JP2008283892A - Labeling for electron microscope - Google Patents

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Atsuo Miyazawa
淳夫 宮澤
Yuko Fukunaga
優子 福永
Yuuri Nishino
有里 西野
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for labeling by which observation can be made with an electron microscope. <P>SOLUTION: The method for obtaining two-dimensional or three-dimensional information about a target protein in a cell to be observed by an electron microscope method comprises a step of providing a construct expressing a fusion protein of a metal-binding protein or a metal-binding peptide and the target protein, a step of introducing the construct into the cell, a step of expressing the fusion protein from the construct in the cell, a step of supplying a metal binding to the metal-binding protein or the metal-binding peptide to the cell and thereby forming, in the fusion protein, a cluster of the metal-binding protein or the metal-binding peptide with the metal in the cell, and a step of observing the cell with the electron microscope. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、電子顕微鏡法により、標的タンパク質の二次元または三次元情報を得る方法および該方法に使用するためのキットに関する。   The present invention relates to a method for obtaining two-dimensional or three-dimensional information of a target protein by electron microscopy, and a kit for use in the method.

光学顕微鏡法および透過型電子顕微鏡法は、高分解能でタンパク質局在を調べるために一般に用いられている。免疫標識による検出は光学顕微鏡法および電子顕微鏡法についての常套的アプローチである。   Optical microscopy and transmission electron microscopy are commonly used to examine protein localization with high resolution. Detection by immunolabeling is a routine approach to light microscopy and electron microscopy.

特定のタンパク質の細胞における超微細構造的局在もまた、免疫電子顕微鏡法により研究されてきた。   Ultrastructural localization of specific proteins in cells has also been studied by immunoelectron microscopy.

これまで構造生物学的なアプローチからタンパク質の生理機能を明らかにするため、受容体やチャネルなどの膜タンパク質と、それらに特異的な結合タンパク質の結晶構造解析を行ってきた。しかし、細胞の重要な機能を担っているのは個々のタンパク質ではなく、細胞内での相互作用によりタンパク質が集合した分子複合体であることが判明してきた。例えばアセチルコリン受容体は、特異的な受容体結合タンパク質であるラプシンや細胞内骨格系タンパク質と相互作用し、ポストシナプスで膜タンパク質複合体を形成し、機能している。したがって、細胞の機能を明らかにするためには、個々のタンパク質の研究を行うと共に、分子複合体としてその構造と機能を研究していく必要がある。 To clarify the physiological functions of proteins from structural biological approaches, we have been conducting crystal structure analysis of membrane proteins such as receptors and channels and their specific binding proteins. However, it has been found that it is not individual proteins that play important functions of cells, but molecular complexes in which proteins are assembled by intracellular interactions. For example, the acetylcholine receptor functions by interacting with specific receptor-binding proteins such as rapsin and intracellular skeletal proteins, forming a membrane protein complex at the post-synapse. Therefore, in order to clarify the functions of cells, it is necessary to study individual proteins and to study their structures and functions as molecular complexes.

細胞内に存在する分子複合体の結晶構造解析は非常に困難であることから、現在注目を集めている構造解析法が、電子顕微鏡法の1つである電子線トモグラフィーである。電子線トモグラフィーは、試料内部の情報も得ることができる透過型電子顕微鏡像の利点を生かし、生物試料の三次元構造を高分解能で解析する手法として、研究が行われてきた。しかし、現在のところ電子線トモグラフィーに適用できる分子標識法がないため、巨大で、その形状が特徴的なアクチンフィラメント[非特許文献1]や粗面小胞体、ミトコンドリア[非特許文献2]などが解析されているにすぎない。 Since it is very difficult to analyze a crystal structure of a molecular complex present in a cell, an electron beam tomography, which is one of electron microscope methods, is currently attracting attention. Electron tomography has been studied as a technique for analyzing the three-dimensional structure of a biological sample with high resolution by taking advantage of a transmission electron microscope image that can also obtain information inside the sample. However, since there is currently no molecular labeling method applicable to electron beam tomography, actin filaments [Non-Patent Document 1], rough endoplasmic reticulum, mitochondria [Non-Patent Document 2], etc., which are huge and have a characteristic shape, are available. It has only been analyzed.

さらに実際の細胞では、極めて多数の同じサイズの分子が、組織の三次元構造の中に重なっているため、電子線トモグラフィーにおいて細胞内の分子は見えているのに、その分子が何であるのか同定できず、解析できないという状況にある。また、プロテオーム解析が非常に進んだ今日、細胞内のタンパク質間ネットワークが明らかにされてきている。こうしたタンパク質間相互作用が、実際の細胞で起きていることを証明するためには、それらのタンパク質が細胞内において相互作用できる空間配置に存在することが重要である。   In addition, in real cells, a large number of molecules of the same size overlap in the three-dimensional structure of the tissue, so it is possible to identify what is in the cell even though it is visible in the electron tomography. It is impossible to analyze it. In addition, today, when proteome analysis has advanced greatly, intracellular protein-protein networks have been elucidated. In order to prove that these protein-protein interactions occur in actual cells, it is important that these proteins exist in a spatial arrangement that allows them to interact in the cells.

電子顕微鏡で観察できる確実な分子標識法が開発されれば、解析の対象が巨大構造や繊維状構造など一部に限られることなく、電子線トモグラフィーから得られる膨大な情報「細胞内に存在するすべてのプロテオームの立体構造情報」を十分に生かせるようになる。そして、細胞あるいは組織内部まで、特異的に分子を標識することができるようになり、細胞内におけるタンパク質間ネットワークを検証することも可能になる。   If a reliable molecular labeling method that can be observed with an electron microscope is developed, the analysis target is not limited to a part of the giant structure or fibrous structure, and a vast amount of information obtained from electron tomography “exists in cells. All 3D structure information of proteomes can be fully utilized. And it becomes possible to label a molecule specifically to the inside of a cell or tissue, and it becomes possible to verify a protein-protein network in the cell.

現在、電子顕微鏡による生物試料の観察は、化学固定を施した試料の薄切法が主流であるが、電子線トモグラフィーによる試料の三次元再構成法が開発され、最近では生きた状態に非常に近い急速凍結・無染色試料を用いたクライオ電子線トモグラフィーが検討され始めた。そこで最も大きな問題になるのが、細胞内で分子を確実に同定するための標識法である。電子線トモグラフィーでは、試料を傾斜させることにより垂直方向の情報を得て組織の三次元再構成を行うため、試料を通常よりも厚い切片にして観察する。しかし、試料が厚くなれば、染色剤や標識用抗体などが組織内部まで浸透できなくなり、分子の同定が困難になってしまう。   At present, observation of biological samples with an electron microscope is mainly performed by slicing a chemically fixed sample, but a three-dimensional reconstruction method of the sample by electron beam tomography has been developed. Cryoelectron tomography using near-frozen and unstained samples has begun to be studied. Therefore, the biggest problem is a labeling method for reliably identifying molecules in cells. In electron beam tomography, since the sample is tilted to obtain information in the vertical direction and three-dimensional reconstruction of the tissue is performed, the sample is observed as a section thicker than usual. However, if the sample becomes thicker, it becomes difficult for a staining agent, a labeling antibody, or the like to penetrate into the tissue, thereby making it difficult to identify the molecule.

また、電子顕微鏡で観察可能なタンパク質の標識法において最も重要な点は、標的分子と標識とが化学量論的に1対1に確定されることである。   Moreover, the most important point in the protein labeling method that can be observed with an electron microscope is that the target molecule and the label are stoichiometrically determined on a one-to-one basis.

オワンクラゲで発見された緑色蛍光タンパク質(GFP)およびそのホモログによる遺伝的標識は、光学顕微鏡法による細胞中の目的のタンパク質観察において迅速な進歩をもたらした。かかる蛍光タグは二次的試薬を使用せずに生細胞中での動的プロセスの可視化を可能にする。   Genetic labeling with green fluorescent protein (GFP) and its homologues found in Aequorea jellyfish has led to rapid advances in observing proteins of interest in cells by light microscopy. Such fluorescent tags allow visualization of dynamic processes in living cells without the use of secondary reagents.

光学顕微鏡法による生細胞中の1つの分子を観察する能力は近年大幅に進歩しており、かかる技術は細胞生物学における近年の多くの進展において必要なものである。単分子イメージングの顕著な進歩はGFPに基づく遺伝的コード化タグの使用により促進されてきた。GFP融合タンパク質の発現により、生細胞中のタグ付加分子のリアルタイムでの非常に安定した研究が可能となる。かかる研究により、細胞中のタンパク質の動態、局在および相互作用についての重要な知見が示されてきた。   The ability to observe a single molecule in living cells by light microscopy has advanced significantly in recent years, and such techniques are necessary in many recent advances in cell biology. Significant advances in single molecule imaging have been facilitated by the use of GFP-based genetic coding tags. The expression of GFP fusion protein allows very stable studies of tagged molecules in living cells in real time. Such studies have shown important insights into protein dynamics, localization and interactions in cells.

一方、高分解能透過型電子顕微鏡法によるタンパク質の検出は、酢酸ウラニルによるネガティブ染色や金コロイドを結合した抗体による免疫標識が一般的であり、電子顕微鏡法によるタンパク質検出を促進する遺伝的コード化タグは未だに開発されていない。   On the other hand, protein detection by high-resolution transmission electron microscopy is generally performed by negative staining with uranyl acetate or immunolabeling with gold colloid-bound antibodies, and genetically encoded tags that facilitate protein detection by electron microscopy Has not yet been developed.

電子線トモグラフィーにより、細胞内に存在する生体分子の三次元情報を得ることができるが、大量の同程度のサイズの分子が細胞中には大量に存在するため、特異的標識なしには標的タンパク質を同定することが出来ない。電子顕微鏡法のための常套的薄切切片においては免疫金コロイド標識が利用可能であるが、金コロイド結合抗体は、特異的に標的タンパク質を標識するために、電子線トモグラフィーに用いて三次元情報を得るための厚い切片の内部に浸透することができない。   Electron tomography can provide three-dimensional information on biomolecules present in cells, but since there are a large number of molecules of the same size in cells, the target protein can be obtained without specific labeling. Cannot be identified. Colloidal gold colloid labels are available in conventional slices for electron microscopy, but colloidal gold-conjugated antibodies can be used for electron tomography to provide three-dimensional information to specifically label target proteins. Can not penetrate inside the thick section to obtain.

GFPと同様の遺伝的コード化タグがあれば電子顕微鏡法により厚い切片や、凍結切片における特定のタンパク質の同定が可能になるが、電子顕微鏡で検出可能な重金属を遺伝的にコードさせることは不可能である。
Kurner J, Medalia O, Linaroudis A A, and Baumeister W (2004) New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography. Exp. Cell Res. 301: 38-42 Csordas G, Renken C, Varnai P, Walter L, Weaver D, Buttle K F, Balla T, Mannella C A, and Hajnoczky G (2006) Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. J. Cell Biol. 174: 915-921
A genetically encoded tag similar to GFP allows identification of specific proteins in thick sections and frozen sections by electron microscopy, but does not genetically encode heavy metals that can be detected by electron microscopy. Is possible.
Kurner J, Medalia O, Linaroudis AA, and Baumeister W (2004) New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography. Exp. Cell Res. 301: 38-42 Csordas G, Renken C, Varnai P, Walter L, Weaver D, Buttle KF, Balla T, Mannella CA, and Hajnoczky G (2006) Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.J. Cell Biol. 174: 915-921

これまで何らかの標識を標的タンパク質の遺伝子に組み込む方法で、電子顕微鏡観察を試みた例は全くない。それは電子顕微鏡で高いコントラストで観察できるのは原子散乱因子が大きな原子(ウランや金)であるために、標識として細胞内で発現させることが不可能であったからである。   Until now, there has been no attempt to observe an electron microscope by a method of incorporating some label into a gene of a target protein. The reason why high-contrast observation is possible with an electron microscope is that the atomic scattering factor is a large atom (uranium or gold), so that it cannot be expressed in a cell as a label.

電子線トモグラフィーを含め電子顕微鏡観察において分子を確実に同定するためには、光学顕微鏡における蛍光標識GFPと同様に、観察したいタンパク質の遺伝子に標識の遺伝子を組み込んで融合タンパク質として細胞内で発現し、標的タンパク質の立体構造と生理機能に影響を与えずに100%確実に共存する、電子顕微鏡で観察可能な標識法の開発が必要不可欠である。   In order to reliably identify molecules in electron microscope observation including electron tomography, in the same way as fluorescently labeled GFP in light microscope, the labeled gene is incorporated into the gene of the protein to be observed and expressed in the cell as a fusion protein, It is indispensable to develop a labeling method that can be observed with an electron microscope and that can coexist 100% without affecting the three-dimensional structure and physiological function of the target protein.

蛍光標識GFPのように標的タンパク質の遺伝子に組み込んで融合タンパク質として発現できる、電子顕微鏡で観察可能な分子標識法を提供するため、本発明者らは、金属と結合するタンパク質の結合モチーフやアミノ酸残基を標的タンパク質の遺伝子に組み込んで融合タンパク質として発現させ、そこに生体内に存在する金属が結合することにより細胞内で金属クラスターを形成させることができれば、電子顕微鏡で観察可能な分子標識になるのではないかと考え、検討を行った。   In order to provide a molecular labeling method that can be observed in an electron microscope, which can be expressed as a fusion protein by being incorporated into a target protein gene such as fluorescently labeled GFP, the present inventors have developed a binding motif or amino acid residue of a protein that binds to a metal. If a group is incorporated into the gene of the target protein and expressed as a fusion protein, and a metal cluster in the cell can be formed by binding to a metal present in the living body, it becomes a molecular label that can be observed with an electron microscope. We thought that it might be, and examined.

そこで本発明者らは、標識となる金属クラスターを形成する金属結合タンパク質やペプチド等の遺伝子を、標的タンパク質の遺伝子に組み込んで融合タンパク質として発現させ、そこに細胞内に存在する金属により金属クラスターを形成させることにより、電子顕微鏡で観察できる細胞内分子標識法を開発し、本発明を完成させるに至った。   Therefore, the present inventors incorporated a gene such as a metal binding protein or peptide that forms a metal cluster to be a label into a target protein gene and expressed it as a fusion protein, and the metal cluster is formed by the metal present in the cell. As a result, an intracellular molecular labeling method that can be observed with an electron microscope was developed, and the present invention was completed.

本発明は第一の態様において、電子顕微鏡法により観察すべき細胞中の標的タンパク質の二次元または三次元情報を得る方法であって、
金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと標的タンパク質との融合タンパク質を発現させうるコンストラクトを提供する工程、
該コンストラクトを、該細胞に導入する工程、
該細胞中で該コンストラクトから該融合タンパク質を発現させる工程、
該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと結合する金属を、該細胞に供給することにより、該細胞中にて該融合タンパク質中の金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと、該金属とのクラスターを形成させる工程、および、
該細胞を電子顕微鏡により観察する工程、
を含む方法を提供する。
In a first aspect, the present invention provides a method for obtaining two-dimensional or three-dimensional information of a target protein in a cell to be observed by electron microscopy,
Providing a construct capable of expressing a metal binding protein or a fusion protein of a metal binding peptide and a target protein,
Introducing the construct into the cell;
Expressing the fusion protein from the construct in the cell;
Supplying a metal that binds to the metal-binding protein or metal-binding peptide to the cell, thereby forming a cluster of the metal with the metal-binding protein or metal-binding peptide in the fusion protein and the metal in the cell ,and,
Observing the cells with an electron microscope;
A method comprising:

本発明の第一の態様において、電子顕微鏡法は、好ましくは透過型電子顕微鏡法である。さらに好ましくは、情報は三次元位置情報であり、電子顕微鏡法は透過型電子顕微鏡による電子線トモグラフィーである。   In the first embodiment of the present invention, the electron microscopy is preferably transmission electron microscopy. More preferably, the information is three-dimensional position information, and the electron microscopy is electron beam tomography using a transmission electron microscope.

本発明は第二の態様において、電子顕微鏡法により観察すべき標的タンパク質を検出する方法であって、
金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと標的タンパク質との融合タンパク質を発現させうるコンストラクトを提供する工程、
該コンストラクトを、細胞に導入する工程、
該細胞中で該コンストラクトから該融合タンパク質を発現させる工程、
該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと結合する金属を、該細胞に供給することにより、該細胞中にて該融合タンパク質中の金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと、該金属とのクラスターを形成させる工程、
該金属とクラスターを形成している融合タンパク質を含む試料を調製する工程、
該試料に含まれる融合タンパク質を電子顕微鏡により観察する工程、
を含む方法を提供する。
In a second aspect, the present invention is a method for detecting a target protein to be observed by electron microscopy,
Providing a construct capable of expressing a metal binding protein or a fusion protein of a metal binding peptide and a target protein,
Introducing the construct into a cell;
Expressing the fusion protein from the construct in the cell;
Supplying a metal that binds to the metal-binding protein or metal-binding peptide to the cell, thereby forming a cluster of the metal with the metal-binding protein or metal-binding peptide in the fusion protein and the metal in the cell ,
Preparing a sample containing a fusion protein forming a cluster with the metal;
Observing the fusion protein contained in the sample with an electron microscope;
A method comprising:

本発明の第一および第二の態様において、金属結合タンパク質は好ましくは少なくとも1つのメタロチオネインを含むものであり、例えば、1〜7個のメタロチオネインを含むものであり、さらに好ましくは金属結合タンパク質は、3〜5個のメタロチオネインを含むものであり、3個のメタロチオネインを含むものであるのが特に好ましい。メタロチオネインが複数個である場合には、それらはタンデムに連結されることが好ましい。好ましくは金属は、カドミウムである。   In the first and second aspects of the present invention, the metal binding protein preferably contains at least one metallothionein, for example, contains 1 to 7 metallothioneins, more preferably the metal binding protein comprises: It contains 3 to 5 metallothioneins and particularly preferably contains 3 metallothioneins. When there are a plurality of metallothioneins, they are preferably linked in tandem. Preferably the metal is cadmium.

また、標的タンパク質は好ましくは、自己集合する性質を有するタンパク質、特に好ましくはホモ多量体を形成するタンパク質である。   The target protein is preferably a protein having a property of self-assembly, particularly preferably a protein that forms a homomultimer.

本発明はまた、第一の態様の方法に使用するためのキットを提供する。即ち、電子顕微鏡法により観察すべき細胞中の標的タンパク質の二次元または三次元情報を得るための、以下を含むキットを提供する:
(1)金属結合タンパク質または金属結合ペプチドをコードする部分を含み、かつ、所望の標的タンパク質が該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドとインフレームに結合することにより、該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと所望の標的タンパク質との融合タンパク質を発現させることが出来る発現カセット、および、
(2)該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドに結合する金属を含む試薬。
The present invention also provides a kit for use in the method of the first aspect. That is, a kit comprising the following for obtaining two-dimensional or three-dimensional information of a target protein in a cell to be observed by electron microscopy is provided:
(1) A metal-binding protein or metal-binding peptide is included, and a desired target protein binds in-frame with the metal-binding protein or metal-binding peptide, thereby An expression cassette capable of expressing a fusion protein with a desired target protein, and
(2) A reagent containing a metal that binds to the metal-binding protein or metal-binding peptide.

さらに本発明は、第二の態様の方法に使用するためのキットを提供する。即ち、電子顕微鏡法により観察すべき標的タンパク質を検出するための、以下を含むキットを提供する:
(1)金属結合タンパク質または金属結合ペプチドをコードする部分を含み、かつ、所望の標的タンパク質が該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドとインフレームに結合することにより、該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと所望の標的タンパク質との融合タンパク質を発現させることが出来る発現カセット、および、
(2)該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドに結合する金属を含む試薬。
The present invention further provides a kit for use in the method of the second aspect. That is, a kit comprising the following for detecting a target protein to be observed by electron microscopy is provided:
(1) A metal-binding protein or metal-binding peptide is included, and a desired target protein binds in-frame with the metal-binding protein or metal-binding peptide, thereby An expression cassette capable of expressing a fusion protein with a desired target protein, and
(2) A reagent containing a metal that binds to the metal-binding protein or metal-binding peptide.

第一および第二の態様の方法に使用するためのキットにおいて、金属結合タンパク質は、3〜5個のメタロチオネインをタンデムに含むものであるのが好ましく、金属はカドミウムであるのが好ましい。   In the kit for use in the method of the first and second embodiments, the metal binding protein preferably contains 3 to 5 metallothioneins in tandem, and the metal is preferably cadmium.

本発明はさらに、標的タンパク質と遺伝的に融合して用いられる、金属結合タンパク質または金属結合ペプチドを含む、電子顕微鏡法による標的タンパク質の検出用マーカーを提供する。   The present invention further provides a marker for detection of a target protein by electron microscopy, which includes a metal binding protein or a metal binding peptide used in genetic fusion with the target protein.

本発明の検出用マーカーにおいて、金属結合タンパク質または金属結合ペプチドは好ましくは、少なくとも1つのメタロチオネインを含むものであり、例えば、1〜7個のメタロチオネインを含むものであり、さらに好ましくは、3〜5個のメタロチオネインを含むものであり、特に好ましくは、3個のメタロチオネインを含むものである。メタロチオネインが複数個である場合にはそれらはタンデムに連結されることが好ましい。   In the detection marker of the present invention, the metal binding protein or the metal binding peptide preferably contains at least one metallothionein, for example, contains 1 to 7 metallothioneins, more preferably 3 to 5 One containing metallothionein, particularly preferably containing three metallothioneins. When there are a plurality of metallothioneins, they are preferably linked in tandem.

本発明の方法は、高い特異性かつ高い親和性の標的タンパク質に対する抗体を必要としないため、免疫金コロイド標識技術に伴ういくつもの制限を克服する。メタロチオネイン融合タンパク質は、タンパク質の高分解能での細胞内分布の研究に以下のような利点をもたらす。第一に、特異性が高く親和性が高い抗体が入手できないタンパク質を遺伝的コード化タグにより標識することが可能である。第二に、標的分子と標識の化学量論比は1:1に近い。第三に、高電子密度重金属が培養中に取り込まれるので、特異性、コントラスト、および分布の変化を引き起こす可能性のある細胞の固定や抗体の透過のための処理を必要とする免疫電子顕微鏡法とは異なり、標識の程度が影響されにくい。本発明の方法による融合タンパク質アプローチでは、電子顕微鏡法のためにその他の標識を用いることなく細胞における標的タンパク質の検出が可能である。   The method of the present invention overcomes several limitations associated with immunogold colloid labeling technology because it does not require antibodies to high specificity and high affinity target proteins. Metallothionein fusion proteins offer the following advantages for studying high-resolution intracellular distribution of proteins. First, proteins for which antibodies with high specificity and high affinity are not available can be labeled with genetically encoded tags. Second, the stoichiometric ratio of target molecule to label is close to 1: 1. Third, immunoelectron microscopy requires processing for cell fixation and antibody permeation that can cause changes in specificity, contrast, and distribution as high electron density heavy metals are incorporated into the culture. Unlike, the degree of labeling is less affected. The fusion protein approach according to the method of the present invention allows the detection of target proteins in cells without using other labels for electron microscopy.

以下、本発明の方法を詳細に説明する。
なお、本明細書および特許請求の範囲において、「金属」または「重金属」とは、単体としての金属のみならず、イオンの形態のものも含まれる。例えば、「カドミウム」という用語には、カドミウムイオンが含まれる。
Hereinafter, the method of the present invention will be described in detail.
In the present specification and claims, the term “metal” or “heavy metal” includes not only a single metal but also an ion form. For example, the term “cadmium” includes cadmium ions.

まず、本発明の第一の態様の方法およびキットについて説明する。なお、電子顕微鏡による観察方法については後述する。   First, the method and kit of the first aspect of the present invention will be described. An observation method using an electron microscope will be described later.

本発明の第一の態様の方法は、電子顕微鏡法により観察すべき細胞中の標的タンパク質の二次元または三次元情報を得る方法であって、
金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと標的タンパク質との融合タンパク質を発現させうるコンストラクトを提供する工程、
該コンストラクトを、該細胞に導入する工程、
該細胞中で該コンストラクトから該融合タンパク質を発現させる工程、
該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと結合する金属を、該細胞に供給することにより、該細胞中にて該融合タンパク質中の金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと、該金属とのクラスターを形成させる工程、および、
該細胞を電子顕微鏡により観察する工程、
を含む方法である。
The method of the first aspect of the present invention is a method for obtaining two-dimensional or three-dimensional information of a target protein in a cell to be observed by electron microscopy,
Providing a construct capable of expressing a metal binding protein or a fusion protein of a metal binding peptide and a target protein,
Introducing the construct into the cell;
Expressing the fusion protein from the construct in the cell;
Supplying a metal that binds to the metal-binding protein or metal-binding peptide to the cell, thereby forming a cluster of the metal with the metal-binding protein or metal-binding peptide in the fusion protein and the metal in the cell ,and,
Observing the cells with an electron microscope;
It is a method including.

細胞は、標的タンパク質を含むものであり、組織を構成する細胞であっても、培養細胞であってもよい。
細胞の種類も特に限定されず、哺乳類細胞などの真核細胞、細菌などの原核細胞のいずれでもよい。
The cell contains a target protein, and may be a cell constituting a tissue or a cultured cell.
The cell type is not particularly limited, and any of eukaryotic cells such as mammalian cells and prokaryotic cells such as bacteria may be used.

標的タンパク質も特に限定されず、細胞中において位置情報や局在を調べたいいずれのタンパク質を標的としてもよい。   The target protein is not particularly limited, and any protein whose position information or localization is to be investigated in the cell may be targeted.

好ましくは、標的タンパク質は、細胞中の特定の部分に集積して存在するものや、多量体を形成するものである。かかる自己集合する性質を有するタンパク質や、ホモ多量体を形成するタンパク質は、金属結合タンパク質との融合タンパク質とした場合でも、自己集合する性質およびホモ多量体を形成する能力を維持できるものが好ましい。自己集合またはホモ多量体の形成により、金属結合タンパク質または金属結合ペプチドが集合し、その結果として集積した金属によりコントラストが得られる。   Preferably, the target protein is accumulated in a specific part of the cell or forms a multimer. Such a protein having the property of self-assembly or a protein that forms a homomultimer is preferably one that can maintain the property of self-assembly and the ability to form a homomultimer even when it is a fusion protein with a metal binding protein. By self-assembly or formation of homomultimers, metal-binding proteins or metal-binding peptides assemble, and as a result, contrast is obtained by the accumulated metal.

金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと標的タンパク質との融合タンパク質を発現させうるコンストラクトを提供する工程について以下に説明する。   The process for providing a construct capable of expressing a metal binding protein or a fusion protein of a metal binding peptide and a target protein is described below.

金属結合タンパク質または金属ペプチドは、金属と結合するタンパク質またはペプチドであれば特に限定されず、公知の金属結合タンパク質や、タンパク質中の金属結合ドメインなどがいずれも使用できる。
また、金属結合タンパク質または金属ペプチドは、1つの金属結合タンパク質または金属結合ペプチドであってもよいし、2以上の金属結合タンパク質または金属結合ペプチドを含むものであってもよい。2以上の金属結合タンパク質または金属結合ペプチドを含む場合、それらはタンデムに連結されていることが好ましい。例えば、2以上の金属結合タンパク質または金属結合ペプチドを含む場合、1種類のものを2以上タンデムに含むものでもよく、複数の種類のものを組み合わせてタンデムに連結したものでもよい。
The metal-binding protein or metal peptide is not particularly limited as long as it is a protein or peptide that binds to a metal, and any known metal-binding protein, metal-binding domain in the protein, or the like can be used.
In addition, the metal binding protein or metal peptide may be one metal binding protein or metal binding peptide, or may include two or more metal binding proteins or metal binding peptides. Where two or more metal binding proteins or metal binding peptides are included, they are preferably linked in tandem. For example, when two or more metal binding proteins or metal binding peptides are included, one or more types may be included in tandem, or a plurality of types may be combined in tandem.

金属結合タンパク質として好ましいものは、少なくとも1つ、例えば1〜7個のメタロチオネインを含むものであり、さらに好ましくは、3〜5個のメタロチオネインを含むものであり、特に好ましくは、3個のメタロチオネインを含むものである。メタロチオネインが複数個である場合には、それらはタンデムに連結されるのが好ましい。この場合、金属はカドミウムであるのが好ましい。3個のメタロチオネインを含むタグの付加は、標的タンパク質の分子量を20,600のみ増加させるだけであり、これは1分子のGFP(27,000)と同程度である。したがって、GFPタグの付加後も機能や可溶性を維持するタンパク質であれば3個のメタロチオネインを含むタグ付加を適用可能であると考えられる。   Preferred as the metal binding protein is one containing at least 1, for example, 1 to 7, metallothionein, more preferably 3 to 5 metallothionein, and particularly preferably 3 metallothionein. Is included. When there are a plurality of metallothioneins, they are preferably linked in tandem. In this case, the metal is preferably cadmium. The addition of a tag containing three metallothioneins only increases the molecular weight of the target protein by 20,600, which is comparable to one molecule of GFP (27,000). Therefore, it is considered that tag addition including three metallothioneins can be applied to any protein that maintains its function and solubility even after the addition of the GFP tag.

標識となる金属結合タンパク質が複数のメタロチオネインを含むなどで、その分子量が大きくなった場合、金属結合タンパク質が標的タンパク質の活性や立体構造に影響を与えないことを確認しておくとよい。   When the molecular weight becomes large because the metal binding protein to be labeled contains a plurality of metallothioneins or the like, it is preferable to confirm that the metal binding protein does not affect the activity or the three-dimensional structure of the target protein.

かかる確認方法としては、金属結合タンパク質と標的タンパク質との融合タンパク質に特異的な蛍光抗体を用いて、光学顕微鏡により認識できる標的タンパク質の局在が、融合タンパク質とすることにより変化していないかを確認する方法が挙げられる。
また、標的タンパク質と相互作用するタンパク質が知られている場合、免疫沈降法により、融合タンパク質が、標的タンパク質の、その相互作用パートナーとの結合能力を維持しているかを確認することができる。
また、融合タンパク質に、さらに、GFPタグを付加して、光学顕微鏡により認識できる標的タンパク質の局在が、融合タンパク質とすることにより変化していないかを確認する方法が挙げられる。
As such a confirmation method, whether or not the localization of the target protein that can be recognized by a light microscope using a fluorescent antibody specific for the fusion protein of the metal binding protein and the target protein has been changed by using the fusion protein. The method of confirming is mentioned.
When a protein that interacts with the target protein is known, it can be confirmed by immunoprecipitation whether the fusion protein maintains the ability of the target protein to bind to its interaction partner.
Further, a method of adding a GFP tag to the fusion protein and confirming whether or not the localization of the target protein that can be recognized by an optical microscope is changed by using the fusion protein can be mentioned.

標的タンパク質自体の活性や立体構造、また、集積する能力あるいはフォールディングする能力を妨げないように、金属結合タンパク質の大きさを適宜調節するとよい。例えば、金属結合タンパク質が複数のメタロチオネインを含む場合、標的タンパク質の活性や立体構造に影響を与えない範囲で、より多くの金属と結合するように、メタロチオネインの繰り返し数を決定するとよい。   The size of the metal binding protein may be adjusted as appropriate so as not to hinder the activity and three-dimensional structure of the target protein itself, the ability to accumulate or the ability to fold. For example, when the metal-binding protein contains a plurality of metallothioneins, the number of metallothionein repeats may be determined so as to bind to more metals within a range that does not affect the activity and three-dimensional structure of the target protein.

メタロチオネインは、公知の金属結合タンパク質であり、そのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、GenBank等から入手できる。メタロチオネインは、Cd2+をはじめ、Hg2+、Cu+、Ag+、Pb2+、Cd2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Au+に結合することが知られている。 Metallothionein is a known metal binding protein, and its amino acid and nucleotide sequence can be obtained from GenBank and the like. Metallothionein is known to bind to Cd 2+ , Hg 2+ , Cu + , Ag + , Pb 2+ , Cd 2+ , Ni 2+ , Zn 2+ , Co 2+ , and Au + .

メタロチオネインは野生型のものであってもよいし、1または数個のアミノ酸配列が欠失、置換または付加された、修飾型のメタロチオネインであってもよい。
メタロチオネインにかかる改変を加えることにより、より金属結合能および結合選択性の強い変異体が得られる場合には、それを用いるのがさらに好ましい。かかる改変を加える方法としては、部位特異的突然変異誘発や、紫外線照射、人為的な遺伝子設計などが挙げられる。
The metallothionein may be a wild type or a modified metallothionein in which one or several amino acid sequences are deleted, substituted or added.
In the case where a mutant having stronger metal binding ability and binding selectivity can be obtained by adding a modification related to metallothionein, it is more preferable to use it. Examples of such a method for modification include site-directed mutagenesis, ultraviolet irradiation, and artificial gene design.

他に利用可能な金属タンパク質または金属結合ペプチドとしては、例えば、TiやAg+と結合するminiTBP-1(Small Volume 1, 826-832, 2005)、Cd2+と結合するフィトケラチンの合成アナログであるEC20(Biomacromolecules 3, 462-465, 2002)、Tb2+と結合するカルモデュリンフラグメントのCa2+結合サイト(FEBS Lett., 282, 143-146, 1991)、VO2+(バナジン酸イオン)と結合するバナビンなどが挙げられる。これらを用いる場合も、上記と同様に、標的タンパク質の立体構造および生理機能に影響を与えないことをあらかじめ確認することが好ましい。miniTBP-1、EC20、カルモデュリンフラグメントのCa2+結合サイトの配列は、それぞれ上記各論文から入手することが出来る。 Other available metal proteins or metal-binding peptide, for example, miniTBP-1 which binds to Ti and Ag + (Small Volume 1, 826-832 , 2005), a synthetic analogue of phytochelatin that bind Cd 2+ EC20 (Biomacromolecules 3, 462-465, 2002), Ca 2+ binding site of calmodulin fragment that binds to Tb 2+ (FEBS Lett., 282, 143-146, 1991), VO 2+ (vanadate ion) Examples include binding vanabin. Also when using these, it is preferable to confirm beforehand that it does not affect the three-dimensional structure and physiological function of a target protein similarly to the above. The sequences of Ca 2+ binding sites of miniTBP-1, EC20, and calmodulin fragments can be obtained from the above-mentioned papers.

金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと標的タンパク質との融合タンパク質を発現させうるコンストラクトの作製は、当業者に周知の方法により行うことができる。   Construction of a construct capable of expressing a metal-binding protein or a fusion protein of a metal-binding peptide and a target protein can be performed by methods well known to those skilled in the art.

例えば、金属結合タンパク質をコードする遺伝子を、PCRによりクローニングする。同様に、標的タンパク質をコードする遺伝子を、PCRによりクローニングする。そして得られた金属結合タンパク質をコードする断片と、標的タンパク質をコードする断片を、インフレームとなるように連結させ、導入すべき細胞に応じて適宜選択したベクターに組み込むとよい。   For example, a gene encoding a metal binding protein is cloned by PCR. Similarly, the gene encoding the target protein is cloned by PCR. Then, the obtained fragment that encodes the metal binding protein and the fragment that encodes the target protein are linked so as to be in-frame, and incorporated into a vector appropriately selected according to the cell to be introduced.

もちろん、金属結合タンパク質および標的タンパク質をコードする遺伝子を得る方法はPCR法に限定されず、当業者に周知のハイブリダイゼーション技術など、いずれの方法を用いてもよい。   Of course, the method for obtaining the genes encoding the metal binding protein and the target protein is not limited to the PCR method, and any method such as a hybridization technique well known to those skilled in the art may be used.

ベクターとしては、導入すべき細胞中で、融合タンパク質を発現させることが可能なものであれば特に限定されない。
ベクターは、細菌性のもの(例えばpET vector, Novagen)であってもよいし、ウイルス性のもの(例えばpAd/CMV/V5-DESTTM Gateway(登録商標) vector, Invitrogen)であってもよく、導入すべき細胞に応じて適宜選択すればよい。ベクターは、プロモーターおよびターミネーターを含むものが好ましい。プロモーターとしては、構成的プロモーターであるCMVプロモーター、誘導性プロモーターであるlacプロモーターなどが挙げられる。
The vector is not particularly limited as long as the fusion protein can be expressed in the cell to be introduced.
The vector may be bacterial (eg, pET vector, Novagen) or viral (eg, pAd / CMV / V5-DEST Gateway (registered trademark) vector, Invitrogen) What is necessary is just to select suitably according to the cell which should be introduce | transduced. The vector preferably contains a promoter and a terminator. Examples of the promoter include a CMV promoter that is a constitutive promoter, a lac promoter that is an inducible promoter, and the like.

次に該コンストラクトを、該細胞に導入する工程について説明する。
上記のようにして得られた、融合タンパク質を発現させうるコンストラクトを観察したい細胞に導入する。コンストラクトの導入方法も、当業者に周知のいずれの方法であってもよく、例えば、リポフェクション法が挙げられる。
Next, the process of introducing the construct into the cell will be described.
The construct obtained as described above and capable of expressing the fusion protein is introduced into a cell to be observed. The method for introducing the construct may be any method known to those skilled in the art, and examples thereof include a lipofection method.

次に該細胞中で該コンストラクトから該融合タンパク質を発現させる工程について説明する。
該コンストラクトが、構成的プロモーターを有するものである場合、該融合タンパク質は特に誘導をかける必要はないが、誘導性プロモーターを有する場合は、細胞に適宜誘導物質を添加する。
Next, the step of expressing the fusion protein from the construct in the cell will be described.
When the construct has a constitutive promoter, the fusion protein does not need to be induced, but when it has an inducible promoter, an inducer is appropriately added to the cell.

細胞中で融合タンパク質を効果的に発現するために、細胞の培養条件などを検討し、最適化するのが好ましい。   In order to effectively express the fusion protein in the cell, it is preferable to examine and optimize the cell culture conditions.

例えば、標的タンパク質が、機能、活性および高次構造を保持するような、培地の組成、培養温度、培養時間を適宜検討する。特に、細胞を培養しながら、培地に金属イオンを添加することにより、細胞中の融合タンパク質と金属とを結合させる場合、金属イオンが細胞の増殖、タンパク質の発現、標的タンパク質の構造や機能に悪影響を与えないように、金属イオン濃度や、金属イオンの存在下で培養する時間を適宜設定する。   For example, the composition of the medium, the culture temperature, and the culture time are appropriately examined so that the target protein retains the function, activity and higher order structure. In particular, when metal ions are added to the culture medium while culturing cells to bind the fusion protein and metal in the cells, the metal ions have an adverse effect on cell growth, protein expression, and the structure and function of the target protein. The time for culturing in the presence of metal ions and the presence of metal ions is appropriately set.

また、標的タンパク質が自己集合するタンパク質である場合、例えば、多量体を形成するものである場合、標的タンパク質を含む融合タンパク質が、機能的な多量体を形成することが出来るように、適宜培地の組成、培養温度、培養時間を設定する。   In addition, when the target protein is a protein that self-assembles, for example, when it forms a multimer, the medium of the medium is appropriately used so that the fusion protein containing the target protein can form a functional multimer. The composition, culture temperature, and culture time are set.

次に、該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと結合する金属を、該細胞に供給することにより、該細胞中にて該融合タンパク質中の金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと、該金属とのクラスターを形成させる工程について説明する。   Next, by supplying a metal that binds to the metal-binding protein or metal-binding peptide to the cell, a cluster of the metal-binding protein or metal-binding peptide in the fusion protein and the metal in the cell is formed in the cell. The process to form is demonstrated.

金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと結合する金属は、金属結合タンパク質または金属結合ペプチドの種類に応じて変わりうる。金属結合タンパク質が、1種の金属に特異的に結合する場合は、その種の金属を細胞に供給する。金属結合タンパク質が2種以上の金属に結合する場合は、結合特異性が高く、融合タンパク質1分子当たりに結合する原子数が多い金属を選択するのが好ましい。   The metal that binds to the metal binding protein or metal binding peptide can vary depending on the type of metal binding protein or metal binding peptide. When a metal binding protein specifically binds to one type of metal, that type of metal is supplied to the cell. When the metal binding protein binds to two or more kinds of metals, it is preferable to select a metal having a high binding specificity and a large number of atoms bonded per molecule of the fusion protein.

例えば、金属結合タンパク質がメタロチオネインの場合は、Cd2+が好ましいが、他の金属であってもよい。
また、金属結合タンパク質が、miniTBP-1の場合はTiやAg+が好ましく、カルモデュリンフラグメントのCa2+結合サイトの場合はTb2+が好ましく、バナビンの場合はVO2+が好ましい。
For example, when the metal binding protein is metallothionein, Cd 2+ is preferable, but other metals may be used.
Further, when the metal binding protein is miniTBP-1, Ti or Ag + is preferable, Tb 2+ is preferable for the Ca 2+ binding site of the calmodulin fragment, and VO 2+ is preferable for vanabin.

また、細胞に供給する金属は、良好なコントラストを得るためには電子密度の大きな重金属、例えば、金、水銀、銀、鉛、カドミウム等が好ましい。   The metal supplied to the cells is preferably a heavy metal with a high electron density, such as gold, mercury, silver, lead, cadmium, etc., in order to obtain a good contrast.

金属を細胞に供給する方法は、細胞中に金属が導入される限り特に限定されない。例えば、細胞を培養している培地に、金属イオンの水溶液を添加する方法、細胞膜透過性を持つ化合物に金属を結合させる方法、マイクロインジェクションにより金属を直接、細胞内に注入する方法等が挙げられる。   The method for supplying the metal to the cell is not particularly limited as long as the metal is introduced into the cell. For example, a method of adding an aqueous solution of metal ions to a medium in which cells are cultured, a method of binding a metal to a compound having cell membrane permeability, a method of directly injecting a metal into a cell by microinjection, etc. .

そして細胞を電子顕微鏡により観察するが、電子顕微鏡による観察方法については後述する。   The cells are observed with an electron microscope, and an observation method with an electron microscope will be described later.

本発明の第一の態様ではまた、電子顕微鏡法により観察すべき細胞中の標的タンパク質の二次元または三次元情報を得るための、以下を含むキットを提供する:
(1)金属結合タンパク質または金属結合ペプチドをコードする部分を含み、かつ、所望の標的タンパク質が該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドとインフレームに結合することにより、該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと所望の標的タンパク質との融合タンパク質を発現させることが出来る発現カセット、および、
(2)該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドに結合する金属を含む試薬。
The first aspect of the invention also provides a kit for obtaining two-dimensional or three-dimensional information of a target protein in a cell to be observed by electron microscopy, comprising:
(1) A metal-binding protein or metal-binding peptide is included, and a desired target protein binds in-frame with the metal-binding protein or metal-binding peptide, thereby An expression cassette capable of expressing a fusion protein with a desired target protein, and
(2) A reagent containing a metal that binds to the metal-binding protein or metal-binding peptide.

かかるキットにおける(1)発現カセットは、金属に結合することが知られているタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子を必須に含み、該金属結合タンパク質またはペプチドと、所望の標的タンパク質がインフレームに結合して融合タンパク質を発現させることが出来るように、1または複数の制限部位を含むものである。   The expression cassette (1) in such a kit essentially contains a gene encoding a protein or peptide known to bind to metal, and the metal-binding protein or peptide and the desired target protein bind in frame. One or more restriction sites so that the fusion protein can be expressed.

発現カセットは、上記金属結合タンパク質またはペプチドをコードする部分、制限部位の他に、プロモーターを含むものが好ましい。プロモーターとしては、構成的プロモーターであるCMVプロモーター、誘導性プロモーターであるlacプロモーターなどが挙げられる。発現カセットには、所望によりターミネーターも含めてもよい。ターミネーターを含めない場合は、カセットに導入する標的タンパク質をコードする遺伝子にターミネーターを付加しておけばよい。   The expression cassette preferably contains a promoter in addition to a portion encoding the metal binding protein or peptide and a restriction site. Examples of the promoter include a CMV promoter that is a constitutive promoter, a lac promoter that is an inducible promoter, and the like. The expression cassette may include a terminator if desired. When a terminator is not included, a terminator may be added to the gene encoding the target protein to be introduced into the cassette.

また、発現カセットは、細菌性ベクター、例えばpET vector(Novagen)から作製してもよいし、ウイルス性ベクター、例えばpAd/CMV/V5-DESTTM Gateway(登録商標) vector(Invitrogen)などから作製してもよく、目的に応じて適宜設計すればよい。 The expression cassette may be prepared from a bacterial vector such as pET vector (Novagen), or from a viral vector such as pAd / CMV / V5-DEST Gateway (registered trademark) vector (Invitrogen). It may be designed appropriately according to the purpose.

上記キットにおける(2)該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドに結合する金属を含む試薬は、(1)の発現カセットにコードされる金属結合タンパク質または金属結合ペプチドに結合する金属を含む試薬であれば特に限定されず、金属の種類は金属結合タンパク質または金属結合ペプチドの種類に応じて適宜設定すればよい。   In the above kit, (2) the reagent containing a metal that binds to the metal-binding protein or metal-binding peptide is a reagent that contains a metal that binds to the metal-binding protein or metal-binding peptide encoded by the expression cassette of (1). It does not specifically limit, The kind of metal should just be set suitably according to the kind of metal binding protein or metal binding peptide.

例えば、金属結合タンパク質が3〜5個のメタロチオネインを含むものである場合、好ましくは金属はカドミウムである。   For example, when the metal binding protein contains 3 to 5 metallothioneins, the metal is preferably cadmium.

金属を含む試薬の形態は、所望の金属が細胞に供給されるような形態であれば特に限定されず、例えば、金属イオンと陰イオンの塩を固体または溶液の形態で含んでいるものとすればよい。また、試薬には所望により、緩衝剤などのpHを調節する試薬を含めてもよい。   The form of the reagent containing a metal is not particularly limited as long as the desired metal is supplied to the cell. For example, the reagent contains a metal ion and an anion salt in a solid or solution form. That's fine. Further, the reagent may contain a reagent for adjusting pH, such as a buffer, as desired.

次に、本発明の第二の方法およびキットについて説明する。なお、電子顕微鏡による観察方法については後述する。   Next, the second method and kit of the present invention will be described. An observation method using an electron microscope will be described later.

本発明の第二の態様の方法は、電子顕微鏡法により観察すべき標的タンパク質を検出する方法であって、
金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと標的タンパク質との融合タンパク質を発現させうるコンストラクトを提供する工程、
該コンストラクトを、細胞に導入する工程、
該細胞中で該コンストラクトから該融合タンパク質を発現させる工程、
該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと結合する金属を、該細胞に供給することにより、該細胞中にて該融合タンパク質中の金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと、該金属とのクラスターを形成させる工程、
該金属とクラスターを形成している融合タンパク質を含む試料を調製する工程、
該試料に含まれる融合タンパク質を電子顕微鏡により観察する工程、
を含む方法である。
The method of the second aspect of the present invention is a method for detecting a target protein to be observed by electron microscopy,
Providing a construct capable of expressing a metal binding protein or a fusion protein of a metal binding peptide and a target protein,
Introducing the construct into a cell;
Expressing the fusion protein from the construct in the cell;
Supplying a metal that binds to the metal-binding protein or metal-binding peptide to the cell, thereby forming a cluster of the metal with the metal-binding protein or metal-binding peptide in the fusion protein and the metal in the cell ,
Preparing a sample containing a fusion protein forming a cluster with the metal;
Observing the fusion protein contained in the sample with an electron microscope;
It is a method including.

好ましくは、標的タンパク質は、自己集合する性質を有するタンパク質や、ホモ多量体を形成するタンパク質である。かかるタンパク質は、金属結合タンパク質との融合タンパク質とされた場合でも、自己集合する性質およびホモ多量体を形成する能力を維持しているのが好ましい。自己集合またはホモ多量体の形成により、金属結合タンパク質または金属結合ペプチドも集合するため、多数の金属が集積し、集積した金属による良好なコントラストが得られる。   Preferably, the target protein is a protein having a property of self-assembly or a protein that forms a homomultimer. Even when such a protein is a fusion protein with a metal binding protein, it preferably maintains the property of self-assembly and the ability to form a homomultimer. Since metal-binding proteins or metal-binding peptides also assemble due to self-assembly or homomultimer formation, a large number of metals accumulate and a good contrast due to the accumulated metal is obtained.

検出する目的は、標的タンパク質の存在自体の有無を検出する目的であっても、標的タンパク自体または標的タンパク質を含む複合体の形態や立体構造を観察する目的であってもよい。   The purpose of detection may be the purpose of detecting the presence or absence of the target protein itself, or the purpose of observing the form or three-dimensional structure of the target protein itself or a complex containing the target protein.

金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと標的タンパク質との融合タンパク質を発現させうるコンストラクトを提供する工程については上記の第一の態様と同様である。   The step of providing a construct capable of expressing a metal binding protein or a fusion protein of a metal binding peptide and a target protein is the same as in the first aspect.

また、該コンストラクトを、該細胞に導入する工程も第一の態様と同様である。   The step of introducing the construct into the cell is the same as in the first embodiment.

該細胞中で該コンストラクトから該融合タンパク質を発現させる工程も第一の態様と同様である。
即ち、該コンストラクトから該融合タンパク質を発現させる際、金属結合タンパク質の存在が、標的タンパク質の立体構造、生理機能に影響を与えないよう適宜条件を設定する。
The step of expressing the fusion protein from the construct in the cell is the same as in the first embodiment.
That is, when expressing the fusion protein from the construct, conditions are appropriately set so that the presence of the metal binding protein does not affect the three-dimensional structure and physiological function of the target protein.

設定すべき条件としては、該コンストラクトを含む宿主細胞が、機能、活性、可溶性を保持した状態で目的タンパク質を発現できる、培養時間、培地組成、培養温度などが挙げられる。また、金属結合タンパク質が標的タンパク質の、フォールディング、集積、固有の構造に影響を与えない条件を設定する。 Conditions to be set include culture time, culture medium composition, culture temperature, etc. in which the host cell containing the construct can express the target protein in a state where the function, activity and solubility are maintained. In addition, conditions are set so that the metal binding protein does not affect the folding, accumulation, and unique structure of the target protein.

該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと結合する金属を、該細胞に供給することにより、該細胞中にて該融合タンパク質中の金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと、該金属とのクラスターを形成させる工程も第一の態様と同様である。   Supplying a metal that binds to the metal-binding protein or metal-binding peptide to the cell, thereby forming a cluster of the metal with the metal-binding protein or metal-binding peptide in the fusion protein and the metal in the cell Is the same as in the first embodiment.

該金属とクラスターを形成している融合タンパク質を含む試料を調製する工程について説明する。   A process for preparing a sample containing the fusion protein forming a cluster with the metal will be described.

該金属とクラスターを形成している融合タンパク質を含む試料は、細胞を物理的に破砕することにより得られた細胞破砕液であってよい。しかし、標的タンパク質を効率的に観察するためには、細胞から融合タンパク質を精製するとよい。精製方法は、当業者に周知のいずれの方法を用いてもよく、イオン交換クロマトグラフィーや、ゲルろ過クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて行ってもよい。   The sample containing the fusion protein that forms a cluster with the metal may be a cell disruption solution obtained by physically disrupting the cells. However, in order to observe the target protein efficiently, the fusion protein may be purified from the cells. As a purification method, any method known to those skilled in the art may be used, and ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, or the like may be appropriately combined.

また、精製を容易にするために、金属結合タンパク質またはペプチドと標的タンパク質を含む融合タンパク質にさらに、精製用のタグを付加すると、アフィニティークロマトグラフィーによる精製が容易となる。かかるタグとしては、FLAGタグ、Hisタグ、Sタグなどが挙げられる。   Further, in order to facilitate purification, if a purification tag is further added to a fusion protein containing a metal binding protein or peptide and a target protein, purification by affinity chromatography becomes easy. Such tags include FLAG tags, His tags, S tags, and the like.

そして該試料に含まれる融合タンパク質を電子顕微鏡により観察するが、電子顕微鏡による観察方法については後述する。   The fusion protein contained in the sample is observed with an electron microscope, and an observation method with an electron microscope will be described later.

本発明の第二の態様ではまた、電子顕微鏡法により観察すべき標的タンパク質を検出するための、以下を含むキットを提供する:
(1)金属結合タンパク質または金属結合ペプチドをコードする部分を含み、かつ、所望の標的タンパク質が該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドとインフレームに結合することにより、該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと所望の標的タンパク質との融合タンパク質を発現させることが出来る発現カセット、および、
(2)該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドに結合する金属を含む試薬。
The second aspect of the invention also provides a kit for detecting a target protein to be observed by electron microscopy, comprising:
(1) A metal-binding protein or metal-binding peptide is included, and a desired target protein binds in-frame with the metal-binding protein or metal-binding peptide, thereby An expression cassette capable of expressing a fusion protein with a desired target protein, and
(2) A reagent containing a metal that binds to the metal-binding protein or metal-binding peptide.

かかるキットにおける(1)および(2)は、第一の態様と同様である。   (1) and (2) in such a kit are the same as in the first embodiment.

本発明はさらに、標的タンパク質と遺伝的に融合して用いられる、金属結合タンパク質または金属結合ペプチドを含む、電子顕微鏡法による標的タンパク質の検出用マーカーを提供する。標的タンパク質と金属結合タンパク質または金属結合ペプチドとを遺伝的に融合させるための様々な手法が当業者に公知である。   The present invention further provides a marker for detection of a target protein by electron microscopy, which includes a metal binding protein or a metal binding peptide used in genetic fusion with the target protein. Various techniques for genetically fusing a target protein with a metal binding protein or metal binding peptide are known to those skilled in the art.

本発明の検出用マーカーは、標的タンパク質を電子顕微鏡法により検出するために使用する限り、上記第一および第二の態様のいずれの方法のために用いてもよく、金属結合タンパク質または金属結合ペプチドは好ましくは、少なくとも1つのメタロチオネインを含むものであり、例えば、1〜7個のメタロチオネインを含むものであり、さらに好ましくは、3〜5個のメタロチオネインを含むものであり、特に好ましくは、3個のメタロチオネインを含むものである。メタロチオネインが複数個である場合にはそれらはタンデムに連結されることが好ましい。かかるマーカーの検出方法は上記の通りである。   The detection marker of the present invention may be used for any of the methods of the first and second aspects as long as it is used for detecting a target protein by electron microscopy. Preferably contains at least one metallothionein, for example, contains 1 to 7 metallothioneins, more preferably contains 3 to 5 metallothioneins, particularly preferably 3 Of the metallothionein. When there are a plurality of metallothioneins, they are preferably linked in tandem. The method for detecting such a marker is as described above.

次に電子顕微鏡による観察方法について説明する。電子顕微鏡法は、透過型電子顕微鏡法および走査型電子顕微鏡法に分けられるが、本発明の方法では、透過型電子顕微鏡法が好適に用いられる。また、観察対象の三次元位置情報または三次元構造情報を得る目的には、電子顕微鏡法が透過型電子顕微鏡による電子線トモグラフィーであるのが好ましい。   Next, an observation method using an electron microscope will be described. Although electron microscopy is divided into transmission electron microscopy and scanning electron microscopy, transmission electron microscopy is preferably used in the method of the present invention. For the purpose of obtaining three-dimensional position information or three-dimensional structure information of the observation object, it is preferable that the electron microscopy is electron beam tomography using a transmission electron microscope.

以下に透過型電子顕微鏡法(以下、電子顕微鏡法と称することもある)について説明する。   Hereinafter, transmission electron microscopy (hereinafter sometimes referred to as electron microscopy) will be described.

電子顕微鏡法による方法としては、超薄切片法、凍結超薄切片法、急速凍結固定法、高圧凍結固定法、凍結置換固定法などを用いることができ、所望によりこれらの方法に電子染色法を組み合わせてもよい。   Electron microscopy methods include ultrathin sections, frozen ultrathin sections, rapid freeze fixation methods, high pressure freeze fixation methods, freeze replacement fixation methods, etc. You may combine.

本発明の第一の態様においては、観察対象は細胞であるが、電子顕微鏡法において観察するためには、0.3μm未満、例えば、0.05〜0.1μmの細胞の超薄切片を観察する。   In the first embodiment of the present invention, the observation object is a cell, but in order to observe by electron microscopy, an ultrathin section of a cell of less than 0.3 μm, for example, 0.05 to 0.1 μm is observed.

まず、基本的な電子顕微鏡法により細胞の切片を観察する方法について説明する。   First, a method for observing a cell section by basic electron microscopy will be described.

もっとも簡単な方法は、常温にて細胞の超薄切片を作成する方法である。かかる方法としては、化学的に前固定および後固定し、脱水後、樹脂で試料を包埋し、樹脂を重合させた後、超薄切して、酢酸ウラニルなどによる電子染色した後に、観察する方法がよく用いられている。しかし、本発明の方法では、後固定および電子染色をしなくても良好なコントラストが得られる。   The simplest method is to prepare an ultrathin section of cells at room temperature. Such methods include chemical pre-fixation and post-fixation, dehydration, embedding the sample with a resin, polymerizing the resin, ultra-slicing, electron staining with uranyl acetate, etc., and then observing The method is often used. However, in the method of the present invention, good contrast can be obtained without post-fixation and electron staining.

上記方法の他に、脱水や樹脂包埋を行わない凍結超薄切片法を好適に用いることが出来る。この方法では、脱水、樹脂包埋を行わずに凍結後、低温で切片を作成するため、生体に近い状態の切片が観察できる。   In addition to the above method, a freezing ultrathin section method that does not perform dehydration or resin embedding can be suitably used. In this method, since the section is prepared at low temperature after freezing without dehydration and resin embedding, a section close to a living body can be observed.

かかる方法としては、例えば、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒドなどで化学固定後、氷晶防止剤(ポリビニルピロニドン等)処理し、急速凍結し、凍結超薄切片をクライオミクロトームで作製する方法が挙げられる。また、氷晶防止剤を用いない方法として、急速凍結固定法、高圧凍結固定法などが挙げられ、いずれも本発明の方法に用いることが出来る。   Examples of such a method include a method of chemically fixing with paraformaldehyde, glutaraldehyde and the like, then treating with an anti-icing agent (polyvinylpyronidone, etc.), rapidly freezing, and preparing a frozen ultrathin section with a cryomicrotome. It is done. Examples of methods that do not use an anti-icing agent include a quick freeze fixation method and a high pressure freeze fixation method, and any of them can be used in the method of the present invention.

以下に、常套の電子顕微鏡法による常温にて細胞の超薄切片を作製する超薄切片法について説明する。組織、細胞観察において超薄切片法は電子顕微鏡法の基礎である。   The ultrathin section method for producing ultrathin sections of cells at room temperature by conventional electron microscopy will be described below. The ultrathin section method is the basis of electron microscopy in tissue and cell observation.

超薄切片法では、試料を、固定した後、エポキシ系樹脂に包埋し、80nm程度の超薄切片を、超薄切用のダイヤモンドナイフを装着したウルトラミクロトームによって得る。   In the ultrathin section method, a sample is fixed and then embedded in an epoxy resin, and an ultrathin section of about 80 nm is obtained by an ultramicrotome equipped with a diamond knife for ultrathin cutting.

1.化学固定
まず、細胞の構造を保存するために一般に化学固定を行う。化学固定に対する概念として、物理固定、すなわち、急速凍結により、瞬時に動きを停止させ、構造を保持する固定方法があるが、その場合、凍結装置が必要である。この方法については後述する。
1. Chemical fixation First, chemical fixation is generally performed in order to preserve the cell structure. As a concept for chemical fixation, there is a fixation method in which the movement is stopped instantaneously and the structure is held by physical fixation, that is, rapid freezing. In this case, a freezing device is required. This method will be described later.

化学固定としては、グルタールアルデヒド/パラホルムアルデヒド(還元剤)による前固定と、四酸化オスミニウム(酸化剤)による二重固定が一般的である。しかし、本発明の方法では、グルタールアルデヒド/パラホルムアルデヒドによる前固定のみで良好に観察できる。もちろん、四酸化オスミニウムによる後固定を行ってもよい。   As chemical fixation, pre-fixation with glutaraldehyde / paraformaldehyde (reducing agent) and double fixation with osmium tetroxide (oxidant) are generally used. However, in the method of the present invention, it can be observed well only by pre-fixation with glutaraldehyde / paraformaldehyde. Of course, post-fixation with osmium tetroxide may be performed.

また、固定には灌流固定と浸漬固定があるが、灌流固定においても、前固定液を被験動物に灌流し、組織を培出した後、浸漬固定する。浸漬固定は、例えば、前固定液に2時間、後固定液に1時間試料を浸漬して行う。   In addition, the fixation includes perfusion fixation and immersion fixation. Also in perfusion fixation, the prefix solution is perfused into the test animal, the tissue is cultivated, and then immersion fixation is performed. The immersion fixation is performed, for example, by immersing the sample in the front fixing solution for 2 hours and in the rear fixing solution for 1 hour.

前固定液の例としては、緩衝液(カコジル酸またはHEPES)にグルタールアルデヒドおよびパラホルムアルデヒドを含む液が挙げられ、後固定液の例としては、緩衝液に四酸化オスミニウムを含む水溶液が挙げられる。化学固定が終わったら、試料を洗浄して脱水する。   Examples of the pre-fix solution include a solution containing glutaraldehyde and paraformaldehyde in a buffer solution (cacodylic acid or HEPES), and examples of the post-fix solution include an aqueous solution containing osmium tetroxide in the buffer solution. . After chemical fixation, the sample is washed and dehydrated.

2.脱水・包埋
次に、試料中の水分をアルコールなどに置換することにより脱水する。脱水には、アルコール、アセトン、ジメチルホルムアミド等を用いることができるが、エタノール濃度の上昇系列が一般に用いられている。100%脱水することが好ましい。
2. Dehydration and embedding Next, the sample is dehydrated by replacing the water in the sample with alcohol. For dehydration, alcohol, acetone, dimethylformamide or the like can be used, but an increasing series of ethanol concentration is generally used. It is preferable to dehydrate 100%.

脱水後、包埋用樹脂の試料への浸透を促進するために、浸透処理を行う。浸透には、包埋用樹脂と、酸化プロピレンの1:1混合液が好適に用いられる。   After dehydration, infiltration treatment is performed in order to promote penetration of the embedding resin into the sample. For the penetration, a 1: 1 mixture of embedding resin and propylene oxide is preferably used.

次に樹脂による包埋を行う。まず、浸透に用いた酸化プロピレンを含んだ樹脂を除いた後、樹脂、好ましくはエポキシ系樹脂で試料を包埋する。例えば、エポキシ系樹脂であれば、35℃で4時間、45℃で12時間、さらに60℃で24時間放置して硬化させる。   Next, embedding with resin is performed. First, after removing the resin containing propylene oxide used for infiltration, the sample is embedded with a resin, preferably an epoxy resin. For example, in the case of an epoxy resin, it is left to cure at 35 ° C. for 4 hours, 45 ° C. for 12 hours, and further at 60 ° C. for 24 hours.

3.重合
重合には熱重合と光重合があるが、エポキシ系樹脂の熱重合が薄切しやすいために、一般的である。次いで重合させた試料を薄切する。
3. Polymerization There are two types of polymerization: thermal polymerization and photopolymerization, which are common because thermal polymerization of epoxy resins is easy to slice. The polymerized sample is then sliced.

4.薄切
ウルトラミクロトームにより、厚さ80nm程度の超薄切片を作製する。
4. Thin section Ultra-thin sections with a thickness of about 80 nm are prepared using an ultramicrotome.

そして、所望により重金属(ウラン、鉛)などにより電子染色後、観察する。本発明の方法では、電子染色を行ってもよいが、行わなくても良好なコントラストが得られる。   Then, if desired, observation is performed after electron staining with heavy metals (uranium, lead) or the like. In the method of the present invention, electron staining may be performed, but a good contrast can be obtained without this.

観察は、試料をグリッド(銅、ニッケル、金、モリブデン製)に載せて行う。 The observation is performed by placing the sample on a grid (made of copper, nickel, gold, molybdenum).

次に、試料を凍結により物理固定する方法について説明する。   Next, a method for physically fixing a sample by freezing will be described.

上記の化学固定を行う常套方法では固定液が必要であるが、物理固定では、瞬時に凍らせて急速凍結することにより試料を固定し、凍結してから超薄切片にする。試料を凍結する場合、無氷晶にする必要がある。無氷晶で凍結させる方法の例としては、急速凍結法、高圧凍結法などが挙げられる。また、凍結後、凍結置換固定して超薄切片とする方法もある。急速凍結法では、試料を液体ヘリウムなどにより、10,000℃/秒以上の速度で急速に凍結させる。   In the conventional method for performing chemical fixation, a fixing solution is required. However, in physical fixation, the sample is fixed by instant freezing and quick freezing, and then frozen to an ultrathin section. When freezing a sample, it is necessary to make it ice-free. Examples of the method of freezing with ice-free crystals include a rapid freezing method and a high-pressure freezing method. In addition, there is a method in which after freezing, freeze-replacement fixation is performed to obtain ultrathin sections. In the quick freezing method, a sample is rapidly frozen with liquid helium at a rate of 10,000 ° C./second or more.

また、細胞の二次元情報を得る場合には通常の電子顕微鏡法を用いればよいが、三次元立体情報を得るためには、電子線トモグラフィーを用いる。 In addition, in order to obtain two-dimensional information of cells, an ordinary electron microscope may be used, but in order to obtain three-dimensional solid information, electron beam tomography is used.

電子線トモグラフィーは電子顕微鏡を用いたコンピュータ断層撮影の1種であり、試料を100nm〜数μm(例えば、300nmや1μm等)の厚さとする。   Electron tomography is one type of computed tomography using an electron microscope, and a sample has a thickness of 100 nm to several μm (for example, 300 nm, 1 μm, etc.).

電子線トモグラフィーは通常の温度で行う場合、試料を上記のように固定、包埋後に超薄切片(例えば、300nm)とし、所望により、ウラン、鉛により電子染色してから観察する。本発明の方法では、電子染色を行わなくても良好なコントラストが得られる。   When electron beam tomography is performed at a normal temperature, the sample is fixed and embedded as described above, and an ultrathin section (for example, 300 nm) is obtained. If desired, the sample is electron-stained with uranium or lead and then observed. In the method of the present invention, good contrast can be obtained without performing electron staining.

凍結切片を用いる電子線トモグラフィー(クライオ電子線トモグラフィー)では、クライオミクロトームで薄切した切片を低温電子顕微鏡で観察する。   In electron beam tomography (cryo electron tomography) using a frozen section, a section sliced with a cryomicrotome is observed with a cryoelectron microscope.

本発明の第二の態様においては、観察対象はタンパク質そのものである。以下に、透過型電子顕微鏡法によりタンパク質そのものを観察する方法について説明する。   In the second embodiment of the present invention, the observation target is the protein itself. Hereinafter, a method for observing the protein itself by transmission electron microscopy will be described.

まず、通常の電子顕微鏡法では、検出または形態観察の対象であるタンパク質そのものを含む溶液をグリッドに載せて乾燥させればよい。即ち、溶液中の粒子を見る場合、固定包埋は不要である。酢酸ウラニルなどによるネガティブ染色を施してもよいが、本発明の方法ではネガティブ染色を行わなくてもコントラストが得られる。   First, in normal electron microscopy, a solution containing the protein itself that is the object of detection or morphology observation may be placed on a grid and dried. That is, when embedding particles in solution, fixed embedding is not necessary. Although negative staining with uranyl acetate or the like may be performed, the method of the present invention can provide contrast without performing negative staining.

次に低温電子顕微鏡法では、氷包埋法を用いるとよい。氷包埋法は、電子顕微鏡法の急速凍結法の一種であり、試料を急速凍結し、固定/染色を行わずに、極低温、例えば-270℃程度で電子顕微鏡による観察を行う。-270℃程度での電子顕微鏡観察には、液体ヘリウム冷却ステージを備えた極低温電子顕微鏡を用いるとよい。   Next, in cryogenic electron microscopy, an ice embedding method may be used. The ice embedding method is a kind of rapid freezing method of electron microscopy, in which a sample is rapidly frozen and observed with an electron microscope at a very low temperature, for example, about −270 ° C. without fixing / staining. For electron microscope observation at around -270 ° C, it is better to use a cryogenic electron microscope equipped with a liquid helium cooling stage.

低温電子顕微鏡法では、親水化処理済みグリッドに載せたタンパク質水溶液をそのまま液体窒素で冷却した液化エタンで急速凍結し、非晶質氷に包埋された試料を観察する。薄膜状に形成された非晶質の氷を支持体として、固定も染色も乾燥もしないで観察出来る。   In cryo-electron microscopy, an aqueous protein solution placed on a hydrophilized grid is snap-frozen with liquefied ethane cooled with liquid nitrogen as it is, and a sample embedded in amorphous ice is observed. It can be observed without fixing, dyeing or drying using amorphous ice formed in a thin film as a support.

本発明の方法では、上記のように、後固定やネガティブ染色を行わなくても良好なコントラストを得ることが出来る。しかし、所望により、他の増感方法を組み合わせて用いてもよい。   In the method of the present invention, as described above, good contrast can be obtained without performing post-fixation or negative staining. However, other sensitization methods may be used in combination as desired.

以下実施例により本発明を詳細に説明する。   Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

初代培養神経細胞におけるポストシナプス肥厚部タンパク質(PSD-95)とメタロチオネイン(MT)との融合タンパク質の電子顕微鏡的分析(MTを融合させたPSD-95の可視化)
本実施例において、電子顕微鏡法によりトランスフェクションされた培養細胞におけるタンパク質の局在を調べるために遺伝的コード化タグを用いた。本発明者らは3つのタンデムなMTのリピート(3MT)に融合したPSD-95(PDS-95-3MT)を、Cd2+の存在下で培養したCOS7細胞から精製した。PSD-95-3MTは電子顕微鏡法により黒色粒子として検出された。PSD-95-3MTの細胞内局在を可視化するために、この融合タンパク質をコードする発現コンストラクトを初代培養神経細胞にトランスフェクションし、その後培地にCd2+を添加した。Cd2+結合PSD-95-3MTの細胞内蓄積により、電子顕微鏡像において良好なコントラストが得られた。遺伝的に融合された3MTタグが標的タンパク質の局在および/または機能に影響を及ぼしているかを調べたところ、本発明者らは、3MTのPSD-95への融合はそのポストシナプス肥厚部(PSD)への局在、その既知の結合パートナーとの相互作用のいずれも変化させないことを見いだした。これらの結果は、Cd2+を配位する3MTは、電子顕微鏡法によるタンパク質局在研究のための価値ある遺伝的コード化タグであることを示す。
Electron microscopic analysis of fusion protein of post-synaptic hypertrophy protein (PSD-95) and metallothionein (MT) in primary cultured neurons (visualization of PSD-95 fused with MT)
In this example, genetically encoded tags were used to examine protein localization in cultured cells transfected by electron microscopy. We purified PSD-95 (PDS-95-3MT) fused to 3 tandem MT repeats (3MT) from COS7 cells cultured in the presence of Cd 2+ . PSD-95-3MT was detected as black particles by electron microscopy. In order to visualize the subcellular localization of PSD-95-3MT, an expression construct encoding this fusion protein was transfected into primary cultured neurons, and then Cd 2+ was added to the medium. Due to intracellular accumulation of Cd 2+ -bound PSD-95-3MT, good contrast was obtained in electron micrographs. When we investigated whether genetically fused 3MT tags affect the localization and / or function of target proteins, we found that 3MT fusion to PSD-95 is a post-synaptic thickening ( We found that neither localization to PSD) nor interaction with its known binding partners was altered. These results indicate that 3MT coordinating Cd 2+ is a valuable genetically encoded tag for protein localization studies by electron microscopy.

PSDに存在するPSD-95は、いくつかのタンパク質相互作用ドメインを持つ足場タンパク質ファミリーのメンバーである。PSD-95は多数のタンパク質とPSDにてクラスター形成し、それらをアンカーすると推定されており、かかるタンパク質としては、N-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)受容体が挙げられる[Sheng M & Pak D T (2000) Ligand-gated ion channel interactions with cytoskeletal and signaling proteins. Annu Rev Physiol 62: 755-778]。PSD-95遺伝子をノックダウンされたマウスは機能的なNMDA受容体を保持しているが、長期増強の異常と学習障害を起こすことが示された[Migaud M, Charlesworth P, Dempster M, Webster L C, Watabe A M, Makhinson M, He Y, Ramsay M F, Morris R G, Morrison J H, O'Dell T J & Grant S G (1998) Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein. Nature 396: 433-439]。したがってPSD-95の機能の一つは、シナプス可塑性の機構に寄与する細胞内シグナル伝達タンパク質とNMDA受容体とを共役させることである [Tomita S, Nicoll R A & Bredt D S (2001) PDZ protein interactions regulating glutamate receptor function and plasticity. J Cell Biol 153: F19-24]。PSD-95の詳細な細胞内分布が明らかになれば、シナプス可塑性機構の理解の助けとなるであろう。   PSD-95, present in PSD, is a member of a scaffold protein family with several protein interaction domains. PSD-95 is presumed to cluster with and anchor many proteins and PSDs, such as the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor [Sheng M & Pak DT (2000) Ligand-gated ion channel interactions with cytoskeletal and signaling proteins. Annu Rev Physiol 62: 755-778]. Mice knocked down with the PSD-95 gene retain functional NMDA receptors, but have been shown to cause abnormal long-term potentiation and impaired learning [Migaud M, Charlesworth P, Dempster M, Webster LC , Watabe AM, Makhinson M, He Y, Ramsay MF, Morris RG, Morrison JH, O'Dell TJ & Grant SG (1998) Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein.Nature 396: 433-439]. Therefore, one of the functions of PSD-95 is to couple intracellular signaling proteins that contribute to the mechanism of synaptic plasticity to NMDA receptors [Tomita S, Nicoll RA & Bredt DS (2001) PDZ protein interactions regulating glutamate receptor function and plasticity. J Cell Biol 153: F19-24]. If the detailed intracellular distribution of PSD-95 is clarified, it will help to understand the mechanism of synaptic plasticity.

材料および方法
細胞培養
COS7細胞は10%ウシ胎児血清を追加したDMEM培地に培養した。トランスフェクションの1日前、細胞を100mmペトリ皿に播種した。トランスフェクション時の細胞密度はは80-90%であった。
神経細胞は胎生19日目のラット(Sprague-Dawley ; Japan SLC,Japan)の脳(海馬領域)から調製した。摘出した海馬をトリプシン処理およびピペッティングにより単離した。細胞懸濁液をポリ-L-リジンおよびラミニン-被覆15mm円形カバーグラスに、アデノウイルス形質導入用には2.5x104/cm2で、リポフェクション用には6x104/cm2で播種した。神経細胞はグルタミン酸、B-27(Invitrogen)、GlutaMAXTM(Invitrogen)、ペニシリン、およびストレプトマイシンを追加したNeurobasal培地(Invitrogen)に、5%CO2を含む加湿環境にて培養した。播種の2日後、アラビノシドCを培地に添加してグリア細胞増殖を阻害した。播種の3日後、培地をB-27、GlutaMAX、ペニシリンおよびストレプトマイシンを追加したNeurobasal培地に交換した。その後、培地を週に一度交換した。
Materials and methods <br/> Cell culture
COS7 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum. One day before transfection, cells were seeded in 100 mm Petri dishes. The cell density at the time of transfection was 80-90%.
Nerve cells were prepared from the brain (hippocampal region) of embryonic day 19 rats (Sprague-Dawley; Japan SLC, Japan). The excised hippocampus was isolated by trypsinization and pipetting. The cell suspension poly -L- lysine and laminin - the coated 15mm circular coverslips, and for adenoviral transduced with 2.5 × 10 4 / cm 2, is for lipofection and plated at 6x10 4 / cm 2. Neurons were cultured in Neurobasal medium (Invitrogen) supplemented with glutamate, B-27 (Invitrogen), GlutaMAX (Invitrogen), penicillin, and streptomycin in a humidified environment containing 5% CO 2 . Two days after sowing, arabinoside C was added to the medium to inhibit glial cell proliferation. Three days after sowing, the medium was replaced with Neurobasal medium supplemented with B-27, GlutaMAX, penicillin and streptomycin. Thereafter, the medium was changed once a week.

クローニングおよびプラスミド構築
pcDNA3.1(-)に組み込まれた全長マウスPSD-95ならびにpcDNA3.1(+)に組み込まれたShaker型カリウムチャネル(Kv1.4)およびc-Mycタグ付加NR2B(NMDA受容体のサブユニット)遺伝子は、今村文昭博士(エール大学)および藤吉好則教授(京都大学)から譲り受けた。c-Mycタグ(EQKLISEEDL)は、NR2Bのアミノ酸残基27および28の間に挿入されていた。pCR2.1に組み込まれた全長マウス神経細胞一酸化窒素合成酵素(nNOS)遺伝子は、小倉勤博士(国立がんセンター研究所)から譲り受けた。
Cloning and plasmid construction
Full-length mouse PSD-95 incorporated into pcDNA3.1 (-) and Shaker-type potassium channel (Kv1.4) and c-Myc-tagged NR2B (subunit of NMDA receptor) incorporated into pcDNA3.1 (+) The gene was obtained from Dr. Fumiaki Imamura (Yale University) and Yoshinori Fujiyoshi (Kyoto University). The c-Myc tag (EQKLISEEDL) was inserted between amino acid residues 27 and 28 of NR2B. The full-length mouse neuronal nitric oxide synthase (nNOS) gene incorporated into pCR2.1 was obtained from Dr. Tsutomu Ogura (National Cancer Center Research Institute).

PSD-95のcDNAは以下の制限酵素切断部位を付加した特異的プライマー対を用いて増幅した: 5'-TAG CTA GCA TGG ACT GTC TCT GTA TAG TG-3'(配列番号1)および、5'-TAC TCG AGC CTA GGG AGT CTC TCT CGG GCT GGG A-3'(配列番号2)。増幅断片をpET21bのNheIおよびXhoI部位にサブクローニングした(PSD-95-pET21b)。同様に、MTIIのcDNAを、マウス腎臓cDNAライブラリー(宝酒造)から、制限酵素切断部位およびFLAGタグを含む以下の特異的プライマー対を用いたPCRによりクローニングした: 5'-ATG CTA GCC CTA GGG GAA TGG ACC CCA ACT GC-3'(配列番号3)および5'-ATC TCG AGC TAC TTG TCG TCG TCA TCC TTG TAG TCA CTA GTA CCG GCA CAG CAG CTG CAC TTG T-3'(配列番号4)。増幅断片をBlnIおよびXhoIで消化し、PSD-95-pET21bの対応する制限部位に挿入し、PSD-95-MT-FLAG-pET21bを得た。   PSD-95 cDNA was amplified using specific primer pairs with the following restriction enzyme cleavage sites: 5'-TAG CTA GCA TGG ACT GTC TCT GTA TAG TG-3 '(SEQ ID NO: 1) and 5' -TAC TCG AGC CTA GGG AGT CTC TCT CGG GCT GGG A-3 '(sequence number 2). The amplified fragment was subcloned into the NheI and XhoI sites of pET21b (PSD-95-pET21b). Similarly, the MTII cDNA was cloned from a mouse kidney cDNA library (Takara Shuzo) by PCR using the following specific primer pair containing a restriction enzyme cleavage site and a FLAG tag: 5'-ATG CTA GCC CTA GGG GAA TGG ACC CCA ACT GC-3 ′ (SEQ ID NO: 3) and 5′-ATC TCG AGC TAC TTG TCG TCG TCA TCC TTG TAG TCA CTA GTA CCG GCA CAG CAG CTG CAC TTG T-3 ′ (SEQ ID NO: 4). The amplified fragment was digested with BlnI and XhoI and inserted into the corresponding restriction site of PSD-95-pET21b to obtain PSD-95-MT-FLAG-pET21b.

PSD-95-2MT-FLAG-pET21bを構築するために、MTの断片をBlnIおよびSpeIによりPSD-95-MT-FLAG-pET21bから切り出し、BlnIで消化しておいたPSD-95-MT-FLAG-pET21bに挿入した。PSD-95-3MT-FLAG-pET21bはこの手順を繰り返すことにより調製した。PSD-95-FLAG-pET21bは、MT断片をBlnIおよびSpeIにより切り出して自己連結させることにより得た。MT-FLAG-pET21bは、PSD-95-3MT-FLAG-pET21b から、PSD-95断片をNheIおよびBlnIにより切り出して自己連結させることにより得た。PSD-95-3MT-FLAG-pET21b、PSD-95-FLAG-pET21b、およびMT-FLAG-pET21bを、NheIおよびXhoIで消化し、インサート配列をpcDNA3.1(-)(Invitrogen)の対応する制限部位に連結した。クローニングおよびプラスミド構築は大腸菌Top10F'株(Invitrogen)にて行った。以下、簡潔に記載するため、PSD-95-3MT-FLAGはPSD-95-3MTと略称する。   To construct PSD-95-2MT-FLAG-pET21b, the MT fragment was excised from PSD-95-MT-FLAG-pET21b with BlnI and SpeI and digested with BlnI PSD-95-MT-FLAG- Inserted into pET21b. PSD-95-3MT-FLAG-pET21b was prepared by repeating this procedure. PSD-95-FLAG-pET21b was obtained by excising the MT fragment with BlnI and SpeI and self-ligating. MT-FLAG-pET21b was obtained by excising PSD-95 fragment from PSD-95-3MT-FLAG-pET21b with NheI and BlnI and self-ligating. PSD-95-3MT-FLAG-pET21b, PSD-95-FLAG-pET21b, and MT-FLAG-pET21b are digested with NheI and XhoI and the insert sequence is the corresponding restriction site in pcDNA3.1 (-) (Invitrogen) Connected. Cloning and plasmid construction were performed in E. coli Top10F 'strain (Invitrogen). Hereinafter, for simplicity, PSD-95-3MT-FLAG is abbreviated as PSD-95-3MT.

トランスフェクション
COS7細胞に、発現ベクターを、Lipofectamine 2000を説明書の指示に従って用いてトランスフェクションした。PSD-95および、Kv1.4、NR2BまたはnNOSを1:1の比でトランスフェクションした。培養13-14日目の神経細胞に、pcDNA3.1(-)中のPSD-95-3MT、PSD-95またはMT遺伝子をトランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後、CdCl2を培地に濃度20μM(COS7細胞)または5μM(神経細胞)となるように添加した。COS7細胞または神経細胞をさらに19時間培養した後、免疫共沈降または免疫細胞化学に供した。
Transfection
COS7 cells were transfected with the expression vector using Lipofectamine 2000 according to the instructions in the instructions. PSD-95 and Kv1.4, NR2B or nNOS were transfected at a 1: 1 ratio. Neurons on day 13-14 of culture were transfected with PSD-95-3MT, PSD-95 or MT gene in pcDNA3.1 (−). 24 hours after transfection, CdCl 2 was added to the medium to a concentration of 20 μM (COS7 cells) or 5 μM (neuronal cells). COS7 cells or neurons were further cultured for 19 hours before being subjected to co-immunoprecipitation or immunocytochemistry.

免疫共沈降
COS7細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄し、免疫沈降用緩衝液(50mM Tris、pH8.0、150mM NaCl、0.5% NP-40) に再懸濁し、5秒間氷上で超音波処理した。抽出物を40,000gで30分間4℃で遠心した。その結果得られた上清を抗FLAG(登録商標)M2アフィニティーゲル(Sigma、USA) とともに一晩4℃でインキュベートした。その後、ゲルを氷冷免疫沈降バッファーで5回洗浄した。結合したタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム(SDS)サンプルバッファーで溶出し、5分間煮沸した。タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により分離した。電気泳動の後、タンパク質サンプルをセミドライエレクトロブロッティングによりニトロセルロースにトランスファーした。イムノブロットを以下の一次抗体で標識し: ウサギ抗FLAG抗体(1:500、Affinity BioReagents、USA); ウサギ抗Kv1.4抗体(1:2,000、Chemicon、USA); ウサギ抗nNOS抗体(1:2,000、BD Transduction Laboratory、USA);マウス抗Myc抗体(1:200、Santa Cruz Biotechnology、USA)、そしてアルカリ性ホスファターゼ結合二次抗体および発色基質を用いて可視化した。
Co-immunoprecipitation
COS7 cells were washed with phosphate buffered saline (PBS), resuspended in immunoprecipitation buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5% NP-40) and sonicated on ice for 5 seconds. . The extract was centrifuged at 40,000 g for 30 minutes at 4 ° C. The results obtained supernatant anti FLAG (TM) M2 affinity gel (Sigma, USA) and incubated overnight at 4 ° C. with. The gel was then washed 5 times with ice-cold immunoprecipitation buffer. The bound protein was eluted with sodium dodecyl sulfate (SDS) sample buffer and boiled for 5 minutes. Proteins were separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Following electrophoresis, protein samples were transferred to nitrocellulose by semi-dry electroblotting. The immunoblot was labeled with the following primary antibodies: rabbit anti-FLAG antibody (1: 500, Affinity BioReagents, USA); rabbit anti-Kv1.4 antibody (1: 2,000, Chemicon, USA); rabbit anti-nNOS antibody (1: 2,000) , BD Transduction Laboratory, USA); mouse anti-Myc antibody (1: 200, Santa Cruz Biotechnology, USA), and alkaline phosphatase-conjugated secondary antibody and chromogenic substrate.

PSD-95-3MTタンパク質の精製
細胞を10μg/mL DNase、10μg/mL RNaseおよび1タブレット/100mL complete protease inhibitor cocktail(Roche、Germany)を含有するTris緩衝液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH7.4)に懸濁し、超音波処理により破砕した。細胞破砕液を4℃で1時間インキュベートし、10,000gで1時間4℃で遠心した。可溶性画分をTris緩衝液で平衡化した抗FLAG M2アフィニティーカラム(Sigma)にかけた。カラムを10カラム体積のTris緩衝液で洗浄し、タンパク質を100mM グリシン、150mM NaCl(pH3.5)で溶出した。溶出液を0.5M Tris-HCl(pH8.0)の添加によりすぐに中和した。次いで、タンパク質をvivaspin100(VIVASCIENCE、Germany)を用いて0.05μg/mLに濃縮した。
Purification of PSD-95-3MT protein Tris buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7. containing 10 μg / mL DNase, 10 μg / mL RNase and 1 tablet / 100 mL complete protease inhibitor cocktail (Roche, Germany). It was suspended in 4) and crushed by sonication. The cell lysate was incubated at 4 ° C for 1 hour and centrifuged at 10,000g for 1 hour at 4 ° C. The soluble fraction was applied to an anti-FLAG M2 affinity column (Sigma) equilibrated with Tris buffer. The column was washed with 10 column volumes of Tris buffer and the protein was eluted with 100 mM glycine, 150 mM NaCl (pH 3.5). The eluate was immediately neutralized by the addition of 0.5M Tris-HCl (pH 8.0). The protein was then concentrated to 0.05 μg / mL using vivaspin 100 (VIVASCIENCE, Germany).

金属含量の分析
精製タンパク質溶液中のカドミウム濃度を、沖エンジニアリング株式会社によりICP発光分光分析法を用いて測定した。タンパク質濃度は牛血清アルブミン(BSA)を標準として用いてSDS-PAGEゲル上でクーマシーブリリアントブルーにより染色したバンドの濃度を定量、比較することにより測定した。
Analysis of metal content The cadmium concentration in the purified protein solution was measured by ICP emission spectroscopy by Oki Engineering Co., Ltd. The protein concentration was measured by quantitatively comparing the concentration of the band stained with Coomassie Brilliant Blue on an SDS-PAGE gel using bovine serum albumin (BSA) as a standard.

アデノウイルス構築および形質導入
PSD-95-3MTの発現コンストラクト(pAdPSD-95-3MT)を含むアデノウイルスをViraPower Adenovirus Expression System(Invitrogen)により説明書の指示に従って調製した。簡単に説明すると、PSD-95-3MTをpENTER Directional TOPOクローニングキット(Invitrogen)を用いてpENTER/D-TOPOベクターにサブクローニングした。次にcDNAインサートをLR Clonaseを用いたGateway systemによりpAd/CMV/V5-DESTベクターに移した。プラスミドを精製し、PacI(New England Biolabs、USA)で消化した。直鎖化したプラスミドをOpti-MEM培地中でLipofectamine2000と混合し、サブコンフルエントな293A細胞にトランスフェクションした。次いで293A細胞を10%ウシ胎児血清を含有するDMEM中で1-2週間培養し、培地を1日おきに交換した。ほとんどの細胞がプレートから剥離したら、細胞および培地を共に収集し、2回凍結融解し、遠心して、アデノウイルスが濃縮された上清を得た。この上清のアリコットを新たな293A細胞に添加し、23日間培養してアデノウイルスを増幅させた。第二ラウンドの増幅の後、結果として得られたアデノウイルス-含有培地をウイルスストックとして用いた。ウイルス力価は50%感染価(tissue culture infection dose)(TCID50=4.4x107)を算出することにより決定した。
Adenovirus construction and transduction
An adenovirus containing an expression construct of PSD-95-3MT (pAdPSD-95-3MT) was prepared by ViraPower Adenovirus Expression System (Invitrogen) according to the instructions in the instructions. Briefly, PSD-95-3MT was subcloned into the pENTER / D-TOPO vector using the pENTER Directional TOPO cloning kit (Invitrogen). Next, the cDNA insert was transferred to the pAd / CMV / V5-DEST vector by the Gateway system using LR Clonase. The plasmid was purified and digested with PacI (New England Biolabs, USA). The linearized plasmid was mixed with Lipofectamine 2000 in Opti-MEM medium and transfected into sub-confluent 293A cells. The 293A cells were then cultured for 1-2 weeks in DMEM containing 10% fetal calf serum and the medium was changed every other day. When most cells detached from the plate, the cells and medium were collected together, freeze-thawed twice, and centrifuged to obtain adenovirus-enriched supernatant. An aliquot of this supernatant was added to fresh 293A cells and cultured for 23 days to amplify adenovirus. After the second round of amplification, the resulting adenovirus-containing medium was used as the virus stock. The virus titer was determined by calculating a 50% infection culture infection dose (TCID 50 = 4.4 × 10 7 ).

アデノウイルス含有培地のアリコットを培養9日目の初代培養神経細胞に添加した。ウイルス添加3日後、CdCl2を培地に5μMとなるように添加した。細胞を19時間インキュベートした後、免疫細胞化学または電子顕微鏡法のために固定した。 An aliquot of adenovirus-containing medium was added to the primary cultured neurons on day 9 of culture. Three days after the addition of virus, CdCl 2 was added to the medium to 5 μM. Cells were incubated for 19 hours and then fixed for immunocytochemistry or electron microscopy.

免疫細胞化学
神経細胞を4%パラホルムアルデヒド/PBSで20分間固定し、10mMグリシン/PBSによりクエンチし、0.5% NP-40/PBSを用いて5分間室温で透過処理した。シナプトフィジンを検出するためには、神経細胞をパラホルムアルデヒドではなく-20℃で10分間メタノール処理した。さらに1% BSA、10%ヤギ血清および0.5% Triton X-100/PBSで1時間ブロッキングし、一晩4℃で以下の一次抗体のいずれかとともにインキュベートした: 1:2,000希釈のウサギ 抗FLAG抗体(Affinity BioReagents、USA); 1:1,000希釈のマウス モノクローナル抗シナプトフィジン抗体 (Sigma);または1:1,000希釈のウサギ ポリクローナル抗MT抗体(Transgenic、Japan)。細胞を3回PBSで洗浄した後、細胞をAlexa488結合二次抗体(1:500、Molecular Probes、USA)またはAlexa543結合二次抗体(1:500、Molecular Probes)とともに1時間インキュベートした。細胞を次いでPBSで3回洗浄し、Vectashield(Vector、USA)で封入した。神経細胞をLSM510 共焦点レーザースキャン顕微鏡(Carl Zeiss、Germany)を用いて観察した。
Immunocytochemical neurons were fixed with 4% paraformaldehyde / PBS for 20 minutes, quenched with 10 mM glycine / PBS, and permeabilized with 0.5% NP-40 / PBS for 5 minutes at room temperature. To detect synaptophysin, neurons were treated with methanol at -20 ° C for 10 minutes instead of paraformaldehyde. Further blocked with 1% BSA, 10% goat serum and 0.5% Triton X-100 / PBS for 1 hour and incubated overnight at 4 ° C. with one of the following primary antibodies: 1: 2,000 dilution of rabbit anti-FLAG antibody ( Affinity BioReagents, USA); 1: 1,000 dilution of mouse monoclonal anti-synaptophysin antibody (Sigma); or 1: 1,000 dilution of rabbit polyclonal anti-MT antibody (Transgenic, Japan). After washing the cells 3 times with PBS, the cells were incubated with Alexa488-conjugated secondary antibody (1: 500, Molecular Probes, USA) or Alexa543-conjugated secondary antibody (1: 500, Molecular Probes) for 1 hour. Cells were then washed 3 times with PBS and mounted with Vectashield (Vector, USA). Neurons were observed using an LSM510 confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Germany).

生存率の評価
細胞生存率をカルセインおよびヨウ化プロピジウム(PI)二重染色キットである、Cellstain(Dojindo、Japan)を用いて評価した。培地にCd2+を添加した後、COS7細胞および初代培養神経細胞をCellstain 二重染色キットを用いて説明書の指示に従って染色した。カルセイン(0.25μM)およびPI(0.5μM)濃度を最適化した。カルセインで染色される生細胞の数、およびPIで染色される死細胞の数を計数した。
Evaluation of viability Cell viability was assessed using Cellstain (Dojindo, Japan), a calcein and propidium iodide (PI) double staining kit. After adding Cd 2+ to the medium, COS7 cells and primary cultured neurons were stained using the Cellstain double staining kit according to the instructions in the instructions. Calcein (0.25 μM) and PI (0.5 μM) concentrations were optimized. The number of live cells stained with calcein and the number of dead cells stained with PI were counted.

透過型電子顕微鏡法
コロジオン膜を貼り付けた銅グリッドにカーボンを蒸着し、グロー放電による親水化処理した直後に、精製タンパク質をグリッドに載せ、水中で洗浄した。グリッドを2%酢酸ウラニルでネガティブ染色するか、あるいは水中で洗浄した。各工程において過剰の溶液は濾紙により除いた。乾燥グリッドを加速電圧100kVに調整したJEM-2010電子顕微鏡(JEOL、Japan)により15,000倍にて観察した。画像はCCDカメラ(TVIPS、Germany)を用いて得、8-bit画像として記録した。
Transmission Electron Microscopy Carbon was deposited on a copper grid with a collodion film attached, and immediately after hydrophilic treatment by glow discharge, the purified protein was placed on the grid and washed in water. Grids were either negatively stained with 2% uranyl acetate or washed in water. Excess solution was removed by filter paper in each step. The dried grid was observed at 15,000 times with a JEM-2010 electron microscope (JEOL, Japan) adjusted to an acceleration voltage of 100 kV. Images were obtained using a CCD camera (TVIPS, Germany) and recorded as 8-bit images.

神経細胞を2%パラホルムアルデヒド/2.5%グルタールアルデヒド/30mM HEPES緩衝液(pH7.2)で2時間固定し、四酸化オスミニウムによって後固定を行った。固定した後、神経細胞を10分間洗浄し、次いで段階的に濃度を上げたエタノール(50%エタノール:10分間、70%エタノール:10分間、80%エタノール:10分間、90%エタノール:10分間、100%無水エタノール2回、各回それぞれ10分間)により脱水した。神経細胞を酸化プロピレンに10分間浸漬し、次いでEpon 812/酸化プロピレン(1:1)中に18時間浸漬した。神経細胞を次に100% Epon 812に移し、6時間後、プログラムオーブン中で重合させた。80nmの厚さの超薄切片をウルトラミクロトーム EM UC-6(Leica Microsystems、Germany)で切り出し、銅グリッド上に集めて、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で電子染色した。無染色サンプルは、四酸化オスミウムによる後固定と、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛による電子染色を行わなかった。乾燥グリッド上の細胞を加速電圧200kVに調整した電子顕微鏡を用いて20,000倍で観察した。画像はCCDカメラ(TVIPS)を用いて取得し、8-bit画像として記録した。 Nerve cells were fixed with 2% paraformaldehyde / 2.5% glutaraldehyde / 30 mM HEPES buffer (pH 7.2) for 2 hours and postfixed with osmium tetroxide. After fixation, nerve cells were washed for 10 minutes, and then gradually increased in concentration (50% ethanol: 10 minutes, 70% ethanol: 10 minutes, 80% ethanol: 10 minutes, 90% ethanol: 10 minutes, It was dehydrated by 100% absolute ethanol twice, 10 minutes each time). Nerve cells were soaked in propylene oxide for 10 minutes and then in Epon 812 / propylene oxide (1: 1) for 18 hours. Neurons were then transferred to 100% Epon 812 and after 6 hours polymerized in a program oven. Ultrathin sections 80 nm thick were cut with an ultramicrotome EM UC-6 (Leica Microsystems, Germany), collected on a copper grid, and electron stained with uranyl acetate and lead citrate. Unstained samples were not post-fixed with osmium tetroxide and electronically stained with uranyl acetate and lead citrate. The cells on the dry grid were observed at a magnification of 20,000 using an electron microscope adjusted to an acceleration voltage of 200 kV. Images were acquired using a CCD camera (TVIPS) and recorded as 8-bit images.

結果
COS7細胞におけるCd2+の細胞毒性およびPSD-95-3MTの発現
電子顕微鏡法によりMT融合標的タンパク質を検出するために、細胞を重金属イオンとともにインキュベートした。MTはAg+、Cd2+、Cu+、Hg2+、およびZn2+などのいくつかの重金属イオンに結合する[Nielson K B, Atkin C L & Winge D R (1985) Distinct metal-binding configurations in metallothionein. J Biol Chem 260: 5342-5350]。50μM AgNO3または80μM HgCl2を培地に添加したところ、Ag+またはHg2+はMTに結合しなかった(データ未公開)。しかし、20μM CdCl2を添加したところ、Cd2+はMTに特異的に結合した。
result
Cytotoxicity of Cd 2+ and expression of PSD-95-3MT in COS7 cells To detect the MT fusion target protein by electron microscopy, cells were incubated with heavy metal ions. MT binds to several heavy metal ions such as Ag + , Cd 2+ , Cu + , Hg 2+ , and Zn 2+ [Nielson KB, Atkin CL & Winge DR (1985) Distinct metal-binding configurations in metallothionein. J Biol Chem 260: 5342-5350]. When 50 μM AgNO 3 or 80 μM HgCl 2 was added to the medium, Ag + or Hg 2+ did not bind to MT (data not shown). However, when 20 μM CdCl 2 was added, Cd 2+ bound specifically to MT.

Cd2+は強力な細胞毒であり、ネクローシスおよびアポトーシスの両方の細胞死を促す可能性がある[Nielson K B, Atkin C L & Winge D R (1985) Distinct metal-binding configurations in metallothionein. J Biol Chem 260: 5342-5350、Lopez E, Figueroa S, Oset-Gasque M J & Gonzalez M P (2003) Apoptosis and necrosis: two distinct events induced by cadmium in cortical neurons in culture. Br J Pharmacol 138: 901-911]。Cd2+への曝露後の細胞生存率を評価するために、COS7細胞に20または40μMのCdCl2を10、20または30時間暴露した。生細胞の割合は20または40μM CdCl2への曝露の30時間後および40μM CdCl2への曝露の20時間後に低下したが、20μM CdCl2への曝露の20時間後には低下しなかった。COS7細胞から精製されたPSD-95-3MTの金属含量の分析により、PSD-95-3MTは、20μM CdCl2への曝露の20時間後にCd2+に結合することが示された。PSD-95-3MTのcDNAをコードするプラスミドをトランスフェクションされ、20μM CdCl2で処置されたCOS7細胞は、トランスフェクションの2日後にはPSD-95-3MTを発現した(図1)。 Cd 2+ is a potent cytotoxin and may promote both necrotic and apoptotic cell death [Nielson KB, Atkin CL & Winge DR (1985) Distinct metal-binding configurations in metallothionein. J Biol Chem 260: 5342-5350, Lopez E, Figueroa S, Oset-Gasque MJ & Gonzalez MP (2003) Apoptosis and necrosis: two distinct events induced by cadmium in cortical neurons in culture. Br J Pharmacol 138: 901-911]. To assess cell viability after exposure to Cd 2+ , COS7 cells were exposed to 20 or 40 μM CdCl 2 for 10, 20 or 30 hours. The percentage of viable cells decreased 30 hours after exposure to 20 or 40 μM CdCl 2 and 20 hours after exposure to 40 μM CdCl 2 , but did not decrease after 20 hours of exposure to 20 μM CdCl 2 . Analysis of the metal content of PSD-95-3MT purified from COS7 cells showed that PSD-95-3MT binds to Cd 2+ 20 hours after exposure to 20 μM CdCl 2 . COS7 cells transfected with the plasmid encoding PSD-95-3MT cDNA and treated with 20 μM CdCl 2 expressed PSD-95-3MT two days after transfection (FIG. 1).

精製PSD-95-3MTの電子顕微鏡像
精製PSD-95-3MTを電子顕微鏡法により検出するために、COS7細胞にPSD-95-3MTをコードする発現プラスミドをトランスフェクションし、20μM CdCl2を処置した(図2a,cおよびe)。またCdCl2を処置しない細胞をコントロールとした(図2b,dおよびf)。PSD-95-3MTを回収した細胞から抗FLAG M2アフィニティーカラムを用いて精製し(図2aおよびb)、精製PSD-95-3MTを電子顕微鏡により観察した(図2c-f)。精製したタンパク質は酢酸ウラニルでネガティブ染色し、電子顕微鏡で確認した(図2cおよびd)。これら粒子はCdCl2を処置した群においてのみ、無染色サンプルにおいても観察された(図2e)。この結果よりCd2+と結合した精製PSD-95-3MTは電子顕微鏡法により観察可能であることが示された。
Electron microscopic image of purified PSD-95-3MT To detect purified PSD-95-3MT by electron microscopy, COS7 cells were transfected with an expression plasmid encoding PSD-95-3MT and treated with 20 μM CdCl 2 (FIGS. 2a, c and e). Further, cells not treated with CdCl 2 were used as controls (FIGS. 2b, d and f). PSD-95-3MT was purified from the collected cells using an anti-FLAG M2 affinity column (FIGS. 2a and b), and the purified PSD-95-3MT was observed with an electron microscope (FIGS. 2c-f). The purified protein was negatively stained with uranyl acetate and confirmed by electron microscopy (FIGS. 2c and d). These particles were only observed in the CdCl 2 treated group and in the unstained sample (FIG. 2e). The results showed that purified PSD-95-3MT bound to Cd 2+ can be observed by electron microscopy.

初代培養神経細胞におけるCd2+の細胞毒性およびPSD-95-3MTの発現
培養13または14日目に、終濃度が5または10μMとなるようにCdCl2を神経細胞の培地に添加し、生細胞の割合をCd2+曝露の10、20または30時間後に算出した。生細胞の割合は10μM CdCl2への曝露の30時間後には低下していたが、5μM CdCl2への曝露の30時間後には有意な低下を示さなかった。CdCl2の処置20時間後の金属含量分析により、Cd2+は5μM CdCl2を処置した細胞からの細胞破砕液に存在しており、細胞中およそ7.5-10μMであることが示された(データ未公開)。それゆえ、本発明者らは、初代培養神経細胞を用いる実験には、5μM CdCl2の20時間未満処置を電子顕微鏡法に好適な試料を得るための条件とした。
Cytotoxicity of Cd 2+ and expression of PSD-95-3MT in primary cultured neurons On day 13 or 14 of culture, CdCl 2 was added to the neuronal culture medium so that the final concentration was 5 or 10 μM. The percentage was calculated at 10, 20 or 30 hours after Cd 2+ exposure. The percentage of viable cells was reduced after 30 hours of exposure to 10 μM CdCl 2 , but showed no significant decrease after 30 hours of exposure to 5 μM CdCl 2 . Metal content analysis 20 hours after treatment with CdCl 2 showed that Cd 2+ was present in cell lysates from cells treated with 5 μM CdCl 2 and was approximately 7.5-10 μM in the cells (data Unpublished). Therefore, the present inventors set conditions for obtaining a sample suitable for electron microscopy in an experiment using primary cultured neurons with a treatment of 5 μM CdCl 2 for less than 20 hours.

神経細胞におけるPSD-95-3MTの分布を電子顕微鏡法により調べるために、本発明者らはpAdPSD-95-3MTを担持するアデノウイルス(AdPSD-95-3MT)を神経細胞に形質導入した(図3)。最高の感染効率(およそ65%)は、初代培養神経細胞を1.8x107pfu/mLのAdPSD-95-3MTで感染させた場合に得られ、その他のAdPSD-95-3MTの感染最適条件は、感染を培養9日目で開始し、単離した細胞を2.5x104細胞/cm2で播種し、培養13日目で細胞を固定することであった(データ未公開)。 In order to examine the distribution of PSD-95-3MT in neurons by electron microscopy, the present inventors transduced neurons with adenovirus carrying pAdPSD-95-3MT (AdPSD-95-3MT) (Fig. 3). The highest infection efficiency (approximately 65%) was obtained when primary neurons were infected with 1.8x10 7 pfu / mL AdPSD-95-3MT, and the other optimal infection conditions for AdPSD-95-3MT are: Infection was initiated on day 9 of culture, the isolated cells were seeded at 2.5 × 10 4 cells / cm 2 and the cells were fixed on day 13 of culture (data not shown).

PSD-95-3MTの観察
初代培養神経細胞にAdPSD-95-3MTを形質導入し、5μM CdCl2で19時間処置した後の細胞を、電子顕微鏡で観察した。Cd2+結合PSD-95-3MT(Cd-PSD-95-3MT)由来のコントラストを見逃さないように、これらサンプルをオスミウムおよびウラン・鉛染色は行わなかった。薄切試料の画像はオスミウムおよびウラン・鉛染色をしなかったにもかかわらず細胞が背景に比べ明るく見えたため、細胞の存在を確認することができた(図4a-d)。AdPSD-95-3MTを形質導入され、かつCd2+で処置された神経細胞においてのみ、高電子密度沈着物が存在したが(図4a)、無処置対照(図4b)またはCdCl2処置のみを受けた神経細胞(図4c)、さらに、AdPSD-95-3MTを形質導入されたがCdCl2とともにインキュベートされなかった神経細胞(図4d)においてはこのような高電子密度沈着物は認められなかった。これらの結果から、高電子密度沈着はCd-PSD-95-3MTであると結論される。以上に示されるように、Cd-PSD-95-3MT由来のコントラストが電子顕微鏡で観察することが確認されたので、次にこの高電子密度沈着物の局在場所を確認するために、細胞をオスミウムおよびウラン・鉛染色を行って観察した。無染色の細胞と同様に、高電子密度沈着物は、AdPSD-95-3MTを形質導入され、かつCd2+で処置された細胞においてのみ観察され(図4e)、その局在場所は、プレシナプスの特徴的構造であるシナプス小胞を含むシナプス終末(T)と向き合うポストシナプス(S)であった。
Observation of PSD-95-3MT AdPSD-95-3MT was transduced into primary cultured neurons, and the cells after treatment with 5 μM CdCl 2 for 19 hours were observed with an electron microscope. These samples were not osmium and uranium-lead stained so as not to miss the contrast from Cd 2+ -bound PSD-95-3MT (Cd-PSD-95-3MT). The images of the sliced samples were brighter than the background even though they were not stained with osmium and uranium / lead, so the presence of the cells could be confirmed (FIGS. 4a-d). High electron density deposits were present only in neurons transduced with AdPSD-95-3MT and treated with Cd 2+ (FIG. 4a), but no treatment (FIG. 4b) or CdCl 2 treatment alone. Such high electron density deposits were not observed in the received neurons (FIG. 4c) and also in neurons that were transduced with AdPSD-95-3MT but not incubated with CdCl 2 (FIG. 4d). . From these results, it can be concluded that the high electron density deposition is Cd-PSD-95-3MT. As shown above, it was confirmed that the contrast derived from Cd-PSD-95-3MT was observed with an electron microscope. Next, in order to confirm the location of this high electron density deposit, Osmium and uranium / lead were stained and observed. Similar to unstained cells, high electron density deposits are only observed in cells transduced with AdPSD-95-3MT and treated with Cd 2+ (FIG. 4e), and their location is pre- It was a post-synapse (S) facing the synaptic terminal (T) containing synaptic vesicles, a characteristic structure of the synapse.

PSD-95-3MTの局在および結合能
MTのPSD-95への付加が、この足場タンパク質の機能を阻害するかどうかを調べた。PSD-95はPSDに凝集しており、トランスフェクションされた神経細胞において過剰発現したPSD-95はシナプスに局在していた。同様に、PSD-95-3MTは樹状突起棘上のプレシナプスマーカーであるシナプトフィジンと共に局在していた。シナプスへの局在は、神経細胞がトランスフェクションではなくアデノウイルスを形質導入された場合でも観察された。一方、MTはトランスフェクションされた神経細胞全体に分布していた。したがって、MTのPSD-95への融合はPSD-95のシナプスへのターゲティングを阻害するものではないと結論される。
PSD-95-3MT localization and binding capacity
We examined whether the addition of MT to PSD-95 inhibits the function of this scaffold protein. PSD-95 aggregated into PSD, and PSD-95 overexpressed in transfected neurons was localized at the synapse. Similarly, PSD-95-3MT was localized with synaptophysin, a presynaptic marker on dendritic spines. Synaptic localization was also observed when neurons were transduced with adenovirus rather than transfection. On the other hand, MT was distributed throughout the transfected neurons. Therefore, it is concluded that fusion of MT to PSD-95 does not inhibit PSD-95 targeting to synapses.

PSD-95はシナプスに存在する多数のタンパク質とも相互作用し、かかるタンパク質としては、NMDA受容体、Kv1.4、およびnNOSが挙げられる。3MTの融合が、PSD-95のこれらタンパク質との相互作用に影響を及ぼすかどうか調べるために、プルダウンアッセイを行った(図5)。図5の左および右列は、COS7細胞からのインプットサンプル(インプット)および免疫沈降(IP)をそれぞれ表す。PSD-95およびPSD-95-3MTは、NR2B(上パネル)、Kv1.4(中パネル)およびnNOS(下パネル)に結合したが、MTはそれらに結合しなかった。それゆえ、これらの結果から、PSD-95の結合能は3MTとの融合により変化しないと結論される。   PSD-95 also interacts with a number of proteins present at the synapse, including NMDA receptors, Kv1.4, and nNOS. To investigate whether 3MT fusion affects the interaction of PSD-95 with these proteins, a pull-down assay was performed (Figure 5). The left and right columns in FIG. 5 represent the input sample (input) and immunoprecipitation (IP) from COS7 cells, respectively. PSD-95 and PSD-95-3MT bound to NR2B (upper panel), Kv1.4 (middle panel) and nNOS (lower panel), but MT did not bind to them. Therefore, it is concluded from these results that the binding ability of PSD-95 is not changed by fusion with 3MT.

内在性MT
Cd2+は様々な組織においてMT発現を誘導する[Ren X Y, Zhou Y, Zhang J P, Feng W H & Jiao B H (2003) Expression of metallothionein gene at different time in testicular interstitial cells and liver of rats treated with cadmium. World J Gastroenterol 9: 1554-1558、Vasconcelos M H, Tam S C, Hesketh J E, Reid M & Beattie J H (2002) Metal- and tissue-dependent relationship between metallothionein mRNA and protein. Toxicol Appl Pharmacol 182: 91-97]。本実験において、内在性MTの5μM CdCl2による誘導を19時間後に抗MT抗体により染色された細胞を用いて調べた。内在性MTはCdCl2を処置しない神経細胞にはほとんど存在せず(図6a)、5μM CdCl2への曝露19時間後の神経細胞においてみ認められた(図6b)。内在性MTは樹状突起全体にわたって分布していた(図6c)。また24時間のCdCl2処置により誘導される内在性MT発現神経細胞は、48時間処置の時よりも少なかった(図6d)。内在性MTの発現を誘導したにもかかわらず、5μM CdCl2を19時間処置した初代培養神経細胞の電子顕微鏡像には、電子顕微鏡法により観察可能な粒子は生じていなかった(図4b)。本発明者らは、内在性MTはCd2+に結合しうるが、電子顕微鏡観察においてコントラストを与えるに十分に高電子密度ではないと結論する。
Endogenous MT
Cd 2+ induces MT expression in various tissues [Ren XY, Zhou Y, Zhang JP, Feng WH & Jiao BH (2003) Expression of metallothionein gene at different time in testicular interstitial cells and liver of rats treated with cadmium. World J Gastroenterol 9: 1554-1558, Vasconcelos MH, Tam SC, Hesketh JE, Reid M & Beattie JH (2002) Metal- and tissue-dependent relationship between metallothionein mRNA and protein. Toxicol Appl Pharmacol 182: 91-97]. In this experiment, the induction of endogenous MT with 5 μM CdCl 2 was examined using cells stained with anti-MT antibody 19 hours later. Endogenous MT was scarcely present in neurons not treated with CdCl 2 (FIG. 6a) and was found in neurons 19 hours after exposure to 5 μM CdCl 2 (FIG. 6b). Endogenous MT was distributed throughout the dendrites (FIG. 6c). In addition, there were fewer endogenous MT-expressing neurons induced by 24-hour CdCl 2 treatment than in the 48-hour treatment (FIG. 6d). Despite the induction of endogenous MT expression, no particles observable by electron microscopy were observed in the electron micrograph of primary cultured neurons treated with 5 μM CdCl 2 for 19 hours (FIG. 4b). We conclude that endogenous MT can bind to Cd 2+ but is not high enough in electron density to give contrast in electron microscopy.

結論
PDS-95-3MTがCd2+の存在下で、COS7細胞中で合成され、精製され、そして電子顕微鏡法により可視化された。初代培養神経細胞において細胞毒性を誘発しないCdCl2処置の条件が確認された(5μM、19時間処理)。この融合タンパク質はトランスフェクションまたは形質導入された初代海馬神経細胞においてシナプス部位に局在していた。Cd-PSD-95-3MTのシナプスでの蓄積により電子顕微鏡法によるこの融合タンパク質の検出が可能となった。さらに、3MTは神経細胞におけるPSD-95の局在またはその既知の結合パートナーとの相互作用に影響を与えなかった。Cd2+結合3MTは免疫反応に基づく標識が利用できない時に有用なアプローチとして提供され、将来、電子顕微鏡法のための一般的手段の一つになる可能性がある。
Conclusion
PDS-95-3MT was synthesized in COS7 cells, purified and visualized by electron microscopy in the presence of Cd2 + . Conditions for CdCl 2 treatment that did not induce cytotoxicity in primary cultured neurons were confirmed (5 μM, treated for 19 hours). This fusion protein was localized at the synaptic site in transfected or transduced primary hippocampal neurons. Accumulation of Cd-PSD-95-3MT at the synapse made it possible to detect this fusion protein by electron microscopy. Furthermore, 3MT did not affect the localization of PSD-95 in neurons or its interaction with known binding partners. Cd 2+ -binding 3MT is offered as a useful approach when labels based on immune responses are not available and may become one of the common tools for electron microscopy in the future.

電子顕微鏡法による効率的なタンパク質検出を可能にする遺伝的コード化メタロチオネイン(MT)タグ
本実施例において、検出したいタンパク質に融合して、Cd2+含有培地を用いて大腸菌で発現可能な、金属結合タンパク質タグが開発され、これは染色工程なしに電子顕微鏡法による効率的なタンパク質検出を可能にした。標的タンパク質としては、大腸菌の14量体シャペロンタンパク質であるGroELを用い、各サブユニットに3〜5個のMTのリピート(3〜5MT)を融合させた。いずれのコンストラクト(GroEL-14(3〜5MT))も大腸菌で大量発現させることができたが、最も効率良く14量体を形成し、Cd2+を多く取り込んだのはGroEL-14(3MT)であり、1分子当たり平均して250原子のカドミウムを取り込んでいた。Cd2+結合GroEL-14(3MT)はカーボングリッド上でネガティブ染色なしに電子顕微鏡法によりコントラストを検出することができた。また、氷包埋して極低温電子顕微鏡で観察した場合は、非タグ付加GroELよりも高いコントラストが得られた。これらの結果から、3MTタグが細胞内で多量体タンパク質を標識し、それによって多量体タンパク質の同定を可能にする有望な手段であることを示す。
A genetically encoded metallothionein (MT) tag that enables efficient protein detection by electron microscopy In this example, a metal that can be fused to the protein to be detected and expressed in E. coli using a Cd2 + -containing medium. A binding protein tag was developed that allowed efficient protein detection by electron microscopy without a staining step. As a target protein, GroEL which is a 14-mer chaperone protein of E. coli was used, and 3 to 5 MT repeats (3 to 5 MT) were fused to each subunit. All of the constructs (GroEL-14 (3-5MT)) could be expressed in large quantities in E. coli, but the most efficient formation of the 14-mer and the higher uptake of Cd2 + was GroEL-14 (3MT) And an average of 250 atoms of cadmium was taken up per molecule. Cd2 + -bound GroEL-14 (3MT) was able to detect contrast by electron microscopy without negative staining on the carbon grid. Also, when embedded in ice and observed with a cryogenic electron microscope, a higher contrast was obtained than with untagged GroEL. These results indicate that the 3MT tag is a promising means for labeling multimeric proteins in cells, thereby enabling the identification of multimeric proteins.

材料および方法
クローニングおよびプラスミド構築
GroELの各サブユニットのC末端に、4残基をスペーサーとしてタンデムに連結したMTをつなげ、さらにそのC末端に5残基から成るFLAGタグ(DDDDK)を付加したコンストラクトを作製した (図7)。MTIIの遺伝子は、マウス腎臓cDNAライブラリーからPCRによりクローニングした。実施例1に記載のように構築したPSD-95-nMT-pET21b(n=3、4および5)を用いて、PSD-95をGroELに置換した。GroEL cDNAは大腸菌ゲノムから制限酵素切断部位を付加した以下のプライマー(5'-GCC ATA TGG CTA GCA TGG GAG CTA AAG ACG TAA AAT-3'(配列番号5)および5'-GGC CTA GGC ATC ATG CCG CCC ATG-3'(配列番号6))を用いてPCRによりクローニングした。PCRにより得られたGroELの増幅断片をNdeIおよびBlnIで消化し、同様の酵素で消化してPSD-95を切り出したPSD-95-nMT-pET21b(n=3、4および5)と連結してGroEL-nMT-pET21bを作製した。GroEL-pET21bは、GroEL-5MT-pET21bをBlnIおよびSpeIで消化し、5MTを切り出した後、自己連結した。各コンストラクトのC末端にはFLAGタグが付加されている。クローニングおよびプラスミド構築は大腸菌Top10F'(Invitrogen)にて行い、タンパク質発現のためにプラスミドを大腸菌BL21(DE3)(Novagen)に形質導入した。
Materials and methods Cloning and plasmid construction
Constructed by connecting MT, which is tandemly linked with 4 residues as spacers, to the C-terminus of each GroEL subunit, and then adding a FLAG tag (DDDDK) consisting of 5 residues to the C-terminus (Fig. 7). . The MTII gene was cloned by PCR from a mouse kidney cDNA library. PSD-95 was replaced with GroEL using PSD-95-nMT-pET21b (n = 3, 4 and 5) constructed as described in Example 1. GroEL cDNA has the following primers (5'-GCC ATA TGG CTA GCA TGG GAG CTA AAG ACG TAA AAT-3 '(SEQ ID NO: 5) and 5'-GGC CTA GGC ATC ATG CCG CCC ATG-3 ′ (SEQ ID NO: 6) was used for cloning by PCR. The amplified fragment of GroEL obtained by PCR was digested with NdeI and BlnI, and ligated with PSD-95-nMT-pET21b (n = 3, 4 and 5) digested with the same enzymes to cut out PSD-95. GroEL-nMT-pET21b was prepared. GroEL-pET21b was self-ligated after digesting GroEL-5MT-pET21b with BlnI and SpeI and excising 5MT. A FLAG tag is added to the C-terminus of each construct. Cloning and plasmid construction were performed in E. coli Top10F '(Invitrogen), and the plasmid was transduced into E. coli BL21 (DE3) (Novagen) for protein expression.

Cd2+含有Luria-Bertani(LB)培地における大腸菌培養
GroELの発現プラスミドを形質導入した大腸菌をアンピシリンを含む2mLのLB培地で一晩37℃で前培養した。この培養液500μLを5mLの培地にスケールアップし、OD600=1.0に達した時点で0.5mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加してGroELの発現を誘導し、IPTG添加30分後にCdCl2を終濃度0.2mMとなるよう添加した。2時間ごとにマイクロプレートリーダー(multi-Spectrophotometer、Viento)を用いてOD600を測定し、14時間18℃で培養を続けた。
Coliform culture in Luria-Bertani (LB) medium containing Cd2 +
E. coli transduced with the GroEL expression plasmid was pre-cultured overnight at 37 ° C. in 2 mL of LB medium containing ampicillin. 500 μL of this culture was scaled up to 5 mL of medium, and when OD 600 = 1.0 was reached, 0.5 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to induce GroEL expression, and IPTG 30 minutes after the addition, CdCl 2 was added to a final concentration of 0.2 mM. The OD 600 was measured using a microplate reader (multi-Spectrophotometer, Viento) every 2 hours, and the culture was continued at 18 ° C. for 14 hours.

Cd2+結合GroEL-14(nMT)の発現
GroELおよびGroEL-14(nMT)(n=3、4または5)を発現させた大腸菌は遠心により収菌し、Tris緩衝液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH7.4)に懸濁し、超音波処理により破砕した。細胞破砕液は13,000gで15分間4℃で遠心して可溶性画分と不溶性画分に分画し、SDS-PAGEを行った。精製へ向けては、大腸菌を一晩37℃でアンピシリンを含む2mLのLB培地中で培養し、さらに8時間37℃で30mLの同じ培地中で培養した。この培養液を300mLのLB培地にスケールアップし、OD600=1.0となった時点で0.5mM IPTGにより誘導をかけた。30分後に終濃度0.2mMとなるようにCdCl2を添加し、培養をさらに14時間18℃で継続した。細胞を31,000gで10分間、4℃で遠心して大腸菌を回収した。
Expression of Cd2 + -binding GroEL-14 (nMT)
E. coli expressing GroEL and GroEL-14 (nMT) (n = 3, 4 or 5) is collected by centrifugation, suspended in Tris buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4), It was crushed by sonication. The cell lysate was centrifuged at 13,000 g for 15 minutes at 4 ° C. and fractionated into a soluble fraction and an insoluble fraction and subjected to SDS-PAGE. For purification, E. coli was cultured overnight at 37 ° C. in 2 mL of LB medium containing ampicillin and further cultured in 30 mL of the same medium at 37 ° C. for 8 hours. The culture was scaled up to 300 mL of LB medium, and when OD 600 = 1.0, induction was performed with 0.5 mM IPTG. After 30 minutes, CdCl 2 was added to a final concentration of 0.2 mM, and the culture was further continued at 18 ° C. for 14 hours. The cells were centrifuged at 31,000 g for 10 minutes at 4 ° C. to recover E. coli.

Cd2+結合GroEL-14(3MT)の精製
GroELまたはGroEL-14(3MT)を発現した細胞を10μg/mL DNase、10μg/mL RNase および1タブレット/100mL complete protease inhibitor cocktail(Roche)を含有するTris緩衝液に懸濁し、超音波処理により破砕した。細胞破砕液を4℃で1時間インキュベートし、10,000gで1時間、4℃で遠心した。可溶性画分をTris緩衝液で平衡化した抗FLAG M2アフィニティーカラム(Sigma)に通した。カラムを10カラム体積のTris緩衝液で洗浄し、結合したタンパク質は0.1mg/mL FLAGペプチド(Sigma)を含有するTris緩衝液で溶出した。溶出液をSuperdex200HRゲルろ過カラム(GE Healthcare Bio-Sciences、USA)に載せ、Tris緩衝液を用いて0.5mL/分で溶出した。 ゲルろ過クロマトグラフィーはAKTA Explorer Chromatography workstation(GE Healthcare Bio-Sciences)で行った。
Purification of Cd2 + -bound GroEL-14 (3MT)
Cells expressing GroEL or GroEL-14 (3MT) were suspended in Tris buffer containing 10 μg / mL DNase, 10 μg / mL RNase and 1 tablet / 100 mL complete protease inhibitor cocktail (Roche) and disrupted by sonication. . The cell lysate was incubated at 4 ° C for 1 hour and centrifuged at 10,000g for 1 hour at 4 ° C. The soluble fraction was passed through an anti-FLAG M2 affinity column (Sigma) equilibrated with Tris buffer. The column was washed with 10 column volumes of Tris buffer and bound protein was eluted with Tris buffer containing 0.1 mg / mL FLAG peptide (Sigma). The eluate was placed on a Superdex200HR gel filtration column (GE Healthcare Bio-Sciences, USA) and eluted with Tris buffer at 0.5 mL / min. Gel filtration chromatography was performed on an AKTA Explorer Chromatography workstation (GE Healthcare Bio-Sciences).

Cd2+結合の分析
精製タンパク質をCentricon YM-50(Millipore、USA)を用いて0.2mg/mLまで濃縮した。タンパク質濃度はBSAを標準に用いてブラッドフォード法により測定した。濃縮したタンパク質溶液の紫外吸収スペクトルを分光計(CARY 300 Bio、VARIAN)を用いて測定した。精製タンパク質溶液中のカドミウム濃度は沖エンジニアリング株式会社によりICP発光分光分析法を用いて測定した。
Analysis of Cd 2+ binding Purified protein was concentrated to 0.2 mg / mL using Centricon YM-50 (Millipore, USA). The protein concentration was measured by the Bradford method using BSA as a standard. The ultraviolet absorption spectrum of the concentrated protein solution was measured using a spectrometer (CARY 300 Bio, VARIAN). Cadmium concentration in the purified protein solution was measured by Oki Engineering Co., Ltd. using ICP emission spectroscopy.

電子顕微鏡法
精製タンパク質をTris緩衝液を用いて0.02mg/mLに調整した。コロジオン膜を貼り付けた銅グリッドにカーボンを蒸着し、グロー放電による親水化処理した直後、この溶液をグリッドに載せ、水で1回洗浄した。一部のグリッドは2%酢酸ウラニルによりネガティブ染色し、一部のグリッドは染色しなかった。グリッドは加速電圧200kVに調整した電子顕微鏡(JEM-2010、JEOL)を用いて25,000倍で観察した。画像はCCDカメラ(TVIPS)用いて得、8-bit画像として保存した。氷包埋したサンプルの観察には、0.33mg/mLのタンパク質溶液を親水化処理したマイクログリッド(QUANTIFOIL(登録商標)(Quantifoil、Germany))に載せ、液体窒素で冷却した液化エタン中に入れることにより迅速に凍結させた。氷包埋したグリッドは、トップエントリー型で冷却温度-270℃の液体ヘリウム冷却ステージを備えた電子顕微鏡(JEM-3000、JEOL)を用いて加速電圧200kVで観察した。Kodak SO-163電子顕微鏡用フィルムを用いて、40,000倍で画像を撮影し、PICTROSTAT DIGITAL400(FUJIFILM Corporation、Japan)によりスキャンしてデジタル画像とした。14量体を形成しているすべてのGroEL粒子を、同じ実験条件で得られたいくつかのデジタル画像から拾い上げ、粒子上の領域およびバックグラウンドのガラス状の非晶質氷(vitreous ice)の平均ピクセル強度をScion Image(Scion Corporation、USA)を用いて測定した。粒子のコントラストは各粒子の平均ピクセル強度から隣接領域のバックグラウンドの平均ピクセル強度を差し引くことにより算出した。顕著に異なるコントラストはスミルノフ・グラブス検定により棄却した。
Electron microscopy Purified protein was adjusted to 0.02 mg / mL using Tris buffer. Immediately after carbon was deposited on a copper grid with a collodion film and hydrophilized by glow discharge, this solution was placed on the grid and washed once with water. Some grids were negatively stained with 2% uranyl acetate and some grids were not stained. The grid was observed at 25,000 times using an electron microscope (JEM-2010, JEOL) adjusted to an acceleration voltage of 200 kV. Images were obtained using a CCD camera (TVIPS) and stored as 8-bit images. The Koritsutsumiuma sample observation, 0.33 mg / mL microgrid (QUANTIFOIL (TM) (Quantifoil, Germany)) for the protein solution was hydrophilized in a loaded, put it in a liquefied ethane cooled by liquid nitrogen Freezing faster. The ice-embedded grid was observed at an acceleration voltage of 200 kV using an electron microscope (JEM-3000, JEOL) equipped with a liquid helium cooling stage with a top entry type and a cooling temperature of -270 ° C. Images were taken at 40,000 times using Kodak SO-163 electron microscope film and scanned with PICTROSTAT DIGITAL400 (FUJIFILM Corporation, Japan) to obtain digital images. All GroEL particles forming the 14-mer are picked up from several digital images obtained under the same experimental conditions, and the average of the area on the particles and the background vitreous ice Pixel intensity was measured using Scion Image (Scion Corporation, USA). The contrast of the particles was calculated by subtracting the average pixel intensity of the background in the adjacent area from the average pixel intensity of each particle. Remarkably different contrasts were rejected by the Smirnov-Grubbs test.

結果
Cd2+含有培地中でのGroEL-14(nMT)の発現
重金属は細胞に毒性である可能性があるため、本発明者らはまず大腸菌増殖をCdCl2の存在下または非存在下で調べた。GroELの発現プラスミドを形質導入された大腸菌BL21(DE3) 株を0.2mM CdCl2の存在下または非存在下で培養し大腸菌増殖を経時的に600nmでの濁度をモニターすることにより調べた。この濃度のCdCl2の存在下または非存在下で培養した大腸菌の増殖曲線に相違はなく、Cd2+処理がBL21(DE3)株の増殖に有害作用を与えないことが示された。
result
For GroEL-14 expression heavy metals (NMT) in a cd 2+ containing medium that may be toxic to cells, the present inventors have first examined the E. coli growth presence of CdCl 2 or absence . E. coli BL21 (DE3) strain transduced with the GroEL expression plasmid was cultured in the presence or absence of 0.2 mM CdCl 2 and E. coli growth was examined by monitoring the turbidity at 600 nm over time. There was no difference in the growth curves of E. coli cultured in the presence or absence of this concentration of CdCl 2 , indicating that Cd 2+ treatment did not adversely affect the growth of BL21 (DE3) strain.

MTタグの付加は0.2mM CdCl2の存在下、IPTGの誘導によるタンパク質の発現に影響を与える可能性があるので、本発明者らは、次に、0.2mM CdCl2の存在下におけるGroEL、またはGroEL-14(nMT)(n=3、4または5)の発現について調べた。誘導をかけた大腸菌の破砕液を可溶性および不溶性画分に分離し、発現したタンパク質をSDS-PAGEにより調べた。すべての GroEL-14(nMT)(n=3、4または5)コンストラクトは、大腸菌を37℃で培養するか、またはCd2+の非存在下で培養した場合、封入体として発現したが(データ未公開)、Cd2+の存在下で18℃で培養したところ、可溶性タンパク質として過剰発現させることに成功した。GroEL-14(3MT)は大腸菌を1mM CdCl2中で培養した場合、14量体形成が妨げられた。一方、低濃度のCdCl2(0.05mM以下)中で培養した場合、GroEL-14(3MT)の発現量は低下し、可溶性タンパク質として得ることはできかった(データ未公開)。Cd2+非結合GroEL-14(3MT)を可溶性タンパク質として発現および精製することができなかったため、MTタグを付加していないGroELを陰性対照として用いた。 Since the addition of the MT tag may affect the expression of the protein by induction of IPTG in the presence of 0.2 mM CdCl 2 , the inventors next made GroEL in the presence of 0.2 mM CdCl 2 , or The expression of GroEL-14 (nMT) (n = 3, 4 or 5) was examined. The induced E. coli disruption solution was separated into soluble and insoluble fractions, and the expressed protein was examined by SDS-PAGE. All GroEL-14 (nMT) (n = 3, 4 or 5) constructs were expressed as inclusion bodies when E. coli were cultured at 37 ° C or in the absence of Cd 2+ (data (Unpublished) When cultured at 18 ° C. in the presence of Cd 2+ , it was successfully overexpressed as a soluble protein. GroEL-14 (3MT) prevented 14-mer formation when E. coli was cultured in 1 mM CdCl 2 . On the other hand, when cultured in a low concentration of CdCl 2 (0.05 mM or less), the expression level of GroEL-14 (3MT) decreased and could not be obtained as a soluble protein (data not shown). Since Cd 2+ unbound GroEL-14 (3MT) could not be expressed and purified as a soluble protein, GroEL without MT tag was used as a negative control.

GroEL-14(3MT)の精製および特徴決定
GroELおよびGroEL-14(nMT)(n=3、4または5)は大腸菌をTris緩衝液で洗浄して培地中の遊離のCd2+を除き、抗FLAG M2アフィニティーカラム(Sigma)を用いて精製した。さらに、14量体を形成しているGroELオリゴマーを、モノマーから分離するためにゲルろ過クロマトグラフィーを行った。なお、すべての工程でCd2+非含有Tris緩衝液を用いた。いずれのタンパク質も高純度で得られたが、4MTおよび5MTタグの付加は、GroEL 14量体の形成を妨げた(データ未公開)。しかし、3MTタグ付加GroELは、ゲルろ過クロマトグラフィーで3MTタグを付加していないGroELと同様のピークパターンを示した。それゆえ、本発明者らは、GroEL-14(3MT)の14量体画分をさらなる分析のために用いた。
Purification and characterization of GroEL-14 (3MT)
GroEL and GroEL-14 (nMT) (n = 3, 4 or 5) were purified using anti-FLAG M2 affinity column (Sigma) by washing E. coli with Tris buffer to remove free Cd2 + in the medium. did. Furthermore, in order to separate the GroEL oligomer forming the 14-mer from the monomer, gel filtration chromatography was performed. In all steps, Cd 2+ -free Tris buffer was used. Although both proteins were obtained in high purity, the addition of 4MT and 5MT tags prevented the formation of GroEL 14mers (data not shown). However, 3MT-tagged GroEL showed the same peak pattern as GroEL without 3MT tag by gel filtration chromatography. Therefore, we used the 14-mer fraction of GroEL-14 (3MT) for further analysis.

本発明者らは、次にGroEL-14(3MT)のCd2+の取り込みを調べた。タグ付加およびタグを付加していないGroELともに、タンパク質で一般的に生じる280nmの吸収を示したが、3MTタグ付加GroELではさらに、Cd2+-メルカプチド結合に特徴的な254nmの吸収を示した[Kito H, Ose Y, Mizuhira V, Sato T, Ishikawa T, and Tazawa T (1982) Separation and purification of (Cd, Cu, Zn)-metallothionein in carp hepato-pancreas. Comp. Biochem. Physiol. C. 73: 121-127] (図8)。これら精製タンパク質のカドミウム含量をICP発光分光分析法により調べたところ、GroEL-14(3MT)では1サブユニットあたり平均して17.8原子のカドミウムを取り込んでいたが、同様のCd2+含有培地で発現させたタグを付加していないGroELにおいては少量のカドミウムが検出されたのみであった(表1)。したがって、これらのデータよりカドミウムは特異的に3MTタグ付加GroELに取り込まれていることが示された。 The inventors next examined the Cd 2+ uptake of GroEL-14 (3MT). Both tagged and untagged GroEL showed an absorption of 280 nm that is commonly found in proteins, but the 3MT tagged GroEL also showed an absorption of 254 nm characteristic of Cd 2+ -mercaptide binding [ Kito H, Ose Y, Mizuhira V, Sato T, Ishikawa T, and Tazawa T (1982) Separation and purification of (Cd, Cu, Zn) -metallothionein in carp hepato-pancreas.Comp.Biochem.Physiol.C. 73: 121-127] (Figure 8). When the cadmium content of these purified proteins was examined by ICP emission spectroscopy, GroEL-14 (3MT) incorporated an average of 17.8 atoms of cadmium per subunit, but was expressed in the same Cd 2+ -containing medium. Only a small amount of cadmium was detected in GroEL without the added tag (Table 1). Therefore, these data showed that cadmium was specifically incorporated into 3MT-tagged GroEL.

精製GroEL-14(3MT)の紫外吸収スペクトルはタンパク質のチオール基がCd2+とメルカプチド結合を形成したときに特徴的な吸収極大を示し、一方、タグを付加していないGroELのスペクトルではCd2+含有培地で培養したにもかかわらずそのような吸収極大は見られなかった (図8)。したがって、Cd2+はMTタグに存在するチオール基に特異的に結合するのに対し、GroELに存在するチオール基にはCd2+はほどんど結合しなかった。そこで、ICP発光分光分析法を用いて3MTタグ中のCd2+含有量を定量した。1つのMT分子は最大7個のCd2+と結合することが出来、それにより1つの3MTタグ当たり最大21個のCd2+と結合する可能性がある。精製したGroEL-14(3MT)は平均17.8個のカドミウム原子と結合していた。これは86%飽和を示し、いくつかのCd2+が精製途中またはタンパク質ミスフォールディングにより失われた可能性がある。また、タグを付加していないGroELはごく少量のCd2+と結合するが、この量は無視できる程度であった(表1)。 The ultraviolet absorption spectrum of purified GroEL-14 (3MT) shows a characteristic absorption maximum when the thiol group of the protein forms a mercaptide bond with Cd 2+ , while the Grod spectrum without tag adds Cd 2 No such absorption maximum was observed despite culturing in the + containing medium (FIG. 8). Therefore, Cd 2+ specifically bound to the thiol group present in the MT tag, whereas Cd 2+ hardly bound to the thiol group present in GroEL. Therefore, the Cd 2+ content in the 3MT tag was quantified using ICP emission spectroscopy. One MT molecule can bind up to 7 Cd 2+ , thereby binding up to 21 Cd 2+ per 3MT tag. The purified GroEL-14 (3MT) was bound with an average of 17.8 cadmium atoms. This indicates 86% saturation and some Cd 2+ may have been lost during purification or due to protein misfolding. In addition, GroEL without a tag bound to a very small amount of Cd 2+ , but this amount was negligible (Table 1).

表1 精製タンパク質中のCd2+含有量
1つのGroELサブユニット当たりに結合するカドミウム原子の数をICP発光分光分析法により調べた。

Figure 2008283892
Table 1 Cd 2+ content in the purified protein The number of cadmium atoms bound per GroEL subunit was determined by ICP emission spectroscopy.
Figure 2008283892

Cd2+結合GroEL-14(3MT)の電子顕微鏡法による観察
タンパク質をカーボン蒸着グリッドに載せて、ネガティブ染色を施し、あるいはネガティブ染色を施さずに、乾燥させて、電子顕微鏡法により観察した。ネガティブ染色を施した場合、GroEL、およびCd2+結合GroEL-14(3MT)ともに14量体GroELに特徴的なリング様構造と4層のラインの入った長方形の構造が観察され、Cd2+結合3MTタグ付加によって14量体形成が阻害されていないことが示された(図9e-j)。一方、ネガティブ染色を施さない場合、タグを付加していないGroELでは何も検出することが出来なかったが(図9aおよびb)、Cd2+結合GroEL-14(3MT)においては、ネガティブ染色像と同程度か、わずかに小さい直径を持つ粒子状のコントラストが検出された(図9cおよびd)。
Observation of Cd 2+ -bound GroEL-14 (3MT) by electron microscopy The protein was placed on a carbon-deposited grid and subjected to negative staining or dried with or without negative staining and observed by electron microscopy. When subjected to negative staining, GroEL, and Cd 2+ binding GroEL-14 (3MT) both 14-mer GroEL a distinctive ring-like structure and rectangular structure containing the 4-layer line was observed, Cd 2+ It was shown that the 14-mer formation was not inhibited by the binding 3MT tag addition (FIGS. 9e-j). On the other hand, when no negative staining was applied, nothing could be detected with GroEL to which no tag was added (FIGS. 9a and b), but with Cd 2+ binding GroEL-14 (3MT), a negative staining image was obtained. Particulate contrast with a diameter slightly smaller than or slightly smaller was detected (FIGS. 9c and d).

次に、精製タンパク質を氷包埋し、極低温電子顕微鏡を用いて観察した。3μmのアンダーフォーカスでは、GroELとCd2+結合GroEL-14(3MT)の両方の粒子が位相コントラストにより検出されたが (図10a-d)、Cd2+結合GroEL-14(3MT)粒子(図10cおよび d)は、タグを付加していないGroEL(図10aおよびb)より高いコントラストが得られた。アンダーフォーカスを1.5μmにすると、タグを付加していないGroELでは明瞭に粒子を検出することができなかったが(図10eおよびf)、Cd2+結合GroEL-3MTでは粒子を検出することが可能であった(図10gおよびh)。 Next, the purified protein was embedded in ice and observed using a cryogenic electron microscope. At 3 μm underfocus, both GroEL and Cd 2+ -bound GroEL-14 (3MT) particles were detected by phase contrast (Figure 10a-d), while Cd 2+ -bound GroEL-14 (3MT) particles (Figure 10). 10c and d) gave higher contrast than GroEL without tag (FIGS. 10a and b). When the under focus was 1.5 μm, it was not possible to clearly detect particles with GroEL without tag (Fig. 10e and f), but it was possible to detect particles with Cd 2+ binding GroEL-3MT. (Figures 10g and h).

3μmアンダーフォーカスで撮影した極低温電子顕微鏡像をスキャンしてデジタル化処理して、粒子コントラストを算出したところ(図11)、Cd2+結合GroEL-14(3MT)の平均粒子コントラストはGroELの平均粒子コントラストよりもかなり高かった。これらの結果は、MTタグが電子顕微鏡法においてタンパク質標識法として有効であることを示す。 A Cryogenic Electron Microscope image taken with 3 μm under focus was scanned and digitized, and the particle contrast was calculated (Fig. 11). The average particle contrast of Cd 2+ -coupled GroEL-14 (3MT) is the average of GroEL. It was much higher than the particle contrast. These results indicate that the MT tag is effective as a protein labeling method in electron microscopy.

3MTタグのGroELへの付加は、染色操作なしにカーボングリッド上で電子顕微鏡法によるその検出を可能とした。一方、タグを付加していないGroELはネガティブ染色を施さなければ検出不可能であった。これらのデータはCd2+結合GroEL-14(3MT)を載せたグリッド上に存在するコントラストが3MTタグによるCd2+の取り込みに直接起因することを示唆する。これらの結果は氷包埋して観察した結果と一致する。氷包埋して観察した場合、位相コントラストにより、ラベルしていないタンパク質でも粒子を検出可能であるが、Cd2+結合GroEL-14(3MT)粒子は3μmおよび1.5μmアンダーフォーカスの両方においてタグを付加していないGroELよりもコントラストが高かった(図10および11)。粒子の位相コントラストは、分子量の大きさにともなっても増加するが、観察されたGroEL-14(3MT)(1,100,000)でのコントラストの上昇はGroEL(800,000)との分子量の差だけでは説明することが出来ない(図11)。 The addition of the 3MT tag to GroEL enabled its detection by electron microscopy on a carbon grid without staining. On the other hand, GroEL without a tag could not be detected without negative staining. These data suggest that the contrast present on the grid loaded with Cd 2+ -bound GroEL-14 (3MT) is directly attributable to the uptake of Cd 2+ by the 3MT tag. These results are consistent with the results observed with ice embedding. When observed in ice, phase detection can detect particles even with unlabeled proteins, but Cd 2+ -bound GroEL-14 (3MT) particles are tagged at both 3 μm and 1.5 μm underfocus. Contrast was higher than GroEL without addition (FIGS. 10 and 11). The phase contrast of the particles increases with the size of the molecular weight, but the observed increase in contrast with GroEL-14 (3MT) (1,100,000) can be explained only by the difference in molecular weight with GroEL (800,000). (Figure 11).

結論
電子顕微鏡法において特定のタンパク質の検出を可能にする新規な遺伝的標識法が開発された。この標識は、タンデムに連結させた3つのMTのリピート(3MTタグ)からなり、本発明者らは、多量体標的タンパク質のモデルとしてGroELにこのタグを遺伝的に融合して発現させることに成功した。3MTタグ付加 GroELは大腸菌で14量体(GroEL-14(3MT))として大量に発現し、0.2mMのCdCl2存在下、Cd2+を効率的に取り込んだ。精製したGroEL-14(3MT)は1分子当たり平均して250個のカドミウム原子を含んでいた。
Conclusion A new genetic labeling method has been developed that allows the detection of specific proteins in electron microscopy. This label consists of three MT repeats (3MT tag) linked in tandem, and we succeeded in expressing this tag by genetic fusion to GroEL as a model for multimeric target proteins. did. 3MT-tagged GroEL was expressed in large amounts as a 14-mer (GroEL-14 (3MT)) in E. coli and efficiently incorporated Cd 2+ in the presence of 0.2 mM CdCl 2 . Purified GroEL-14 (3MT) contained an average of 250 cadmium atoms per molecule.

Cd2+結合GroEL-14(3MT)をネガティブ染色して電子顕微鏡観察を行ったところ、MTタグを付加していないGroELと同様の14量体構造が観察された。Cd2+結合GroEL-14(3MT)粒子は、無染色状態でも電子顕微鏡法によりカーボン蒸着グリッド上で黒色スポットとして検出することに成功した。さらに、氷包埋した場合も、Cd2+結合GroEL-14(3MT)粒子はMTタグを付加していないGroELと比べて高いコントラストで検出された。よって、3MTタグは電子顕微鏡で観察可能な標識として使用できる可能性が高く、多量体タンパク質の同定を可能にする有望な手段と成り得る。 When Cd 2+ -binding GroEL-14 (3MT) was negatively stained and observed with an electron microscope, a 14-mer structure similar to GroEL without an MT tag was observed. Cd 2+ -bound GroEL-14 (3MT) particles were successfully detected as black spots on the carbon deposition grid by electron microscopy even in the unstained state. In addition, when embedded in ice, Cd 2+ -bound GroEL-14 (3MT) particles were detected with higher contrast than GroEL without MT tag. Therefore, the 3MT tag is likely to be used as a label that can be observed with an electron microscope, and can be a promising means that enables identification of multimeric proteins.

図1は、COS7細胞におけるPSD-95-3MTの発現を示す。COS7細胞にPSD-95-3MTの発現コンストラクトをトランスフェクションし、20μM CdCl2で処理した。PSD-95-3MTを抗FLAG抗体および Alexa488結合二次抗体により免疫染色した。FIG. 1 shows the expression of PSD-95-3MT in COS7 cells. COS7 cells were transfected with an expression construct of PSD-95-3MT and treated with 20 μM CdCl 2 . PSD-95-3MT was immunostained with anti-FLAG antibody and Alexa488-conjugated secondary antibody. 図2は、精製PSD-95-3MTの電子顕微鏡像を示す。PSD-95-3MTをCdCl2で処理したCOS7細胞から精製した(図2a,cおよびe)。CdCl2を処置しない細胞をコントロールとした(図2b,dおよびf)。aおよびb) 抗FLAG M2アフィニティーカラムにより精製したPSD-95-3MTのSDS-PAGE。Sup:細胞破砕液の上清(可溶性画分); ppt:細胞破砕液の沈殿(不溶性画分); スルー: カラム非結合画分、洗浄;アフィニティーゲルの洗浄液画分; 溶出液:溶出したサンプル。PSD-95-3MTはSDS-PAGEではおおよその分子量125,000を有する(矢印)。溶出液1は電子顕微鏡法のためのサンプルとして回収した。c-f) 酢酸ウラニルによるネガティブ染色(cおよびd)または無染色(eおよびf)精製PSD-95-3MT(溶出液1)を乾燥した電子顕微鏡像。高電子密度粒子が観察された。FIG. 2 shows an electron microscopic image of purified PSD-95-3MT. PSD-95-3MT was purified from COS7 cells treated with CdCl 2 (FIGS. 2a, c and e). Cells not treated with CdCl 2 served as controls (FIGS. 2b, d and f). a and b) SDS-PAGE of PSD-95-3MT purified by anti-FLAG M2 affinity column. Sup: Cell lysate supernatant (soluble fraction); ppt: Cell lysate precipitate (insoluble fraction); Through: Column unbound fraction, wash; Affinity gel wash fraction; Eluate: Eluted sample . PSD-95-3MT has an approximate molecular weight of 125,000 on SDS-PAGE (arrow). Eluate 1 was collected as a sample for electron microscopy. cf) Electron microscope image of dried negative staining (c and d) or unstained (e and f) purified PSD-95-3MT (eluent 1) with uranyl acetate. High electron density particles were observed. 図3は、初代培養神経細胞におけPSD-95-3MTの発現を示す。初代培養神経細胞にPSD-95-3MTの発現コンストラクトを含有するアデノウイルスを形質導入し、5μM CdCl2で処理した。 PSD-95-3MTを抗FLAG抗体およびAlexa543結合二次抗体により免疫染色した。FIG. 3 shows the expression of PSD-95-3MT in primary cultured neurons. Adenovirus containing the PSD-95-3MT expression construct was transduced into primary cultured neurons and treated with 5 μM CdCl 2 . PSD-95-3MT was immunostained with anti-FLAG antibody and Alexa543-conjugated secondary antibody. 図4は、初代培養神経細胞におけるPSD-95-3MTの電子顕微鏡像を示す。a-d) 初代培養神経細胞をパラホルムアルデヒドおよびグルタールアルデヒドで固定したが、オスミウム後固定および電子染色は行わなかった。e-h) オスミウムによる後固定およびウラン・鉛染色を行った。高電子密度沈着が、AdPSD-95-3MTを形質導入し、CdCl2とともにインキュベートした神経細胞において観察されたが(aおよびe)、対照(bおよびf)、CdCl2とともにインキュベートしただけの神経細胞(cおよびg)ならびにAdPSD-95-3MTを形質導入しただけの神経細胞(dおよびh)では観察されなかった。FIG. 4 shows an electron microscope image of PSD-95-3MT in primary cultured neurons. ad) Primary cultured neurons were fixed with paraformaldehyde and glutaraldehyde, but no post-osmosis fixation or electron staining was performed. eh) Post-fixation with osmium and uranium / lead staining. High electron density deposition was observed in neurons transduced with AdPSD-95-3MT and incubated with CdCl 2 (a and e), but control (b and f), only neurons incubated with CdCl 2 (c and g) and neurons that were only transduced with AdPSD-95-3MT (d and h) were not observed. 図5は、PSD-95-3MTの NR2B、Kv1.4およびnNOSへの結合を示す。COS7細胞を、PSD-95-3MT、PSD-95またはMTにより、NR2B(上パネル)、Kv1.4(中パネル)またはnNOS(下パネル)の存在下または非存在下でトランスフェクションした。NR2B、Kv1.4またはnNOSを免疫沈降した(IP)。MTはNR2B、Kv1.4およびnNOSに結合しなかったが、PSD-95-3MTおよびPSD-95の両方はこれらタンパク質と共に共免疫沈降した。FIG. 5 shows the binding of PSD-95-3MT to NR2B, Kv1.4 and nNOS. COS7 cells were transfected with PSD-95-3MT, PSD-95 or MT in the presence or absence of NR2B (upper panel), Kv1.4 (middle panel) or nNOS (lower panel). NR2B, Kv1.4 or nNOS was immunoprecipitated (IP). MT did not bind to NR2B, Kv1.4 and nNOS, but both PSD-95-3MT and PSD-95 co-immunoprecipitated with these proteins. 図6は、内在性MTを示す。培養14日目の神経細胞を5μM CdCl2で処理し、19時間後に固定しMTを免疫染色した。 a) 対照細胞。b) CdCl2処理細胞。c) 高拡大率でのCdCl2処理19時間後での樹状突起。d) 内在性MT発現細胞数の経時変化。FIG. 6 shows endogenous MT. Neurons on day 14 of culture were treated with 5 μM CdCl 2 , fixed after 19 hours and immunostained for MT. a) Control cells. b) CdCl 2 treated cells. c) Dendrites 19 hours after CdCl 2 treatment at high magnification. d) Change in the number of endogenous MT-expressing cells over time. 図7は、nMT融合GroELコンストラクトの模式図である。nMTタグをGroEL各サブユニットのC末端の付加し、すべてのコンストラクトはC末端にFLAGタグを含む。FIG. 7 is a schematic diagram of an nMT-fused GroEL construct. An nMT tag is added at the C-terminus of each GroEL subunit, and all constructs contain a FLAG tag at the C-terminus. 図8は、精製GroEL(a)およびGroEL-14(3MT)(b)の紫外吸収スペクトルを示す。石英キュベットに0.2mg/mLに調整したタンパク質溶液を入れ、吸収スペクトルを測定した。FIG. 8 shows the ultraviolet absorption spectra of purified GroEL (a) and GroEL-14 (3MT) (b). A protein solution adjusted to 0.2 mg / mL was put in a quartz cuvette, and an absorption spectrum was measured. 図9は、Cd2+結合3MTタグ付加GroELの電子顕微鏡像を示す。GroELおよびCd2+結合GroEL-14(3MT)粒子を電子顕微鏡で200kVにて観察した。無染色のGroEL(aおよびb)、Cd2+結合GroEL-14(3MT)(cおよびd)、ネガティブ染色したGroEL(e-g)、ならびにCd2+結合GroEL-14(3MT)(h-j)の典型的な電子顕微鏡像を示す。(b)、(d)、(f)、(g)、(i)および(j)は、それぞれ低倍率像において四角で囲った領域を拡大したものである。スケールバーは500オングストロームを示す。FIG. 9 shows an electron microscopic image of Cd 2+ -binding 3MT-tagged GroEL. GroEL and Cd 2+ -bound GroEL-14 (3MT) particles were observed with an electron microscope at 200 kV. Typical of unstained GroEL (a and b), Cd 2+ binding GroEL-14 (3MT) (c and d), negative stained GroEL (eg), and Cd 2+ binding GroEL-14 (3MT) (hj) An electron microscope image is shown. (b), (d), (f), (g), (i), and (j) are enlarged views of a region surrounded by a square in the low-magnification image. The scale bar indicates 500 angstroms. 図10は、Cd2+結合3MTタグ付加GroELの極低温電子顕微鏡像を示す。氷包埋したGroELおよびCd2+結合GroEL-14(3MT)粒子を極低温電子顕微鏡で200kVにて観察した。GroEL(a,b,eおよびf)ならびにCd2+結合GroEL-14(3MT)(c,d,gおよびh)の、3μmアンダーフォーカス(a-d)および1.5μmアンダーフォーカス(e-h)での典型的な画像を示す。(b)、(d)、(f)および(h)は、それぞれ低倍率像において四角で囲った領域を拡大したものであり、観察された個々の粒子像を丸で囲ってある。スケールバーは500オングストロームを示す。FIG. 10 shows a cryogenic electron microscope image of Cd 2+ -binding 3MT-tagged GroEL. Ice-embedded GroEL and Cd 2+ -bound GroEL-14 (3MT) particles were observed at 200 kV with a cryogenic electron microscope. Typical of GroEL (a, b, e and f) and Cd 2+ binding GroEL-14 (3MT) (c, d, g and h) at 3 μm under focus (ad) and 1.5 μm under focus (eh) The correct image. (b), (d), (f), and (h) are enlarged views of a region surrounded by a square in each low-magnification image, and each observed particle image is circled. The scale bar indicates 500 angstroms. 図11は、3μmアンダーフォーカスで撮影した極低温電子顕微鏡像の粒子コントラスト分布を示す。各粒子のコントラストは粒子のピクセル強度から、粒子に隣接した領域のバックグラウンドのピクセル強度を差し引くことにより算出した。他のものと有意に異なるコントラストはスミルノフ・グラブス検定により棄却した。FIG. 11 shows the particle contrast distribution of a cryogenic electron microscope image taken with 3 μm under focus. The contrast of each particle was calculated by subtracting the background pixel intensity of the area adjacent to the particle from the pixel intensity of the particle. Contrast significantly different from the others was rejected by the Smirnov-Grubbs test.

Claims (17)

電子顕微鏡法により観察すべき細胞中の標的タンパク質の二次元または三次元情報を得る方法であって、
金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと標的タンパク質との融合タンパク質を発現させうるコンストラクトを提供する工程、
該コンストラクトを、該細胞に導入する工程、
該細胞中で該コンストラクトから該融合タンパク質を発現させる工程、
該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと結合する金属を、該細胞に供給することにより、該細胞中にて該融合タンパク質中の金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと、該金属とのクラスターを形成させる工程、および、
該細胞を電子顕微鏡により観察する工程、
を含む方法。
A method for obtaining two-dimensional or three-dimensional information of a target protein in a cell to be observed by electron microscopy,
Providing a construct capable of expressing a metal binding protein or a fusion protein of a metal binding peptide and a target protein,
Introducing the construct into the cell;
Expressing the fusion protein from the construct in the cell;
Supplying a metal that binds to the metal-binding protein or metal-binding peptide to the cell, thereby forming a cluster of the metal with the metal-binding protein or metal-binding peptide in the fusion protein and the metal in the cell ,and,
Observing the cells with an electron microscope;
Including methods.
電子顕微鏡法が、透過型電子顕微鏡法である、請求項1に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the electron microscopy is transmission electron microscopy. 情報が三次元位置情報であり、電子顕微鏡法が透過型電子顕微鏡による電子線トモグラフィーである、請求項2に記載の方法。   The method according to claim 2, wherein the information is three-dimensional position information, and the electron microscopy is electron beam tomography using a transmission electron microscope. 電子顕微鏡法により観察すべき標的タンパク質を検出する方法であって、
金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと標的タンパク質との融合タンパク質を発現させうるコンストラクトを提供する工程、
該コンストラクトを、細胞に導入する工程、
該細胞中で該コンストラクトから該融合タンパク質を発現させる工程、
該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと結合する金属を、該細胞に供給することにより、該細胞中にて該融合タンパク質中の金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと、該金属とのクラスターを形成させる工程、
該金属とクラスターを形成している融合タンパク質を含む試料を調製する工程、
該試料に含まれる融合タンパク質を電子顕微鏡により観察する工程、
を含む方法。
A method for detecting a target protein to be observed by electron microscopy,
Providing a construct capable of expressing a metal binding protein or a fusion protein of a metal binding peptide and a target protein,
Introducing the construct into a cell;
Expressing the fusion protein from the construct in the cell;
Supplying a metal that binds to the metal-binding protein or metal-binding peptide to the cell, thereby forming a cluster of the metal with the metal-binding protein or metal-binding peptide in the fusion protein and the metal in the cell ,
Preparing a sample containing a fusion protein forming a cluster with the metal;
Observing the fusion protein contained in the sample with an electron microscope;
Including methods.
金属結合タンパク質または金属結合ペプチドが、少なくとも1つのメタロチオネインを含むものである、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the metal-binding protein or metal-binding peptide comprises at least one metallothionein. 金属結合タンパク質または金属結合ペプチドが、3〜5個のメタロチオネインをタンデムに含むものである、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the metal-binding protein or metal-binding peptide contains 3 to 5 metallothioneins in tandem. 金属結合タンパク質または金属結合ペプチドが、3個のメタロチオネインをタンデムに含むものである、請求項6に記載の方法。   The method according to claim 6, wherein the metal-binding protein or metal-binding peptide contains three metallothioneins in tandem. 金属結合タンパク質または金属結合ペプチドが結合する金属がカドミウムである、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the metal to which the metal-binding protein or metal-binding peptide binds is cadmium. 標的タンパク質が自己集合する性質を有するタンパク質である、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 8, wherein the target protein is a protein having a property of self-assembling. 標的タンパク質がホモ多量体を形成するタンパク質である、請求項9に記載の方法。   The method according to claim 9, wherein the target protein is a protein that forms a homomultimer. 電子顕微鏡法により観察すべき細胞中の標的タンパク質の二次元または三次元情報を得るための、以下を含むキット:
(1)金属結合タンパク質または金属結合ペプチドをコードする部分を含み、かつ、所望の標的タンパク質が該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドとインフレームに結合することにより、該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと所望の標的タンパク質との融合タンパク質を発現させることが出来る発現カセット、および、
(2)該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドに結合する金属を含む試薬。
A kit containing the following for obtaining 2D or 3D information of a target protein in a cell to be observed by electron microscopy:
(1) A metal-binding protein or metal-binding peptide is included, and a desired target protein binds in-frame with the metal-binding protein or metal-binding peptide, thereby An expression cassette capable of expressing a fusion protein with a desired target protein, and
(2) A reagent containing a metal that binds to the metal-binding protein or metal-binding peptide.
電子顕微鏡法により観察すべき標的タンパク質を検出するための、以下を含むキット:
(1)金属結合タンパク質または金属結合ペプチドをコードする部分を含み、かつ、所望の標的タンパク質が該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドとインフレームに結合することにより、該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドと所望の標的タンパク質との融合タンパク質を発現させることが出来る発現カセット、および、
(2)該金属結合タンパク質または金属結合ペプチドに結合する金属を含む試薬。
A kit containing the following for detecting a target protein to be observed by electron microscopy:
(1) A metal-binding protein or metal-binding peptide is included, and a desired target protein binds in-frame with the metal-binding protein or metal-binding peptide, thereby An expression cassette capable of expressing a fusion protein with a desired target protein, and
(2) A reagent containing a metal that binds to the metal-binding protein or metal-binding peptide.
該金属結合タンパク質が、3〜5個のメタロチオネインをタンデムに含むものであり、金属がカドミウムである、請求項11または12に記載のキット。   The kit according to claim 11 or 12, wherein the metal binding protein contains 3 to 5 metallothioneins in tandem, and the metal is cadmium. 標的タンパク質と遺伝的に融合して用いられる、金属結合タンパク質または金属結合ペプチドを含む、電子顕微鏡法による標的タンパク質の検出用マーカー。   A marker for detection of a target protein by electron microscopy, including a metal binding protein or a metal binding peptide, which is genetically fused with the target protein. 金属結合タンパク質または金属結合ペプチドが、少なくとも1つのメタロチオネインを含むものである、請求項14に記載のマーカー。   15. A marker according to claim 14, wherein the metal binding protein or metal binding peptide comprises at least one metallothionein. 金属結合タンパク質または金属結合ペプチドが、3〜5個のメタロチオネインをタンデムに含むものである、請求項15に記載のマーカー。   The marker according to claim 15, wherein the metal-binding protein or the metal-binding peptide contains 3 to 5 metallothioneins in tandem. 金属結合タンパク質または金属結合ペプチドが、3個のメタロチオネインをタンデムに含むものである、請求項16に記載のマーカー。   The marker according to claim 16, wherein the metal-binding protein or metal-binding peptide comprises three metallothioneins in tandem.
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Hayashi et al. The transmembrane transporter domain of glutamate transporters is a process tip localizer
Maina et al. Dityrosine cross-links are present in Alzheimer’s disease-derived tau oligomers and paired helical filaments (PHF) which promotes the stability of the PHF-core tau (297–391) in vitro