JP2008214324A - Micelle-encapsulated liposome - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生体に対して高いドラッグデリバリー機能を有するブロック共重合ミセルをさらに多機能化した、リン脂質二重膜小胞体すなわちリポソームに関する。 The present invention relates to a phospholipid bilayer vesicle, that is, a liposome, which is a multifunctional block copolymer micelle having a high drug delivery function for a living body.
薬物を生体内の標的部位へ送達するための薬物運搬システム（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ、ＤＤＳ）の一つに、親水性セグメントと疎水性セグメントとからなるブロック共重合体（特許文献１、特許文献２）が報告されている。このブロック共重合体は、適当な条件の下で、疎水性セグメントを内側に、親水性セグメントを外側にした高分子ミセルを形成する。 One of drug delivery systems (DDS) for delivering a drug to a target site in a living body is a block copolymer comprising a hydrophilic segment and a hydrophobic segment (
このブロック共重合体ミセルの場合、その原理から、運搬される薬物は疎水性セグメントに物理的に結合することのできる疎水性薬物に限定されるという問題点があった。これに対して、運搬される薬物の範囲等を疎水性薬物からタンパク質や核酸などの生体高分子にまで拡げることを目的として、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとからなるブロック共重合体が開発されている（特許文献３）。このブロック共重合体は、荷電性セグメントの荷電と反対の荷電を有する物質、例えばタンパク質、ペプチドホルモン、核酸、荷電性官能基を有する低分子性薬物などを、荷電性セグメントに静電的に担持することができ、荷電性セグメント及びこれに静電的に結合した化合物を内側に、非荷電性セグメントを外側にした高分子ミセルを形成することができる。 In the case of this block copolymer micelle, the principle is that the drug to be transported is limited to a hydrophobic drug that can physically bind to the hydrophobic segment. On the other hand, block copolymers composed of uncharged segments and charged segments have been developed with the aim of extending the range of drugs to be transported from hydrophobic drugs to biopolymers such as proteins and nucleic acids. (Patent Document 3). This block copolymer electrostatically carries substances having a charge opposite to that of the charged segment, such as proteins, peptide hormones, nucleic acids, and low molecular weight drugs having a charged functional group, on the charged segment. Polymeric micelles can be formed with a charged segment and a compound electrostatically bound thereto and an uncharged segment on the outside.
さらに、上記のブロック共重合体の改良型として、親水性高分子構造部分と高分子カルボン酸部分とを有するブロック共重合体の高分子カルボン酸部分の側鎖であるカルボキシル基に抗癌剤以外の疎水性化合物を結合させる方法（特許文献４）、ブロック共重合体の末端アミノ基を修飾する方法（特許文献５）、アドリアマイシンとの複合体（特許文献６）、疎水性セグメントの側鎖に薬物を結合せしめて疎水性薬理機能セグメントとしたブロック共重合体をミセルとする技術（特許文献７）、荷電性セグメントを改良してｐＫａの低い嵩高い側鎖を有するポリカチオンセグメントとし、ミセルからの薬物（遺伝子）の放出速度やミセルの安定性などを制御可能する技術（特許文献８）も報告されている。上記の改良は、主としてブロック共重合体それ自体の構造等の改変に関するものである。 Further, as an improved type of the above block copolymer, a hydrophobic group other than an anticancer agent is added to the carboxyl group which is a side chain of the polymer carboxylic acid portion of the block copolymer having a hydrophilic polymer structure portion and a polymer carboxylic acid portion. A method of binding an active compound (Patent Document 4), a method of modifying a terminal amino group of a block copolymer (Patent Document 5), a complex with adriamycin (Patent Document 6), a drug on the side chain of a hydrophobic segment A technology that uses a block copolymer that has been combined to form a hydrophobic pharmacological functional segment as a micelle (Patent Document 7), a charged segment is improved to a polycation segment having a bulky side chain with a low pKa, and a drug from the micelle A technique (Patent Document 8) that can control the release rate of (gene) and the stability of micelles has also been reported. The above improvement mainly relates to modification of the structure of the block copolymer itself.
一方、荷電性セグメントと非荷電性セグメントからなるブロック共重合体を、該ブロック共重合体の荷電とは反対の荷電を有するリポソームの表面に静電的に結合させた、ポリマー修飾リポソームが報告されている（特許文献９）。ただし、この技術では、ブロック共重合体のリポソーム表面への結合は静電的に行われる必要がある。これに対して、親水性セグメントを外側とする上記ブロック共重合体からなる高分子ミセルは、全体として電荷を有しないかあるいはごくわずかにしか電荷を有しないことから、荷電を有するリポソームの表面に当該高分子ミセルを静電的に結合させることは難しい。 On the other hand, polymer-modified liposomes have been reported in which a block copolymer consisting of a charged segment and an uncharged segment is electrostatically bound to the surface of a liposome having a charge opposite to that of the block copolymer. (Patent Document 9). However, in this technique, the block copolymer needs to be bound electrostatically to the liposome surface. In contrast, polymer micelles composed of the above block copolymer with the hydrophilic segment on the outside have no charge or very little charge as a whole. It is difficult to electrostatically bind the polymer micelle.
また本発明者らの一部は、核酸などの生体高分子を運搬するＤＤＳ技術として、ポリカチオンとこれに静電的に結合した生体高分子とからなる正に帯電したコンプレックスを負に帯電するＳＵＶ型リポソームで封入する方法を開発した（特許文献１０）。しかしながらこの方法は、封入されるコンプレックスを帯電させ、これとは逆の電荷に帯電させたリポソームを用いて、静電的にコンプレックスをリポソームで被覆しなければならないことから、全体として荷電を有しないかあるいはごくわずかにしか荷電を有しない前記高分子ミセルに対しては適用できない。
本発明は、親水性セグメントと疎水性セグメントとからなるブロック共重合体及び非荷電性セグメントと荷電性セグメントとからなるブロック共重合体のＤＤＳとしての可能性ないし適用範囲を拡大することを目的とするものである。 It is an object of the present invention to expand the possibility or application range as a DDS of a block copolymer comprising a hydrophilic segment and a hydrophobic segment and a block copolymer comprising an uncharged segment and a charged segment. To do.
本発明者らは、それ自体ＤＤＳとして使用される親水性セグメントと疎水性セグメントとからなるブロック共重合体又は非荷電性セグメントと荷電性セグメントとからなるブロック共重合体を含むミセルをさらに脂質膜、特にドラッグデリバリー用機能性素子を表面に有する脂質膜で被覆することにより、飛躍的に両親媒性ブロック共重合体のＤＤＳ機能を高めることができることを見いだし、下記の各発明を完成した。 The present inventors further added a micelle comprising a block copolymer consisting of a hydrophilic segment and a hydrophobic segment, or a block copolymer consisting of an uncharged segment and a charged segment, which is itself used as a DDS. In particular, it was found that the DDS function of an amphiphilic block copolymer can be dramatically improved by coating a functional element for drug delivery with a lipid film on the surface, and the following inventions have been completed.
（１）親水性セグメントと疎水性セグメントを有するブロック共重合体からなるミセル、又は非荷電性セグメント及び荷電性セグメントを有するブロック共重合体と該荷電性セグメントの荷電と反対の荷電を有する化合物との複合体からなるミセルを封入してなる、ミセル封入リポソーム。(1) A micelle comprising a block copolymer having a hydrophilic segment and a hydrophobic segment, or a block copolymer having an uncharged segment and a charged segment, and a compound having a charge opposite to that of the charged segment A micelle-encapsulated liposome encapsulating a micelle composed of the complex.
（２）親水性セグメント及び非荷電性セグメントが、末端が修飾されていてもよいポリアルキレングリコールである、（１）に記載のミセル封入リポソーム。(2) The micelle-encapsulated liposome according to (1), wherein the hydrophilic segment and the uncharged segment are polyalkylene glycols that may be modified at the ends.
（３）疎水性セグメントが側鎖に薬物を結合した疎水性薬理機能セグメントである、（１）に記載のミセル封入リポソーム。(3) The micelle-encapsulated liposome according to (1), wherein the hydrophobic segment is a hydrophobic pharmacological functional segment in which a drug is bonded to a side chain.
（４）荷電性セグメントが、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ＤＥＡＥ−デキストラン、キトサン、ポリエチレンイミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、ポリアリルアミン、ポリビニルヒスチジン、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチルスチレン）、ポリ（メタクリル酸２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）、スペルミンからなる群より選ばれる１種以上のポリカチオンである、（１）に記載のミセル封入リポソーム。(4) The charged segment is polylysine, polyarginine, polyhistidine, DEAE-dextran, chitosan, polyethyleneimine, tetraethylenepentamine, pentaethylenehexamine, polyallylamine, polyvinylhistidine, poly (N, N-dimethylaminomethylstyrene) ), Poly (2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate), and spermine, the micelle-encapsulated liposome according to (1), which is at least one polycation selected from the group consisting of spermine.
（５）荷電性セグメントが、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリリンゴ酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸、オリゴ核酸からなる群より選ばれる１種以上のポリアニオンである、（１）に記載のミセル封入リポソーム。(5) The micelle encapsulation according to (1), wherein the charged segment is at least one polyanion selected from the group consisting of polyaspartic acid, polyglutamic acid, polymalic acid, polymethacrylic acid, polyacrylic acid, and oligonucleic acid. Liposome.
（６）化合物が、荷電性官能基を有する薬物、タンパク質、核酸、多糖類及びそれらの複合体よりなる群から選ばれる一種以上である、（１）に記載のミセル封入リポソーム。(6) The micelle-encapsulated liposome according to (1), wherein the compound is at least one selected from the group consisting of a drug having a charged functional group, a protein, a nucleic acid, a polysaccharide, and a complex thereof.
（７）ドラッグデリバリー用機能性素子を脂質膜表面に有する、（１）〜（６）の何れかに記載のミセル封入リポソーム。(7) The micelle-encapsulated liposome according to any one of (1) to (6), which has a drug delivery functional element on the lipid membrane surface.
（８）ドラッグデリバリー用機能性素子が、細胞膜透過性ペプチド、血中滞留性ポリアルキレングリコール、特異抗体、標的化リガンド、ｐＨ応答性膜融合性ペプチド、トランスサイトーシス誘導性ペプチドよりなる群から選ばれる一種以上である、（７）に記載のミセル封入リポソーム。(8) The functional element for drug delivery is selected from the group consisting of a cell membrane-permeable peptide, a blood-retaining polyalkylene glycol, a specific antibody, a targeting ligand, a pH-responsive membrane-fusogenic peptide, and a transcytosis-inducing peptide The micelle-encapsulated liposome according to (7), which is at least one kind.
本発明のリポソームは、親水性セグメントと疎水性セグメントとからなるブロック共重合体又は非荷電性セグメントと荷電性セグメントとからなるブロック共重合体を含むミセルをさらに脂質膜、特にドラッグデリバリー用機能性素子を表面に有する脂質膜で被覆する構成により、飛躍的に高められた薬物運搬能を有する。 The liposome of the present invention further comprises a micelle comprising a block copolymer composed of a hydrophilic segment and a hydrophobic segment or a block copolymer composed of an uncharged segment and a charged segment, and a lipid membrane, particularly a drug delivery functionality. Due to the structure in which the element is covered with a lipid film on the surface, the drug delivery ability is dramatically improved.
本発明で使用されるブロック共重合体の一つは、親水性セグメントと疎水性セグメントとからなるブロック共重合体であり、その代表例は前記特許文献１に記載されている。また各セグメントの側鎖又は末端に種々の改変が加えられたブロック共重合体や、薬物が物理的又は化学的に結合したブロック共重合体も、本発明で使用することができる。さらに前記特許文献１に記載されたブロック共重合体以外にも、親水性セグメントと疎水性セグメントとからなるブロック共重合体であってミセルを形成することができるものであれば、本発明において利用可能である。以下、親水性セグメントと疎水性セグメントからなるブロック共重合体を「両親媒型ブロック共重合体」と表すことにする。 One of the block copolymers used in the present invention is a block copolymer composed of a hydrophilic segment and a hydrophobic segment, and a typical example thereof is described in
本発明で利用可能な両親媒型ブロック共重合体の基本構造は、前記特許文献１に記載されている通りである。具体的には、親水性のセグメントとしては、例えばポリエチレンオキシド、ポリアルキレンオキシド、ポリリンゴ酸、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリリシン、ポリサッカライド、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリルアミド、ポリメタクリル酸、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、ポリアミノ酸あるいはこれらの誘導体由来のセグメントが挙げられる。また疎水性セグメントとしては、例えばポリ（β−ベンジル Ｌ−アルパルテート）、ポリ（γ−ベンジル Ｌ−グルタメート）、ポリ（β−置換アスパルテート）、ポリ（γ−置換グルタメート）、ポリ（Ｌ−ロイシン）、ポリ（Ｌ−バリン）、ポリ（Ｌ−フェニルアラニン）、疎水性ポリアミノ酸、ポリスチレン、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸アミド、ポリアクリル酸アミド、ポリアミド、ポリエステル、ポリアルキレンオキシド、疎水性のポリオレフィン等を挙げることができる。 The basic structure of the amphiphilic block copolymer usable in the present invention is as described in
上記の親水性セグメントと疎水性セグメントとを有するブロック共重合体の例としては、ポリエチレンオキシド−ポリスチレンブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリブタジエンブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリイソプレンブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリエチレンブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリ（β−ベンジルアスパルテート）ブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリ（γ−ベンジルグルタメート）ブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリ（アラニン）ブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリ（フェニルアラニン）ブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリ（ロイシン）ブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリ（イソロイシン）ブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリ（バリン）ブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリスチレンブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリブタジエンブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリイソプレンブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリプロピレンブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリエチレンブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリ（β−ベンジルアスパルテート）ブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリ（γ−ベンジルグルタメート）ブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリ（アラニン）ブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリ（フェニルアラニン）ブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリ（ロイシン）ブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリ（イソロイシン）ブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリ（バリン）ブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリスチレンブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリブタジエンブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリイソプレンブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリプロピレンブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリエチレンブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリ（β−ベンジルアスパルテート）ブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリ（γ−ベンジルグルタメート）ブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリ（アラニン）ブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリ（フェニルアラニン）ブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリ（ロイシン）ブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリ（イソロイシン）ブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリ（バリン）ブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリスチレンブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリブタジエンブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリイソプレンブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリプロピレンブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレンブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリ（β−ベンジルアスパルテート）ブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリ（γ−ベンジルグルタメート）ブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリ（アラニン）ブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリ（フェニルアラニン）ブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリ（ロイシン）ブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリ（イソロイシン）ブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリ（バリン）ブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリスチレンブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリブタジエンブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリイソプレンブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリプロピレンブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリエチレンブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリ（β−ベンジルアスパルテート）ブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリ（γ−ベンジルグルタメート）ブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリ（アラニン）ブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリ（フェニルアラニン）ブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリ（ロイシン）ブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリ（イソロイシン）ブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリ（バリン）ブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリスチレンブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリブタジエンブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリイソプレンブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリプロピレンブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリエチレンブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリ（β−ベンジルアスパルテート）ブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリ（γ−ベンジルグルタメート）ブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリ（アラニン）ブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリ（フェニルアラニン）ブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリ（ロイシン）ブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリ（イソロイシン）ブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリ（バリン）ブロックコポリマーなどを挙げることができる。 Examples of the block copolymer having the hydrophilic segment and the hydrophobic segment include polyethylene oxide-polystyrene block copolymer, polyethylene oxide-polybutadiene block copolymer, polyethylene oxide-polyisoprene block copolymer, polyethylene oxide-polypropylene block copolymer, Polyethylene oxide-polyethylene block copolymer, polyethylene oxide-poly (β-benzyl aspartate) block copolymer, polyethylene oxide-poly (γ-benzyl glutamate) block copolymer, polyethylene oxide-poly (alanine) block copolymer, polyethylene oxide-poly (phenylalanine) ) Block copolymer, polyethylene oxide-poly (leucine) Block copolymer, polyethylene oxide-poly (isoleucine) block copolymer, polyethylene oxide-poly (valine) block copolymer, polyacrylic acid-polystyrene block copolymer, polyacrylic acid-polybutadiene block copolymer, polyacrylic acid-polyisoprene block copolymer, polyacrylic Acid-polypropylene block copolymer, polyacrylic acid-polyethylene block copolymer, polyacrylic acid-poly (β-benzylaspartate) block copolymer, polyacrylic acid-poly (γ-benzylglutamate) block copolymer, polyacrylic acid-poly (alanine) ) Block copolymer, polyacrylic acid-poly (phenylalanine) block copolymer, polyacrylic acid-poly (leucine) Lock copolymer, polyacrylic acid-poly (isoleucine) block copolymer, polyacrylic acid-poly (valine) block copolymer, polymethacrylic acid-polystyrene block copolymer, polymethacrylic acid-polybutadiene block copolymer, polymethacrylic acid-polyisoprene block copolymer, Polymethacrylic acid-polypropylene block copolymer, polymethacrylic acid-polyethylene block copolymer, polymethacrylic acid-poly (β-benzylaspartate) block copolymer, polymethacrylic acid-poly (γ-benzylglutamate) block copolymer, polymethacrylic acid-poly (Alanine) block copolymer, polymethacrylic acid-poly (phenylalanine) block copolymer, polymethacrylic acid-poly (Leucy) Block copolymer, polymethacrylic acid-poly (isoleucine) block copolymer, polymethacrylic acid-poly (valine) block copolymer, poly (N-vinylpyrrolidone) -polystyrene block copolymer, poly (N-vinylpyrrolidone) -polybutadiene block copolymer Poly (N-vinylpyrrolidone) -polyisoprene block copolymer, poly (N-vinylpyrrolidone) -polypropylene block copolymer, poly (N-vinylpyrrolidone) -polyethylene block copolymer, poly (N-vinylpyrrolidone) -poly (β- Benzyl aspartate) block copolymer, poly (N-vinyl pyrrolidone) -poly (γ-benzyl glutamate) block copolymer, poly (N-vinyl pyrrolidone) -poly (alanine) block Copolymer, poly (N-vinylpyrrolidone) -poly (phenylalanine) block copolymer, poly (N-vinylpyrrolidone) -poly (leucine) block copolymer, poly (N-vinylpyrrolidone) -poly (isoleucine) block copolymer, poly ( N-vinylpyrrolidone) -poly (valine) block copolymer, poly (aspartic acid) -polystyrene block copolymer, poly (aspartic acid) -polybutadiene block copolymer, poly (aspartic acid) -polyisoprene block copolymer, poly (aspartic acid)- Polypropylene block copolymer, poly (aspartic acid) -polyethylene block copolymer, poly (aspartic acid) -poly (β-benzylaspartate) block copolymer, poly (aspara Acid) -poly (γ-benzylglutamate) block copolymer, poly (aspartic acid) -poly (alanine) block copolymer, poly (aspartic acid) -poly (phenylalanine) block copolymer, poly (aspartic acid) -poly (leucine) Block copolymer, poly (aspartic acid) -poly (isoleucine) block copolymer, poly (aspartic acid) -poly (valine) block copolymer, poly (glutamic acid) -polystyrene block copolymer, poly (glutamic acid) -polybutadiene block copolymer, poly (glutamic acid) ) -Polyisoprene block copolymer, poly (glutamic acid) -polypropylene block copolymer, poly (glutamic acid) -polyethylene block copolymer, poly (glutamic acid) Poly (β-benzyl aspartate) block copolymer, poly (glutamic acid) -poly (γ-benzyl glutamate) block copolymer, poly (glutamic acid) -poly (alanine) block copolymer, poly (glutamic acid) -poly (phenylalanine) block copolymer, Examples thereof include poly (glutamic acid) -poly (leucine) block copolymers, poly (glutamic acid) -poly (isoleucine) block copolymers, poly (glutamic acid) -poly (valine) block copolymers, and the like.
上記の各セグメントは、前記特許文献２又は４〜１１に開示されるように、必要に応じて側鎖や末端に置換基を導入した誘導体としてもよい。また両親媒型ブロック共重合体を用いてミセルを形成するには、両親媒型ブロック共重合体を水性溶液中で混合し、必要に応じて透析、攪拌、希釈、濃縮、超音波処理、温度制御、ｐＨ制御、有機溶媒の添加等の操作を適宜行って調製すればよい。 Each of the above segments may be a derivative in which a substituent is introduced into a side chain or a terminal as required, as disclosed in
上記の両親媒型ブロック共重合体で形成されるミセルは、その疎水性の内核に、疎水性薬物を封入することができる。例えばアドリアマイシン、ダウノマイシン、メントレキセート、マイトマイシンＣ等の抗ガン剤、インドメタシン等の鎮痛消炎剤、中枢神経系用薬、末梢神経系用薬、アレルギー用薬、循環器官用薬、呼吸器官用薬、消化器官用薬、ホルモン剤、代謝性医薬品、抗生物質、化学療法剤等の疎水性薬物が挙げられる。本発明における親水性セグメントと疎水性セグメントを有するブロック共重合体からなるミセルには、疎水性の内核に疎水性薬物を封入したミセルも含まれる。ミセルの疎水性核に疎水性薬物を封入する方法は、両親媒型ブロック共重合体と疎水性薬物を水性溶液中で混合し、必要に応じて透析、攪拌、希釈、濃縮、超音波処理、温度制御、ｐＨ制御、有機溶媒の添加等の操作を適宜行って調製すればよい。 The micelle formed with the above amphiphilic block copolymer can encapsulate a hydrophobic drug in its hydrophobic inner core. For example, anticancer drugs such as adriamycin, daunomycin, mentrexate, mitomycin C, analgesic / anti-inflammatory drugs such as indomethacin, drugs for central nervous system, drugs for peripheral nervous system, drugs for allergy, drugs for cardiovascular system, drugs for respiratory organs, Hydrophobic drugs such as gastrointestinal drugs, hormonal drugs, metabolic drugs, antibiotics, and chemotherapeutic agents can be mentioned. The micelle comprising a block copolymer having a hydrophilic segment and a hydrophobic segment in the present invention includes a micelle in which a hydrophobic drug is encapsulated in a hydrophobic inner core. The method of encapsulating the hydrophobic drug in the hydrophobic nucleus of the micelle is to mix the amphiphilic block copolymer and the hydrophobic drug in an aqueous solution, and if necessary, dialyze, stir, dilute, concentrate, sonicate, What is necessary is just to prepare by performing operation, such as temperature control, pH control, and the addition of an organic solvent suitably.
本発明で使用されるブロック共重合体のもう一つは、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとからなるブロック共重合体である。その代表例は、前記特許文献３に記載されている。また各セグメントの側鎖又は末端に種々の改変が加えられたブロック共重合体や、薬物が物理的又は化学的に結合したブロック共重合体も、本発明で使用することができる。さらに前記特許文献３に記載されたブロック共重合体以外にも、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとからなるブロック共重合体であって、該荷電性セグメントの荷電と反対の荷電を有する化合物と結合してミセルを形成することができるものであれば、本発明において利用可能である。以下、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとからなるブロック共重合体を「荷電性ブロック共重合体」と表すことにする。 Another block copolymer used in the present invention is a block copolymer comprising an uncharged segment and a charged segment. A typical example is described in Patent Document 3. In addition, a block copolymer in which various modifications are added to the side chain or terminal of each segment, and a block copolymer in which a drug is physically or chemically bonded can also be used in the present invention. Furthermore, in addition to the block copolymer described in Patent Document 3, a block copolymer comprising an uncharged segment and a charged segment, wherein the compound has a charge opposite to the charge of the charged segment; Anything that can be combined to form a micelle can be used in the present invention. Hereinafter, a block copolymer composed of an uncharged segment and a charged segment will be referred to as a “charged block copolymer”.
本発明で利用可能な「荷電性ブロック共重合体」の各セグメントの種類あるいは構造は、前記特許文献３に記載されているとおりである。具体的には、非荷電性セグメントとしては、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコールの他に、ポリアルキレンオキシド、ポリサッカライド、ポリアクリルアミド、ポリ置換アクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ置換メタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリアミノ酸又はそれらの誘導体等を例示することができる。 また荷電性セグメントとしては、荷電性側鎖を有するポリアミノ酸、具体的にはポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン等の他、ポリリンゴ酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリビニルイミダゾール又はこれらの誘導体等を例示することができる。 The kind or structure of each segment of the “chargeable block copolymer” that can be used in the present invention is as described in Patent Document 3. Specifically, as the uncharged segment, in addition to polyalkylene glycol such as polyethylene glycol and polypropylene glycol, polyalkylene oxide, polysaccharide, polyacrylamide, polysubstituted acrylamide, polymethacrylamide, polysubstituted methacrylamide, polyvinyl Examples include pyrrolidone, polyvinyl alcohol, polyacrylic acid ester, polymethacrylic acid ester, polyamino acid, or derivatives thereof. The charged segments include polyamino acids having charged side chains, specifically polyaspartic acid, polyglutamic acid, polylysine, polyarginine, polyhistidine, and the like, as well as polymalic acid, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, and polyethylene. Examples thereof include imine, polyvinylamine, polyallylamine, polyvinylimidazole, and derivatives thereof.
上記の非荷電性セグメントと荷電性セグメントの好適な組合せとしては、ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体、ポリエチレンオキシド−ポリグルタミン酸ブロック共重合体、ポリエチレングリコール−ポリアルギニンブロック共重合体、ポリエチレングリコール−ポリヒスチジンブロック共重合体、ポリエチレングリコール−ポリメタクリル酸ブロック共重合体、ポリエチレングリコール−ポリエチレンイミンブロック共重合体、ポリエチレングリコール−ポリビニルアミンブロック共重合体、ポリエチレングリコール−ポリアリルアミンブロック共重合体、ポリエチレンオキシド−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体、ポリエチレンオキシド−ポリグルタミン酸ブロック共重合体、ポリエチレンオキシド−ポリリジンブロック共重合体、ポリエチレンオキシド−ポリアクリル酸ブロック共重合体、ポリエチレンオキシド−ポリビニルイミダゾールブロック共重合体、ポリアクリルアミド−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体、ポリアクリルアミド−ポリヒスチジンブロック共重合体、ポリメタクリルアミド−ポリアクリル酸、ポリメタクリルアミド−ポリビニルアミンブロック共重合体、ポリビニルピロリドン−ポリメタクリル酸ブロック共重合体、ポリビニルアルコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体、ポリビニルアルコール−ポリアルギニンブロック共重合体、ポリアクリル酸エステル−ポリグルタミン酸ブロック共重合体、ポリアクリル酸エステル−ポリヒスチジンブロック共重合体、ポリメタクリル酸エステル−ポリビニルアミンブロック共重合体、又はポリメタクリル酸−ポリビニルイミダゾールブロック共重合体等を例示することができる。 Suitable combinations of the uncharged segment and the charged segment include polyethylene glycol-polyaspartic acid block copolymer, polyethylene oxide-polyglutamic acid block copolymer, polyethylene glycol-polyarginine block copolymer, polyethylene glycol. -Polyhistidine block copolymer, polyethylene glycol-polymethacrylic acid block copolymer, polyethylene glycol-polyethyleneimine block copolymer, polyethylene glycol-polyvinylamine block copolymer, polyethylene glycol-polyallylamine block copolymer, poly Ethylene oxide-polyaspartic acid block copolymer, polyethylene oxide-polyglutamic acid block copolymer, polyethylene oxide-polymer Lysine block copolymer, polyethylene oxide-polyacrylic acid block copolymer, polyethylene oxide-polyvinylimidazole block copolymer, polyacrylamide-polyaspartic acid block copolymer, polyacrylamide-polyhistidine block copolymer, polymethacryl Amide-polyacrylic acid, polymethacrylamide-polyvinylamine block copolymer, polyvinylpyrrolidone-polymethacrylic acid block copolymer, polyvinyl alcohol-polyaspartic acid block copolymer, polyvinyl alcohol-polyarginine block copolymer, poly Acrylate ester-polyglutamic acid block copolymer, polyacrylate ester-polyhistidine block copolymer, polymethacrylate ester-polyvinylamino Block copolymer, or polymethacrylic acid - can be exemplified polyvinyl imidazole block copolymer.
上記の各セグメントは、前記特許文献２又は４〜１１に開示されるように、必要に応じて側鎖や末端に置換基を導入した誘導体としてもよい。上記の荷電型ブロック共重合体及びその誘導体の製造法は、特許文献３に記載されている。例えば、ポリエチレングリコール−ポリ（α，β−アスパラギン酸）ブロック共重合体は、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物を、片末端一級アミノ基のポリエチレングリコール（分子量約２００〜２５００００）を開始剤として重合させてポリエチレングリコール−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）ブロック共重合体を合成し、さらにアルカリ処理して脱ベンジル化を行うことによりポリエチレングリコール−ポリ（α，β−アスパラギン酸）ブロック共重合体を得ることができる。また、ポリエチレングリコール−ポリリシンブロック共重合体は、ε−カルボベンゾキシ−Ｌ−リシン無水物を、片末端一級アミノ基のポリエチレングリコール（分子量２００〜２５００００）を開始剤として重合させてポリエチレングリコール−ポリ（ε−カルボベンゾキシ−Ｌ−リシン）ブロック共重合体を合成し、さらにメタンスルホン酸を用いて脱保護反応を行うことで、ポリエチレングリコール−ポリリシンブロック共重合体を得ることができる。 Each of the above segments may be a derivative in which a substituent is introduced into a side chain or a terminal as required, as disclosed in
また、上記の荷電型ブロック共重合体と共にミセルを形成することができる化合物としては、荷電性ブロック共重合体の荷電と反対の荷電を有する化合物であれば特にその種類に限定はないが、タンパク質（ペプチド、オリゴペプチドを含む）、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド等を含む）、分子内に荷電性官能基を有する低分子化合物等を例示することができる。 The compound capable of forming micelles with the above charged block copolymer is not particularly limited as long as it is a compound having a charge opposite to that of the chargeable block copolymer. Examples thereof include peptides (including peptides and oligopeptides), nucleic acids (including DNA, RNA, oligonucleotides, and the like), low molecular compounds having a charged functional group in the molecule, and the like.
これらの化合物と荷電性ブロック共重合体とを用いてミセルを形成するには、荷電性ブロック共重合体と化合物とを水性溶液中で混合し、必要に応じて透析、攪拌、希釈、濃縮、超音波処理、温度制御、ｐＨ制御、有機溶媒の添加等の操作を適宜行って調製すればよい。この様にして形成されるミセルは安定な高分子ミセル構造をとり、その内核に効率よくタンパク質やＤＮＡ等の荷電物質を取り込むことができる。このため、生体内で分解されやすい荷電性薬物を安定化して体内投与することができる。 In order to form micelles using these compounds and the chargeable block copolymer, the chargeable block copolymer and the compound are mixed in an aqueous solution and, if necessary, dialyzed, stirred, diluted, concentrated, It may be prepared by appropriately performing operations such as ultrasonic treatment, temperature control, pH control, addition of an organic solvent, and the like. The micelles thus formed have a stable polymer micelle structure and can efficiently incorporate charged substances such as proteins and DNA into the inner core. For this reason, the chargeable drug which is easily degraded in the living body can be stabilized and administered in the body.
なお、両親媒型ブロック共重合体の親水性セグメントと荷電型ブロック共重合体の非荷電性セグメントは同じ構造となる場合もある。その様な例としてはポリアルキレングリコールであり、特にポリエチレングリコールが、両セグメントとして好ましい。 The hydrophilic segment of the amphiphilic block copolymer and the non-chargeable segment of the charged block copolymer may have the same structure. Such an example is polyalkylene glycol, and particularly polyethylene glycol is preferred as both segments.
上記ブロック共重合体からなるミセルを封入するリポソームを構成するリン脂質は、一般的に用いられている各種のリン脂質であれば、いずれも利用可能である。その具体例としては、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン）、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−スクシニルＰＥ）、ホスファチジルエチレングリコール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン等のリン脂質又はこれらの水素添加物、セファリン、セレブロシド、セラミド、スフィンゴミエリン、ガングリオシド等の糖脂質が挙げられ、これらのうち１種又は２種以上を使用することができる。リン脂質は、卵黄、大豆その他の動植物に由来する天然脂質（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン等）、合成脂質又は半合成脂質のいずれであってもよい。 As the phospholipid constituting the liposome encapsulating the micelle made of the block copolymer, any of various phospholipids generally used can be used. Specific examples thereof include phosphatidylcholine (for example, dioleoylphosphatidylcholine, dilauroylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine), phosphatidylglycerol (for example, dioleoylphosphatidylglycerol, dilauroylphosphatidylglycerol, dilauroylphosphatidylcholine, Myristoylphosphatidylglycerol, dipalmitoylphosphatidylglycerol, distearoylphosphatidylglycerol), phosphatidylethanolamine (eg dioleoylphosphatidylethanolamine, dilauroylphosphatidylethanolamine, dimyristoylphosphatidylethanolamine, dipalmitoylphosphine Phospholipids such as thidylethanolamine, distearoylphosphatidiethanolamine), N-succinylphosphatidylethanolamine (N-succinyl PE), phosphatidylethylene glycol, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidic acid, cardiolipin, or hydrogenated products thereof, Examples include glycolipids such as cephalin, cerebroside, ceramide, sphingomyelin, ganglioside, and one or more of these can be used. The phospholipid may be egg yolk, soybean or other natural lipid derived from animals and plants (eg, egg yolk lecithin, soybean lecithin, etc.), synthetic lipid or semi-synthetic lipid.
本発明のリポソームには、脂質二重層の構成脂質としてカチオン性脂質を必要に応じて含ませることもできる。カチオン性脂質としては、例えば、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロライド（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＤＯＤＡＣ）、Ｎ−（２，３−オレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（Ｎ−（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ、ＤＯＴＭＡ）、ジドデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｄｏｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ、ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＡＰ）、３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモールコレステロール（３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）−ｃａｒｂａｍｏｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ、ＤＭＲ ＩＥ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ−Ｎ−［２（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｕｍ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、ＤＯＳＰＡ）等が挙げられる。特にＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰの利用が好ましい。これらのカチオン性脂質を含むリポソームは、自己融合性、すなわち互いに接触したリポソーム同士が自発的に膜融合してより大きなサイズのリポソームへと変化する性質）を有しており、前記のブロック共重合体からなるミセルを封入したリポソームの調製において特に有利である。 The liposome of the present invention can contain a cationic lipid as a constituent lipid of the lipid bilayer as necessary. Examples of the cationic lipid include dioctadecyldimethylammonium chloride (DODAC), N- (2,3-oleyloxy) propyl-N, N, N-trimethylammonium (N- (2,3-dioyloxy)). (propyl-N, N, N-trimethylammonium, DOTMA), didodecylammonium bromide (DDAB), 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium dopamine AP), dododecylammonium bromide (DDAB) 3β-N- (N ′, N′-dimethylaminoethane) carbamol Lesterol (3β-N- (N ′, N ′,-dimethyl-aminoethane) -carbamol cholesterol, DC-Chol), 1,2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammonium (1,2-dimyristoypropylpropyl-3 -Dimethylhydroxyl ammonium (DMR IE), 2,3-dioleyloxy-N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propaneammonium trifluoroacetate (2,3-dioyloxy-N- [ 2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propanamine trifluoracet te, DOSPA), and the like. In particular, use of DOPE or DOTAP is preferable. Liposomes containing these cationic lipids have the ability to self-fuse, that is, the liposomes in contact with each other spontaneously undergo membrane fusion and change into larger sized liposomes). This is particularly advantageous in the preparation of liposomes encapsulating micelles composed of coalescence.
また、リポソームの脂質二重層には、脂質二重層を物理的又は化学的に安定させたり、膜の流動性を調節したりするために、例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール等の動物由来のステロール、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等の植物由来のステロール（フィトステロール）、チモステロール、エルゴステロール等の微生物由来のステロール、グリセロール、シュクロース等の糖類、トリオレイン、トリオクタノイン等のグリセリン脂肪酸エステルのうち、１種又は２種以上を含有させることができる。その含有量は特に限定されるものでないが、脂質二重層を構成する総脂質に対して５〜４０％（モル比）であることが好ましく、１０〜３０％（モル比）であることがさらに好ましい。 In addition, the lipid bilayer of the liposome includes, for example, cholesterol, cholesterol succinic acid, lanosterol, dihydrolanosterol, desmolysate, in order to physically or chemically stabilize the lipid bilayer and to regulate the fluidity of the membrane. Sterols derived from animals such as sterols, dihydrocholesterol, sterols derived from plants such as stigmasterol, sitosterol, campesterol, brassicasterol (phytosterols), sterols derived from microorganisms such as tymosterol, ergosterol, glycerol, sucrose, etc. 1 type (s) or 2 or more types can be contained among glycerol fatty acid esters, such as saccharides, triolein, and trioctanoin. The content is not particularly limited, but is preferably 5 to 40% (molar ratio), more preferably 10 to 30% (molar ratio) with respect to the total lipid constituting the lipid bilayer. preferable.
さらに、リポソームの脂質二重層には、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等の抗酸化剤、ステアリルアミン、オレイルアミン等の正荷電を付与する荷電物質、ジセチルホスフェート等の負電荷を付与する荷電物質、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質等の膜タンパク質を含有させることができ、その含有量は適宜調節することができる。 In addition, the lipid bilayer of the liposome contains antioxidants such as tocopherol, propyl gallate, ascorbyl palmitate, butylated hydroxytoluene, charged substances such as stearylamine and oleylamine, and negative substances such as dicetyl phosphate. Membrane proteins such as charged substances that impart electric charge, membrane surface proteins, and integral membrane proteins can be contained, and the content can be adjusted as appropriate.
また、本発明のリポソームには、例えばポリアルギニンペプチド（国際特許出願公開第ＷＯ２００５／０３２５９３号パンフレット）などの細胞膜透過性ペプチド、血中滞留性ポリアルキレングリコール（Ｔｈｅｒｅｓａ Ｍ．Ａｌｌｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ誌 １５巻、第２１５−２２０頁、１９９４年）、ＧＡＬＡペプチド（国際特許出願公開第ＷＯ２００５−０３２５９３号パンフレット）などのｐＨ応答性膜融合性ペプチド、トランスサイトーシス誘導性ペプチド（特許出願番号２００６−１７９９５５）、特異抗体、標的化リガンドその他のドラッグデリバリー用機能性素子を、それぞれ公知の方法に従って含ませてもよい。 In addition, the liposome of the present invention includes, for example, a cell membrane permeable peptide such as polyarginine peptide (International Patent Application Publication No. WO2005 / 032593), blood-retaining polyalkylene glycol (Theresa M. Allen, Trends Pharmaceutical Science 15). 215-220 (1994), pH-responsive membrane-fusogenic peptides such as GALA peptide (International Patent Application Publication No. WO2005-032593), transcytosis-inducing peptide (Patent Application No. 2006-179955) , Specific antibodies, targeting ligands and other functional elements for drug delivery may be included according to known methods.
本発明のリポソームは、前記ブロック共重合体からなるミセルを脂質層で封入することにより調製される。リポソームの調製法としては、例えば、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法等の公知の方法を用いて作製することができる。例えば水和法の場合、脂質二重層の構成成分である脂質を有機溶剤に溶解し、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得た後、脂質膜を前記ブロック共重合体からなるミセルを含む水性溶媒で水和させ、攪拌又は超音波処理することにより、製造することができる。また、脂質二重層の構成成分である脂質を有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得、この脂質膜を前記ブロック共重合体からなるミセルを含む水性溶媒で水和させ、攪拌又は超音波処理することによりリポソームを製造する。必要に応じて、ドラッグデリバリー用機能性素子を有機溶媒に添加する、あるいはリポソームを含む外液にドラッグデリバリー用機能性素子を添加することにより、リポソームにドラッグデリバリー用機能性素子を導入することができる。 The liposome of the present invention is prepared by encapsulating the micelle made of the block copolymer with a lipid layer. As a method for preparing the liposome, for example, it is prepared using a known method such as a hydration method, an ultrasonic treatment method, an ethanol injection method, an ether injection method, a reverse phase evaporation method, a surfactant method, or a freezing / thawing method. be able to. For example, in the case of the hydration method, a lipid membrane, which is a constituent component of the lipid bilayer, is dissolved in an organic solvent, and the organic solvent is evaporated and removed to obtain a lipid membrane. It can be produced by hydrating with an aqueous solvent containing, stirring or sonicating. In addition, after dissolving the lipid, which is a component of the lipid bilayer, in an organic solvent, the organic solvent is evaporated and removed to obtain a lipid membrane, and the lipid membrane is washed with an aqueous solvent containing micelles composed of the block copolymer. Liposomes are produced by mixing and stirring or sonication. If necessary, the functional element for drug delivery can be introduced into the liposome by adding the functional element for drug delivery to an organic solvent, or by adding the functional element for drug delivery to an external solution containing liposomes. it can.
上記の方法において、有機溶媒として、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン等の炭化水素類、塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類、メタノール、エタノール等の低級アルコール類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、アセトン等のケトン類等を、単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。 In the above method, as the organic solvent, for example, hydrocarbons such as pentane, hexane, heptane and cyclohexane, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene, methanol, ethanol Lower alcohols such as methyl acetate, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, ketones such as acetone and the like can be used alone or in combination of two or more.
また、所定のポアサイズのフィルターを通過させることにより、一定の粒度分布を持ったリポソームを得ることができる。また、公知の方法に従って、多重膜リポソームから一枚膜リポソームへの転換、一枚膜リポソームから多重膜リポソームへの転換を行うことができる。 Moreover, a liposome having a certain particle size distribution can be obtained by passing through a filter having a predetermined pore size. Further, according to a known method, conversion from multilamellar liposomes to single membrane liposomes and conversion from single membrane liposomes to multilamellar liposomes can be performed.
また、本発明のリポソームは、前記のブロック共重合体からなるミセルに予め調製したリポソーム（前記ミセルは封入されていない）を加え、リポソーム間の膜融合を誘導してミセルを封入する方法によっても製造することができる。この方法の場合、予め調製されるリポソームには、脂質膜に膜融合性脂質（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１９６０１）を含有させ、自己融合性を持たせておくことが好ましい。あるいは膜融合性脂質を含有させる方法以外のリポソーム間の膜融合を促す種々の公知の方法を、当該予め調製されるリポソームに適用してもよい。リポソーム間の膜融合を促す種々の公知の方法としては、溶液のｐＨを変化させることで膜融合を促す方法やＣａ２＋などのイオンを加えて膜融合を誘導する方法等を挙げることができる。この方法では、リポソームでミセルを取り囲むことが必要であり、ミセルに対して過剰量の予め調製したリポソームを加える、特にミセル１容量に対して予め調製したリポソームを２容量以上、さらには９容量以上加えることが好ましい。In addition, the liposome of the present invention can be obtained by adding a previously prepared liposome to the micelle comprising the block copolymer (the micelle is not encapsulated), and inducing membrane fusion between the liposomes to encapsulate the micelle. Can be manufactured. In the case of this method, it is preferable that a liposome prepared in advance contains a membrane-fusible lipid (International Patent Application No. PCT / JP2006 / 319601) in a lipid membrane and has self-fusibility. Alternatively, various known methods for promoting membrane fusion between liposomes other than the method of containing a membrane-fusible lipid may be applied to the liposome prepared in advance. Various known methods for promoting membrane fusion between liposomes include a method for promoting membrane fusion by changing the pH of the solution, a method for inducing membrane fusion by adding ions such as Ca 2+, and the like. In this method, it is necessary to surround the micelles with liposomes, and an excessive amount of previously prepared liposomes is added to the micelles, particularly 2 volumes or more of liposomes prepared beforehand for 1 volume of micelles, and more than 9 volumes. It is preferable to add.
また、互いに親和性を示す一組の化学物質、例えばビオチンとアビジンや抗原と特異抗体などを、ミセルを形成するブロック共重合体の親水性セグメント又は非荷電性セグメントの側鎖又は末端と、予め調製されるリポソームの表面に、それらの間で対を形成するように結合させておき、当該化学物質の親和性を利用してミセルをリポソームで取り囲んでもよい。 In addition, a set of chemical substances showing affinity for each other, for example, biotin and avidin, antigen and specific antibody, etc., are added in advance to the side chain or terminal of the hydrophilic segment or uncharged segment of the block copolymer forming the micelle. The prepared micelles may be bound to form a pair between them, and the micelles may be surrounded by the liposomes using the affinity of the chemical substance.
本発明のリポソームは、例えば、分散液の状態で使用することができる。分散溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液，酢酸緩衝液等の緩衝液を使用することができる。分散液には、例えば、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤等の添加剤を添加して使用してもよい。 The liposome of the present invention can be used, for example, in the form of a dispersion. As the dispersion solvent, for example, a buffer solution such as physiological saline, phosphate buffer, citrate buffer, and acetate buffer can be used. For example, additives such as sugars, polyhydric alcohols, water-soluble polymers, nonionic surfactants, antioxidants, pH regulators, hydration accelerators may be added to the dispersion.
本発明のリポソームは、分散液を乾燥（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥等）させた状態で使用することもできる。乾燥させたリポソームは、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液，酢酸緩衝液等の緩衝液を加えて分散液とすることができる。 The liposome of the present invention can also be used in a state where the dispersion is dried (for example, freeze-dried, spray-dried, etc.). The dried liposome can be made into a dispersion by adding a buffer solution such as physiological saline, phosphate buffer, citrate buffer, or acetate buffer.
本発明のリポソームは、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれにおいても使用することもできる。本発明のリポソームをｉｎ ｖｉｖｏにおいて使用する場合、投与経路としては、例えば、静脈、腹腔内、皮下、経鼻等の非経口投与が挙げられ、投与量及び投与回数は、リポソームに封入されたブロック共重合体からなるミセルに応じて適宜調節することができる。 The liposome of the present invention can be used both in vivo and in vitro. When the liposome of the present invention is used in vivo, examples of the administration route include parenteral administration such as intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, and nasal administration, and the dosage and number of administrations are blocks encapsulated in liposomes. It can adjust suitably according to the micelle which consists of a copolymer.
以下、非限定的な実施例によって、本発明をさらに詳しく説明する。 The invention will now be described in more detail by means of non-limiting examples.
＜実施例１＞
非荷電性セグメントがポリエチレングリコールであり、荷電性セグメントがＰ［Ａｓｐ（ＤＥＴ）］（重合数７１）である荷電型ブロック共重合体（ＰＥＧ−ＤＥＴ：分子量３１３９４）を、Ｎ／Ｐ＝１０となるように１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶解した（ブロック共重合体の最終濃度は１．３６ｍｇ／ｍＬ）。この溶液１容量を０．１ｍｇ／ｍＬのルシフェラーゼをコードする遺伝子を有するｐＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３．１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）溶液２容量に対して加え、ピペッティングでよく混合した後、室温で一晩インキュベートして、ｐＤＮＡを含む荷電型ブロック共重合体からなるミセル（ＰＩＣ）を調製した。<Example 1>
A charged block copolymer (PEG-DET: molecular weight 31394) in which the non-chargeable segment is polyethylene glycol and the charged segment is P [Asp (DET)] (polymerization number 71) is N / P = 10. It was dissolved in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) so that the final concentration of the block copolymer was 1.36 mg / mL. One volume of this solution is added to 2 volumes of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing pDNA (pcDNA3.1-luciferase) having a gene encoding 0.1 mg / mL of luciferase, and pipetting is sufficient. After mixing, the mixture was incubated overnight at room temperature to prepare a micelle (PIC) composed of a charged block copolymer containing pDNA.
０．６７５ｍｍｏｌのＤＯＰＥ及び０．１５ｍｍｏｌのＣＨＥＭＳ（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ＝９：２）を１５０μＬのクロロホルムに溶解した溶液をガラス試験管に分取し、窒素ガスを吹き付けて蒸発乾固させ、脂質膜を形成させた。脂質濃度が０．５５ｍＭになるように１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を脂質膜に添加し、室温で１０分間放置することによって水和させた。水和後、超音波槽で数秒間超音波処理した後にプローブ型超音波発生装置（ＢＲＡＢＳＯＮ社ＳＯＮＩＦＩＥＲ ２５０Ｄ）で１０分間超音波処理することによりリポソーム（ＳＵＶ）を調製した。混入した金属粒子を遠心処理により除いた後、上清のＳＵＶ懸濁液を使用した。 A solution obtained by dissolving 0.675 mmol of DOPE and 0.15 mmol of CHEMS (DOPE: CHEMS = 9: 2) in 150 μL of chloroform was taken into a glass test tube, and was evaporated to dryness by blowing nitrogen gas, and the lipid membrane was removed. Formed. A 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) was added to the lipid membrane so that the lipid concentration was 0.55 mM, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes for hydration. After hydration, liposomes (SUV) were prepared by sonicating for several seconds in an ultrasonic bath and then sonicating with a probe type ultrasonic generator (SONIFIER 250D manufactured by BRABSON) for 10 minutes. After removing the contaminated metal particles by centrifugation, the supernatant SUV suspension was used.
上記のように調製したＰＩＣの粒子径およびゼータ電位、及びＰＩＣ：ＳＵＶ＝１：１〜１：９（容量比）となるように混合した後の粒子径をＭａｌｖｅｒｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（英国）製のＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ｓｅｒｉｅｓを用いて、ゼータ電位をＰＨＯＴＡＬ ＥＬＳ ８０００（大塚電子株式会社）を用いて測定した（図１）。ＰＩＣ単独の粒子径は約７５ｎｍ、ゼータ電位は約５ｍＶであった。このＰＩＣに対してＳＵＶ（約−３４ｍＶの負電荷を有する）を増量しながら添加していくと、ＰＩＣ：ＳＵＶ＝１：９において、ゼータ電位と粒子径の反転が生じたことから、ミセルを封入したリポソームが形成されたと考えられる。 The particle size and zeta potential of the PIC prepared as described above, and the particle size after mixing so as to be PIC: SUV = 1: 1 to 1: 9 (volume ratio) were obtained from Zetasizer manufactured by Malvern Instruments (UK). Using Nano series, the zeta potential was measured using PHOTAL ELS 8000 (Otsuka Electronics Co., Ltd.) (FIG. 1). The particle diameter of PIC alone was about 75 nm, and the zeta potential was about 5 mV. When SUV (having a negative charge of about -34 mV) was added to this PIC while increasing the amount, the reversal of the zeta potential and the particle size occurred at PIC: SUV = 1: 9. It is thought that the encapsulated liposome was formed.
＜実施例２＞
実施例１で調製したＰＩＣと、実施例１におけるＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ＝９：２を、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ＤＯＰＥ＝８．９８／２／０．０２に変更して調製したＳＵＶとを、ＰＩＣ：ＳＵＶ＝１／２又は１／９の容量比で混合した。混合物に対して下記の表１に示す％のショ糖溶液を重層して、ショ糖密度勾配遠心分離用のサンプルを用意した。<Example 2>
PIC prepared in Example 1 and SUV prepared by changing DOPE / CHEMS = 9: 2 in Example 1 to DOPE / CHEMS / Rhodamine-DOPE = 8.98 / 2 / 0.02 : SUV was mixed at a volume ratio of 1/2 or 1/9. A sample for sucrose density gradient centrifugation was prepared by overlaying the mixture with the sucrose solution of% shown in Table 1 below.
その結果、ＰＩＣのみでは、ショ糖濃度２０〜６０％の範囲にＤＮＡが存在しているのに対して、ＰＩＣとＳＵＶの混合物では、ショ糖濃度１０％〜２０％の境界にＤＮＡが濃縮されており、また脂質成分も１０％〜２０％の境界にのみ認められた（図２ａ、図２ｂ）。ミセルがリポソームに封入されると見かけ比重が軽くなるので、上記の結果から、ミセルを封入したリポソームが形成されたと考えられる。 As a result, with PIC alone, DNA is present in the sucrose concentration range of 20 to 60%, whereas in the PIC and SUV mixture, DNA is concentrated at the boundary of sucrose concentration of 10% to 20%. In addition, lipid components were also observed only at the boundary of 10% to 20% (FIGS. 2a and 2b). When the micelle is encapsulated in the liposome, the apparent specific gravity becomes light. From the above results, it is considered that the liposome encapsulating the micelle was formed.
＜実施例３＞
実施例１で調製したＰＩＣ：ＳＵ＝１：９の混合物にステアリル化オクタアルギニンを脂質量の５ｍｏｌ％となるように添加し、室温で３０分間インキュベーションして、表面にオクタアルギニンを有するミセル封入リポソームを調製した。２４穴プレートに分裂細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞を４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／ＤＭＥＭ血清培地となるように播種して一晩培養し、０．４μｇの前記ｐＤＮＡのみ、実施例１で調製したＰＩＣ単独０．４μｇ（ＤＮＡ量として）、及び上記ミセル封入リポソーム０．４μｇ（ＤＮＡ量として）をそれぞれ細胞に添加して最終容量２５０μｌ（ＤＭＥＭ無血清培地）で３７℃、３時間インキュベーション後、さらにＤＭＥＭ血清培地１ｍＬを加えて４５時間インキュベーションした。<Example 3>
A micelle-encapsulated liposome having octaarginine on the surface by adding stearylated octaarginine to the mixture of PIC: SU = 1: 9 prepared in Example 1 so as to be 5 mol% of the lipid amount and incubating at room temperature for 30 minutes. Was prepared. NIH3T3 cells, which are dividing cells, are seeded in a 24-well plate so as to form 4 × 10 4 cells / well / DMEM serum medium and cultured overnight. Only 0.4 μg of the above pDNA, PIC alone prepared in Example 1 0.4 μg (as the amount of DNA) and 0.4 μg of the micelle-encapsulated liposome (as the amount of DNA) were added to the cells, respectively, and incubated at 37 ° C. for 3 hours in a final volume of 250 μl (DMEM serum-free medium). 1 mL of medium was added and incubated for 45 hours.
遠心処理して回収した細胞をＲｅｐｏｒｔｅｒ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に溶解し、−８０℃で３０分以上凍結した後に室温で融解して得た細胞溶解液２０μＬと、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，社）５０μＬとを混合し、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ，アトー社）にて活性を測定した。その後、細胞溶解液のタンパク質量をＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）にて定量した。 Cells recovered by centrifugation were dissolved in a reporter lysis buffer (Promega), frozen at −80 ° C. for 30 minutes or more and then thawed at room temperature, and Luciferase assay reagent (Promega, Inc.). ) 50 μL was mixed, and the activity was measured with a luminometer (Lumensecens-PSN, Atto Co.) After that, the protein amount of the cell lysate was quantified with BCA protein assay Kit (PIERCE, Rockford, IL).
ＰＩＣ単独で遺伝子導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞では１０００程度の遺伝子発現が確認されたのに対して、ミセル封入リポソームで遺伝子導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞では１０万倍以上の遺伝子発現が観察された（図３）。 In NIH3T3 cells transfected with PIC alone, about 1000 gene expression was confirmed, whereas in NIH3T3 cells transfected with micelle-encapsulated liposomes, 100,000 times or more gene expression was observed (FIG. 3).
＜実施例４＞
実施例１で調製したＰＩＣと、実施例１におけるＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ＝９：２をＤＯＰＥ：ＰＡ＝７：２に代えて調製したＳＵＶとを、ＰＩＣ：ＳＵＶ＝１：９の容量比で混合した後、ステアリル化オクタアルギニンを脂質量の１０ｍｏｌ％となるように添加し、室温で３０分間インキュベーションして、表面にオクタアルギニンを有するミセル封入リポソームを調製した。２４穴プレートに非分裂細胞であるＪａｗｓ ＩＩ細胞を８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／αＭＥＭ血清培地となるように播種して二晩培養し、実施例１で調製したＰＩＣ単独０．４μｇ（ＤＮＡ量として）、及び上記ミセル封入リポソーム０．４μｇ（ＤＮＡ量として）をそれぞれ細胞に添加して最終容量２５０μｌ（αＭＥＭ無血清培地）で３７℃、３時間インキュベーション後、さらにαＭＥＭ血清培地１ｍＬを加えて２１時間インキュベーションした。<Example 4>
PIC prepared in Example 1 and SUV prepared by replacing DOPE: CHEMS = 9: 2 in Example 1 with DOPE: PA = 7: 2 were mixed at a volume ratio of PIC: SUV = 1: 9. Then, stearyl-ized octaarginine was added so that it might become 10 mol% of lipid amount, and it incubated at room temperature for 30 minutes, and prepared the micelle enclosure liposome which has octaarginine on the surface. Jaws II cells, which are non-dividing cells, were seeded in a 24-well plate so as to be 8 × 10 4 cells / well / αMEM serum medium and cultured overnight, and 0.4 μg of PIC alone (DNA amount prepared in Example 1) And 0.4 μg of the above micelle-encapsulated liposomes (as the amount of DNA) were added to the cells, incubated at 37 ° C. for 3 hours at a final volume of 250 μl (αMEM serum-free medium), and then further added with 1 mL of αMEM serum medium. Incubated for hours.
遠心処理して回収した細胞をＲｅｐｏｒｔｅｒ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に溶解し、−８０℃で３０分以上凍結した後に室温で融解して得た細胞溶解液２０ｍＬと、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，社）５０μＬとを混合し、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ，アトー社）にて活性を測定した。その後、細胞溶解液のタンパク質量をＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）にて定量した。 Cells recovered by centrifugation were dissolved in Reporter lysis buffer (Promega), frozen at -80 ° C. for 30 minutes or more and then thawed at room temperature, and Luciferase assay reagent (Promega, Inc.). 50 μL was mixed, and the activity was measured with a luminometer (Luminescence-PSN, Ato). Thereafter, the amount of protein in the cell lysate was quantified with a BCA protein assay Kit (PIERCE, Rockford, IL).
ＰＩＣ単独で遺伝子導入したＪａｗｓ ＩＩ細胞では１０００程度の遺伝子発現が確認されたのに対して、ミセル封入リポソームで遺伝子導入したＪａｗｓ ＩＩ細胞では１０００倍以上の遺伝子発現が観察された（図４）。 About 1000 gene expression was confirmed in the Jaws II cells transfected with PIC alone, whereas gene expression more than 1000 times was observed in the Jaws II cells transfected with micelle-encapsulated liposomes (FIG. 4).
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