twice and drying the sample solution containing ribonucleic acid to the dried part; and (d) supplying the sample solution to the dried part. The gist of the present invention is to prepare a mass spectrometric sample including a step of supplying and drying an additive solution containing ammonium citrate.

本発明の第2の特徴は、（イ）10乃至50mg/mlの濃度で3-ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、（ロ）マトリックス溶液が乾燥した部分にリボ核酸を含むサンプル溶液を供給し、さらにクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給して乾燥させるステップとを含む質量分析サンプルの調製方法であることを要旨とする。   The second feature of the present invention is that (b) a step of supplying a matrix solution containing 3-hydroxypicolinic acid at a concentration of 10 to 50 mg / ml onto the sample plate and drying; and (b) a portion where the matrix solution is dried. A sample solution containing ribonucleic acid, and an additive solution containing ammonium citrate and drying the sample solution.

本発明の第3の特徴は、（イ）10乃至50mg/mlの濃度で3-ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、（ロ）マトリックス溶液が乾燥した部分にマトリックス溶液を更に供給し乾燥させるステップと、（ハ）マトリックス溶液が2回供給され乾燥した部分にリボ核酸を含むサンプル溶液を供給し乾燥させるステップと、（ニ）サンプル溶液が乾燥した部分にクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給し乾燥させるステップと、（ホ）添加剤溶液が乾燥した部分にレーザを照射し、リボ核酸のプロトン脱離イオンを生成させるステップとを含むリボ核酸のイオン化方法であることを要旨とする。   The third feature of the present invention is that (b) supplying a matrix solution containing 3-hydroxypicolinic acid at a concentration of 10 to 50 mg / ml onto the sample plate and drying; and (b) a portion where the matrix solution is dried. (C) supplying the matrix solution twice and drying the sample solution containing ribonucleic acid to the dried part; and (d) supplying the sample solution to the dried part. Ionization of ribonucleic acid comprising: supplying an additive solution containing ammonium citrate and drying; and (e) irradiating a portion of the additive solution dried with laser to generate proton-eliminated ions of ribonucleic acid. The gist is the method.

本発明の第4の特徴は、（イ）10乃至50mg/mlの濃度で3-ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、（ロ）マトリックス溶液が乾燥した部分にリボ核酸を含むサンプル溶液を供給し、さらにクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給して乾燥させるステップと、（ハ）添加剤溶液が乾燥した部分にレーザを照射し、リボ核酸のプロトン脱離イオンを生成させるステップとを含むリボ核酸のイオン化方法であることを要旨とする。   The fourth feature of the present invention is that (b) supplying a matrix solution containing 3-hydroxypicolinic acid at a concentration of 10 to 50 mg / ml onto the sample plate and drying; and (b) a portion where the matrix solution is dried. Supplying a sample solution containing ribonucleic acid to the sample, supplying an additive solution containing ammonium citrate and drying; and (c) irradiating the dried portion of the additive solution with a laser to deprotonate the ribonucleic acid. The present invention provides a method for ionizing ribonucleic acid comprising a step of generating separated ions.

本発明の第5の特徴は、（イ）10乃至50mg/mlの濃度で3-ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、（ロ）マトリックス溶液が乾燥した部分にマトリックス溶液を更に供給し乾燥させるステップと、（ハ）マトリックス溶液が2回供給され乾燥した部分にリボ核酸を含むサンプル溶液を供給し乾燥させるステップと、（ニ）サンプル溶液が乾燥した部分にクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給し乾燥させるステップと、（ホ）添加剤溶液が乾燥した部分にレーザを照射し、リボ核酸のプロトン脱離イオンを生成させるステップと、（ヘ）リボ核酸のプロトン脱離イオンの飛行時間を測定し、リボ核酸のプロトン脱離イオンの質量電荷比を測定するステップとを含むリボ核酸の質量分析方法であることを要旨とする。   The fifth feature of the present invention is that (b) supplying a matrix solution containing 3-hydroxypicolinic acid at a concentration of 10 to 50 mg / ml onto a sample plate and drying; and (b) a portion where the matrix solution is dried. (C) supplying the matrix solution twice and drying the sample solution containing ribonucleic acid to the dried part; and (d) supplying the sample solution to the dried part. Supplying an additive solution containing ammonium citrate and drying; (e) irradiating the dried portion of the additive solution with a laser to generate proton-eliminated ions of ribonucleic acid; and (f) ribonucleic acid. Measuring the time of flight of proton desorption ions of the ribonucleic acid, and measuring the mass-to-charge ratio of proton desorption ions of the ribonucleic acid The gist of the analysis method.

本発明の第6の特徴は、（イ）10乃至50mg/mlの濃度で3-ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、（ハ）マトリックス溶液が乾燥した部分にリボ核酸を含むサンプル溶液を供給し、さらにクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給して乾燥させるステップと、（ニ）添加剤溶液が乾燥した部分にレーザを照射し、リボ核酸のプロトン脱離イオンを生成させるステップと、（ホ）リボ核酸のプロトン脱離イオンの飛行時間を測定し、リボ核酸のプロトン脱離イオンの質量電荷比を測定するステップとを含むリボ核酸の質量分析方法であることを要旨とする。   The sixth feature of the present invention is that (a) supplying a matrix solution containing 3-hydroxypicolinic acid at a concentration of 10 to 50 mg / ml onto a sample plate and drying; (c) a portion where the matrix solution is dried Supplying a sample solution containing ribonucleic acid to the sample, supplying an additive solution containing ammonium citrate and drying the sample; and (d) irradiating the dried portion of the additive solution with a laser to remove protons from the ribonucleic acid. A method of mass spectrometry of ribonucleic acid, comprising the steps of: generating separated ions; and (e) measuring a time of flight of proton desorbed ions of ribonucleic acid and measuring a mass-to-charge ratio of proton desorbed ions of ribonucleic acid. It is a summary.

本発明の第7の特徴は、（イ）細胞から低分子リボ核酸を抽出するステップと、（ロ）10乃至50mg/mlの濃度で3-ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、（ハ）マトリックス溶液が乾燥した部分にマトリックス溶液を更に供給し乾燥させるステップと、（ニ）マトリックス溶液が2回供給され乾燥した部分に低分子リボ核酸を含むサンプル溶液を供給し乾燥させるステップと、（ホ）サンプル溶液が乾燥した部分にクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給し乾燥させるステップと、（ヘ）添加剤溶液が乾燥した部分にレーザを照射し、低分子リボ核酸のプロトン脱離イオンを生成させるステップと、（ト）低分子リボ核酸のプロトン脱離イオンの飛行時間を測定し、低分子リボ核酸のプロトン脱離イオンの質量電荷比を測定するステップとを含む細胞由来の低分子リボ核酸の質量分析方法であることを要旨とする。   The seventh feature of the present invention is that (b) a step of extracting low-molecular-weight ribonucleic acid from cells, and (b) a matrix solution containing 3-hydroxypicolinic acid at a concentration of 10 to 50 mg / ml is supplied onto the sample plate. And (d) a step of further supplying a matrix solution to the portion where the matrix solution is dried and drying, and (d) a sample solution containing the low molecular weight ribonucleic acid in the portion where the matrix solution is supplied twice and dried. Supplying and drying; (e) supplying and drying an additive solution containing ammonium citrate to a part where the sample solution is dried; and (f) irradiating a laser on the part where the additive solution is dried. A step of generating proton detachment ions of molecular ribonucleic acid, and (g) measuring time of flight of proton detachment ions of low molecular ribonucleic acid, And a method for mass spectrometry of cell-derived low-molecular-weight ribonucleic acid, comprising a step of measuring a mass-to-charge ratio of proton desorption ions.

本発明の第8の特徴は、（イ）細胞から低分子リボ核酸を抽出するステップと、（ロ）10乃至50mg/mlの濃度で3-ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、（ハ）マトリックス溶液が乾燥した部分に低分子リボ核酸を含むサンプル溶液を供給し、さらにクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給して乾燥させるステップと、（ニ）添加剤溶液が乾燥した部分にレーザを照射し、低分子リボ核酸のプロトン脱離イオンを生成させるステップと、（ホ）低分子リボ核酸のプロトン脱離イオンの飛行時間を測定し、低分子リボ核酸のプロトン脱離イオンの質量電荷比を測定するステップとを含む細胞由来の低分子リボ核酸の質量分析方法であることを要旨とする。   The eighth feature of the present invention is that (b) a step of extracting low-molecular-weight ribonucleic acid from cells, and (b) a matrix solution containing 3-hydroxypicolinic acid at a concentration of 10 to 50 mg / ml is supplied onto a sample plate. (C) supplying a sample solution containing low-molecular-weight ribonucleic acid to a portion where the matrix solution is dried, supplying an additive solution containing ammonium citrate, and (d) adding Irradiating the dried part of the agent solution with laser to generate proton desorption ions of low molecular ribonucleic acid, and (e) measuring the time of flight of proton desorption ions of low molecular ribonucleic acid, And a method for mass spectrometry of cell-derived low-molecular-weight ribonucleic acid, comprising a step of measuring a mass-to-charge ratio of proton desorption ions.

本発明にかかるリボ核酸の塩基長としては、好ましくは5-50塩基、更に好ましくは10-40塩基である。リボ核酸としては、従来知られた方法で有機合成されたリボ核酸、あるいは細胞から抽出した天然由来のリボ核酸のいずれかを問わない。細胞としては、植物由来の細胞であってもよいし、動物由来の細胞であってもよい。これらの細胞からのリボ核酸の抽出方法は、AGPC（acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)法など、当業者が適宜選択できる。天然由来のリボ核酸としては、rRNA、tRNA、mRNAが挙げられる。特にマイクロRNAをはじめとする、塩基長が15-35塩基程度の低分子リボ核酸を解析対象とすることで、後述するような機能性RNAの解析を可能とする。   The base length of the ribonucleic acid according to the present invention is preferably 5-50 bases, more preferably 10-40 bases. The ribonucleic acid may be either ribonucleic acid organically synthesized by a conventionally known method or naturally-derived ribonucleic acid extracted from cells. The cell may be a plant-derived cell or an animal-derived cell. A method for extracting ribonucleic acid from these cells can be appropriately selected by those skilled in the art, such as AGPC (acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) method. Naturally-derived ribonucleic acid includes rRNA, tRNA, and mRNA. In particular, analysis of functional RNA as described below is possible by analyzing low-molecular-weight ribonucleic acid having a base length of about 15 to 35 bases, such as microRNA.

本発明によれば、サブピコモルオーダの濃度のリボ核酸の質量分析を可能とする質量分析サンプルの調製方法、リボ核酸のイオン化方法、リボ核酸の質量分析方法、及び細胞由来の低分子リボ核酸の質量分析方法を提供可能である。   According to the present invention, a mass spectrometry sample preparation method, ribonucleic acid ionization method, ribonucleic acid mass spectrometry method, and cell-derived low-molecular-weight ribonucleic acid can be analyzed. A mass spectrometry method can be provided.

以下に本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。但し、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。   Embodiments of the present invention will be described below. In the following description of the drawings, the same or similar parts are denoted by the same or similar reference numerals. However, the drawings are schematic. Therefore, specific dimensions and the like should be determined in light of the following description. Moreover, it is a matter of course that portions having different dimensional relationships and ratios are included between the drawings.

さて、ヒトゲノム解析の成果として特筆すべきことは、ヒトゲノムの98%にわたるタンパク質をコードしない非翻訳領域からの大量の転写産物が見つかったことである。非翻訳領域の2/3からncRNAが転写されていると見積もられている。ncRNAはタンパク質に翻訳されることなく存在し機能性RNAとして振舞うことが、最近の研究で明らかになりつつある。生命の複雑さとゲノムに存在する非翻訳領域の増加には相関が見られ、高度な生命現象の源はncRNAが担っている可能性が指摘されている。   What is noteworthy as a result of human genome analysis is that a large amount of transcripts from untranslated regions that do not encode proteins covering 98% of the human genome were found. It is estimated that ncRNA is transcribed from 2/3 of the untranslated region. Recent studies have revealed that ncRNA exists without being translated into protein and behaves as a functional RNA. There is a correlation between the complexity of life and the increase in untranslated regions in the genome, suggesting that ncRNA may be responsible for the source of advanced life phenomena.

マイクロRNA (miRNA)は、ncRNAの中で最も解析が進んでいる機能性の低分子RNAである。miRNAは特定のmRNAの3'非翻訳領域に相補的に結合し、mRNAの翻訳抑制及びRNA干渉(RNAi: RNA interference)による分解を誘導し、発生のタイミングや分化の方向性を決定する重要な分子として注目されている。最近の研究で、ヒトにはmiRNAが1000個程度存在し、それぞれのmiRNAが複数の遺伝子の翻訳抑制に関わっていることが明らかとなった。ヒトのタンパク質遺伝子の30％がmiRNAによって制御されているとの見積もりもある。また、核内に存在するncRNAがDNAのメチル化やクロマチン修飾を誘導し、エピジェネティックな遺伝子発現の制御にも大きな役割を果たしていることが次第に明らかになりつつある。このように、ncRNAは遺伝子発現において翻訳制御のみならず、転写レベルでの制御にも積極的に関与していることが明らかとなり、<DNA→RNA→タンパク質>という古典的なセントラルドグマが大きく塗り替えられようとしている。大量に存在するncRNAの中には未知の機能性RNAが多く含まれていると考えられる。複雑な生命活動を分子レベルで理解するためには、新規に発見される機能性RNAの探索と解析が重要である。   MicroRNA (miRNA) is a functional small RNA that has been most analyzed among ncRNAs. miRNAs bind complementarily to the 3 'untranslated region of specific mRNAs, induce translational suppression of mRNA and degradation due to RNA interference (RNAi), and determine the timing of development and the direction of differentiation. It is attracting attention as a molecule. Recent studies have revealed that there are about 1000 miRNAs in humans and that each miRNA is involved in the translational repression of multiple genes. Some estimates indicate that 30% of human protein genes are regulated by miRNA. In addition, it is becoming increasingly clear that ncRNA present in the nucleus induces DNA methylation and chromatin modification and plays an important role in the control of epigenetic gene expression. Thus, it is clear that ncRNA is actively involved in not only translational control but also transcriptional control in gene expression, and the classic central dogma <DNA → RNA → protein> has been greatly changed. It is going to be done. A large amount of ncRNA is thought to contain many unknown functional RNAs. In order to understand complex life activities at the molecular level, it is important to search and analyze newly discovered functional RNAs.

通常、微量なRNAの解析法としては、逆転写とポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を組み合わせたcDNAの解析が一般的である。しかしランダムプライミング及びリンカーライゲーションの効率のばらつきや、cDNAの合成量のバイアスが生じるため、PCRを用いる解析法は定量性に欠ける。さらにPCRを用いる解析法は、末端構造や塩基修飾など、機能性RNAが有する質的な情報を読み取ることができない。またクローニング及びシーケンスにも時間がかかる。一方、RNAを蛍光又はラジオアイソトープ等で標識し、ハイブリダイゼーションを基本原理とするマイクロアレイ技術によって解析する試みもなされている。しかし標識効率やハイブリダイゼーション効率にばらつきが生じるため、マイクロアレイ技術による解析結果も潜在的な誤差を含みうる。 Usually, as a method for analyzing a very small amount of RNA, cDNA analysis combining reverse transcription and polymerase chain reaction (PCR) is generally used. However, the random priming and linker ligation efficiencies and bias in the synthesis amount of cDNA occur, and the analysis method using PCR lacks quantitativeness. Furthermore, the analysis method using PCR cannot read qualitative information of functional RNA such as terminal structure and base modification. Cloning and sequencing are also time consuming. On the other hand, attempts have been made to label RNA with fluorescence or radioisotope and analyze it by microarray technology based on the basic principle of hybridization. However, since the labeling efficiency and the hybridization efficiency vary, the analysis result by the microarray technique may include a potential error.

そこで発明者は、四重極イオントラップ型MALDI-TOF-MS装置によるRNAの解析を試みた。MALDI-TOF-MS装置は、図1に示すように、質量分析サンプルからイオンを生成させるイオン化部11、イオン化部11で生じたイオンを一時的に保持するイオントラップ部12、及びイオントラップ部12から放出されるイオンを飛行させ、イオンの飛行時間を検出する飛行時間分析部13を備える。   Therefore, the inventors tried to analyze RNA using a quadrupole ion trap type MALDI-TOF-MS apparatus. As shown in FIG. 1, the MALDI-TOF-MS apparatus includes an ionization unit 11 that generates ions from a mass analysis sample, an ion trap unit 12 that temporarily holds ions generated in the ionization unit 11, and an ion trap unit 12 A time-of-flight analysis unit 13 is provided that detects the time of flight of ions by flying ions emitted from the air.

イオン化部11はパルス状のレーザを発するレーザ光源112、及びレーザが照射される質量分析サンプルを保持するサンプルプレート111を備える。レーザが照射されると、質量分析サンプルに含まれる検体がイオン化され、イオン化部11内の空間に放出される。イオン化部11は、放出されたイオンを集束するイオンレンズ113をさらに備える。   The ionization unit 11 includes a laser light source 112 that emits a pulsed laser, and a sample plate 111 that holds a mass analysis sample irradiated with the laser. When the laser is irradiated, the analyte contained in the mass spectrometry sample is ionized and released into the space inside the ionization unit 11. The ionization unit 11 further includes an ion lens 113 that focuses the emitted ions.

イオントラップ部12は、第1のエンドキャップ電極121、リング電極124、及び第2のエンドキャップ電極123を備える。ここで第1のエンドキャップ電極121、リング電極124、及び第2のエンドキャップ電極123で囲まれた空間をイオントラップ空間122とする。第1のエンドキャップ電極121及び第2のエンドキャップ電極123のそれぞれには、イオンレンズ113で集束されたイオンが通過可能な開口が設けられている。イオン化部11で生じたイオンは第1のエンドキャップ電極121に設けられた開口を通ってイオントラップ空間122に入射する。第1のエンドキャップ電極121、リング電極124、及び第2のエンドキャップ電極123はイオントラップ空間122に四重極電場を形成し、入射してきたイオンをイオントラップ空間122内に保持する。設定により、イオントラップ空間122内に保持された複数種類のイオンから単一の種類のイオンを選択することが可能である。またイオントラップ空間122内に保持されたイオンにアルゴン(Ar)ガス等を衝突させ、衝突誘起解離法(CID: Collision Induced Dissociation)によりイオンを開裂させることも可能である。ここで、開裂される前のイオンをプリカーサイオン、開裂したイオンをプロダクトイオンと呼ぶ。   The ion trap unit 12 includes a first end cap electrode 121, a ring electrode 124, and a second end cap electrode 123. Here, a space surrounded by the first end cap electrode 121, the ring electrode 124, and the second end cap electrode 123 is defined as an ion trap space 122. Each of the first end cap electrode 121 and the second end cap electrode 123 is provided with an opening through which ions focused by the ion lens 113 can pass. Ions generated in the ionization unit 11 enter the ion trap space 122 through an opening provided in the first end cap electrode 121. The first end cap electrode 121, the ring electrode 124, and the second end cap electrode 123 form a quadrupole electric field in the ion trap space 122 and hold incident ions in the ion trap space 122. By setting, it is possible to select a single type of ion from a plurality of types of ions held in the ion trap space 122. It is also possible to cause argon (Ar) gas or the like to collide with ions held in the ion trap space 122 and cleave the ions by collision induced dissociation (CID). Here, the ions before cleavage are called precursor ions, and the cleaved ions are called product ions.

イオンが負イオンである場合、第1のエンドキャップ電極121に負の電圧を印加し、第2のエンドキャップ電極123に正の電圧を印加すると、イオンは第2のエンドキャップ電極123に向かって加速し、第2のエンドキャップ電極123に設けられた開口から飛行時間分析部13に入射する。飛行時間分析部13は、イオンを反射するためのリフレクタ電極125、及びイオンを検出する検出器131を備える。飛行時間分析部13の内部において、低質量電荷比のイオンは高速に飛行し、高質量電荷比のイオンは低速に飛行する。したがって、検出器131がイオンを検出したタイミングと検出強度に基づいて、イオンのマススペクトルを生成することが可能となる。イオン化部11、イオントラップ部12、及び飛行時間分析部13には制御部14が接続されている。制御部14は、イオンレンズ113、第1のエンドキャップ電極121、リング電極124、第2のエンドキャップ電極123、及びリフレクタ電極125等を制御する。   If the ions are negative ions, applying a negative voltage to the first endcap electrode 121 and applying a positive voltage to the second endcap electrode 123 causes the ions to travel toward the second endcap electrode 123. Accelerate and enter the time-of-flight analysis unit 13 through an opening provided in the second end cap electrode 123. The time-of-flight analysis unit 13 includes a reflector electrode 125 for reflecting ions and a detector 131 for detecting ions. Inside the time-of-flight analysis unit 13, ions with a low mass to charge ratio fly at high speed, and ions with a high mass to charge ratio fly at low speed. Therefore, it is possible to generate a mass spectrum of ions based on the timing at which the detector 131 detects ions and the detection intensity. A control unit 14 is connected to the ionization unit 11, the ion trap unit 12, and the time-of-flight analysis unit 13. The control unit 14 controls the ion lens 113, the first end cap electrode 121, the ring electrode 124, the second end cap electrode 123, the reflector electrode 125, and the like.

ここで発明者は、極微量のRNAをMALDI-TOF-MS装置で高い感度で検出するには、10乃至50mg/mlの濃度で下記化学式(1)の3-ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させ、マトリックス溶液が乾燥した部分にマトリックス溶液を更に供給し乾燥させ、マトリックス溶液が2回供給され乾燥した部分にRNAを含むサンプル溶液を供給し乾燥させ、サンプル溶液が乾燥した部分にクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給し乾燥させることを含む質量分析サンプルの第1の調製方法が有効であることを見いだした。

Figure 2008292422
Here, in order to detect an extremely small amount of RNA with high sensitivity using a MALDI-TOF-MS apparatus, the inventor prepared a matrix solution containing 3-hydroxypicolinic acid represented by the following chemical formula (1) at a concentration of 10 to 50 mg / ml. The sample solution is supplied and dried on the sample plate, the matrix solution is further supplied to the dried portion of the matrix solution and dried, the sample solution containing RNA is supplied to the dried portion of the matrix solution and dried, and the sample solution is dried. It has been found that the first method for preparing a mass spectrometric sample including supplying an additive solution containing ammonium citrate to the dried portion and drying it is effective.
Figure 2008292422

実施の形態に係る質量分析サンプルの第1の調製方法で得られる質量分析サンプルをMALDI-TOF-MS装置で分析すれば、サブピコモルからフェムトモルオーダのRNAを検出することが可能となる。下記化学式(2)の2,4,6-トリヒドロキシアセトフェノンをマトリックスとして用い、マトリックス溶液、サンプル溶液、及び添加剤溶液を順次滴下し乾燥させることをしなかった従来のDNAの質量分析サンプルの調製方法と比較して、実施の形態に係る質量分析サンプルの第1の調製方法によれば、MALDI-TOF-MS装置を用いて16倍の感度でRNAのプロトン脱離イオン([M-H]-)を検出可能となる。

Figure 2008292422
When the mass spectrometry sample obtained by the first method for preparing a mass spectrometry sample according to the embodiment is analyzed with a MALDI-TOF-MS apparatus, femtomolar RNA can be detected from sub-picomolar. Preparation of a conventional DNA mass spectrometric sample that uses 2,4,6-trihydroxyacetophenone of the following chemical formula (2) as a matrix and does not allow the matrix solution, the sample solution, and the additive solution to be dropped and dried sequentially. Compared to the method, according to the first method for preparing a mass spectrometry sample according to the embodiment, the proton desorption ion ([MH] − ) of RNA is 16 times more sensitive using a MALDI-TOF-MS apparatus. Can be detected.
Figure 2008292422

また従来、MALDI-TOF-MS法でRNAの2価のプロトン脱離イオン([M-2H]2-)を検出するのは困難であるとされていた。これに対し、実施の形態に係る質量分析サンプルの第1の調製方法によれば、MALDI-TOF-MS装置を用いてフェムトモルオーダのRNAから2価のプロトン脱離イオンを生成し、高い感度で検出することが可能となる。さらに実施の形態に係る質量分析サンプルの第1の調製方法においては、プロトン脱離イオン以外の塩付加イオン（[M-2H+Na]-等）の生成を抑制する添加剤として、下記化学式(3)のクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液が添加される。したがって、RNAのプロトン脱離イオンを高い信号対雑音(SN: Signal to Noise)比で検出することが可能となる。

Figure 2008292422
Conventionally, it has been difficult to detect divalent proton desorption ions ([M-2H] 2- ) of RNA by MALDI-TOF-MS. In contrast, according to the first method for preparing a mass spectrometry sample according to the embodiment, a bivalent proton desorption ion is generated from femtomolar RNA using a MALDI-TOF-MS apparatus, and high sensitivity is obtained. Can be detected. Furthermore, in the first preparation method of the mass spectrometry sample according to the embodiment, as an additive for suppressing the production of salt addition ions ([M-2H + Na] − etc.) other than proton desorption ions, the following chemical formula ( 3) Additive solution containing ammonium citrate is added. Therefore, it is possible to detect proton desorption ions of RNA with a high signal-to-noise (SN) ratio.
Figure 2008292422

また発明者は、10乃至50mg/mlの濃度で3-ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させ、マトリックス溶液が乾燥した部分にリボ核酸を含むサンプル溶液を供給し、さらにクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給して乾燥させることを含む質量分析サンプルの第2の調製方法も、RNAをMALDI-TOF-MS装置で高い感度で検出するために有効であることを見いだした。質量分析サンプルの第2の調製方法を用いてMALDI-TOF-MS装置で検出可能なRNAの物質量の下限は、質量分析サンプルの第1の調製方法を用いた場合を上回る。しかし、従来の質量分析サンプルの調製方法を用いた場合よりも、質量分析サンプルの第2の調製方法を用いて8倍の感度でRNAのプロトン脱離イオンをMALDI-TOF-MS装置で検出可能となる。   In addition, the inventor supplies a matrix solution containing 3-hydroxypicolinic acid at a concentration of 10 to 50 mg / ml on a sample plate and dries, and supplies a sample solution containing ribonucleic acid to a portion where the matrix solution is dried. A second method for the preparation of mass spectrometry samples, including feeding an additive solution containing ammonium citrate and drying, was also found to be effective for detecting RNA with high sensitivity on a MALDI-TOF-MS instrument. It was. The lower limit of the amount of RNA substance that can be detected by the MALDI-TOF-MS apparatus using the second mass spectrometry sample preparation method is higher than that when the first mass spectrometry sample preparation method is used. However, RNA desorption ions of RNA can be detected with a MALDI-TOF-MS instrument 8 times more sensitively using the second method for mass spectrometry sample preparation than when using the conventional method for mass spectrometry sample preparation. It becomes.

（第1の実施例）
図2に示すフローチャートを参照して、第1の実施例に係る質量分析サンプルの調製方法について説明する。 (First embodiment)
With reference to the flowchart shown in FIG. 2, a method for preparing a mass spectrometry sample according to the first embodiment will be described.

(a) ステップS101で、質量分析グレードの3-ヒドロキシピコリン酸（フルカ社）、液体クロマトグラフィ質量分析グレードのアセトニトリル（和光純薬工業株式会社）、クエン酸アンモニウム（フルカ社）、及びトリフルオロ酢酸（ピアス社）を用意した。ステップS102でトリフルオロ酢酸を体積濃度が0.1%(v/v)となるよう超純水で希釈した。次にステップS103で25mgの3-ヒドロキシピコリン酸を、900μlのトリフルオロ酢酸溶液（体積濃度0.1%）と100μlのアセトニトリル（濃度100%）の混合液で溶解し、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が25mg/mlのマトリックス溶液を調製した。   (a) In step S101, mass spectrometry grade 3-hydroxypicolinic acid (Fluka), liquid chromatography mass spectrometry grade acetonitrile (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), ammonium citrate (Fluka), and trifluoroacetic acid ( Pierce Co., Ltd.) was prepared. In step S102, trifluoroacetic acid was diluted with ultrapure water so that the volume concentration became 0.1% (v / v). Next, in step S103, 25 mg of 3-hydroxypicolinic acid is dissolved in a mixture of 900 μl of trifluoroacetic acid solution (volume concentration 0.1%) and 100 μl of acetonitrile (concentration 100%), and the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is increased. A 25 mg / ml matrix solution was prepared.

(b) ステップS104で10mgのクエン酸アンモニウムを1mlのトリフルオロ酢酸溶液（体積濃度0.1%）で溶解し、クエン酸アンモニウムの濃度が10mg/mlの添加剤溶液を調製した。ステップS105で配列がAUCAUCAUCAUCAUCAUCGの有機合成RNAを用意した。また電気抵抗率が18×106Ω・cm以上の超純水を用意した。次に有機合成RNAを超純水で溶解し、有機合成RNAの濃度がそれぞれ50×10-9mol/l、25×10-9mol/l、12.5×10-9mol/l、6.25×10-9mol/lの4種類のサンプル溶液を調製した。 (b) In step S104, 10 mg of ammonium citrate was dissolved in 1 ml of trifluoroacetic acid solution (volume concentration 0.1%) to prepare an additive solution having an ammonium citrate concentration of 10 mg / ml. In step S105, an organic synthetic RNA having a sequence of AUCAUCAUCAUCAUCAUCG was prepared. In addition, ultrapure water having an electrical resistivity of 18 × 10 6 Ω · cm or more was prepared. Next, the organic synthetic RNA was dissolved in ultrapure water, and the organic synthetic RNA concentrations were 50 x 10 -9 mol / l, 25 x 10 -9 mol / l, 12.5 x 10 -9 mol / l, 6.25 x 10 respectively. Four sample solutions of -9 mol / l were prepared.

(c) ステップS106で図3に示すサンプルプレート111を用意した。サンプルプレート111には、株式会社島津製作所製のステンレスからなる386穴サンプルプレート等が使用可能である。次にサンプルプレート111上に0.5μlのマトリックス溶液を滴下し自然乾燥させて、図4に示すようにサンプルプレート111上に結晶状の第1マトリックス層21を形成させた。次にステップS107で第1マトリックス層21上に0.5μlのマトリックス溶液をさらに滴下した。滴下により第1のマトリックス層21は溶解した。その後、自然乾燥により、図5に示すようにサンプルプレート111上に結晶状の第2マトリックス層22が形成された。   (c) In step S106, the sample plate 111 shown in FIG. 3 was prepared. As the sample plate 111, a 386-hole sample plate made of stainless steel manufactured by Shimadzu Corporation can be used. Next, 0.5 μl of a matrix solution was dropped on the sample plate 111 and allowed to dry naturally, and a crystalline first matrix layer 21 was formed on the sample plate 111 as shown in FIG. Next, in step S107, 0.5 μl of the matrix solution was further dropped on the first matrix layer 21. The first matrix layer 21 was dissolved by dropping. Thereafter, a crystalline second matrix layer 22 was formed on the sample plate 111 by natural drying as shown in FIG.

(d) ステップS108で第2マトリックス層22上に4種類のサンプル溶液のいずれかを0.5μl滴下した。滴下により、第2のマトリックス層22は溶解した。その後、自然乾燥により、図6に示すようにサンプルプレート111上にサンプル含有層23が形成された。次にステップS109でサンプル含有層23上に0.5μlの添加剤溶液を滴下した。滴下により、サンプル含有層23は溶解した。その後、自然乾燥により、図7に示すようにサンプルプレート111上にサンプル添加剤含有層24が形成され、第1の実施例に係る質量分析サンプルを得た。   (d) In step S108, 0.5 μl of any of the four types of sample solutions was dropped on the second matrix layer 22. The second matrix layer 22 was dissolved by dripping. Thereafter, the sample-containing layer 23 was formed on the sample plate 111 by natural drying as shown in FIG. Next, in step S109, 0.5 μl of the additive solution was dropped on the sample-containing layer 23. The sample-containing layer 23 was dissolved by dropping. Thereafter, the sample additive-containing layer 24 was formed on the sample plate 111 by natural drying, as shown in FIG. 7, and the mass spectrometry sample according to the first example was obtained.

得られた質量分析サンプルを、株式会社島津製作所製の四重極イオントラップ型MALDI-TOF-MS装置で質量分析した。MALDI-TOF-MS装置の測定パラメータは、チューニングモードをネガティブに、スペクトルデータの取り込み周期を5Hzに設定した。またサンプル添加剤含有層24に照射するレーザの照射強度を調節するパラメータであるパワーを115〜120（無単位）に、スペクトルデータの積算数を200に、レーザのショット回数を2回に、測定レンジを高(High)に設定した。   The obtained mass spectrometry sample was subjected to mass spectrometry using a quadrupole ion trap type MALDI-TOF-MS apparatus manufactured by Shimadzu Corporation. For the measurement parameters of the MALDI-TOF-MS instrument, the tuning mode was set to negative and the spectral data acquisition cycle was set to 5 Hz. In addition, the power, which is a parameter for adjusting the irradiation intensity of the laser irradiating the sample additive-containing layer 24, is set to 115 to 120 (no unit), the cumulative number of spectrum data is set to 200, and the number of laser shots is measured to 2 times. The range was set to High.

図8はサンプル溶液中の有機合成RNAの濃度が50×10-9mol/lであり、サンプルプレート111上における有機合成RNAの全物質量が25×10-15molである場合のマススペクトルを示す。図9はサンプル溶液中の有機合成RNAの濃度が25×10-9mol/lであり、サンプルプレート111上における有機合成RNAの全物質量が12.5×10-15molである場合のマススペクトルを示す。図10はサンプル溶液中の有機合成RNAの濃度が12.5×10-9mol/lであり、サンプルプレート111上における有機合成RNAの全物質量が6.25×10-15molである場合のマススペクトルを示す。図11はサンプル溶液中の有機合成RNAの濃度が6.25×10-9mol/lであり、サンプルプレート111上における有機合成RNAの全物質量が3.13×10-15molである場合のマススペクトルを示す。 Figure 8 shows the mass spectrum when the concentration of organic synthetic RNA in the sample solution is 50 x 10 -9 mol / l and the total amount of organic synthetic RNA on the sample plate 111 is 25 x 10 -15 mol. Show. Figure 9 shows the mass spectrum when the concentration of organic synthetic RNA in the sample solution is 25 x 10 -9 mol / l and the total amount of organic synthetic RNA on the sample plate 111 is 12.5 x 10 -15 mol. Show. Figure 10 shows the mass spectrum when the concentration of organic synthetic RNA in the sample solution is 12.5 × 10 -9 mol / l and the total amount of organic synthetic RNA on the sample plate 111 is 6.25 × 10 -15 mol. Show. Figure 11 shows the mass spectrum when the concentration of organic synthetic RNA in the sample solution is 6.25 × 10 -9 mol / l and the total amount of organic synthetic RNA on the sample plate 111 is 3.13 × 10 -15 mol. Show.

図8乃至図11に示すマススペクトルの質量電荷比(m/z)が5,925の位置に、有機合成RNAの1価のプロトン脱離イオンを示すピークが観察された。さらに図11に示すように、サンプルプレート111上における有機合成RNAの全物質量が3.13×10-15molであっても、有機合成RNAの1価のプロトン脱離イオンのピークはSN比5以上で観察可能であった。また図8乃至図10に示すように、マススペクトルの質量電荷比が2,962の位置に、有機合成RNAの2価のプロトン脱離イオンが観察された。図10に示すように、サンプルプレート111上における有機合成RNAの全物質量が6.25×10-15molであっても、有機合成RNAの2価のプロトン脱離イオンのピークはSN比5以上で観察可能であった。 A peak indicating a monovalent proton desorption ion of organic synthetic RNA was observed at a position where the mass to charge ratio (m / z) of the mass spectrum shown in FIGS. 8 to 11 was 5,925. Furthermore, as shown in FIG. 11, even if the total amount of organic synthetic RNA on the sample plate 111 is 3.13 × 10 -15 mol, the peak of monovalent proton desorption ions of organic synthetic RNA is SN ratio 5 or more. It was observable. Further, as shown in FIGS. 8 to 10, divalent proton desorption ions of organic synthetic RNA were observed at the position where the mass-to-charge ratio of the mass spectrum was 2,962. As shown in FIG. 10, even when the total amount of organic synthetic RNA on the sample plate 111 is 6.25 × 10 -15 mol, the divalent proton desorption ion peak of the organic synthetic RNA has an SN ratio of 5 or more. It was observable.

従来、MALDI-TOF-MS法で検出可能なRNAの物質量の下限は50×10-15mol程度であるとされていた。これに対し、第1の実施例に係る質量分析サンプルの調整法によれば、従来と比較して1/16の物質量のRNAを高い感度で検出可能であることが示された。また従来、MALDI-TOF-MS法では2価のプロトン脱離イオンを検出するのは困難であるとされていた。これに対し、第1の実施例に係る質量分析サンプルの調整法によれば、RNAの2価のプロトン脱離イオンも高い感度で検出可能であることが示された。2価のプロトン脱離イオンは、1価のプロトン脱離イオンと比較して質量電荷比が半分である。したがって2価のプロトン脱離イオンが検出可能となることにより、MALDI-TOF-MS法で高分子を検出することも可能となる。 Conventionally, the lower limit of the amount of RNA substance detectable by the MALDI-TOF-MS method was supposed to be about 50 × 10 −15 mol. On the other hand, according to the method for preparing a mass spectrometry sample according to the first example, it was shown that RNA having a substance amount of 1/16 can be detected with high sensitivity as compared with the conventional method. Conventionally, it has been difficult to detect divalent proton desorption ions by the MALDI-TOF-MS method. On the other hand, according to the method for preparing a mass spectrometry sample according to the first example, it was shown that divalent proton desorption ions of RNA can be detected with high sensitivity. A divalent proton desorption ion has a mass-to-charge ratio of half that of a monovalent proton desorption ion. Therefore, it becomes possible to detect a polymer by the MALDI-TOF-MS method by detecting divalent proton desorption ions.

（第2の実施例）
超純水を溶媒とし、3-ヒドロキシピコリン酸を50mg/ml、25mg/ml及び10mg/mlのそれぞれの濃度で、アセトニトリルを50%(v/v)、25%(v/v)及び10%(v/v)のそれぞれの濃度で含む9種のマトリックス溶液を調整した。また超純水を溶媒とし、クエン酸アンモニウムの濃度が50mg/ml、25mg/ml及び10mg/mlの3種の添加剤溶液を調整した。なお9種のマトリックス溶液及び3種の添加剤溶液のそれぞれは、体積濃度0.1%(v/v)でトリフルオロ酢酸を含む。 (Second embodiment)
Using ultrapure water as a solvent, 3-hydroxypicolinic acid at concentrations of 50 mg / ml, 25 mg / ml and 10 mg / ml, respectively, acetonitrile 50% (v / v), 25% (v / v) and 10% Nine matrix solutions containing each concentration (v / v) were prepared. In addition, three kinds of additive solutions having ultrapure water as a solvent and ammonium citrate concentrations of 50 mg / ml, 25 mg / ml and 10 mg / ml were prepared. Each of the nine matrix solutions and the three additive solutions contains trifluoroacetic acid at a volume concentration of 0.1% (v / v).

次に配列がAUCAUCAUCAUCAUCGの16塩基有機合成RNA、配列がAUCAUCAUCAUCAUCAUCGの19塩基有機合成RNA、及び配列がpUGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGUの23塩基有機合成RNAを準備した。次に16塩基有機合成RNA、19塩基有機合成RNA、及び23塩基有機合成RNAをそれぞれ濃度が50×10-9mol/lとなるよう同一の超純水に溶解させ、サンプル溶液の原液を得た。さらにサンプル溶液の原液を希釈し、16塩基有機合成RNA、19塩基有機合成RNA、及び23塩基有機合成RNAのそれぞれ濃度が50×10-9mol/l、25×10-9mol/l、12.5×10-9mol/l及び6.25×10-9mol/lの4種類のサンプル溶液を得た。 Next, 16-base organic synthetic RNA having the sequence AUCAUCAUCAUCAUCG, 19-base organic synthetic RNA having the sequence AUCAUCAUCAUCAUCAUCG, and 23-base organic synthetic RNA having the sequence pUGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU were prepared. Next, 16-base organic synthetic RNA, 19-base organic synthetic RNA, and 23-base organic synthetic RNA are each dissolved in the same ultrapure water so that the concentration is 50 × 10 -9 mol / l to obtain a stock solution of the sample solution. It was. Furthermore, dilute the stock solution of the sample solution, and the concentrations of 16 base organic synthetic RNA, 19 base organic synthetic RNA, and 23 base organic synthetic RNA are 50 × 10 -9 mol / l, 25 × 10 -9 mol / l, 12.5 Four types of sample solutions of × 10 -9 mol / l and 6.25 × 10 -9 mol / l were obtained.

その後、9種類のマトリックス溶液、4種類のサンプル溶液、及び3種の添加剤溶液の組み合わせを用いて、第1の実施例に係る質量分析サンプルの調製方法と同様に第2の実施例に係る質量分析サンプルを調整した。なお一つの質量分析サンプルを調製する際に使用したサンプル溶液は0.5μlである。そして第1の実施例と同じ条件を用いて第2の実施例に係る質量分析サンプルを四重極イオントラップ型MALDI-TOF-MS装置で分析した。   Then, using a combination of 9 types of matrix solutions, 4 types of sample solutions, and 3 types of additive solutions, the method according to the second example is similar to the method for preparing the mass spectrometry sample according to the first example. A mass spectrometry sample was prepared. The sample solution used for preparing one mass spectrometry sample is 0.5 μl. The mass spectrometry sample according to the second example was analyzed with a quadrupole ion trap type MALDI-TOF-MS apparatus using the same conditions as in the first example.

図12に示すように、マトリックス溶液におけるアセトニトリルの濃度が10%(v/v)である場合、マトリックス溶液における3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が25mg/ml及び50mg/ml、添加剤溶液におけるクエン酸アンモニウムの濃度が10mg/ml、25mg/ml及び50mg/mlの時に、サンプルプレート上のRNAの全物質量が6.25×10-15molであってもRNAの1価のプロトン脱離イオンを示すピークをSN比3以上で検出可能であった。 As shown in FIG. 12, when the concentration of acetonitrile in the matrix solution is 10% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid in the matrix solution is 25 mg / ml and 50 mg / ml, and citric acid in the additive solution When ammonium concentration is 10 mg / ml, 25 mg / ml, and 50 mg / ml, the peak that shows monovalent proton desorption ions of RNA even if the total amount of RNA on the sample plate is 6.25 × 10 -15 mol Was detectable with an SN ratio of 3 or higher.

図13はアセトニトリルの濃度が10%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が25mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が10mg/mlの時のマススペクトルである。図14はアセトニトリルの濃度が10%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が25mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が25mg/mlの時のマススペクトルである。図15はアセトニトリルの濃度が10%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が25mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が50mg/mlの時のマススペクトルである。   FIG. 13 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 10% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 25 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 10 mg / ml. FIG. 14 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 10% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 25 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 25 mg / ml. FIG. 15 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 10% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 25 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 50 mg / ml.

図16はアセトニトリルの濃度が10%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が50mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が10mg/mlの時のマススペクトルである。図17はアセトニトリルの濃度が10%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が50mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が25mg/mlの時のマススペクトルである。図18はアセトニトリルの濃度が10%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が50mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が50mg/mlの時のマススペクトルである。図13乃至図18に示すマススペクトルのいずれにおいても、19塩基有機合成RNA及び16塩基有機合成RNAのそれぞれの1価のプロトン脱離イオンを示すピークが観察されている。   FIG. 16 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 10% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 50 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 10 mg / ml. FIG. 17 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 10% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 50 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 25 mg / ml. FIG. 18 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 10% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 50 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 50 mg / ml. In any of the mass spectra shown in FIGS. 13 to 18, peaks indicating monovalent proton desorption ions of 19-base organic synthetic RNA and 16-base organic synthetic RNA are observed.

また図12、図13、図16に示すように、マトリックス溶液におけるアセトニトリルの濃度が10%(v/v)、添加剤溶液におけるクエン酸アンモニウムの濃度が10mg/mlである場合、マトリックス溶液における3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が10mg/ml、25mg/ml及び50mg/mlの時に、サンプルプレート上のRNAの全物質量が6.25×10-15molであってもRNAの1価のプロトン脱離イオンを示すピークをSN比3以上で検出可能であった。 Also, as shown in FIGS. 12, 13, and 16, when the concentration of acetonitrile in the matrix solution is 10% (v / v) and the concentration of ammonium citrate in the additive solution is 10 mg / ml, 3 in the matrix solution -When the concentration of hydroxypicolinic acid is 10 mg / ml, 25 mg / ml, and 50 mg / ml, the monovalent proton desorption ions of RNA even if the total amount of RNA on the sample plate is 6.25 × 10 -15 mol It was possible to detect a peak with a SN ratio of 3 or more.

図19はアセトニトリルの濃度が10%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が10mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が10mg/mlの時のマススペクトルである。図13、図16、図19に示すマススペクトルのいずれにおいても、19塩基有機合成RNA及び16塩基有機合成RNAのそれぞれの1価のプロトン脱離イオンを示すピークが観察されている。   FIG. 19 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 10% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 10 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 10 mg / ml. In any of the mass spectra shown in FIG. 13, FIG. 16, and FIG. 19, peaks indicating monovalent proton desorption ions of 19-base organic synthetic RNA and 16-base organic synthetic RNA are observed.

また図12、図13、図14、図15に示すように、マトリックス溶液における3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が25mg/ml、アセトニトリルの濃度が10%(v/v)である場合、添加剤溶液におけるクエン酸アンモニウムの濃度が10mg/ml、25mg/ml、50mg/mlの時に、サンプルプレート上のRNAの全物質量が6.25×10-15molであってもRNAの1価のプロトン脱離イオンを示すピークをSN比3以上で検出可能であった。 Also, as shown in FIG. 12, FIG. 13, FIG. 14 and FIG. 15, when the concentration of 3-hydroxypicolinic acid in the matrix solution is 25 mg / ml and the concentration of acetonitrile is 10% (v / v), the additive solution Monovalent proton desorption ions of RNA even when the total amount of RNA on the sample plate is 6.25 × 10 -15 mol when the concentration of ammonium citrate is 10 mg / ml, 25 mg / ml, or 50 mg / ml It was possible to detect a peak with a SN ratio of 3 or more.

またマトリックス溶液における3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が25mg/ml、添加剤溶液におけるクエン酸アンモニウムの濃度が10mg/mlである場合、マトリックス溶液におけるアセトニトリルの濃度が10%(v/v)及び25%(v/v)の時に、サンプルプレート上のRNAの全物質量が6.25×10-15molであってもRNAの1価のプロトン脱離イオンを示すピークをSN比3以上で検出可能であった。図20はアセトニトリルの濃度が25%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が25mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が10mg/mlの時のマススペクトルである。図13、図14、図15、図20に示すマススペクトルのいずれにおいても、19塩基有機合成RNA及び16塩基有機合成RNAのそれぞれの1価のプロトン脱離イオンを示すピークが観察されている。 Also, when the concentration of 3-hydroxypicolinic acid in the matrix solution is 25 mg / ml and the concentration of ammonium citrate in the additive solution is 10 mg / ml, the concentration of acetonitrile in the matrix solution is 10% (v / v) and 25% (v / v), even if the total amount of RNA on the sample plate is 6.25 x 10 -15 mol, a peak indicating monovalent proton desorption ions of RNA can be detected with an SN ratio of 3 or more. It was. FIG. 20 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 25% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 25 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 10 mg / ml. In any of the mass spectra shown in FIG. 13, FIG. 14, FIG. 15, and FIG. 20, peaks indicating monovalent proton desorption ions of 19-base organic synthetic RNA and 16-base organic synthetic RNA are observed.

次に図12、図13、図14に示すように、マトリックス溶液における3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が25mg/ml、アセトニトリルの濃度が10%(v/v)である場合、添加剤溶液におけるクエン酸アンモニウムの濃度が10mg/ml及び25mg/mlの時に、サンプルプレート上のRNAの全物質量が3.13×10-15molであってもRNAの1価のプロトン脱離イオンをSN比3以上で検出可能であった。 Next, as shown in FIGS. 12, 13, and 14, when the concentration of 3-hydroxypicolinic acid in the matrix solution is 25 mg / ml and the concentration of acetonitrile is 10% (v / v), the quencher in the additive solution When the concentration of ammonium acid is 10 mg / ml and 25 mg / ml, the monovalent proton desorption ions of RNA are not less than 3 SN ratio even if the total amount of RNA on the sample plate is 3.13 × 10 -15 mol. It was detectable.

また図12、図13、図19に示すように、マトリックス溶液におけるアセトニトリルの濃度が10%(v/v)、添加剤溶液におけるクエン酸アンモニウムの濃度が10mg/mlである場合、マトリックス溶液における3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が10mg/ml及び25mg/mlの時に、サンプルプレート上のRNAの全物質量が3.13×10-15molであってもRNAの1価のプロトン脱離イオンを示すピークをSN比3以上で検出可能であった。 As shown in FIGS. 12, 13, and 19, when the concentration of acetonitrile in the matrix solution is 10% (v / v) and the concentration of ammonium citrate in the additive solution is 10 mg / ml, 3 in the matrix solution -When the concentration of hydroxypicolinic acid is 10 mg / ml and 25 mg / ml, a peak indicating monovalent proton desorption ions of RNA is observed even if the total amount of RNA on the sample plate is 3.13 x 10 -15 mol. Detection was possible with an SN ratio of 3 or higher.

また図12に示すように、マトリックス溶液における3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が10mg/ml、アセトニトリルの濃度が50%(v/v)である場合、添加剤溶液におけるクエン酸アンモニウムの濃度が10mg/mlの時に、サンプルプレート上のRNAの全物質量が3.13×10-15molであってもRNAの1価のプロトン脱離イオンを示すピークをSN比3以上で検出可能であった。図21はアセトニトリルの濃度が50%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が10mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が10mg/mlの時のマススペクトルである。 Also, as shown in FIG. 12, when the concentration of 3-hydroxypicolinic acid in the matrix solution is 10 mg / ml and the concentration of acetonitrile is 50% (v / v), the concentration of ammonium citrate in the additive solution is 10 mg / ml. In the case of ml, even when the total amount of RNA on the sample plate was 3.13 × 10 −15 mol, a peak showing monovalent proton desorption ions of RNA could be detected with an SN ratio of 3 or more. FIG. 21 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 50% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 10 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 10 mg / ml.

次に図12、図13、図14に示すように、マトリックス溶液における3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が25mg/ml、アセトニトリルの濃度が10%(v/v)である場合、添加剤溶液におけるクエン酸アンモニウムの濃度が10mg/ml及び25mg/mlの時に、サンプルプレート上のRNAの全物質量が6.25×10-15molであってもRNAの2価のプロトン脱離イオンを示すピークをSN比3以上で検出可能であった。 Next, as shown in FIGS. 12, 13, and 14, when the concentration of 3-hydroxypicolinic acid in the matrix solution is 25 mg / ml and the concentration of acetonitrile is 10% (v / v), the quencher in the additive solution When the ammonium acid concentration is 10 mg / ml and 25 mg / ml, even if the total amount of RNA on the sample plate is 6.25 × 10 -15 mol, the peak indicating the divalent proton desorption ion of RNA is shown in the SN ratio. It was detectable at 3 or more.

図12に示すように、他の条件では6.25fmol以下のRNAを検出することはできなかった。図22はアセトニトリルの濃度が10%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が10mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が25mg/mlの時のマススペクトルである。図23はアセトニトリルの濃度が10%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が10mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が50mg/mlの時のマススペクトルである。図24はアセトニトリルの濃度が25%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が10mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が50mg/mlの時のマススペクトルである。図25はアセトニトリルの濃度が25%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が50mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が50mg/mlの時のマススペクトルである。図26はアセトニトリルの濃度が50%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が10mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が25mg/mlの時のマススペクトルである。図27はアセトニトリルの濃度が50%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が10mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が50mg/mlの時のマススペクトルである。図22乃至図27に示すマススペクトルを与える条件では、25fmolのRNAも検出できなかった。   As shown in FIG. 12, RNA under 6.25 fmol could not be detected under other conditions. FIG. 22 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 10% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 10 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 25 mg / ml. FIG. 23 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 10% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 10 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 50 mg / ml. FIG. 24 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 25% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 10 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 50 mg / ml. FIG. 25 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 25% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 50 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 50 mg / ml. FIG. 26 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 50% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 10 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 25 mg / ml. FIG. 27 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 50% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 10 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 50 mg / ml. Under the conditions giving the mass spectra shown in FIGS. 22 to 27, 25 fmol RNA could not be detected.

図28はアセトニトリルの濃度が25%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が10mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が25mg/mlの時のマススペクトルである。図29はアセトニトリルの濃度が25%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が25mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が50mg/mlの時のマススペクトルである。図30はアセトニトリルの濃度が25%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が50mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が10mg/mlの時のマススペクトルである。図31はアセトニトリルの濃度が50%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が25mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が10mg/mlの時のマススペクトルである。図32はアセトニトリルの濃度が50%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が25mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が25mg/mlの時のマススペクトルである。図33はアセトニトリルの濃度が50%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が50mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が10mg/mlの時のマススペクトルである。図28乃至図33に示すマススペクトルを与える条件では、25fmolのRNAは検出できたが、12.5fmolのRNAを検出できなかった。   FIG. 28 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 25% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 10 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 25 mg / ml. FIG. 29 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 25% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 25 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 50 mg / ml. FIG. 30 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 25% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 50 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 10 mg / ml. FIG. 31 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 50% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 25 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 10 mg / ml. FIG. 32 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 50% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 25 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 25 mg / ml. FIG. 33 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 50% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 50 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 10 mg / ml. Under the conditions giving the mass spectrum shown in FIGS. 28 to 33, 25 fmol RNA could be detected, but 12.5 fmol RNA could not be detected.

図34はアセトニトリルの濃度が25%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が10mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が10mg/mlの時のマススペクトルである。図35はアセトニトリルの濃度が25%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が25mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が25mg/mlの時のマススペクトルである。図36はアセトニトリルの濃度が25%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が50mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が25mg/mlの時のマススペクトルである。図37はアセトニトリルの濃度が50%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が25mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が50mg/mlの時のマススペクトルである。図38はアセトニトリルの濃度が50%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が50mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が25mg/mlの時のマススペクトルである。図39はアセトニトリルの濃度が50%(v/v)、3-ヒドロキシピコリン酸の濃度が50mg/ml、クエン酸アンモニウムの濃度が50mg/mlの時のマススペクトルである。図34乃至図39に示すマススペクトルを与える条件では、12.5fmolのRNAは検出できたが、6.25fmolのRNAを検出できなかった。   FIG. 34 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 25% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 10 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 10 mg / ml. FIG. 35 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 25% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 25 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 25 mg / ml. FIG. 36 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 25% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 50 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 25 mg / ml. FIG. 37 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 50% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 25 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 50 mg / ml. FIG. 38 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 50% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 50 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 25 mg / ml. FIG. 39 is a mass spectrum when the concentration of acetonitrile is 50% (v / v), the concentration of 3-hydroxypicolinic acid is 50 mg / ml, and the concentration of ammonium citrate is 50 mg / ml. Under the conditions giving the mass spectrum shown in FIGS. 34 to 39, 12.5 fmol RNA could be detected, but 6.25 fmol RNA could not be detected.

（第3の実施例）
第1の実施例と同じサンプル溶液及び添加剤溶液を準備した。次に第1の実施例と同じ有機合成された19塩基RNAを超純水で溶解し、19塩基RNAの濃度が1,000×10-9mol/l、500×10-9mol/l、100×10-9mol/l、50×10-9mol/l、25×10-9mol/l、12.5×10-9mol/l、及び6.25×10-9mol/lの7種類のサンプル溶液を調製した。その後、第1の実施例と同様にサンプルプレート上に第1マトリックス層、第2マトリックス層、サンプル層、及び添加剤層を形成し、第3の実施例に係る質量分析サンプルを得た。 (Third embodiment)
The same sample solution and additive solution as in the first example were prepared. Next, 19 base RNA synthesized in the same manner as in the first example was dissolved in ultrapure water, and the concentration of 19 base RNA was 1,000 × 10 −9 mol / l, 500 × 10 −9 mol / l, 100 × Seven sample solutions of 10 -9 mol / l, 50 × 10 -9 mol / l, 25 × 10 -9 mol / l, 12.5 × 10 -9 mol / l, and 6.25 × 10 -9 mol / l Prepared. Thereafter, the first matrix layer, the second matrix layer, the sample layer, and the additive layer were formed on the sample plate in the same manner as in the first example, and the mass spectrometry sample according to the third example was obtained.

第1の実施例と同じ条件を用いて第3の実施例に係る質量分析サンプルを四重極イオントラップ型MALDI-TOF-MS装置で分析した。図40は、サンプルプレート上の19塩基RNAの全物質量が500×10-15molの時のマススペクトルである。図41は、サンプルプレート上の19塩基RNAの全物質量が250×10-15molの時のマススペクトルである。図42は、サンプルプレート上の19塩基RNAの全物質量が50×10-15molの時のマススペクトルである。図43は、サンプルプレート上の19塩基RNAの全物質量が25×10-15molの時のマススペクトルである。図44は、サンプルプレート上の19塩基RNAの全物質量が12.5×10-15molの時のマススペクトルである。図45は、サンプルプレート上の19塩基RNAの全物質量が6.25×10-15molの時のマススペクトルである。図46は、サンプルプレート上の19塩基RNAの全物質量が3.13×10-15molの時のマススペクトルである。 Using the same conditions as in the first example, the mass spectrometry sample according to the third example was analyzed with a quadrupole ion trap MALDI-TOF-MS apparatus. FIG. 40 is a mass spectrum when the total amount of 19-base RNA on the sample plate is 500 × 10 −15 mol. FIG. 41 is a mass spectrum when the total amount of 19-base RNA on the sample plate is 250 × 10 −15 mol. FIG. 42 is a mass spectrum when the total amount of 19-base RNA on the sample plate is 50 × 10 −15 mol. FIG. 43 is a mass spectrum when the total amount of 19-base RNA on the sample plate is 25 × 10 −15 mol. FIG. 44 is a mass spectrum when the total amount of 19-base RNA on the sample plate is 12.5 × 10 −15 mol. FIG. 45 is a mass spectrum when the total amount of 19-base RNA on the sample plate is 6.25 × 10 −15 mol. FIG. 46 is a mass spectrum when the total amount of 19-base RNA on the sample plate is 3.13 × 10 −15 mol.

図40乃至図46に示すように、19塩基RNAのイオンは全質量が500×10-15乃至3.13×10-15molのいずれの場合であっても検出可能であった。よって実施の形態に係る質量分析方法の再現性が検証された。 As shown in FIGS. 40 to 46, the 19-base RNA ions were detectable even when the total mass was 500 × 10 −15 to 3.13 × 10 −15 mol. Therefore, the reproducibility of the mass spectrometry method according to the embodiment was verified.

（第1の比較例）
まずアセトニトリルを体積濃度が25%(v/v)となるよう超純水で希釈した。次に希釈されたアセトニトリルにクエン酸アンモニウムを濃度が50×10-3mol/lとなるように加え、さらに3-ヒドロキシピコリン酸を飽和するまで加えて、第1の比較例に係るマトリックス溶液を得た。次に第1の比較例に係るマトリックス溶液をサンプルプレート上に0.5μl滴下して乾燥させ、第1の比較例に係る結晶マトリックス層を形成させた。その後、第3の実施例と同様に調製された0.5μlのサンプル溶液をマトリックス層上に滴下し乾燥させて、第1の比較例に係る質量分析サンプルを得た。 (First comparative example)
First, acetonitrile was diluted with ultrapure water to a volume concentration of 25% (v / v). Next, ammonium citrate is added to the diluted acetonitrile so that the concentration becomes 50 × 10 −3 mol / l, and further, 3-hydroxypicolinic acid is added until saturation, and the matrix solution according to the first comparative example is added. Obtained. Next, 0.5 μl of the matrix solution according to the first comparative example was dropped on the sample plate and dried to form a crystal matrix layer according to the first comparative example. Thereafter, 0.5 μl of the sample solution prepared in the same manner as in the third example was dropped on the matrix layer and dried to obtain a mass spectrometry sample according to the first comparative example.

第1の実施例と同じ条件を用いて第1の比較例に係る質量分析サンプルを四重極イオントラップ型MALDI-TOF-MS装置で分析した。すると図47、図48、図49に示すように、サンプルプレート上の19塩基RNAの全物質量が500×10-15mol、250×10-15mol及び50×10-15molの場合、19塩基RNAのイオンは検出可能であった。しかし図50に示すように、サンプルプレート上の19塩基RNAの全物質量が25×10-15molの場合、19塩基RNAのイオンを示すピークはノイズに埋もれた。したがってマトリックスに3-ヒドロキシピコリン酸を用いても、第1の実施例に係る質量分析サンプルの調製方法に従わなければ、50×10-15mol未満の極微量のRNAを検出することは不可能であることが示された。 The mass spectrometry sample according to the first comparative example was analyzed with a quadrupole ion trap MALDI-TOF-MS apparatus using the same conditions as in the first example. Then, as shown in FIG. 47, FIG. 48, FIG. 49, when the total amount of 19 base RNA on the sample plate is 500 × 10 −15 mol, 250 × 10 −15 mol, and 50 × 10 −15 mol, Base RNA ions were detectable. However, as shown in FIG. 50, when the total amount of 19-base RNA on the sample plate was 25 × 10 −15 mol, the peak indicating the 19-base RNA ion was buried in noise. Therefore, even if 3-hydroxypicolinic acid is used for the matrix, it is impossible to detect a trace amount of RNA of less than 50 x 10 -15 mol unless the mass spectrometry sample preparation method according to the first example is followed. It was shown that.

（第2の比較例）
まず濃度が100%のアセトニトリルに2,4,6-トリヒドロキシアセトフェノン（フルカ社）を濃度が250×10-3mol/lとなるように加え、第2の比較例に係るマトリックス溶液を得た。次にクエン酸アンモニウムを濃度が300×10-3mol/lとなるよう超純水で溶解し、第2の比較例に係る添加剤溶液を得た。その後、マトリックス溶液と添加剤溶液とを1:1の割合で混合して第1の混合液を得た。さらに第1の混合液と第3の実施例と同じサンプル溶液とを1:1で混合し、第2の混合液を得た。その後、サンプルプレート上に第2の比較例に係るマトリックス溶液を0.5μl滴下して乾燥させ、第2の比較例に係る結晶マトリックス層を形成させた。さらに結晶マトリックス層上に1μlの第2の混合液を滴下し乾燥させて、第2の比較例に係る質量分析サンプルを得た。 (Second comparative example)
First, 2,4,6-trihydroxyacetophenone (Fluka) was added to acetonitrile with a concentration of 100% so that the concentration was 250 × 10 −3 mol / l, and a matrix solution according to the second comparative example was obtained. . Next, ammonium citrate was dissolved in ultrapure water so as to have a concentration of 300 × 10 −3 mol / l to obtain an additive solution according to the second comparative example. Thereafter, the matrix solution and the additive solution were mixed at a ratio of 1: 1 to obtain a first mixed solution. Further, the first mixed solution and the same sample solution as in the third example were mixed 1: 1 to obtain a second mixed solution. Thereafter, 0.5 μl of the matrix solution according to the second comparative example was dropped on the sample plate and dried to form a crystal matrix layer according to the second comparative example. Further, 1 μl of the second mixed solution was dropped onto the crystal matrix layer and dried to obtain a mass spectrometry sample according to the second comparative example.

第1の実施例と同じ条件を用いて第2の比較例に係る質量分析サンプルを四重極イオントラップ型MALDI-TOF-MS装置で分析した。すると図51、図52、図53に示すように、サンプルプレート上の19塩基RNAの全物質量が500×10-15mol、250×10-15mol及び50×10-15molの場合、19塩基RNAのイオンは検出可能であった。しかし図54に示すように、サンプルプレート上の19塩基RNAの全物質量が25×10-15molの場合、19塩基RNAのイオンを示すピークはノイズに埋もれた。したがってマトリックスとして2,4,6-トリヒドロキシアセトフェノンを用いる従来の方法では、50×10-15mol未満の極微量のRNAを検出することは不可能であることが示された。 The mass spectrometry sample according to the second comparative example was analyzed with a quadrupole ion trap type MALDI-TOF-MS apparatus using the same conditions as in the first example. Then, as shown in FIG. 51, FIG. 52, and FIG. 53, when the total amount of 19-base RNA on the sample plate is 500 × 10 −15 mol, 250 × 10 −15 mol, and 50 × 10 −15 mol, Base RNA ions were detectable. However, as shown in FIG. 54, when the total amount of 19-base RNA on the sample plate was 25 × 10 −15 mol, the peak indicating 19-base RNA ions was buried in noise. Therefore, it was shown that the conventional method using 2,4,6-trihydroxyacetophenone as a matrix cannot detect a trace amount of RNA of less than 50 × 10 −15 mol.

（第4の実施例）
配列がAUCAUCAUCGの有機合成RNAを超純水で溶解し、有機合成RNAの濃度が1×10-6mol/lのサンプル溶液を調製した。また第1の実施例と同じマトリックス溶液とサンプル溶液を調製した。次に第1の実施例に係る質量分析サンプルの調製方法と同様に質量分析サンプルを調製した。なおサンプル溶液を0.5μl滴下したので、サンプルプレート上の有機合成RNAの全物質量は500×10-15molであった。その後、質量分析サンプルを、株式会社島津製作所製の四重極イオントラップ型MALDI-TOF-MS装置でMS/MS分析した。なおプリカーサイオンの開裂にはアルゴンガスを用いた。MALDI-TOF-MS装置の測定パラメータは、チューニングモードをネガティブに、スペクトルデータの取り込み周期を5Hzに設定した。またレーザの照射強度を調節するパラメータを115〜120（無単位）に、スペクトルデータの積算数を200に、レーザのショット回数を2回に、測定レンジを中(Middle)に設定した。またアルゴンガスとプリカーサイオンの衝突エネルギを調節するパラメータであるCIDコントロールを120に設定した。 (Fourth embodiment)
An organic synthetic RNA having the sequence AUCAUCAUCG was dissolved in ultrapure water to prepare a sample solution having an organic synthetic RNA concentration of 1 × 10 −6 mol / l. In addition, the same matrix solution and sample solution as in the first example were prepared. Next, a mass spectrometry sample was prepared in the same manner as the mass spectrometry sample preparation method according to the first example. Since 0.5 μl of the sample solution was dropped, the total amount of organic synthetic RNA on the sample plate was 500 × 10 −15 mol. Thereafter, the mass spectrometry sample was subjected to MS / MS analysis using a quadrupole ion trap type MALDI-TOF-MS apparatus manufactured by Shimadzu Corporation. Argon gas was used for the cleavage of the precursor ion. For the measurement parameters of the MALDI-TOF-MS instrument, the tuning mode was set to negative and the spectral data acquisition cycle was set to 5 Hz. In addition, parameters for adjusting the laser irradiation intensity were set to 115 to 120 (no unit), the number of spectral data integration was set to 200, the number of laser shots was set to 2, and the measurement range was set to middle. The CID control, which is a parameter for adjusting the collision energy between argon gas and precursor ions, was set to 120.

ここで、MSMS分析の結果を説明する前に、例として4塩基B1, B2, B3, B4を含むRNAのリン酸エステル結合の開裂の様式について、図55を参照して説明する。リン酸エステル結合の5'末端側のC-O結合が開裂した場合、5'末端側に「a(n)系列」の断片が生成し、3'末端側に「w(n)系列」の断片が生成する。なおnは断片に残る塩基の数を表す。例えばa(1)系列の断片は1個の塩基B1を含み、w(3)系列の断片は3個の塩基B2, B3, B4を含む。 Here, before explaining the results of MSMS analysis, the mode of cleavage of the phosphate ester bond of RNA containing 4 bases B 1 , B 2 , B 3 , B 4 will be explained as an example with reference to FIG. . When the CO bond on the 5 ′ end side of the phosphate ester bond is cleaved, an “a (n) series” fragment is generated on the 5 ′ end side, and a “w (n) series” fragment is generated on the 3 ′ end side. Generate. N represents the number of bases remaining in the fragment. For example, the a (1) series fragment contains 1 base B 1 and the w (3) series fragment contains 3 bases B 2 , B 3 , B 4 .

リン酸エステル結合の5'末端側のO-P結合が開裂した場合、5'末端側に「b(n)系列」の断片が生成し、3'末端側に「x(n)系列」の断片が生成する。リン酸エステル結合の3'末端側のP-O結合が開裂した場合、5'末端側に「c(n)系列」の断片が生成し、3'末端側に「y(n)系列」の断片が生成する。リン酸エステル結合の3'末端側のO-C結合が開裂した場合、5'末端側に「d(n)系列」の断片が生成し、3'末端側に「z(n)系列」の断片が生成する。   When the OP bond on the 5 ′ end side of the phosphate ester bond is cleaved, a “b (n) series” fragment is generated on the 5 ′ end side, and an “x (n) series” fragment is generated on the 3 ′ end side. Generate. When the PO bond on the 3 ′ end side of the phosphate ester bond is cleaved, a “c (n) series” fragment is generated on the 5 ′ end side, and a “y (n) series” fragment is generated on the 3 ′ end side. Generate. When the OC bond at the 3 ′ end of the phosphate ester bond is cleaved, a “d (n) series” fragment is generated at the 5 ′ end, and a “z (n) series” fragment is generated at the 3 ′ end. Generate.

第4の実施例に係るMSMS分析の結果を説明する。図56に示すマススペクトルの質量電荷比が3,103の位置に、分解されなかった有機合成RNAのプロトン脱離イオン（プリカーサイオン）を示すピークが観察された。またプリカーサイオンが分解されて生成した複数のプロダクトイオンを示すピークが、プリカーサイオンよりも低い質量電荷比の位置に観察された。ピークは、c(3)乃至c(9)系列のプロダクトイオン、及びy(3)乃至y(9)系列のプロダクトイオンを示していることが解析可能であった。よって、プリカーサイオンの塩基配列が未知であった場合でも、プロダクトイオンの質量分析の結果から、プリカーサイオンの塩基配列を決定可能であることが示された。   The result of the MSMS analysis according to the fourth example will be described. A peak indicating proton desorption ions (precursor ions) of organic synthetic RNA that was not decomposed was observed at a position where the mass-to-charge ratio of the mass spectrum shown in FIG. 56 was 3,103. In addition, peaks indicating a plurality of product ions generated by the decomposition of the precursor ions were observed at positions having a lower mass-to-charge ratio than the precursor ions. It was possible to analyze that the peaks indicate product ions of c (3) to c (9) series and product ions of y (3) to y (9) series. Therefore, even when the base sequence of the precursor ion was unknown, the result of mass analysis of the product ion showed that the base sequence of the precursor ion can be determined.

（第5の実施例）
マウスの肝臓細胞から、ホモジナイザを用いたAGPC（acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)法により、 rRNA、tRNA、及びmRNAを含む全RNA(total RNA)を抽出した。次に抽出した全RNAをフィルタ膜（ミリポア社、YM-100)でろ過し、低分子量のRNA画分を粗精製した。さらに低分子量のRNA画分をポリアクリルアミドの濃度が15%(w/v)のゲルに電気泳動させた。その後、20塩基のRNAが泳動される位置のゲルを切り出し、切り出されたゲルを溶出して、miRNAの粗精製画分を得た。次にmiRNAの粗精製画分をエタノールで沈殿させ、沈殿したmiRNAを超純水で溶解することにより、濃度2.4×10-6mol/lでmiRNAを含む第5の実施例に係るサンプル溶液を調製した。また第1の実施例と同じマトリックス溶液と添加剤溶液を調製した。 (Fifth embodiment)
Total RNA (total RNA) containing rRNA, tRNA, and mRNA was extracted from mouse liver cells by AGPC (acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) method using a homogenizer. Next, the extracted total RNA was filtered through a filter membrane (Millipore, YM-100), and the low molecular weight RNA fraction was roughly purified. Further, the RNA fraction having a low molecular weight was electrophoresed on a gel having a polyacrylamide concentration of 15% (w / v). Thereafter, the gel at the position where the 20-base RNA was migrated was cut out, and the cut out gel was eluted to obtain a crude miRNA fraction. Next, the crude purified fraction of miRNA is precipitated with ethanol, and the precipitated miRNA is dissolved in ultrapure water, so that the sample solution according to the fifth example containing miRNA at a concentration of 2.4 × 10 −6 mol / l is prepared. Prepared. The same matrix solution and additive solution as in the first example were prepared.

その後、第1の実施例に係る質量分析サンプルの調製方法と同様に第5の実施例に係る質量分析サンプルを調整し、株式会社島津製作所製の四重極イオントラップ型MALDI-TOF-MS装置で質量分析した。MALDI-TOF-MS装置の測定パラメータは、チューニングモードをネガティブに、スペクトルデータの取り込み周期を5Hzに設定した。またレーザの照射強度を調節するパラメータを115〜120（無単位）に、スペクトルデータの積算数を1000に、レーザのショット回数を2回に、測定レンジを高(High)に設定した。   Thereafter, the mass spectrometry sample according to the fifth embodiment was prepared in the same manner as the mass spectrometry sample preparation method according to the first embodiment, and a quadrupole ion trap type MALDI-TOF-MS apparatus manufactured by Shimadzu Corporation Mass spectrometry. For the measurement parameters of the MALDI-TOF-MS instrument, the tuning mode was set to negative and the spectral data acquisition cycle was set to 5 Hz. In addition, the parameter for adjusting the laser irradiation intensity was set to 115 to 120 (no unit), the number of spectral data integration was set to 1000, the number of laser shots was set to 2, and the measurement range was set to High.

結果として図57に示すように、miRNAに由来する複数のピークが検出された。また質量電荷比が7502.32のピークは配列5'p-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU-OH3'を有するmiR-122aと呼ばれるmiRNAのイオンを示し、質量電荷比が7196.88のピークは3'末端の1塩基が欠損したmiR-122aの変異体のイオンを示し、質量電荷比が6850.28のピークは3'末端の2塩基が欠損したmiR-122aの変異体のイオンを示すことが判明した。第5の実施例より、マウスの臓器から抽出したRNAのMALDI-TOF-MSによる質量分析が可能であることが示された。   As a result, as shown in FIG. 57, a plurality of peaks derived from miRNA were detected. The peak with a mass-to-charge ratio of 7502.32 shows the miR-122a miR ion having the sequence 5'p-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU-OH3 ', and the peak with a mass-to-charge ratio of 7968.88 is a miR- lacking one base at the 3' end The 122a mutant ion was shown, and the peak with a mass-to-charge ratio of 6850.28 was found to indicate the miR-122a mutant ion lacking two bases at the 3 'end. From the fifth example, it was shown that RNA extracted from mouse organs can be subjected to mass spectrometry by MALDI-TOF-MS.

（第6の実施例）
図58に示すフローチャートを参照して、第6の実施例に係る質量分析サンプルの調製方法について説明する。 (Sixth embodiment)
A method for preparing a mass spectrometry sample according to the sixth embodiment will be described with reference to the flowchart shown in FIG.

(a) まずステップS201乃至S204を図2のステップS101乃至S104と同様に実施し、マトリックス溶液及び添加剤溶液を調製した。次に図58のステップS205で配列がAUCAUCAUCAUCAUCAUCGの有機合成RNAを超純水で溶解し、有機合成RNAの濃度がそれぞれ2000×10-9mol/l、1000×10-9mol/l、500×10-9mol/l、100×10-9mol/l、50×10-9mol/l、25×10-9mol/l、12.5×10-9mol/l、6.25×10-9mol/lの7種類のサンプル溶液を調製した。 (a) First, steps S201 to S204 were performed in the same manner as steps S101 to S104 in FIG. 2 to prepare a matrix solution and an additive solution. Next, in step S205 of FIG. 58, the organic synthetic RNA having the sequence AUCAUCAUCAUCAUCAUCG is dissolved in ultrapure water, and the organic synthetic RNA concentrations are 2000 × 10 −9 mol / l, 1000 × 10 −9 mol / l, and 500 ×, respectively. 10 -9 mol / l, 100 × 10 -9 mol / l, 50 × 10 -9 mol / l, 25 × 10 -9 mol / l, 12.5 × 10 -9 mol / l, 6.25 × 10 -9 mol / Seven kinds of sample solutions of l were prepared.

(b) ステップS206でサンプルプレート上に0.5μlのマトリックス溶液を滴下し自然乾燥させて、サンプルプレート上に結晶状のマトリックス層を形成させた。次にステップS207で、マトリックス層上に0.25μlのサンプル溶液を滴下し、直後に0.25μlの添加剤溶液もマトリックス層上に滴下した。滴下によりマトリックス層は溶解した。その後、溶解したマトリックス溶液、サンプル溶液、及び添加剤溶液の混合液を自然乾燥させ、サンプルプレート上にサンプル添加剤含有層を形成させ、第6の実施例に係る質量分析サンプルを得た。   (b) In step S206, 0.5 μl of the matrix solution was dropped on the sample plate and allowed to air dry to form a crystalline matrix layer on the sample plate. Next, in step S207, 0.25 μl of the sample solution was dropped on the matrix layer, and immediately after that, 0.25 μl of the additive solution was also dropped on the matrix layer. The matrix layer was dissolved by dropping. Thereafter, the mixed solution of the dissolved matrix solution, sample solution, and additive solution was naturally dried to form a sample additive-containing layer on the sample plate, and the mass spectrometry sample according to the sixth example was obtained.

第1の実施例と同じ条件を用いて第6の実施例に係る質量分析サンプルを四重極イオントラップ型MALDI-TOF-MS装置で分析した。図59、図60、図61、図62、図63、及び図64に示すように、サンプルプレート上の有機合成RNAの全物質量が500×10-15mol、250×10-15mol、50×10-15mol、25×10-15mol、12.5×10-15mol、6.25×10-15molのいずれの時も、有機合成RNAのイオンは検出可能であった。しかし図65に示すように、サンプルプレート上の有機合成RNAの全物質量が3.13×10-15molの時は、有機合成RNAのイオンを示すピークはノイズに埋もれた。第6の実施例に係る質量分析サンプルの調整方法によって検出可能なRNAの物質量の下限は第1の実施例には及ばなかったものの、従来の質量分析サンプルの調整方法と比較して、なお高い感度でRNAを検出可能であることが示された。第6の実施例に係る質量分析サンプルの調整方法は必要なステップ数が少ないため、実験操作を簡易にすることが可能となった。 Using the same conditions as in the first example, the mass spectrometry sample according to the sixth example was analyzed with a quadrupole ion trap MALDI-TOF-MS apparatus. As shown in FIGS. 59, 60, 61, 62, 63, and 64, the total amount of organic synthetic RNA on the sample plate is 500 × 10 −15 mol, 250 × 10 −15 mol, 50 At any of × 10 -15 mol, 25 × 10 -15 mol, 12.5 × 10 -15 mol, and 6.25 × 10 -15 mol, the organic synthetic RNA ions were detectable. However, as shown in FIG. 65, when the total amount of organic synthetic RNA on the sample plate was 3.13 × 10 −15 mol, the peak indicating the organic synthetic RNA ion was buried in noise. Although the lower limit of the RNA substance amount detectable by the method for preparing a mass spectrometry sample according to the sixth example did not reach that of the first example, compared with the conventional method for preparing a mass spectrometry sample, It was shown that RNA can be detected with high sensitivity. Since the method for preparing a mass spectrometry sample according to the sixth example requires a small number of steps, the experimental operation can be simplified.

（配列表の説明）
本明細書の配列表に記載された配列番号1乃至4は、以下の配列を示す。 (Explanation of sequence listing)
SEQ ID NOs: 1 to 4 described in the sequence listing of the present specification represent the following sequences.

［配列番号 : 1] 第1、第2、及び第6の実施例で用いた有機合成19塩基RNAの塩基配列。 [SEQ ID NO: 1] Base sequence of organic synthetic 19-base RNA used in the first, second and sixth examples.

［配列番号 : 2] 第2の実施例で用いた有機合成16塩基RNAの塩基配列。 [SEQ ID NO: 2] Base sequence of organic synthetic 16-base RNA used in the second example.

［配列番号 : 3] 第2の実施例で用いた有機合成23塩基RNAの塩基配列。 [SEQ ID NO: 3] Base sequence of organic synthetic 23-base RNA used in the second example.

［配列番号 : 4] 第4の実施例で用いた有機合成10塩基RNAの塩基配列。 [SEQ ID NO: 4] The base sequence of the organic synthetic 10-base RNA used in the fourth example.

本明細書において塩基を略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclatureによる略号、あるいは当該分野における慣用略号を用いる。以下に、略号の例を示す。   In the present specification, when a base is represented by an abbreviation, an abbreviation by IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclature or an abbreviation commonly used in the field is used. Examples of abbreviations are shown below.

a : アデニン、t : チミン、g : グアニン、c : シトシン、u:ウラシル。   a: adenine, t: thymine, g: guanine, c: cytosine, u: uracil.

本発明の実施の形態に係るMALDI-TOF-MS装置の模式図である。1 is a schematic diagram of a MALDI-TOF-MS apparatus according to an embodiment of the present invention. 本発明の実施の形態の第１の実施例に係る質量分析サンプルの調製方法を示すフローチャートである。It is a flowchart which shows the preparation method of the mass spectrometry sample which concerns on the 1st Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第１の実施例に係る質量分析サンプルの第１の工程断面図である。It is a 1st process sectional view of a mass spectrometry sample concerning the 1st example of an embodiment of the invention. 本発明の実施の形態の第１の実施例に係る質量分析サンプルの第２の工程断面図である。It is a 2nd process sectional view of a mass spectrometry sample concerning the 1st example of an embodiment of the invention. 本発明の実施の形態の第１の実施例に係る質量分析サンプルの第３の工程断面図である。It is a 3rd process sectional view of a mass spectrometry sample concerning the 1st example of an embodiment of the invention. 本発明の実施の形態の第１の実施例に係る質量分析サンプルの第４の工程断面図である。It is a 4th process sectional view of a mass spectrometry sample concerning the 1st example of an embodiment of the invention. 本発明の実施の形態の第１の実施例に係る質量分析サンプルの第５の工程断面図である。It is a 5th process sectional view of a mass spectrometry sample concerning the 1st example of an embodiment of the invention. 本発明の実施の形態の第１の実施例に係るマススペクトルを示す第１のグラフである。It is a 1st graph which shows the mass spectrum which concerns on the 1st Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第１の実施例に係るマススペクトルを示す第２のグラフである。It is a 2nd graph which shows the mass spectrum which concerns on the 1st Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第１の実施例に係るマススペクトルを示す第３のグラフである。It is a 3rd graph which shows the mass spectrum which concerns on the 1st Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第１の実施例に係るマススペクトルを示す第４のグラフである。It is a 4th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 1st Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係る質量分析の結果を示す表である。It is a table | surface which shows the result of the mass spectrometry which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第１のグラフである。It is a 1st graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第２のグラフである。It is a 2nd graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第３のグラフである。It is a 3rd graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第４のグラフである。It is a 4th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第５のグラフである。It is a 5th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第６のグラフである。It is a 6th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第７のグラフである。It is a 7th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第８のグラフである。It is an 8th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第１０のグラフである。It is a 10th graph which shows a mass spectrum concerning the 2nd example of an embodiment of the invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第１１のグラフである。It is an 11th graph which shows a mass spectrum concerning the 2nd example of an embodiment of the invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第１２のグラフである。It is a 12th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第１３のグラフである。It is a 13th graph which shows the mass spectrum concerning the 2nd example of an embodiment of the invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第１４のグラフである。It is a 14th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第１５のグラフである。It is a 15th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第１６のグラフである。It is a 16th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第１７のグラフである。It is a 17th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第１８のグラフである。It is an 18th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第１９のグラフである。It is a 19th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第２０のグラフである。It is a 20th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第２１のグラフである。It is a 21st graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第２２のグラフである。It is a 22nd graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第２３のグラフである。It is a 23rd graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第９のグラフである。It is a 9th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第２４のグラフである。It is a 24th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第２５のグラフである。It is a 25th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第２６のグラフである。It is a 26th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の実施例に係るマススペクトルを示す第２７のグラフである。It is a 27th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第３の実施例に係るマススペクトルを示す第１のグラフである。It is a 1st graph which shows the mass spectrum which concerns on the 3rd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第３の実施例に係るマススペクトルを示す第２のグラフである。It is a 2nd graph which shows the mass spectrum which concerns on the 3rd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第３の実施例に係るマススペクトルを示す第３のグラフである。It is a 3rd graph which shows the mass spectrum which concerns on the 3rd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第３の実施例に係るマススペクトルを示す第４のグラフである。It is a 4th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 3rd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第３の実施例に係るマススペクトルを示す第５のグラフである。It is a 5th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 3rd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第３の実施例に係るマススペクトルを示す第６のグラフである。It is a 6th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 3rd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第３の実施例に係るマススペクトルを示す第７のグラフである。It is a 7th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 3rd Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第１の比較例に係るマススペクトルを示す第１のグラフである。It is a 1st graph which shows the mass spectrum which concerns on the 1st comparative example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第１の比較例に係るマススペクトルを示す第２のグラフである。It is a 2nd graph which shows the mass spectrum which concerns on the 1st comparative example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第１の比較例に係るマススペクトルを示す第３のグラフである。It is a 3rd graph which shows the mass spectrum which concerns on the 1st comparative example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第１の比較例に係るマススペクトルを示す第４のグラフである。It is a 4th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 1st comparative example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の比較例に係るマススペクトルを示す第１のグラフである。It is a 1st graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd comparative example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の比較例に係るマススペクトルを示す第２のグラフである。It is a 2nd graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd comparative example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の比較例に係るマススペクトルを示す第３のグラフである。It is a 3rd graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd comparative example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第２の比較例に係るマススペクトルを示す第４のグラフである。It is a 4th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 2nd comparative example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第４の実施例に係るリン酸エステル結合の開裂の様式を説明する模式図である。It is a schematic diagram explaining the mode of cleavage of the phosphate ester bond which concerns on 4th Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第４の実施例に係るマススペクトルを示すグラフである。It is a graph which shows the mass spectrum which concerns on the 4th Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第５の実施例に係るマススペクトルを示すグラフである。It is a graph which shows the mass spectrum which concerns on the 5th Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第６の実施例に係る質量分析サンプルの調製方法を示すフローチャートである。It is a flowchart which shows the preparation method of the mass spectrometry sample which concerns on the 6th Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第６の実施例に係るマススペクトルを示す第１のグラフである。It is a 1st graph which shows the mass spectrum which concerns on the 6th Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第６の実施例に係るマススペクトルを示す第２のグラフである。It is a 2nd graph which shows the mass spectrum which concerns on the 6th Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第６の実施例に係るマススペクトルを示す第３のグラフである。It is a 3rd graph which shows the mass spectrum which concerns on the 6th Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第６の実施例に係るマススペクトルを示す第４のグラフである。It is a 4th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 6th Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第６の実施例に係るマススペクトルを示す第５のグラフである。It is a 5th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 6th Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第６の実施例に係るマススペクトルを示す第６のグラフである。It is a 6th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 6th Example of embodiment of this invention. 本発明の実施の形態の第６の実施例に係るマススペクトルを示す第７のグラフである。It is a 7th graph which shows the mass spectrum which concerns on the 6th Example of embodiment of this invention.

符号の説明Explanation of symbols

10…有機合成
11…イオン化部
12…イオントラップ部
13…飛行時間分析部
14…制御部
21…第1マトリックス層
22…第2マトリックス層
23…サンプル含有層
23…有機合成
24…サンプル添加剤含有層
111…サンプルプレート
112…レーザ光源
113…イオンレンズ
121…第1のエンドキャップ電極
122…イオントラップ空間
123…第2のエンドキャップ電極
124…リング電極
125…リフレクタ電極
131…検出器 10 ... Organic synthesis
11 ... Ionization part
12 ... Ion trap part
13 ... Time of flight analysis
14 ... Control unit
21 ... 1st matrix layer
22… Second matrix layer
23 ... Sample-containing layer
23… Organic synthesis
24 ... Sample additive layer
111 ... Sample plate
112 ... Laser light source
113 ... Ion lens
121… First end cap electrode
122… Ion trap space
123… Second end cap electrode
124 ... Ring electrode
125 ... Reflector electrode
131 ... Detector

Claims (16)

１０乃至５０ｍｇ／ｍｌの濃度で３−ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が乾燥した部分に前記マトリックス溶液を更に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が２回供給され乾燥した部分にリボ核酸を含むサンプル溶液を供給し乾燥させるステップと、
前記サンプル溶液が乾燥した部分にクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給し乾燥させるステップ
とを含むことを特徴とする質量分析サンプルの調製方法。 Supplying a matrix solution containing 3-hydroxypicolinic acid at a concentration of 10 to 50 mg / ml onto a sample plate and drying;
Further supplying and drying the matrix solution in a portion where the matrix solution is dried;
Supplying the sample solution containing ribonucleic acid to the dried portion supplied twice with the matrix solution and drying;
Supplying an additive solution containing ammonium citrate to a dried portion of the sample solution and drying the sample solution. １０乃至５０ｍｇ／ｍｌの濃度で３−ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が乾燥した部分にリボ核酸を含むサンプル溶液を供給し、さらにクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給して乾燥させるステップ
とを含むことを特徴とする質量分析サンプルの調製方法。 Supplying a matrix solution containing 3-hydroxypicolinic acid at a concentration of 10 to 50 mg / ml onto a sample plate and drying;
Supplying a sample solution containing ribonucleic acid to a portion where the matrix solution is dried, and further supplying an additive solution containing ammonium citrate and drying the sample solution. 前記マトリックス溶液の溶媒が、水及びアセトニトリルを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の質量分析サンプルの調製方法。   The method for preparing a mass spectrometry sample according to claim 1 or 2, wherein the solvent of the matrix solution contains water and acetonitrile. 前記マトリックス溶液における前記アセトニトリルの体積濃度が１０乃至５０％であることを特徴とする請求項３に記載の質量分析サンプルの調製方法。   The method for preparing a mass spectrometric sample according to claim 3, wherein the volume concentration of the acetonitrile in the matrix solution is 10 to 50%. 前記添加剤溶液における前記クエン酸アンモニウムの濃度が１０乃至５０ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の質量分析サンプルの調製方法。   The method for preparing a mass spectrometry sample according to any one of claims 1 to 4, wherein the concentration of the ammonium citrate in the additive solution is 10 to 50 mg / ml. １回目の前記マトリックス溶液の供給量、２回目の前記マトリックス溶液の供給量、前記サンプル溶液の供給量、及び前記添加剤溶液の供給量が同じであることを特徴とする請求項１に記載の質量分析サンプルの調製方法。   The supply amount of the matrix solution for the first time, the supply amount of the matrix solution for the second time, the supply amount of the sample solution, and the supply amount of the additive solution are the same. Preparation method of mass spectrometry sample. １０乃至５０ｍｇ／ｍｌの濃度で３−ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が乾燥した部分に前記マトリックス溶液を更に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が２回供給され乾燥した部分にリボ核酸を含むサンプル溶液を供給し乾燥させるステップと、
前記サンプル溶液が乾燥した部分にクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給し乾燥させるステップと、
前記添加剤溶液が乾燥した部分にレーザを照射し、前記リボ核酸のプロトン脱離イオンを生成させるステップ
とを含むことを特徴とするリボ核酸のイオン化方法。 Supplying a matrix solution containing 3-hydroxypicolinic acid at a concentration of 10 to 50 mg / ml onto a sample plate and drying;
Further supplying and drying the matrix solution in a portion where the matrix solution is dried;
Supplying the sample solution containing ribonucleic acid to the dried portion supplied twice with the matrix solution and drying;
Supplying an additive solution containing ammonium citrate to a dried portion of the sample solution and drying;
Irradiating a portion where the additive solution is dried with a laser to generate proton desorption ions of the ribonucleic acid. １０乃至５０ｍｇ／ｍｌの濃度で３−ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が乾燥した部分にリボ核酸を含むサンプル溶液を供給し、さらにクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給して乾燥させるステップと、
前記添加剤溶液が乾燥した部分にレーザを照射し、前記リボ核酸のプロトン脱離イオンを生成させるステップ
とを含むことを特徴とするリボ核酸のイオン化方法。 Supplying a matrix solution containing 3-hydroxypicolinic acid at a concentration of 10 to 50 mg / ml onto a sample plate and drying;
Supplying a sample solution containing ribonucleic acid to a dried portion of the matrix solution, and further supplying an additive solution containing ammonium citrate and drying the solution;
Irradiating a portion where the additive solution is dried with a laser to generate proton desorption ions of the ribonucleic acid. １０乃至５０ｍｇ／ｍｌの濃度で３−ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が乾燥した部分に前記マトリックス溶液を更に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が２回供給され乾燥した部分にリボ核酸を含むサンプル溶液を供給し乾燥させるステップと、
前記サンプル溶液が乾燥した部分にクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給し乾燥させるステップと、
前記添加剤溶液が乾燥した部分にレーザを照射し、前記リボ核酸のプロトン脱離イオンを生成させるステップと、
前記リボ核酸のプロトン脱離イオンの飛行時間を測定し、前記リボ核酸のプロトン脱離イオンの質量電荷比を測定するステップ
とを含むことを特徴とするリボ核酸の質量分析方法。 Supplying a matrix solution containing 3-hydroxypicolinic acid at a concentration of 10 to 50 mg / ml onto a sample plate and drying;
Further supplying and drying the matrix solution in a portion where the matrix solution is dried;
Supplying the sample solution containing ribonucleic acid to the dried portion supplied twice with the matrix solution and drying;
Supplying an additive solution containing ammonium citrate to a dried portion of the sample solution and drying;
Irradiating the dried portion of the additive solution with a laser to generate proton detachment ions of the ribonucleic acid;
Measuring the time of flight of proton desorption ions of the ribonucleic acid and measuring the mass-to-charge ratio of proton desorption ions of the ribonucleic acid. １０乃至５０ｍｇ／ｍｌの濃度で３−ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が乾燥した部分にリボ核酸を含むサンプル溶液を供給し、さらにクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給して乾燥させるステップと、
前記添加剤溶液が乾燥した部分にレーザを照射し、前記リボ核酸のプロトン脱離イオンを生成させるステップと、
前記リボ核酸のプロトン脱離イオンの飛行時間を測定し、前記リボ核酸のプロトン脱離イオンの質量電荷比を測定するステップ
とを含むことを特徴とするリボ核酸の質量分析方法。 Supplying a matrix solution containing 3-hydroxypicolinic acid at a concentration of 10 to 50 mg / ml onto a sample plate and drying;
Supplying a sample solution containing ribonucleic acid to a dried portion of the matrix solution, and further supplying an additive solution containing ammonium citrate and drying the solution;
Irradiating the dried portion of the additive solution with a laser to generate proton detachment ions of the ribonucleic acid;
Measuring the time of flight of proton desorption ions of the ribonucleic acid and measuring the mass-to-charge ratio of proton desorption ions of the ribonucleic acid. 前記３−ヒドロキシピコリン酸の濃度が２５乃至５０ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項９又は１０のいずれか１項に記載のリボ核酸の質量分析方法。   The method for mass spectrometry of ribonucleic acid according to any one of claims 9 and 10, wherein the concentration of the 3-hydroxypicolinic acid is 25 to 50 mg / ml. 前記プロトン脱離イオンの価数が２であることを特徴とする請求項１１に記載のリボ核酸の質量分析方法。   The method for mass spectrometry of ribonucleic acid according to claim 11, wherein the valence of the proton desorption ion is 2. 細胞から低分子リボ核酸を抽出するステップと、
１０乃至５０ｍｇ／ｍｌの濃度で３−ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が乾燥した部分に前記マトリックス溶液を更に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が２回供給され乾燥した部分に前記低分子リボ核酸を含むサンプル溶液を供給し乾燥させるステップと、
前記サンプル溶液が乾燥した部分にクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給し乾燥させるステップと、
前記添加剤溶液が乾燥した部分にレーザを照射し、前記低分子リボ核酸のプロトン脱離イオンを生成させるステップと、
前記低分子リボ核酸のプロトン脱離イオンの飛行時間を測定し、前記低分子リボ核酸のプロトン脱離イオンの質量電荷比を測定するステップ
とを含むことを特徴とする細胞由来の低分子リボ核酸の質量分析方法。 Extracting small ribonucleic acids from the cells;
Supplying a matrix solution containing 3-hydroxypicolinic acid at a concentration of 10 to 50 mg / ml onto a sample plate and drying;
Further supplying and drying the matrix solution in a portion where the matrix solution is dried;
Supplying the sample solution containing the low-molecular-weight ribonucleic acid to the dried portion supplied with the matrix solution twice, and drying;
Supplying an additive solution containing ammonium citrate to a dried portion of the sample solution and drying;
Irradiating the dried portion of the additive solution with a laser to generate proton desorption ions of the low molecular ribonucleic acid;
Measuring the time of flight of proton desorption ions of the low-molecular ribonucleic acid and measuring the mass-to-charge ratio of proton desorption ions of the low-molecular ribonucleic acid. Mass spectrometry method. 細胞から低分子リボ核酸を抽出するステップと、
１０乃至５０ｍｇ／ｍｌの濃度で３−ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が乾燥した部分に前記低分子リボ核酸を含むサンプル溶液を供給し、さらにクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給して乾燥させるステップと、
前記添加剤溶液が乾燥した部分にレーザを照射し、前記低分子リボ核酸のプロトン脱離イオンを生成させるステップと、
前記低分子リボ核酸のプロトン脱離イオンの飛行時間を測定し、前記低分子リボ核酸のプロトン脱離イオンの質量電荷比を測定するステップ
とを含むことを特徴とする細胞由来の低分子リボ核酸の質量分析方法。 Extracting small ribonucleic acids from the cells;
Supplying a matrix solution containing 3-hydroxypicolinic acid at a concentration of 10 to 50 mg / ml onto a sample plate and drying;
Supplying a sample solution containing the low-molecular-weight ribonucleic acid to a portion where the matrix solution is dried, and further supplying an additive solution containing ammonium citrate and drying the solution;
Irradiating the dried portion of the additive solution with a laser to generate proton desorption ions of the low molecular ribonucleic acid;
Measuring the time of flight of proton desorption ions of the low-molecular ribonucleic acid and measuring the mass-to-charge ratio of proton desorption ions of the low-molecular ribonucleic acid. Mass spectrometry method. 前記低分子リボ核酸が非コードＲＮＡであることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の細胞由来の低分子リボ核酸の質量分析方法。   The method for mass spectrometry of low molecular ribonucleic acid derived from cells according to claim 13 or 14, wherein the low molecular ribonucleic acid is non-coding RNA. 前記非コードＲＮＡがマイクロＲＮＡであることを特徴とする請求項１５に記載の細胞由来の低分子リボ核酸の質量分析方法。   The method for mass spectrometry of cell-derived small ribonucleic acid according to claim 15, wherein the non-coding RNA is microRNA.
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