JP2008241305A - Method of amplifying fluorescence signal - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、蛍光物質に励起光を照射して蛍光シグナルを発生させる方法であって、該蛍光シグナルを増幅する方法に関する。特に、微量化学物質測定、創薬分野等の研究開発や臨床診断分野において使用される蛍光測定の蛍光シグナル増幅方法に関する。 The present invention relates to a method for generating a fluorescent signal by irradiating a fluorescent material with excitation light, and a method for amplifying the fluorescent signal. In particular, the present invention relates to a fluorescence signal amplification method for fluorescence measurement used in the field of research and development in the field of trace chemical substances, drug discovery, and clinical diagnosis.
今日、特にバイオメディカルの分野において、遺伝子解析や蛋白質の機能解明等の基礎研究、解析したデーターを利用する新薬開発、癌、ホルモン、感染症などの臨床診断などの用途で蛍光測定が広く使用されている。
一般的に、高感度が要求される蛍光測定には、光電子増倍管を検出器として使用し、フォトンカウンティング法により蛍光量が測定される。フォトンカウンティング法は現在のところ最も感度の高い測光法である。
実際には光子そのものを計数するわけではなく、光子ひとつのエネルギーによって光電子増倍管の光電陰極から叩き出されたひとつの光電子が、ダイノードを通過する過程にて数百万個に増倍されて生じた電流パルスを陽極から外部に取り出し、アンプや波高弁別回路を通した後でパルスカウンタを使用して計数するものである。
Today, especially in the field of biomedical, fluorescence measurement is widely used for basic research such as gene analysis and protein function elucidation, new drug development using the analyzed data, clinical diagnosis of cancer, hormones, infectious diseases, etc. ing.
In general, for fluorescence measurement requiring high sensitivity, a photomultiplier tube is used as a detector, and the amount of fluorescence is measured by a photon counting method. The photon counting method is currently the most sensitive photometric method.
Actually, the photons themselves are not counted, but one photoelectron struck out from the photocathode of the photomultiplier tube by the energy of one photon is multiplied to millions in the process of passing through the dynode. The generated current pulse is taken out from the anode, passed through an amplifier and a wave height discrimination circuit, and then counted using a pulse counter.
フォトンカウンティング法による蛍光測定は、前述のように極めて高感度であるが、バイオメディカルの分野等においては、測定精度の向上や測定の高速化、測定チップ及び装置の小型化、イニシャル及びランニングコストの低減などの観点から、更なる高感度化が求められている。
フォトンカウンティング法による蛍光測定の検出限界感度は、検出器に導入される光子の数、即ち、蛍光物質の蛍光量とノイズである暗電流量によって決定される。従って、検出感度を向上させるには、蛍光量を増加させるか、又はブランクを低減させる、即ち、暗電流量を低減させるかのいずれかの対策が必要である。
The fluorescence measurement by the photon counting method is extremely sensitive as described above. However, in the biomedical field, etc., the measurement accuracy is improved and the measurement speed is increased, the measurement chip and the device are downsized, and the initial and running costs are reduced. From the viewpoint of reduction or the like, higher sensitivity is required.
The detection limit sensitivity of the fluorescence measurement by the photon counting method is determined by the number of photons introduced into the detector, that is, the amount of fluorescence of the fluorescent material and the amount of dark current that is noise. Therefore, in order to improve the detection sensitivity, it is necessary to take measures to either increase the amount of fluorescence or reduce the blank, that is, reduce the amount of dark current.
暗電流とは、光子が導入されない状態においても観測される電流パルスであり、主に光電面から放出される熱電子によるものである。従って、光電子増倍管を冷却することによって、暗電流量を低減することができる。また、必要以上に検出波長領域が広い光電子増倍管を使用しないことも暗電流を低減するのに有効である。
しかしながら、これらの手法は既に一般的に行われており、暗電流を低減するのみでは、蛍光測定の大幅な検出感度向上は困難である。
Dark current is a current pulse that is observed even when no photons are introduced, and is mainly due to thermoelectrons emitted from the photocathode. Therefore, the amount of dark current can be reduced by cooling the photomultiplier tube. Also, it is effective to reduce the dark current not to use a photomultiplier tube having a detection wavelength region wider than necessary.
However, these techniques are already generally used, and it is difficult to significantly improve the detection sensitivity of fluorescence measurement only by reducing the dark current.
一方、検出器に導入される蛍光量を増加させる方法としては、例えば、蛍光励起空間において励起光軸の側方に配置された集光鏡と、蛍光励起空間の外側において励起光軸方向に対して実質的に直角方向であって前記集光鏡に対向する位置に配置された検出器とを備え、集光鏡が励起光軸と平行な方向に対して平坦な反射面をもつ逆カマボコ形凹面鏡からなり、検出器が検出胴体を励起光軸に対して平行とするサイドオンタイプの光電子増倍管であることを特徴とする蛍光分析装置が挙げられる。即ち、サイドオンタイプの光電子増倍管の受光部が検出胴体の方向に長いことを利用して、それに対応して平行な方向に対して平坦な反射面をもつ逆カマボコ形凹面鏡を集光鏡として用いることによって、励起光源からの励起光の焦点の調整を容易にすると共に焦点の周辺からもより多くの蛍光を集めて受光部へ供給できるようにしたものである（特許文献1）。 On the other hand, as a method of increasing the amount of fluorescence introduced into the detector, for example, a condensing mirror disposed on the side of the excitation optical axis in the fluorescence excitation space and the excitation optical axis direction outside the fluorescence excitation space. And a detector disposed at a position substantially perpendicular to the light collecting mirror and facing the light collecting mirror, the light collecting mirror having a flat reflecting surface with respect to a direction parallel to the excitation optical axis. There is a fluorescence analyzer characterized by comprising a concave mirror, and the detector is a side-on type photomultiplier tube whose detection body is parallel to the excitation optical axis. That is, by utilizing the fact that the light-receiving part of the side-on type photomultiplier tube is long in the direction of the detection body, a corresponding inverted concave concave mirror having a flat reflecting surface with respect to the parallel direction is correspondingly collected. As a result, the focus of the excitation light from the excitation light source can be easily adjusted, and more fluorescence can be collected from the periphery of the focus and supplied to the light receiving unit (Patent Document 1).
また、励起光源及び蛍光検出器、2枚の反射面とで構成され、反射面は鏡面を持って対向し蛍光励起空間を形成し、一の反射面には励起光を通過させる穴が空いている蛍光増幅器が開発されている。励起光は蛍光励起空間を進行し２枚の鏡面間を反復通過する。鏡面に対しての入射角が大きい一部の励起光は該反復通過を行う過程において、次第に鏡面の端部に向かい外部に射出される。該入射角が小さい励起光は膨大な量の入射反射を鏡面間で繰り返す。蛍光励起空間に満たされている蛍光物質は励起光の反復通過を受け光子との衝突確立が指数関数的に上昇し蛍光量の大幅な向上を実現するものである（特許文献2）。
どちらの方法によっても、検出器に導入される蛍光量は増加するものと推測されるが、前者の方法は発生する蛍光量自体を増加させるものではないため、大幅な蛍光量の増加は望めない。
In addition, it is composed of an excitation light source and a fluorescence detector, and two reflection surfaces. The reflection surfaces are opposed to each other with a mirror surface to form a fluorescence excitation space, and one reflection surface has a hole through which excitation light passes. Fluorescence amplifiers have been developed. The excitation light travels in the fluorescence excitation space and repeatedly passes between the two mirror surfaces. Part of the excitation light having a large incident angle with respect to the mirror surface is gradually emitted toward the end of the mirror surface in the process of repeatedly passing. Excitation light having a small incident angle repeats an enormous amount of incident reflection between mirror surfaces. The fluorescent material filled in the fluorescence excitation space is subjected to repeated passage of excitation light, and the probability of collision with photons rises exponentially and realizes a significant improvement in the amount of fluorescence (Patent Document 2).
Both methods are presumed to increase the amount of fluorescence introduced into the detector, but the former method does not increase the amount of generated fluorescence itself, so a significant increase in the amount of fluorescence cannot be expected. .
また、後者の方法は一の反射面に励起光導入用の穴があり、その穴のみから励起光が照射されるため導入される励起光量が少なくなる。一方、穴を大きくして導入する励起光量を増加させると2枚の鏡面間を反復通過する励起光量が減少して増幅効果が大幅に低減するため、穴の径を如何に設定しようとも大幅な蛍光量の増加は困難である。 In the latter method, there is a hole for introducing excitation light on one reflecting surface, and excitation light is irradiated only from the hole, so that the amount of excitation light introduced is reduced. On the other hand, increasing the amount of excitation light introduced by enlarging the hole reduces the amount of excitation light that repeatedly passes between the two mirror surfaces, greatly reducing the amplification effect, so no matter how the hole diameter is set It is difficult to increase the amount of fluorescence.
また、特許文献1、2の方法は従来測定系の大型化に繋がるため、バイオメディカルの分野等で要求されている測定チップ及び装置の小型化といったニーズに対応することが困難であるし、さらには蛍光測定装置自体の改良が必要になるため、既存の装置をそのまま使用できないといった課題がある。
即ち、本発明の目的は、微量化学物質測定、創薬分野等の研究開発や臨床診断分野において使用される蛍光測定の検出感度を向上させるために、蛍光シグナルを大幅に増幅させる方法を提供することである。 That is, an object of the present invention is to provide a method for greatly amplifying a fluorescence signal in order to improve the detection sensitivity of fluorescence measurement used in the field of research and development in the field of trace chemical substances, drug discovery, and clinical diagnosis. That is.
本発明の蛍光シグナルの増幅方法は、蛍光物質（F）をフォトニック結晶（PC）の空隙部に存在させて、該フォトニック結晶（PC）により励起光（L）を反射反復させることを特徴とする。 The method for amplifying a fluorescent signal of the present invention is characterized in that a fluorescent substance (F) is present in a void of a photonic crystal (PC), and excitation light (L) is repeatedly reflected by the photonic crystal (PC). And
本発明の蛍光シグナル増幅方法によれば、蛍光シグナルを大幅に増幅させることができるため、微量化学物質測定、創薬分野等の研究開発や臨床診断分野において使用される蛍光測定に適用すれば、その検出感度を向上させることができる。
また、本発明に使用するフォトニック結晶は、極めて微細な構造であることから、各種蛍光測定の測定チップ及び装置の小型化、イニシャル及びランニングコストの低減などに寄与することができる。
According to the fluorescence signal amplification method of the present invention, it is possible to greatly amplify the fluorescence signal, so if applied to fluorescence measurement used in the research and development in the field of trace chemicals, drug discovery, etc. and clinical diagnosis, The detection sensitivity can be improved.
In addition, since the photonic crystal used in the present invention has a very fine structure, it can contribute to downsizing of measurement chips and devices for various fluorescence measurements, reduction of initial and running costs, and the like.
本発明の蛍光物質（Ｆ）としては、特に制限されることなく、公知の蛍光物質を使用することができる。例えば、ローダミン系色素（ローダミンB、ローダミン６G、ローダミン１２３）、クマリン系色素（クマリン３４３、クマリン４８０）、フルオレセイン、リサミン-ローダミンBスルホニルクロライド、アニリノナフタレンスルホン酸、2-メトキシ2，4-ジフェニル3（2H）フラノン、メチルウンベリフェロン、ダンシルクロライド、ルシファーイエロー、エリスロシン、ピレン、テキサスレッド、エオシン、フルオレサミン、クロロフィルなどの有機蛍光色素、ユーロピウム、テルビウムなどの金属蛍光錯体が挙げられる。 The fluorescent substance (F) of the present invention is not particularly limited, and a known fluorescent substance can be used. For example, rhodamine dyes (rhodamine B, rhodamine 6G, rhodamine 123), coumarin dyes (coumarin 343, coumarin 480), fluorescein, lysamine-rhodamine B sulfonyl chloride, anilinonaphthalene sulfonic acid, 2-methoxy 2,4-diphenyl 3 (2H) furanone, methylumbelliferone, dansyl chloride, lucifer yellow, erythrosin, pyrene, Texas red, eosin, fluoresamine, and other organic fluorescent dyes such as chlorophyll, and metal fluorescent complexes such as europium and terbium.
蛍光シグナルを単純に増幅するという観点からは、蛍光物質（Ｆ）の使用形態は特に限定されることはなく、溶媒に分散した状態で使用することもできるし、固体状態にて使用することもできる。
しかし、実際の蛍光測定に適用するには、溶媒を使用した形態が好ましい場合が多く、使用できる溶媒は適用する蛍光測定の種類によって最適なものを選択する必要がある。少なくとも、溶媒としては、蛍光物質を溶解又は分散可能なものを使用することが好ましく、また後述のように、蛍光シグナルの増幅倍率向上の観点からは、溶媒の屈折率が概ね低い方が好ましい。
バイオメディカルの分野において使用する場合には、免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチド若しくはオリゴペプチドなどに結合した蛍光物質（Ｆ）を使用することができる。
また、酵素イムノアッセイのように、酵素を利用してフォトニック結晶中において蛍光物質を反応生成する測定系にも使用することができる。蛍光物質としては、前述の蛍光物質と同一のものを使用することができる。
From the standpoint of simply amplifying the fluorescent signal, the usage form of the fluorescent substance (F) is not particularly limited, and can be used in a state dispersed in a solvent, or in a solid state. it can.
However, in order to apply to actual fluorescence measurement, a form using a solvent is often preferable, and it is necessary to select an optimum solvent depending on the type of fluorescence measurement to be applied. At least, it is preferable to use a solvent that can dissolve or disperse the fluorescent substance. From the viewpoint of improving the amplification factor of the fluorescent signal, it is preferable that the solvent has a generally low refractive index as described later.
When used in the biomedical field, immune proteins, enzymes, microorganisms, nucleic acids, small organic compounds, non-immune proteins, immunoglobulin-binding proteins, sugar-binding proteins, sugar chains that recognize sugar, fatty acids or fatty acids A fluorescent substance (F) bound to an ester or a polypeptide or oligopeptide having a ligand binding ability can be used.
Moreover, it can also be used for a measurement system that generates and reacts a fluorescent substance in a photonic crystal using an enzyme, such as an enzyme immunoassay. As the fluorescent material, the same fluorescent materials as those described above can be used.
免疫蛋白質としては、抗原、抗体やハプテンを例示することができる。抗体としては、次の抗原に対する抗体が使用でき、該抗原としては、薬剤、低分子ホルモン、腫瘍マーカー、ウイルス、高分子ホルモン、サイトカイン、各種グロスファクター等が挙げられる。薬剤としては、例えば、テオフィリン、フェニトイン、バルプロ酸などが挙げられる。低分子ホルモンとしては、例えば、サイロキシン、エストロゲン、エストラジオールなどが挙げられる。腫瘍マーカーとしては、例えば、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＣＡ１９−９などが挙げられる。ウイルスとしては、例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶなどが挙げられる。高分子ホルモンとしては、例えば、甲状腺刺激ホルモン、インシュリンなどが挙げられる。サイトカインとしては、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６などが挙げられる。各種グロスファクターとしては、例えば、ＥＧＦ、ＰＤＧＦなどが挙げられる。これらの抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよく、さらに抗体の分解物であるＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂであってもよい。 Examples of immune proteins include antigens, antibodies and haptens. As the antibody, an antibody against the following antigen can be used, and examples of the antigen include drugs, low molecular hormones, tumor markers, viruses, high molecular hormones, cytokines, various growth factors and the like. Examples of the drug include theophylline, phenytoin, valproic acid and the like. Examples of the low molecular hormone include thyroxine, estrogen, and estradiol. Examples of tumor markers include CEA, AFP, and CA19-9. Examples of viruses include HIV, HCV, HBV and the like. Examples of the polymer hormone include thyroid stimulating hormone, insulin and the like. Examples of cytokines include IL-1, IL-2, and IL-6. Examples of various growth factors include EGF, PDGF, and the like. These antibodies may be monoclonal antibodies or polyclonal antibodies, and may be F (ab ') 2, Fab', Fab which are degradation products of antibodies.
酵素としては、酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、ターゲット物質がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、ターゲット物質がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等をターゲット物質とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
As an enzyme, an oxidoreductase, a hydrolase, an isomerase, a desorption enzyme, a synthetic enzyme, etc. can be used. Specifically, glucose oxidase can be used if the target substance is glucose, and cholesterol oxidase can be used if the target substance is cholesterol. In addition, when targeting pesticides, insecticides, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, antibiotics, narcotics, cocaine, heroin, cracks, etc., target substances that are metabolized from them, such as acetylcholinesterase, Enzymes such as catecholamine esterase, noradrenaline esterase and dopamine esterase can be used.
The microorganism is not particularly limited, and various microorganisms including Escherichia coli can be used.
核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡの化学合成は、市販の合成装置を用いて行うことができるし、市販されているＤＮＡプローブをそのまま使用することもできる。 As the nucleic acid, either DNA (including cDNA) or RNA can be used. The type of DNA is not particularly limited, and may be any of naturally derived DNA, recombinant DNA prepared by gene recombination technology, or chemically synthesized DNA. Chemical synthesis of DNA (including cDNA) and RNA can be performed using a commercially available synthesizer, or a commercially available DNA probe can be used as it is.
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
Examples of the low molecular weight organic compound include any compound that can be synthesized by an ordinary organic chemical synthesis method.
The non-immune protein is not particularly limited, and for example, avidin (streptavidin), biotin or a receptor can be used.
As the immunoglobulin-binding protein, for example, protein A or protein G, rheumatoid factor and the like can be used.
Examples of sugar-binding proteins include lectins. Examples of the fatty acid or fatty acid ester include stearic acid, arachidic acid, behenic acid, ethyl stearate, ethyl arachidate, and ethyl behenate.
本発明においてフォトニック結晶（ＰＣ）とは、光の波長と同程度の周期的な屈折率変化を3次元的に有する構造体であって、フォトニックバンドギャップを有するものを意味する。周期的な屈折率変化はフォトニック結晶の構成材料とフォトニック結晶の空隙部又は空隙部に充填される物質により決定される。 In the present invention, the photonic crystal (PC) means a structure having a three-dimensional periodic refractive index change equivalent to the wavelength of light and having a photonic band gap. The periodic refractive index change is determined by the constituent material of the photonic crystal and the gap portion of the photonic crystal or the substance filled in the gap portion.
フォトニックバンドギャップとは、電磁波に対するバンドギャップであり、電磁波の絶縁帯域を意味する。そのギャップに対応する特定波長の電磁波はフォトニック結晶の表面付近で反射されたり、フォトニック結晶内に深く入り込んで反射されたり、或いは、透過する電磁波も存在する。また、フォトニック結晶の内部に入り込んだ電磁波が、結晶内部において反射反復して閉じ込められる現象も起こる。
フォトニックバンドギャップによる電磁波の反射は、ブラック反射を原理とするため、通常の鏡のように表面のみで反射されるわけではなく、何層かの結晶面において反射される。真球状微粒子を集積して作製されるフォトニック結晶の場合には、反射される電磁波は次式に従う。
λmax＝2ｄ（n2-sin2θ）1/2
ここで、λmaxは反射光のピーク波長、ｄは真球状微粒子の粒径、nはフォトニック結晶の屈折率、θは入射角度である。
フォトニック結晶では、前述のような反射や透過、閉じ込めといった現象が混在して存在しているものと想定される。なお、フォトニック結晶内部での電磁波の閉じ込めが起こる場合、電磁波のフォトニック結晶内部での滞在時間が延びることが分かっている。
The photonic band gap is a band gap with respect to an electromagnetic wave and means an insulating band of the electromagnetic wave. An electromagnetic wave having a specific wavelength corresponding to the gap is reflected near the surface of the photonic crystal, reflected deeply into the photonic crystal, or transmitted. There also occurs a phenomenon in which electromagnetic waves entering the photonic crystal are repeatedly reflected and confined inside the crystal.
Since the reflection of electromagnetic waves by the photonic band gap is based on the principle of black reflection, it is not reflected only on the surface like an ordinary mirror, but is reflected on several crystal planes. In the case of a photonic crystal produced by accumulating true spherical fine particles, the reflected electromagnetic wave follows the following equation.
λmax = 2d (n 2 -sin 2 θ) 1/2
Here, λmax is the peak wavelength of the reflected light, d is the particle size of the spherical particles, n is the refractive index of the photonic crystal, and θ is the incident angle.
In a photonic crystal, it is assumed that the above-described phenomena such as reflection, transmission, and confinement exist together. It is known that when electromagnetic waves are confined inside the photonic crystal, the residence time of the electromagnetic waves inside the photonic crystal is extended.
特定波長の電磁波としては、γ線、X線、紫外線、可視光線、赤外線、ミリ波、マイクロ波等が挙げられる。本発明の蛍光シグナル増幅方法は、バイオメディカル分野等における蛍光測定に適用することを目的とするため、紫外線、可視光線、赤外線に対応するフォトニックバンドギャップを有するフォトニック結晶を使用することが好ましく、更に好ましくは、波長100〜1000nmの紫外線、可視光線、赤外線に対応するものであり、特に好ましくは、波長300〜800nmの紫外線、可視光線、近赤外線に対応するものである。 Examples of the electromagnetic wave having a specific wavelength include γ rays, X rays, ultraviolet rays, visible rays, infrared rays, millimeter waves, and microwaves. Since the fluorescent signal amplification method of the present invention is intended to be applied to fluorescence measurement in the biomedical field and the like, it is preferable to use a photonic crystal having a photonic band gap corresponding to ultraviolet rays, visible rays, and infrared rays. More preferably, it corresponds to ultraviolet rays, visible rays, and infrared rays having a wavelength of 100 to 1000 nm, and particularly preferably, those corresponding to ultraviolet rays, visible rays, and near infrared rays having a wavelength of 300 to 800 nm.
フォトニック結晶の空隙部とは、空洞である部分を意味し、本発明においては蛍光物質（Ｆ）が存在する場所である。蛍光物質（Ｆ）は、前述のように溶媒に分散した形態で使用することが好ましく、その場合は、フォトニック結晶の構成材料の屈折率と溶媒の屈折率によって、フォトニック結晶の周期的な屈折率変化が生まれる。
フォトニック結晶の空隙部の形態としては、後述するフォトニック結晶構造の逆パターンであり、フォトニック結晶構造の変化により追随して変化するものである。
フォトニック結晶の空隙部に蛍光物質（Ｆ）を存在させる方法としては、溶媒に分散又は溶解された蛍光物質の場合には、シリンジ等で圧力を加えて充填する方法や毛細管力により充填する方法が挙げられる。また、固体状態の蛍光物質を存在させる方法としては、溶媒に分散させて前述の方法にて充填した後、溶媒を除去する方法などが挙げられる。
バイオメディカル分野等、特に免疫検査薬やＤＮＡチップにおいては、空隙部に検出対象と特異的に結合する抗体や相補的なＤＮＡを分散又は溶解した試薬を充填しておき、又はフォトニック結晶の構成材料に該結合物質を予め固定化しておき、蛍光物質にて標識された検出対象物質をフォトニック結晶中に導入することができる。また、酵素イムノアッセイの場合には、予め酵素を固定化等しておき、基質を導入することにより蛍光物質（Ｆ）をフォトニック結晶の空隙部にて反応生成することもできる。
The void portion of the photonic crystal means a portion that is a cavity, and in the present invention is a place where the fluorescent material (F) exists. As described above, the fluorescent substance (F) is preferably used in a form dispersed in a solvent. In this case, the periodicity of the photonic crystal depends on the refractive index of the constituent material of the photonic crystal and the refractive index of the solvent. Refractive index change is born.
The form of the void portion of the photonic crystal is a reverse pattern of the photonic crystal structure described later, and changes following the change of the photonic crystal structure.
As a method for causing the fluorescent material (F) to exist in the voids of the photonic crystal, in the case of a fluorescent material dispersed or dissolved in a solvent, a method of filling by applying pressure with a syringe or the like, or a method of filling by capillary force Is mentioned. Moreover, as a method of making a fluorescent substance of a solid state exist, after dispersing in a solvent and filling with the above-mentioned method, the method of removing a solvent etc. are mentioned.
In the biomedical field, especially in immunological test drugs and DNA chips, the cavity is filled with an antibody that specifically binds to the detection target or a reagent in which complementary DNA is dispersed or dissolved, or a photonic crystal configuration The binding substance can be immobilized on the material in advance, and the detection target substance labeled with a fluorescent substance can be introduced into the photonic crystal. In the case of enzyme immunoassay, the fluorescent substance (F) can also be produced by reaction in the voids of the photonic crystal by immobilizing the enzyme in advance and introducing the substrate.
フォトニック結晶の構成材料と空隙部との屈折率差が大きい方が、フォトニック結晶の反射率は高くなり、電磁波を閉じ込める効果が高くなる。従って、フォトニック結晶構成材料の屈折率が高く、空隙部に充填する溶媒等の屈折率が低い方が反射率は高くなる。
また、両者の屈折率の組み合わせによって、上式のフォトニック結晶の屈折率nが変化するので、反射される電磁波の波長が変化する、即ち、フォトニックバンドギャップの対応波長領域が変化する。
従って、本発明においては後述のように、励起光（Ｌ）のピーク波長におけるフォトニック結晶（PC）の反射率が10〜80％であることが好ましいため、両者の屈折率の組み合わせを最適なものとすることが必要である。
The greater the difference in refractive index between the constituent material of the photonic crystal and the gap, the higher the reflectance of the photonic crystal and the higher the effect of confining electromagnetic waves. Therefore, the reflectance is higher when the refractive index of the photonic crystal constituent material is higher and the refractive index of the solvent or the like filling the gap is lower.
Further, since the refractive index n of the photonic crystal of the above equation changes depending on the combination of both refractive indexes, the wavelength of the reflected electromagnetic wave changes, that is, the corresponding wavelength region of the photonic band gap changes.
Therefore, in the present invention, as described later, since the reflectance of the photonic crystal (PC) at the peak wavelength of the excitation light (L) is preferably 10 to 80%, the combination of both refractive indexes is optimal. It is necessary to be.
フォトニック結晶の構成材料としては、有機化合物、無機化合物のいずれも使用することができる。構成材料の屈折率としては、蛍光シグナルの増幅倍率向上の観点等から、1.3〜3.0であることが好ましく、更に好ましくは1.4〜2.5、より好ましくは1.45〜2.0である。
加えて、構成材料は後述する励起光（Ｌ）の波長領域において、透明性が高いことが好ましい。透明性が高ければ、励起光（L）を吸収することがなく、励起効率を高めることができるからである。
As a constituent material of the photonic crystal, either an organic compound or an inorganic compound can be used. The refractive index of the constituent material is preferably 1.3 to 3.0, more preferably 1.4 to 2.5, and more preferably 1.45 to 2.0 from the viewpoint of improving the amplification factor of the fluorescence signal.
In addition, the constituent material preferably has high transparency in the wavelength region of excitation light (L) described later. This is because if the transparency is high, the excitation light (L) is not absorbed and the excitation efficiency can be increased.
有機化合物としては、前述の条件を満たす各種ポリマーを使用することが好ましく、開環重合系ポリマー、重付加系ポリマー、重縮合系ポリマー、ビニル重合系ポリマーなどの合成ポリマー、多糖類（セルロース、アミロース、アミロペクチン、キトサン、キチン、アラミド繊維など）、脂質（リン脂質、糖脂質、コレステロールなど）、各種ポリペプチド（コラーゲンなど）などの天然ポリマー等が挙げられる。
開環重合系ポリマー、重付加系ポリマー、重縮合系ポリマーなどの非ビニル重合系ポリマーとしては、ウレタン樹脂、ウレア樹脂、ポリアミド樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエーテル樹脂等が挙げられる。
ビニル重合系ポリマーは、ビニル基を有するモノマーを構成単位とするポリマーであり、シアノ基含有ビニルモノマー、（メタ）アクリレート（アクリル樹脂）、カルボキシル基含有ビニルモノマー、芳香族ビニル炭化水素、脂肪族ビニル炭化水素、脂環式ビニル炭化水素、（メタ）アクリルアミド、ビニルスルホン酸、ビニルケトン、多官能モノマー、フッ素系モノマー等を構成単位として使用することができる。
後述の真球状微粒子（P）をフォトニック結晶の構成材料として使用する場合には、専ら、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、これらの構成モノマーとカルボキシル基含有ビニルモノマー、多官能モノマーなどとの共重合体が使用される。市販されている単分散ポリスチレン系微粒子を使用することもできる。
As the organic compound, it is preferable to use various polymers that satisfy the above-described conditions. Synthetic polymers such as ring-opening polymerization polymers, polyaddition polymers, polycondensation polymers, vinyl polymerization polymers, polysaccharides (cellulose, amylose) Natural polymers such as amylopectin, chitosan, chitin, aramid fiber, etc.), lipids (phospholipid, glycolipid, cholesterol, etc.) and various polypeptides (collagen etc.).
Non-vinyl polymerization polymers such as ring-opening polymerization polymers, polyaddition polymers, and polycondensation polymers include urethane resins, urea resins, polyamide resins, polyimide resins, epoxy resins, silicone resins, polyester resins, polyether resins, etc. Is mentioned.
A vinyl polymerization polymer is a polymer having a monomer having a vinyl group as a constituent unit, and is a cyano group-containing vinyl monomer, (meth) acrylate (acrylic resin), carboxyl group-containing vinyl monomer, aromatic vinyl hydrocarbon, aliphatic vinyl. Hydrocarbons, alicyclic vinyl hydrocarbons, (meth) acrylamides, vinyl sulfonic acids, vinyl ketones, polyfunctional monomers, fluorine monomers, and the like can be used as structural units.
When the spherical particles (P) described later are used as a constituent material for photonic crystals, polystyrene, polymethyl methacrylate, copolymers of these constituent monomers with carboxyl group-containing vinyl monomers, polyfunctional monomers, etc. are exclusively used. Is used. Commercially available monodisperse polystyrene-based fine particles can also be used.
無機化合物としては、天然物、天然物の変性物及び合成物（精製物を含む）のいずれも使用することができるが、生産ロットのブレ防止等の観点から、合成物であることが好ましい。例えば、金属化合物や有機物を前駆体とする炭化物等が挙げられる。
金属化合物としては、元素の周期率表において、１族〜１６族の金属酸化物（酸化チタン、酸化ケイ素（シリカ）、酸化亜鉛、酸化アルミニウム、酸化モリブデン、酸化タングステン、酸化バナジウム、及び酸化インジウム等）、金属硫化物（硫化銅、硫化亜鉛、硫化鉛、硫化ニッケル及び硫化白金等）、金属ハロゲン化物（フッ化カルシウム、フッ化スズ及びフッ化カリウム等）、金属炭化物（炭化カルシウム、炭化チタン、炭化鉄及び炭化ナトリウム等）、金属窒化物（窒化アルミニウム、窒化クロム、チッ化ケイ素、窒化ゲルマニウム及び窒化コバルト等）、金属塩（チタン酸塩（チタン酸バリウム、チタン酸マグネシウム、チタン酸カリウム等）、アルミン酸塩（アルミン酸イットリウム（YAG）等）、これらの固溶体（チタン酸ジルコン酸ランタン鉛等）などが挙げられる。
これらのうち、透明性や屈折率、製造容易性などの観点から、金属酸化物が好ましく、特に好ましくは、酸化チタン、ジルコニア、シリカである。市販されている単分散シリカ微粒子を使用することもできる。
As the inorganic compound, any of a natural product, a modified product of a natural product, and a synthetic product (including a purified product) can be used, but a synthetic product is preferable from the viewpoint of preventing a production lot from blurring. For example, a carbide having a metal compound or an organic substance as a precursor can be used.
Examples of the metal compound include group 1 to group 16 metal oxides (titanium oxide, silicon oxide (silica), zinc oxide, aluminum oxide, molybdenum oxide, tungsten oxide, vanadium oxide, indium oxide, etc.) in the periodic table of elements. ), Metal sulfides (such as copper sulfide, zinc sulfide, lead sulfide, nickel sulfide and platinum sulfide), metal halides (such as calcium fluoride, tin fluoride and potassium fluoride), metal carbides (calcium carbide, titanium carbide, Iron carbide and sodium carbide), metal nitride (aluminum nitride, chromium nitride, silicon nitride, germanium nitride, cobalt nitride, etc.), metal salt (titanate (barium titanate, magnesium titanate, potassium titanate, etc.)) , Aluminates (yttrium aluminate (YAG), etc.), solid solutions of these (zirconium titanate) Phosphate lead lanthanum, etc.), and the like.
Of these, metal oxides are preferable from the viewpoint of transparency, refractive index, ease of production, and the like, and titanium oxide, zirconia, and silica are particularly preferable. Commercially available monodispersed silica fine particles can also be used.
フォトニック結晶の作製方法としては、マイクロマニュピュレーター等を使用して構成単位を1個ずつ集積する方法や構成単位として真球状微粒子（P）を使用し、重力や遠心力、毛細管力、液架橋力等により集積する方法が挙げられる。
前者の方法としては、構成単位、具体的には、公知の微細加工技術（リソグラフィー及びエッチング、レーザー加工等）により作製した金属化合物や合成ポリマーからなる柱状体や板状体を電子顕微鏡等で確認しながら1個ずつ集積していく方法が挙げられる。この方法によれば、反射率の極めて高いフォトニック結晶を作製することが可能であるが、生産速度が極めて遅く、産業的に利用できる方法ではない。
Photonic crystals can be produced by using a micro-manipulator or the like to collect the structural units one by one, using spherical particles (P) as the structural unit, gravity, centrifugal force, capillary force, liquid The method of accumulating by the crosslinking power etc. is mentioned.
As the former method, a structural unit, specifically, a columnar body or a plate-like body made of a metal compound or a synthetic polymer prepared by a known fine processing technique (lithography and etching, laser processing, etc.) is confirmed with an electron microscope or the like. One way is to collect them one by one. According to this method, it is possible to produce a photonic crystal having a very high reflectance, but the production speed is extremely slow and it is not a method that can be used industrially.
一方、後者の方法は、電子顕微鏡等で確認しながら集積する必要がなく、集積ドライビングフォースを適切に選択すれば、極めて容易に大量生産することができるため前者の方法よりも好ましい。後者の方法によれば、フォトニック結晶の周期構造は六方最密充填構造及び／又は立方最密充填構造となる。後述のように、ある特定形状のテンプレートを使用する場合には、選択的に立方最密充填構造が得られる。
これら六方最密充填構造及び／又は立方最密充填構造を総称してオパール構造という。
このオパール構造からなるフォトニック結晶を鋳型として、後述の方法において、逆オパール構造のフォトニック結晶を作製することができる。逆オパール構造とは、オパール構造体の間隙に構成材料の前駆体などを充填した後、オパール構造体を取り除くことにより形成される構造であり、オパール構造体をちょうど逆にした構造である。
ここで立方最密充填構造及び六方最密充填構造とは、いずれも最密充填構造であって、充填率は74体積％である。
On the other hand, the latter method is preferable to the former method because it is not necessary to perform accumulation while confirming with an electron microscope or the like, and mass production can be performed very easily if the accumulation driving force is appropriately selected. According to the latter method, the periodic structure of the photonic crystal becomes a hexagonal close-packed structure and / or a cubic close-packed structure. As will be described later, when a template having a specific shape is used, a cubic close-packed structure is selectively obtained.
These hexagonal close-packed structures and / or cubic close-packed structures are collectively referred to as opal structures.
Using the photonic crystal having the opal structure as a template, a photonic crystal having an inverted opal structure can be produced by a method described later. The inverted opal structure is a structure formed by filling a gap between the opal structures with a precursor of a constituent material and the like and then removing the opal structure, and is a structure in which the opal structure is just reversed.
Here, the cubic close-packed structure and the hexagonal close-packed structure are both close-packed structures, and the filling rate is 74% by volume.
立方最密充填構造は、面心立方格子構造とも呼ばれ、正四角形の単位格子の各頂点および各面の中心に粒子が位置し、最稠密面をABCABCABCの順に重ねた構造となっている。
六方最密充填構造は、単位格子を正六角柱で表し、この正六角柱の上面および底面の各角および中心と、六角柱の内部で高さ 1/2 のところに 3 つの粒子が存在する。底面の中心に位置する原子は、底面の角の 6 粒子および上下の各3粒子（計 12 粒子）と接しており、最稠密面をABABABの順に重ねた構造となっている。
また、バルク状の構成材料をレーザーにより直接加工する方法もフォトニック結晶の作製方法として挙げることができる。具体的な方法としては、感光性レジストに短パルスレーザーを照射することによりレーザーを照射した部分のみを選択的に硬化させて周期構造を得る方法（特開2004-126312に記載の方法）などが挙げられる。
The cubic close-packed structure is also called a face-centered cubic lattice structure, and has a structure in which particles are positioned at the vertices of the regular tetragonal unit cell and the center of each surface, and the close-packed surfaces are stacked in the order ABCCABBC.
In the hexagonal close-packed structure, the unit cell is represented by a regular hexagonal column, and there are three particles at each corner and center of the top and bottom surfaces of this regular hexagonal column and at a height of 1/2 inside the hexagonal column. The atom located in the center of the bottom is in contact with the 6 particles at the corner of the bottom and 3 particles above and below (12 particles in total), and has the structure in which the most dense surfaces are stacked in the order of ABABAB.
A method of directly processing a bulk-shaped constituent material with a laser can also be mentioned as a method for producing a photonic crystal. As a specific method, there is a method of obtaining a periodic structure by selectively curing only a portion irradiated with a laser by irradiating a photosensitive resist with a short pulse laser (a method described in JP-A-2004-126312). Can be mentioned.
真球状微粒子（P）を使用し、重力や遠心力、毛細管力、液架橋力等により集積する方法としては、公知の方法を使用することができる。
真球状微粒子（P）の集積による方法では、蛍光測定の増幅システムとして適用するためのマクロな形状を作り上げることが必要であり、何らかの基板・容器が必要となる。
基板・容器としては、真球状微粒子（P）を規則的に集積できれば種々の形態のものを使用することができ、凹凸のない平面基板、穴や溝が形成された基板、キャピラリー状の容器等を使用することができる。これら基板・容器の形状や大きさにより、得られるフォトニック結晶の形状や大きさが決定される。
基板・容器を構成する材料としては、シリコンやシリカ、石英等の無機化合物からなるものやアクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂などの合成ポリマー等からなるものを使用することができる。基板や容器に集積した状態のままフォトニック結晶を使用して、励起光（L）が基板等を通して照射される場合には、フォトニック結晶の構成材料と同様に、基板等の構成材料も励起光（L）に対して透明性が高いことが好ましい。
As a method of using true spherical fine particles (P) and accumulating by gravity, centrifugal force, capillary force, liquid cross-linking force, etc., known methods can be used.
In the method using accumulation of true spherical fine particles (P), it is necessary to create a macro shape for application as an amplification system for fluorescence measurement, and some kind of substrate / container is required.
As the substrate / container, various shapes can be used as long as the spherical fine particles (P) can be regularly collected, a flat substrate without irregularities, a substrate with holes or grooves, a capillary-like container, etc. Can be used. The shape and size of the obtained photonic crystal are determined by the shape and size of the substrate / container.
As a material constituting the substrate / container, a material made of an inorganic compound such as silicon, silica, or quartz, or a material made of a synthetic polymer such as an acrylic resin, an epoxy resin, or a silicone resin can be used. When excitation light (L) is irradiated through the substrate, etc., using the photonic crystal as it is accumulated in the substrate or container, the component material such as the substrate is excited as well as the component material of the photonic crystal. It is preferable that transparency is high with respect to light (L).
真球状微粒子（P）を集積する方法としては、毛細管力、遠心力をドライビングフォースとして使用する方法が、生産性、均一性、厚膜化などの観点から優れている。液架橋力を使用する方法によれば、平面基板上に真球状微粒子のスラリーを添加して乾燥させるといった簡単な操作により集積させることができるが、均一性の低いフォトニック結晶になりやすいという欠点がある。
毛細管力を使用した集積方法としては、細い管の中の溶媒が管の中を上昇する現象（毛細管現象）を使用する集積方法である。
溶媒が上昇する高さは、溶媒の表面張力、管の濡れ易さ、溶媒の密度等によって決まり、次式により計算することができる。
h= 2Tcosθ/pgr
ここでTは表面張力(N/m)、θは接触角、pは溶媒の密度(kg/m3)、gは重力加速度(m/s2)
、rは管の半径(m)である。
As a method for accumulating the true spherical fine particles (P), a method using a capillary force or a centrifugal force as a driving force is excellent from the viewpoints of productivity, uniformity and thickening. According to the method using the liquid cross-linking force, it can be accumulated by a simple operation such as adding a slurry of spherical particles on a flat substrate and drying it, but it has a drawback that it tends to be a photonic crystal with low uniformity. There is.
An accumulation method using capillary force is an accumulation method using a phenomenon (capillary phenomenon) in which a solvent in a thin tube rises in the tube.
The height at which the solvent rises depends on the surface tension of the solvent, the ease of wetting of the tube, the density of the solvent, and the like, and can be calculated by the following equation.
h = 2Tcosθ / pgr
Where T is the surface tension (N / m), θ is the contact angle, p is the density of the solvent (kg / m 3 ), and g is the acceleration of gravity (m / s2)
, R is the radius (m) of the tube.
溶媒中に分散されている真球状微粒子（P）は溶媒の上昇により一緒に上昇し、管の上から順に集積されていく。真球状粒子（P）の集積は、溶媒が蒸発することにより発生する液架橋力によって最終的に行われるが、毛細管、所謂、キャピラリーの形状制御効果と垂直方向に働きやすい方向の揃った液架橋力ため、均一性の高いフォトニック結晶を作製することが可能な方法である。
この方法に使用できる容器としては、ガラスや石英製のキャピラリーを使用することが好ましく、キャピラリーの断面形状は、円状や四角形状を使用することができる。
具体的な方法としては、キャピラリーを真球状微粒子（P）のスラリーに片端を浸漬するだけである。また、管表面の親疎水性を調整する等集積の条件を最適化することにより、更に均一性の高いフォトニック結晶を作製することができる。
Spherical fine particles (P) dispersed in the solvent rise together with the rise of the solvent and accumulate in order from the top of the tube. Accumulation of spherical particles (P) is finally performed by the liquid cross-linking force generated by the evaporation of the solvent, but the liquid cross-linking in which the capillaries, the so-called capillary shape control effect and the direction that works easily in the vertical direction are aligned. Therefore, it is a method capable of producing a highly uniform photonic crystal.
As a container that can be used in this method, a capillary made of glass or quartz is preferably used, and a circular or square shape can be used as the cross-sectional shape of the capillary.
As a specific method, only one end of the capillary is immersed in a slurry of spherical particles (P). Furthermore, by optimizing the accumulation conditions such as adjusting the hydrophilicity / hydrophobicity of the tube surface, a photonic crystal with higher uniformity can be produced.
遠心力を使用した集積方法は、遠心力を使用することにより、フォトニック結晶の生産効率を高め、更に従来の方法では作製することが困難である均一性の高い周期構造単位の小さなフォトニック結晶を作製することが可能な方法である。例えば、遠心力を10Ｇ加えると、集積速度が10倍となる。また、5000Ｇ程度の強い遠心力を加えると、粒子径が300nm程度の小さな粒子も容易に集積することが可能であり、バイオメディカル分野等の蛍光測定に適した微細なフォトニック結晶を作製することができる。
遠心力とは、遠心力中心から外へと向かう方向の慣性力であり、次式で与えられる。
F = ｍｒω２
ここで、ｍは真球状微粒子（P）の質量、ｒは遠心場の中心から真球状微粒子（P）までの距離、ωは角速度（回転数×2π）である。ｒは、正確には遠心場の中心（遠心機の中心）から真球状微粒子（P）までの距離であるが、粒子は常に移動するので、便宜上遠心機の中心から基板等までの距離として扱う。
使用する遠心力の強さとしては、粒子径や粒子の比重により好ましい強さは異なるが、生産速度向上の観点からは強い方がよい。但し、規則性の高い均一な真球状微粒子（P）の集積体を作製するためには、遠心力の強さだけでなく、処理時間、粒子スラリーの濃度、溶媒の蒸発速度等のパラメーターを最適化する必要がある。
The integration method using centrifugal force increases the production efficiency of photonic crystals by using centrifugal force, and furthermore, photonic crystals with small periodic structural units with high uniformity that are difficult to produce by conventional methods. It is a method that can be manufactured. For example, when a centrifugal force of 10 G is applied, the accumulation speed becomes 10 times. In addition, when a strong centrifugal force of about 5000 G is applied, small particles with a particle size of about 300 nm can be easily collected, and a fine photonic crystal suitable for fluorescence measurement in the biomedical field, etc., should be produced. Can do.
Centrifugal force is an inertial force in the direction from the center of centrifugal force to the outside, and is given by the following equation.
F = mrω 2
Here, m is the mass of the true spherical fine particles (P), r is the distance from the center of the centrifugal field to the true spherical fine particles (P), and ω is the angular velocity (number of rotations × 2π). To be precise, r is the distance from the center of the centrifuge field (centrifugal center) to the spherical particles (P). However, since the particles always move, they are treated as the distance from the center of the centrifuge to the substrate or the like for convenience. .
The strength of the centrifugal force to be used varies depending on the particle diameter and the specific gravity of the particles, but it is better from the viewpoint of improving the production speed. However, in order to produce a highly regular and uniform aggregate of spherical particles (P), not only the strength of the centrifugal force but also parameters such as processing time, particle slurry concentration, and solvent evaporation rate are optimal. It is necessary to make it.
前述方法により作製したオパール構造のフォトニック結晶を鋳型として、逆オパール構造のフォトニック結晶を作製することができる。ポリスチレン微粒子を集積したオパール構造を鋳型として、酸化チタンを構成材料する逆オパール構造のフォトニック結晶を作製する方法を以下に説明する。
ポリスチレン微粒子を集積したオパール構造体の間隙に酸化チタンの前駆体であるエタノール、チタニウムテトライソプロポキシド、少量の水から作成されたチタニアゾルを充填し、エタノール及び水を乾燥除去した後、ポリスチレン微粒子を除去することにより酸化チタンからなる逆オパール構造体を作製することができる。ポリスチレン微粒子の除去方法としては、400〜500℃程度に加熱してポリスチレン微粒子を熱分解してガス化する方法やトルエンやジメチルスルホキシド等の有機溶剤を使用して溶解除去する方法が挙げられる。酸化チタンを構成材料する逆オパール構造のフォトニック結晶は、焼成温度を高くすることにより屈折率を高めることができ、５００℃で焼成すれば、２．５程度の屈折率となり、９００℃で焼成すれば、２．８程度の屈折率が得られる。これは、酸化チタンの結晶構造が、アモルファス、アナターゼ、ルチルと変化するためである。
A photonic crystal having an inverse opal structure can be produced using the photonic crystal having an opal structure produced by the above method as a template. A method for producing a photonic crystal having an inverted opal structure using titanium oxide as a material by using an opal structure in which polystyrene fine particles are accumulated as a template will be described below.
Fill the gap between the opal structure with the polystyrene fine particles accumulated with the titanium oxide precursor ethanol, titanium tetraisopropoxide, and a titania sol made from a small amount of water, dry the ethanol and water and remove the polystyrene fine particles. By removing it, an inverted opal structure made of titanium oxide can be produced. Examples of the method for removing the polystyrene fine particles include a method of pyrolyzing the polystyrene fine particles by heating to about 400 to 500 ° C. and a method of dissolving and removing them using an organic solvent such as toluene and dimethyl sulfoxide. Inverse opal structure photonic crystals that constitute titanium oxide can increase the refractive index by raising the firing temperature. If fired at 500 ° C., the refractive index becomes about 2.5, and fired at 900 ° C. Then, a refractive index of about 2.8 can be obtained. This is because the crystal structure of titanium oxide changes from amorphous to anatase and rutile.
一方、シリカ微粒子を集積したオパール構造のフォトニック結晶を鋳型として、ポリスチレンを構成材料とする逆オパール構造のフォトニック結晶を作製することもできる。シリカ微粒子を使用したオパール構造体の間隙に構成材料の原料であるスチレンモノマー及び重合開始剤を充填し、加熱することによりスチレンを重合しポリマー化した後、シリカ微粒子を除去することによりポリスチレンからなる逆オパール構造体を作製することができる。シリカ微粒子の除去方法としては、フッ酸に浸漬してシリカ微粒子を溶解除去する方法が挙げられる。 On the other hand, a photonic crystal having an inverted opal structure using polystyrene as a constituent material can be produced using a photonic crystal having an opal structure in which silica fine particles are integrated as a template. It is made of polystyrene by filling the gap of the opal structure using silica fine particles with the styrene monomer and polymerization initiator which are raw materials of the constituent materials, polymerizing styrene by heating and polymerizing, and then removing the silica fine particles An inverse opal structure can be produced. Examples of the method for removing the silica fine particles include a method in which the silica fine particles are dissolved and removed by immersion in hydrofluoric acid.
フォトニック結晶により、励起光（Ｌ）を反射反復するとは、前述の電磁波をフォトニック結晶内部で閉じ込めることを意味し、励起光（Ｌ）は電磁波であるから、フォトニック結晶内部で反射反復して閉じ込められることになる。
励起光が反射反復して閉じ込められることにより、フォトニック結晶の空隙部に存在する蛍光物質との衝突頻度が飛躍的に向上して、蛍光シグナルの大幅な増幅が可能となる。
励起光の反射反復、即ち、閉じ込め効果は、励起光（L）波長におけるフォトニック結晶の反射率、フォトニック結晶の厚みなどに依存する。フォトニック結晶の反射率としては、フォトニック結晶の構成材料や空隙部に充填される溶媒などの屈折率等によっても多少異なるが、励起光（L）のピーク波長において１０〜８０％であることが好ましく、さらに好ましくは２０〜６０％である。反射率がこの範囲であると、蛍光シグナルの増幅倍率が高くなる傾向にある。また、フォトニック結晶の厚みについても、１０〜１０００μmであることが好ましく、さらに好ましくは５０〜５００μmである。厚みがこの範囲であると、蛍光シグナルの増幅倍率が高くなる傾向にある。
Repetitive reflection of the excitation light (L) by the photonic crystal means that the above-described electromagnetic wave is confined inside the photonic crystal, and since the excitation light (L) is an electromagnetic wave, the reflection is repeated inside the photonic crystal. Will be trapped.
When the excitation light is repeatedly reflected and confined, the collision frequency with the fluorescent substance existing in the void portion of the photonic crystal is remarkably improved, and the fluorescence signal can be greatly amplified.
The reflection repetition of the excitation light, that is, the confinement effect depends on the reflectance of the photonic crystal at the excitation light (L) wavelength, the thickness of the photonic crystal, and the like. The reflectivity of the photonic crystal is 10% to 80% at the peak wavelength of the excitation light (L), although it varies slightly depending on the constituent material of the photonic crystal and the refractive index of the solvent filled in the gap. Is more preferable, and 20 to 60% is more preferable. When the reflectance is within this range, the amplification factor of the fluorescent signal tends to increase. Moreover, it is preferable that it is 10-1000 micrometers also about the thickness of a photonic crystal, More preferably, it is 50-500 micrometers. When the thickness is within this range, the amplification factor of the fluorescent signal tends to increase.
励起光（L）としては、公知の励起光を使用することができ、水銀ランプ、キセノンランプや各種レーザー光（アルゴンイオンレーザー、窒素レーザー等のガスレーザー、半導体レーザー、YAGレーザー等の固体レーザー）が挙げられる。蛍光測定の検出感度向上の観点からは、レーザー光を励起光として使用することが好ましいが、本発明の性質上、如何なる励起光を使用しても同様の増幅倍率をもって蛍光シグナルを増幅することができる。
励起光（L）の波長は、使用する蛍光物質（F）の最大吸収波長によって、また、適用する蛍光測定によって変化するので、種々の領域に対応できるように、フォトニック結晶のフォトニックバンド領域を制御する。一般的には、波長300〜800nmの紫外線、可視光線、近赤外線を使用することが多い。
As the excitation light (L), known excitation light can be used, such as mercury lamps, xenon lamps and various laser beams (gas lasers such as argon ion lasers and nitrogen lasers, solid state lasers such as semiconductor lasers and YAG lasers). Is mentioned. From the viewpoint of improving the detection sensitivity of fluorescence measurement, it is preferable to use laser light as excitation light. However, due to the nature of the present invention, it is possible to amplify a fluorescence signal with the same amplification factor even if any excitation light is used. it can.
The wavelength of the excitation light (L) varies depending on the maximum absorption wavelength of the fluorescent substance (F) used and also depending on the applied fluorescence measurement, so that it can correspond to various regions, the photonic band region of the photonic crystal To control. In general, ultraviolet rays having a wavelength of 300 to 800 nm, visible rays, and near infrared rays are often used.
蛍光シグナルは、公知の蛍光測定装置にて測定することができ、本発明の蛍光シグナル増幅方法は種々の蛍光測定に適用することができる。 The fluorescence signal can be measured with a known fluorescence measuring apparatus, and the fluorescence signal amplification method of the present invention can be applied to various fluorescence measurements.
フォトニック結晶（PC）の励起光（L）の照射部以外の面に、ミラーを設置することができる。ここでミラーとは通常の鏡面体を意味する。ミラーは、反射率が極めて高いものの、反射の原理がブラック反射ではなく表面反射であるため、励起光（Ｌ）の照射部には設置することができない。しかし、励起光（L）の照射部以外の面にミラーを設置すれば、フォトニック結晶を透過した励起光やフォトニック結晶により拡散された励起光をフォトニック結晶中に戻すことができるため、更なる蛍光シグナルの増幅効果が得られる。 A mirror can be installed on a surface other than the irradiation part of the excitation light (L) of the photonic crystal (PC). Here, the mirror means a normal mirror body. Although the mirror has a very high reflectance, it cannot be installed in the excitation light (L) irradiation section because the principle of reflection is not black reflection but surface reflection. However, if a mirror is installed on the surface other than the irradiation part of the excitation light (L), the excitation light transmitted through the photonic crystal and the excitation light diffused by the photonic crystal can be returned to the photonic crystal. A further fluorescent signal amplification effect is obtained.
[実施例]
次に本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明の主旨を逸脱しない限り本発明は実施例に限定されるものではない。なお、特記しない限り部は重量部、％は重量％を意味する。
[Example]
EXAMPLES Next, the present invention will be specifically described with reference to examples. However, the present invention is not limited to the examples without departing from the gist of the present invention. Unless otherwise specified, “part” means “part by weight” and “%” means “% by weight”.
＜フォトニック結晶の作製＞
（1）ポリスチレン微粒子のオパール構造からなるフォトニック結晶（PC-1）
ポリスチレン微粒子の水分散体［積水化学社製、体積平均粒径(以下、ＤＶと記すことがある。)：190nm、Cv：3％以下、固形分濃度：10％］に、厚み30μｍ、長さ50mm、幅5mmの石英製キャピラリー（C1）を30mm浸漬して24時間・室温にて静置した。
24時間後、キャピラリー（C1）を微粒子の水分散体から取出し、90℃にて1時間乾燥させることにより、浸漬した側と反対側の端部に、キャピラリー（C1）内に充填された長さ約1mmのオパール構造型フォトニック結晶（PC-1）が作製できた。
フォトニック結晶（PC-1）は、キャピラリー（C1）の内部壁面に接触して形成されているので、フォトニック結晶（PC-1）の厚みは30μｍ、幅は5mmである。
<Preparation of photonic crystal>
(1) Photonic crystal consisting of opal structure of polystyrene fine particles (PC-1)
Aqueous dispersion of polystyrene particles [manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd., volume average particle diameter (hereinafter sometimes referred to as D V.): 190nm, Cv : 3% or less, solid concentration: 10%, the thickness of 30 [mu] m, the length A quartz capillary (C1) having a thickness of 50 mm and a width of 5 mm was immersed in 30 mm, and allowed to stand at room temperature for 24 hours.
After 24 hours, the capillary (C1) is removed from the aqueous dispersion of fine particles and dried at 90 ° C. for 1 hour to fill the capillary (C1) at the end opposite to the immersed side. An opal structure type photonic crystal (PC-1) of about 1 mm was produced.
Since the photonic crystal (PC-1) is formed in contact with the inner wall surface of the capillary (C1), the photonic crystal (PC-1) has a thickness of 30 μm and a width of 5 mm.
（2）ポリスチレン微粒子のオパール構造からなるフォトニック結晶（PC-2）
石英製キャピラリー（C1）の代わりに、厚み50μｍ、長さ50mm、幅5mmの石英製キャピラリー（C2）を使用する以外は、（PC-1）と同様にして、フォトニック結晶（PC-2）を作製した。
（3）ポリスチレン微粒子のオパール構造からなるフォトニック結晶（PC-3）
石英製キャピラリー（C1）の代わりに、厚み100μｍ、長さ50mm、幅5mmの石英製キャピラリー（C3）を使用する以外は、（PC-1）と同様にして、フォトニック結晶（PC-3）を作製した。
(2) Photonic crystal consisting of opal structure of polystyrene fine particles (PC-2)
Photonic crystal (PC-2) is the same as (PC-1) except that a quartz capillary (C2) with a thickness of 50 μm, length 50 mm, and width 5 mm is used instead of the quartz capillary (C1) Was made.
(3) Photonic crystal (PC-3) consisting of opal structure of polystyrene fine particles
Photonic crystal (PC-3) is the same as (PC-1) except that a quartz capillary (C3) with a thickness of 100 μm, length 50 mm, and width 5 mm is used instead of the quartz capillary (C1) Was made.
（4）ポリスチレン微粒子のオパール構造からなるフォトニック結晶（PC-4）
石英製キャピラリー（C1）の代わりに、厚み300μｍ、長さ50mm、幅5mmの石英製キャピラリー（C4）を使用する以外は、（PC-1）と同様にして、フォトニック結晶（PC-4）を作製した。
（5）ポリスチレン微粒子のオパール構造からなるフォトニック結晶（PC-5）
石英製キャピラリー（C1）の代わりに、厚み500μｍ、長さ50mm、幅5mmの石英製キャピラリー（C5）を使用する以外は、（PC-1）と同様にして、フォトニック結晶（PC-5）を作製した。
(4) Photonic crystal composed of opal structure of polystyrene fine particles (PC-4)
Photonic crystal (PC-4) is the same as (PC-1) except that a quartz capillary (C4) with a thickness of 300 μm, a length of 50 mm, and a width of 5 mm is used instead of the quartz capillary (C1) Was made.
(5) Photonic crystal consisting of opal structure of polystyrene fine particles (PC-5)
Photonic crystal (PC-5) is the same as (PC-1) except that a quartz capillary (C5) with a thickness of 500 μm, a length of 50 mm, and a width of 5 mm is used instead of the quartz capillary (C1). Was made.
（6）ポリスチレン微粒子のオパール構造からなるフォトニック結晶（PC-6）
石英製キャピラリー（C1）の代わりに、厚み1000μｍ、長さ50mm、幅5mmの石英製キャピラリー（C6）を使用する以外は、（PC-1）と同様にして、フォトニック結晶（PC-6）を作製した。
（7）ポリスチレン微粒子のオパール構造からなるフォトニック結晶（PC-7）
ポリスチレン微粒子の水分散体（積水化学社製、体積平均粒径：190nm、Cv：3％以下、固形分濃度：10％）の代わりに、ポリスチレン微粒子の水分散体（積水化学社製、体積平均粒径：220nm、Cv：3％以下、固形分濃度：10％）を使用する以外は、（PC-4）と同様にして、フォトニック結晶（PC-7）を作製した。
(6) Photonic crystal consisting of opal structure of polystyrene fine particles (PC-6)
Photonic crystal (PC-6) is the same as (PC-1) except that a quartz capillary (C6) with a thickness of 1000 μm, a length of 50 mm, and a width of 5 mm is used instead of the quartz capillary (C1). Was made.
(7) Photonic crystal consisting of opal structure of polystyrene fine particles (PC-7)
Instead of an aqueous dispersion of polystyrene fine particles (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd., volume average particle size: 190 nm, Cv: 3% or less, solid content concentration: 10%), an aqueous dispersion of polystyrene fine particles (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd., volume average) A photonic crystal (PC-7) was produced in the same manner as (PC-4) except that particle size: 220 nm, Cv: 3% or less, and solid content concentration: 10%.
（8）シリカ微粒子のオパール構造からなるフォトニック結晶（PC-8）
ポリスチレン微粒子の水分散体（積水化学社製、体積平均粒径：190nm、Cv：3％以下、固形分濃度：10％）の代わりに、シリカ微粒子の水分散体（体積平均粒径：150nm、Cv：7％、固形分濃度：10％）を使用する以外は、（PC-4）と同様にして、フォトニック結晶（PC-8）を作製した。
シリカ微粒子の水分散体は、テトラエトキシシラン100部、エタノール1500部、水400部、メチルアミン30部を混合して密閉攪拌状態において室温で24時間反応させることによりシリカ微粒子を合成し、遠心分離・溶媒置換を行うことにより作製した。
（9）シリカ微粒子のオパール構造からなるフォトニック結晶（PC-9）
シリカ微粒子の水分散体（体積平均粒径：150nm、Cv：7％、固形分濃度：10％）の代わりに、シリカ微粒子の水分散体（体積平均粒径：160nm、Cv：7％、固形分濃度：10％）を使用する以外は、（PC-8）と同様にして、フォトニック結晶（PC-9）を作製した。
シリカ微粒子の水分散体は、テトラエトキシシラン100部、エタノール1500部、水500部、メチルアミン35部を混合して密閉攪拌状態において室温で24時間反応させることによりシリカ微粒子を合成し、遠心分離・溶媒置換を行うことにより作製した。
(8) Photonic crystal composed of opal structure of silica fine particles (PC-8)
Instead of an aqueous dispersion of polystyrene fine particles (Sekisui Chemical Co., Ltd., volume average particle size: 190 nm, Cv: 3% or less, solid content concentration: 10%), an aqueous dispersion of silica fine particles (volume average particle size: 150 nm, A photonic crystal (PC-8) was produced in the same manner as (PC-4) except that Cv: 7% and solid content concentration: 10% were used.
Silica fine particles in water dispersion were prepared by mixing 100 parts of tetraethoxysilane, 1500 parts of ethanol, 400 parts of water, and 30 parts of methylamine and synthesizing silica fine particles by reacting them at room temperature for 24 hours in a closed stirring state. -Prepared by solvent replacement.
(9) Photonic crystal composed of opal structure of silica fine particles (PC-9)
Silica fine particle water dispersion (volume average particle size: 160 nm, Cv: 7%, solid) instead of silica fine particle water dispersion (volume average particle size: 150 nm, Cv: 7%, solid content concentration: 10%) A photonic crystal (PC-9) was produced in the same manner as (PC-8) except that the partial concentration was 10%.
Silica fine particles in water dispersion were prepared by mixing 100 parts of tetraethoxysilane, 1500 parts of ethanol, 500 parts of water, and 35 parts of methylamine and synthesizing silica fine particles by reacting at room temperature for 24 hours in a closed stirring state. -Prepared by solvent replacement.
（10）酸化チタンの逆オパール構造からなるフォトニック結晶（PC-10）
ポリスチレン微粒子の水分散体（積水化学社製、体積平均粒径(以下、ＤＶと記すことがある。)：260nm、Cv：3％以下、固形分濃度：10％）を、カバーガラス上に滴下して60℃にて静置することにより、直径約1ｃｍ、厚み100μｍのオパール構造型フォトニック結晶（PC-10Ｂ）を作製した。厚みは渦電流膜厚計ＥＤＹ-1000（サンコウ電子社製）にて測定した。
オパール構造体（PC-10Ｂ）の間隙に酸化チタンの前駆体であるエタノール、チタニウムテトライソプロポキシド、水及び塩酸から作成されたチタニアゾルを充填し、エタノール及び水を乾燥除去した後、500℃にて焼成することによりポリスチレン微粒子を熱分解除去して、酸化チタンからなる逆オパール構造のフォトニック結晶（ＰＣ-10）を得た。フォトニック結晶の大きさは、直径約1ｃｍ、厚み20μｍであった。
（11）酸化チタンの逆オパール構造からなるフォトニック結晶（PC-11）
ポリスチレン微粒子の水分散体（積水化学社製、体積平均粒径：260nm、Cv：3％以下、固形分濃度：10％）の代わりに、ポリスチレン微粒子の水分散体（積水化学社製、体積平均粒径：280nm、Cv：3％以下、固形分濃度：10％）を使用する以外は、（PC-10）と同様にして、フォトニック結晶（PC-11）を作製した。
(10) Photonic crystal composed of inverse opal structure of titanium oxide (PC-10)
Aqueous dispersion of polystyrene particles (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd., volume average particle diameter (hereinafter, sometimes referred to as D V):. 260nm, Cv : 3% or less, solid concentration: 10%) and on the cover glass By dropping and standing at 60 ° C., an opal structure type photonic crystal (PC-10B) having a diameter of about 1 cm and a thickness of 100 μm was produced. The thickness was measured with an eddy current film thickness meter EDY-1000 (manufactured by Sanko Electronics Co., Ltd.).
The gap between the opal structures (PC-10B) was filled with titania sol made from titanium oxide precursor ethanol, titanium tetraisopropoxide, water and hydrochloric acid. The polystyrene fine particles were thermally decomposed and removed by firing to obtain a photonic crystal (PC-10) having an inverse opal structure made of titanium oxide. The size of the photonic crystal was about 1 cm in diameter and 20 μm in thickness.
(11) Photonic crystal composed of inverse opal structure of titanium oxide (PC-11)
Instead of an aqueous dispersion of polystyrene fine particles (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd., volume average particle diameter: 260 nm, Cv: 3% or less, solid content concentration: 10%), an aqueous dispersion of polystyrene fine particles (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd., volume average) A photonic crystal (PC-11) was produced in the same manner as (PC-10) except that the particle size was 280 nm, Cv was 3% or less, and the solid content concentration was 10%.
＜フォトニック結晶の反射スペクトル（反射率）の測定＞
正立顕微鏡ＢＸ51（オリンパス社製）及び、分光器ＰＭＡ-11（浜松ホトニクス社製）を使用して反射スペクトルの測定を行った。反射率（％）は、金板をブランクとして算出した。
反射スペクトル波長が400nm以下のフォトニック結晶については、絶対反射率測定装置ARMV-734（日本分光社製、紫外可視近赤外分光光度計V600に設置して使用）を使用して反射スペクトルの測定を行い、反射率（％）は絶対率で表示した。
<Measurement of reflection spectrum (reflectance) of photonic crystal>
The reflection spectrum was measured using an upright microscope BX51 (manufactured by Olympus) and a spectroscope PMA-11 (manufactured by Hamamatsu Photonics). The reflectance (%) was calculated using a metal plate as a blank.
For photonic crystals with a reflection spectrum wavelength of 400 nm or less, use the absolute reflectance measurement device ARMV-734 (manufactured by JASCO Corporation, installed in the UV-visible near-infrared spectrophotometer V600) to measure the reflection spectrum. The reflectance (%) was displayed as an absolute rate.
＜蛍光シグナル増幅倍率の評価＞
励起光源として、アルゴンイオンレーザー（スペクトラフィジックス社製）を使用して蛍光シグナルの測定を行った。該アルゴンイオンレーザーは、ピーク波長457、476、488、496、514nmの発振が可能である。
実施例９〜12については、水銀ランプ（ウシオ社製）及びカットフィルターを使用してピーク波長を365nmに設定した。
ブランクは、オパール構造型フォトニック結晶については、比較するフォトニック結晶と同一の厚みを有する石英製キャピラリーに、蛍光物質濃度が同一である蛍光試薬を充填したものとした。逆オパール構造型フォトニック結晶については、2枚のカバーガラス（マツナミ社製、No2）の間にシリコングリスを挟んで比較するフォトニック結晶と同一の厚みに調整したものに、蛍光物質濃度が同一である蛍光試薬を充填したものとした。
蛍光シグナルの増幅倍率は、「フォトニック結晶サンプルでの蛍光シグナルのピーク強度／ブランクシグナルのピーク強度」であり、蛍光分子数基準で表した。
蛍光シグナルの検出器には、ＳＰＥＣ-10（プリンストンインスツルメンツ社製）を使用した。
<Evaluation of fluorescence signal amplification factor>
The fluorescence signal was measured using an argon ion laser (Spectra Physics) as an excitation light source. The argon ion laser can oscillate with peak wavelengths of 457, 476, 488, 496, and 514 nm.
For Examples 9 to 12, the peak wavelength was set to 365 nm using a mercury lamp (USHIO Inc.) and a cut filter.
As for the blank, as for the opal structure type photonic crystal, a quartz capillary having the same thickness as the photonic crystal to be compared was filled with a fluorescent reagent having the same fluorescent substance concentration. The inverted opal structure type photonic crystal has the same fluorescent substance concentration as that of the photonic crystal to be compared with silicon grease sandwiched between two cover glasses (Matsunami, No. 2). It was assumed to be filled with a fluorescent reagent.
The amplification factor of the fluorescent signal is “peak intensity of the fluorescent signal in the photonic crystal sample / peak intensity of the blank signal” and is expressed on the basis of the number of fluorescent molecules.
SPEC-10 (Princeton Instruments) was used as a fluorescence signal detector.
＜実施例1＞
石英製キャピラリー（C1）内に作製されたフォトニック結晶（PC-1）の空隙部に、10-4Ｍの濃度に調整したローダミンＢのエチレングリコール溶液を充填して、反射スペクトルの測定及び蛍光シグナルの測定を行った。
反射スペクトルのピーク波長は460nm、反射率は40％であった。
励起光源は、アルゴンイオンレーザー（ピーク波長457nm、スペクトラフィジックス社製）を使用し、励起光のピーク波長におけるフォトニック結晶（PC-1）の反射率は40％であった。
キャピラリー（C1）に、10-4Ｍの濃度に調整したローダミンＢのエチレングリコール溶液のみを充填したものをブランクとして、該ブランクに対する蛍光シグナルの増幅倍率を評価したところ、蛍光分子数基準で10倍の増幅倍率を確認した。
<Example 1>
The void portion of the photonic crystal (PC-1) prepared in the quartz capillary (C1) is filled with an ethylene glycol solution of rhodamine B adjusted to a concentration of 10 -4 M, and the reflection spectrum is measured and fluorescence is measured. Signal measurement was performed.
The peak wavelength of the reflection spectrum was 460 nm, and the reflectance was 40%.
As an excitation light source, an argon ion laser (peak wavelength: 457 nm, manufactured by Spectra Physics) was used, and the reflectance of the photonic crystal (PC-1) at the peak wavelength of the excitation light was 40%.
When a capillary (C1) filled with only an ethylene glycol solution of rhodamine B adjusted to a concentration of 10 −4 M was used as a blank, the amplification factor of the fluorescence signal with respect to the blank was evaluated. The amplification magnification of was confirmed.
＜実施例2＞
フォトニック結晶（PC-1）の代わりに、フォトニック結晶（PC-2）を使用する以外は、実施例1と同様にして、反射スペクトルの測定及び蛍光シグナルの測定を行った。
<Example 2>
A reflection spectrum and a fluorescence signal were measured in the same manner as in Example 1 except that the photonic crystal (PC-2) was used instead of the photonic crystal (PC-1).
＜実施例3＞
フォトニック結晶（PC-1）の代わりに、フォトニック結晶（PC-3）を使用する以外は、実施例1と同様にして、反射スペクトルの測定及び蛍光シグナルの測定を行った。
<Example 3>
A reflection spectrum and a fluorescence signal were measured in the same manner as in Example 1 except that the photonic crystal (PC-3) was used instead of the photonic crystal (PC-1).
＜実施例4＞
フォトニック結晶（PC-1）の代わりに、フォトニック結晶（PC-4）を使用する以外は、実施例1と同様にして、反射スペクトルの測定及び蛍光シグナルの測定を行った。
<Example 4>
A reflection spectrum and a fluorescence signal were measured in the same manner as in Example 1 except that the photonic crystal (PC-4) was used instead of the photonic crystal (PC-1).
＜実施例5＞
フォトニック結晶（PC-1）の代わりに、フォトニック結晶（PC-5）を使用する以外は、実施例1と同様にして、反射スペクトルの測定及び蛍光シグナルの測定を行った。
<Example 5>
A reflection spectrum and a fluorescence signal were measured in the same manner as in Example 1 except that the photonic crystal (PC-5) was used instead of the photonic crystal (PC-1).
＜実施例6＞
フォトニック結晶（PC-1）の代わりに、フォトニック結晶（PC-6）を使用する以外は、実施例1と同様にして、反射スペクトルの測定及び蛍光シグナルの測定を行った。
<Example 6>
A reflection spectrum and a fluorescence signal were measured in the same manner as in Example 1 except that the photonic crystal (PC-6) was used instead of the photonic crystal (PC-1).
＜実施例7＞
励起光波長として、457nmの代わりに、488nmを使用しする以外は、実施例4と同様にして、反射スペクトルの測定及び蛍光シグナルの測定を行った。励起光のピーク波長におけるフォトニック結晶（PC-4）の反射率は10％であった。
<Example 7>
The reflection spectrum and the fluorescence signal were measured in the same manner as in Example 4 except that 488 nm was used instead of 457 nm as the excitation light wavelength. The reflectance of the photonic crystal (PC-4) at the peak wavelength of the excitation light was 10%.
＜実施例8＞
フォトニック結晶（PC-1）の代わりに、フォトニック結晶（PC-7）を使用し、励起光波長として、457nmの代わりに、514nmを使用する以外は、実施例1と同様にして、反射スペクトルの測定及び蛍光シグナルの測定を行った。励起光のピーク波長におけるフォトニック結晶（PC-7）の反射率は10％であった。
<Example 8>
Reflection in the same manner as in Example 1 except that a photonic crystal (PC-7) is used instead of the photonic crystal (PC-1) and 514 nm is used instead of 457 nm as the excitation light wavelength. The spectrum was measured and the fluorescence signal was measured. The reflectance of the photonic crystal (PC-7) at the peak wavelength of the excitation light was 10%.
＜実施例9＞
フォトニック結晶（PC-1）の代わりに、フォトニック結晶（PC-8）を使用し、10-4Ｍの濃度に調整したローダミンＢのエチレングリコール溶液の代わりに、ＬＡＮＣＥcＡＭＰ384Ｋｉｔ（パーキンエルマー社製）を使用する。励起光源としては、アルゴンイオンレーザーの代わりに、水銀ランプ（ウシオ社製、カットフィルターを使用してピーク波長を365nmに設定）を使用する以外は、実施例1と同様にして、反射スペクトルの測定及び蛍光シグナルの測定を行った。励起光のピーク波長におけるフォトニック結晶（PC-8）の反射率は10％であった。
ＬＡＮＣＥcＡＭＰ384Ｋｉｔは、cＡＭＰ-ビオチン-ストレプトアビジンの結合体のストレプトアビジンにドナー蛍光物質であるユーロピウム錯体が標識された試薬（１）と、抗ｃAMP抗体にアクセプター蛍光物質であるAlexaFluor647が標識された試薬（２）、及びスタンダードからなるｃAMPからなるｃAMPを競合法にて測定する試薬である。
試薬（１）と試薬（２）とを混合すると、抗ｃAMP抗体とcＡＭＰが結合して、ユーロピウム錯体とAlexaFluor647の距離が近くなり、この状態において励起光を照射すると、ユーロピウム錯体のみが励起されAlexaFluor647にそのエネルギーが転移してAlexaFluor647の蛍光シグナルが観測される。本実施例では、スタンダードｃAMPは使用せず、試薬（１）と試薬（２）のみを混合して使用し、AlexaFluor647の蛍光シグナルを測定した。
<Example 9>
LANCEcAMP384Kit (manufactured by PerkinElmer), instead of photonic crystal (PC-1), using photonic crystal (PC-8) instead of rhodamine B ethylene glycol solution adjusted to a concentration of 10 -4 M Is used. Measurement of reflection spectrum in the same manner as in Example 1 except that a mercury lamp (made by Ushio Inc., using a cut filter and setting the peak wavelength to 365 nm) is used as the excitation light source. And the fluorescence signal was measured. The reflectance of the photonic crystal (PC-8) at the peak wavelength of the excitation light was 10%.
The LANCE cAMP384 Kit is composed of a reagent (1) in which a europium complex as a donor fluorescent substance is labeled on streptavidin, which is a conjugate of cAMP-biotin-streptavidin, and a reagent in which an anti-cAMP antibody is labeled with an acceptor fluorescent substance in AlexaFluor647 (2 ) And cAMP consisting of cAMP consisting of a standard.
When the reagent (1) and the reagent (2) are mixed, the anti-cAMP antibody and cAMP bind to each other, and the distance between the europium complex and AlexaFluor647 becomes close. When irradiated with excitation light in this state, only the europium complex is excited and AlexaFluor647 The energy is transferred to and the fluorescence signal of AlexaFluor647 is observed. In this example, standard cAMP was not used, and only the reagent (1) and the reagent (2) were mixed and used to measure the fluorescence signal of AlexaFluor647.
＜実施例10＞
水銀ランプ照射面と反対面のキャピラリー（Ｃ4）外壁面に、金製薄板を設置する以外は、実施例9と同様にして、反射スペクトルの測定及び蛍光シグナルの測定を行った。
<Example 10>
The reflection spectrum and the fluorescence signal were measured in the same manner as in Example 9 except that a thin gold plate was installed on the outer wall surface of the capillary (C4) opposite to the mercury lamp irradiation surface.
＜実施例11＞
フォトニック結晶（PC-8）の代わりに、フォトニック結晶（PC-9）を使用する以外は、実施例9と同様にして、反射スペクトルの測定及び蛍光シグナルの測定を行った。
<Example 11>
A reflection spectrum and a fluorescence signal were measured in the same manner as in Example 9 except that the photonic crystal (PC-9) was used instead of the photonic crystal (PC-8).
＜実施例12＞
フォトニック結晶（PC-8）の代わりに、フォトニック結晶（PC-9）を使用する以外は、実施例10と同様にして、反射スペクトルの測定及び蛍光シグナルの測定を行った。
<Example 12>
A reflection spectrum and a fluorescence signal were measured in the same manner as in Example 10 except that the photonic crystal (PC-9) was used instead of the photonic crystal (PC-8).
＜実施例13＞
フォトニック結晶（PC-1）の代わりに、フォトニック結晶（PC-10）を使用する以外は、実施例1と同様にして、反射スペクトルの測定及び蛍光シグナルの測定を行った。
<Example 13>
A reflection spectrum and a fluorescence signal were measured in the same manner as in Example 1 except that the photonic crystal (PC-10) was used instead of the photonic crystal (PC-1).
＜実施例14＞
励起光波長として、457nmの代わりに、514nmを使用する以外は、実施例13と同様にして、反射スペクトルの測定及び蛍光シグナルの測定を行った。
<Example 14>
The reflection spectrum and the fluorescence signal were measured in the same manner as in Example 13 except that 514 nm was used instead of 457 nm as the excitation light wavelength.
＜実施例15＞
フォトニック結晶（PC-1）の代わりに、フォトニック結晶（PC-11）を使用する以外は、実施例1と同様にして、反射スペクトルの測定及び蛍光シグナルの測定を行った。
<Example 15>
A reflection spectrum and a fluorescence signal were measured in the same manner as in Example 1 except that the photonic crystal (PC-11) was used instead of the photonic crystal (PC-1).
＜実施例16＞
励起光波長として、457nmの代わりに、476nmを使用する以外は、実施例15と同様にして、反射スペクトルの測定及び蛍光シグナルの測定を行った。
<Example 16>
A reflection spectrum and a fluorescence signal were measured in the same manner as in Example 15 except that 476 nm was used instead of 457 nm as the excitation light wavelength.
＜実施例17＞
励起光波長として、457nmの代わりに、488nmを使用する以外は、実施例15と同様にして、反射スペクトルの測定及び蛍光シグナルの測定を行った。
<Example 17>
The reflection spectrum and the fluorescence signal were measured in the same manner as in Example 15 except that 488 nm was used instead of 457 nm as the excitation light wavelength.
＜実施例18＞
励起光波長として、457nmの代わりに、496nmを使用する以外は、実施例15と同様にして、反射スペクトルの測定及び蛍光シグナルの測定を行った。
<Example 18>
A reflection spectrum and a fluorescence signal were measured in the same manner as in Example 15 except that 496 nm was used instead of 457 nm as the excitation light wavelength.
＜比較例＞
各実施例において測定しているブランクが比較例となる。
ブランクは、オパール構造型フォトニック結晶については、比較するフォトニック結晶と同一の厚みを有する石英製キャピラリーに、蛍光物質濃度が同一である蛍光試薬を充填したものである。逆オパール構造型フォトニック結晶については、2枚のカバーガラス（マツナミ社製、No2）の間にシリコングリスを挟んで比較するフォトニック結晶と同一の厚みに調整したものに、蛍光物質濃度が同一である蛍光試薬を充填したものである。
蛍光シグナルの増幅倍率は、「フォトニック結晶サンプルでの蛍光シグナルのピーク強度／ブランクシグナルのピーク強度」であることから、本発明の蛍光シグナル増幅方法と従来のフォトニック結晶を用いない方法（ブランク＝比較例）とを比較した値である。
<Comparative example>
A blank measured in each example is a comparative example.
In the blank, for the opal structure type photonic crystal, a quartz capillary having the same thickness as the photonic crystal to be compared is filled with a fluorescent reagent having the same fluorescent substance concentration. The inverted opal structure type photonic crystal has the same fluorescent substance concentration as that of the photonic crystal to be compared with silicon grease sandwiched between two cover glasses (Matsunami, No. 2). Is filled with a fluorescent reagent.
The amplification factor of the fluorescence signal is “peak intensity of the fluorescence signal in the photonic crystal sample / peak intensity of the blank signal”. Therefore, the fluorescence signal amplification method of the present invention and the conventional method using no photonic crystal (blank) = Comparison example).
表1〜4に実施例のサンプル条件及び評価結果を示した。 Tables 1 to 4 show sample conditions and evaluation results of the examples.
いずれの実施例においても、フォトニック結晶を使用することにより、蛍光シグナルが増幅されていることが分かる。
概ね励起光波長におけるフォトニック結晶の反射率が高く、フォトニック結晶の膜厚が厚い方が、増幅倍率が高くなる傾向にある。
フォトニック結晶の厚みが20μｍ程度の薄膜においても、蛍光シグナルの増幅が確認できた。
また、ＬＡＮＣＥcＡＭＰ384Ｋｉｔを使用した場合にも蛍光シグナルが増幅し、本発明の蛍光シグナル増幅方法は、バイオメディカル分野の蛍光測定にも適用できることが分かった。
In any Example, it turns out that the fluorescence signal is amplified by using a photonic crystal.
In general, the higher the reflectance of the photonic crystal at the excitation light wavelength and the thicker the photonic crystal, the higher the amplification factor.
Even in a thin film having a photonic crystal thickness of about 20 μm, amplification of the fluorescence signal was confirmed.
Further, it was found that the fluorescence signal was amplified even when LANCEcAMP 384 Kit was used, and the fluorescence signal amplification method of the present invention was applicable to fluorescence measurement in the biomedical field.
本発明の蛍光シグナル増幅方法は、微量化学物質測定、創薬分野等の研究開発や臨床診断分野において使用される蛍光測定に適用することができ、これら蛍光測定の高感度化を可能にする。 The fluorescence signal amplification method of the present invention can be applied to fluorescence measurement used in research and development in the field of trace chemical substances, drug discovery, etc., and clinical diagnosis, and enables high sensitivity of these fluorescence measurements.
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