JP2008208079A - Reagent set for cross-linking protein - Google Patents
Reagent set for cross-linking protein Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008208079A JP2008208079A JP2007047139A JP2007047139A JP2008208079A JP 2008208079 A JP2008208079 A JP 2008208079A JP 2007047139 A JP2007047139 A JP 2007047139A JP 2007047139 A JP2007047139 A JP 2007047139A JP 2008208079 A JP2008208079 A JP 2008208079A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cross
- acid residue
- group
- linking
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Abstract
Description
本発明は、架橋部位近傍の環境に関する情報を得ることができるタンパク質架橋試薬セット、及び該タンパク質架橋試薬セットを用いることを特徴とするタンパク質架橋部位の近傍の荷電状態の検査方法に関する。 The present invention relates to a protein cross-linking reagent set capable of obtaining information on the environment in the vicinity of the cross-linking site, and a method for examining the charge state in the vicinity of the protein cross-linking site, characterized in that the protein cross-linking reagent set is used.
タンパク質の機能解明は、生命現象の解明や有効な医薬品の開発等において、重要な課題である。生体においては、主にタンパク質が機能因子として働いているためである。多くの場合、タンパク質の機能は、タンパク質の立体構造やタンパク質間の相互作用に依存している。このため、タンパク質の機能を解明するためには、複数のタンパク質間の相互作用に関する情報や、複数のタンパク質から構成されたタンパク質複合体の構造、物性、機能等に関する情報を入手することが、特に重要である。 Elucidation of protein functions is an important issue in elucidating biological phenomena and developing effective pharmaceuticals. This is because in the living body, proteins mainly function as functional factors. In many cases, the function of a protein depends on the three-dimensional structure of the protein and the interaction between proteins. For this reason, in order to elucidate the function of a protein, it is particularly necessary to obtain information on the interaction between multiple proteins and information on the structure, physical properties, functions, etc. of a protein complex composed of multiple proteins. is important.
タンパク質間相互作用やタンパク質複合体解析のための手法として、トポロジー解析が挙げられる。トポロジー解析とは、タンパク質分子間又はタンパク質複合体内で、架橋試薬を用いて架橋反応を行い、得られた架橋産物を解析するものである。解析の目的に応じた、種々の架橋試薬が開示されている。例えば、異種アミノ酸残基の側鎖と選択的に反応させるため、異種の官能基を導入した架橋試薬として、Ｎ−（１１−マレイミドウンデカノイルオキシ）スクシンイミド等の、アミノ基とチオール基との架橋反応が可能な異反応性二価性架橋試薬がある。該異反応性二価性架橋試薬は、例えば、マレイミド基とＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステル基を分子の両端にもち、タンパク質のアミノ基に対しては活性化エステル基が、チオール基に対してはマレイミド基が、それぞれ選択的に反応する。 Topological analysis is a technique for analyzing protein-protein interactions and protein complexes. In the topology analysis, a cross-linking reaction is performed using a cross-linking reagent between protein molecules or in a protein complex, and the obtained cross-linked product is analyzed. Various cross-linking reagents are disclosed depending on the purpose of analysis. For example, in order to selectively react with a side chain of a heterogeneous amino acid residue, as a cross-linking reagent into which a heterogeneous functional group is introduced, N- (11-maleimidoundecanoyloxy) succinimide or the like, an amino group and a thiol group There are different reactive divalent crosslinking reagents capable of crosslinking reaction. The heteroreactive divalent crosslinking reagent has, for example, a maleimide group and an N-hydroxysuccinimide activated ester group at both ends of the molecule, an activated ester group for a protein amino group, and a thiol group. Each reacts selectively with a maleimide group.
また、（１）メチレン鎖長の異なるジスクシンイミド系２価性架橋試薬が開示されている（例えば、非特許文献１参照）。該２価性架橋試薬は、１の架橋試薬内に２の官能基を有しており、該２官能基間のメチレン鎖長が異なる数種の該２価性架橋試薬を用いて架橋処理することにより、タンパク質間の架橋距離やタンパク質複合体の位置関係を明らかにすることができるものである。その他、検出の高感度化を図るため、蛍光原子団を導入した架橋試薬等がある。
タンパク質と架橋試薬との架橋反応に限らず、タンパク質と他の物質との結合においては、タンパク質の結合部位近傍の環境、特に、静電的に中性なのか、又は正若しくは負に帯電しているのか、というような静電的環境は、タンパク質間相互作用において非常に重要な因子である。にもかかわらず、上記異反応性二価性架橋試薬や上記（１）の架橋試薬のような、現在トポロジー解析に用いられている架橋試薬は、タンパク質の架橋部位の反応性や、架橋部位同士の距離や位置関係についての情報、すなわち、架橋部位自身についての情報を得ることはできるが、架橋部位の近傍の環境についての情報は得ることができない、という問題があった。 Not only in the cross-linking reaction between protein and cross-linking reagent, but in the binding between protein and other substances, the environment in the vicinity of the protein binding site, especially electrostatically neutral or charged positively or negatively The electrostatic environment, such as whether or not, is a very important factor in protein-protein interactions. Nevertheless, the cross-linking reagents currently used in the topology analysis, such as the heteroreactive divalent cross-linking reagent and the cross-linking reagent of (1) above, are reactive with the cross-linking sites of proteins, However, there is a problem that it is possible to obtain information about the distance and the positional relationship of each other, that is, information about the crosslinked site itself, but not information about the environment in the vicinity of the crosslinked site.
本発明は、タンパク質分子間及びタンパク質複合体のトポロジー解析におけるタンパク質架橋部位の近傍の局所環境情報、特に静電的環境についての情報を入手可能な架橋試薬を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a cross-linking reagent capable of obtaining information on local environment between protein molecules and in the vicinity of a protein cross-linking site in a topology analysis of a protein complex, particularly information on an electrostatic environment.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、基本骨格がペプチド鎖で構成されており、２の官能基を有する架橋試薬であって、該２の官能基のうち、１の官能基の近傍のペプチド鎖を構成するアミノ酸残基の電荷のみが異なる２種類又は３種類の架橋試薬を用いて架橋処理を行い、それぞれの架橋試薬により得られた架橋産物の量を比較検討することにより、タンパク質架橋部位の近傍の荷電状態についての情報を得ることが可能であることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that the basic skeleton is composed of a peptide chain and is a cross-linking reagent having two functional groups. Perform cross-linking treatment using two or three different cross-linking reagents that differ only in the charge of the amino acid residues that make up the peptide chain in the vicinity of the functional group, and compare the amount of cross-linking products obtained with each cross-linking reagent As a result, it was found that it was possible to obtain information about the charge state in the vicinity of the protein cross-linking site, and the present invention was completed.
すなわち、本発明は、基本骨格がペプチド鎖で構成されており、官能基１と官能基２を有する架橋試薬１と、官能基１の近傍の電荷のみが、前記架橋試薬１と異なる架橋試薬２と、を有することを特徴とするタンパク質架橋試薬セットを提供するものである。
また、本発明は、基本骨格がペプチド鎖で構成されており、官能基１と官能基２を有する架橋試薬１と、官能基１の近傍の電荷のみが、前記架橋試薬１と異なる架橋試薬２と、官能基１の近傍の電荷のみが、前記架橋試薬１と前記架橋試薬２のいずれとも異なる架橋試薬３と、を有することを特徴とするタンパク質架橋試薬セットを提供するものである。
また、本発明は、前記官能基１と前記官能基２が、前記ペプチド鎖の両端にあることを特徴とするタンパク質架橋試薬セットを提供するものである。
また、本発明は、前記官能基１と前記官能基２が、同一種類の官能基であることを特徴とするタンパク質架橋試薬セットを提供するものである。
また、本発明は、前記官能基が、活性化エステル基であることを特徴とするタンパク質架橋試薬セットを提供するものである。
また、本発明は、前記活性化エステル基が、スクシンイミドエステル基であることを特徴とするタンパク質架橋試薬セットを提供するものである。
また、本発明は、前記ペプチド鎖が標識されていることを特徴とするタンパク質架橋試薬セットを提供するものである。
また、本発明は、前記標識が、蛍光標識であることを特徴とするタンパク質架橋試薬セットを提供するものである。
また、本発明は、前記蛍光標識が、ＮＢＤ（４−ニトロベンゾキサ−１，３−ジアゾール）、ＤＡＮＳＬ（５−ジメチルアミノナフタレンスルホニル）、フルオレセイン、及びローダミンからなる群より選ばれる１以上の蛍光母核を有する蛍光物質を用いた蛍光標識であることを特徴とするタンパク質架橋試薬セットを提供するものである。
また、本発明は、前記架橋試薬１が、下記式（１）で表され、
Ａ1−（Ａ2）ｍ−（Ａ3）ｎ−Ａ3a （１）
（但し、Ａ1はアミノ基に蛍光物質が導入されかつ側鎖のカルボキシル基が活性エステル化されたグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基であり；Ａ2は中性アミノ酸残基であり；Ａ3は（ａ）中性アミノ酸残基、（ｂ）アルギニン残基又はヒスチジン残基、（ｃ）グルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基、からなる群より選ばれる１種のアミノ酸残基であり；Ａ3aは、前記Ａ3のα−カルボキシル基が活性エステル化されたアミノ酸残基であり；ｍ及びｎは、０〜３の整数であり、かつｍ≧ｎである。）
前記架橋試薬２が、下記式（２）で表される
Ａ1−（Ａ2）ｍ−（Ａ4）ｎ−Ａ4a 式（２）
（但し、Ａ1はアミノ基に蛍光物質が導入されかつ側鎖のカルボキシル基が活性エステル化されたグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基であり；Ａ2は中性アミノ酸残基であり；Ａ4は前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）からなる群より選ばれ、かつ前記Ａ3とは異なる１種のアミノ酸残基であり；Ａ4aは、前記Ａ4のα−カルボキシル基が活性エステル化されたアミノ酸残基であり；ｍ及びｎは、０〜３の整数であり、かつｍ≧ｎである。）
ことを特徴とするタンパク質架橋試薬セットを提供するものである。
また、本発明は、前記架橋試薬１が、下記式（１）で表され、
Ａ1−（Ａ2）ｍ−（Ａ3）ｎ−Ａ3a （１）
（但し、Ａ1はアミノ基に蛍光物質が導入されかつ側鎖のカルボキシル基が活性エステル化されたグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基であり；Ａ2は中性アミノ酸残基であり；Ａ3は（ａ）中性アミノ酸残基、（ｂ）アルギニン残基又はヒスチジン残基、（ｃ）グルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基、からなる群より選ばれる１種のアミノ酸残基であり；Ａ3aは、前記Ａ3のα−カルボキシル基が活性エステル化されたアミノ酸残基であり；ｍ及びｎは、０〜３の整数であり、かつｍ≧ｎである。）
前記架橋試薬２が、下記式（２）で表され、
Ａ1−（Ａ2）ｍ−（Ａ4）ｎ−Ａ4a 式（２）
（但し、Ａ1はアミノ基に蛍光物質が導入されかつ側鎖のカルボキシル基が活性エステル化されたグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基であり；Ａ2は中性アミノ酸残基であり；Ａ4は前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）からなる群より選ばれ、かつ前記Ａ3とは異なる１種のアミノ酸残基であり；Ａ4aは、前記Ａ4のα−カルボキシル基が活性エステル化されたアミノ酸残基であり；ｍ及びｎは、０〜３の整数であり、かつｍ≧ｎである。）
前記架橋試薬３が、下記式（３）で表される
Ａ1−（Ａ2）ｍ−（Ａ5）ｎ−Ａ5a 式（３）
（但し、Ａ1はアミノ基に蛍光物質が導入されかつ側鎖のカルボキシル基が活性エステル化されたグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基であり；Ａ2は中性アミノ酸残基であり；Ａ5は前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）からなる群より選ばれ、かつ前記Ａ3及びＡ4とは異なる１種のアミノ酸残基であり；Ａ5aは、前記Ａ5のα−カルボキシル基が活性エステル化されたアミノ酸残基であり；ｍ及びｎは、０〜３の整数であり、かつｍ≧ｎである。）
ことを特徴とするタンパク質架橋試薬セットを提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のタンパク質架橋試薬セットを用いて、タンパク質分子内又は分子間を架橋することにより、官能基１が架橋するタンパク質架橋部位の近傍の荷電状態の検査方法を提供するものである。
That is, in the present invention, the basic skeleton is composed of a peptide chain, the crosslinking reagent 1 having the functional group 1 and the functional group 2, and the crosslinking reagent 2 that is different from the crosslinking reagent 1 only in the charge in the vicinity of the functional group 1. And a protein cross-linking reagent set.
In the present invention, the basic skeleton is composed of a peptide chain, the crosslinking reagent 1 having the functional group 1 and the functional group 2, and the crosslinking reagent 2 that is different from the crosslinking reagent 1 only in the vicinity of the functional group 1. And a cross-linking reagent 3 in which only the charge in the vicinity of the functional group 1 is different from both the cross-linking reagent 1 and the cross-linking reagent 2 is provided.
The present invention also provides a protein cross-linking reagent set, wherein the functional group 1 and the functional group 2 are at both ends of the peptide chain.
The present invention also provides a protein crosslinking reagent set, wherein the functional group 1 and the functional group 2 are the same type of functional group.
In addition, the present invention provides a protein crosslinking reagent set, wherein the functional group is an activated ester group.
The present invention also provides a protein crosslinking reagent set, wherein the activated ester group is a succinimide ester group.
The present invention also provides a protein cross-linking reagent set, wherein the peptide chain is labeled.
The present invention also provides a protein cross-linking reagent set, wherein the label is a fluorescent label.
In the invention, it is preferable that the fluorescent label is one or more fluorescent substances selected from the group consisting of NBD (4-nitrobenzoxa-1,3-diazole), DANSL (5-dimethylaminonaphthalenesulfonyl), fluorescein, and rhodamine. The present invention provides a protein cross-linking reagent set characterized by being a fluorescent label using a fluorescent substance having a mother nucleus.
In the present invention, the crosslinking reagent 1 is represented by the following formula (1):
A 1- (A 2 ) m- (A 3 ) n-A 3a (1)
(However, A 1 is a glutamic acid residue or aspartic acid residue in which a fluorescent substance is introduced into an amino group and a side chain carboxyl group is active esterified; A 2 is a neutral amino acid residue; A 3 Is one amino acid residue selected from the group consisting of (a) neutral amino acid residues, (b) arginine residues or histidine residues, (c) glutamic acid residues or aspartic acid residues; A 3a Is an amino acid residue in which the α-carboxyl group of A 3 is active esterified; m and n are integers of 0 to 3 and m ≧ n.
The crosslinking reagent 2 is represented by the following formula (2): A 1- (A 2 ) m- (A 4 ) n-A 4a formula (2)
(Where A 1 is a glutamic acid residue or aspartic acid residue in which a fluorescent substance is introduced into the amino group and the side chain carboxyl group is active esterified; A 2 is a neutral amino acid residue; A 4 Is an amino acid residue selected from the group consisting of (a), (b), and (c) and different from A 3 ; A 4a is an active α-carboxyl group of A 4 Esterified amino acid residues; m and n are integers from 0 to 3 and m ≧ n.)
The present invention provides a protein cross-linking reagent set.
In the present invention, the crosslinking reagent 1 is represented by the following formula (1):
A 1- (A 2 ) m- (A 3 ) n-A 3a (1)
(However, A 1 is a glutamic acid residue or aspartic acid residue in which a fluorescent substance is introduced into an amino group and a side chain carboxyl group is active esterified; A 2 is a neutral amino acid residue; A 3 Is one amino acid residue selected from the group consisting of (a) neutral amino acid residues, (b) arginine residues or histidine residues, (c) glutamic acid residues or aspartic acid residues; A 3a Is an amino acid residue in which the α-carboxyl group of A 3 is active esterified; m and n are integers of 0 to 3 and m ≧ n.
The crosslinking reagent 2 is represented by the following formula (2):
A 1 - (A 2) m- (A 4) n-A 4a formula (2)
(Where A 1 is a glutamic acid residue or aspartic acid residue in which a fluorescent substance is introduced into the amino group and the side chain carboxyl group is active esterified; A 2 is a neutral amino acid residue; A 4 Is an amino acid residue selected from the group consisting of (a), (b), and (c) and different from A 3 ; A 4a is an active α-carboxyl group of A 4 Esterified amino acid residues; m and n are integers from 0 to 3 and m ≧ n.)
The cross-linking reagent 3 is represented by the following formula (3): A 1- (A 2 ) m- (A 5 ) n-A 5a formula (3)
Wherein A 1 is a glutamic acid residue or aspartic acid residue in which a fluorescent substance is introduced into the amino group and the side chain carboxyl group is active esterified; A 2 is a neutral amino acid residue; A 5 Is an amino acid residue selected from the group consisting of (a), (b) and (c) and different from A 3 and A 4 ; A 5a is the α-carboxyl of A 5 The group is an active esterified amino acid residue; m and n are integers from 0 to 3 and m ≧ n.)
The present invention provides a protein cross-linking reagent set.
In addition, the present invention provides a method for inspecting a charged state in the vicinity of a protein cross-linking site where functional group 1 cross-links by cross-linking protein molecules within or between protein molecules using any of the protein cross-linking reagent sets described above. To do.
本発明のタンパク質架橋試薬セットを用いることにより、架橋処理により得られた架橋産物の量を比較検討するだけで、タンパク質架橋部位の近傍が、静電的に中性なのか、又は正若しくは負に帯電しているのか、という荷電状態、すなわち静電的環境についての情報を得ることができる。通常の架橋反応と同様に、単にタンパク質と該タンパク質架橋試薬を反応させるだけでよいため、よりネイティブな構造のタンパク質の局所的な環境の情報を得ることができる。
また、本発明のタンパク質架橋部位の近傍の荷電状態の検査方法により、立体構造解析等を要することなく、簡便に、タンパク質架橋部位の近傍の静電的環境についての情報を得ることができる。
By using the protein cross-linking reagent set of the present invention, it is possible to determine whether the vicinity of the protein cross-linking site is electrostatically neutral or positive or negative by simply examining the amount of the cross-linked product obtained by the cross-linking treatment. It is possible to obtain information about a charged state, that is, whether it is charged, that is, an electrostatic environment. Similar to the normal cross-linking reaction, it is only necessary to react the protein with the protein cross-linking reagent, so that information on the local environment of the protein having a more native structure can be obtained.
In addition, according to the method for inspecting a charge state in the vicinity of a protein cross-linking site of the present invention, information on the electrostatic environment in the vicinity of the protein cross-linking site can be easily obtained without requiring a three-dimensional structure analysis or the like.
本発明において架橋試薬とは、タンパク質を架橋する試薬を意味する。同一種類のタンパク質分子間を架橋する試薬であってもよく、異種類のタンパク質分子間を架橋する試薬であってもよい。また、タンパク質分子内を架橋する試薬であってもよい。 In the present invention, the crosslinking reagent means a reagent that crosslinks a protein. It may be a reagent that crosslinks between the same type of protein molecules, or a reagent that crosslinks between different types of protein molecules. Moreover, the reagent which bridge | crosslinks the protein molecule | numerator may be sufficient.
本発明のタンパク質架橋試薬セット（以下、架橋試薬セットと略す。）は、基本骨格がペプチド鎖で構成されており、官能基１と官能基２を有する架橋試薬１と、官能基１の近傍の電荷のみが前記架橋試薬１と異なる架橋試薬２と、を有するタンパク質架橋試薬である。つまり、架橋試薬２は、架橋試薬１のペプチド鎖を構成するアミノ酸残基のうち、官能基１が結合しているアミノ酸残基の近傍のアミノ酸残基のみが、架橋試薬１とは電荷が異なるアミノ酸残基である。 The protein cross-linking reagent set of the present invention (hereinafter abbreviated as a cross-linking reagent set) has a basic skeleton composed of a peptide chain, a cross-linking reagent 1 having a functional group 1 and a functional group 2, and the vicinity of the functional group 1. A protein cross-linking reagent having a cross-linking reagent 2 different from the cross-linking reagent 1 only in charge. That is, the crosslinking reagent 2 is different in charge from the crosslinking reagent 1 only in the amino acid residues in the vicinity of the amino acid residue to which the functional group 1 is bonded among the amino acid residues constituting the peptide chain of the crosslinking reagent 1. An amino acid residue.
官能基１が結合しているアミノ酸残基の近傍のアミノ酸残基とは、静電的環境についての情報を得たい架橋部位の範囲に応じて、適宜決定することができるが、官能基１が結合しているアミノ酸残基又は該アミノ酸残基から１〜３アミノ酸残基であることが好ましく、官能基１が結合しているアミノ酸残基又は該アミノ酸残基の隣のアミノ酸残基であることが特に好ましい。架橋部位に強い影響を与えることができるためである。 The amino acid residue in the vicinity of the amino acid residue to which the functional group 1 is bonded can be appropriately determined according to the range of the crosslinking site for which information on the electrostatic environment is desired. It is preferably a bonded amino acid residue or 1 to 3 amino acid residues from the amino acid residue, and is an amino acid residue to which the functional group 1 is bonded or an amino acid residue next to the amino acid residue. Is particularly preferred. This is because a strong influence can be exerted on the crosslinking site.
ここで、電荷が異なるとは、同種の電荷であって、電荷の絶対量が異なる場合であってもよいが、電荷の種類が異なることが好ましい。電荷の種類が異なるとは、例えば、架橋試薬１が正電荷である場合には、架橋試薬２は負電荷若しくは中性であることを意味する。また、架橋試薬１が中性である場合には、架橋試薬２は正若しくは負電荷であることを意味する。 Here, the different charges may be the same kind of charges and may have different absolute amounts of charges, but the kinds of charges are preferably different. For example, when the cross-linking reagent 1 is positively charged, it means that the cross-linking reagent 2 is negatively charged or neutral. Moreover, when the crosslinking reagent 1 is neutral, it means that the crosslinking reagent 2 has a positive or negative charge.
架橋試薬のペプチド鎖を構成するアミノ酸残基のうち、官能基１が結合しているアミノ酸残基の近傍のアミノ酸残基を、側鎖が正電荷を有するアミノ酸残基とすることで、官能基１の近傍の電荷を正電荷とすることができる。同様に、側鎖が負電荷を有するアミノ酸残基とすることで、官能基１の近傍の電荷を負電荷とすることができ、側鎖が電荷を有さないアミノ酸残基とすることで、官能基１の近傍の電荷を中性とすることができる。側鎖が正電荷を有するアミノ酸残基として、アルギニン残基及びヒスチジン残基が好ましい。側鎖が負電荷を有するアミノ酸残基として、グルタミン酸残基及びアスパラギン酸残基がある。側鎖が電荷を有さないアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基であってもよく、親水性アミノ酸残基であってもよい。また、適当な電荷を有するアミノ酸残基であれば、非天然型のアミノ酸残基であってもよい。 Among the amino acid residues constituting the peptide chain of the cross-linking reagent, the amino acid residue in the vicinity of the amino acid residue to which the functional group 1 is bonded is defined as an amino acid residue having a positive charge on the side chain. A charge in the vicinity of 1 can be a positive charge. Similarly, by making the side chain an amino acid residue having a negative charge, the charge near the functional group 1 can be made a negative charge, and by making the side chain an amino acid residue having no charge, The charge in the vicinity of the functional group 1 can be neutral. Arginine residues and histidine residues are preferred as amino acid residues whose side chains are positively charged. Examples of amino acid residues whose side chains are negatively charged include glutamic acid residues and aspartic acid residues. The amino acid residue whose side chain has no charge may be a hydrophobic amino acid residue or a hydrophilic amino acid residue. In addition, as long as the amino acid residue has an appropriate charge, it may be a non-natural amino acid residue.
本発明の架橋試薬のペプチド鎖を構成するアミノ酸残基のうち、官能基１が結合しているアミノ酸残基の近傍のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基は、いずれのアミノ酸残基であってもよく、非天然型のアミノ酸残基であってもよい。側鎖が電荷を有さないアミノ酸残基であることや、側鎖が比較的小さいアミノ酸残基であることが好ましい。架橋反応において、ペプチド鎖のうち、架橋試薬１と架橋試薬２で共通する部分が及ぼす影響を低く抑えることができるため、官能基１の近傍の電荷の影響をより適正に判断することが可能となるためである。 Of the amino acid residues constituting the peptide chain of the cross-linking reagent of the present invention, amino acid residues other than the amino acid residues near the amino acid residue to which the functional group 1 is bonded may be any amino acid residue. It may be a non-natural amino acid residue. The side chain is preferably an amino acid residue having no charge, or the side chain is preferably a relatively small amino acid residue. In the cross-linking reaction, it is possible to suppress the influence of a portion common to the cross-linking reagent 1 and the cross-linking reagent 2 in the peptide chain, so that the influence of the charge in the vicinity of the functional group 1 can be determined more appropriately. It is to become.
本発明の架橋試薬のペプチド鎖を構成するアミノ酸残基数は、特に限定されるものではなく、架橋反応に用いるタンパク質の大きさや性質等に応じて、適宜決定することができる。３〜７アミノ酸残基から構成されるペプチド鎖であることが好ましい。ペプチド鎖が螺旋構造をとりにくく、ペプチド鎖の長さを、ペプチド鎖を構成するアミノ酸残基数に応じた長さにすることができるためである。その他、アミノ酸残基数を適宜選択することにより、架橋試薬の最大架橋距離を、所望のタンパク質間架橋距離とすることもできる。 The number of amino acid residues constituting the peptide chain of the cross-linking reagent of the present invention is not particularly limited, and can be determined as appropriate according to the size and properties of the protein used for the cross-linking reaction. A peptide chain composed of 3 to 7 amino acid residues is preferred. This is because the peptide chain is less likely to have a helical structure, and the length of the peptide chain can be set to a length corresponding to the number of amino acid residues constituting the peptide chain. In addition, by appropriately selecting the number of amino acid residues, the maximum cross-linking distance of the cross-linking reagent can be set to a desired inter-protein cross-linking distance.
本発明において用いられる官能基は、タンパク質と結合する性質を有する官能基、すなわち、タンパク質が有するアミノ基、カルボキシル基、チオール基等に対して反応性を有する官能基であれば、特に限定されるものではなく、通常架橋試薬に用いられるいずれの官能基を用いても良い。該官能基として、例えば、活性化エステル基、イソチオシアナート基、チオール基、ジスルフィド基等がある。反応性が良好であるため、活性化エステル基であることが好ましい。該活性化エステル基として、例えば、スクシンイミドエステル基、ニトロフェニルエステル基、ペンタフルオロフェニルエステル基、及びベンゾトリアゾールエステル基等がある。特にスクシンイミドエステル基であることが好ましい。 The functional group used in the present invention is particularly limited as long as it is a functional group having a property of binding to a protein, that is, a functional group having reactivity with an amino group, a carboxyl group, a thiol group, etc. of the protein. Any functional group that is usually used in a crosslinking reagent may be used. Examples of the functional group include an activated ester group, an isothiocyanate group, a thiol group, and a disulfide group. Since the reactivity is good, it is preferably an activated ester group. Examples of the activated ester group include a succinimide ester group, a nitrophenyl ester group, a pentafluorophenyl ester group, and a benzotriazole ester group. Particularly preferred is a succinimide ester group.
本発明の架橋試薬を構成する官能基１と官能基２は、基本骨格のペプチド鎖のいずれにあってもよいが、ペプチド鎖の両端にあること、すなわち、官能基１と官能基２がペプチド鎖の両端のアミノ酸残基にそれぞれ結合していることが好ましい。タンパク質の架橋効率が良好なためである。 The functional group 1 and the functional group 2 constituting the cross-linking reagent of the present invention may be in any of the peptide chains of the basic skeleton, but are present at both ends of the peptide chain, that is, the functional group 1 and the functional group 2 are peptides. It is preferable that it is bonded to amino acid residues at both ends of the chain. This is because the cross-linking efficiency of the protein is good.
本発明の架橋試薬を構成する官能基１と官能基２は、同一種類の官能基であることが好ましい。官能基１と官能基２のタンパク質に対する反応性が同等であることにより、官能基１の近傍の電荷の差異のみが有する架橋効率に与える影響を、より正確に評価することができるためである。官能基１と官能基２を異種の官能基とする場合には、官能基１を、官能基２よりも反応性が高い官能基とすることが好ましい。官能基２の反応性のほうが高い場合には、官能基１の近傍の電荷の差異が架橋反応に与える影響の評価が困難になるおそれがあるためである。 The functional group 1 and the functional group 2 constituting the cross-linking reagent of the present invention are preferably the same type of functional group. This is because, since the reactivity of the functional group 1 and the functional group 2 with respect to the protein is equivalent, the influence of only the charge difference in the vicinity of the functional group 1 on the crosslinking efficiency can be more accurately evaluated. When the functional group 1 and the functional group 2 are different functional groups, the functional group 1 is preferably a functional group having a higher reactivity than the functional group 2. This is because when the reactivity of the functional group 2 is higher, it may be difficult to evaluate the influence of the charge difference in the vicinity of the functional group 1 on the crosslinking reaction.
本発明の架橋試薬のペプチド鎖は、標識されていることが好ましい。架橋産物の検出が容易となるためである。該標識として、例えば、蛍光標識、放射性同位体による標識、及びビオチン等の低分子化合物による標識等がある。検出感度が高く、安全であることから、蛍光標識であることが好ましい。該蛍光標識に用いる蛍光物質は、架橋反応を阻害しない物質である限り特に限定されず、タンパク質等を標識する場合に通常用いられる蛍光物質を用いることができる。該蛍光物質として、例えば、ＮＢＤ、ＤＡＮＳＬ、フルオレセイン、及びローダミン等の蛍光母核を有する蛍光物質がある。ＮＢＤ型やＤＡＮＳＬ型の蛍光母核を有する蛍光物質は、通常、親水性よりも疎水性の環境下で蛍光強度が増大する性質を有している。このため、架橋試薬単体の状態のよりもタンパク質との架橋産物の状態のほうが、蛍光強度が強くなるため、好ましい。また、フルオレセイン類の蛍光母核を有する蛍光物質は、非常に蛍光が明るいこと、及び、汎用されていることから、検出感度をさらに向上させることができるため、好ましい。ローダミン類の蛍光母核を有する蛍光物質は、ｐＨ等の環境の影響を受けにくいため、蛍光が安定しており、好ましい。 The peptide chain of the crosslinking reagent of the present invention is preferably labeled. This is because the cross-linked product can be easily detected. Examples of the label include a fluorescent label, a label with a radioisotope, and a label with a low molecular compound such as biotin. A fluorescent label is preferred because of its high detection sensitivity and safety. The fluorescent substance used for the fluorescent label is not particularly limited as long as it is a substance that does not inhibit the cross-linking reaction, and a fluorescent substance that is usually used when labeling a protein or the like can be used. Examples of the fluorescent material include a fluorescent material having a fluorescent nucleus such as NBD, DANSL, fluorescein, and rhodamine. A fluorescent substance having an NBD type or DANSL type fluorescent host nucleus usually has a property that the fluorescence intensity increases in a hydrophobic environment rather than hydrophilicity. For this reason, the state of the cross-linked product with the protein is preferable to the state of the cross-linking reagent alone because the fluorescence intensity becomes stronger. In addition, a fluorescent substance having a fluorescent nucleus of fluoresceins is preferable because it has very bright fluorescence and is widely used, so that detection sensitivity can be further improved. A fluorescent substance having a fluorescent mother nucleus of rhodamines is preferable because it is less affected by the environment such as pH and has stable fluorescence.
該蛍光物質は、架橋反応を阻害しない限り、該ペプチド鎖を構成するいずれのアミノ酸残基に結合させてもよい。蛍光物質の種類によっては、ｐＨや極性の有無等の環境の影響を受け易いことがあるため、該蛍光物質は、官能基１の近傍であって架橋試薬１と架橋試薬２で電荷が異なる部位からより離れたアミノ酸残基に結合させることが好ましい。架橋試薬１と架橋試薬２で異なる環境が、該蛍光物質の蛍光強度に与える影響を小さくすることができるためである。例えば、官能基１と官能基２がペプチド鎖の両端のアミノ酸残基にそれぞれ結合している場合には、該蛍光物質は、官能基２が結合しているアミノ酸残基に結合していることが好ましい。 The fluorescent substance may be bound to any amino acid residue constituting the peptide chain as long as the crosslinking reaction is not inhibited. Depending on the type of fluorescent substance, it may be susceptible to environmental influences such as pH and polarity, so that the fluorescent substance is in the vicinity of the functional group 1 and has different charges in the crosslinking reagent 1 and the crosslinking reagent 2 It is preferable to bind to an amino acid residue further away from This is because the influence of different environments on the crosslinking reagent 1 and the crosslinking reagent 2 on the fluorescence intensity of the fluorescent substance can be reduced. For example, when the functional group 1 and the functional group 2 are bonded to the amino acid residues at both ends of the peptide chain, the fluorescent substance is bonded to the amino acid residue to which the functional group 2 is bonded. Is preferred.
本発明の架橋試薬は、いずれの方法により合成してもよい。例えば、ペプチド鎖に官能基や蛍光物質等を修飾する方法により合成してもよく、官能基等を予め側鎖に結合させたアミノ酸を用いてペプチド鎖を合成する方法により合成してもよい。ペプチド鎖の合成は、例えば、カップリング剤としてジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いて合成することができる。また、官能基等の修飾は、常法により行うことができる。 The crosslinking reagent of the present invention may be synthesized by any method. For example, the peptide chain may be synthesized by a method of modifying a functional group, a fluorescent substance, or the like, or may be synthesized by a method of synthesizing a peptide chain using an amino acid having a functional group or the like previously bonded to a side chain. The peptide chain can be synthesized using, for example, dicyclohexylcarbodiimide (DCC) as a coupling agent. Moreover, modification of a functional group etc. can be performed by a conventional method.
本発明のタンパク質架橋試薬セットを用いて、タンパク質分子内又は分子間を架橋することにより、官能基１が架橋するタンパク質架橋部位の近傍の荷電状態を調べることができる。具体的には、タンパク質と架橋試薬１を用いて得られた架橋産物の量と、タンパク質と架橋試薬２を用いて得られた架橋産物の量を比較検討する。 By using the protein cross-linking reagent set of the present invention to cross-link protein molecules or between molecules, the charge state in the vicinity of the protein cross-linking site where the functional group 1 cross-links can be examined. Specifically, the amount of the crosslinking product obtained using the protein and the crosslinking reagent 1 is compared with the amount of the crosslinking product obtained using the protein and the crosslinking reagent 2.
例えば、官能基１が架橋するタンパク質架橋部位の近傍が正に帯電している場合には、官能基１の近傍の電荷が負である架橋試薬１と、官能基１の近傍の電荷が正又は中性である架橋試薬２からなる架橋試薬セットを用いて、該タンパク質を架橋すると、該架橋試薬１を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量は、該架橋試薬２を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量よりも多くなる。これは、該タンパク質架橋部位近傍が正に帯電しているために、官能基１の近傍の電荷が負である架橋試薬１は、該タンパク質架橋部位近傍に静電的な相互作用により引き寄せられるため、該架橋試薬１による該タンパク質の架橋反応が、該架橋試薬２による該タンパク質の架橋反応よりも促進されるためであると推察される。同様に、官能基１が架橋するタンパク質架橋部位の近傍が負に帯電している場合には、官能基１の近傍の電荷が正である架橋試薬１と、官能基１の近傍の電荷が負又は中性である架橋試薬２からなる架橋試薬セットを用いて、該タンパク質を架橋すると、該架橋試薬１を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量は、該架橋試薬２を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量よりも多くなる。 For example, when the vicinity of the protein cross-linking site where the functional group 1 crosslinks is positively charged, the cross-linking reagent 1 in which the charge in the vicinity of the functional group 1 is negative and the charge in the vicinity of the functional group 1 is positive or When the protein was cross-linked using a cross-linking reagent set consisting of a neutral cross-linking reagent 2, the amount of the cross-linked product of the protein obtained using the cross-linking reagent 1 was obtained using the cross-linking reagent 2. More than the amount of cross-linked product of the protein. This is because since the vicinity of the protein cross-linking site is positively charged, the cross-linking reagent 1 having a negative charge near the functional group 1 is attracted to the vicinity of the protein cross-linking site by electrostatic interaction. This is presumably because the cross-linking reaction of the protein by the cross-linking reagent 1 is promoted more than the cross-linking reaction of the protein by the cross-linking reagent 2. Similarly, when the vicinity of the protein crosslinking site where functional group 1 crosslinks is negatively charged, crosslinking reagent 1 in which the charge in the vicinity of functional group 1 is positive and the charge in the vicinity of functional group 1 is negative. Alternatively, when the protein is cross-linked using a cross-linking reagent set consisting of the cross-linking reagent 2 that is neutral, the amount of the cross-linked product of the protein obtained using the cross-linking reagent 1 is obtained using the cross-linking reagent 2. More than the amount of cross-linked product of the protein.
同様に、官能基１が架橋するタンパク質架橋部位の近傍の電荷が中性である場合には、官能基１の近傍の電荷が中性である架橋試薬１と、官能基１の近傍の電荷が正又は負である架橋試薬２からなる架橋試薬セットを用いて、該タンパク質を架橋すると、該架橋試薬１を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量は、該架橋試薬２を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量とほぼ同量となる。 Similarly, when the charge in the vicinity of the protein cross-linking site where the functional group 1 crosslinks is neutral, the crosslinking reagent 1 in which the charge in the vicinity of the functional group 1 is neutral and the charge in the vicinity of the functional group 1 When the protein is cross-linked using a cross-linking reagent set consisting of a cross-linking reagent 2 that is positive or negative, the amount of cross-linking product of the protein obtained using the cross-linking reagent 1 is obtained using the cross-linking reagent 2. The amount of the crosslinked product of the protein is almost the same.
その他、架橋試薬１と架橋試薬２の、官能基１の近傍の電荷の絶対量が異なる場合には、電荷が同種である場合であっても、官能基１が架橋するタンパク質架橋部位の近傍の荷電状態を調べることができる。例えば、架橋試薬１と架橋試薬２の官能基１の近傍の電荷がいずれも正であり、かつ、架橋試薬１の該電荷の絶対量が、架橋試薬２の該電荷の絶対量の２倍である架橋試薬セットを用いて、タンパク質を架橋する場合に、該タンパク質架橋部位の近傍が負に帯電していると、該架橋試薬１を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量は、該架橋試薬２を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量よりも多くなる。また、該タンパク質架橋部位の近傍が正に帯電していると、該架橋試薬１を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量は、該架橋試薬２を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量よりも少なくなる。該タンパク質架橋部位の近傍の電荷が中性である場合には、該架橋試薬１を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量と、該架橋試薬２を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量は、ほぼ同量となる。 In addition, when the absolute amount of the charge in the vicinity of the functional group 1 is different between the crosslinking reagent 1 and the crosslinking reagent 2, even if the charge is the same type, the vicinity of the protein crosslinking site where the functional group 1 is crosslinked. The charge state can be examined. For example, the charges in the vicinity of the functional group 1 of the crosslinking reagent 1 and the crosslinking reagent 2 are both positive, and the absolute amount of the charge of the crosslinking reagent 1 is twice the absolute amount of the charge of the crosslinking reagent 2. When a protein is crosslinked using a certain crosslinking reagent set, if the vicinity of the protein crosslinking site is negatively charged, the amount of the crosslinked product of the protein obtained using the crosslinking reagent 1 is More than the amount of cross-linked product of the protein obtained using Reagent 2. When the vicinity of the protein cross-linking site is positively charged, the amount of the cross-linked product of the protein obtained using the cross-linking reagent 1 is the amount of the cross-linked product of the protein obtained using the cross-linking reagent 2 Less than the amount. When the charge in the vicinity of the protein crosslinking site is neutral, the amount of the crosslinked product of the protein obtained using the crosslinking reagent 1 and the crosslinked product of the protein obtained using the crosslinking reagent 2 The amount is almost the same.
官能基１の近傍の電荷が互いに異なる３種類の架橋試薬からなる架橋試薬セットを用いて、タンパク質分子内又は分子間を架橋することにより官能基１が架橋するタンパク質架橋部位の近傍の荷電状態を、より正確に調べることができる。 By using a cross-linking reagent set consisting of three types of cross-linking reagents having different charges in the vicinity of the functional group 1, the charge state in the vicinity of the protein cross-linking site where the functional group 1 cross-links by cross-linking within or between protein molecules. Can be examined more accurately.
例えば、官能基１が架橋するタンパク質架橋部位の近傍が正に帯電している場合には、官能基１の近傍の電荷が負である架橋試薬１と、官能基１の近傍の電荷が正である架橋試薬２と、官能基１の近傍の電荷が中性である架橋試薬３からなる架橋試薬セットを用いて、該タンパク質を架橋すると、該架橋試薬１を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量が最も多く、該架橋試薬２を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量が最も少なくなる。 For example, when the vicinity of the protein cross-linking site where the functional group 1 crosslinks is positively charged, the cross-linking reagent 1 in which the charge in the vicinity of the functional group 1 is negative and the charge in the vicinity of the functional group 1 is positive. When the protein is crosslinked using a crosslinking reagent set comprising a certain crosslinking reagent 2 and a crosslinking reagent 3 having a neutral charge in the vicinity of the functional group 1, crosslinking of the protein obtained by using the crosslinking reagent 1 The amount of product is the largest, and the amount of the crosslinked product of the protein obtained using the crosslinking reagent 2 is the smallest.
また、官能基１が架橋するタンパク質架橋部位の近傍の電荷が中性である場合には、官能基１の近傍の電荷が負である架橋試薬１と、官能基１の近傍の電荷が正である架橋試薬２と、官能基１の近傍の電荷が中性である架橋試薬３からなる架橋試薬セットを用いて、該タンパク質を架橋すると、該架橋試薬３を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量は、該架橋試薬１や該架橋試薬２を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量よりも多くなる。一方、該架橋試薬１を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量と、該架橋試薬２を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量は、ほぼ同量となる。 In addition, when the charge in the vicinity of the protein crosslinking site where the functional group 1 crosslinks is neutral, the crosslinking reagent 1 in the vicinity of the functional group 1 is negative, and the charge in the vicinity of the functional group 1 is positive. When the protein is cross-linked using a cross-linking reagent set consisting of a cross-linking reagent 2 and a cross-linking reagent 3 having a neutral charge in the vicinity of the functional group 1, the cross-linking of the protein obtained using the cross-linking reagent 3 The amount of product is larger than the amount of cross-linked product of the protein obtained using the cross-linking reagent 1 or the cross-linking reagent 2. On the other hand, the amount of the crosslinked product of the protein obtained using the crosslinking reagent 1 and the amount of the crosslinked product of the protein obtained using the crosslinking reagent 2 are substantially the same.
その他、例えば、官能基１の近傍の電荷が正である架橋試薬１と架橋試薬２と、官能基１の近傍の電荷が負である架橋試薬３とからなり、かつ、架橋試薬１の該電荷の絶対量が、架橋試薬２の該電荷の絶対量の２倍である架橋試薬セットを用いて、タンパク質を架橋する場合に、官能基１が架橋するタンパク質架橋部位の近傍が負に帯電していると、該架橋試薬１を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量が最も多く、該架橋試薬３を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量が最も少なくなる。一方、該タンパク質架橋部位の近傍の電荷が中性である場合には、いずれの架橋試薬を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量も、ほぼ同量となる。 In addition, for example, the cross-linking reagent 1 and the cross-linking reagent 2 having a positive charge in the vicinity of the functional group 1 and the cross-linking reagent 3 having a negative charge in the vicinity of the functional group 1, and the charge of the cross-linking reagent 1. When the protein is cross-linked using a cross-linking reagent set in which the absolute amount of is 2 times the absolute amount of the charge of the cross-linking reagent 2, the vicinity of the protein cross-linking site where the functional group 1 cross-links is negatively charged. If so, the amount of the cross-linked product of the protein obtained using the cross-linking reagent 1 is the largest, and the amount of the cross-linked product of the protein obtained using the cross-linking reagent 3 is the smallest. On the other hand, when the charge in the vicinity of the protein cross-linking site is neutral, the amount of the cross-linked product of the protein obtained using any cross-linking reagent is almost the same.
本発明の架橋試薬として、例えば、架橋試薬１が、下記式（１）で表され、
Ａ1−（Ａ2）ｍ−（Ａ3）ｎ−Ａ3a （１）
（但し、Ａ1はアミノ基に蛍光物質が導入されかつ側鎖のカルボキシル基が活性エステル化されたグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基であり；Ａ2は中性アミノ酸残基であり；Ａ3は（ａ）中性アミノ酸残基、（ｂ）アルギニン残基又はヒスチジン残基、（ｃ）グルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基、からなる群より選ばれる１種のアミノ酸残基であり；Ａ3aは、前記Ａ3のα−カルボキシル基が活性エステル化されたアミノ酸残基であり；ｍ及びｎは、０〜３の整数であり、かつｍ≧ｎである。）
架橋試薬２が、下記式（２）で表される
Ａ1−（Ａ2）ｍ−（Ａ4）ｎ−Ａ4a 式（２）
（但し、Ａ1はアミノ基に蛍光物質が導入されかつ側鎖のカルボキシル基が活性エステル化されたグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基であり；Ａ2は中性アミノ酸残基であり；Ａ4は前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）からなる群より選ばれ、かつ前記Ａ3とは異なる１種のアミノ酸残基であり；Ａ4aは、前記Ａ4のα−カルボキシル基が活性エステル化されたアミノ酸残基であり；ｍ及びｎは、０〜３の整数であり、かつｍ≧ｎである。）
架橋試薬セットがある。
As the crosslinking reagent of the present invention, for example, the crosslinking reagent 1 is represented by the following formula (1),
A 1- (A 2 ) m- (A 3 ) n-A 3a (1)
(However, A 1 is a glutamic acid residue or aspartic acid residue in which a fluorescent substance is introduced into an amino group and a side chain carboxyl group is active esterified; A 2 is a neutral amino acid residue; A 3 Is one amino acid residue selected from the group consisting of (a) neutral amino acid residues, (b) arginine residues or histidine residues, (c) glutamic acid residues or aspartic acid residues; A 3a Is an amino acid residue in which the α-carboxyl group of A 3 is active esterified; m and n are integers of 0 to 3 and m ≧ n.
The crosslinking reagent 2 is represented by the following formula (2): A 1- (A 2 ) m- (A 4 ) n-A 4a formula (2)
(Where A 1 is a glutamic acid residue or aspartic acid residue in which a fluorescent substance is introduced into the amino group and the side chain carboxyl group is active esterified; A 2 is a neutral amino acid residue; A 4 Is an amino acid residue selected from the group consisting of (a), (b), and (c) and different from A 3 ; A 4a is an active α-carboxyl group of A 4 Esterified amino acid residues; m and n are integers from 0 to 3 and m ≧ n.)
There is a cross-linking reagent set.
その他にも、例えば、上記式（１）で表される架橋試薬１と上記（２）で表される架橋試薬２に加えて、さらに、下記式（３）で表される架橋試薬３、
Ａ1−（Ａ2）ｍ−（Ａ5）ｎ−Ａ5a 式（３）
（但し、Ａ1はアミノ基に蛍光物質が導入されかつ側鎖のカルボキシル基が活性エステル化されたグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基であり；Ａ2は中性アミノ酸残基であり；Ａ5は前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）からなる群より選ばれ、かつ前記Ａ3及びＡ4とは異なる１種のアミノ酸残基であり；Ａ5aは、前記Ａ5のα−カルボキシル基が活性エステル化されたアミノ酸残基であり；ｍ及びｎは、０〜３の整数であり、かつｍ≧ｎである。）
からなる架橋試薬セットがある。
Besides, for example, in addition to the crosslinking reagent 1 represented by the above formula (1) and the crosslinking reagent 2 represented by the above (2), a crosslinking reagent 3 represented by the following formula (3),
A 1 - (A 2) m- (A 5) n-A 5a formula (3)
(Where A 1 is a glutamic acid residue or aspartic acid residue in which a fluorescent substance is introduced into the amino group and the side chain carboxyl group is active esterified; A 2 is a neutral amino acid residue; A 5 Is an amino acid residue selected from the group consisting of (a), (b) and (c) and different from A 3 and A 4 ; A 5a is the α-carboxyl of A 5 The group is an active esterified amino acid residue; m and n are integers from 0 to 3 and m ≧ n.)
There is a cross-linking reagent set consisting of:
なお、架橋試薬とタンパク質を架橋させる方法や、得られた架橋産物の解析は、常法により行うことができる。例えば、タンパク質溶液に架橋試薬を添加することにより、架橋試薬とタンパク質を架橋させることができる。また、吸光度分析や比色分析により、架橋産物を解析することができる。蛍光標識された架橋試薬からなる架橋試薬セットを用いる場合には、蛍光分析により、架橋産物を解析することができる。その他、解析を行う前に、架橋産物を分離して検出してもよい。該分離方法として、電気泳動法やカラムクロマトグラフィ法等がある。 In addition, the method of crosslinking a crosslinking reagent and protein, and the analysis of the obtained crosslinking product can be performed by a conventional method. For example, the crosslinking reagent and the protein can be crosslinked by adding a crosslinking reagent to the protein solution. Moreover, a crosslinked product can be analyzed by absorbance analysis or colorimetric analysis. When using a cross-linking reagent set consisting of a fluorescently labeled cross-linking reagent, the cross-linked product can be analyzed by fluorescence analysis. In addition, the cross-linked product may be separated and detected before analysis. Examples of the separation method include electrophoresis and column chromatography.
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to a following example.
３アミノ酸残基からなるペプチド鎖の、Ｃ末端に官能基１を、Ｎ末端に官能基２とＮＢＤを有する、官能基１の近傍の電荷の種類が異なる３種類の架橋試薬からなる架橋試薬セットを、一般的な液相ペプチド合成プロセスにしたがって合成した。官能基としてスクシンイミドエステル基を用いた。 A cross-linking reagent set comprising three types of cross-linking reagents having a functional group 1 at the C-terminal, a functional group 2 and NBD at the N-terminal, and different types of charges in the vicinity of the functional group 1 of a peptide chain consisting of three amino acid residues Was synthesized according to the general liquid phase peptide synthesis process. A succinimide ester group was used as a functional group.
まず、官能基１の近傍の電荷が負であり、下記式（４）で表される
ＮＢＤ−Ａｓｐ（ＯＳｕ）−Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯＳｕ 式（４）
架橋試薬１を、「ペプチド合成」（著者：泉屋信夫ら、丸善（株） 昭和５０年発行）に記載の方法に従って合成した。合成の概要を図１に示した。
First, the charge in the vicinity of the functional group 1 is negative, and NBD-Asp (OSu) -Ala-Glu-OSu represented by the following formula (4) Formula (4)
The crosslinking reagent 1 was synthesized according to the method described in “Peptide Synthesis” (author: Nobuo Izumiya et al., Maruzen Co., Ltd., published in 1975). The outline of the synthesis is shown in FIG.
得られた化合物のＩＲスペクトル分析を行って、カルボキシル基の１７００ｃｍ-1付近の吸収ピークと、スクシンイミドエステルの１７７０ｃｍ-1付近の吸収ピークを確認した。また、蛍光スペクトル分析を行い、ＮＢＤのスペクトルの特徴、すなわち、極大蛍光波長が５４０ｎｍ（励起波長４８８ｎｍ）であることを確認した。これらの分析結果から、該化合物が、カルボキシル基とスクシンイミドエステルとを有するＮＨ−ＮＢＤ誘導体であり、目的の架橋試薬１であることを確認した。 Obtained by performing the IR spectrum analysis of the compound was confirmed with the absorption peak around 1700 cm -1 of the carboxyl group, the absorption peak around 1770 cm -1 of the succinimide ester. Further, a fluorescence spectrum analysis was performed, and it was confirmed that the characteristics of the NBD spectrum, that is, the maximum fluorescence wavelength was 540 nm (excitation wavelength: 488 nm). From these analysis results, it was confirmed that the compound was an NH-NBD derivative having a carboxyl group and a succinimide ester, and was the target crosslinking reagent 1.
Ｇｌｕ（ＯＢｕt）−ＯＢｚｌに代えて、Ａｒｇ（Ｂｏｃ）−ＯＢｚｌを用いた以外は、全て架橋試薬１の合成と同様にして、官能基１の近傍の電荷が正であり、下記式（５）で表される
ＮＢＤ−Ａｓｐ（ＯＳｕ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＯＳｕ 式（５）
架橋試薬２を合成した。
Instead of Glu (OBu t) -OBzl, except for using Arg (Boc) -OBzl, in the same manner as the synthesis of all crosslinking reagent 1, charge in the vicinity of the functional group 1 is positive, the following equation (5 NBD-Asp (OSu) -Ala-Arg-OSu Formula (5)
Cross-linking reagent 2 was synthesized.
さらに、Ｇｌｕ（ＯＢｕt）−ＯＢｚｌに代えて、Ｇｌｎ（Ｂｏｃ）−ＯＢｚｌを用いた以外は、全て架橋試薬１の合成と同様にして、官能基１の近傍の電荷が中性であり、下記式（６）で表される
ＮＢＤ−Ａｓｐ（ＯＳｕ）−Ａｌａ−Ｇｌｎ−ＯＳｕ 式（６）
架橋試薬３を合成した。
Further, instead of Glu (OBu t) -OBzl, except for using the Gln (Boc) -OBzl, in the same manner as the synthesis of all crosslinking reagent 1, charge in the vicinity of the functional group 1 is neutral, below NBD-Asp (OSu) -Ala-Gln-OSu represented by the formula (6) Formula (6)
Cross-linking reagent 3 was synthesized.
実施例１で合成した架橋試薬セットを用いて、ニワトリ卵白リゾチーム（分子量１４．３ｋＤ）を架橋し、リゾチームの架橋部位近傍の荷電状態を検査した。
まず、実施例１で合成した３種類の架橋試薬を、エチルアルコールを用いて、それぞれ５×１０-4Ｍの架橋試薬溶液を調製した。さらに、０．１Ｍリン酸−ホウ酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、５×１０-4Ｍのリゾチーム溶液を調製した。
次に、３本の試験管に１ｍｌずつ分注した該リゾチーム溶液に、０．２ｍｌの該架橋試薬溶液をそれぞれ混合し、３０℃で８時間放置することにより、３種類の架橋反応液を得た。
Using the cross-linking reagent set synthesized in Example 1, chicken egg white lysozyme (molecular weight 14.3 kD) was cross-linked, and the charge state in the vicinity of the cross-linked site of lysozyme was examined.
First, 5 × 10 −4 M crosslinking reagent solutions were prepared using ethyl alcohol as the three kinds of crosslinking reagents synthesized in Example 1. Furthermore, a 5 × 10 −4 M lysozyme solution was prepared using 0.1 M phosphate-borate buffer (pH 7.5).
Next, 0.2 ml of the cross-linking reagent solution was mixed with 1 ml of the lysozyme solution dispensed into three test tubes, and left at 30 ° C. for 8 hours to obtain three types of cross-linking reaction solutions. It was.
得られた架橋反応液を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分析し、市販の蛍光イメージアナライザーを用いて、励起波長４８８ｎｍでシグナルを検出したところ、約３０ｋＤａの位置に、架橋前のリゾチーム溶液では検出されなかった新たな蛍光性タンパク質のバンドを検出した。該蛍光性タンパク質の大きさは、リゾチームのおよそ２倍であり、該架橋試薬でリゾチーム分子同士が架橋された架橋産物であった。なお、該架橋試薬１〜３の最大架橋距離は、骨格ペプチドのアミノ酸残基数から約２３Åと算出された。 The obtained cross-linking reaction solution was analyzed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, and a signal was detected with a commercially available fluorescence image analyzer at an excitation wavelength of 488 nm. In the lysozyme solution before cross-linking, the position was about 30 kDa. A new fluorescent protein band that was not detected was detected. The size of the fluorescent protein was approximately twice that of lysozyme, and was a crosslinked product in which lysozyme molecules were crosslinked with the crosslinking reagent. The maximum cross-linking distance of the cross-linking reagents 1 to 3 was calculated to be about 23 mm from the number of amino acid residues of the backbone peptide.
得られた架橋産物量を、バンドの蛍光強度を用いて比較すると、該架橋試薬１を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量が最も多く、該架橋試薬２を用いて得られた該タンパク質の架橋産物量が最も少なかった。この結果から、官能基１が架橋するリゾチーム架橋部位の近傍の局所環境では、負の電荷を有する架橋試薬との反応を促進する相互作用が働いていることが示唆された。リゾチームは、等電点が１１．３であり、塩基性タンパク質であることからも、該可能性は支持される。すなわち、リゾチーム分子間架橋反応においては、少なくとも、一方のリゾチーム架橋部位の近傍は正の電荷を有しており、このために、該リゾチーム架橋部位の近傍に架橋試薬の負電荷が吸引・濃縮され、架橋試薬と該リゾチーム架橋部位との反応が促進されたと推察される。
以上、実施例２の結果から、本発明の架橋試薬セットを用いることにより、官能基１が架橋するタンパク質架橋部位の近傍の荷電状態を高感度で検査することができること、及び、タンパク質間架橋距離に関する情報も入手できることが明らかである。
When the amount of the cross-linked product obtained was compared using the fluorescence intensity of the band, the amount of the cross-linked product of the protein obtained using the cross-linking reagent 1 was the largest, and the protein obtained using the cross-linking reagent 2 The amount of cross-linked product was the smallest. From this result, it was suggested that in the local environment in the vicinity of the lysozyme cross-linking site where the functional group 1 cross-links, an interaction that promotes the reaction with the cross-linking reagent having a negative charge is working. Lysozyme has an isoelectric point of 11.3 and is a basic protein, so this possibility is supported. That is, in the lysozyme intermolecular cross-linking reaction, at least the vicinity of one lysozyme cross-linking site has a positive charge, and for this reason, the negative charge of the cross-linking reagent is attracted and concentrated near the lysozyme cross-linking site. It is speculated that the reaction between the crosslinking reagent and the lysozyme crosslinking site was promoted.
As described above, from the results of Example 2, by using the cross-linking reagent set of the present invention, the charge state in the vicinity of the protein cross-linking site where the functional group 1 cross-links can be inspected with high sensitivity, and the inter-protein cross-linking distance. It is clear that information about is also available.
本発明の架橋試薬セットにより、荷電状態等の、タンパク質架橋部位の近傍の局所環境に関する情報を簡便かつ高感度で入手できることから、タンパク質のトポロジー解析の分野で利用が可能である。 With the cross-linking reagent set of the present invention, information on the local environment in the vicinity of the protein cross-linking site, such as the charge state, can be obtained simply and with high sensitivity, and therefore can be used in the field of protein topology analysis.
Claims (12)
官能基１の近傍の電荷のみが、前記架橋試薬１と異なる架橋試薬２と、
を有することを特徴とするタンパク質架橋試薬セット。 A basic skeleton composed of a peptide chain, a crosslinking reagent 1 having a functional group 1 and a functional group 2;
Only the charge in the vicinity of the functional group 1 is different from the crosslinking reagent 1, the crosslinking reagent 2;
A protein crosslinking reagent set characterized by comprising:
官能基１の近傍の電荷のみが、前記架橋試薬１と異なる架橋試薬２と、
官能基１の近傍の電荷のみが、前記架橋試薬１と前記架橋試薬２のいずれとも異なる架橋試薬３と、
を有することを特徴とするタンパク質架橋試薬セット。 A basic skeleton composed of a peptide chain, a crosslinking reagent 1 having a functional group 1 and a functional group 2;
Only the charge in the vicinity of the functional group 1 is different from the crosslinking reagent 1, the crosslinking reagent 2;
Only the charge in the vicinity of the functional group 1 is different from both the crosslinking reagent 1 and the crosslinking reagent 2;
A protein crosslinking reagent set characterized by comprising:
Ａ1−（Ａ2）ｍ−（Ａ3）ｎ−Ａ3a （１）
（但し、Ａ1はアミノ基に蛍光物質が導入されかつ側鎖のカルボキシル基が活性エステル化されたグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基であり；Ａ2は中性アミノ酸残基であり；Ａ3は（ａ）中性アミノ酸残基、（ｂ）アルギニン残基又はヒスチジン残基、（ｃ）グルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基、からなる群より選ばれる１種のアミノ酸残基であり；Ａ3aは、前記Ａ3のα−カルボキシル基が活性エステル化されたアミノ酸残基であり；ｍ及びｎは、０〜３の整数であり、かつｍ≧ｎである。）
前記架橋試薬２が、下記式（２）で表される
Ａ1−（Ａ2）ｍ−（Ａ4）ｎ−Ａ4a 式（２）
（但し、Ａ1はアミノ基に蛍光物質が導入されかつ側鎖のカルボキシル基が活性エステル化されたグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基であり；Ａ2は中性アミノ酸残基であり；Ａ4は前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）からなる群より選ばれ、かつ前記Ａ3とは異なる１種のアミノ酸残基であり；Ａ4aは、前記Ａ4のα−カルボキシル基が活性エステル化されたアミノ酸残基であり；ｍ及びｎは、０〜３の整数であり、かつｍ≧ｎである。）
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載のタンパク質架橋試薬セット。 The crosslinking reagent 1 is represented by the following formula (1):
A 1- (A 2 ) m- (A 3 ) n-A 3a (1)
(However, A 1 is a glutamic acid residue or aspartic acid residue in which a fluorescent substance is introduced into an amino group and a side chain carboxyl group is active esterified; A 2 is a neutral amino acid residue; A 3 Is one amino acid residue selected from the group consisting of (a) neutral amino acid residues, (b) arginine residues or histidine residues, (c) glutamic acid residues or aspartic acid residues; A 3a Is an amino acid residue in which the α-carboxyl group of A 3 is active esterified; m and n are integers of 0 to 3 and m ≧ n.
The crosslinking reagent 2 is represented by the following formula (2): A 1- (A 2 ) m- (A 4 ) n-A 4a formula (2)
(Where A 1 is a glutamic acid residue or aspartic acid residue in which a fluorescent substance is introduced into the amino group and the side chain carboxyl group is active esterified; A 2 is a neutral amino acid residue; A 4 Is an amino acid residue selected from the group consisting of (a), (b), and (c) and different from A 3 ; A 4a is an active α-carboxyl group of A 4 Esterified amino acid residues; m and n are integers from 0 to 3 and m ≧ n.)
The protein cross-linking reagent set according to any one of claims 1 to 9.
Ａ1−（Ａ2）ｍ−（Ａ3）ｎ−Ａ3a （１）
（但し、Ａ1はアミノ基に蛍光物質が導入されかつ側鎖のカルボキシル基が活性エステル化されたグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基であり；Ａ2は中性アミノ酸残基であり；Ａ3は（ａ）中性アミノ酸残基、（ｂ）アルギニン残基又はヒスチジン残基、（ｃ）グルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基、からなる群より選ばれる１種のアミノ酸残基であり；Ａ3aは、前記Ａ3のα−カルボキシル基が活性エステル化されたアミノ酸残基であり；ｍ及びｎは、０〜３の整数であり、かつｍ≧ｎである。）
前記架橋試薬２が、下記式（２）で表され、
Ａ1−（Ａ2）ｍ−（Ａ4）ｎ−Ａ4a 式（２）
（但し、Ａ1はアミノ基に蛍光物質が導入されかつ側鎖のカルボキシル基が活性エステル化されたグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基であり；Ａ2は中性アミノ酸残基であり；Ａ4は前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）からなる群より選ばれ、かつ前記Ａ3とは異なる１種のアミノ酸残基であり；Ａ4aは、前記Ａ4のα−カルボキシル基が活性エステル化されたアミノ酸残基であり；ｍ及びｎは、０〜３の整数であり、かつｍ≧ｎである。）
前記架橋試薬３が、下記式（３）で表される
Ａ1−（Ａ2）ｍ−（Ａ5）ｎ−Ａ5a 式（３）
（但し、Ａ1はアミノ基に蛍光物質が導入されかつ側鎖のカルボキシル基が活性エステル化されたグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基であり；Ａ2は中性アミノ酸残基であり；Ａ5は前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）からなる群より選ばれ、かつ前記Ａ3及びＡ4とは異なる１種のアミノ酸残基であり；Ａ5aは、前記Ａ5のα−カルボキシル基が活性エステル化されたアミノ酸残基であり；ｍ及びｎは、０〜３の整数であり、かつｍ≧ｎである。）
ことを特徴とする請求項２〜９のいずれか記載のタンパク質架橋試薬セット。 The crosslinking reagent 1 is represented by the following formula (1):
A 1- (A 2 ) m- (A 3 ) n-A 3a (1)
(However, A 1 is a glutamic acid residue or aspartic acid residue in which a fluorescent substance is introduced into an amino group and a side chain carboxyl group is active esterified; A 2 is a neutral amino acid residue; A 3 Is one amino acid residue selected from the group consisting of (a) neutral amino acid residues, (b) arginine residues or histidine residues, (c) glutamic acid residues or aspartic acid residues; A 3a Is an amino acid residue in which the α-carboxyl group of A 3 is active esterified; m and n are integers of 0 to 3 and m ≧ n.
The crosslinking reagent 2 is represented by the following formula (2):
A 1 - (A 2) m- (A 4) n-A 4a formula (2)
(Where A 1 is a glutamic acid residue or aspartic acid residue in which a fluorescent substance is introduced into the amino group and the side chain carboxyl group is active esterified; A 2 is a neutral amino acid residue; A 4 Is an amino acid residue selected from the group consisting of (a), (b), and (c) and different from A 3 ; A 4a is an active α-carboxyl group of A 4 Esterified amino acid residues; m and n are integers from 0 to 3 and m ≧ n.)
The cross-linking reagent 3 is represented by the following formula (3): A 1- (A 2 ) m- (A 5 ) n-A 5a formula (3)
(Where A 1 is a glutamic acid residue or aspartic acid residue in which a fluorescent substance is introduced into the amino group and the side chain carboxyl group is active esterified; A 2 is a neutral amino acid residue; A 5 Is an amino acid residue selected from the group consisting of (a), (b) and (c) and different from A 3 and A 4 ; A 5a is the α-carboxyl of A 5 The group is an active esterified amino acid residue; m and n are integers from 0 to 3 and m ≧ n.)
The protein cross-linking reagent set according to any one of claims 2 to 9.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007047139A JP2008208079A (en) | 2007-02-27 | 2007-02-27 | Reagent set for cross-linking protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007047139A JP2008208079A (en) | 2007-02-27 | 2007-02-27 | Reagent set for cross-linking protein |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2008208079A true JP2008208079A (en) | 2008-09-11 |
Family
ID=39784708
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007047139A Withdrawn JP2008208079A (en) | 2007-02-27 | 2007-02-27 | Reagent set for cross-linking protein |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2008208079A (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002531217A (en) * | 1998-12-04 | 2002-09-24 | チャンドラシェカー ピー． パサック， | Biocompatible crosslinked polymer |
-
2007
- 2007-02-27 JP JP2007047139A patent/JP2008208079A/en not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002531217A (en) * | 1998-12-04 | 2002-09-24 | チャンドラシェカー ピー． パサック， | Biocompatible crosslinked polymer |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3194980A1 (en) | Improved single molecule peptide sequencing | |
| Fülöp et al. | A foldamer-dendrimer conjugate neutralizes synaptotoxic β-amyloid oligomers | |
| CN109929009B (en) | CCP peptide fragment, antigen, reagent, kit and application containing CCP peptide fragment | |
| Cruz et al. | Peptide—protein interactions within human hair keratins | |
| WO2009007846A9 (en) | Methods for modifying, isolating, detecting, visualizing, and quantifying citrullinated and/or homocitrullinated peptides, polypeptides and proteins | |
| US20230251265A1 (en) | Preparation method and the application of capture magnetic bead targeting weak protein-protein interactions based on the photo-affinity covalent linkage strategy | |
| Babos et al. | Role of N-or C-terminal biotinylation in autoantibody recognition of citrullin containing filaggrin epitope peptides in rheumatoid arthritis | |
| US8445291B2 (en) | Method for detecting target substance, and tag, DNA, vector, probe and detection kit for use therewith | |
| Horsfall et al. | A bimane‐based peptide staple for combined helical induction and fluorescent imaging | |
| KR20180041243A (en) | Cyclic peptides, affinity chromatography carriers, labeling antibodies, antibody drug complexes, and pharmaceutical preparations | |
| Moyer et al. | Leveraging orthogonal mass spectrometry based strategies for comprehensive sequencing and characterization of ribosomal antimicrobial peptide natural products | |
| Pina et al. | Tryptophan tags and de novo designed complementary affinity ligands for the expression and purification of recombinant proteins | |
| Yoshiya et al. | Development of trityl group anchored solubilizing tags for peptide and protein synthesis | |
| Lavoie et al. | Development of peptide ligands for targeted capture of host cell proteins from cell culture production harvests | |
| JP2008208079A (en) | Reagent set for cross-linking protein | |
| Brandis et al. | A two‐step strategy to visually identify molecularly imprinted polymers for tagged proteins | |
| CN116348498A (en) | Method and kit for determining polypeptide, polymer, solid phase and test substance | |
| Martos et al. | Identification of an IgE reactive peptide in hen egg riboflavin binding protein subjected to simulated gastrointestinal digestion | |
| CN111303865B (en) | Fluorescent probe compound and preparation method and application thereof | |
| CN1329410C (en) | Acyl transfer with stabilized transition complex using catalyst with catalytic imidazole (e. g. histidine) function | |
| US9075070B2 (en) | HTS fluorescence polarization assay for inhibitors of Keap1-Nrf2 interaction | |
| Martínez Ceron et al. | Fully automated screening of a combinatorial library to avoid false positives: application to tetanus toxoid ligand identification | |
| Balliu et al. | Exploring non‐obvious hydrophobic binding pockets on protein surfaces: Increasing affinities in peptide–protein interactions | |
| Yang et al. | Photo-affinity pulling down of low-affinity binding proteins mediated by post-translational modifications | |
| EP1621546B1 (en) | Peptide ligands specific to immonoglobulins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7421 Effective date: 20091105 |
|
| RD01 | Notification of change of attorney |
Effective date: 20091113 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7421 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20091118 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120306 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Effective date: 20120412 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 |