JP2008195704A - Composition for lifetime extension of normal cell containing withanone which is ingredient of leaf extract of withania somnifera - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アシュワガンダの葉抽出物の構成成分であるウィザノンを有効成分として含む、正常細胞の寿命延長、正常細胞のプロテアソーム活性の誘発及び活性保持、正常細胞の酸化的ストレスからの保護、正常細胞の紫外線によるＤＮＡ損傷若しくは化学毒性からの保護、正常細胞のグルコース−６−ホスホデヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の活性若しくはＧ６ＰＤ欠損症の治療、腫瘍若しくはがんの治療若しくは予防、又はがん細胞の抗がん剤に対する感受性増強のための組成物に関する。 The present invention includes, as an active ingredient, withanone which is a constituent of a leaf extract of Ashwagandha, extends the life span of normal cells, induces and retains proteasome activity of normal cells, protects normal cells from oxidative stress, normal cells Protection from UV-induced DNA damage or chemical toxicity, normal cell glucose-6-phosphodehydrogenase (G6PD) activity or G6PD deficiency treatment, tumor or cancer treatment or prevention, or cancer cell anticancer The present invention relates to a composition for enhancing sensitivity to an agent.
アーユルベーダは、インドを起源とする5,000年に及ぶ、世界でもっとも古い医学体系の一つである。アーユルベーダは古代サンスクリット語の語源からきており’ayu’は生命を、’ved’は知識を意味し、多くの場合、生命の科学と訳されている。何世紀もの間、預言者や自然科学者たちが考えぬき、発展させてきた健康維持法で、研究・実験を繰り返し、討論を重ね、さらに熟考が加えられてきた。彼らの教えは何千年もの間、師からその弟子へと語り継がれていき、紀元前5-6世紀には、懇切丁寧な指導書が古代インド語のサンスクリット語で書かれている。アーユルベーダは病気の予防、若返り促進、そして寿命を延長する効果がある言われている。さらに最近では、世界中の科学者達がアーユルベーダのハーブ調剤を医療現場で実証する試みをはじめている。 Ayurveda is one of the oldest medical systems in the world, with 5,000 years of origin in India. Ayurveda comes from the ancient Sanskrit origin, 'ayu' means life, 'ved' means knowledge, and is often translated as the science of life. For centuries, research and experiments have been repeated, debated, and pondered with the health maintenance methods that prophets and natural scientists have not thought about and developed. Their teachings have been handed down from their teachers to their disciples for thousands of years, and in the 5th and 6th centuries BC, polite teaching books are written in ancient Indian Sanskrit. Ayurveda is said to be effective in preventing disease, promoting rejuvenation, and extending lifespan. More recently, scientists around the world have begun attempts to demonstrate Ayurvedic herbal preparations in the medical setting.
アシュワガンダ（Withania somnifera）はアーユルベーダの中で最もすぐれた薬草で、’アーユルベーダの女王’または、’アーユルベーダの賜物’等と呼ばれており、常緑樹でインドの乾燥地帯で見かけられ、高さは１ｍほどに成長する。葉を一年中付けており、肥沃で、適度の湿気と水はけの良い土地で生育する。根の使用は3,000年以上前から行われている。なお、アシュワガンダは下記のいくつかの呼び名で呼ばれている。Withania somnifera（ラテン語）、アシュワガンダ（サンスクリット語）、アシュガンダ（ヒンズー語）、及びインディアンジンセン（インド人参）または、ウィンターチェリー（英語） Ashwagandha ( Withania somnifera ) is the best medicinal herb in Ayurveda and is called 'Ayurvedic Queen' or 'Ayurvedic Gift' etc. It is an evergreen tree and can be found in the dry area of India. To grow. It has leaves all year round and grows on fertile, moderately humid and well drained land. The roots have been used for over 3,000 years. Ashwagandha is called by the following names. Withania somnifera (Latin), Ashwaganda (Sanskrit), Ashganda (Hindu), Indian Ginseng (Indian Ginseng) or Winter Cherry (English)
アシュワガンダは強壮薬（アーユルベーダ薬草の中で最も信頼されている）として分類され、健康増進、若返り促進薬そして寿命延長をもたらす力があるとして広く評価されている。一般的に信じられている効能は以下の通りである。 Ashwagandha is classified as a tonic (the most trusted Ayurvedic herb) and is widely recognized for its ability to promote health, rejuvenation, and prolong life. The commonly believed benefits are:
（抗ストレス作用）
アシュワガンダはアーユルベーダの中でも抗ストレス効果のある薬草として位置付けられており、過酷なストレスに適応できる自然の力を養い、必要に応じて精神力を強化させる。現代語で、adaptogen”適応薬”と言える。さらに勉学や仕事で肉体的、精神的疲労が加えられた時にストレスに適応できる自然の力を向上させる（非特許文献１から３）。
(Anti-stress action)
Ashwagandha is positioned as an anti-stress medicinal herb in Ayurveda, cultivating the natural power that can adapt to severe stress, and strengthening mental power as needed. In modern language, it can be said to be an adaptogen "adapted drug". Furthermore, when physical and mental fatigue is added by study and work, the natural power that can adapt to stress is improved (Non-Patent Documents 1 to 3).
（抗炎症作用）
アシュワガンダには抗炎症作用があり、関節の不具合を和らげる。また、アシュワガンダの持つ温感や浸透性は体内の血液の循環を良くする。このためアシュワガンダは 発熱、関節炎、腫瘍や様々な感染症などの処方によく使われている。体力、精力、持久力維持を促進し（非特許文献４から７）、その効力はチョウセンニンジンに匹敵すると言える。
(Anti-inflammatory effect)
Ashwagandha has an anti-inflammatory effect that relieves joint problems. In addition, the warmth and permeability of Ashwagandha improves blood circulation in the body. For this reason, Ashwagandha is often used to prescribe fever, arthritis, tumors and various infectious diseases. It promotes the maintenance of physical strength, energy and endurance (Non-Patent Documents 4 to 7), and it can be said that the efficacy is comparable to ginseng.
（抗酸化作用）
アシュワガンダは重要な抗酸化栄養素である。特に脳細胞においてフリーラジカルによる損傷を抑制することが証明されている。アシュワガンダに含まれている化学物質は強力な抗酸化物と考えられ、これらは体内の三つの抗酸化酵素（スーパーオキサイドジスムターゼ、カタラーゼそしてグルタチオンペルオキシターゼ）を増加させる（非特許文献８から１０）。
(antioxidant effect)
Ashwagandha is an important antioxidant nutrient. In particular, it has been proven to suppress free radical damage in brain cells. The chemicals contained in Ashwagandha are considered strong antioxidants, which increase the body's three antioxidant enzymes (superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase) (Non-Patent Documents 8 to 10).
（抗菌作用）
アシュワガンダのアルコールおよび水抽出物は広い範囲の抗菌活性を持っていることが認められている（非特許文献１１及び１２）。
(Antimicrobial action)
Ashwagandha alcohol and water extracts are recognized to have a wide range of antibacterial activity (Non-Patent Documents 11 and 12).
（糖尿病予防）
血液中の血糖値やコレステロール値を低下させることができ、これにより心血管系の状態を良好に保つ（非特許文献１３及び１４）。
(Diabetes prevention)
The blood glucose level and cholesterol level in the blood can be lowered, thereby keeping the state of the cardiovascular system favorable (Non-patent Documents 13 and 14).
（関節炎・月経不順）
関節炎の治療と月経不順に効果があると考えられる（非特許文献１５）。
(Arthritis, irregular menstruation)
It is considered to be effective in treating arthritis and irregular menstruation (Non-patent Document 15).
（強精作用）
特に男性の生殖機能の強壮薬としての作用があり、健全な性衝動を呼び起こす。さらに精神的安定性を促進しながら性機能を修復し、全体としての活力を引き出す効力がある（非特許文献１６）。
(Strong action)
In particular, it acts as a tonic of male reproductive function and evokes healthy sexual impulses. Furthermore, it has the effect of restoring sexual function while promoting mental stability, and drawing out vitality as a whole (Non-patent Document 16).
（神経の刺激）
アシュワガンダは精神を強化するラサヤナ（強壮薬）で、行為を強める効果がある。記憶や問題解決能力を引き出し、脳全体の調和のとれた機能性を高め強化する。さらに神経系に滋養を与える効果があり、神経を強め、神経機能を維持する。
永い間インドの人々はアシュワガンダを認知障害の老人の脳疾患の治療薬として処方してきた（非特許文献１７及び１８）。
(Nerve stimulation)
Ashwagandha is Rasayana (a tonic) that strengthens the spirit and has the effect of strengthening action. Bring out memory and problem-solving skills, and enhance and strengthen the harmonious functionality of the entire brain. It also has the effect of nourishing the nervous system, strengthening the nerves and maintaining the nerve function.
For a long time, Indian people have prescribed Ashwagandha as a treatment for brain disease in elderly people with cognitive impairment (Non-Patent Documents 17 and 18).
（老人性疾患の治療薬）
アシュワガンダは特に老人の健康改善と病気予防に使われている（非特許文献１９）。
(Therapeutic agent for senile diseases)
Ashwagandha is especially used to improve the health and prevent diseases of the elderly (Non-patent Document 19).
（化学療法）
アシュワガンダの効能は放射線や化学療法を受けている患者に対して、有益な加療法になると考えられる（非特許文献２０から２２）。
(chemical treatment)
The efficacy of Ashwagandha is considered to be beneficial for patients undergoing radiation or chemotherapy (Non-Patent Documents 20 to 22).
元来インドにおいてアーユルベーダ薬として一般的に使用されてきたのは、アシュワガンダの根の部分である。本発明者らは、アシュワガンダの葉の抽出物に効能があるかについて研究を行った。根の部分に比べて葉は採取しやすい上、大量に入手可能だからである。本発明者らはすでに、葉の抽出物に抗変異原効果があることを発表している（非特許文献２３及び２４）。さらに今回、この葉の抽出物がガン細胞を特異的に死滅させることがわかった（非特許文献２５、及び特許文献１）。逆相クロマトグラフィーにより抽出物を成分ごとに分画し実験を行ったところ、葉の抽出物及びその構成成分（ピーク２１、NMRによりWithanoneと同定されている）はヒトの正常細胞に影響を与えないこともわかっている（特許文献１）。 Originally commonly used in India as an Ayurvedic drug, is the root of Ashwagandha. The present inventors have studied whether or not Ashwagandha leaf extract is effective. This is because leaves are easier to collect than the roots and are available in large quantities. The present inventors have already announced that a leaf extract has an antimutagenic effect (Non-patent Documents 23 and 24). Furthermore, it has been found that this leaf extract specifically kills cancer cells (Non-patent Document 25 and Patent Document 1). When the extract was fractionated into components by reverse phase chromatography and the experiment was conducted, the leaf extract and its constituents (peak 21, identified as Withanone by NMR) affect normal human cells. It is also known that there is no (Patent Document 1).
本発明は、アシュワガンダ葉抽出物に含まれるウィザノン（Withanone）の薬理作用を解明し、その薬理作用に基づいて、新しい医薬用途及び保健用途のための組成物を提供することを解決すべき課題とした。 The present invention is to elucidate the pharmacological action of Withanone contained in Ashwagandha leaf extract and to provide a composition for new pharmaceutical use and health use based on the pharmacological action. did.
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、アシュワガンダ葉抽出物に含まれるウィザノン（Withanone）が正常細胞の寿命延長作用、正常細胞のプロテアソーム活性の誘発作用及び活性保持作用、正常細胞の酸化的ストレスからの保護作用、正常細胞の紫外線によるＤＮＡ損傷及び化学毒性からの保護作用、正常細胞のグルコース−６−ホスホデヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の活性作用及びＧ６ＰＤ欠損症の治療作用、腫瘍及びがんの治療作用及び予防作用、並びにがん細胞の抗がん剤に対する感受性増強作用を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that Withanone contained in the extract of Ashwagandha leaves has a normal cell longevity action, a normal cell proteasome activity induction action and an activity retention action, normal Protective action against oxidative stress of cells, protection of normal cells against DNA damage and chemical toxicity due to ultraviolet light, active action of normal cell glucose-6-phosphodehydrogenase (G6PD) and therapeutic action of G6PD deficiency, tumor and It has been found that it has a therapeutic and preventive action for cancer, and an action for enhancing the sensitivity of cancer cells to anticancer agents, and has completed the present invention.
即ち、本発明によれば、下記式（１）：
で示されるウィザノン（Withanone）またはその誘導体を有効成分として含む、正常細胞の寿命延長、正常細胞のプロテアソーム活性の誘発及び活性保持、又は正常細胞の酸化的ストレスからの保護のための組成物が提供される。
That is, according to the present invention, the following formula (1):
A composition for prolonging the life span of normal cells, inducing and maintaining normal cell proteasome activity, or protecting normal cells from oxidative stress, comprising Withanone or a derivative thereof as an active ingredient is provided. Is done.
本発明によればさらに、下記式で示されるウィザノン（Withanone）を有効成分として含む、正常細胞の寿命延長、正常細胞のプロテアソーム活性の誘発及び活性保持、又は正常細胞の酸化的ストレスからの保護のための組成物が提供される。
本発明によればさらに、アシュワガンダの葉抽出物を有効成分として含む、正常細胞の寿命延長、正常細胞のプロテアソーム活性の誘発及び活性保持、又は正常細胞の酸化的ストレスからの保護のための組成物が提供される。 Further according to the present invention, a composition for prolonging the life span of normal cells, inducing and maintaining the proteasome activity of normal cells, or protecting normal cells from oxidative stress, comprising Ashwagandha leaf extract as an active ingredient Is provided.
本発明によればさらに、下記式（１）：
で示されるウィザノン（Withanone）またはその誘導体を有効成分として含む、正常細胞の紫外線によるＤＮＡ損傷または化学毒性からの保護のための組成物が提供される。
According to the present invention, the following formula (1):
A composition for protecting normal cells from DNA damage or chemical toxicity due to ultraviolet rays is provided, which comprises Withanone or a derivative thereof as an active ingredient.
本発明によればさらに、下記式で示されるウィザノン（Withanone）を有効成分として含む、正常細胞の紫外線によるＤＮＡ損傷または化学毒性からの保護のための組成物が提供される。
本発明によればさらに、アシュワガンダの葉抽出物を有効成分として含む、正常細胞の紫外線によるＤＮＡ損傷または化学毒性からの保護のための組成物が提供される。 According to the present invention, there is further provided a composition for protecting normal cells from DNA damage or chemical toxicity due to ultraviolet rays, comprising Ashwagandha leaf extract as an active ingredient.
好ましくは、本発明の組成物は、上記化学毒性が治療に用いられる薬剤または環境毒物である。 Preferably, the composition of the present invention is a drug or environmental toxicant whose chemical toxicity is used for treatment.
本発明によればさらに、下記式（１）：
で示されるウィザノン（Withanone）またはその誘導体を有効成分として含む、正常細胞のグルコース−６−ホスホデヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の活性化又はＧ６ＰＤ欠損症の治療のための組成物が提供される。
According to the present invention, the following formula (1):
A composition for activation of glucose-6-phosphodehydrogenase (G6PD) in normal cells or treatment of G6PD deficiency is provided, comprising withanone or a derivative thereof represented by the formula:
本発明によればさらに、下記式で示されるウィザノン（Withanone）を有効成分として含む、正常細胞のグルコース−６−ホスホデヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の活性化又はＧ６ＰＤ欠損症の治療のための組成物が提供される。
本発明によればさらに、アシュワガンダの葉抽出物を有効成分として含む、正常細胞のグルコース−６−ホスホデヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の活性化又はＧ６ＰＤ欠損症の治療のための組成物が提供される。 The present invention further provides a composition for activating normal cell glucose-6-phosphodehydrogenase (G6PD) or treating G6PD deficiency, comprising Ashwagandha leaf extract as an active ingredient.
本発明によればさらに、下記式（１）
で示されるウィザノン（Withanone）またはその誘導体を有効成分として含む、腫瘍若しくはがんの治療若しくは予防、又はがん細胞の抗がん剤に対する感受性増強のための組成物が提供される。
According to the present invention, the following formula (1)
A composition for treating or preventing a tumor or cancer or enhancing sensitivity of a cancer cell to an anticancer agent, comprising withanone or a derivative thereof represented by the formula:
本発明によればさらに、下記式で示されるウィザノン（Withanone）を有効成分として含む、腫瘍若しくはがんの治療若しくは予防、又はがん細胞の抗がん剤に対する感受性増強のための組成物が提供される。
本発明によればさらに、アシュワガンダの葉抽出物を有効成分として含む、腫瘍若しくはがんの治療若しくは予防、又はがん細胞の抗がん剤に対する感受性増強のための組成物が提供される。 The present invention further provides a composition for treating or preventing tumors or cancer, or enhancing the sensitivity of cancer cells to an anticancer agent, comprising Ashwagandha leaf extract as an active ingredient.
好ましくは、上記した本発明の腫瘍若しくはがんの治療若しくは予防、又はがん細胞の抗がん剤に対する感受性増強のための組成物は、抗がん剤、より好ましくはドキソルビシン、エトポシドまたは５ＦＵと併用される。 Preferably, the composition for treating or preventing tumor or cancer of the present invention or enhancing sensitivity of cancer cells to an anticancer agent is preferably an anticancer agent, more preferably doxorubicin, etoposide or 5FU. Used together.
本発明によればさらに、組成物が食品、栄養補助食品、医薬品、医薬部外品または化粧品である、上記した本発明の組成物が提供される。 According to the present invention, there is further provided the above-described composition of the present invention, wherein the composition is a food, a dietary supplement, a pharmaceutical, a quasi-drug, or a cosmetic.
本発明により、ウィザノン（Withanone）の正常細胞の寿命延長作用、正常細胞のプロテアソーム活性の誘発作用及び活性保持作用、正常細胞の酸化的ストレスからの保護作用、正常細胞の紫外線によるＤＮＡ損傷及び化学毒性からの保護作用、正常細胞のグルコース−６−ホスホデヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の活性作用及びＧ６ＰＤ欠損症の治療作用、腫瘍及びがんの治療作用及び予防作用、並びにがん細胞の抗がん剤に対する感受性増強作用が科学的に明らかとなり、その新しい医薬用途もしくは保健用途もしくは医薬部外品用途もしくは化粧品用途の開拓に資することが可能となった。例えば、アシュワガンダ葉抽出物は、正常細胞の寿命延長、正常細胞のプロテアソーム活性の誘発作用及び活性保持作用、正常細胞の酸化的ストレスからの保護作用、正常細胞の紫外線によるＤＮＡ損傷若しくは化学毒性からの保護作用、又は正常細胞のグルコース−６−ホスホデヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の活性作用が関連する疾患の治療用または予防用組成物の生産に利用することができる。特に、Ｇ６ＰＤ欠損症、腫瘍若しくはがんの治療用または予防用組成物の生産に利用することができ、がんの治療においては他の抗がん剤と併用することで、上記抗がん剤のがん細胞に対する感受性を増強することができる。 According to the present invention, Withanone normal cell life-prolonging effect, normal cell proteasome activity inducing and maintaining activity, normal cell protection from oxidative stress, normal cell UV damage and chemical toxicity Protective action against glucose, normal cell glucose-6-phosphodehydrogenase (G6PD) active action and G6PD deficiency therapeutic action, tumor and cancer therapeutic action and preventive action, and sensitivity of cancer cells to anticancer agents The potentiating action has been scientifically clarified, and it has become possible to contribute to the development of the new pharmaceutical use, health use, quasi-drug use, or cosmetic use. For example, Ashwagandha leaf extract is effective in prolonging the life span of normal cells, inducing and maintaining the activity of proteasome activity in normal cells, protecting against normal cell oxidative stress, DNA damage or chemical toxicity due to ultraviolet rays in normal cells. The composition can be used for the production of a composition for treating or preventing a disease associated with a protective action or an active action of glucose-6-phosphodehydrogenase (G6PD) in normal cells. In particular, it can be used for the production of a composition for the treatment or prevention of G6PD deficiency, tumor or cancer, and in combination with other anticancer agents in the treatment of cancer, the above anticancer agent Can enhance the sensitivity to cancer cells.
（１）アシュワガンダ葉抽出物
アシュワガンダとしては学名Withania somniferaを用いる。アシュワガンダ葉抽出物とは、アシュワガンダの葉を抽出して得られる抽出物である。アシュワガンダの葉は採取したままの新鮮葉、それを乾燥させたもの、または焙煎させたものいずれでもよいが、乾燥させたものが望ましい。原料とするアシュワガンダは天然に生育するものに限定されず、in vitroで培養したものであってもよいが、アシュワガンダ葉に含有される成分の組成はアシュワガンダの産地や樹齢等により若干の差があると考えられるため、本発明のアシュワガンダ葉抽出物を得るためには、インド国内で種から栽培した２〜４年目の植物を用いることが望ましい。
(1) Ashwagandha leaf extract The scientific name Withania somnifera is used as Ashwagandha. The Ashwagandha leaf extract is an extract obtained by extracting Ashwagandha leaves. Ashwagandha leaves may be freshly harvested leaves, dried or roasted, but are preferably dried. Ashwagandha as a raw material is not limited to those that grow naturally, but may be cultured in vitro, but the composition of the components contained in the leaves of Ashwagandha varies slightly depending on the location of Ashwagandha, the age of the tree, etc. Therefore, in order to obtain the Ashwagandha leaf extract of the present invention, it is desirable to use plants of 2 to 4 years grown from seeds in India.
本発明におけるアシュワガンダ葉抽出物としては、アシュワガンダの葉をアルコール（水性アルコール）で抽出、濃縮して得られるアルコール抽出物、およびここで得られるアルコール抽出物からクロロフィルなどの色素を除いた残渣をジエチルエーテルで抽出、濃縮して得られるエーテル抽出物、又はこれらの抽出物の成分を用いる。
アルコール抽出物を得るのに使用される水性アルコールとしては、炭素数１〜３の脂肪族アルコールが望ましく、例えばメタノール、エタノール、プロパノール等が挙げられる。
The Ashwagandha leaf extract in the present invention includes an alcohol extract obtained by extracting and concentrating Ashwagandha leaves with alcohol (aqueous alcohol), and a residue obtained by removing pigments such as chlorophyll from the alcohol extract obtained here. An ether extract obtained by extraction with ether and concentration, or components of these extracts are used.
The aqueous alcohol used for obtaining the alcohol extract is preferably an aliphatic alcohol having 1 to 3 carbon atoms, and examples thereof include methanol, ethanol, and propanol.
エーテル抽出物を得るには、上記のようにして得られたアルコール抽出物に水を加えた含水アルコール抽出物をさらに適当な溶媒（例えばヘキサン）で抽出してクロロフィルその他の色素を除いた残渣をジエチルエーテルで抽出、濃縮して得るのが適当である。
本発明におけるアシュワガンダ葉抽出物としては、上記で得られたエーテル抽出物をさらにカラムクロマトグラフィーなどにより精製した画分を用いてもよい。クロマトグラフィーとしては逆相が適当である。
In order to obtain an ether extract, a water-containing alcoholic extract obtained by adding water to the alcoholic extract obtained as described above is further extracted with an appropriate solvent (for example, hexane) to remove a residue obtained by removing chlorophyll and other pigments. It is suitable to obtain by extraction and concentration with diethyl ether.
As the Ashwagandha leaf extract in the present invention, a fraction obtained by further purifying the ether extract obtained above by column chromatography or the like may be used. A reversed phase is suitable for chromatography.
エーテル抽出物を逆相に付した場合、次に示す式Ｉ（ウィザフェリンＡ）、式II（12-Deoxywithastramonolide）、式III（ウィザノライドＡ）、式IV（ウィザノン）に対応する複数のピークを得ることができる。本発明においては、上記の中でも特に、式IV（ウィザノン）に対応するピークを示す成分を精製することにより単離することができる化合物を用いることができる。 When the ether extract is subjected to reverse phase, a plurality of peaks corresponding to the following formula I (withaferrin A), formula II (12-Deoxywithastramonolide), formula III (withanolide A), and formula IV (withanone) are obtained. be able to. In the present invention, among the above, compounds that can be isolated by purifying a component showing a peak corresponding to formula IV (withanone) can be used.
本発明における有効成分として、アシュワガンダ葉のエーテル抽出物を逆相クロマトグラフィーにより精製した画分を用いる場合、特に有用であるのは本明細書の実施例２で得られたピーク２１の成分を精製して得られた化合物（以下、単にピーク２１と称することもある）である。 When the fraction obtained by purifying the ether extract of Ashwagandha leaf by reverse phase chromatography is used as an active ingredient in the present invention, it is particularly useful to purify the component of peak 21 obtained in Example 2 of the present specification. Thus obtained compound (hereinafter sometimes simply referred to as peak 21).
本発明者らは、ピーク２１が前記式IVの化合物であるウィザノンに対応することを見出した。よって、正常細胞の寿命延長作用、正常細胞のプロテアソーム活性の誘発作用及び活性保持作用、正常細胞の酸化的ストレスからの保護作用、正常細胞の紫外線によるＤＮＡ損傷及び化学毒性からの保護作用、正常細胞のグルコース−６−ホスホデヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の活性作用及びＧ６ＰＤ欠損症の治療作用、腫瘍及びがんの治療作用及び予防作用、並びにがん細胞の抗がん剤に対する感受性増強作用を有するようなウィザノン及びウィザノンの誘導体を、本発明においては有効成分として用いることができる。ウィザノン及びウィザノンの誘導体の製造方法は特に限定されるものではなく、アシュワガンダ葉から単離されるほか、単離化合物の化学的変換または合成等によっても製造することができる。かかる化学的変換または合成等の方法は、例えば”Natural Product Reports”(8(4), 415(1991))その他に記載されるような当業者に周知の適当な方法によることができる。 The inventors have found that peak 21 corresponds to withanone which is a compound of formula IV. Therefore, normal cell life-extending effect, normal cell proteasome activity inducing and maintaining activity, normal cell protection from oxidative stress, normal cell UV damage and chemical toxicity protection, normal cell With the activity of glucose-6-phosphodehydrogenase (G6PD) and the therapeutic effect of G6PD deficiency, the therapeutic and preventive effects of tumors and cancer, and the enhancement of the sensitivity of cancer cells to anticancer agents And derivatives of withanone can be used as active ingredients in the present invention. The method for producing withanone and a derivative of withanone is not particularly limited, and it can be produced by chemical conversion or synthesis of an isolated compound as well as being isolated from Ashwagandha leaves. Such chemical transformation or synthesis methods may be by any suitable method known to those skilled in the art, for example as described in “Natural Product Reports” (8 (4), 415 (1991)) and others.
ウィザノン又はその誘導体として適切なものを以下の式で示す。
上記式において、Xは酸素、窒素、硫黄原子または、−OCO−、−COO−、−CONH−、−NHCO−、−OCONH−、−NHCOO−、−NHCONH−、−NHCSNH−基を表し、R1、R2は同一または異なって、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリールを表す。 In the above formula, X represents an oxygen, nitrogen, sulfur atom, or —OCO—, —COO—, —CONH—, —NHCO—, —OCONH—, —NHCOO—, —NHCONH—, —NHCSNH— group, R 1 and R 2 are the same or different and each represents hydrogen, alkyl, aryl, or heteroaryl.
本発明において「アルキル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜５のものを挙げることができる。具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルを挙げることができる。当該「アルキル」は置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロ、トリメチルシリルを挙げることができ、これらが１〜３個置換されている。
本発明において「アリール」としては、例えば、炭素数６〜１２のものを挙げることができる。具体的には、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニルを挙げることができる。当該「アリール」は置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１〜３個置換されている。
本発明において「ヘテロアリール」としては、窒素、酸素、又は硫黄原子を含む１〜２環性の複素環を表す。当該「ヘテロアリール」は置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１〜３個置換されている。
本発明におけるアシュワガンダ葉抽出物として、ピーク２１（ウィザノン）あるいはその誘導体を他のアシュワガンダ葉抽出物の成分等その他の化合物と組合わせて用いることもできる。
In the present invention, examples of the “alkyl” include linear or branched ones having 1 to 5 carbon atoms. Specific examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, and tert-butyl. The “alkyl” may be substituted, and examples of the substituent include halogen, alkyl, alkoxy, cyano, nitro, and trimethylsilyl, and 1 to 3 of these are substituted.
In the present invention, examples of the “aryl” include those having 6 to 12 carbon atoms. Specific examples include phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, and biphenyl. The “aryl” may be substituted, and examples of the substituent include halogen, alkyl, alkoxy, cyano, and nitro, and 1 to 3 of these are substituted.
In the present invention, “heteroaryl” represents a 1 to 2 cyclic heterocyclic ring containing a nitrogen, oxygen or sulfur atom. The “heteroaryl” may be substituted, and examples of the substituent include halogen, alkyl, alkoxy, cyano, nitro, and 1 to 3 of these are substituted.
As the Ashwagandha leaf extract in the present invention, peak 21 (withanone) or a derivative thereof can be used in combination with other compounds such as components of other Ashwagandha leaf extracts.
（２）組成物
本発明はさらに、ウィザノン（Withanone）またはその誘導体を有効成分として含む、正常細胞の寿命延長、正常細胞のプロテアソーム活性の誘発及び活性保持、正常細胞の酸化的ストレスからの保護、正常細胞の紫外線によるＤＮＡ損傷または化学毒性からの保護、正常細胞のグルコース−６−ホスホデヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の活性若しくはＧ６ＰＤ欠損症の治療、腫瘍若しくはがんの治療若しくは予防、又はがん細胞の抗がん剤に対する感受性増強のための組成物を提供し、組成物は食品、栄養補助食品、医薬品、医薬部外品または化粧品の形でありうる。
(2) Composition The present invention further includes, as an active ingredient, withanone (Withanone) or a derivative thereof, normal cell life extension, induction and maintenance of normal cell proteasome activity, protection from normal cell oxidative stress, Protection of normal cells from DNA damage or chemical toxicity by ultraviolet rays, normal cell glucose-6-phosphodehydrogenase (G6PD) activity or treatment of G6PD deficiency, treatment or prevention of tumors or cancer, or anti-cancer cells A composition for enhancing sensitivity to a cancer drug is provided, and the composition may be in the form of a food, a dietary supplement, a pharmaceutical, a quasi drug, or a cosmetic.
本発明の組成物が医薬用組成物であるときの投与方法は特に限定されるものではなく、経口、経鼻、非経口、経肺、経皮、経粘膜などが可能である。本発明の医薬用組成物は種々の剤形とすることができる。例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができるが、これらに限定されない。また、製剤には薬剤的に許容できる種々の担体を加えることができる。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、コーティング剤、ビタミンＣ、抗酸化剤を含むことができるが、これらに限定されない。 The administration method when the composition of the present invention is a pharmaceutical composition is not particularly limited, and oral, nasal, parenteral, pulmonary, transdermal, transmucosal and the like are possible. The pharmaceutical composition of the present invention can be in various dosage forms. For example, for oral administration, tablets, capsules, powders, granules, pills, solutions, emulsions, suspensions, solutions, spirits, syrups, extracts, elixirs can be used. However, it is not limited to these. In addition, various pharmaceutically acceptable carriers can be added to the preparation. For example, excipients, binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, coloring agents, sweeteners, flavoring agents, solubilizers, suspending agents, emulsifiers, coating agents, vitamin C, antioxidants It can include but is not limited to these.
本発明の医薬用組成物の投与量は、一般的には、アシュワガンダ葉抽出物に換算して成人１日用量として１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１００ｍｇ〜５００ｍｇを使用する。もちろん個別的に、投与されるヒトの年齢、体重、症状、投与経路、投与期間、治療経過等に応じて変化させることもできる。１日あたりの量を数回に分けて投与することもできる。また、他の抗腫瘍剤や治療法と組み合わせて投与することもできる。 The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is generally 1 mg to 1000 mg, preferably 100 mg to 500 mg as an adult daily dose in terms of Ashwagandha leaf extract. Of course, it can be changed individually according to the age, weight, symptoms, administration route, administration period, course of treatment, etc. of the administered human. The daily dose can be administered in several divided doses. It can also be administered in combination with other anti-tumor agents and treatments.
本発明の組成物は、食品又は栄養補助食品の形態とすることもできる。例えば、アシュワガンダ葉抽出物を原材料に配合することにより、麺類、パン、キャンディー、ゼリー、クッキー、スープ、健康飲料、焼酎などのアルコール飲料等の形態とすることができる。このような食品、栄養補助食品にはアシュワガンダ葉抽出物の他に、鉄、カルシウム等の無機成分、種々のビタミン類、オリゴ糖、キトサン等の食物繊維、大豆抽出物等のタンパク質、レシチンなどの脂質、ショ糖、乳糖等の糖類を加えることができる。 The composition of the present invention may be in the form of a food or a dietary supplement. For example, by blending Ashwagandha leaf extract as a raw material, it can be in the form of alcoholic beverages such as noodles, bread, candy, jelly, cookies, soup, health drink, shochu. In addition to Ashwagandha leaf extract, such foods and dietary supplements include inorganic components such as iron and calcium, dietary fibers such as various vitamins, oligosaccharides and chitosan, proteins such as soy extract, and lecithin. Sugars such as lipids, sucrose and lactose can be added.
本発明の組成物は、アシュワガンダ葉抽出物を原材料に配合することにより、医薬部外品または化粧品の形態とすることもできる。本発明の組成物を医薬部外品または化粧品とするときは、本発明の効果を損なわない範囲で、アシュワガンダ葉抽出物に加えて、通常医薬部外品や化粧品に用いられる他の成分、例えば油分、湿潤剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、界面活性剤、防腐剤、保湿剤、香料、水、アルコール、増粘剤等を必要に応じて適宜配合することができる。 The composition of this invention can also be made into the form of a quasi-drug or cosmetics by mix | blending Ashwagandha leaf extract with a raw material. When the composition of the present invention is a quasi-drug or cosmetic, in addition to the Ashwagandha leaf extract, other ingredients that are usually used in quasi-drugs and cosmetics, for example, within a range not impairing the effects of the present invention Oils, wetting agents, ultraviolet absorbers, antioxidants, surfactants, preservatives, humectants, fragrances, water, alcohol, thickeners and the like can be appropriately blended as necessary.
（３）本発明の組成物が有用な症状
本発明の組成物は、正常細胞の寿命延長作用、正常細胞のプロテアソーム活性の誘発作用及び活性保持作用、正常細胞の酸化的ストレスからの保護作用、正常細胞の紫外線によるＤＮＡ損傷及び化学毒性からの保護作用、正常細胞のグルコース−６−ホスホデヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の活性作用及びＧ６ＰＤ欠損症の治療作用、腫瘍及びがんの治療作用及び予防作用、並びにがん細胞の抗がん剤に対する感受性増強作用を有する。従って、本発明の組成物はこれらの作用が有用である症状に有効である。本発明の組成物が有用である症状には老化が含まれるが、これに限定されない。本発明の組成物が、正常細胞の寿命延長作用、正常細胞のプロテアソーム活性の誘発作用及び活性保持作用、正常細胞の酸化的ストレスからの保護作用、正常細胞の紫外線によるＤＮＡ損傷及び化学毒性からの保護作用、正常細胞のグルコース−６−ホスホデヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の活性作用及びＧ６ＰＤ欠損症の治療作用、腫瘍及びがんの治療作用及び予防作用、並びにがん細胞の抗がん剤に対する感受性増強作用を有するかどうかについては、以下に記載する実施例に記載の各方法を用いることができるが含まれるが、これに限定されない。
(3) Symptoms in which the composition of the present invention is useful The composition of the present invention has an effect of extending the life span of normal cells, inducing and maintaining the activity of proteasome activity in normal cells, and protecting against normal cell oxidative stress. Protective action against normal cell ultraviolet ray DNA damage and chemical toxicity, normal cell glucose-6-phosphodehydrogenase (G6PD) active action and G6PD deficiency therapeutic action, tumor and cancer therapeutic action and preventive action, and Has the effect of enhancing the sensitivity of cancer cells to anticancer drugs. Therefore, the composition of the present invention is effective for symptoms for which these actions are useful. Symptoms for which the compositions of the present invention are useful include, but are not limited to, aging. The composition of the present invention is effective in prolonging the life span of normal cells, inducing and maintaining the activity of proteasome activity in normal cells, protecting against normal cell oxidative stress, DNA damage caused by ultraviolet rays in normal cells and chemical toxicity. Protective action, normal cell glucose-6-phosphodehydrogenase (G6PD) active action and G6PD deficiency therapeutic action, tumor and cancer therapeutic action and preventive action, and cancer cell sensitivity enhancement action to anticancer agents Although it can include each method as described in the examples described below, it is not limited thereto.
本発明を以下の実施例でさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されない。種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。 The present invention will be described in more detail in the following examples, but the present invention is not limited thereto. Various changes and modifications can be made by those skilled in the art, and these changes and modifications are also included in the present invention.
実施例１：アシュワガンダ葉抽出物の調製
インド北部で種から栽培した３年目の植物（ｉｎ vivo 植物）から、１０月に、アシュワガンダ(Withania somnifera)の葉を採取した。流水で洗浄し、空気乾燥してから細かい粉末状に破砕した。この粉末状となった葉を、改変ソックスレー法により抽出した(Lavie et al., 1968)。温メタノール（６０℃）を用いて、ソックスレー装置で４〜５日間、葉の粉末を徹底的に抽出した。得られたメタノール抽出物をさらにヘキサンで抽出してクロロフィルおよび他の色素を除き、次いで、ジエチルエーテルで抽出し、エバポレーションによりエーテル抽出物を得た。抽出手順のフローチャートを以下に示す。
実験室でアシュワガンダ(Withania somnifera)のin vitro培養を行う場合は、無菌的に発芽させた幼植物の茎端からin vitroで苗木を育てた。
腋生の茎基部のカルスから栽培した苗条を、６−ベンジルアデニン（ＢＡ、２ｍｇ/ｌ）あるいはＮ６（２−イソペンテニル）アデノシン単独（２−ｉＰ、４ｍｇ/ｌ）、あるいはこれら２つの組合わせ（ＢＡ、１ｍｇ/ｌおよび２−ｉＰ、１ｍｇ/ｌ）を添加したＭＳ培地（Murashige and Skoog's medium）で栽培した。これらの植物生長調節物質を用いて栽培された葉を、３０日目、６０日目、９０日目で採取し、空気乾燥して上述の方法で抽出した。
When ashwaganda ( Withania somnifera ) was cultured in vitro in the laboratory, seedlings were grown in vitro from the stem ends of aseptically germinated seedlings.
Shoots cultivated from callus at the base of cocoon stem are treated with 6-benzyladenine (BA, 2 mg / l) or N 6 (2-isopentenyl) adenosine alone (2-iP, 4 mg / l), or a combination of the two Cultivated in MS medium (Murashige and Skoog's medium) supplemented with (BA, 1 mg / l and 2-iP, 1 mg / l). Leaves cultivated using these plant growth regulators were collected on the 30th, 60th, and 90th days, air dried, and extracted by the method described above.
実施例２：Lashの構成成分の分析
実施例１の方法でin vivo植物から得たLashのエーテル抽出物を逆相ＨＬＰＣに付し、構成成分を分析した。
ＨＬＰＣは次の条件で行った。
カラム：YMC-Pack Pro C-18 (4.6 mm × 150mm)
移動相：A液；１％ MeOH水溶液
B液；MeOH:EtOH:i-PrOH=52.25:45.30:2.45
Gradient: 35%B→45%B (25min)
検出：UV: 220nm
カラム温度：50 ℃
流速：1ml / min
図１中の左側のチャートが、この抽出物のものである。標準試料と比較することにより、ピークのうちの３つはウィザフェリンＡ（Withaferin A：溶出時間16.7mins）、ウィザノライドＡ若しくはＤ（Withanolide A or D：19.3mins）、12-deoxywithastramonolide（18.8mins）と同定された。次に、一つのメジャーなピークであるピーク２１（Peak 21：21.9mins）の化合物を単離し（図１中の右側のチャート）、以下の実験に用いた。（以下、単にピーク２１とも称することがある）
Example 2: Analysis of components of Lash The ether extract of Lash obtained from an in vivo plant by the method of Example 1 was subjected to reverse phase HLPC, and the components were analyzed.
HLPC was performed under the following conditions.
Column: YMC-Pack Pro C-18 (4.6 mm × 150mm)
Mobile phase: Liquid A; 1% aqueous MeOH
Liquid B; MeOH: EtOH: i-PrOH = 52.25: 45.30: 2.45
Gradient: 35% B → 45% B (25min)
Detection: UV: 220nm
Column temperature: 50 ° C
Flow rate: 1ml / min
The left chart in FIG. 1 is for this extract. By comparison with the standard sample, three of the peaks are Withaferin A (Withaferin A: elution time 16.7mins), Withanolide A or D (Withanolide A or D: 19.3mins), 12-deoxywithastramonolide (18.8mins) Identified. Next, a compound having peak 21 (Peak 21: 21.9 mins), which is one major peak, was isolated (the chart on the right side in FIG. 1) and used in the following experiment. (Hereafter, it may be simply referred to as peak 21)
また、ピーク２１をＭＡＳＳとＮＭＲとに供し、以下の化合物として同定した。実施例１でin vivo植物から得られたLashエーテル抽出物300mgをシリカゲル薄層クロマトグラフィー（Merck、シリカゲル60F254、ジクロロメタン：メタノール＝10：1、Rf=0.43）にて精製し、淡緑色化合物を得た。これをジクロロメタン-メタノールにて、白色粉末18mgを得た。ESI-MASSの結果は、[M+Na]+=493.2であった。1H-NMR及び13C-NMRのケミカルシフト測定値を以下に示す。
1D-NMR
1H-NMR (500MHz, CDCl3):
0.86(S,3H,H-18),1.04(d,J=7Hz,3H,H-21),1.18(S,3H,H-19),1.26-1.40(m,3H,H-11,15),1.53-1.62(m,2H,H-9,H-12),1.67-1.80(m,2H,H-8,H-12),1.88(S,3H,H-27),1.94(S,3H,H-28),1.88-1.95(m,2H,H-16),1.98-2.07(m,1H,H-14),2.30-2.35(m,1H,H-20),2.42-2.56(m,4H,17-OH,H-4,23),2.67-2.71(m,1H,H-4),2.80-2.84(m,1H,H-11),3.05(d,J=3.7Hz,1H,H-6),3.15-3.16(m,1H,5-OH),3.31-3.33(m,1H,H-7),4.59-4.63(m,1H,H-22),5.85(dd,J=10.1,2.6Hz,1H,H-2),6.58-6.61(m,1H,H-3)
13C-NMR (125MHz, CDCl3):
9.5(C-21),12.3(C-27),14.7(C-19),15.1(C-18),20.5(C-28),21.6(C-11),22.9(C-15),32.5(C-12),32.8(C-23),35.2(C-9),36.0(C-8),36.7(C-16),36.8(C-4),42.9(C-20),45.9(C-14),48.7(C-13),51.0(C-10),56.3(C-6),57.2(C-7),73.2(C-5),78.7(C-22),84.6(C-17),121.4(C-25),129.0(C-2),139.7(C-3),150.4(C-24),167.1(C-26),203.1(C-1)
以上より、ピーク２１は既知化合物のウィザノン(Withanone)であることが判明した。
Peak 21 was subjected to MASS and NMR and identified as the following compound. The Lash ether extract 300 mg obtained from the in vivo plant in Example 1 was purified by silica gel thin layer chromatography (Merck, silica gel 60F 254 , dichloromethane: methanol = 10: 1, Rf = 0.43) to obtain a pale green compound. Obtained. This was dichloromethane-methanol to obtain 18 mg of white powder. The result of ESI-MASS was [M + Na] + = 493.2. Chemical shift measurement values of 1 H-NMR and 13 C-NMR are shown below.
1D-NMR
1 H-NMR (500MHz, CDCl 3 ):
0.86 (S, 3H, H-18), 1.04 (d, J = 7Hz, 3H, H-21), 1.18 (S, 3H, H-19), 1.26-1.40 (m, 3H, H-11,15 ), 1.53-1.62 (m, 2H, H-9, H-12), 1.67-1.80 (m, 2H, H-8, H-12), 1.88 (S, 3H, H-27), 1.94 (S , 3H, H-28), 1.88-1.95 (m, 2H, H-16), 1.98-2.07 (m, 1H, H-14), 2.30-2.35 (m, 1H, H-20), 2.42-2.56 (m, 4H, 17-OH, H-4,23), 2.67-2.71 (m, 1H, H-4), 2.80-2.84 (m, 1H, H-11), 3.05 (d, J = 3.7Hz , 1H, H-6), 3.15-3.16 (m, 1H, 5-OH), 3.31-3.33 (m, 1H, H-7), 4.59-4.63 (m, 1H, H-22), 5.85 (dd , J = 10.1, 2.6Hz, 1H, H-2), 6.58-6.61 (m, 1H, H-3)
13 C-NMR (125 MHz, CDCl 3 ):
9.5 (C-21), 12.3 (C-27), 14.7 (C-19), 15.1 (C-18), 20.5 (C-28), 21.6 (C-11), 22.9 (C-15), 32.5 (C-12), 32.8 (C-23), 35.2 (C-9), 36.0 (C-8), 36.7 (C-16), 36.8 (C-4), 42.9 (C-20), 45.9 ( C-14), 48.7 (C-13), 51.0 (C-10), 56.3 (C-6), 57.2 (C-7), 73.2 (C-5), 78.7 (C-22), 84.6 (C -17), 121.4 (C-25), 129.0 (C-2), 139.7 (C-3), 150.4 (C-24), 167.1 (C-26), 203.1 (C-1)
From the above, it was found that the peak 21 is a known compound, Withanone.
実施例３：ウィザノンによるガン細胞の死滅
ヒト正常細胞(TIG-1)と様々なガン細胞（ PC14, SKBR3, HS578T, MCF7）を異なる濃度のLashもしくはウィザノンで処理した（図２）。細胞の生死はWSTアッセイで測定した。図2でみられるように、 Lashやウィザノンで処理したガン細胞は、死滅した。一方、正常細胞の生死には顕著な影響は見られなかった。
Example 3: Cancer cell killing by withanone Human normal cells (TIG-1) and various cancer cells (PC14, SKBR3, HS578T, MCF7) were treated with different concentrations of Lash or withanone (FIG. 2). Cell viability was measured by WST assay. As seen in Figure 2, cancer cells treated with Lash or Withanone died. On the other hand, there was no significant effect on the life and death of normal cells.
実施例４：ウィザノンが正常細胞の寿命に与える効果
正常ヒト肺繊維芽細胞（TIG-1）を、加湿インキュベーター内(37℃及び5％CO2) で、１０％胎児ウシ血清（FBS）を補充したダルベッコ改変イーグル最小必須培地（DMEM, Gibco)中でウィザノン(2.5μg/ml及び5μg/ml)の非存在下又は存在下において培養した。細胞はコンフルエントになった時点で、１：８又は１：１６の分割比で継代した。連続的な継代を、細胞が老化して分裂を停止するまで行った。細胞分裂の総数は、実験終了時に、分割比（１：８分割は、３回の細胞分裂、１：１６分割は４回の細胞分裂）及び継代の数に基づいて計算した。細胞は、細胞分裂５０回までは４〜５日に１度継代し、その後は６〜８日に一度継代した。非分裂状態が２週間以上継続した。ウィザノンを添加した培養物の寿命は５〜８回細胞が分裂するまで延びた（図３）
Example 4 Effect of Withanone on Normal Cell Life Span Normal human lung fibroblasts (TIG-1) were supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) in a humidified incubator (37 ° C. and 5% CO 2 ). In Dulbecco's Modified Eagle Minimum Essential Medium (DMEM, Gibco) in the absence or presence of withanone (2.5 μg / ml and 5 μg / ml). When cells became confluent, they were passaged at a split ratio of 1: 8 or 1:16. Successive passages were performed until the cells aged and stopped dividing. The total number of cell divisions was calculated at the end of the experiment based on the split ratio (1: 8 split was 3 cell splits, 1:16 split was 4 cell splits) and the number of passages. Cells were passaged once every 4-5 days up to 50 cell divisions and then once every 6-8 days. Non-dividing state continued for more than 2 weeks. The lifespan of the culture with added Wizanone extended until the cells divide 5-8 times (FIG. 3)
実施例５：ウィザノンによる老化細胞に対する抗老化作用
対照及びウィザノンを供給した老化細胞(PD 62)をＵＶ顕微鏡で観察した。自由に選択した領域内について自己蛍光を示す細胞の数を計測し、自己蛍光細胞の百分率をプロットした。老化したヒトの繊維芽細胞（TIG-1）をウィザノンの存在下培養すると、老化のマーカーである自己蛍光が正常細胞よりも弱いことが示された（図４）。
Example 5: Anti-aging effect on senescent cells by withanone Control and senescent cells fed with withanone (PD 62) were observed with a UV microscope. The number of cells showing autofluorescence in the freely selected area was counted and the percentage of autofluorescent cells was plotted. When aging human fibroblasts (TIG-1) were cultured in the presence of withanone, it was shown that autofluorescence, which is a marker for aging, was weaker than normal cells (FIG. 4).
実施例６：ウィザノンによる老化細胞に対する抗老化作用
対照及びウィザノンを供給した細胞を、細胞染色老化バイオアッセイキット（Cell Staining Senescent BioAssayTM Kit） (US Biological, USA)を用いて内生β−ｇａｌについて染色した。β−ｇａｌ陽性細胞の数をランダムに選択した領域で３回の独立した実験で計測し、β−ｇａｌ陽性細胞の百分率をプロットした。老化したヒトの繊維芽細胞（TIG-1）をウィザノンの存在下で培養すると、老化のマーカーであるβ−ｇａｌ陽性細胞の数が正常細胞よりも少なくなった（図５）。
Example 6: Anti-aging effect on senescent cells by withanone Control and cells supplied with withan were treated for endogenous β-gal using a Cell Staining Senescent BioAssay ™ Kit (US Biological, USA). Stained. The number of β-gal positive cells was counted in three independent experiments in a randomly selected region and the percentage of β-gal positive cells was plotted. When senescent human fibroblasts (TIG-1) were cultured in the presence of withanone, the number of β-gal positive cells, which are markers for senescence, was smaller than that of normal cells (FIG. 5).
実施例７：ウィザノンによるプロテアソーム活性化作用
TIG-1細胞をウィザノン（5μg/ml）で４８時間処理した。細胞を溶解バッファー（20 mM Tris pH-7.6, 0.5％tritonX-100, 250mM NaCl, 3mM EDTA 及びprotease inhibitor cocktail (Complete Mini; Roche Diagnostics K.K., Basel, Switzerland)）中で溶解した。プロテアソームアッセイは以下の通り行った。20 μgのタンパク質溶解物をHepes緩衝液(0.1 M, pH-7.8)中の10μMのN-succinyl-LLVY-AMCとともに３７℃で４５分間インキュベートした。停止溶液(30mM酢酸ナトリウム, 70 mM酢酸、及び100 mMモノクロロ酢酸ナトリウム)を添加して反応を停止し、350/460 (励起/放射)の吸光度を分光光度計で測定した。ECGC (200 μg/ml、48時間の処理)及びCurcumin (15μg/ml,処理)をポジティブコントロールとして用いた。正常細胞をwithanoneで処理するとプロテアソーム活性が誘導された（図６）。
Example 7: Proteasome activation action by withanone
TIG-1 cells were treated with withanone (5 μg / ml) for 48 hours. Cells were lysed in lysis buffer (20 mM Tris pH-7.6, 0.5% tritonX-100, 250 mM NaCl, 3 mM EDTA and protease inhibitor cocktail (Complete Mini; Roche Diagnostics KK, Basel, Switzerland)). The proteasome assay was performed as follows. 20 μg of protein lysate was incubated with 10 μM N-succinyl-LLVY-AMC in Hepes buffer (0.1 M, pH-7.8) for 45 minutes at 37 ° C. Stop solution (30 mM sodium acetate, 70 mM acetic acid, and 100 mM sodium monochloroacetate) was added to stop the reaction, and the absorbance at 350/460 (excitation / radiation) was measured with a spectrophotometer. ECGC (200 μg / ml, treatment for 48 hours) and Curcumin (15 μg / ml, treatment) were used as positive controls. When normal cells were treated with withanone, proteasome activity was induced (FIG. 6).
実施例８：ウィザノンによる酸化ストレスに対する防護作用
TIG-1細胞を、ウィザノンの存在下又は非存在下で、Ｈ２Ｏ２で２時間処理することにより酸化ストレスに供した。細胞を、Ｈ２Ｏ２で処理した後、４８時間培養し、顕微鏡下で観察し撮影した。細胞をメタノール：アセトン（１：１）で固定化し、クリスタルバイオレット（メタノール中５％）で染色した。染色した細胞を顕微鏡下で撮影した。細胞の生存を、ＷＳＴ−１細胞生存キット（ロシュ）を用いて測定した。その結果、ウィザノンは正常細胞を酸化ストレスから保護した。細胞をウィザノンの存在下及び非存在下で酸化剤H2O2により２時間処理した場合、ウィザノンの存在下では細胞の生存率が上昇した（図７）。
Example 8: Protection against oxidative stress by withanone
TIG-1 cells were subjected to oxidative stress by treatment with H 2 O 2 for 2 hours in the presence or absence of withanone. The cells were treated with H 2 O 2 and then cultured for 48 hours, and observed and photographed under a microscope. Cells were fixed with methanol: acetone (1: 1) and stained with crystal violet (5% in methanol). Stained cells were photographed under a microscope. Cell survival was measured using the WST-1 cell survival kit (Roche). As a result, Withanone protected normal cells from oxidative stress. When cells were treated with oxidant H2O2 for 2 hours in the presence and absence of withanone, cell viability increased in the presence of withanone (FIG. 7).
実施例９：ウィザノンによる、プロテアソーム阻害剤（Expoximicin）により引き起こされる老化の早期化の防止
TIG-1細胞を、プロテアソーム阻害剤(Epoximicin)で１時間処理して、老化の早期化を誘導した。細胞を４８時間培養し、顕微鏡で観察し、撮影した。細胞をメタノール：アセトン（１：１）で固定化し、クリスタルバイオレット（メタノール中５％）で染色した。染色した細胞を顕微鏡下で撮影した。細胞の生存を、ＷＳＴ−１細胞生存キット（ロシュ）を用いて測定した。ウィザノンは、プロテアソーム阻害剤であるExpoximicinにより引き起こされる老化の早期化から正常細胞を保護した（図８）。
Example 9: Prevention of premature aging caused by proteasome inhibitor (Expoximicin) by withanone
TIG-1 cells were treated with a proteasome inhibitor (Epoximicin) for 1 hour to induce premature senescence. The cells were cultured for 48 hours, observed with a microscope, and photographed. Cells were fixed with methanol: acetone (1: 1) and stained with crystal violet (5% in methanol). Stained cells were photographed under a microscope. Cell survival was measured using the WST-1 cell survival kit (Roche). Withanone protected normal cells from premature aging caused by the proteasome inhibitor Expoximicin (FIG. 8).
（実施例の考察）
老化は複雑な現象であり、個人の遺伝子や環境といった様々な要因によって影響される。老化に伴いタンパク質が損傷されたり、酸化されたタンパク質が除かれなくなると、それらの酸化されたタンパク質は次第に蓄積される。プロテアソームは通常のタンパク質の他に、損傷を受けたり変異、もしくは誤った立体構造をとったタンパク質を分解するのに重要な役割を果たしている。生物は老化に伴い次第にタンパク質の分解効率が悪くなり、通常損傷されたタンパク質を除去することにより保たれているタンパク質の質の維持や、分解されたタンパク質の維持管理が適切に行われなくなると、変異などの修飾を受けたタンパク質が蓄積され、老化した人の機能低下に大きな影響を与えると言われている（Richter-Landsberg, C., and Bauer, N. G. (2004) Int J Dev Neurosci 22, 443-451； Farout, L., and Friguet, B. (2006) Antioxid Redox Signal 8, 205-216；Proctor, C. J., Soti, C., Boys, R. J., Gillespie, C. S., Shanley, D. P., Wilkinson, D. J., and Kirkwood, T. B. (2005) Mech Ageing Dev 126, 119-131；Grune, T. (2000) Biogerontology1, 31-40；及びMartinez-Vicente, M., Sovak, G., and Cuervo, A. M. (2005) Exp Gerontol 40, 622-633）。プロテアソームの機能を巧みに操作することにより、分解されたタンパク質の蓄積を管理することができ、また老化した体を若返らせることが出来る可能性もある。プロテアソームの機能を刺激することはアンチエイジングの重要な手法であると考えられる（Rattan, S. I. (2004) Ann N Y Acad Sci 1019, 554-558）。このことから考えると、withanoneは単独もしくはlashなどの他の因子などと組み合わせる事により、アンチエイジングに効果的な化合物である可能性がある(図７及び図８を参照)。
さらにプロテアソームの機能を生化学レベルで刺激することで、細胞を酸化的損傷や化学物質によるプロテアソームの阻害から守っている正常細胞をwithanoneで処理すると損傷の蓄積が押さえられ、老化を抑制し細胞の寿命が長くなる。
(Consideration of Examples)
Aging is a complex phenomenon and is influenced by various factors such as individual genes and environment. When proteins are damaged with aging or when oxidized proteins cannot be removed, the oxidized proteins gradually accumulate. In addition to normal proteins, the proteasome plays an important role in degrading damaged, mutated, or misstructured proteins. As organisms age, the degradation efficiency of proteins gradually deteriorates, and if the quality of the protein that is normally maintained by removing damaged proteins is not maintained or the maintenance of degraded proteins is not properly performed, Proteins that have been modified such as mutations accumulate, and are said to have a major impact on functional decline in aging people (Richter-Landsberg, C., and Bauer, NG (2004) Int J Dev Neurosci 22, 443 Farout, L., and Friguet, B. (2006) Antioxid Redox Signal 8, 205-216; Proctor, CJ, Soti, C., Boys, RJ, Gillespie, CS, Shanley, DP, Wilkinson, DJ, and Kirkwood, TB (2005) Mech Ageing Dev 126, 119-131; Grune, T. (2000) Biogerontology 1, 31-40; and Martinez-Vicente, M., Sovak, G., and Cuervo, AM (2005) Exp Gerontol 40, 622-633). By skillfully manipulating the function of the proteasome, it is possible to manage the accumulation of degraded proteins and to rejuvenate the aging body. Stimulating the function of the proteasome is considered to be an important anti-aging technique (Rattan, SI (2004) Ann NY Acad Sci 1019, 554-558). Considering this, withanone may be an effective compound for anti-aging by itself or in combination with other factors such as lash (see FIGS. 7 and 8).
Furthermore, by stimulating the function of the proteasome at the biochemical level, treatment with normal cells that protect cells from oxidative damage and chemical proteasome inhibition by withanone suppresses the accumulation of damage and suppresses aging. Long life.
実施例１０：ウィザノンによる、紫外線により引き起こされるＤＮＡダメージの防護
ウィザノンが、紫外線により引き起こされるＤＮＡダメージからヒト正常細胞を防御することを検証した（図９）。ヒト間葉系幹細胞を紫外線（１０ＭＪ／ｃｍ２）に暴露後、ＤＭＥＭ培地内でウィザノンの存在下または非存在下で約１２時間培養した。ＤＮＡ損傷マーカーであるｐ５３タンパク質のレベルをウェスタンブロッティングによって検出した。図９に示したように、ウィザノンで処理した細胞中のｐ５３レベルは、コントロールよりも低く、ウィザノンが細胞を紫外線により引き起こされるＤＮＡ損傷から防御する事を示唆している。
Example 10: Protection of DNA damage caused by UV light by Withanone It was verified that Withanon protects human normal cells from DNA damage caused by UV light (FIG. 9). Human mesenchymal stem cells were exposed to ultraviolet light (10 MJ / cm 2 ) and then cultured in DMEM medium in the presence or absence of withanone for about 12 hours. The level of p53 protein, a DNA damage marker, was detected by Western blotting. As shown in FIG. 9, p53 levels in cells treated with Withanone are lower than controls, suggesting that Withanone protects cells from DNA damage caused by UV radiation.
実施例１１：ウィザノンによる抗がん作用
アシュワガンダの葉抽出物とその成分であるウィザノンがGlucose 6 phospho dehydrogenase（Ｇ６ＰＤ）を活性化することを検証した（図１０）。ヒト正常繊維芽細胞をアシュワガンダの葉抽出物（Ｌａｓｈ）と精製した成分（ウィザノン）の混合物で１２〜２４時間処理し、Ｇ６ＰＤの酵素活性をティアンらの方法(Tian, et al., 1994, JBC, 269, 14798-14805)を用いて測定した。図１０に示すように上記混合物はＧ６ＰＤの酵素を活性化した。
Example 11: Anticancer effect by withanone It was verified that Ashwagandha leaf extract and its component, withanone, activate Glucose 6 phospho dehydrogenase (G6PD) (FIG. 10). Normal human fibroblasts were treated with a mixture of Ashwagandha leaf extract (Lash) and purified components (Withanon) for 12-24 hours, and the enzyme activity of G6PD was determined by the method of Tian et al. (Tian, et al., 1994, JBC , 269, 14798-14805). As shown in FIG. 10, the above mixture activated the enzyme of G6PD.
なお、Ｇ６ＰＤはエネルギー産生において酸化還元反応を触媒する必須酵素であり、その欠失は溶血性貧血として知られる貧血の原因となる。Ｇ６ＰＤはＸ染色体上に存在し、Ｇ６ＰＤ欠損症は男性においては一染色体上の変異が原因となりを引き起こされる。全世界で４億人がこの病気にかかっている。 G6PD is an essential enzyme that catalyzes the redox reaction in energy production, and its deletion causes anemia known as hemolytic anemia. G6PD is present on the X chromosome, and G6PD deficiency is caused by mutations on one chromosome in men. 400 million people worldwide have this disease.
実施例１２：ウィザノンによる化学毒性防護作用
ウィザノンを豊富に含むアシュワガンダ葉抽出物（ｉ−ＦＡＬＰ）の抗がん作用を測定した（図１１）。図１１のＡのウィザノンをｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍抑制実験（ヌードマウスを使用）と毒性実験（通常マウスを使用）に使用した。マウスに通常の固形飼料と水を十分量与え、飼育室の環境に３日間適応させた（温度２４±２℃、湿度５５〜６５％、１２時間毎の照明サイクル）。ｉ−ＦＡＬＰを一日おきに２ヶ月与え続けた。ｉ−ＦＡＬＰは滅菌した２％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）と混合し、柔軟性テフロン（登録商標）ニードルで食道にインジェクションした。体重測定と一般的な健康状態のチェックを２ヶ月間行った。ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍形成実験においてはＢａｌｂ／ｃヌードマウスに対してヒト繊維肉腫細胞（ＨＴ１０８０）を腹の両側２箇所に皮下注射した（液体培地０．５ ｍｌに１０６個の細胞）。その後１５−２０日間、ｉ−ＦＡＬＰを与えたマウス群とコントロールのマウス群を観察した。
Example 12: Chemotoxicity protective action by withanone The anticancer action of Ashwagandha leaf extract (i-FALP) rich in witherone was measured (FIG. 11). The withanone of FIG. 11A was used for in vivo tumor suppression experiments (using nude mice) and toxicity experiments (usually using mice). Mice were given sufficient amounts of normal chow and water and adapted to the environment in the breeding room for 3 days (temperature 24 ± 2 ° C., humidity 55-65%, lighting cycle every 12 hours). i-FALP was continued every other day for 2 months. i-FALP was mixed with sterilized 2% carboxymethylcellulose (CMC) and injected into the esophagus with a flexible Teflon needle. Body weight measurements and general health checks were conducted for 2 months. In in vivo tumor formation experiments, Balb / c nude mice were injected subcutaneously with human fibrosarcoma cells (HT1080) at two sites on both sides of the abdomen (10 6 cells in 0.5 ml of liquid medium). Thereafter, a group of mice given i-FALP and a group of control mice were observed for 15-20 days.
ｉ−ＦＡＬＰを経口投与することにより腫瘍の形成が著しく阻害された（図１１のＢ、Ｃ）。コントロールマウス群においては１５−２０日の間に１８匹中１７匹で大きな腫瘍が形成されたが、ｉ−ＦＡＬＰを投与したマウスにおいては１８匹中３匹で大きな腫瘍が形成され、３匹で小さな腫瘍が、３匹で腫瘍芽が、残りの６匹では完全に腫瘍の形成を抑制がみられた。インジェクションしたがん細胞が少ないほう（マウスあたり１０６個と比較して１０５個程度）が腫瘍形成の抑制効果が高かったことから、ｉ−ＦＡＬＰは穏やかな抗がん作用を持つことが考えられ、がんの予防薬として効果が期待できる。さらに、ｉ−ＦＡＬＰを一日おきに与え続ける６週間の長期投与実験では、図１１のＤに示すように、コントロール群との間に体重において大きな差は見られなかった。 Tumor formation was markedly inhibited by oral administration of i-FALP (B, C in FIG. 11). In the control mouse group, 17 out of 18 mice formed large tumors during 15-20 days, while in mice administered i-FALP, 3 out of 18 mice formed large tumors. Three small tumors showed tumor buds and the remaining six completely inhibited tumor formation. The smaller the number of injected cancer cells (about 10 5 compared to 10 6 per mouse), the higher the inhibition of tumor formation, so i-FALP may have a mild anticancer effect. And can be expected to be effective as a cancer preventive. Furthermore, in a 6-week long-term administration experiment in which i-FALP was given every other day, as shown in FIG. 11D, there was no significant difference in body weight from the control group.
実施例１３：ウィザノンによる、正常細胞における化学毒性からの保護−増殖アッセイ
ウィザノンを豊富に含むアシュワガンダ葉抽出物（図１１Ａに示したｉ−Ｆａｃｔｏｒ）を用いて、抗がん剤（ドキソルビシン、エトポシド、５ＦＵ）によって引き起こされる細胞毒性の影響を正常細胞で検証した（図１２）。細胞増殖アッセイで示したように、ｉ−Ｆａｃｔｏｒはヒトがん細胞の３種類すべての抗がん剤に対する感受性を高めるが、正常細胞では細胞毒性を抑制した。
Example 13: Protection against chemotoxicity in normal cells by Withanone-Proliferation assay With the use of Ashwagandha leaf extract rich in Withanone (i-Factor shown in Fig. 11A), anticancer agents (doxorubicin, etoposide, The cytotoxic effect caused by 5FU) was verified in normal cells (FIG. 12). As shown in the cell proliferation assay, i-Factor increased the sensitivity of human cancer cells to all three anticancer agents, but suppressed cytotoxicity in normal cells.
実施例１４：ウィザノンによる、正常細胞における化学毒性からの保護−細胞周期アッセイ
Ｗｉｔｈａｆｅｒｉ−Ａは正常細胞においてＧ２期で細胞周期を停止させることによって、細胞毒性を示す（図１３のＡ−ｃとＡ−ａの比較）。ｉ−Ｆａｃｔｏｒの添加によって細胞毒性（図１３のＡ−ｃとＡ−ｄの比較）と細胞周期の異常（図１３のＢ−ｃとＢ−ｄ）は見られなくなる。細胞周期の定量的解析はパネルＣ、Ｄに示した。
ｉ−ＦａｃｔｏｒとＷｉｔｈａｆｅｒｉｎ−Ａのヒト正常細胞に対する影響を細胞周期解析により検討した。Ｗｉｔａｆｅｒｉｎ−ＡはＧ２期で細胞周期を停止させたが、Ｗｉｔａｆｅｒｉｎ−Ａとｉ−Ｆａｃｔｏｒを同時に作用させると細胞周期の停止が見られなくなった。
Example 14: Protection against chemical toxicity in normal cells by withanone-cell cycle assay Withaferi-A exhibits cytotoxicity by arresting the cell cycle in the G2 phase in normal cells (Ac and A in FIG. 13). -A comparison). Addition of i-Factor eliminates cytotoxicity (comparison between Ac and Ad in FIG. 13) and cell cycle abnormality (Bc and Bd in FIG. 13). Quantitative analysis of the cell cycle is shown in panels C and D.
The effects of i-Factor and Withaferin-A on human normal cells were examined by cell cycle analysis. Witaferin-A stopped the cell cycle in the G2 phase, but when Witaferin-A and i-Factor were acted simultaneously, the cell cycle was not stopped.
Claims (16)
で示されるウィザノン（Withanone）またはその誘導体を有効成分として含む、正常細胞の寿命延長、正常細胞のプロテアソーム活性の誘発及び活性保持、又は正常細胞の酸化的ストレスからの保護のための組成物。 Following formula (1):
A composition for prolonging the life span of normal cells, inducing and retaining normal cell proteasome activity, or protecting normal cells from oxidative stress, comprising Withanone or a derivative thereof as an active ingredient.
で示されるウィザノン（Withanone）またはその誘導体を有効成分として含む、正常細胞の紫外線によるＤＮＡ損傷または化学毒性からの保護のための組成物。 Following formula (1):
A composition for protecting normal cells from DNA damage or chemical toxicity due to ultraviolet rays, comprising withanone or a derivative thereof as an active ingredient.
で示されるウィザノン（Withanone）またはその誘導体を有効成分として含む、正常細胞のグルコース−６−ホスホデヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の活性化又はＧ６ＰＤ欠損症の治療のための組成物。 Following formula (1):
A composition for activation of glucose-6-phosphodehydrogenase (G6PD) in normal cells or treatment of G6PD deficiency, comprising withanone or a derivative thereof represented by the formula:
で示されるウィザノン（Withanone）またはその誘導体を有効成分として含む、腫瘍若しくはがんの治療若しくは予防、又はがん細胞の抗がん剤に対する感受性増強のための組成物。 Following formula (1):
A composition for treating or preventing tumor or cancer, or enhancing sensitivity of cancer cells to an anticancer agent, comprising withanone or a derivative thereof represented by the formula:
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