JP2008209132A - Separation method of chylomicron (cm) in blood by ion exchange chromatography and discrimination method of metabolic syndrome - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、血液中に微量に含まれるカイロミクロン（ＣＭ）の分離方法、並びに血液中のリポ蛋白中のコレステロール値を指標としたメタボリックシンドロームの識別方法に関する。 The present invention relates to a method for separating chylomicron (CM) contained in a trace amount in blood, and a method for identifying metabolic syndrome using a cholesterol level in lipoproteins in blood as an index.
血液中のリポ蛋白には、健康な人においても、比較的多く量が存在するリポ蛋白として、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）があり、健康な人では微量であるが、家族性高脂血症などの疾患患者の血液中に多く存在する中間型リポ蛋白（ＩＤＬ）、食後一過性に増加するリポ蛋白であるカイロミクロン（ＣＭ）がある。また、Ｌｐ（ａ）と呼ばれる微量に存在するリポ蛋白もある。ＣＭは、微量なリポ蛋白ではあるが、カイロミクロンレムナントと呼ばれる動脈硬化性疾患に対する高いリスクとなるリポ蛋白が含まれており、近年、重要視されつつあるリポ蛋白である（非特許文献１）。 Lipoproteins in blood include high density lipoprotein (HDL), low density lipoprotein (LDL), and very low density lipoprotein (VLDL) as lipoproteins present in relatively large amounts even in healthy people. Yes, it is trace amount in healthy people, but it is intermediate lipoprotein (IDL), which is abundant in the blood of patients with familial hyperlipidemia and other diseases, and chylomicron (lipoprotein that increases transiently after meals) CM). There is also a lipoprotein called Lp (a) that exists in a trace amount. Although CM is a small amount of lipoprotein, it contains a lipoprotein called a chylomicron remnant, which is a high risk for arteriosclerotic diseases, and is a lipoprotein that has recently been regarded as important (Non-patent Document 1). .
このように、ＣＭは、微量ではあるが、動脈硬化性疾患に対するリスクファクターとして重要なリポ蛋白ではある。
ＣＭの分離分析方法としては、超遠心分離装置（非特許文献２）、電気泳動（非特許文献３）、ゲルろ過クロマトグラフィー（非特許文献４）による方法があるが、超遠心分離装置は高価な装置であり汎用性に乏しく、更にＣＭの比重は水より軽いため、浮上時間により分離しなければならないため高度な手技を必要とする。電気泳動による分離の場合、ＣＭは電荷をほとんど有しないため、原点に位置し、血液中の薬物などの不純物の影響を受けやすく分析精度が低いという問題点がある。ゲルろ過クロマトグラフィーの場合において、ＣＭはゲルの細孔径に入らずにボイドの位置に溶出する。ゲルの細孔径は、製造ごとにある程度差が生じてしまうことは避けられず、このゲルの細孔径の差がＣＭの分離に影響を及ぼすために、測定精度が低下するという問題点がある。
Thus, CM is a lipoprotein that is important as a risk factor for arteriosclerotic disease, although in a minute amount.
As a method for separating and analyzing CM, there are a method using an ultracentrifuge (Non-patent document 2), electrophoresis (Non-patent document 3), and gel filtration chromatography (Non-patent document 4), but the ultracentrifuge is expensive. It is a simple device and lacks versatility. Furthermore, since the specific gravity of CM is lighter than that of water, it must be separated according to the ascent time, so that it requires advanced techniques. In the case of separation by electrophoresis, since CM has almost no electric charge, it is located at the origin and is susceptible to the influence of impurities such as drugs in the blood, resulting in low analysis accuracy. In the case of gel filtration chromatography, CM elutes at the void position without entering the pore diameter of the gel. It is inevitable that the pore size of the gel will vary to some extent from production to production, and this difference in pore size of the gel will affect the separation of CM, resulting in a problem that the measurement accuracy is reduced.
また、本発明者らは、以前に陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて血液試料中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの５つのリポ蛋白を分離する方法（非特許文献５）を確立しているが、この方法ではＣＭとＬｐ（ａ）が同時に溶出するため、ＣＭの正確な量を把握することが困難であった。 In addition, the present inventors have previously established a method (non-patent document 5) for separating five lipoproteins of HDL, LDL, IDL, VLDL, and CM in a blood sample using anion exchange chromatography. However, since this method elutes CM and Lp (a) at the same time, it is difficult to grasp the exact amount of CM.
メタボリックシンドロームは２００５年に診断基準が定められた心筋梗塞や脳梗塞などの動脈硬化性疾患のリスクの高い内臓脂肪が増加する疾患である。その診断基準は、下記である。
１． ウエスト周囲径が男性８５ｃｍ以上、女性９０ｃｍ以上であること。
２． ウエスト周囲径に加えて、次の３項目のうち、２項目以上が当てはまる。
(i)脂質：中性脂肪１３０ｍｇ／ｄＬ以上かつ／または、ＨＤＬコレステロール４０ｍｇ／ｄＬ未満
(ii)血圧：収縮期血圧１３０ｍｍＨｇ以上かつ／または、拡張期血圧８５ｍｍＨｇ以上
(iii)血糖値：空腹時血糖値１１０ｍｇ／ｄＬ以上
Metabolic syndrome is a disease in which visceral fat having a high risk of arteriosclerotic diseases such as myocardial infarction and cerebral infarction whose diagnostic criteria were established in 2005 is increased. The diagnostic criteria are as follows.
1. The waist circumference is 85 cm or more for men and 90 cm or more for women.
2. In addition to the waist circumference, two or more of the following three items apply.
(i) lipid: neutral fat 130 mg / dL or more and / or HDL cholesterol less than 40 mg / dL
(ii) Blood pressure: systolic blood pressure 130 mmHg or more and / or diastolic blood pressure 85 mmHg or more
(iii) Blood glucose level: Fasting blood glucose level of 110 mg / dL or more
以上のようにメタボリックシンドロームは複数の検査により診断するのであるが、それは煩雑であり、この診断基準以外に簡便に判別する方法が望まれている。また、メタボリックシンドロームは、新しい疾患でその治療法は現在発展途上にあり、治療法を研究する上でも、簡便な判別方法の確立は非常に重要である。 As described above, the metabolic syndrome is diagnosed by a plurality of examinations. However, it is complicated, and a method for easily discriminating other than this diagnostic criterion is desired. Metabolic syndrome is a new disease and its treatment is currently under development, and establishment of a simple discrimination method is very important in researching treatment.
上記のように、血液中に微量に含まれるリポ蛋白であるＣＭを分離することは重要であるが、その分離能力が充分、かつ簡便な測定方法がこれまでなかった。本発明の目的は、高価な測定方法や、特別なカラムがなくても、簡便で充分にＣＭを分離することが出来る方法を提供することにある。
また、ＣＭ、または、ＶＬＤＬの中に含まれるコレステロール値を測定することにより、簡便に行えるメタボリックシンドロームの判別法を提供することにある。
As described above, it is important to separate CM, which is a lipoprotein contained in a trace amount in blood, but there has been no measurement method that has sufficient separation ability and is simple. An object of the present invention is to provide an expensive measurement method and a method that can easily and sufficiently separate CM without a special column.
It is another object of the present invention to provide a metabolic syndrome discrimination method that can be easily performed by measuring cholesterol levels contained in CM or VLDL.
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討の結果として、本発明を完成するに至った。
すなわち、血液中のＣＭを分離する方法として、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、血液中の微量に存在するＣＭとＬｐ（ａ）を吸着させるための溶離液（溶離液１）、ＣＭを溶出するための溶離液（溶離液２）の塩濃度の異なる溶離液を１、２の順に陰イオン交換カラムに流すことにより、当該陰イオン交換カラムからＣＭを分離し、溶出する方法で、溶離液１は塩濃度が１８０ｍｍｏｌ／Ｌから２００ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液２の塩濃度が２１０ｍｍｏｌ／Ｌから２８０ｍｍｏｌ／Ｌの２つの塩濃度の異なる溶離液を用いることにより、使用する陰イオン交換カラムによって血液試料中に含まれるＣＭを分離溶出する方法を発明した。
また、非特許文献５の方法と本発明を用いることで、血液試料中に存在するＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ、Ｌｐ（ａ）の６つのリポ蛋白を順に分離し溶出する方法を確立し、下記の２つのグループの血液試料を測定したところ、メタボリックシンドロームの識別のために血液中のＣＭが含むコレステロール値と血液中のＶＬＤＬが含むコレステロール値が優れていることを見出した。
１． メタボリックシンドローム患者（８名）
２． 健常者（１４名）
The present inventor has completed the present invention as a result of intensive studies to solve the above problems.
That is, as a method for separating CM in blood, an anion exchange chromatography is used to elute eluent (eluent 1) and CM for adsorbing CM and Lp (a) present in trace amounts in blood. In order to separate and elute CM from the anion exchange column by flowing eluents with different salt concentrations of the eluent (eluent 2) to the anion exchange column in the order of 1, 2 1 is a salt concentration of 180 mmol / L to 200 mmol / L, and the eluent 2 has a salt concentration of 210 mmol / L to 280 mmol / L. A method for separating and eluting CM contained in a blood sample was invented.
In addition, by using the method of Non-Patent Document 5 and the present invention, a method for sequentially separating and eluting six lipoproteins of HDL, LDL, IDL, VLDL, CM, and Lp (a) present in a blood sample is established. Then, when the following two groups of blood samples were measured, it was found that the cholesterol level contained in CM in blood and the cholesterol level contained in VLDL in blood were excellent for the identification of metabolic syndrome.
1. Patients with metabolic syndrome (8 patients)
2. Healthy people (14 people)
本発明は、血液中に含まれるリポ蛋白であるＣＭを良好に分離する方法を提供する。そして、ＣＭ、または、ＶＬＤＬの中に含まれるコレステロール値を測定することにより、簡便に行えるメタボリックシンドロームの判別法を提供する。 The present invention provides a method for satisfactorily separating CM, which is a lipoprotein contained in blood. Then, a method for discriminating metabolic syndrome that can be easily performed by measuring the cholesterol level contained in CM or VLDL is provided.
以下に本発明について、詳細に説明する。
上述したように、血液中に微量に存在するＣＭは動脈硬化性疾患と密接な関連性があり、これらのリポ蛋白の分離・分析方法は、動脈硬化性疾患の研究を進める上で、重要である。また、メタボリックシンドロームは、動脈硬化性疾患の高いリスクとなる重要な疾患であり、ＣＭまたはＶＬＤＬの中に含まれるコレステロール値を指標とするメタボリックシンドロームの簡便な判別法の提供は、メタボリックシンドロームあるいは動脈硬化性疾患の進展を研究する上で重要である。
The present invention is described in detail below.
As described above, CM present in minute amounts in blood is closely related to arteriosclerotic diseases, and the method for separating and analyzing these lipoproteins is important in promoting research on arteriosclerotic diseases. is there. In addition, metabolic syndrome is an important disease that is a high risk of arteriosclerotic disease, and the provision of a simple method for discriminating metabolic syndrome using the cholesterol level contained in CM or VLDL as an index is provided by metabolic syndrome or arterial disease. It is important in studying the progress of sclerosis.
ＣＭの分離分析法としては、超遠心分離装置を用いた方法が一般的ではあるが、装置が高価で、手技も難しい。また、ゲルろ過クロマトグラフィーや電気泳動によっても可能であるが、測定精度が悪い。 As a method for separating and analyzing CM, a method using an ultracentrifugation apparatus is generally used, but the apparatus is expensive and the technique is difficult. Moreover, although it is possible by gel filtration chromatography or electrophoresis, the measurement accuracy is poor.
陰イオン交換クロマトグラフィーによるリポ蛋白の分離は、一般的な液体クロマトグラフィーの装置を用いて実施が可能で、分離した後にコレステロールと反応する市販の酵素液（例えば、総コレステロールＥテストワコー、和光純薬株式会社製、または、総コレステロール測定用ＴＣＨＯ−ＣＬ、セロテック社製）と混合して反応させ可視光検出器で測定することが出来て、簡便で定量性も良いことが知られている（非特許文献５）。我々は、この陰イオン交換クロマトグラフィーにより、ＣＭの分離を試みた。２つの溶離液を用いたステップ溶出により、十分な分離を実現した。検討には、健常人の血清（血液試料Ａ）、超遠心分離法で分離したＣＭ試料（ＣＭの含量が約８０％の試料）（比重＜０．９４ｇ／ｍＬ）を用いた。２つの溶離液を用いたステップ溶出の条件で測定した結果として、ＣＭ試料では、その７６％のＣＭ画分が溶離液２により溶出され、健常人血清では、ＣＭコレステロール値が０．３６ｍｇ／ｄＬとなった（実施例１、図２〜３）。 Separation of lipoproteins by anion exchange chromatography can be performed using a general liquid chromatography apparatus, and a commercially available enzyme solution that reacts with cholesterol after separation (for example, total cholesterol E test Wako, Wako Jun) It is known that it can be measured by a visible light detector by mixing and reacting with Yakuhin Co., Ltd. or TCHO-CL for total cholesterol measurement (manufactured by Cellotech), and is easy to measure and has good quantitative properties ( Non-patent document 5). We attempted to separate CM by this anion exchange chromatography. Sufficient separation was achieved by step elution with two eluents. In the examination, healthy human serum (blood sample A) and CM sample separated by ultracentrifugation (sample with a CM content of about 80%) (specific gravity <0.94 g / mL) were used. As a result of measurement under the conditions of step elution using two eluents, 76% of the CM fraction was eluted with eluent 2 in the CM sample, and the CM cholesterol value was 0.36 mg / dL in the healthy human serum. (Example 1, FIGS. 2-3).
使用する陰イオン交換カラムに充填されるゲルとしては、シリカ系やポリマー系のゲルにジアミノエチル（ＤＥＡＥ）基や第４級アミノエチル（ＱＡＥ）基が結合したもの、また、そのゲルの表面に１０００オングストローム程度の孔があるもの（多孔質）と孔がないもの（非多孔質）があるが、好ましくはリポ蛋白に対して分離性能の高い非多孔質のタイプ、例えばポリマー系の非多孔質タイプの表面にＤＥＡＥ基を持つゲルをカラムに充填したＴＳＫ−ＧＥＬ ＤＥＡＥ−ＮＰＲ（東ソー株式会社製）が挙げられる。溶離液は、リポ蛋白の分離能力が高い過塩素酸ナトリウムなどのカオトロピックイオンを含んだ溶離液が望ましい。ＣＭを含む対象となる血液試料としては、血清試料や、ＥＤＴＡやヘパリンなどの抗凝固剤を添加して得られた血漿試料が望ましい。 The gel packed in the anion exchange column to be used includes a silica-based or polymer-based gel bonded with a diaminoethyl (DEAE) group or a quaternary aminoethyl (QAE) group. There are those with pores of about 1000 angstroms (porous) and those without pores (non-porous), but preferably non-porous type with high separation performance for lipoproteins, such as non-porous polymers Examples include TSK-GEL DEAE-NPR (manufactured by Tosoh Corporation) in which a column is filled with a gel having a DEAE group on the surface of the type. The eluent is preferably an eluent containing chaotropic ions such as sodium perchlorate having high lipoprotein separation ability. As a blood sample to be a target containing CM, a serum sample or a plasma sample obtained by adding an anticoagulant such as EDTA or heparin is desirable.
分離に使用する塩濃度の異なる溶離液１、２は、塩濃度の低い順にカラムに流す。この２種類の溶離液の役割としては、溶離液１はＣＭとＬｐ（ａ）を吸着させ、それら以外のリポ蛋白を溶出させ、溶離液２はＣＭだけを溶出させることにある。また、ＣＭの性状（構成物質の含量比率）には、均一ではなく幅があることが知られており（非特許文献２）、溶離液１と２の間に、更に新たな塩濃度を加えたり、分離溶出する条件として、段階的に溶離液を高める条件を加えたりして、ＣＭを複数のピークに分離しても良い。また、溶離液１では、ＣＭとＬｐ（ａ）以外のリポ蛋白であるＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬを溶出するのであるが、溶離液１の前に新たな塩濃度を加えたり、分離溶出する条件として、段階的に溶離液を高める条件を加えたりして、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬなどを分離分析する条件を加えても良い（図４）。 The eluents 1 and 2 having different salt concentrations used for separation are passed through the column in ascending order of salt concentration. The role of these two types of eluents is to elute CM and Lp (a) and elute lipoproteins other than them, and eluent 2 to elute only CM. In addition, it is known that the CM properties (content ratio of constituents) are not uniform but have a wide range (Non-patent Document 2), and a new salt concentration is added between the eluents 1 and 2. Alternatively, CM may be separated into a plurality of peaks by adding a condition for increasing the eluent stepwise as a condition for separating and eluting. In eluent 1, HDL, LDL, IDL, and VLDL, which are lipoproteins other than CM and Lp (a), are eluted, and a new salt concentration is added before eluent 1 or separated and eluted. As conditions, conditions for increasing the eluent stepwise may be added, or conditions for separating and analyzing HDL, LDL, IDL, VLDL, etc. may be added (FIG. 4).
使用する溶離液１、２の塩濃度は、ＣＭを分離する目的として、溶離液１については、ＣＭとＬｐ（ａ）以外のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬのリポ蛋白を溶出させる塩濃度として、１８０ｍｍｏｌ／Ｌから２００ｍｍｏｌ／Ｌが適切である。溶離液２としては、ＣＭを溶出させ、Ｌｐ（ａ）を溶出させない溶離液の塩濃度として、２１０ｍｍｏｌ／Ｌから２８０ｍｍｏｌ／Ｌが適切である。なお、測定に用いている陰イオン交換カラムは１検体ごとに吸着しているリポ蛋白をすべて溶出してから、次の検体の測定に供するのが好ましい。陰イオン交換カラムに吸着力が最も強いリポ蛋白としてＬｐ（ａ）が知られており、このＬｐ（ａ）は塩濃度３００ｍｍｏｌ／Ｌ以上で溶出可能であるので、吸着しているリポ蛋白をすべて溶出するために用いる溶離液（以下、カラム洗浄液）は、塩濃度３１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であればよい。カラム洗浄液の塩濃度に上限はないが、溶離液の作成などの取扱いを考えると７００ｍｍｏｌ／Ｌまでが適当である。また、使用するカラムや溶離液に入れる塩の種類により若干ことなるが、最も好ましい条件は、ＤＥＡＥ基をもつ非多孔質のポリマー系のゲルを充填したカラムを用い、そのカラムに用いる溶離液に過塩素酸ナトリウムを含み、溶離液１の塩濃度は１９０ｍｍｏｌ／Ｌから１９５ｍｍｏｌ／Ｌ、溶離液２の塩濃度は２４５ｍｍｏｌ／Ｌから２７５ｍｍｏｌ／Ｌである。溶離液を流す量は、使用するカラムや溶離液に入れる塩の種類により若干ことなるが、溶離液１、２をそれぞれカラム容量の６倍以上が適当である。 The salt concentration of the eluents 1 and 2 to be used is as a salt concentration for eluting HDL, LDL, IDL, and VLDL lipoproteins other than CM and Lp (a) for the purpose of separating CM. 180 mmol / L to 200 mmol / L is suitable. As the eluent 2, 210 mmol / L to 280 mmol / L is appropriate as the salt concentration of the eluent that elutes CM and does not elute Lp (a). The anion exchange column used for the measurement is preferably used for the measurement of the next sample after eluting all the lipoproteins adsorbed for each sample. Lp (a) is known as the lipoprotein having the strongest adsorption power to the anion exchange column, and since this Lp (a) can be eluted at a salt concentration of 300 mmol / L or more, all the adsorbed lipoproteins are removed. The eluent used for elution (hereinafter referred to as column washing solution) may be a salt concentration of 315 mmol / L or more. There is no upper limit to the salt concentration of the column washing solution, but up to 700 mmol / L is appropriate in consideration of handling such as preparation of the eluent. The most preferable conditions are a column packed with a non-porous polymer-based gel having a DEAE group, and the eluent used for the column is slightly different depending on the column used and the type of salt to be added to the eluent. It contains sodium perchlorate, the eluent 1 has a salt concentration of 190 mmol / L to 195 mmol / L, and the eluent 2 has a salt concentration of 245 mmol / L to 275 mmol / L. The amount of the eluent to flow is slightly different depending on the column to be used and the type of salt to be put in the eluent, but it is appropriate that the eluents 1 and 2 are each 6 times or more the column volume.
好ましい塩としては、上述のとおり過塩素酸ナトリウムが使用されるが、その他、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化カリウムなどが上げられる。また、溶離液の塩濃度とは加えた試薬の解離しているイオンの塩濃度であり、過塩素酸ナトリウムの場合には、ほぼ１００％が解離しているので、過塩素酸ナトリウムを１００ｍｍｏｌ／Ｌ入れた場合には、その塩濃度は１００ｍｍｏｌ／Ｌとなる。緩衝液に依存する塩濃度はその試薬の解離定数から算出するが、実施例で使用した５０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス緩衝液はｐＨ７．５のときの解離した分子の濃度（塩濃度）は、トリスのｐＫａ＝８．１から算出すると約４０ｍｍｏｌ／Ｌとなる。 As a preferable salt, sodium perchlorate is used as described above, and other examples include sodium thiocyanate and potassium iodide. The salt concentration of the eluent is the salt concentration of ions dissociated from the added reagent. In the case of sodium perchlorate, almost 100% is dissociated. When L is added, the salt concentration becomes 100 mmol / L. Although the salt concentration depending on the buffer is calculated from the dissociation constant of the reagent, the concentration of the dissociated molecule (salt concentration) when the 50 mmol / L Tris buffer used in the examples is pH 7.5 is When calculated from pKa = 8.1, it is about 40 mmol / L.
使用する溶離液には、緩衝液を加え、ｐＨを６から９に調製することが好ましい。加える緩衝液の種類としては、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液などが上げられる。
分離した各リポ蛋白のフラクション（ＣＭとＬｐ（ａ）以外のリポ蛋白のフラクション、ＣＭのフラクション、Ｌｐ（ａ）のフラクション）の検出方法としては、それぞれのフラクションを試験管に取得して、それぞれの中のリポ蛋白を構成する成分を測定することが出来る。リポ蛋白を構成する成分とその測定法の例としては、コレステロール；コレステロールオキシダーゼを用いた呈色試薬で測定する方法、中性脂肪；リポプロテインリパーゼを用いた呈色試薬で測定する方法、リン脂質；ホスホリパーゼＤを用いた呈色試薬で測定する方法、ビタミンＥ；逆相クロマトグラフィーによる方法、アポリポ蛋白（Ａ−１やＢやＥなど）；抗体を用いたラテックス凝集法などがあげられる。また、コレステロールオキシダーゼを用いた呈色試薬で測定する方法、中性脂肪；リポプロテインリパーゼを用いた呈色試薬で測定する方法、については、非特許文献４、５、６に示されているように、フラクションを取らずにカラムからの溶出液に配管中で一定流速にて酵素試薬を混合し反応させ検出することにより良好に各リポ蛋白を検出、定量することが可能である。
It is preferable to adjust the pH to 6 to 9 by adding a buffer to the eluent used. Examples of the buffer solution to be added include Tris-HCl buffer solution, phosphate buffer solution, borate buffer solution and the like.
As a method for detecting each separated lipoprotein fraction (lipoprotein fraction other than CM and Lp (a), CM fraction, Lp (a) fraction), each fraction was obtained in a test tube, The component which comprises the lipoprotein in can be measured. Examples of components constituting lipoproteins and methods for measuring them include cholesterol; a method using a color reagent using cholesterol oxidase; a neutral fat; a method using a color reagent using lipoprotein lipase; a phospholipid A method of measuring with a color reagent using phospholipase D, vitamin E; a method by reverse phase chromatography, apolipoprotein (A-1, B, E, etc.); a latex agglutination method using an antibody, and the like. Non-patent documents 4, 5, and 6 show a method for measuring with a color reagent using cholesterol oxidase, a method for measuring neutral fat; and a color reagent using lipoprotein lipase. In addition, it is possible to detect and quantify each lipoprotein satisfactorily by mixing and reacting the eluate from the column with the enzyme reagent in the pipe at a constant flow rate without causing a fraction to react.
本発明を用いて構築したＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ、Ｌｐ（ａ）の分離分析条件を用いて得られたメタボリックシンドロームの測定値と健常者の値を比較したところ、ＶＬＤＬコレステロール値とＣＭコレステロール値について、有為差が認められた（表４、図１０、１１）。また、その有為差は、ＶＬＤＬコレステロール値に比べ、ＣＭコレステロール値の方が大きかった（実施例３）。メタボリックシンドロームの病態として、比較的軽度な脂質代謝の異常が認められるので、軽度の脂質代謝でも変化が生じやすいＶＬＤＬとＣＭに値の差が見られたと考えられる。 When the measured value of the metabolic syndrome obtained using the separation analysis conditions of HDL, LDL, IDL, VLDL, CM, and Lp (a) constructed using the present invention was compared with the value of a healthy subject, A significant difference was observed in CM cholesterol levels (Table 4, FIGS. 10 and 11). Further, the significant difference was greater in the CM cholesterol value than in the VLDL cholesterol value (Example 3). As a pathological condition of metabolic syndrome, a relatively slight abnormality in lipid metabolism is observed, so it is considered that a difference in value was observed between VLDL and CM, which are likely to change even with mild lipid metabolism.
これらのことから、ＶＬＤＬコレステロール値、または、ＣＭコレステロール値、特にＣＭコレステロール値は、メタボリックシンドロームの疾患の識別に有用な指標であると言える。 From these facts, it can be said that the VLDL cholesterol level or the CM cholesterol level, particularly the CM cholesterol level, is a useful index for identifying a disease of the metabolic syndrome.
血液中のＣＭが含むコレステロール値やＶＬＤＬが含むコレステロール値は上述のとおりにクロマトグラフィーにより分離し、そして、カラムから溶出した分離したＣＭやＶＬＤＬのリポ蛋白を含む溶液に、配管中に一定流速で酵素試薬を混合し反応させ検出することにより、各リポ蛋白のピークを確認出来る。そして、このピーク面積から各リポ蛋白中のコレステロール値をもとめることができる。 Cholesterol levels contained in CM and VLDL in blood are separated by chromatography as described above, and the solution containing the separated CM and VLDL lipoproteins eluted from the column is added to the pipe at a constant flow rate. The peak of each lipoprotein can be confirmed by mixing and detecting an enzyme reagent and detecting. And the cholesterol value in each lipoprotein can be calculated | required from this peak area.
以下に本発明について、実施例を用いて説明する。ただし、本発明は実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described using examples. However, the present invention is not limited to the examples.
（実施例１）
図１に装置の形態を示す。実施例に用いた装置構成を下記に示す。
実施例に用いた装置は図１に示す。溶離液Ａ（１）は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、溶離液Ｂ（２）は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ+５００ｍＭ 過塩素酸ナトリウム ｐＨ７．５である。溶離液ＡとＢを流すポンプ（４）は２台のＤＰ−８０２０（東ソー（株）製）を用いた。ＤＰ−８０２０ポンプは、２台を制御することにより、２つの溶離液のグラディエントを行えるポンプである。溶離液ＡとＢを混合するミキサー（５）はスタティックミキサーＣ（東ソー（株）製）を用いた。オートサンプラー（６）はＡＳ−８０２０（東ソー（株）製）を、カラムオーブン（９）はＣＯ−８０２１（東ソー（株）製）を用いた。カラム（８）はＤＥＡＥ−ＮＰＲカラムサイズ３．０ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２５ｍｍ（東ソー（株）製）を、フィルター（７）はＨＬＣ−７２３ＧＨｂ３型用のカラムフィルターＳタイプ（東ソー（株）製）を用いた。コレステロール反応液（１０）はＴＣＨＯ−ＣＬ（セロテック社製）を、ポンプ直前にエアートラップ（１１）を設置した。コレステロール反応液のためのポンプ（１２）はＤＰ−８０２０（東ソー（株）製）を用いた。溶離液ＡとＢおよびコレステロール反応液については、脱気装置（３）を設置した。コレステロール反応液（コレステロール反応液は、主要な成分としてコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム、４―アミノアンチピリンが含まれる。）のラインに、抵抗管（１３）０．１ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２ｍを２つ直列につないで設置した。反応コイル（１４）は、０．２５ｍｍＩ．Ｄ．ｘ３０ｍとした。検出器はＵＶ−８０２０（東ソー（株）製）（１５）を用いた。溶離液はＡとＢをあわせて０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速とし、コレステロール反応液の流速は０．２０ｍＬ／ｍｉｎとした。カラムオーブンの温度は２５℃とし、反応コイルは３７℃に保温した。検出器は６００ｎｍで検出した。使用したＤＥＡＥ−ＮＰＲカラムは、粒子系が２．５μｍで交換基容量が０．２３ｍｅｑ／ｍＬ−ｇｅｌのポリマー系非多孔質ゲルを充填したものである。測定の形態としては、まず、血清などのリポ蛋白を含んだ試料をオートサンプラー（６）から注入する。注入する配管はポンプ（４）とカラム（８）の間に設置されており、ポンプ（４）から溶離液を流すことにより試料はカラムに導入される。カラム（８）にポンプ（４）により比較的塩濃度の低い溶離液（溶離液Ｂの割合が低い）を予め流すことにより、カラム（８）を平衡化しておいて、試料中のリポ蛋白をカラムに吸着させる。続いて、溶離液Ｂの流す割合を溶離液Ａに比べ高めてカラムに流す溶離液の塩濃度を高めることにより、吸着力の弱いリポ蛋白から順にカラム出口から溶出してくる。この溶出液とコレステロール反応液（１０）を混合し、反応コイル（１４）に導いて反応させる。反応液はコレステロールの量に依存して発色する試薬となっているので、その色を検出器（１５）で測定することでコレステロール量に依存するクロマトグラムを取得し、そのピーク面積により、各リポ蛋白のコレステロール含量を算出するものである。
(Example 1)
FIG. 1 shows the configuration of the apparatus. The apparatus configuration used in the examples is shown below.
The apparatus used in the examples is shown in FIG. The eluent A (1) is 50 mM Tris-HCl pH 7.5, and the eluent B (2) is 50 mM Tris-HCl + 500 mM sodium perchlorate pH 7.5. Two DP-8020 (manufactured by Tosoh Corporation) were used as the pump (4) for flowing the eluents A and B. The DP-8020 pump is a pump that can perform gradients of two eluents by controlling two pumps. As a mixer (5) for mixing the eluents A and B, a static mixer C (manufactured by Tosoh Corporation) was used. The autosampler (6) used AS-8020 (manufactured by Tosoh Corporation), and the column oven (9) used CO-8021 (manufactured by Tosoh Corporation). Column (8) is DEAE-NPR column size 3.0 mm I.D. D. x25 mm (manufactured by Tosoh Corporation) was used, and the filter (7) was a column filter S type for HLC-723GHb3 type (manufactured by Tosoh Corporation). Cholesterol reaction solution (10) was TCHO-CL (manufactured by Serotech), and an air trap (11) was installed just before the pump. DP-8020 (manufactured by Tosoh Corporation) was used as the pump (12) for the cholesterol reaction solution. A deaerator (3) was installed for the eluents A and B and the cholesterol reaction solution. Cholesterol reaction solution (Cholesterol reaction solution contains cholesterol esterase, cholesterol oxidase, peroxidase, ascorbate oxidase, N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline sodium, 4-aminoantipyrine as main components. In the resistance tube (13) 0.1 mmI. D. Two x2m were connected in series. The reaction coil (14) has a 0.25 mm I.D. D. x30 m. The detector used was UV-8020 (manufactured by Tosoh Corporation) (15). The eluent was combined with A and B at a flow rate of 0.5 mL / min, and the flow rate of the cholesterol reaction solution was 0.20 mL / min. The temperature of the column oven was 25 ° C., and the reaction coil was kept at 37 ° C. The detector detected at 600 nm. The DEAE-NPR column used was packed with a polymer non-porous gel having a particle system of 2.5 μm and an exchange group capacity of 0.23 meq / mL-gel. As a form of measurement, first, a sample containing lipoprotein such as serum is injected from the autosampler (6). The pipe for injection is installed between the pump (4) and the column (8), and the sample is introduced into the column by flowing the eluent from the pump (4). The column (8) is equilibrated by flowing an eluent having a relatively low salt concentration (the ratio of the eluent B is low) through the pump (4) in advance to the column (8). Adsorb to the column. Subsequently, by increasing the flow rate of the eluent B as compared with the eluent A and increasing the salt concentration of the eluent that flows through the column, the elution from the column outlet starts from the lipoprotein having the weaker adsorbing power. This eluate and the cholesterol reaction solution (10) are mixed and led to the reaction coil (14) to be reacted. Since the reaction solution is a reagent that develops color depending on the amount of cholesterol, a chromatogram depending on the amount of cholesterol is obtained by measuring the color with a detector (15), and each liposomal is determined by its peak area. The cholesterol content of protein is calculated.
溶離液による溶出パターンを、０．０分から５．０分はＢの組成を３０．０％に固定し、５．０分から５．５分はＢの組成を３０．０％から４５．０％へのリニアグラディエントとし、５．５分から１０．５分はＢの組成を４５．０％に固定し、１０．５分から１１．０分はＢの組成を４５．０％から１００．０％へのリニアグラディエントとし、１１．０分から１６．０分はＢの組成を１００．０％に固定し、１６．０分から１６．５分はＢの組成を１００．０％から３０．０％へのリニアグラディエントとし、１６．５分から２５．０分はＢの組成を３０．０％に固定した。測定は、２５分サイクルで分析した。なお、本分析条件について、前述した溶離液１、２は、それぞれ、溶離液１がＢの組成３０％、溶離液２がＢの組成４５％にあたり、それぞれの塩濃度は、溶離液１が１９０ｍｍｏｌ／Ｌ、溶離液２が２６５ｍｍｏｌ／Ｌとなる。 The elution pattern of the eluent is fixed at 30.0% for B from 0.0 minutes to 5.0 minutes, and from 30.0% to 45.0% for B from 5.0 minutes to 5.5 minutes. The linear composition gradient was set to 45.0% for 5.5 minutes to 10.5 minutes, and the B composition was changed from 45.0% to 100.0% for 10.5 minutes to 11.0 minutes. The linear composition was 11.0 to 16.0 minutes, the B composition was fixed at 100.0%, and the 16.0 to 16.5 minutes composition was changed from 100.0% to 30.0%. A linear gradient was used, and the composition of B was fixed at 30.0% from 16.5 minutes to 25.0 minutes. Measurements were analyzed with a 25 minute cycle. In this analysis condition, the eluents 1 and 2 described above correspond to the eluent 1 having a B composition of 30% and the eluent 2 having a B composition of 45%, respectively. / L, eluent 2 is 265 mmol / L.
検討に用いた健常人の血液試料（以下、血液試料Ａ）としては、総コレステロール２５０ｍｇ／ｄＬ、中性脂肪８９ｍｇ／ｄＬの血清を用いた。空腹時の健常人の血清には、ＣＭはほとんど含まれない。本分析条件において、血液試料ＡのＣＭコレステロール値は０．３６ｍｇ／ｄＬと非常に微量であった（図２）。また、本分析条件で、健常人血清から超遠心分離装置を用いて得られたＣＭ（比重＜０．９４ｇ／ｍＬ）を分析した。このＣＭ試料は、ＣＭが微量にしか含まれていない健常人の血清から取得したこともあり、ＣＭの含量は８０％程度と推定される。分析結果は、ＣＭを溶出させる溶離液２の位置に全体のピーク面積の７６％のピークが認められ、良好な分離パターンが得られたことが明らかである（図３）。 As a blood sample (hereinafter referred to as blood sample A) of a healthy person used for the examination, serum having a total cholesterol of 250 mg / dL and neutral fat of 89 mg / dL was used. The serum of fasting healthy individuals contains almost no CM. Under the present analysis conditions, the CM cholesterol value of blood sample A was as very small as 0.36 mg / dL (FIG. 2). Moreover, CM (specific gravity <0.94 g / mL) obtained from normal human serum using an ultracentrifuge was analyzed under the present analysis conditions. This CM sample was obtained from the serum of a healthy person who contained only a small amount of CM, and the CM content is estimated to be about 80%. As a result of the analysis, it is clear that a peak of 76% of the entire peak area was observed at the position of the eluent 2 for eluting CM, and a good separation pattern was obtained (FIG. 3).
次に、それぞれの溶離液の最適な塩濃度を求めるために、溶離液１、２の塩濃度を変更して分析を実施した。まず、溶離液１の濃度をＢ２４〜３８％（１６０〜２３０ｍｍｏｌ／Ｌ）において、血液試料Ａを測定して、ＣＭのピーク面積から算出されるコレステロール値を評価した（表１）。Ｂ２４％（１６０ｍｍｏｌ／Ｌ）では、ＣＭコレステロール値が５．７２ｍｇ／ｄＬと高く、ＣＭ以外のリポ蛋白画分が含まれていることが推定されたが、Ｂ２８％（１８０ｍｍｏｌ／Ｌ）では、ＣＭコレステロール値が１．０８ｍｇ／ｄＬと急激に低くなり、ＣＭ以外のリポ蛋白画分の量が低下した。Ｂ３０％（１９０ｍｍｏｌ／Ｌ）では、ＣＭコレステロール値が０．３６ｍｇ／ｄＬと、ＣＭピークに含まれるＣＭ以外のリポ蛋白画分の量がさらに低下し、ＣＭの純度が高まっていることがわかる。Ｂ３４、３６、３８％（２１０、２２０、２３０ｍｍｏｌ／Ｌ）では、ＣＭの回収量が０．０４ｍｇ／ｄＬ以下と極端に少なく、使用出来ない条件であることがわかるが、Ｂ３２％（２００ｍｍｏｌ／Ｌ）では、ＣＭの回収量（０．０９ｍｇ／ｄＬ）が上昇し、使用可能な条件であることがわかる。Ｂ３１％（１９５ｍｍｏｌ／Ｌ）では、ＣＭの回収量が０．２０ｍｇ／ｄＬと更に高い回収量が得られている。これらのことから、使用可能な溶離液１の塩濃度はＢ２８〜３２％（１８０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ）であり、最良の塩濃度はＢ３０〜３１％（１９０〜１９５ｍｍｏｌ／Ｌ）であることがわかった。なお、純度の高いＣＭ画分をピークとして得たい場合には、回収量の低いＢ３２％（２００ｍｍｏｌ／Ｌ）を用いることが、ＣＭ以外のリポ蛋白が含まれる量が低くなると考えられるため、好ましい。 Next, in order to obtain the optimum salt concentration of each eluent, the analysis was performed by changing the salt concentration of eluents 1 and 2. First, the blood sample A was measured at an eluent 1 concentration of B24 to 38% (160 to 230 mmol / L), and the cholesterol value calculated from the peak area of CM was evaluated (Table 1). In B24% (160 mmol / L), the CM cholesterol value was as high as 5.72 mg / dL, and it was estimated that a lipoprotein fraction other than CM was included, but in B28% (180 mmol / L), CM The cholesterol level rapidly decreased to 1.08 mg / dL, and the amount of lipoprotein fraction other than CM decreased. It can be seen that at B 30% (190 mmol / L), the CM cholesterol value is 0.36 mg / dL, the amount of lipoprotein fraction other than CM contained in the CM peak is further reduced, and the purity of CM is increased. In B34, 36, 38% (210, 220, 230 mmol / L), it can be seen that the recovered amount of CM is extremely small, 0.04 mg / dL or less, and it is an unusable condition, but B32% (200 mmol / L) ), The recovered amount of CM (0.09 mg / dL) increases, indicating that it is a usable condition. With B31% (195 mmol / L), the recovered amount of CM is as high as 0.20 mg / dL. From these facts, it can be seen that the usable eluent 1 has a salt concentration of B28 to 32% (180 to 200 mmol / L), and the best salt concentration is B30 to 31% (190 to 195 mmol / L). It was. In addition, when it is desired to obtain a high-purity CM fraction as a peak, it is preferable to use B32% (200 mmol / L) having a low recovery amount because the amount of lipoproteins other than CM is considered to be low. .
続いて、溶離液２について、濃度をＢ３２〜５１％（２００〜２９５ｍｍｏｌ／Ｌ）において、血液試料Ａを測定してＣＭのピーク面積から算出されるコレステロール値を評価した（表２）。Ｂ３２％（２００ｍｍｏｌ／Ｌ）では、ＣＭコレステロール値が０．１０ｍｇ／ｄＬと低く、ＣＭが溶離液２で完全に溶出されないことが予想された。Ｂ３４％（２１０ｍｍｏｌ／Ｌ）では、ＣＭコレステロール値が０．２０ｍｇ／ｄＬと上昇し、良好に分離されていると判断できる。Ｂ４１％（２４５ｍｍｏｌ／Ｌ）では、ＣＭコレステロール値が０．３１ｍｇ／ｄＬと更に高くなり、更に良好に分離されたと判断された。Ｂ５１％（２９５ｍｍｏｌ／Ｌ）では、ＣＭコレステロール値が１．８２ｍｇ／ｄＬと高くなり、溶離液２でＣＭだけでなく、Ｌｐ（ａ）も一部溶出していることが予想された。Ｂ４８％（２８０ｍｍｏｌ／Ｌ）では、ＣＭコレステロール値が０．２６ｍｇ／ｄＬと低下し、良好な分離が得られた。Ｂ４７％（２７５ｍｍｏｌ／Ｌ）でも、ＣＭコレステロール値が０．３３ｍｇ／ｄＬとＢ４８％（２８０ｍｍｏｌ／Ｌ）のＣＭコレステロール値（０．２６ｍｇ／ｄＬ）よりやや高く、良好に分離され回収された。これらのことから、使用可能な溶離液２の塩濃度はＢ３４〜４８％（２１０〜２８０ｍｍｏｌ／Ｌ）であり、最良の塩濃度はＢ４１〜４７％（２４５〜２７５ｍｍｏｌ／Ｌ）であることがわかった。 Subsequently, for eluent 2, the blood sample A was measured at a concentration of B32 to 51% (200 to 295 mmol / L), and the cholesterol value calculated from the peak area of CM was evaluated (Table 2). With B32% (200 mmol / L), the CM cholesterol value was as low as 0.10 mg / dL, and it was expected that CM would not be completely eluted with eluent 2. At B34% (210 mmol / L), the CM cholesterol value rises to 0.20 mg / dL, and it can be judged that it is well separated. With B41% (245 mmol / L), the CM cholesterol value was further increased to 0.31 mg / dL, and it was judged that the B cholesterol was further favorably separated. In B51% (295 mmol / L), the CM cholesterol value was as high as 1.82 mg / dL, and it was predicted that not only CM but also Lp (a) was partially eluted in the eluent 2. With B48% (280 mmol / L), the CM cholesterol value decreased to 0.26 mg / dL, and good separation was obtained. Even with B47% (275 mmol / L), the CM cholesterol values were 0.33 mg / dL and slightly higher than the CM cholesterol value (0.26 mg / dL) of B48% (280 mmol / L), and were well separated and recovered. From these facts, it can be seen that the usable eluent 2 has a salt concentration of B34 to 48% (210 to 280 mmol / L), and the best salt concentration is B41 to 47% (245 to 275 mmol / L). It was.
続いて、溶離液１、２のカラムに流す時間を検討した。検討は、これまでと同様に血液試料Ａを測定してＣＭのピーク面積から算出されるコレステロール値を評価した（表３）。評価における、溶離液１、２の塩濃度をそれぞれＢ３１％（１９５ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｂ４３％（２５５ｍｍｏｌ／Ｌ）溶離液１、２の一定の塩濃度で溶離液を流す時間を０．５分、１分、２分、３分、５分、７分、１０分、１５分、２０分と変化させた。塩濃度を変化させる際には、溶離液の変化によるベースラインのノイズを軽減するために、短い時間のリニアグラディエントを用いているが、その時間はそれぞれ０．１分、０．２分、０．３分、０．５分、０．５分、０．５分、０．５分、０．５分、０．５分とし、１検体当りの測定サイクルはそれぞれ１０分、１２分、１５分、１９分、２５分、３１分、４０分、５５分、７０分とした。なお、これまでの溶離液１、２の評価に使用した分析条件は、溶離液１、２の一定の塩濃度で溶離液を流す時間が５分の条件にあたる。溶離液を流す時間が０．５分ではＣＭコレステロール値が１８１．０５ｍｇ／ｄＬとＣＭ以外のリポ蛋白が多く含まれ、分離が良好ではないと言える。溶離液を流す時間が２分においては、ＣＭコレステロール値が０．９７ｍｇ／ｄＬと良好に分離されたと判断できる。特に、溶離液を流す時間３分（ＣＭコレステロール値 ０．５１ｍｇ／ｄＬ）から、溶離液を流す時間１０分（ＣＭコレステロール値 ０．２６ｍｇ／ｄＬ）においては、良好に分離されたと判断された。これらの結果から、溶離液を流す量は２分（カラム体積の６倍）以上、好ましくは、３分（カラム体積の９倍）から１０分（カラム体積の２８倍）が望ましい。 Subsequently, the time for the eluents 1 and 2 to flow through the columns was examined. In the examination, blood sample A was measured as before, and the cholesterol value calculated from the peak area of CM was evaluated (Table 3). In the evaluation, the salt concentration of the eluents 1 and 2 was 0.5% for the time of flowing the eluent at a constant salt concentration of B31% (195 mmol / L) and B43% (255 mmol / L) eluents 1 and 2, respectively. It was changed to 1 minute, 2 minutes, 3 minutes, 5 minutes, 7 minutes, 10 minutes, 15 minutes, and 20 minutes. When changing the salt concentration, a short-time linear gradient is used to reduce baseline noise due to changes in the eluent, but the times are 0.1 minutes, 0.2 minutes, and 0, respectively. 3 minutes, 0.5 minutes, 0.5 minutes, 0.5 minutes, 0.5 minutes, 0.5 minutes, and 0.5 minutes, and the measurement cycle per sample is 10 minutes, 12 minutes, and 15 minutes, respectively. Minutes, 19 minutes, 25 minutes, 31 minutes, 40 minutes, 55 minutes, and 70 minutes. In addition, the analysis conditions used for the evaluation of the eluents 1 and 2 so far are the conditions in which the eluent is allowed to flow at a constant salt concentration of the eluents 1 and 2 for 5 minutes. When the eluent flow time is 0.5 minutes, the CM cholesterol value is 181.05 mg / dL, which contains a large amount of lipoproteins other than CM, and it can be said that the separation is not good. It can be determined that when the eluent flow time was 2 minutes, the CM cholesterol value was well separated as 0.97 mg / dL. In particular, it was judged that the separation was good when the eluent flow time was 3 minutes (CM cholesterol value 0.51 mg / dL) and the eluent flow time 10 minutes (CM cholesterol value 0.26 mg / dL). From these results, the flow rate of the eluent is preferably 2 minutes (6 times the column volume) or more, preferably 3 minutes (9 times the column volume) to 10 minutes (28 times the column volume).
（実施例２）
実施例１と同じ装置を用い、ＣＭとＬｐ（ａ）と同時にＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬを分離分析する測定法の検討を行った。
溶離液の溶出パターンは、０．０分から３．５分はＢの組成を２０．０％に固定、３．５分から８．５分はＢの組成を２４．０％に固定、８．５分から１１．０分はＢの組成を２７．０％に固定、１１．０分から１４．５分はＢの組成を３２．０％に固定、１４．５分から１７．５分はＢの組成を４５．０％に固定、１７．５分から１８．５分はＢの組成を４５．０％から１００．０％にリニアグラディエント、１８．５分から２１．５分はＢの組成を１００．０％に固定、２１．５分から２２．５分はＢの組成を１００．０％から２０．０％にリニアグラディエント、２２．５分から３１．０分はＢの組成を１００．０％に固定とした。なお、１検体の測定時間は３１分とした。
(Example 2)
Using the same apparatus as in Example 1, a measurement method for separating and analyzing HDL, LDL, IDL, and VLDL simultaneously with CM and Lp (a) was examined.
The elution pattern of the eluent is that the composition of B is fixed at 20.0% from 0.0 to 3.5 minutes, the composition of B is fixed at 24.0% from 3.5 to 8.5 minutes, 8.5 From 1 to 11.0 minutes, the B composition is fixed at 27.0%. From 11.0 to 14.5 minutes, the B composition is fixed at 32.0%. From 14.5 to 17.5 minutes, the B composition is fixed. Fixed at 45.0%, 17.5 min to 18.5 min B composition from 45.0% to 100.0% linear gradient, 18.5 min to 21.5 min B composition to 100.0% The composition of B was fixed at a linear gradient from 100.0% to 20.0% from 21.5 minutes to 22.5 minutes, and the composition of B was fixed at 100.0% from 22.5 minutes to 31.0 minutes. . The measurement time for one sample was 31 minutes.
健常人の血清検体と、健常人から超遠心分離装置を用いた方法で得られたＨＤＬ（比重（比重１．１２５ｍｇ／ｍｌ以上）、Ｌｐ（ａ）（比重１．０６０〜１．１２５ｍｇ／ｍｌ）、ＬＤＬ（比重１．０１９〜１．０６０ｍｇ／ｍｌ）、ＩＤＬ（比重１．００６〜１．０１９ｍｇ／ｍｌ）、ＶＬＤＬ（比重０．９３０〜１．００６ｍｇ／ｍｌ）、高脂血症患者から超遠心分離装置を用いた方法で得られたＣＭ（比重０．９４ｍｇ／ｍｌ以下）を測定した。 Serum specimens of healthy individuals, and HDL (specific gravity (specific gravity 1.125 mg / ml or more), Lp (a) (specific gravity 1.060 to 1.125 mg / ml) obtained from a healthy person by a method using an ultracentrifugation apparatus ), LDL (specific gravity 1.019 to 1.060 mg / ml), IDL (specific gravity 1.006 to 1.019 mg / ml), VLDL (specific gravity 0.930 to 1.006 mg / ml), from hyperlipidemic patients CM (specific gravity of 0.94 mg / ml or less) obtained by a method using an ultracentrifugation apparatus was measured.
ＨＤＬ試料については、溶出時間３．３分に主たるピークが見られ、Ｌｐ（ａ）試料については、溶出時間３．３分に主たるピークが見られ、７．３分と２１．６分にマイナーなピークが確認され、ＬＤＬ試料は、溶出時間７．５分に主たるピークが見られ、溶出時間１２．４分にマイナーなピークが確認された。Ｌｐ（ａ）試料には、Ｌｐ（ａ）とＨＤＬとＬＤＬの混合物であるので、Ｌｐ（ａ）試料を測定したときの、３．３分のピークはＨＤＬであり、７．３分のピークはＬＤＬであり、２１．６分のピークがＬｐ（ａ）であると考えられる。ＩＤＬ試料は、溶出時間１２．４分に主たるピークが見られ、溶出時間１４．８分にマイナーなピークが確認され、ＶＬＤＬ試料は、溶出時間１４．８分に主たるピークが見られ、溶出時間１８．２分にマイナーなピークが確認され、ＣＭ試料では、溶出時間１８．２分に主たるピークが見られた（図４）。また、この分離条件において、健常人の血清検体を測定し、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ、Ｌｐ（ａ）のピークをコレステロール反応液と混合せずに、各ピークについてピークトップを中心として１．５分間取得し、このフラクション試料を５％アクリルアミド濃度のＳＤＳ電気泳動を行い、ウエスタンブロットの手法により解析した。なお、抗体は人のアポリポ蛋白Ｂ１００とアポリポ蛋白（ａ）に対するヤギポリクロナール抗体とヤギ抗体に対するウサギ抗体にアルカリフォスファターゼを結合させた２次抗体を用いた。発色には化学発光基質（ＣＤＰ−ｓｔａｒ パーキンエルマ社）を用いた。結果を図５に示したが、アポリポ蛋白Ｂ１００抗体を用いた解析結果においては、予想通りＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、Ｌｐ（ａ）において、アポリポ蛋白Ｂ１００の強いバンドが検出され、ＣＭについても弱いバンドが検出され、ＨＤＬについては検出されなかった。また、アポリポ蛋白（ａ）抗体を用いた解析結果においても、予想通り、Ｌｐ（ａ）においてのみアポリポ蛋白（ａ）が検出された。なお、アポリポ蛋白（ａ）はＬｐ（ａ）の構成蛋白である。これらの結果から、健常人の血清検体において見られる溶出時間３．３分、７．５分、１２．４分、１４．８分、１８．２分、２１．６分のピークは、それぞれ、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ、Ｌｐ（ａ）のピークであると言える（図４）。 For the HDL sample, a main peak is observed at an elution time of 3.3 minutes, and for the Lp (a) sample, a main peak is observed at an elution time of 3.3 minutes, and minor at 7.3 and 21.6 minutes. In the LDL sample, a main peak was observed at an elution time of 7.5 minutes, and a minor peak was observed at an elution time of 12.4 minutes. Since the Lp (a) sample is a mixture of Lp (a), HDL and LDL, the peak at 3.3 minutes when the Lp (a) sample is measured is HDL, and the peak at 7.3 minutes Is LDL, and the peak at 21.6 minutes is considered to be Lp (a). In the IDL sample, a main peak was observed at an elution time of 12.4 minutes, a minor peak was confirmed at an elution time of 14.8 minutes, and in the VLDL sample, a main peak was observed at an elution time of 14.8 minutes. A minor peak was confirmed at 18.2 minutes, and the main peak was observed in the CM sample at an elution time of 18.2 minutes (FIG. 4). In this separation condition, a serum sample of a healthy person is measured, and the HDL, LDL, IDL, VLDL, CM, and Lp (a) peaks are not mixed with the cholesterol reaction solution, and each peak is centered on the peak top. After 1.5 minutes, this fraction sample was subjected to SDS electrophoresis at a 5% acrylamide concentration and analyzed by Western blotting. The antibody used was a secondary antibody in which alkaline phosphatase was bound to a goat polyclonal antibody against human apolipoprotein B100 and apolipoprotein (a) and a rabbit antibody against goat antibody. A chemiluminescent substrate (CDP-star Perkin Elma) was used for color development. The results are shown in FIG. 5. In the analysis results using the apolipoprotein B100 antibody, a strong band of apolipoprotein B100 was detected in LDL, IDL, VLDL, and Lp (a) as expected, and the CM was also weak. Was detected, but not for HDL. Further, in the analysis results using the apolipoprotein (a) antibody, as expected, apolipoprotein (a) was detected only in Lp (a). Apolipoprotein (a) is a constituent protein of Lp (a). From these results, peaks of elution time 3.3 minutes, 7.5 minutes, 12.4 minutes, 14.8 minutes, 18.2 minutes, 21.6 minutes seen in serum samples of healthy individuals are respectively shown. It can be said that the peaks are HDL, LDL, IDL, VLDL, CM, and Lp (a) (FIG. 4).
（実施例３）
実施例２の分析条件を用いて、メタボリックシンドローム８例（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ）、健常人１４例について、種々の項目を比較した（表４）。なお、用いた症例はすべて男性である。有為差検定には、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ法を用いた。一般的にメタボリックシンドロームの判定に有用であると言われているアディポネクチン（非特許文献７）については、測定したところ推測通り、健常人に比べメタボリックシンドローム群で低値であり、有為差が認められた（表４、図６）。続いて、本発明により得られた測定値であるＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ、Ｌｐ（ａ）の６つのリポ蛋白に含まれるコレステロール値を比較した。ＨＤＬについては、メタボリックシンドロームの診断基準にも含まれている項目であるので、当然有為差は認められた（表４、図７）。ＬＤＬとＩＤＬについては、健常人とメタボリックシンドロームにおいて有為差は認められなかった（表４、図８、９）。ＶＬＤＬとＣＭについては、健常人とメタボリックシンドロームにおいて有為差が認められ、メタボリックシンドロームを判別するに能力の高い指標になることが確認された（表４、図１０、１１）。ＶＬＤＬとＣＭについて、健常人とメタボリックシンドロームを有為差検定したときのＵ値は、ＶＬＤＬで１７．５、ＣＭで８．５となり、特にＣＭでその有為差は高かった。なお、アディポネクチンについて有為差検定を行ったときのＵ値は、８．０でありＣＭのＵ値（８．５）と同等であることから、アディポネクチンとＣＭコレステロール値のメタボリックシンドロームの判別能力は同等であると言える。このような、判別を行う場合には、通常、健常人を複数測定し、それらの値の平均値＋２倍の標準偏差の値を閾値として、対象者を判別する。本技術の場合には、表４の結果から、ＶＬＤＬコレステロールの場合、その値が健常人の平均値＋２倍の標準偏差１６．３ｍｇ／ｄＬより高いと、その対象者がメタボリックシンドロームであると判定でき、また、ＣＭコレステロールの場合、その値が健常人の平均値＋２倍の標準偏差２．４ｍｇ／ｄＬより高いと、その対象者がメタボリックシンドロームであると判定できる。表４のメタボリックシンドローム８名のデータにこの閾値を当てはめると、８名中の６名がＶＬＤＬコレステロールの場合でもＣＭコレステロールの場合でも判別できることがわかる（表５中のメタボリックシンドローム検体番号３番と４番は判別できてない）。この結果を考えても、図１０および図１１のそれぞれの値の分布を見ても、ＶＬＤＬコレステロール値、および、ＣＭコレステロール値はメタボリックシンドロームの判別において優れた性能を持つことは明らかである。Ｌｐ（ａ）については、健常人とメタボリックシンドロームにおいて有為差が認められメタボロックシンドロームで高値を示しているものの、個々のデータを見ると、３名の健常人で３ｍｇ／ｄＬより高く、メタボリックシンドロームを判別する指標として望ましくないことが確認された（表４、図１２）。
(Example 3)
Using the analysis conditions of Example 2, various items were compared for metabolic syndrome (8 cases) (Metabolic) and 14 healthy subjects (Table 4). All cases used were male. The Mann-Whitney method was used for the significant difference test. As for adiponectin (Non-patent Document 7), which is generally said to be useful for the determination of metabolic syndrome, as measured, it is lower in the metabolic syndrome group than in healthy individuals, and there is a significant difference. (Table 4, FIG. 6). Subsequently, the cholesterol values contained in the six lipoproteins of HDL, LDL, IDL, VLDL, CM, and Lp (a), which were measured values obtained by the present invention, were compared. Since HDL is an item included in the diagnostic criteria for metabolic syndrome, a significant difference was naturally recognized (Table 4, FIG. 7). Regarding LDL and IDL, no significant difference was observed between healthy subjects and metabolic syndrome (Table 4, FIGS. 8 and 9). Regarding VLDL and CM, a significant difference was observed between healthy subjects and metabolic syndrome, and it was confirmed that the indicators were highly capable of discriminating metabolic syndrome (Table 4, FIGS. 10 and 11). Regarding VLDL and CM, the U value when a healthy person and a metabolic syndrome were tested for a significant difference was 17.5 for VLDL and 8.5 for CM, and the significant difference was particularly high for CM. Since the U value when a significant difference test is performed for adiponectin is 8.0, which is equivalent to the U value of CM (8.5), the ability to discriminate the metabolic syndrome between adiponectin and CM cholesterol is It can be said that they are equivalent. When such discrimination is performed, usually, a plurality of healthy persons are measured, and the target person is discriminated using an average value of those values + 2 times the standard deviation as a threshold value. In the case of the present technology, from the results of Table 4, in the case of VLDL cholesterol, if the value is higher than the average value of healthy individuals + 2 times the standard deviation of 16.3 mg / dL, it is determined that the subject has metabolic syndrome In the case of CM cholesterol, if the value is higher than the average value of healthy individuals + 2 times the standard deviation of 2.4 mg / dL, it can be determined that the subject has metabolic syndrome. By applying this threshold value to the data of 8 metabolic syndromes in Table 4, it can be seen that 6 out of 8 cases can be discriminated whether they are VLDL cholesterol or CM cholesterol (Metabolic Syndrome Specimen Nos. 3 and 4 in Table 5). The number cannot be determined). Considering this result and looking at the distribution of the respective values in FIG. 10 and FIG. 11, it is clear that the VLDL cholesterol value and the CM cholesterol value have excellent performance in determining the metabolic syndrome. As for Lp (a), a significant difference was observed between healthy individuals and metabolic syndrome, and high values were observed in metabolic syndrome. However, when individual data were viewed, it was higher than 3 mg / dL in 3 healthy individuals, It was confirmed that it is not desirable as an index for discriminating the syndrome (Table 4, FIG. 12).
１ 溶離液Ａ
２ 溶離液Ｂ
３ 脱気装置
４ ポンプ
５ ミキサー
６ オートサンプラー
７ フィルター
８ カラム
９ カラムオーブン
１０ コレステロール反応液
１１ エアートラップ
１２ コレステロール反応液のためのポンプ
１３ 抵抗管
１４ 反応コイル
１５ 検出器
1 Eluent A
2 Eluent B
3 Deaerator 4 Pump 5 Mixer 6 Autosampler 7 Filter 8 Column 9 Column Oven 10 Cholesterol Reaction Liquid 11 Air Trap 12 Pump for Cholesterol Reaction Liquid 13 Resistance Tube 14 Reaction Coil 15 Detector
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