JP2008245633A - Recombinant coryneform bacterium and method for producing biodegradable polyester - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、組換えコリネ型細菌および生分解性ポリエステルの製造方法に関し、詳しくは、生分解性ポリエステル生産能力を本来有していないコリネ型細菌に、生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群およびコリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターを導入することにより、内毒素を有しない安全な生分解性ポリエステルを効率よく生産させる能力を付与したコリネ型細菌およびこれを用いた生分解性ポリエステルの製造方法に関するものである。 The present invention relates to a recombinant coryneform bacterium and a method for producing a biodegradable polyester. More specifically, the present invention relates to a biodegradable polyester synthase gene group and a coryneform bacterium in a coryneform bacterium that does not originally have biodegradable polyester production ability. The present invention relates to a coryneform bacterium having an ability to efficiently produce a safe biodegradable polyester having no endotoxin by introducing a promoter for a bacterial cell surface protein gene, and a method for producing a biodegradable polyester using the same Is.
石油など化石燃料由来の合成プラスチックは、自然環境中で分解されないために、環境中に半永久的に蓄積して、様々な環境問題を引き起こしている。このような背景から、自然界に存在する微生物によって分解される生分解性プラスチックは、環境に負荷を与えない高分子材料として注目されはじめ、実用化に向け優れた性能を持つ材料の開発が行われている。また、これら生分解性プラスチックは同時に生体適合性も有することから、生体機能材料としても注目され、生物・医学領域への新たな展開も期待されている。 Synthetic plastics derived from fossil fuels such as petroleum are not decomposed in the natural environment, and therefore accumulate semipermanently in the environment, causing various environmental problems. Against this background, biodegradable plastics, which are degraded by microorganisms that exist in nature, have begun to attract attention as polymer materials that do not impact the environment, and materials with excellent performance are being developed for practical use. ing. In addition, since these biodegradable plastics have biocompatibility at the same time, they are attracting attention as biofunctional materials and are expected to be developed in the biomedical field.
このような生分解性プラスチックの合成法として、微生物合成、天然物誘導、化学合成法などが検討されているが、糖や油脂などの再生可能な生物有機資源（バイオマス）を原料とできる微生物合成法は、資源の有効利用という観点から高いニーズがある。 As a method for synthesizing such biodegradable plastics, microbial synthesis, natural product induction, chemical synthesis methods, etc. are being studied, but microbial synthesis that can be made from renewable biological organic resources (biomass) such as sugar and fats and oils. The law has high needs from the viewpoint of effective use of resources.
そして、これまでに数多くの微生物において、バイオマスを細胞内に取り入れた後に、複数の合成代謝経路を経て生分解性ポリエステルをつくり、菌体内に蓄積することが知られている。 In many microorganisms, it is known that after taking biomass into cells, biodegradable polyester is produced through a plurality of synthetic metabolic pathways and accumulated in the cells.
このような微生物によって生合成された生分解性ポリエステルは、微生物細胞から抽出された後、様々な形に成型・加工されて各種用途に提供され、使用後は、環境微生物の作用により二酸化炭素と水に分解されて最初の再生可能なバイオマスに還元される。 Biodegradable polyester biosynthesized by such microorganisms is extracted from microbial cells, then molded and processed into various forms and provided for various uses. After use, carbon dioxide and carbon dioxide are produced by the action of environmental microorganisms. It is broken down into water and reduced to the first renewable biomass.
これら生分解性ポリエステルの中で、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸は、合成プラスチックと同様に熱可塑性を示し、優れた生分解性を有することから注目を集めている生分解性ポリエステルである。 Among these biodegradable polyesters, poly-3-hydroxyalkanoic acid is a biodegradable polyester that is attracting attention because it exhibits thermoplasticity similar to synthetic plastics and has excellent biodegradability.
微生物細胞内でポリ３−ヒドロキシアルカン酸が合成される代謝過程は、バイオマスを原料として、モノマー供給代謝経路を経てポリ３−ヒドロキシアルカン酸のモノマーである（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡがつくられ、次いでポリ３−ヒドロキシアルカン酸重合酵素によって重合されポリ３−ヒドロキシアルカン酸が合成される。 The metabolic process in which poly-3-hydroxyalkanoic acid is synthesized in microbial cells is made from (R) -3-hydroxyacyl CoA, which is a monomer of poly-3-hydroxyalkanoic acid, using biomass as a raw material and via a monomer supply metabolic pathway. And then polymerized with a poly-3-hydroxyalkanoic acid polymerizing enzyme to synthesize poly-3-hydroxyalkanoic acid.
このモノマー供給経路は大きく分けて、アセチルＣｏＡを出発物質としたアセチルＣｏＡの二量化経路と、脂肪酸生合成経路（de novo fatty acid synthesis）の中間体からの変換経路と、脂肪酸分解（β-oxidation）の中間体からの変換経路の３つの主経路が挙げられ、これら主経路以外にもいくつかの副経路が存在する。 This monomer supply route is roughly divided into a dimerization route of acetyl CoA using acetyl CoA as a starting material, a conversion route from an intermediate of a fatty acid biosynthesis route (de novo fatty acid synthesis), and a fatty acid degradation (β-oxidation). There are three main routes of the conversion route from the intermediate), and there are several sub-routes in addition to these main routes.
そして、これら生分解性プラスチックの微生物合成に生産天然菌を利用する場合、前述のような複雑な微生物代謝経路を経たり、生産天然菌自身のプラスチック分解系などが作動してしまうため、人為的に生分解性ポリエステルの生産性を高めたり、所望の共重合組成を有する生分解性ポリエステルを生産させるには限界があり、所望の生分解性プラスチックを作り出せなかった。 And when using natural bacteria produced in the biosynthesis of these biodegradable plastics, it is difficult for humans to go through complicated microbial metabolic pathways as described above, or the plastic degradation system of the natural bacteria produced itself operates. However, there is a limit to increasing the productivity of biodegradable polyester and producing biodegradable polyester having a desired copolymer composition, and the desired biodegradable plastic could not be produced.
そのため、単に生産天然菌を利用するのではなく、近年急速に進んだ遺伝子組換え技術を利用して、生分解性プラスチックを合成する酵素である生分解性プラスチック重合酵素の遺伝子を単離し、組換え微生物を利用した生産が検討されるようになった（特許文献１および２、非特許文献１）。 For this reason, the gene of biodegradable plastic polymerizing enzyme, which is an enzyme that synthesizes biodegradable plastic, is isolated and assembled using gene recombination technology that has been rapidly advanced in recent years, rather than simply using natural bacteria produced. Production using recombinant microorganisms has been studied (Patent Documents 1 and 2, Non-Patent Document 1).
例えば、生分解性ポリエステル重合酵素遺伝子の一部を改変し、その基質特異性を変換することによって生分解性ポリエステル中の共重合組成を制御し、生産する生分解性ポリエステルの物性をある程度自由に改変する試みがなされている（特許文献１）。 For example, by modifying a part of the biodegradable polyester polymerizing enzyme gene and changing its substrate specificity, the copolymer composition in the biodegradable polyester is controlled, and the physical properties of the biodegradable polyester to be produced are freely controlled to some extent. Attempts to modify have been made (Patent Document 1).
また、代表的な生分解性ポリエステル合成微生物であるラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）の生分解性ポリエステル重合酵素の遺伝子をプロモーターを用いて発現誘導することにより、生分解性ポリエステル合成の検討が推進されている（特許文献２、非特許文献１）。 In addition, the biodegradable polyester synthesizing microorganism Ralstonia eutropha (Ralstonia eutropha), a biodegradable polyester polymerizing enzyme gene, is induced by using a promoter to promote biodegradable polyester synthesis. (Patent Document 2, Non-Patent Document 1).
特許文献２では、該重合酵素遺伝子の誘導性プロモーターを利用して高分子量の生分解性プラスチックの生産性向上に成功したことを開示している。 Patent Document 2 discloses that the productivity of high molecular weight biodegradable plastics has been successfully improved by using the inducible promoter of the polymerase enzyme gene.
非特許文献１では、該重合酵素の改変による組換え微生物の生分解性ポリエステル生産量の影響を調べるため、in vivo分析システムの構築に成功している。 In Non-Patent Document 1, an in vivo analysis system has been successfully constructed in order to examine the influence of the biodegradable polyester production amount of a recombinant microorganism by modifying the polymerization enzyme.
そして、上記組換え微生物を利用した生分解性プラスチックの生産には、宿主細菌としてグラム陰性菌である大腸菌が用いられ、発現遺伝子である生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群もグラム陰性菌由来のものである。 In the production of biodegradable plastics using the above-mentioned recombinant microorganisms, Escherichia coli, which is a gram-negative bacterium, is used as a host bacterium, and the biodegradable polyester synthase gene group which is an expressed gene is also derived from a gram-negative bacterium. It is.
このように組換え微生物を用いた生分解性プラスチックの生産には、宿主細菌として大腸菌のほかにポリ３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子破壊株ＰＨＢ−４などのラルストニア・ユートロファ、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子破壊株などの各種シュードモナス属等が使用されており、これらの微生物はすべて内毒素を有するグラム陰性菌である。そして、発現遺伝子である生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群もほとんどがグラム陰性菌由来の遺伝子が用いられている。 Thus, for the production of biodegradable plastics using recombinant microorganisms, in addition to Escherichia coli as host bacteria, Ralstonia eutropha such as poly 3-hydroxyalkanoate synthase gene disruption strain PHB-4, poly 3-hydroxyalkane Various Pseudomonas genera such as acid synthase gene-disrupted strains are used, and these microorganisms are all Gram-negative bacteria having endotoxins. And most of the biodegradable polyester synthase gene groups that are expressed genes are genes derived from Gram-negative bacteria.
一方、コリネ型細菌は、ポリエステル生産能を有しておらず、元来、内毒素を内在していないグラム陽性菌であるため、食品など生体内に入るアミノ酸を生産するのに安全性が確立されている菌種である。特にこのコリネ型細菌は、大腸菌の１０倍以上といわれる程の高密度培養が可能な細菌であり、全ＤＮＡ配列が完全解読され、宿主ベクター系が開発されて遺伝子組換え技術による物質生産も盛んに行われており、多くの食品会社において主力のアミノ酸発酵菌となっている。 Coryneform bacteria, on the other hand, do not have polyester-producing ability and are originally Gram-positive bacteria that do not contain endotoxin. Therefore, safety has been established for producing amino acids that enter living bodies such as food. It is a fungus species. In particular, this coryneform bacterium is a bacterium that can be cultured at a density as high as 10 times that of Escherichia coli. The entire DNA sequence has been completely deciphered, a host vector system has been developed, and the production of substances by gene recombination technology is also popular. In many food companies, it is the main amino acid fermenting bacterium.
そのため、組換えコリネ型細菌を作製し、目的タンパク質を生産させる多くの試みがなされており、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターを利用した酵素タンパク質の分泌生産に関する検討もなされている（非特許文献２）。 For this reason, many attempts have been made to produce recombinant coryneform bacteria and produce the target protein, and studies have also been conducted on the secretory production of enzyme proteins using promoters for cell surface protein genes of coryneform bacteria (non- Patent Document 2).
しかし、現在までにこれらコリネ型細菌を宿主細菌に用いて生分解性ポリエステルを生産させた例は報告されていない。 However, there have been no reports of biodegradable polyester production using these coryneform bacteria as host bacteria.
特許文献１〜２、非特許文献１のような大腸菌を宿主細菌とした組換え微生物による生分解性ポリエステルの製造方法では、大腸菌がグラム陰性菌であるため膜中に内毒素（その活性本体は、リポ多糖といわれている）が内在しており、生分解性ポリエステルを生産抽出して生体医療材料や食品接触容器に使用した場合、その混入が問題になる。 In the method for producing biodegradable polyester using a recombinant microorganism using Escherichia coli as a host bacterium such as Patent Documents 1 and 2 and Non-patent Document 1, since E. coli is a Gram-negative bacterium, endotoxin (its active body is the active body). , Which is said to be lipopolysaccharide), and when biodegradable polyester is produced and extracted and used in biomedical materials and food contact containers, its contamination becomes a problem.
そのため、元来膜中に内毒素を有しないグラム陽性菌を宿主細菌とする組換え微生物による生分解性ポリエステルの製造方法が求められる。 Therefore, there is a need for a method for producing biodegradable polyester using a recombinant microorganism having a Gram-positive bacterium that does not inherently have endotoxin in the membrane as a host bacterium.
しかし、遺伝子発現に利用される発現遺伝子である生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群はグラム陰性菌由来のもが圧倒的に多く、一般的に発現遺伝子と発現宿主細菌が同じグラム陰性菌同士の組み合わせで遺伝子発現が上手く進むため、宿主細菌として大腸菌等のグラム陰性菌が利用されている。 However, the biodegradable polyester synthase gene group, which is an expression gene used for gene expression, is predominantly derived from Gram-negative bacteria, and generally a combination of Gram-negative bacteria with the same expression gene and expression host bacteria. Therefore, Gram-negative bacteria such as Escherichia coli are used as host bacteria.
グラム陽性菌とグラム陰性菌は、前述した内毒素の有無のみならず、プロモーターの配列を認識する各細菌が保有するＲＮＡポリメラーゼの認識特異性の相違、遺伝子発現に関連したｍＲＮＡ配列やそれらと相互作用する因子との相互関係等の相違が存在するため、グラム陰性菌由来の生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群をグラム陽性菌に発現させるためには、これらの相違を克服しなければならない。 Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria are not only the presence or absence of the endotoxin described above, but also the differences in the recognition specificity of RNA polymerase possessed by each bacterium that recognizes the promoter sequence, mRNA sequences related to gene expression, and their mutual relationship. Since there is a difference such as a mutual relationship with an acting factor, in order to express a biodegradable polyester synthase gene group derived from a Gram-negative bacterium to a Gram-positive bacterium, these differences must be overcome.
一方、前述のとおり、グラム陽性菌であるコリネ型細菌を宿主細菌として用いた例は、非特許文献２のようにアミノ酸発酵の分野においてタンパク質の生産に利用されているが、生分解性ポリエステルの生産には使用された報告はない。 On the other hand, as described above, an example in which a coryneform bacterium that is a Gram-positive bacterium is used as a host bacterium is used for protein production in the field of amino acid fermentation as in Non-Patent Document 2, but a biodegradable polyester There are no reports used for production.
ここで、遺伝子組換え技術を用いたタンパク質発現と本発明における生分解性ポリエステル生産の相違について述べる。 Here, the difference between protein expression using genetic recombination technology and biodegradable polyester production in the present invention will be described.
タンパク質は、ＤＮＡから転写・翻訳を経て生産される。一方、生分解性ポリエステルは、ＤＮＡから転写・翻訳を経て生産された複数の生分解性ポリエステル合成酵素を利用して、（バイオマス）原料からモノマーを合成し、さらにモノマーを重合して生産される。 Protein is produced from DNA through transcription and translation. On the other hand, biodegradable polyesters are produced by synthesizing monomers from (biomass) raw materials using a plurality of biodegradable polyester synthases produced from DNA via transcription and translation, and then polymerizing the monomers. .
このように、生分解性ポリエステルの生産過程は、タンパク質生産過程に加えた複数の酵素反応過程を経なければならない。 Thus, the biodegradable polyester production process must go through a plurality of enzyme reaction processes in addition to the protein production process.
そのため、コリネ型細菌に生分解性ポリエステル生産能を付与するには、複数の生分解性ポリエステル合成酵素を機能的に発現させるのに加えて、（バイオマス）原料調達のタイミングや量、モノマーを生産する過程で必要な還元力を整える補酵素（ＮＡＤＰＨ）の供給、モノマーを重合する過程を阻害する遊離ＣｏＡの細胞内存在状態、生産された生分解性ポリエステルによる細胞毒性等を考慮しなければならず、これらの点は宿主細菌固有の代謝経路により異なるため、大腸菌とコリネ型細菌でも大いに異なると考えられる。 Therefore, in order to give biodegradable polyester production ability to coryneform bacteria, in addition to functionally expressing multiple biodegradable polyester synthases, production of (biomass) raw material procurement timing, quantity and monomers Consideration must be given to the supply of coenzyme (NADPH) that regulates the reducing power required in the process, the intracellular presence of free CoA that inhibits the process of polymerizing monomers, the cytotoxicity of the biodegradable polyester produced, etc. However, since these points differ depending on the metabolic pathway inherent to the host bacteria, it is considered that they differ greatly between E. coli and coryneform bacteria.
また、コリネ型細菌は元来アミノ酸発酵菌であり、通常解糖系から生成したアセチルＣｏＡを原料としてアミノ酸発酵代謝を行っているため、同じ原料であるアセチルＣｏＡから生分解性ポリエステルを生産させるには、アミノ酸代謝経路から生分解性ポリエステル合成経路に移行させる培養条件を検討しなければならない。しかしながら、培養する段階で大腸菌と比べてコリネ型細菌が圧倒的に有利な点は、多くの複合成分から構成される糖質を旺盛に資化できる能力にある。この特長は、複合糖質を多く含むバイオマスの有効利用を考えた上で大変魅力的である。 Coryneform bacteria are originally amino acid-fermenting bacteria, and are usually fermented with amino acid fermentation using acetyl CoA produced from glycolysis as a raw material. Therefore, biodegradable polyester is produced from acetyl CoA, which is the same raw material. Therefore, culture conditions for transferring from the amino acid metabolic pathway to the biodegradable polyester synthesis pathway must be examined. However, the dominant advantage of coryneform bacteria over E. coli at the stage of culturing is the ability to vigorously assimilate carbohydrates composed of many complex components. This feature is very attractive considering the effective use of biomass containing a large amount of complex carbohydrates.
以上より、グラム陽性菌であるコリネ型細菌にグラム陰性菌由来の生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群を導入して生分解性ポリエステルを生産させるためには、上記複数の課題を解決しなければならない。 From the above, in order to produce biodegradable polyester by introducing biodegradable polyester synthase gene group derived from Gram-negative bacteria into coryneform bacteria that are Gram-positive bacteria, the above-mentioned multiple problems must be solved. .
さらに、生分解性ポリエステルの微生物合成方法では、単一細胞内でその生産性を最適化したり、単一細胞レベルで最適化した組換え微生物をいかに高密度培養するかが重要な課題となる。 Furthermore, in the microbial synthesis method of biodegradable polyester, it is an important issue to optimize the productivity in a single cell or to culture a recombinant microorganism optimized at the single cell level.
本発明は、以上のような問題点を解決するためになされたものであって、大腸菌と膜構造が異なり元来内毒素を有さず安全性が確立され、かつ高密度培養の可能なコリネ型細菌に、生分解性ポリエステル生産能を付与した組換えコリネ型細菌、およびこれら組換えコリネ型細菌を用いて医療や食品業界などの生体に接触する生分解性ポリエステルを効率的に生産する製造方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in order to solve the above-mentioned problems, and has a membrane structure different from that of Escherichia coli and originally has no endotoxin. Recombinant Coryneform Bacteria Giving Biodegradable Polyester Production Ability, and Production of Biodegradable Polyester that Uses the Recombinant Coryneform Bacteria to Contact Living Organs such as the Medical and Food Industries It aims to provide a method.
本発明者は、以上のような問題を解決するために、鋭意研究を行った結果、宿主細菌としてコリネ型細菌を用いて生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群を導入し発現させることにより、高密度培養の可能な生産性に有利な生分解性ポリエステルを生産する組換えコリネ型細菌を構築し、内毒素を含有しない極めて安全性の高い生分解性ポリエステルを製造することに成功し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has introduced a biodegradable polyester synthase gene group using a coryneform bacterium as a host bacterium and expressed it, thereby achieving high density. By constructing a recombinant coryneform bacterium that produces a biodegradable polyester advantageous for culturable productivity and succeeding in producing a highly safe biodegradable polyester that does not contain endotoxin, the present invention It came to complete.
本発明に係る組換えコリネ型細菌の特徴は、コリネ型細菌に、生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群と前記コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターを導入して生分解性ポリエステル生産能を付与するように改変した点にある。 A feature of the recombinant coryneform bacterium according to the present invention is that a biodegradable polyester synthase gene group and a promoter for a cell surface protein gene of the coryneform bacterium are introduced into the coryneform bacterium to impart biodegradable polyester production ability. It is in the point modified so as to.
また、本発明において、前記生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群と、前記コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターとの距離を近接させて転写機能を備えさせることが好ましい。 In the present invention, it is preferable that the biodegradable polyester synthase gene group and the promoter for cell surface protein genes of the coryneform bacterium are brought close to each other to provide a transcription function.
さらに、本発明において、前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム（Corynebacterium）属であり、かつ、前記コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターがコリネバクテリウム（Corynebacterium）属由来のものであることが望ましい。 Furthermore, in the present invention, the coryneform bacterium is preferably from the genus Corynebacterium, and the promoter for the cell surface protein gene of the coryneform bacterium is preferably derived from the genus Corynebacterium. .
また、本発明において、前記コリネバクテリウム（Corynebacterium）属がコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であることが好ましい。 In the present invention, the genus Corynebacterium is preferably Corynebacterium glutamicum.
さらに、本発明において、前記コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３８６９、ＡＴＣＣ１３０３２、およびＡＴＣＣ１４０６７であることが好ましい。 Furthermore, in the present invention, the Corynebacterium glutamicum is preferably Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, ATCC 13032, and ATCC 14067.
本発明において、生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群が、ラルストニア属（Ralstonia）、シュードモーナス属（Pseudomonas）、およびバチルス属（Bacillus）のいずれかに由来するものであることが望ましい。 In the present invention, the biodegradable polyester synthase gene group is desirably derived from any of Ralstonia, Pseudomonas, and Bacillus.
本発明において、前記生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群は、β−ケトチオラーゼ遺伝子、ＮＡＤＰＨ依存アセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子およびポリ３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子から構成されることが望ましく、これらがオペロンを形成していることがより好ましい。 In the present invention, the biodegradable polyester synthase gene group is preferably composed of a β-ketothiolase gene, an NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase gene, and a poly-3-hydroxyalkanoate synthase gene, and these include an operon. More preferably, it is formed.
また、本発明において、前記生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群のポリ３−ヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子を変異型Ｇ４Ｄ遺伝子、または前記生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群のポリ３−ヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子のコドンユーセージをコリネ型菌用に変換した重合酵素遺伝子のいずれかを用いることにより生分解性ポリエステルの生産を増大させることが好ましい。 Further, in the present invention, the poly3-hydroxyalkanoic acid synthase gene of the biodegradable polyester synthase gene group is a mutant G4D gene, or the poly-3-hydroxyalkanoic acid synthase of the biodegradable polyester synthase gene group. It is preferred to increase the production of biodegradable polyester by using any of the polymerizing enzyme genes in which the codon usage of the gene is converted for coryneform bacteria.
また、本発明において、ベクターの異なるプラスミドｐＰＳ−ＣＡＢとｐＶＣ７−ＣＡＢの２つをコリネ型細菌に導入することにより生分解性ポリエステルの生産を増大させることが好ましい。 In the present invention, it is preferable to increase the production of biodegradable polyester by introducing two plasmids pPS-CAB and pVC7-CAB having different vectors into coryneform bacteria.
また、本発明の生分解性ポリエステルの製造方法の特徴は、組換えコリネ型細菌を、炭素源としてグルコース、窒素源として硫酸アンモニウムをそれぞれ添加した所定の培地組成中において、その培養温度が２７℃〜３７℃、ｐＨが７〜８の条件下で培養することにより生分解性ポリエステルを生産させる点にある。 The biodegradable polyester production method of the present invention is characterized in that a recombinant coryneform bacterium is cultured in a predetermined medium composition to which glucose as a carbon source and ammonium sulfate as a nitrogen source are added. The biodegradable polyester is produced by culturing under conditions of 37 ° C. and pH 7-8.
また、本発明において、培養温度が３０℃であってｐＨが７．５の条件下で前記組換えコリネ型細菌を培養することが望ましい。 In the present invention, it is desirable to culture the recombinant coryneform bacterium under the conditions of a culture temperature of 30 ° C. and a pH of 7.5.
さらに、本発明において、培地組成が、少なくともグルコース、硫酸アンモニウム、およびビオチンを含み、前記ビオチン濃度が３〜４５０μｇ／Ｌの組成であることが好ましく、前記ビオチン濃度が１０〜３０μｇ／Ｌであることがより望ましい。 Furthermore, in the present invention, the medium composition preferably contains at least glucose, ammonium sulfate, and biotin, and the biotin concentration is preferably 3 to 450 μg / L, and the biotin concentration is 10 to 30 μg / L. More desirable.
本発明によれば、生分解性ポリエステル生産能を有する組換えコリネ型細菌を得ることにより、バイオマスを栄養源として成育し、環境に優しい生分解性材料としてだけでなく、安全性の高い高機能性材料として、医療や食品など生体に直接接触しても利用可能な生分解性ポリエステルを効率よく生産できる。さらには、同一菌体においてアミノ酸と生分解性ポリエステルを同時生産させることができ、２種の付加価値の高い生体産物を生産させるトータルエネルギーを省力化させた高効率的な微生物発酵システムを得ることができる。 According to the present invention, by obtaining a recombinant coryneform bacterium having a biodegradable polyester-producing ability, biomass is grown as a nutrient source, and not only as an environmentally friendly biodegradable material, but also a highly safe and high function Biodegradable polyester that can be used even when in direct contact with a living body such as medicine or food can be efficiently produced as a functional material. Furthermore, it is possible to simultaneously produce amino acids and biodegradable polyester in the same cell, and to obtain a highly efficient microbial fermentation system that saves the total energy required to produce two types of biological products with high added value. Can do.
以下、本発明に係る組換えコリネ型細菌および生分解性ポリエステルの製造方法の一実施形態について説明する。 Hereinafter, an embodiment of a method for producing a recombinant coryneform bacterium and a biodegradable polyester according to the present invention will be described.
本実施形態における組換えコリネ型細菌は、遺伝子組換え技術を用いて元来生分解性ポリエステル生産能を有しないコリネ型細菌に、生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群（以下、「酵素遺伝子群」と略する場合がある）と前記コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターを含むプラスミドベクターを導入して、生分解性ポリエステル生産能を付与されるように形質転換された組換えコリネ型細菌である。さらに、本実施形態における生分解性ポリエステルの製造方法は、前記組換えコリネ型細菌を所定の条件下にて培養することにより、安全性の高い生分解性ポリエステルを製造する方法である。 The recombinant coryneform bacterium according to the present embodiment is transformed into a biodegradable polyester synthase gene group (hereinafter referred to as “enzyme gene group”) by using a gene recombination technique and a coryneform bacterium that does not originally have biodegradable polyester production ability. A recombinant coryneform bacterium transformed so as to have a biodegradable polyester-producing ability by introducing a plasmid vector containing a promoter for the cell surface protein gene of the coryneform bacterium . Furthermore, the method for producing a biodegradable polyester in the present embodiment is a method for producing a highly safe biodegradable polyester by culturing the recombinant coryneform bacterium under predetermined conditions.
すなわち、本発明における組換えコリネ型細菌では、酵素遺伝子群にコリネ型細菌で機能するプロモーターを連結させた遺伝子を含むプラスミドベクターを作製し、当該プラスミドベクターをコリネ型細菌に導入して、当該細菌内で人工的に生分解性ポリエステル生合成経路を構築して、コリネ型細菌に生分解性ポリエステルの生産能力を付与している。 That is, in the recombinant coryneform bacterium according to the present invention, a plasmid vector containing a gene in which a promoter that functions in the coryneform bacterium is linked to an enzyme gene group is prepared, and the plasmid vector is introduced into the coryneform bacterium. A biodegradable polyester biosynthetic pathway has been artificially constructed within the plant to give coryneform bacteria the ability to produce biodegradable polyester.
ここで、本発明における生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群とは、糖や油脂などのバイオマスから生分解性ポリエステルを合成するのに必要な複数の酵素タンパク質をコードした遺伝子のことである。 Here, the biodegradable polyester synthase gene group in the present invention is a gene encoding a plurality of enzyme proteins necessary for synthesizing biodegradable polyester from biomass such as sugar and fats and oils.
例えば、アセチルＣｏＡを基質原料として、これを２量化するβ−ケトチオラーゼ（以下、「ＰｈｂＡ」と略する場合がある）、続いて還元してモノマーである３−ヒドロキシブチルＣｏＡを生成するＮＡＤＰＨ依存性アセトアセチルＣｏＡ還元酵素（以下、「ＰｈｂＢ」と略する場合がある）、さらに３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを重合して最終的にポリエステルを合成する重合酵素（以下、「ＰｈｂＣ」と略する場合がある）の３つの酵素タンパク質の遺伝子をコードした遺伝子がある。 For example, β-ketothiolase (hereinafter sometimes abbreviated as “PhbA”) which dimerizes acetyl CoA as a substrate raw material, followed by reduction to produce 3-hydroxybutyl CoA as a monomer depends on NADPH An acetoacetyl CoA reductase (hereinafter sometimes abbreviated as “PhbB”), and a polymerization enzyme (hereinafter, abbreviated as “PhbC”) that finally synthesizes polyester by polymerizing 3-hydroxybutyryl CoA. There is a gene encoding the gene of three enzyme proteins.
本発明におけるコリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子プロモーターとは、コリネ型細菌の細胞表層上に主要タンパク質として発現合成され、いずれ菌体外へはがれる機能を発揮するものであり、Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＳＰ）などが挙げられる。特にＢ ｔｙｐｅのものが好ましい。 The cell surface protein gene promoter of the coryneform bacterium in the present invention is a gene expressed and synthesized as a main protein on the cell surface layer of the coryneform bacterium, and exhibits a function of eventually peeling off the cell body. Cell Surface Protein (CSP) Etc. B type is particularly preferable.
ここで、本発明で使用するコリネ型細菌の菌体内代謝経路の一部、およびコリネ型細菌内で人工的に構築する生分解性ポリエステル生合成経路について説明する。例として、コリネ型細菌内で代表的なポリ３−ヒドロキシアルカン酸（以下、「ＰＨＡ」と略する場合がある）であるポリ３−ヒドロキシブタン酸（以下、「ＰＨＢ」と略する場合がある）の合成経路の構築について図１を参照しながら説明する。 Here, a part of the intracellular metabolic pathway of coryneform bacteria used in the present invention and a biodegradable polyester biosynthesis pathway artificially constructed in coryneform bacteria will be described. As an example, poly-3-hydroxybutanoic acid (hereinafter referred to as “PHB”), which is a representative poly-3-hydroxyalkanoic acid (hereinafter sometimes referred to as “PHA”) in coryneform bacteria, may be abbreviated. ) Will be described with reference to FIG.
コリネ型細菌は、グルコースを細胞内に取り入れた後、解糖系に入り、最終的にアセチルＣｏＡが生成する。通常は、このアセチルＣｏＡがＴＣＡ回路（トリカルボン酸回路あるいはクエン酸回路）に入り、中間代謝物質である２−オキソグルタル酸からアミノ酸であるグルタミン酸が合成される。コリネ型細菌において、このアミノ酸合成ルートは既に確立されている。 The coryneform bacterium takes glucose into the cell, then enters the glycolysis system, and finally produces acetyl CoA. Normally, this acetyl CoA enters the TCA cycle (tricarboxylic acid cycle or citric acid cycle), and glutamic acid, which is an amino acid, is synthesized from 2-oxoglutaric acid, which is an intermediate metabolite. In coryneform bacteria, this amino acid synthesis route has already been established.
一方、コリネ型細菌内に人工的に構築するＰＨＢ合成に関与する３つの酵素遺伝子、β−ケトチオラーゼ（ＰｈｂＡ）遺伝子、ＮＡＤＰＨ依存性アセトアセチルＣｏＡ還元酵素（ＰｈｂＢ）遺伝子、およびＰＨＢ重合酵素（ＰｈｂＣ）遺伝子は、既に解読されているコリネ型細菌のＤＮＡ配列からは、全て存在しないことが推定されている。そのため、コリネ型細菌において、ＰＨＢの合成経路は確立されていないと考えられ、実際コリネ型細菌ではＰＨＢの合成は確認されていない。 On the other hand, three enzyme genes involved in PHB synthesis artificially constructed in coryneform bacteria, β-ketothiolase (PhbA) gene, NADPH-dependent acetoacetyl CoA reductase (PhbB) gene, and PHB synthase (PhbC) It is presumed that the genes are not all present from the DNA sequences of coryneform bacteria that have already been decoded. Therefore, it is considered that a PHB synthesis route has not been established in coryneform bacteria, and in fact, PHB synthesis has not been confirmed in coryneform bacteria.
そこで、ＰＨＢを合成する酵素遺伝子群であるＰＨＢ合成酵素遺伝子群のオペロン（以下「ｐｈｂＣＡＢ」と略する場合がある）をコリネ型細菌に導入することで、ＰｈｂＡおよびＰｈｂＢによるアセチルＣｏＡ二量化経路からのモノマー供給経路とＰｈｂＣが直結した合成経路をデザインして、コリネ型細菌内で解糖系とＴＣＡ回路の中間に位置するアセチルＣｏＡを原料とするＰＨＢの合成経路を人工的に構築する。 Thus, by introducing an operon of the PHB synthase gene group (hereinafter sometimes abbreviated as “phbCAB”), which is an enzyme gene group that synthesizes PHB, into coryneform bacteria, the acetyl-CoA dimerization pathway by PhbA and PhbB A synthetic pathway in which PhbC is directly connected to the monomer supply pathway is designed to artificially construct a synthetic pathway for PHB using acetyl-CoA as a raw material located in the middle of the glycolytic system and the TCA cycle in coryneform bacteria.
本実施形態において、コリネ型細菌で機能するプロモーターとは、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターが好ましく、当該プロモーターと前記酵素遺伝子群との距離を近接させて機能可能なように連結されている。 In this embodiment, the promoter that functions in coryneform bacteria is preferably a promoter for cell surface protein genes of coryneform bacteria, and the promoter and the enzyme gene group are linked so as to function in close proximity. Yes.
つまり、コリネ型細菌において、前記酵素遺伝子群の発現のためには、当該酵素遺伝子群の５’上流に前記コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターのＤＮＡ配列を連結する必要がある。そして、当該酵素遺伝子群と当該プロモーターのＤＮＡ配列が連結される位置は、酵素遺伝子群が発現可能であれば特に限定されないが、当該酵素遺伝子群と当該プロモーターとの間に酵素遺伝子群と同一生物由来のプロモーターのＤＮＡ配列が連結されていないことが望ましい。さらに、当該酵素遺伝子群と当該プロモーターとのＤＮＡ配列が隙間を空けずに連結されているのではなく、わずかな間隔を隔てて連結されていることが望ましい。 That is, in the coryneform bacterium, in order to express the enzyme gene group, it is necessary to link the DNA sequence of the promoter for the cell surface protein gene of the coryneform bacterium 5 'upstream of the enzyme gene group. The position where the enzyme gene group and the DNA sequence of the promoter are linked is not particularly limited as long as the enzyme gene group can be expressed, but the same organism as the enzyme gene group is located between the enzyme gene group and the promoter. Desirably, the DNA sequences of the derived promoters are not linked. Furthermore, it is desirable that the DNA sequences of the enzyme gene group and the promoter are not connected without a gap but are connected at a slight interval.
また、本実施形態で使用するコリネ型細菌は以下のような特徴を有する細菌である。すなわち、元来、生分解性ポリエステル生産能を有していない。大腸菌などのグラム陰性菌と膜構造が異なり、元々内毒素を有していないグラム陽性菌である。アミノ酸発酵菌として頻用されている伝統のある細菌であり、生産物質の安全性が確立されている。細胞培養密度が大腸菌の１０倍以上であり、総合的に物質生産の生産性に有利である。全ＤＮＡ配列が解読されており、操作性のよい宿主ベクター系の開発が進展してきている。したがって、このようなコリネ型細菌の特徴を利用して、安全性の高い生分解性ポリエステルを効率的に合成している。 Further, the coryneform bacterium used in the present embodiment is a bacterium having the following characteristics. That is, it originally has no biodegradable polyester production ability. It is a Gram-positive bacterium that has a membrane structure different from that of Gram-negative bacteria such as Escherichia coli and does not originally have endotoxin. It is a traditional bacterium that is frequently used as an amino acid fermenting bacterium, and the safety of production substances has been established. The cell culture density is more than 10 times that of Escherichia coli, and it is advantageous to the productivity of substance production comprehensively. Since the entire DNA sequence has been decoded, development of a host vector system with good operability has been progressing. Therefore, a highly safe biodegradable polyester is efficiently synthesized using such characteristics of coryneform bacteria.
なお、内毒素を有しない細菌であるという特徴を有するグラム陽性菌において、例えば枯草菌なども挙げられるが、枯草菌はコリネ型細菌と異なり熱耐性の強固な胞子を形成するため、産業的な生産に用いる菌株としては適性を欠く。このような点と上述したコリネ型細菌の特徴とから、グラム陽性菌の中でもコリネ型細菌は、産業的な生産に用いるのに好適な細菌である。 In addition, in Gram-positive bacteria characterized by being bacteria that do not have endotoxin, for example, Bacillus subtilis can also be mentioned, but since Bacillus subtilis forms a heat-resistant spore unlike coryneform bacteria, it is industrial. The strain used for production lacks suitability. From these points and the characteristics of the coryneform bacterium described above, among the gram-positive bacteria, the coryneform bacterium is a bacterium suitable for use in industrial production.
本発明において、宿主細菌として使用するコリネ型細菌は、生分解性ポリエステル生産能を付与し得る上述のような特徴を有するコリネ型細菌であれば特に制限されない。コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、アグロコッカス（Agrococcus）属、アグロマイセス（Agromyces）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、オーレオバクテリウム（Aureobacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、セルロモナス（Cellulomonas）属、クラビバクター（Clavibacter）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、ラサイバクター（Rathayibacter）属、テラバクター（Terrabacter）属、ツリセラ（Turicella）属などに属する細菌が挙げられるところ、このうちコリネバクテリウム（Corynebacterium）属がより好ましい。 In the present invention, the coryneform bacterium used as the host bacterium is not particularly limited as long as it is a coryneform bacterium having the above-described characteristics that can impart biodegradable polyester-producing ability. Corynebacterium, Corynebacterium, Agrococcus, Agromyces, Arthrobacter, Aureobacterium, Brevibacterium The bacteria belonging to the genus, Cellulomonas genus, Clavibacter genus, Microbacterium genus, Rathayibacter genus, Terrabacter genus, Turicella genus, etc. Of these, the genus Corynebacterium is more preferable.
さらに、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属として、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７、コリネバクテリウム・カルナエＡＴＣＣ１５９９１、コリネバクテリウム・アセトグルタミカムＡＴＣＣ１５８０６等の菌株が挙げられる、生産能力などを考慮するとコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９、ＡＴＣＣ１３０３２、およびＡＴＣＣ１４０６７が好ましい。 Furthermore, examples of the genus Corynebacterium include Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, Corynebacterium glutamicum ATCC 13870, Corynebacterium glutamicum ATCC 14067, Corynebacterium carnae ATCC 15991, Corynebacterium -Examples include acetoglutamicum ATCC 15806 and the like. Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, ATCC 13032, and ATCC 14067 are preferable in consideration of production capacity.
そして、前記コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターとして用いるコリネ型細菌については、宿主細菌として使用する前記コリネ型細菌と同種類のものであれば特に制限されない。本発明では上記コリネ型細菌と同様にコリネバクテリウム（Corynebacterium）属が好ましく、具体的にはコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９、ＡＴＣＣ１３０３２、およびＡＴＣＣ１４０６７であることが好ましい。なお、上記プロモーターのＤＮＡ配列は、コリネ型細菌で機能する配列であれば、１つ若しくは複数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加されたＤＮＡ配列であってもよい。 The coryneform bacterium used as the promoter for the cell surface protein gene of the coryneform bacterium is not particularly limited as long as it is the same type as the coryneform bacterium used as a host bacterium. In the present invention, the genus Corynebacterium is preferable as in the case of the coryneform bacterium, and specifically, Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, ATCC 13032, and ATCC 14067 are preferable. The DNA sequence of the promoter may be a DNA sequence in which one or more bases are deleted, substituted, and / or added as long as the sequence functions in coryneform bacteria.
前記酵素遺伝子群としては、糖や油脂などのバイオマスから生分解性ポリエステルを合成できる酵素遺伝子群であれば特に限定されないが、細菌由来の酵素をコードする遺伝子であって、ＰＨＡ合成酵素遺伝子群が好ましい。 The enzyme gene group is not particularly limited as long as it is an enzyme gene group that can synthesize biodegradable polyester from biomass such as sugar and fat, but it is a gene that encodes an enzyme derived from bacteria, and the PHA synthase gene group is preferable.
これらの具体的な酵素遺伝子群としては、例えば以下の３つが挙げられる。
１）アセチルＣｏＡからアセチルＣｏＡの二量化経路によりモノマーである（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに変換後、ＰＨＢに重合する、β−ケトチオラーゼ（ＰｈｂＡ）とＮＡＤＰＨ依存性アセトアセチルＣｏＡ還元酵素（ＰｈｂＢ）とＰＨＢ重合酵素（ＰｈｂＣ）の酵素遺伝子群。
２）脂肪酸β酸化系の中間体であるエノイルＣｏＡからモノマーである（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡに変換後、ＰＨＡに重合する、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラーゼとＰＨＡ重合酵素の酵素遺伝子群。
３）ｄｅ ｎｏｖｏ脂肪酸生合成系の中間体である（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカン酸−アシル・キャリア・タンパク質からモノマーである（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡに変換後、ＰＨＡに重合する、アシルトランスフェラーゼとＰＨＡ重合酵素の酵素遺伝子群。
Examples of these specific enzyme gene groups include the following three.
1) β-ketothiolase (PhbA) and NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase polymerized to PHB after conversion from acetyl-CoA to monomer (R) -3-hydroxybutyryl-CoA through the dimerization pathway of acetyl-CoA PhbB) and PHB synthase (PhbC) enzyme gene group.
2) Enzyme genes of R-form-specific enoyl CoA hydrolase and PHA synthase that polymerize to PHA after conversion from enoyl CoA which is an intermediate of fatty acid β-oxidation system to monomer (R) -3-hydroxyacyl CoA .
3) (R) -3-hydroxyalkanoic acid-acyl carrier protein, which is an intermediate of de novo fatty acid biosynthesis system, is converted to monomer (R) -3-hydroxyacyl CoA and then polymerized to PHA. Enzyme genes of acyltransferase and PHA synthase.
これらは、ＰＨＡのモノマーである（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡをつくるモノマー供給酵素と、次いでモノマーを重合してＰＨＡを合成するＰＨＡ重合酵素で構成されている。また、１）および３）の遺伝子群については後述する実施例により適用可能であることが明らかであるし、２）の遺伝子群についても、この経路に関与することで知られている「エノイルＣｏＡヒドラターゼ」の遺伝子の導入株で油脂からＰＨＡが生産できる過去の例からも本実施形態として適用可能であることがわかる。 These are composed of a monomer supply enzyme that produces (R) -3-hydroxyacyl CoA, which is a monomer of PHA, and then a PHA synthase that polymerizes the monomer to synthesize PHA. Further, it is clear that the gene groups of 1) and 3) can be applied according to the examples described later, and the gene group of 2) is also known as “enoyl CoA, which is known to be involved in this pathway. It can be seen that the present embodiment can also be applied to past examples in which PHA can be produced from fats and oils by introducing a hydratase gene introduction strain.
これらの酵素遺伝子群のうち、本実施形態では、遺伝子配列が明確な点やオペロンを形成している点、扱いやすさの点等に鑑みて、ＰｈｂＡとＰｈｂＢとＰｈｂＣとから構成される酵素遺伝子群を使用している。 Among these enzyme gene groups, in the present embodiment, an enzyme gene composed of PhbA, PhbB, and PhbC in view of the point that the gene sequence is clear, the operon is formed, the ease of handling, etc. Using a group.
ここで、ＰＨＢの生合成経路におけるアセチルＣｏＡから、アセチルＣｏＡ二量化経路によりＰＨＢを合成する経路について説明する。まず、２分子のアセチルＣｏＡが、ＰｈｂＡの作用によって縮合され、アセトアセチルＣｏＡとなる。続いてＮＡＤＰＨの還元力を利用してＰｈｂＢの作用により、モノマーである（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへと変換される。最後に、ＰｈｂＣが（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを重合してＰＨＢが合成される。 Here, the pathway for synthesizing PHB from the acetyl CoA in the biosynthesis pathway of PHB through the acetyl CoA dimerization pathway will be described. First, two molecules of acetyl CoA are condensed by the action of PhbA to become acetoacetyl CoA. Subsequently, it is converted into monomer (R) -3-hydroxybutyryl CoA by the action of PhbB using the reducing power of NADPH. Finally, PhbC polymerizes (R) -3-hydroxybutyryl CoA to synthesize PHB.
これら３つの生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子は、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）などでは、ＰｈｂＡ遺伝子−ＰｈｂＢ遺伝子−ＰｈｂＣ遺伝子から構成されるオペロンｐｈｂＣＡＢを形成しているが、ＰＨＡを生産する細菌によって遺伝子構成は様々である。そのため、前記３つの生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子がオペロンを形成していない場合には、遺伝子組換え技術により、人工的に３種類の生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子のオペロンを形成して使用することが好ましい。これは、形質転換効率を高めることを目的としたプラスミドの最小化、および１つのプロモーターから当該３種類の生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子を時期同調的に効率よく転写させる目的のためである。 These three biodegradable polyester synthase genes form an operon phbCAB composed of a PhbA gene-PhbB gene-PhbC gene in Ralstonia eutropha, etc., but the gene is produced by a bacterium that produces PHA. There are various configurations. Therefore, when the three biodegradable polyester synthase genes do not form an operon, the operons of three types of biodegradable polyester synthase genes are artificially formed and used by gene recombination technology. It is preferable. This is for the purpose of minimizing the plasmid for the purpose of enhancing transformation efficiency and efficiently transferring the three types of biodegradable polyester synthase genes from one promoter in a timely manner.
また、本発明の酵素遺伝子群の由来微生物としては、本発明における効果を奏すれば、特に限定されないが、例えば、ラルストニア（Ralstonia）属、シュードモーナス（Pseudomonas）属、バチルス（Bacillus）属、アロクロマチウム（Allochromatium）属、シネコシスチス（Synechocystis）属、アエロモナス（Aeromonas）属等が挙げられる。好ましくは、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、シュードモーナスsp．（Pseudomonas sp．）、およびバチルスsp．（Bacillus sp．）が挙げられ、具体例としては、ラルストニア・ユートロファＨ１６株およびシュードモーナス６１−３株、バチルスＩＮＴ００５株であることが望ましい。なお、ラルストニア・ユートロファは、現在のWautersiaを指す。 In addition, the microorganism derived from the enzyme gene group of the present invention is not particularly limited as long as the effect in the present invention is achieved. For example, the genus Ralstonia, the genus Pseudomonas, the genus Bacillus, Examples include the genus Allochromatium, the genus Synechocystis and the genus Aeromonas. Preferably, Ralstonia eutropha, Pseudomonas sp. (Pseudomonas sp.), And Bacillus sp. (Bacillus sp.), And specific examples are Ralstonia eutropha H16 strain, Pseudomonas 61-3 strain, and Bacillus INT005 strain. Ralstonia Eutropha refers to the current Wautersia.
本発明の酵素遺伝子群のＰｈｂＣ遺伝子として、ＰｈｂＣ遺伝子に変異を加えた変異ＰｈｂＣ遺伝子を使用することもできる。変異ＰｈｂＣ遺伝子としては、前記変異ＰｈｂＣ遺伝子を構成遺伝子とした酵素遺伝子群をコリネ型細菌に導入した際に発現可能であれば特に限定されないが、シュードモーナスｓｐ．由来の変異ＰｈｂＣ１である遺伝子ＥＤ／ＱＭ、ラルストニア・ユートロファ由来の変異ＰｈｂＣであるＧ４Ｄ、ラルストニア・ユートロファ由来の変異ＰｈｂＣであるＰｈｂＣ’が望ましい。シュードモーナス属由来のＰｈｂＣはＰｈｂＣ１およびＰｈｂＣ２が存在し、どちらを用いてもよいがＰｈｂＣ１がより好ましい。これら変異ＰｈｂＣ遺伝子は、後述する実施例により適用可能であることが明らかであり、変異を加えていないＰｈｂＣよりもＰＨＢの生産量が多くなることが示されているためである。 As the PhbC gene of the enzyme gene group of the present invention, a mutated PhbC gene obtained by adding a mutation to the PhbC gene can also be used. The mutant PhbC gene is not particularly limited as long as it can be expressed when an enzyme gene group comprising the mutant PhbC gene as a constitutive gene is introduced into a coryneform bacterium, but Pseudomonas sp. The gene ED / QM that is the derived mutation PhbC1, G4D that is the mutant PhbC derived from Ralstonia utropha, and PhbC 'that is the mutant PhbC derived from Ralstonia utropha are desirable. PhbC1 derived from Pseudomonas genus includes PhbC1 and PhbC2, and either may be used, but PhbC1 is more preferable. It is clear that these mutant PhbC genes can be applied in the examples described later, and it is shown that the production amount of PHB is higher than that of PhbC without mutation.
なお、ＥＤ／ＱＭとは、ＰｈｂＣ１遺伝子の１３０番目のグルタミン酸（Ｅ）がアスパラギン酸（Ｄ）に、４８１番目のグルタミン（Ｑ）がメチオニン（Ｍ）にアミノ酸置換した変異ＰｈｂＣ遺伝子である。Ｇ４Ｄとは、ＰｈｂＣのＮ末端４番目のグリシン（Ｇ）がアスパラギン酸（Ｄ）にアミノ酸置換した変異ＰｈｂＣ遺伝子である。ＰｈｂＣ’とは、ＰｈｂＣのコドンユーセージをコリネ型細菌用に最適化したものである。 In addition, ED / QM is a mutant PhbC gene in which the 130th glutamic acid (E) of the PhbC1 gene is amino acid substituted for aspartic acid (D) and the 481st glutamic acid (Q) is substituted for methionine (M). G4D is a mutated PhbC gene in which the N-terminal fourth glycine (G) of PhbC is amino acid substituted for aspartic acid (D). PhbC 'is an optimized version of the codon usage of PhbC for coryneform bacteria.
次に、本発明においてコリネ型細菌に導入されるプラスミドベクターの構築例を以下に示す。 Next, construction examples of plasmid vectors introduced into coryneform bacteria in the present invention are shown below.
酵素遺伝子群は、例えばラルストニア・ユートロファＨ１６株由来のｐｈｂＣＡＢを用いることができる。同遺伝子群の塩基配列を配列番号１に示し、同遺伝子中のβ−ケトチオラーゼ（ＰｈｂＡ）遺伝子、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素（ＰｈｂＢ）遺伝子、ＰＨＢ重合酵素（ＰｈｂＣ）遺伝子にコードされるアミノ酸配列を配列番号２から配列番号４に示す。 As the enzyme gene group, for example, phbCAB derived from Ralstonia eutropha H16 strain can be used. The base sequence of the same gene group is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequences encoded by the β-ketothiolase (PhbA) gene, acetoacetyl CoA reductase (PhbB) gene, and PHB polymerase (PhbC) gene in the same gene are sequenced. No. 2 to SEQ ID No. 4.
宿主のコリネ型細菌としては、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９、ＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１４０６７を使用することができ、プロモーターは宿主と同一であることが好ましいため、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９またはＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１４０６７の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターを用いることが望ましい。 As the host coryneform bacterium, for example, Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, ATCC 13032, ATCC 14067 can be used, and the promoter is preferably the same as that of the host. It is desirable to use a promoter for the surface protein gene.
そして、前記ラルストニア・ユートロファＨ１６株由来のｐｈｂＣＡＢの５’上流にコリネバクテリウム・グルタミカムの細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターを連結する。 Then, a promoter for the cell surface protein gene of Corynebacterium glutamicum is linked 5 'upstream of the phbCAB derived from the Ralstonia eutropha H16 strain.
構築に使用するベクターは、コリネ型細菌において自立増殖するプラスミドであれば特に制限されないが、大腸菌においても自立増殖可能なベクターが好ましい。この点から、コリネ型細菌と大腸菌との間で複製可能なシャトルベクターであるｐＰＳＰＴＧ１、ｐＶＣ７［Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，69，358-366（2003）］を用いることができる。 The vector used for the construction is not particularly limited as long as it is a plasmid that grows independently in coryneform bacteria, but a vector that can also grow independently in Escherichia coli is preferable. From this point, pPSPTG1 and pVC7 [Kikuchi, Y., which are shuttle vectors capable of replicating between coryneform bacteria and Escherichia coli. et al. : Appl. Environ. Microbiol. 69, 358-366 (2003)].
前記プロモーターが前記酵素遺伝子群ｐｈｂＣＡＢの５’上流に配置されるように、プロモーターを含むｐＰＳＰＴＧ１またはｐＶＣ７に酵素遺伝子群を連結・挿入して、当該プロモーターによってｐｈｂＣＡＢ遺伝子を発現する発現プラスミドベクターｐＰＳ−ＣＡＢまたはｐＶＣ７−ＣＡＢを構築することができる。 An expression plasmid vector pPS-CAB for expressing the phbCAB gene with the promoter by ligating and inserting the enzyme gene group into pPSPTG1 or pVC7 containing the promoter so that the promoter is located 5 ′ upstream of the enzyme gene group phbCAB. Alternatively, pVC7-CAB can be constructed.
このとき、酵素遺伝子群とプロモーターの遺伝子配列を直接連続して連結せずに、間に遺伝子の翻訳過程に好適な配列を含むように連結挿入する。 At this time, the enzyme gene group and the gene sequence of the promoter are not directly connected continuously, but are inserted so as to include a sequence suitable for the gene translation process.
さらに、酵素遺伝子群とプロモーターの遺伝子配列の間に前記ラルストニア・ユートロファＨ１６株由来のプロモーターを挟まないように連結挿入する。 Further, the promoter derived from the Ralstonia eutropha H16 strain is ligated and inserted between the enzyme gene group and the gene sequence of the promoter.
以上の方法により、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９またはＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１４０６７において、ＰＨＢを合成可能なプラスミドベクターを構築できる。 By the above method, a plasmid vector capable of synthesizing PHB can be constructed in Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, ATCC 13032, and ATCC 14067.
構築した上記プラスミドベクターをコリネ型細菌に導入する方法は、公知の方法により行うことができ、例えばエレクトロポレーション法やカルシウム法等を用いることができる。これにより、ＰＨＢ生産能を付与されるように形質転換された組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９またはＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１４０６７が得られる。 A method for introducing the constructed plasmid vector into a coryneform bacterium can be performed by a known method, for example, an electroporation method, a calcium method, or the like. As a result, recombinant Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 or ATCC 13032 and ATCC 14067 transformed so as to be imparted with the ability to produce PHB can be obtained.
なお、後述する実施例から明らかなように、上記プラスミドベクターｐＰＳ−ＣＡＢ、ｐＶＣ７−ＣＡＢは、各々一つをコリネ型細菌に導入しても良いし、ｐＰＳ−ＣＡＢとｐＶＣ７−ＣＡＢの２つをコリネ型細菌に導入してもよい。 As is clear from the examples described later, one of the plasmid vectors pPS-CAB and pVC7-CAB may be introduced into a coryneform bacterium, or two of pPS-CAB and pVC7-CAB may be introduced. It may be introduced into coryneform bacteria.
また、本発明における生分解性ポリエステルの製造方法は、上記組換えコリネ型細菌を所定の培養条件にて培養して得られる培養物から生分解性ポリエステルを採取する方法である。 The method for producing a biodegradable polyester according to the present invention is a method for collecting biodegradable polyester from a culture obtained by culturing the above recombinant coryneform bacterium under a predetermined culture condition.
所定の培養条件として、培地組成、培養温度およびｐＨは、組換えコリネ型細菌が生育でき、生分解ポリエステルを生産できる条件であれば特に限定されないが、酵素遺伝子群としてラルストニア・ユートロファＨ１６株由来またはシュードモーナスｓｐ．６１−３株、バチルスｓｐ．ＩＮＴ００５株を用い、宿主および細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターのコリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９またはＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１４０６７であって、当該プロモーターが酵素遺伝子群の上流に機能可能に配置されている場合には、次のような培養条件が好ましい。 As predetermined culture conditions, medium composition, culture temperature and pH are not particularly limited as long as recombinant coryneform bacteria can grow and biodegradable polyester can be produced, but the enzyme gene group is derived from Ralstonia eutropha H16 strain or Pseudomonas sp. 61-3 strain, Bacillus sp. When the INT005 strain is used and the host and cell surface protein gene promoter coryneform bacterium is Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 or ATCC 13032, ATCC 14067, and the promoter is operably arranged upstream of the enzyme gene group The following culture conditions are preferable.
培養温度としては、２７℃〜３７℃が好ましく、特に３０℃が好ましい。培養ｐＨとしては、７〜８の条件下で培養するのが好ましく、特に７．５が好ましい。 As culture | cultivation temperature, 27 to 37 degreeC is preferable, and 30 degreeC is especially preferable. The culture pH is preferably 7 to 8 and particularly preferably 7.5.
一方、培地組成としては、例えば、炭素源としてグルコースおよび窒素源として硫酸アンモニウムを用いることができる。より具体的には、少なくともグルコース、硫酸アンモニウム、およびビオチンを含んでおり、前記グルコースが前記硫酸アンモニウムよりも２倍以上高く、また、前記ビオチン濃度が３〜４５０μｇ／Ｌの組成であることが好ましく、より好ましくは前記ビオチン濃度が１０〜３０μｇ／Ｌである。 On the other hand, as the medium composition, for example, glucose as a carbon source and ammonium sulfate as a nitrogen source can be used. More specifically, it preferably contains at least glucose, ammonium sulfate, and biotin, the glucose is more than twice as high as the ammonium sulfate, and the biotin concentration is preferably 3 to 450 μg / L. The biotin concentration is preferably 10 to 30 μg / L.
さらに、前記組換えコリネ型細菌をビオチンが含まれない培地で培養後、ビオチンおよびグルコースを追加した培地で培養する２段階培養方法を用いてもよい。このビオチン濃度の異なる２段階培養方法では、前記組換えコリネ型細菌は、ビオチンが含まれない培地での培養によりグルタミン酸を生産し、その後ビオチンおよびグルコースを追加した培地での培養により生分解性ポリエステルを生産することができる。 Further, a two-stage culture method may be used in which the recombinant coryneform bacterium is cultured in a medium not containing biotin and then cultured in a medium supplemented with biotin and glucose. In this two-stage culture method with different biotin concentrations, the recombinant coryneform bacterium produces glutamic acid by culturing in a medium not containing biotin, and then biodegradable polyester by culturing in a medium supplemented with biotin and glucose. Can be produced.
ｐＨ、攪拌速度、温度等を制御できる発酵槽（Jar fermentor）を用いて前記組換えコリネ型細菌を培養し、生分解性ポリエステルを生産させてもよい。 The recombinant coryneform bacterium may be cultured using a fermentor (Jar fermentor) capable of controlling pH, stirring speed, temperature, etc. to produce a biodegradable polyester.
そして、組換えコリネ型細菌から生産された生分解性ポリエステルの回収方法は、特に限定されず、公知の溶媒抽出法、物理的破砕法、化学的処理などが挙げられる。例えばクロロホルム等の有機溶媒に溶解後、エタノールにて再沈殿する定法により抽出・精製することができる。 And the collection | recovery method of biodegradable polyester produced from recombinant coryneform bacterium is not specifically limited, A well-known solvent extraction method, a physical crushing method, a chemical process etc. are mentioned. For example, it can be extracted and purified by a conventional method in which it is dissolved in an organic solvent such as chloroform and then reprecipitated with ethanol.
また、細胞内に合成された生分解性ポリエステルの定量は、例えば、乾燥菌体を濃硫酸によりクロトン酸に変換（脱離反応）後、１０倍量の０．０１４Ｎ硫酸を加え、得られたサンプルを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供試し他成分と分離させ、２１０ｎｍでの吸収を分光学的に検出する方法等によって行うことができる［Ｋａｒｒ，Ｄ．Ｂ．ｅｔ ａｌ：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，46，1339-1344（1983）］。 In addition, quantification of the biodegradable polyester synthesized in the cells was obtained by, for example, converting dry cells to crotonic acid with concentrated sulfuric acid (elimination reaction) and then adding 10 times the amount of 0.014N sulfuric acid. The sample can be subjected to high performance liquid chromatography (HPLC), separated from other components, and the absorption at 210 nm can be detected spectroscopically [Karr, D. et al. B. et al: Appl. Environ. Microbiol. 46, 1339-1344 (1983)].
細胞内のＰＨＢ重合酵素の活性測定は、得られる培養物を遠心して回収し、超音波処理にて細胞を破砕後、モノマーである基質（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからＰＨＢへの重合反応時に遊離するＣｏＡを４１２ｎｍの波長にて定量する方法等により測定できる。［Ｓａｔｏｈ，Ｙ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，95，335-341（2003）］ Intracellular PHB polymerization enzyme activity was measured by centrifuging and recovering the resulting culture, sonicating the cells, and then polymerizing the monomer substrate (R) -3-hydroxybutyryl CoA to PHB. CoA released during the reaction can be measured by a method of quantifying it at a wavelength of 412 nm. [Satoh, Y .; , J .; Biosci. Bioeng. , 95, 335-341 (2003)]
そして、生分解性ポリエステルの組成は、細胞からクロロホルム等の有機溶媒を用いて抽出後、抽出物をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）などに供試することで測定・分析することができる。 The composition of the biodegradable polyester is measured and analyzed by extracting the cells from cells using an organic solvent such as chloroform and then subjecting the extract to gas chromatography (GC), nuclear magnetic resonance (NMR), etc. can do.
生分解性ポリエステルの分子量は、ゲルパミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）、などを用いて測定することができる。また、細胞内での生分解性ポリエステルの合成の有無は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）などにより直接的に観察することができる。 The molecular weight of the biodegradable polyester can be measured using gel permeation chromatography (GPC) or the like. Moreover, the presence or absence of the synthesis | combination of biodegradable polyester in a cell can be directly observed with a transmission electron microscope (TEM).
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
『生分解性ポリエステル生産能を有するコリネ型細菌の作製のためのプロモーター検討』 “Examination of promoters for the production of coryneform bacteria capable of producing biodegradable polyester”
グラム陽性菌であるコリネ型細菌でグラム陰性菌由来ＰＨＢ合成遺伝子群を発現させ、ＰＨＢを合成させるために、５’上流にプロモーターを連結し、３’下流にターミネーターを連結し、プロモーターのパターンの異なる３種類のプラスミドベクターを下記の手順で構築した。構築した３種類のプラスミドベクターの遺伝子コンストラクトを図２に示す。 In order to express a gram-negative bacterium-derived PHB synthetic gene group in a coryneform bacterium that is a gram-positive bacterium and synthesize PHB, a promoter is connected 5 ′ upstream, a terminator is connected 3 ′ downstream, Three different plasmid vectors were constructed according to the following procedure. FIG. 2 shows the gene constructs of the three types of plasmid vectors constructed.
プロモーターは、ラルストニア・ユートロファＨ１６株由来のｐｈｂＣＡＢプロモーター（Ｐｐｈｂ）を用いた場合、Ｐｐｈｂとコリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーター（Ｐｃｓｐ）とを用いた場合、そしてＰｃｓｐを用いた場合の３パターンである。 Three types of promoters are used when the phbCAB promoter (Pphb) derived from Ralstonia eutropha H16 strain is used, when Pphb and a promoter for cell surface protein genes of coryneform bacteria (Pcsp) are used, and when Pcsp is used. It is.
「プロモーターにＰｐｈｂを用いた場合」
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーター（Ｐｃｓｐ）を含むｐＰＳＰＴＧ１プラスミド［Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，69，358-366（2003）］をＫｐｎＩで制限酵素処理し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化させた後、ＢａｍＨＩで制限酵素処理したベクターの部分をゲル抽出方法で得た。このベクターに、ラルストニア・ユートロファＨ１６株由来のプロモーター（Ｐｐｈｂ）とｐｈｂＣＡＢ、ターミネーター（Ｔｐｈｂ）を含むｐＧＥＭ−ＣＡＢ［Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｌｏ．Ｌｅｔｔ．，198，65-71（2001）］プラスミドをＳｍａＩとＢａｍＨＩで制限酵素処理して得られた、プロモーターＰｐｈｂ・ｐｈｂＣＡＢ・ターミネーターＴｐｈｂを含む約５．０ｋｂの遺伝子断片を挿入・連結した。これにより、プロモーターＰｐｈｂによってｐｈｂＣＡＢ遺伝子を発現する発現プラスミドベクターｐＰＧＥＭ−ＣＡＢを構築した（図２（Ａ））。
“When Pphb is used as the promoter”
PPSPTG1 plasmid [Kikuchi, Y. et al., Containing a promoter (Pcsp) for cell surface protein gene derived from Corynebacterium glutamicum ATCC 13869. et al. : Appl. Environ. Microbiol. , 69, 358-366 (2003)] was subjected to restriction enzyme treatment with KpnI, blunt-ended with T4 DNA polymerase, and then subjected to restriction enzyme treatment with BamHI to obtain a portion of the vector by a gel extraction method. In this vector, pGEM-CAB [Taguchi, S., which contains a promoter (Pphb) derived from Ralstonia eutropha H16 strain, phbCAB, and terminator (Tphb). et al, FEMS Microbilo. Lett. , 198, 65-71 (2001)] A gene fragment of about 5.0 kb containing a promoter Pphb, phbCAB and terminator Tphb obtained by restriction enzyme treatment of the plasmid with SmaI and BamHI was inserted and ligated. Thereby, an expression plasmid vector pPGEM-CAB expressing the phbCAB gene with the promoter Pphb was constructed (FIG. 2A).
「プロモーターにＰｐｈｂとＰｃｓｐを用いた場合」
ｐＰＳＰＴＧ１プラスミドをＢｓｔＥＩＩで制限酵素処理し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化させた後、ＢａｍＨＩで制限酵素処理したベクターの部分をゲル抽出方法で得た。このベクターに、ｐＧＥＭ−ＣＡＢプラスミドをＳｍａＩとＢａｍＨＩで制限酵素処理して得られた、プロモーターＰｐｈｂ・ｐｈｂＣＡＢ・ターミネーターＴｐｈｂを含む約５．０ｋｂの遺伝子断片を挿入・連結した。これにより、プロモーターＰｐｈｂとＰｃｓｐによってｐｈｂＣＡＢ遺伝子を発現する発現プラスミドベクターｐＰＳＧＥＭ−ＣＡＢを構築した（図２（Ｂ））。
“When Pphb and Pcsp are used as promoters”
The pPSPTG1 plasmid was subjected to restriction enzyme treatment with BstEII, blunt-ended with T4 DNA polymerase, and then a portion of the vector treated with BamHI restriction enzyme was obtained by a gel extraction method. To this vector, a gene fragment of about 5.0 kb containing promoter Pphb, phbCAB and terminator Tphb obtained by restriction enzyme treatment of pGEM-CAB plasmid with SmaI and BamHI was inserted and ligated. Thereby, an expression plasmid vector pPSGEM-CAB expressing the phbCAB gene with the promoters Pphb and Pcsp was constructed (FIG. 2B).
「プロモーターにＰｃｓｐを用いた場合」
ｐＰＳＰＴＧ１プラスミドとｐＧＥＭ−ＣＡＢプラスミドを各々ＢｓｔＥＩＩとＣｓｐ４５Ｉで制限酵素処理し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化させた後、ＢａｍＨＩで制限酵素処理した。これらをゲル抽出方法にて、ベクター部分とｐｈｂＣＡＢ・ターミネーターＴｐｈｂを含む４．３ｋｂの遺伝子断片を得て連結反応させた。これにより、プロモーターＰｃｓｐによってｐｈｂＣＡＢ遺伝子を発現する発現プラスミドベクターｐＰＳ−ＣＡＢを構築した（図２（Ｃ））。
“When Pcsp is used as the promoter”
The pPSPTTG1 plasmid and the pGEM-CAB plasmid were treated with restriction enzymes BstEII and Csp45I, blunt-ended with T4 DNA polymerase, and then treated with BamHI. Using a gel extraction method, a 4.3 kb gene fragment containing the vector portion and phbCAB / terminator Tphb was obtained and ligated. Thus, an expression plasmid vector pPS-CAB expressing the phbCAB gene with the promoter Pcsp was constructed (FIG. 2C).
得られた３種類のプラスミドベクターｐＰＧＥＭ−ＣＡＢ、ｐＰＳＧＥＭ−ＣＡＢ、ｐＰＳ−ＣＡＢ各々をエレクトロポレーションによりコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９［Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，69，358-366（2003）］に導入し、形質転換された組換えコリネ型細菌を得た。 Each of the three types of plasmid vectors pPGEM-CAB, pPSGEM-CAB, and pPS-CAB obtained was electroporated by Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 [Kikuchi, Y. et al. et al. : Appl. Environ. Microbiol. , 69, 358-366 (2003)], and transformed recombinant coryneform bacteria were obtained.
得られた３種類の組換えコリネ型細菌を、ＭＭＴＧ培地中［Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，69，358-366（2003）］において、培養温度３０℃、ｐＨ７．５で７２時間培養した後、ＰＨＢの含量を測定した。 The obtained three types of recombinant coryneform bacteria were cultured in MMTG medium [Kikuchi, Y. et al. et al. : Appl. Environ. Microbiol. , 69, 358-366 (2003)], the PHB content was measured after culturing for 72 hours at 30 ° C. and pH 7.5.
菌体内に蓄積されたＰＨＢの定量は、乾燥菌体を濃硫酸によりクロトン酸に変換後、１０倍量の０．０１４Ｎ硫酸を加え、得られたサンプルをＨＰＬＣに供し、２１０ｎｍの波長にて定量した［Ｋａｒｒ，Ｄ．Ｂ． ｅｔ ａｌ：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，46，1339-1344（1983）］。 The PHB accumulated in the cells was quantified by converting the dried cells into crotonic acid with concentrated sulfuric acid, adding 10 times the amount of 0.014N sulfuric acid, and subjecting the obtained sample to HPLC, and quantifying at a wavelength of 210 nm. [Karr, D. et al. B. et al: Appl. Environ. Microbiol. 46, 1339-1344 (1983)].
つまり、菌体にＴＥ緩衝液を加えて懸濁し、遠心分離により菌体を回収し、−８０℃で２時間凍結後に２日間真空乾燥して乾燥菌体の重量を測定した。得られた乾燥菌体に硫酸1 ｍＬを加え、１２０℃のヒートブロックで４０分間加熱してクロトン酸に変換した後、氷中にて急冷した。その後、４ｍｌの０．０１４Ｎ硫酸溶液を撹拌、冷却しながらゆっくり加えた。得られたサンプルは孔経０．４５μｍのＰＴＦＥ膜［Ａｄｖａｎｃｅ Ｍｆｓ．Ｉｎｃ，Ｔｏｋｙｏ］に通し、ＨＰＬＣに供し、クロトン酸を吸光度２１０ｎｍにて測定した。カラムは、アミネックスＨＰＸ−８７Ｈイオンカラム［７．８ｍｍＩ．Ｄ．ｘ３００ｍｍ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ］を６０℃で使用し、移動相は０．０１４Nの硫酸溶液を用い、流速は０．７ｍｌ／分で行った。ＰＨＢの蓄積率は、ＨＰＬＣで得られたクロトン酸量と面積の関係式（検量線）を基に、純正のポリ３−ヒドロキシブタン酸からクロトン酸への変換効率５０％を用いて算出した。 That is, a TE buffer solution was added to the cells to suspend them, and the cells were collected by centrifugation, frozen at −80 ° C. for 2 hours and then vacuum-dried for 2 days to measure the weight of the dried cells. 1 mL of sulfuric acid was added to the obtained dried cells, heated in a heat block at 120 ° C. for 40 minutes for conversion to crotonic acid, and then rapidly cooled in ice. Thereafter, 4 ml of 0.014N sulfuric acid solution was slowly added while stirring and cooling. The obtained sample was a PTFE membrane having a pore diameter of 0.45 μm [Advanced Mfs. Inc., Tokyo] and subjected to HPLC, and crotonic acid was measured at an absorbance of 210 nm. The column was an Aminex HPX-87H ion column [7.8 mmI. D. x300 mm; Bio-Rad Lab. , California] at 60 ° C., 0.014 N sulfuric acid solution was used as the mobile phase, and the flow rate was 0.7 ml / min. The PHB accumulation rate was calculated using a conversion efficiency of 50% from pure poly-3-hydroxybutanoic acid to crotonic acid based on the relational expression (calibration curve) between the amount of crotonic acid and area obtained by HPLC.
その結果、プラスミドベクターｐＰＧＥＭ−ＣＡＢ、ｐＰＳＧＥＭ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌では、ＰＨＢが生産されず、プラスミドベクターｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌のみＰＨＢの生産が確認された。 As a result, PHB was not produced in recombinant coryneform bacteria having plasmid vectors pPGEM-CAB and pPSGEM-CAB, and only PHB production was confirmed in recombinant coryneform bacteria having plasmid vector pPS-CAB.
さらに、上記組換えコリネ型細菌について、ｐｈｂＣＡＢのＰＨＢ重合酵素（ＰｈｂＣ）を測定したところ、プラスミドｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌のみ活性が検出された。 Furthermore, when the PHB synthase (PhbC) of phbCAB was measured for the above recombinant coryneform bacterium, only the activity of the recombinant coryneform bacterium carrying the plasmid pPS-CAB was detected.
総菌体抽出物のＰＨＢ重合酵素の活性測定は、モノマーである基質（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからＰＨＢへの酵素反応時に遊離するＣｏＡを４１２ｎｍの波長にて定量した［Ｓａｔｏｈ，Ｙ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，95，335-341（2003）］。 The activity of the PHB polymerizing enzyme in the total cell extract was determined by quantifying CoA released during the enzymatic reaction from the monomer substrate (R) -3-hydroxybutyryl CoA to PHB at a wavelength of 412 nm [Satoh, Y . , J .; Biosci. Bioeng. , 95, 335-341 (2003)].
つまり、まず上記組換えコリネ型細菌を３０℃で７２時間培養した。その後、１４，０００ｘｇで２分間遠心し、氷上で４秒間、１５回の超音波破砕により菌体を破壊後、１４，０００ｘｇで２分間遠心して、総菌体抽出物を得た。次に、４．０８ｍＭの（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを含む１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を２５℃で１０分間予熱後、前記総菌体抽出物を添加して酵素反応を開始した。経時的に２０μＬずつサンプリングし、得られたサンプリング液に５％のＴＣＡを５０μＬ加えて撹拌し酵素反応を停止させた。４℃、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心して得られた上清６２．５μＬに、５００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を３３７．５μＬと１０ｍＭのＤＴＮＢ溶液を５μL添加し、２分以上室温に放置した。その後、生成したＴＮＢアニオンを吸光度４１２ｎｍ（モル吸光係数１３６００）にて測定した。反応１分間当たり１μｍｏｌのＴＮＢアニオンが生成する酵素量を１Ｕ（ユニット）とした。 That is, the recombinant coryneform bacterium was first cultured at 30 ° C. for 72 hours. Thereafter, the cells were centrifuged at 14,000 × g for 2 minutes, disrupted by sonication 15 times for 4 seconds on ice, and then centrifuged at 14,000 × g for 2 minutes to obtain a total cell extract. Next, 1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 4.08 mM (R) -3-hydroxybutyryl CoA was preheated at 25 ° C. for 10 minutes, and then the total cell extract was added. Enzymatic reaction was started. 20 μL was sampled over time, and 50 μL of 5% TCA was added to the obtained sampling solution and stirred to stop the enzyme reaction. To 62.5 μL of the supernatant obtained by centrifugation at 15,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., 337.5 μL of 500 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) and 5 μL of 10 mM DTNB solution were added for 2 minutes or more. Left at room temperature. Thereafter, the produced TNB anion was measured at an absorbance of 412 nm (molar extinction coefficient 13600). The amount of enzyme produced by 1 μmol of TNB anion per minute per reaction was defined as 1 U (unit).
以上の結果から、組換えコリネ型細菌でｐｈｂＣＡＢの遺伝子発現には、ｐｈｂＣＡＢのプロモーター（Ｐｐｈｂ）は機能せず、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質の遺伝子プロモーター（Ｐｃｓｐ）が機能することが明らかとなった。また、このｐｈｂＣＡＢの生産能を付与された組換えコリネ型細菌は、ＰｈｂＣ活性が認められ、ｐｈｂＣＡＢはオペロンを形成していることからモノマーを供給する酵素ＰｈｂＡおよびＰｈｂＢも機能的に発現していることが示唆された。 From the above results, it is clear that the phbCAB promoter (Pphb) does not function and the coryneform bacterium cell surface protein gene promoter (Pcsp) functions in phbCAB gene expression in recombinant coryneform bacteria. It was. In addition, the recombinant coryneform bacterium imparted with the ability to produce phbCAB has PhbC activity, and since phbCAB forms an operon, the enzymes PhbA and PhbB that supply monomers are also functionally expressed. It has been suggested.
『菌種の異なるコリネ型細菌での検討』 “Studies on coryneform bacteria of different species”
宿主細菌であるコリネ型細菌において、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９だけでなく、異なる種類でもＰＨＢを合成できるか検討を行った。 In the coryneform bacterium which is a host bacterium, it was examined whether PHB can be synthesized not only by Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 but also by different types.
実験方法は、プラスミドベクターｐＰＳ−ＣＡＢをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９およびＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１４０６７にエレクトロポレーション法によりそれぞれ導入し、形質転換された３種類の組換えコリネ型細菌を得た。得られた３種類の組換えコリネ型細菌を、ＭＭＴＧ培地中において、培養温度３０℃、ｐＨ７．５で７２時間培養した後、ＰＨＢの含量を測定した。 In the experimental method, plasmid vector pPS-CAB was introduced into Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, ATCC 13032, and ATCC 14067, respectively, by electroporation to obtain three types of transformed recombinant coryneform bacteria. The obtained three types of recombinant coryneform bacteria were cultured in MMTG medium for 72 hours at a culture temperature of 30 ° C. and pH 7.5, and then the PHB content was measured.
その結果、組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９のみならず菌種の異なる組換えコリネ型細菌ＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１４０６７を宿主細菌としてもＰＨＢを合成することができた。宿主細菌の違いによりＰＨＢの蓄積量および生産量は違う値を示し、組換えコリネ型細菌ＡＴＣＣ１４０６７が最も高い値を示した（図３Ａ，図３Ｂ）。 As a result, it was possible to synthesize PHB using not only recombinant Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 but also recombinant coryneform bacteria ATCC 13032 and ATCC 14067 of different bacterial species as host bacteria. The accumulated amount and production amount of PHB differed depending on the host bacteria, and the recombinant coryneform bacterium ATCC14067 showed the highest value (FIGS. 3A and 3B).
『他菌種由来の酵素遺伝子群を用いた検討』 “Examination using enzyme genes derived from other species”
ラルストニア属由来だけでなく、他菌種由来酵素遺伝子群をコリネ型細菌に導入してもＰＨＢを合成できるか検討を行った。 It was examined whether PHB could be synthesized not only by the genus Ralstonia but also by introducing an enzyme gene group derived from other bacterial species into coryneform bacteria.
酵素遺伝子群は、モノマー供給酵素とモノマーを重合させてＰＨＢを合成するＰＨＢ重合酵素とから構成されており、本実施例ではモノマー供給酵素およびＰＨＢ重合酵素のそれぞれについて、ラルストニア属由来以外の菌種由来の遺伝子を用いて検討を行った。 The enzyme gene group is composed of a monomer supplying enzyme and a PHB synthesizing enzyme that synthesizes PHB by polymerizing the monomer. In this example, for each of the monomer supplying enzyme and the PHB polymerizing enzyme, bacterial species other than those derived from Ralstonia Examination was performed using the gene derived from the origin.
モノマー供給酵素遺伝子は、ラルストニア・ユートロファＨ１６株由来のＰｈｂＡとＰｈｂＢ、または大腸菌由来のＦａｂＨを用いた。ラルストニア・ユートロファＨ１６株由来のモノマー供給酵素は、アセチルＣｏＡからアセチルＣｏＡの二量化経路によりモノマーを合成するのに対して、大腸菌由来のモノマー供給酵素は、de novo脂肪酸生合成系の中間体である（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカン酸−アシル・キャリア・タンパク質からモノマーを合成する。 The monomer-feeding enzyme gene used was PhbA and PhbB derived from Ralstonia eutropha H16 strain, or FabH derived from E. coli. The monomer-feeding enzyme derived from Ralstonia eutropha H16 strain synthesizes monomers from acetyl-CoA through the dimerization pathway of acetyl-CoA, whereas the monomer-feeding enzyme derived from E. coli is an intermediate in the de novo fatty acid biosynthesis system. A monomer is synthesized from (R) -3-hydroxyalkanoic acid-acyl carrier protein.
ＰＨＢ重合酵素遺伝子は、ラルストニア・ユートロファＨ１６株由来、またはシュードモーナスｓｐ．６１−３株の野生型由来、シュードモーナスｓｐ．６１−３株の変異型由来、バチルスｓｐ．ＩＮＴ００５株由来の４種類を用いた。シュードモーナスｓｐ．６１−３株の変異型の重合酵素遺伝子（ＥＤ／ＱＭ）とは、ＰｈａＣ１の１３０番目のグルタミン酸（Ｅ）がアスパラギン酸（Ｄ）、４８１番目のグルタミン（Ｑ）がメチオニン（Ｍ）にアミノ酸置換したものである。 The PHB synthase gene is derived from Ralstonia eutropha H16 strain or Pseudomonas sp. 61-3 strain wild type, Pseudomonas sp. 61-3 strain-derived mutant, Bacillus sp. Four types derived from INT005 strain were used. Pseudomonas sp. The mutant polymerase gene (ED / QM) of strain 61-3 is PhaC1 with 130th glutamic acid (E) aspartic acid (D) and 481st glutamine (Q) with methionine (M). It is a thing.
実験方法は、ｐＰＳＰＴＧ１プラスミドをＢｓｔＥＩＩで制限酵素処理し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化させた後、ＢａｍＨＩで制限酵素処理したベクター部分をゲル抽出方法で得た。このベクターにｐＧＥＭ−ＣｌＰｓＡＢ［Ｋｅｎ’ｉｃｈｉｒｏ Ｍ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，6，99-104（2005）］またはＥＤＱＭＰｓＡＢプラスミド［Ｋｅｎ’ｉｃｈｉｒｏ Ｍ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，6，99-104（2005）］をＸｂａＩで、ｐＧＥＭ−ＲＣＢｓＡＢプラスミド［Ｓａｔｏｈ，Ｙ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，94，343-350（2002）］をＮｃｏＩで制限酵素処理し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化させた後、ＢａｍＨＩで制限酵素処理して得られた各遺伝子断片をそれぞれ挿入・連結し、プラスミドベクターｐＰＳ−ＣｌＰｓＡＢ、ｐＰＳ−ＥＤＱＭＰｓＡＢ、ｐＰＳ−ＲＣＢｓＡＢをそれぞれ得た。 In the experimental method, a pPSPTG1 plasmid was treated with restriction enzyme BstEII, blunt-ended with T4 DNA polymerase, and then subjected to restriction enzyme treatment with BamHI to obtain a vector portion by gel extraction. To this vector, pGEM-ClPsAB [Ken'ichiro M et al, Biomacromolecules, 6, 99-104 (2005)] or EDQMPsAB plasmid [Ken'ichiro M et al, Biomacromolecules, 6, 99-104 (2005)] with XbaI. PGEM-RCBsAB plasmid [Satoh, Y .; , J .; Biosci. Bioeng. , 94, 343-350 (2002)] after restriction enzyme treatment with NcoI, blunt end treatment with T4 DNA polymerase, and insertion and ligation of each gene fragment obtained by restriction enzyme treatment with BamHI. Vectors pPS-ClPsAB, pPS-EDQMPsAB, and pPS-RCBsAB were obtained, respectively.
さらに、ｐＰＳ−Ｃ１ＰｓＡＢをＳａｃＩＩで制限酵素処理し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化させた後、ＸｂａＩで制限酵素処理したベクターの部分をゲル抽出方法で得た。このベクターにｐＴｒｃＦａｂＨ(F87H)プラスミド［Nomura CT et al, Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ, 5(4), 1457-1464(2004)］をＮｃｏＩで制限酵素処理し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化させた後、ＸｂａＩで制限酵素処理して得られた遺伝子断片を挿入・連結し、プラスミドベクターｐＰＳ−Ｃ１ＰｓＨを得た。なお、ｐＰＳ−ＣＡＢは実施例１に示したとおり構築した。 Furthermore, pPS-C1PsAB was subjected to restriction enzyme treatment with SacII, blunt-ended with T4 DNA polymerase, and then a portion of the vector treated with XbaI restriction enzyme was obtained by a gel extraction method. PTrcFabH (F87H) plasmid [Nomura CT et al, Biomolecules, 5 (4), 1457-1464 (2004)] was treated with NcoI in this vector, blunt-ended with T4 DNA polymerase, and restricted with XbaI. The gene fragment obtained by the enzyme treatment was inserted and ligated to obtain a plasmid vector pPS-C1PsH. Note that pPS-CAB was constructed as shown in Example 1.
ｐＰＳ−ＣＡＢ、ｐＧＥＭ−ＣｌＰｓＡＢ、ｐＧＥＭ−ＥＤＱＭＰｓＡＢ、ｐＧＥＭ−ＲＣＢｓＡＢは、モノマー供給酵素遺伝子がラルストニア・ユートロファＨ１６株由来であり、重合酵素遺伝子がそれぞれラルストニア・ユートロファＨ１６株、シュードモーナスｓｐ．６１−３株の野生型、シュードモーナスｓｐ．６１−３株の変異型、バチルスｓｐ．ＩＮＴ００５株由来である遺伝子を導入している。ｐＰＳ−Ｃ１ＰｓＨは、モノマー供給酵素遺伝子が大腸菌由来であり、重合酵素遺伝子がシュードモーナスｓｐ．６１−３株の野生型由来である遺伝子が導入している。 In pPS-CAB, pGEM-ClPsAB, pGEM-EDQMPsAB, and pGEM-RCBsAB, the monomer supply enzyme gene is derived from Ralstonia eutropha H16 strain, and the polymerization enzyme gene is Ralstonia eutropha H16 strain and Pseudomonas sp. 61-3 wild type Pseudomonas sp. 61-3 strain mutant, Bacillus sp. A gene derived from the INT005 strain has been introduced. In pPS-C1PsH, the monomer supply enzyme gene is derived from Escherichia coli, and the polymerization enzyme gene is Pseudomonas sp. A gene derived from wild type 61-3 strain has been introduced.
得られた５種類のプラスミドベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９にエレクトロポレーション法によりそれぞれ導入し、形質転換された５種類の組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９を作製した。これをＭＭＴＧ培地、３０℃で７２時間培養した後、ＰＨＢの含量を測定した。 The five types of plasmid vectors thus obtained were each introduced into Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 by electroporation to prepare five types of transformed Corynebacterium glutamicum ATCC 13869. This was cultured for 72 hours at 30 ° C. in MMTG medium, and then the content of PHB was measured.
その結果、由来菌種の異なる上記のモノマー供給酵素遺伝子または重合酵素遺伝子を含むプラスミドベクターを導入した５種類の組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９すべてにおいてＰＨＢの合成が確認された。またｐＰＳ−ＥＤＱＭＰｓＡＢは、ｐＰＳ−ＣｌＰｓＡＢに比べて約１０倍高いＰＨＢ蓄積が確認された（図４Ａ，図４Ｂ）。 As a result, PHB synthesis was confirmed in all five types of recombinant Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 into which the plasmid vector containing the above-described monomer-feeding enzyme gene or polymerization enzyme gene having a different origin was introduced. Moreover, pPS-EDQMPsAB confirmed PHB accumulation | storage about 10 times higher compared with pPS-ClPsAB (FIG. 4A, FIG. 4B).
上記実施例３の結果から、モノマー供給酵素としてラルストニア属のみならず大腸菌由来のものでもＰＨＢ合成させることに成功し、モノマー供給経路としてアセチルＣｏＡの二量化経路だけでなく脂肪酸生合成系という新たな経路からもＰＨＢを生産できることが明らかになった。また、重合酵素についても、ラルストニア属由来のものだけでなく、シュードモナス属および、バチルス属由来のものを用いてもＰＨＢを合成することができることが示された。また、変異重合酵素（ＥＤ／ＱＭ）を用いると、ＰＨＢを高生産することができることが示された。 From the results of Example 3 above, PHB was successfully synthesized not only from Ralstonia but also from Escherichia coli as a monomer-feeding enzyme. It became clear that PHB can also be produced from the route. Further, it was shown that PHB can be synthesized not only from the Ralstonia genus but also from the Pseudomonas genus and Bacillus genus. In addition, it was shown that PHB can be produced at high yield when using mutant polymerase (ED / QM).
これらより本システムは、多様な生物種由来の多様なモノマー供給酵素および重合酵素の導入によりＰＨＢ生産が可能であると期待される。 From these, this system is expected to be able to produce PHB by introducing various monomer supply enzymes and polymerization enzymes derived from various species.
『ＰＨＢ合成に関与する遺伝子発現量を増加されることによるＰＨＢ高生産の検討』 “Examination of high production of PHB by increasing the expression level of genes involved in PHB synthesis”
コリネ型細菌を用いてＰＨＢをさらに効率的に合成するために、ＰＨＢ合成に関与する遺伝子の発現量を増加させることでＰＨＢの高生産を試みた。 In order to synthesize PHB more efficiently using coryneform bacteria, high production of PHB was attempted by increasing the expression level of genes involved in PHB synthesis.
（１）変異重合酵素遺伝子を用いたＰＨＢ合成
ラルストニア・ユートロファＨ１６株由来の酵素遺伝子群（ｐｈｂＣＡＢ）のうち、ＰＨＢ重合酵素（ＰｈｂＣ）を変異させた変異ＰＨＢ重合酵素Ｇ４Ｄを含む変異酵素遺伝子群ｐｈｂＧ４ＤＡＢを用いてＰＨＢの高生産を試みた。
(1) PHB synthesis using a mutant polymerase enzyme gene Among the enzyme gene group (phbCAB) derived from Ralstonia eutropha H16 strain, a mutant enzyme gene group phbG4DAB containing a mutant PHB polymerase enzyme G4D obtained by mutating a PHB polymerase enzyme (PhbC). We tried high production of PHB using
Ｇ４Ｄは、ＰｈｂＣのＮ末端４番目のグリシン（Ｇ）がアスパラギン酸（Ｄ）にアミノ酸置換した変異ＰＨＢ重合酵素であり、これまでの研究で大腸菌およびラルストニア・ユートロファ菌体内で野生型のＰｈｂＣよりも発現量が高く、ＰＨＢ生産量も多くなることが報告されている［Normi et al, Macromol. Biosic., 2005, 5, 197-206］。 G4D is a mutant PHB polymerizing enzyme in which the N-terminal fourth glycine (G) of PhbC is amino acid-substituted for aspartic acid (D), and in previous studies, E. coli and Ralstonia eutrophae cells are more susceptible than wild-type PhbC. It has been reported that the expression level is high and PHB production is also increased [Normi et al, Macromol. Biosic., 2005, 5, 197-206].
実験方法は、ｐＰＳＰＴＧ１プラスミドをＢｓｔＥＩＩで制限酵素処理し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化させた後、ＢａｍＨＩで制限酵素処理したベクターの部分をゲル抽出方法で得た。このベクターにｐＧＥＭ−ｐｈｂＧ４ＤＡＢプラスミド［Normi Ｙ． et al, Macromol. Biosic., 5, 197-206（2005）］をCｓｐ４５Ｉで制限酵素処理しＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化させた後、ＢａｍＨＩで制限酵素処理して得られた４．３ｋｂの遺伝子断片を挿入・連結し、発現プラスミドベクターｐＰＳ−Ｇ４ＤＡＢを構築した。ｐＰＳ−ＣＡＢの構築方法は実施例１に示したとおりである。 In the experimental method, the pPSPTG1 plasmid was treated with restriction enzyme BstEII, blunt-ended with T4 DNA polymerase, and then subjected to restriction enzyme treatment with BamHI to obtain a portion of the vector by gel extraction. The pGEM-phbG4DAB plasmid [Normi Y. et al, Macromol. Biosic., 5, 197-206 (2005)], a 4.3 kb gene obtained by treating with Csp45I, blunting with T4 DNA polymerase, and then treating with BamHI. The fragments were inserted and ligated to construct an expression plasmid vector pPS-G4DAB. The construction method of pPS-CAB is as shown in Example 1.
得られた発現プラスミドベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９にエレクトロポレーション法によりそれぞれ導入し、形質転換された組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９を作製した。これをＭＭＴＧ培地、３０℃で７２時間培養した後、ＰＨＢの含量を測定した。 The obtained expression plasmid vector was introduced into Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 by electroporation to produce transformed recombinant Corynebacterium glutamicum ATCC 13869. This was cultured for 72 hours at 30 ° C. in MMTG medium, and then the content of PHB was measured.
その結果、変異ＰＨＢ重合酵素Ｇ４Ｄを発現させてもＰＨＢ合成が確認され、野生型のＰｈｂＣを発現させたものより３３％高いＰＨＢ生産が認められた（図５，図６Ｂ）。 As a result, even when mutant PHB synthase G4D was expressed, PHB synthesis was confirmed, and PHB production 33% higher than that of wild-type PhbC was observed (FIGS. 5 and 6B).
この組換えコリネ型細菌におけるＧ４ＤのＰＨＢ生産の増大は、大腸菌やラルストニア・ユートロファを用いたときと同様にＧ４Ｄの発現量の増加によるものと考えられ、抗体を用いたウエスタン分析法によっても重合酵素タンパク質が確認された。そして、宿主細菌が大腸菌やラルストニア・ユートロファのようなグラム陰性菌だけでなく、グラム陽性菌であるコリネ型細菌でもＧ４ＤによるＰＨＢ生産の増大が観察され、宿主細菌がグラム陽性・陰性を問わず、Ｇ４Ｄの変異によって本重合酵素の発現量が上昇する結果を得た。 The increase in PHB production of G4D in this recombinant coryneform bacterium is thought to be due to an increase in the expression level of G4D, as in the case of using Escherichia coli and Ralstonia eutropha. Polymerase is also detected by Western analysis using antibodies. Protein was confirmed. And not only gram-negative bacteria such as E. coli and Ralstonia utropha, but also coryneform bacteria that are gram-positive bacteria, an increase in PHB production by G4D is observed, regardless of whether the host bacteria are gram-positive or negative, The result that the expression level of this polymerization enzyme rises by the mutation of G4D was obtained.
（２）ｐＰＳ−Ｃ’ＡＢを用いたＰＨＢ合成
ｐＰＳ−Ｃ’ＡＢとは、ラルストニア・ユートロファ由来の重合酵素遺伝子のコドンユーセージをコリネ型細菌用に変換したものである。実験方法は、ｐＰＳ−ＣＡＢをＫｐｎＩとＢｇｌＩＩで制限酵素処理し、ＫｐｎＩとＢａｍＨＩで制限酵素処理したｐＵＣ１９（TOYOBO）ベクターに導入した。
２つのプライマー（５′−GCAGCATCCACCCAGGAAGGCAAGTCCCAG−３′（配列番号５）、５′−TGCGCCCTTGCCGGTTGCCATGATTTGA−３′（配列番号６））を用いたＰＣＲ増幅でｐＵＣ１９Ｃ’を作製した。ｐＵＣ１９Ｃ’はＥｃｏＲＶとＭｕｎＩで制限酵素処理し、同じ制限酵素処理したｐＰＳ−ＣＡＢに挿入・連結し、発現プラスミドベクターｐＰＳ−Ｃ’ＡＢを構築した。ｐＰＳ−ＣＡＢの構築方法は実施例１に示したとおりである。
(2) PHB synthesis using pPS-C′AB pPS-C′AB is obtained by converting the codon usage of the Ralstonia eutropha-derived polymerization enzyme gene for coryneform bacteria. In the experimental method, pPS-CAB was introduced into a pUC19 (TOYOBO) vector treated with restriction enzymes KpnI and BglII and treated with restriction enzymes KpnI and BamHI.
PUC19C ′ was prepared by PCR amplification using two primers (5′-GCAGCATCCACCCAGGAAGGCAAGTCCCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 5), 5′-TGCGCCCTTGCCGGTTGCCATGATTTGA-3 ′ (SEQ ID NO: 6)). pUC19C ′ was treated with restriction enzymes EcoRV and MunI, and inserted and ligated into the same restriction enzyme-treated pPS-CAB to construct an expression plasmid vector pPS-C′AB. The construction method of pPS-CAB is as shown in Example 1.
得られた発現プラスミドベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９にエレクトロポレーション法によりそれぞれ導入し、形質転換された組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９を作製した。これをＭＭＴＧ培地、３０℃で７２時間培養した後、ＰＨＢの含量を測定した。 The obtained expression plasmid vector was introduced into Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 by electroporation to produce transformed recombinant Corynebacterium glutamicum ATCC 13869. This was cultured for 72 hours at 30 ° C. in MMTG medium, and then the content of PHB was measured.
その結果、ｐＰＳ−Ｃ’ＡＢを導入した組換えコリネ型細菌は、ｐＰＳ−ＣＡＢやｐＰＳ−Ｇ４ＤＡＢよりもさらにＰＨＢの生産量が上昇した（図５，図６Ｂ）これは、翻訳レベルで重合酵素の発現量が上昇したためであると考えられる。 As a result, the recombinant coryneform bacterium into which pPS-C′AB was introduced had a higher PHB production amount than pPS-CAB and pPS-G4DAB (FIGS. 5 and 6B). This is thought to be due to an increase in the expression level of.
（３）異なるベクターを用いたＰＨＢ合成
ｐＰＳＰＴＧベクター以外のｐＶＣ７ベクターを用いることによりＰＨＢの高生産を試みた。ｐＶＣ７ベクターはｐＰＳＰＴＧベクターと複製起点が異なり、コピー数が少ない特徴をもつベクターである［Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，69，358-366（2003）］
(3) PHB synthesis using different vectors High production of PHB was attempted by using a pVC7 vector other than the pPSPTG vector. The pVC7 vector is different from the pPSPTG vector in that it has a replication origin and is characterized by a low copy number [Kikuchi, Y. et al. et al. : Appl. Environ. Microbiol. , 69, 358-366 (2003)]
実験方法は、ｐＰＳ−ＣＡＢプラスミドとｐＶＣ７ベクターをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで制限酵素処理し、ゲル抽出方法で得られたＣＡＢを含む遺伝子断片をベクターに挿入・連結し、発現プラスミドベクターｐＶＣ７−ＣＡＢを構築した。ｐＰＳ−ＣＡＢの構築方法は実施例１に示したとおりである。 In the experimental method, the pPS-CAB plasmid and the pVC7 vector were treated with restriction enzymes with EcoRI and BamHI, and the gene fragment containing CAB obtained by the gel extraction method was inserted and ligated into the vector to construct an expression plasmid vector pVC7-CAB. . The construction method of pPS-CAB is as shown in Example 1.
得られた発現プラスミドベクターｐＰＳ−ＣＡＢ、ｐＶＣ７−ＣＡＢそれぞれと、ｐＰＳ−ＣＡＢとｐＶＣ７−ＣＡＢの２つ一緒にコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９にエレクトロポレーション法によりそれぞれ導入した。得られた形質転換された３種類の組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９をＭＭＴＧ培地、３０℃で７２時間培養した後、ＰＨＢの含量を測定した。 The resulting expression plasmid vectors pPS-CAB and pVC7-CAB and two of pPS-CAB and pVC7-CAB were introduced into Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 by electroporation. The three transformed recombinant Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 thus obtained were cultured in MMTG medium at 30 ° C. for 72 hours, and then the content of PHB was measured.
その結果、ｐＶＣ７−ＣＡＢはｐＰＳ−ＣＡＢよりもＰＨＢ生産が低かった。一方、ｐＰＳ−ＣＡＢとｐＶＣ７−ＣＡＢの２つの発現プラスミドベクターを導入すると、各々１つを導入するよりも高いＰＨＢの生産が認められた（図６Ａ，図６Ｂ）。 As a result, pVC7-CAB had a lower PHB production than pPS-CAB. On the other hand, when two expression plasmid vectors, pPS-CAB and pVC7-CAB, were introduced, higher PHB production was observed than when one was introduced (FIGS. 6A and 6B).
このように複製起点の異なる２種類のプラスミドを導入してＰＨＢを高生産化することができたのは、ＰｈｂＡおよびＰｈｂＢの発現量増強によるモノマー３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの供給量上昇とさらに重合酵素ＰｈｂＣの発現量増加の２つの正の効果が発揮された効果と考えられる。 The introduction of two types of plasmids with different origins of replication in this way was able to increase the production of PHB because the increase in the supply amount of monomer 3-hydroxybutyryl CoA and the further polymerization by enhancing the expression amount of PhbA and PhbB It is considered that two positive effects of increasing the expression level of the enzyme PhbC were exhibited.
以上のことから、 進化酵素の使用およびベクターコピー数の増加という新たな手法より、ＰＨＢ生産量を上昇させることができた。 Based on the above, it was possible to increase PHB production by a new technique of using evolutionary enzymes and increasing the number of vector copies.
『コリネ型細菌における最適培養条件の検討』 “Examination of optimal culture conditions for coryneform bacteria”
ラルストニア・ユートロファＨ１６株由来ＰＨＢ酵素遺伝子群のオペロン（ｐｈｂＣＡＢ）をコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９にエレクトロポレーションにより導入し［Ｌｉｂｅｌ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．：ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，65，299-303（1989）］、この遺伝子群を発現する組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９において、ＰＨＢ合成に好適な培養培地および培養温度・ｐＨについての検討を行った。 An operon (phbCAB) of the PHB enzyme gene group derived from Ralstonia eutropha H16 strain was introduced into Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 by electroporation [Libel, W. et al. et al. : FEMS Microbiol. Lett. , 65, 299-303 (1989)], a recombinant Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 expressing this gene group was examined for a culture medium suitable for PHB synthesis and a culture temperature and pH.
まず、培養培地の検討では、ＬＢ培地［ＢａｃｔｏＴｒｙｐｔｏｎｅ，ＢａｃｔｏＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ，ＮａＣｌ（Ｊｕｎｓｅｉ）］、富栄養培地ＣＭ２Ｇ［Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，69，358-366（2003）］、最小培地ＭＭＴＧ［Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，69，358-366（2003）］の３種類について温度３０℃で７２時間培養後に評価を行った。各培地組成について図７に示す。 First, in the examination of the culture medium, LB medium [BactoTryptone, BactoYeast Extract, NaCl (Junsei)], rich medium CM2G [Kikuchi, Y. et al. et al. : Appl. Environ. Microbiol. 69, 358-366 (2003)], minimal medium MMTG [Kikuchi, Y. et al. et al. : Appl. Environ. Microbiol. , 69, 358-366 (2003)] was evaluated after incubation at 30 ° C. for 72 hours. Each medium composition is shown in FIG.
その結果、最小培地に炭素源としてグルコース、窒素源として硫酸アンモニウムを添加したＭＭＴＧ培地のみがＰＨＢ合成を実現した。ＬＢ培地、ＣＭ２Ｇ培地の天然培地を主体としたものではＰＨＢ合成は実現しなかった。このことから、今後組換えコリネ型細菌を用いた生分解性ポリエステル合成についての検討では、成分内容が明確で炭素と窒素の栄養バランス（Ｃ／Ｎ比）を自在に変動可能なＭＭＴＧ培地は好適と考えられる。 As a result, only MMTG medium in which glucose as a carbon source and ammonium sulfate as a nitrogen source were added to the minimum medium realized PHB synthesis. PHB synthesis was not realized with LB medium and CM2G medium based on natural medium. For this reason, in future studies on biodegradable polyester synthesis using recombinant coryneform bacteria, MMTG medium that has a clear component content and can freely change the nutrient balance (C / N ratio) of carbon and nitrogen is suitable. it is conceivable that.
次に、培養温度・ｐＨの検討では、ＭＭＴＧ培地にカナマイシン５０μｇ／ｍｌを添加した培地を用いて検討した。温度条件は２７℃から３７℃、ｐＨは７から８で行った。 Next, the culture temperature and pH were examined using a medium in which 50 μg / ml kanamycin was added to the MMTG medium. The temperature conditions were 27 ° C. to 37 ° C., and the pH was 7 to 8.
その結果、図８および図９に示すように、ＰＨＢの合成は、検討したどの培養温度・ｐＨにおいても認められたが、合成の至適温度と至適ｐＨは、それぞれ３７℃と７．５であった。これは、コリネ型細菌自身の増殖の至適培養条件と合致していた。すなわち、組換えコリネ型細菌での生分解性ポリエステル合成は、コリネ型細菌自身の増殖条件と連動させた形で条件設定することが重要であることを示している。 As a result, as shown in FIG. 8 and FIG. 9, PHB synthesis was observed at any culture temperature and pH studied, but the optimum synthesis temperature and pH were 37 ° C. and 7.5 ° C., respectively. Met. This was consistent with the optimal culture conditions for the growth of coryneform bacteria themselves. That is, it is shown that it is important to set conditions for biodegradable polyester synthesis in recombinant coryneform bacteria in a manner linked to the growth conditions of the coryneform bacteria themselves.
『ｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌の培養時間の検討』 “Examination of culture time for recombinant coryneform bacteria harboring pPS-CAB”
プロモーターの検討において、ｐＰＳ−ＣＡＢを保有した組換えコリネ型細菌のみに、ＰＨＢ合成が検出された。このことから、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーター（Ｐｃｓｐ）が、ｐｈｂＣＡＢの発現に対してコリネ型細菌で有効に機能したことが推定される。そこで、このＰＨＢ合成能を有する組換えコリネ型細菌の培養は、最適の条件であるＭＭＴＧ培地にて３０℃、ｐＨ７．５を採用し、培養時間の検討を行った。 In the examination of the promoter, PHB synthesis was detected only in the recombinant coryneform bacterium carrying pPS-CAB. From this, it is presumed that the cell surface protein gene promoter (Pcsp) of coryneform bacteria functioned effectively in coryneform bacteria for the expression of phbCAB. Therefore, the culture of this recombinant coryneform bacterium having the ability to synthesize PHB was carried out by examining the culture time by employing 30 ° C. and pH 7.5 in MMTG medium, which is the optimum condition.
培養時間の検討は、組換えコリネ型細菌の成長とＰＨＢの合成を経時的に９６時間まで測定した。組換えコリネ型細菌の成長曲線は、経時的に培養液をサンプリングして、乾燥菌体重量（ｍｇ／ｍｌ）を測定しながらプロットして作成した（図１０中●印）。一方、ＰＨＢの合成は菌の成長曲線と同一時間にサンプリングして、上記乾燥菌体試料から分析後に算出してＰＨＢの細胞内合成蓄積量（％，ＰＨＢ重量／乾燥菌体試料重量）をプロットして作成した（図１０中○印）。 In the examination of the culture time, the growth of recombinant coryneform bacteria and the synthesis of PHB were measured over time up to 96 hours. The growth curve of the recombinant coryneform bacterium was prepared by sampling the culture solution over time and plotting it while measuring the dry cell weight (mg / ml) (marked with ● in FIG. 10). On the other hand, PHB synthesis is sampled at the same time as the growth curve of the fungus, calculated after analysis from the dry cell sample, and plotted as PHB intracellular synthesis accumulation (%, PHB weight / dry cell sample weight). (Circle mark in FIG. 10).
その結果、図１０に示すように、菌の成長とＰＨＢ合成はほぼ連動しており、４８時間後にはＰＨＢの合成は約２２．５％の一定レベルに達し、その後９６時間培養後まで安定的に蓄積した。したがって、ＰＨＢの細胞内合成蓄積量を再現性よく安定して測定できる培養時間として、７２時間を設定した。 As a result, as shown in FIG. 10, the growth of bacteria and PHB synthesis are almost linked, and after 48 hours, PHB synthesis reaches a certain level of about 22.5%, and thereafter stable until after 96 hours of culture. Accumulated. Accordingly, 72 hours was set as the culture time for stably measuring the amount of PHB intracellular synthesis accumulated with good reproducibility.
『バイオ工学的アプローチによるＰＨＢの高生産』 "High production of PHB by biotechnological approach"
ｐＨ、攪拌速度、温度等を制御できる発酵槽（Jar fermentor）を用いて 、ｐＨと攪拌速度を制御してＰＨＢの高生産を試みた。発酵槽は試験管スケールよりも培養管理が行き届きＰＨＢ生産量を高める効果のあることが確認された。 Using a Jar fermentor capable of controlling pH, stirring speed, temperature, etc., high production of PHB was attempted by controlling pH and stirring speed. It was confirmed that the fermenter had an effect of increasing the PHB production because the culture management was more complete than the test tube scale.
実験条件は、プラスミドベクターｐＰＳ−ＣＡＢを導入した組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９を５Ｌ容の発酵槽で２ＬのＭＭＴＧ培地を用い、３０℃で７２時間培養した。ｐＨは７．５、攪拌速度は３００ｒｐｍ、温度は３０℃に固定した。 As experimental conditions, recombinant Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 introduced with the plasmid vector pPS-CAB was cultured in a 5 L fermentor using 2 L of MMTG medium at 30 ° C. for 72 hours. The pH was fixed at 7.5, the stirring speed was 300 rpm, and the temperature was fixed at 30 ° C.
その結果、発酵槽を用いずに７２時間培養したＰＨＢ生産量が２２ｗｔ％であるのに対し、発酵槽を用いて７２時間培養したＰＨＢ生産量は４０ｗｔ％であり、最終的な生産量だけではなく、生産性も試験管スケールの実験より優れることがわかった（図１１Ａ，図１１Ｂ）。これは、攪拌方法の違いによって通気性が良くなった効果によるものと考えられる。今後は、培養条件のバイオ工学的な制御によるＰＨＢの高生産が期待される。 As a result, the PHB production amount cultured for 72 hours without using the fermenter is 22 wt%, whereas the PHB production amount cultured for 72 hours using the fermenter is 40 wt%, and the final production amount alone is It was also found that the productivity was superior to the test tube scale experiment (FIGS. 11A and 11B). This is considered to be due to the effect of improved air permeability due to the difference in the stirring method. In the future, high production of PHB is expected by biotechnological control of culture conditions.
『培養培地中のビオチン濃度の検討』 “Examination of biotin concentration in culture medium”
コリネ型細菌は、グルタミン酸生産菌として代謝経路等がよく研究されている。ビオチンは、グルタミン酸生産の原料となるアセチルＣｏＡを脂肪酸生産もしくはグルタミン酸生産へと誘導するスイッチ的な役割を果たすことが知られている。アセチルＣｏＡはＰＨＢの原料でもあり、アセチルＣｏＡをＰＨＢ生産へ促すにもビオチン濃度が重要だと考えられる。（図１参照） Coryneform bacteria are well studied for their metabolic pathway as glutamic acid producing bacteria. Biotin is known to play a switch role in inducing acetyl CoA, which is a raw material for glutamic acid production, to fatty acid production or glutamic acid production. Acetyl-CoA is also a raw material for PHB, and biotin concentration is considered important for promoting acetyl-CoA to PHB production. (See Figure 1)
そこで、実施例５においてＭＭＴＧ培地においてＰＨＢ合成に成功したため、さらにこのＭＭＴＧ培地のビオチン濃度を変化させ、ＰＨＢ合成に最適なビオチン濃度を調べた。 Therefore, since PHB synthesis was successful in the MMTG medium in Example 5, the biotin concentration in the MMTG medium was further changed, and the optimum biotin concentration for PHB synthesis was examined.
実験方法は、ｐＰＳ―ＣＡＢを導入した組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９をビオチン濃度が異なるＭＭＴＧ培地で３０℃、７２時間培養した。この際のグルコース濃度は６重量パーセント濃度に固定した。 As an experimental method, recombinant Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 into which pPS-CAB was introduced was cultured in an MMTG medium having a different biotin concentration at 30 ° C. for 72 hours. The glucose concentration at this time was fixed at a concentration of 6 weight percent.
その結果、ＭＭＴＧ培地中のビオチン濃度の変化によりＰＨＢ生産量も変化し、ビオチン濃度１０〜３０μｇ／ＬにおいてＰＨＢを好適に生産し、特に１０μｇ／Ｌの場合に最も多く生産する結果が得られた。このことからビオチンが脂肪酸生産やグルタミン酸生産だけでなくＰＨＢ生産にも影響を及ぼしていることが示された（図１２Ａ，図１２Ｂ）。 As a result, the amount of PHB produced also changed due to the change in the biotin concentration in the MMTG medium, and PHB was suitably produced at a biotin concentration of 10 to 30 μg / L, with the result being most produced especially at 10 μg / L. . This indicates that biotin affects not only fatty acid production and glutamic acid production but also PHB production (FIGS. 12A and 12B).
『ビオチン濃度の調節によるＰＨＢおよびグルタミン酸のダブル生産の検討』 “Examination of double production of PHB and glutamic acid by adjusting biotin concentration”
実施例８で示したとおり、ビオチン濃度はアセチルＣｏＡを脂肪酸またはグルタミン酸、ＰＨＢのどの生産に誘導するか決めるのに重要であることが示された。そのため、培養中に添加するビオチン濃度を調節することによって、菌体外にグルタミン酸を分泌させ、菌体内にＰＨＢを蓄積させるダブル生産を試みた。 As shown in Example 8, the biotin concentration was shown to be important in determining which fatty acid, glutamic acid, or PHB is induced to produce acetyl-CoA. Therefore, by controlling the concentration of biotin added during culture, we attempted double production in which glutamic acid was secreted outside the cells and PHB was accumulated in the cells.
（１）グルタミン酸およびＰＨＢを生産するビオチン濃度の検討
まず、グルタミン酸を生産するビオチン濃度とＰＨＢを生産するビオチン濃度を調べるため、ＭＭＴＧ培地のビオチン濃度を変化させ各物質の生産量を測定した。
(1) Examination of Biotin Concentration Producing Glutamic Acid and PHB First, in order to examine the biotin concentration producing glutamic acid and the biotin concentration producing PHB, the biotin concentration in the MMTG medium was changed and the production amount of each substance was measured.
実験方法は、プラスミドベクターｐＰＳ−ＣＡＢを導入した組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９をビオチン濃度の異なるＭＭＴＧ培地で３０℃、７２時間培養した。グルタミン酸の濃度の測定は、ヤマサグルタミン酸キットを利用した。 In the experimental method, recombinant Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 into which the plasmid vector pPS-CAB was introduced was cultured in an MMTG medium having a different biotin concentration at 30 ° C. for 72 hours. The concentration of glutamic acid was measured using a Yamasa glutamic acid kit.
その結果、ビオチン濃度０〜３μｇ／Ｌではグルタミン酸が生産され、３〜４５０μｇ／ＬではＰＨＢが生産され、グルタミン酸とＰＨＢの生産のための最適のビオチン濃度が異なり、ビオチン濃度が低ければグルタミン酸が、高ければＰＨＢが生産される傾向が明らかになった（図１３Ａ，図１３Ｂ）。 As a result, glutamic acid is produced at a biotin concentration of 0 to 3 μg / L, PHB is produced at a concentration of 3 to 450 μg / L, and the optimum biotin concentration for production of glutamic acid and PHB is different. The tendency for PHB to be produced becomes clear when it is high (FIGS. 13A and 13B).
（２）ビオチン濃度の調節によるＰＨＢおよびグルタミン酸のダブル生産の検討
上記（１）の結果におけるＰＨＢとグルタミン酸の最適なビオチン濃度の違いを利用して、ビオチンが入ってない培地からグルタミン酸を醗酵させた後、ビオチンおよび炭素源になるグルコースを加えるビオチン濃度の異なる２段階の培養方法により、ＰＨＢとグルタミン酸の両方を一度に生産させるダブル生産を試みた。
(2) Examination of double production of PHB and glutamic acid by adjusting biotin concentration Using the difference in optimal biotin concentration between PHB and glutamic acid in the result of (1) above, glutamic acid was fermented from a medium not containing biotin. Then, double production was attempted, in which both PHB and glutamic acid were produced at once by a two-stage culture method in which biotin and glucose serving as a carbon source were added, with different biotin concentrations.
実験方法は、プラスミドベクターｐＰＳ−ＣＡＢを導入した組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９をビオチンの入ってないＭＭＴＧ培地に３０℃で５３時間培養した後、最終濃度をビオチン３０μｇ／Ｌ、グルコース６ｗｔ％濃度となるように加えた。グルタミン酸の濃度の測定は、ヤマサグルタミン酸キットを利用した。 In the experiment method, recombinant Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 introduced with the plasmid vector pPS-CAB was cultured in MMTG medium without biotin at 30 ° C. for 53 hours, and the final concentration was 30 μg / L of biotin and 6 wt% glucose. It was added to become. The concentration of glutamic acid was measured using a Yamasa glutamic acid kit.
その結果、ビオチン濃度の違いによる２段階培養によって同じコリネ型細菌で二つの有効物質の生産ができた。それだけではなく、今まで終始ビオチン濃度を３０μｇ／Ｌにして培養した１段階培養の時よりもＰＨＢの生産量が上昇した（図１４Ａ，図１４Ｂ）。 As a result, two effective substances could be produced in the same coryneform bacterium by two-stage culture with different biotin concentrations. Not only that, the production amount of PHB was higher than that in the case of the one-stage culture in which the biotin concentration was always maintained at 30 μg / L (FIGS. 14A and 14B).
『ｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌により生産される生分解性ポリエステルの組成分析』 “Composition analysis of biodegradable polyester produced by recombinant coryneform bacteria carrying pPS-CAB”
ｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌により生産される生分解性ポリエステルの組成を、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて分析した。その結果、図１５のチャート上に示されるように、ＰＨＢに相当するピークのみしか検出されなかった。これより、生産される生分解性ポリエステルは、（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸以外のモノマーユニットが導入されていない（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸のホモポリマーであることが確認された。 The composition of biodegradable polyester produced by recombinant coryneform bacteria carrying pPS-CAB was analyzed using gas chromatography (GC). As a result, only the peak corresponding to PHB was detected as shown in the chart of FIG. From this, it was confirmed that the biodegradable polyester produced is a homopolymer of (R) -3-hydroxybutanoic acid in which no monomer unit other than (R) -3-hydroxybutanoic acid is introduced.
『ｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌により生産されるＰＨＢの分子量測定』 “Molecular weight measurement of PHB produced by recombinant coryneform bacteria carrying pPS-CAB”
ｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌により生産されるＰＨＢの分子量についてゲルパミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて測定した。 The molecular weight of PHB produced by the recombinant coryneform bacterium carrying pPS-CAB was measured using gel permeation chromatography (GPC).
測定方法は、ＴＳＫ ｇｅｌ ＧＭＨＨＲ−Ｍカラム［７．８ｎｍＩ．Ｄ．ｘ３００ｍｍ；Ｔｏｓｈｏ Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ］とＳｈｏｄｅｘ ＸＦ−８０４Ｌカラム［８ｎｍＩ．Ｄ．ｘ３００ｍｍ；Ｓｈｏｗａ Ｄｅｎｋｏ Ｋ．Ｋ．，Ｔｏｋｙｏ］を備えたＪａｓｃｏ ＧＰＣ−９００を使用して４０℃で行った。移動相はクロロホルムを用い、流速０．８ｍｌ／分で行った。純正のポリスチレンを用いて検量線を作成した。 The measurement method was TSK gel GMHHR-M column [7.8 nm I.D. D. x 300 mm; Tosoh Co. , Tokyo] and Shodex XF-804L column [8 nm I.D. D. x300 mm; Showa Denko K .; K. , Tokyo] using a Jasco GPC-900. The mobile phase was chloroform and the flow rate was 0.8 ml / min. A calibration curve was prepared using pure polystyrene.
その結果、図１６に示すように、宿主のみをコリネ型細菌から大腸菌に換えた組換え大腸菌Ｅ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株において合成されるＰＨＢに比べて一桁小さい分子量であった。 As a result, as shown in FIG. 16, the molecular weight was an order of magnitude smaller than that of PHB synthesized in recombinant E. coli E coli JM109 strain in which only the host was changed from coryneform bacteria to E. coli.
『ｐＰＧＥＭ−ＣＡＢおよびｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌によるＰＨＢの発現』 "Expression of PHB by recombinant coryneform bacteria harboring pPGEM-CAB and pPS-CAB"
ｐＰＧＥＭ−ＣＡＢおよびｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌内でのＰＨＢの発現の有無を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により直接的に観察した。 The presence or absence of PHB expression in the recombinant coryneform bacterium carrying pPGEM-CAB and pPS-CAB was directly observed with a transmission electron microscope (TEM).
方法は、組換えコリネ型細菌を塩化カコジル緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した２％グルタルアルデヒドで１時間、２％四酸化オスミウムで３０分間処理して二重固定化した。そのサンプルをエタノールに置換して脱水し、エポキシ樹脂Ｅｐｏｎ８１２で包埋した。エポキシ樹脂の切片を作製し、ウラシルアセテートおよび鉛アセテートにより染色後、電子顕微鏡（JEM-2010；Ｊｅｏｌ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により観察した。 In the method, recombinant coryneform bacteria were double-immobilized by treatment with 2% glutaraldehyde dissolved in cacodyl chloride buffer (pH 7.4) for 1 hour and 2% osmium tetroxide for 30 minutes. The sample was replaced with ethanol, dehydrated, and embedded with epoxy resin Epon812. A section of epoxy resin was prepared, stained with uracil acetate and lead acetate, and then observed with an electron microscope (JEM-2010; Jeol, Tokyo, Japan).
その結果、図１７で示すようにｐＰＧＥＭ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌には、ＰＨＢの顆粒は観察されず（図１７（Ａ））、ｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌のみに、ＰＨＢの顆粒を示す白い固まり（不溶性物）が明確に観察された（図１７（Ｂ））。 As a result, as shown in FIG. 17, PHB granules are not observed in the recombinant coryneform bacterium having pPGEM-CAB (FIG. 17A), and only the recombinant coryneform bacterium having pPS-CAB is observed. In addition, a white lump (insoluble matter) showing PHB granules was clearly observed (FIG. 17B).
以上のように本実施形態によれば、野生型コリネ細菌等の元来、生分解性ポリエステル生産能を有さないコリネ型細菌を改変して生分解性ポリエステル生産能を付与された組換えコリネ型細菌を得ることにより、環境に優しい生分解性であって安全性の高い高機能性材料として、医療や食品など生体に直接接触しても利用可能な生分解性ポリエステルを効率よく生産できる。しかも同一菌体においてアミノ酸と生分解性ポリエステルを同時生産させることができ、２種の付加価値の高い生体産物を生産させるトータルエネルギーを省力化させた高効率的な微生物発酵システムを得ることができる。 As described above, according to the present embodiment, a recombinant coryne provided with a biodegradable polyester-producing ability by modifying a coryneform bacterium originally not having a biodegradable polyester-producing ability, such as a wild-type corynebacterium. By obtaining type bacteria, it is possible to efficiently produce biodegradable polyester that can be used even if it is in direct contact with a living body such as medical or food, as an environmentally friendly biodegradable and highly safe highly functional material. In addition, amino acids and biodegradable polyester can be produced simultaneously in the same cell, and a highly efficient microbial fermentation system can be obtained that saves the total energy required to produce two types of biological products with high added value. .
なお、本発明に係る生分解性ポリエステル生産能を有する組換えコリネ型細菌およびそれを用いた製造方法は、前述した実施形態に限定されるものではなく、適宜変更することができる。 In addition, the recombinant coryneform bacterium having a biodegradable polyester-producing ability and a production method using the same according to the present invention are not limited to the above-described embodiments, and can be appropriately changed.
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