JP2008193984A - Method for counting sequence number of repeating base sequence, and sequence number counting kit for repeating base sequence - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、繰り返し塩基配列の配列数の測定方法および繰り返し塩基配列の配列数の測定キットに関する。 The present invention relates to a method for measuring the number of sequences of repeated base sequences and a kit for measuring the number of sequences of repeated base sequences.
核酸の塩基配列上の差異は、核酸の置換、挿入、欠質あるいは組み替えにより生ずる。この核酸の塩基配列上の差異のうち、ある集団内で1%以上の頻度で存在する変異は、特に遺伝子多型と呼ばれている。遺伝子多型には、1個の塩基が他の塩基に置換されている一塩基多型(以下、「SNP」という)、繰り返し単位が2〜4塩基であるマイクロサテライト多型、繰り返し単位が数塩基から数十塩基であるVNTR(variable nucleotide tandem repeat)多型などが知られている。 Differences in nucleic acid base sequences are caused by nucleic acid substitution, insertion, deletion or recombination. Among the differences in the nucleotide sequence of the nucleic acid, a mutation present at a frequency of 1% or more in a certain group is particularly called a gene polymorphism. A gene polymorphism is a single nucleotide polymorphism (hereinafter referred to as “SNP”) in which one base is replaced with another base, a microsatellite polymorphism having 2 to 4 repeat units, and a number of repeat units. A VNTR (variable nucleotide tandem repeat) polymorphism of several tens of bases to a base is known.
遺伝子多型は、一定の頻度である集団内に広がっている。このため、生存(生殖)に不利な影響を与えるのではなく、全く形質の変化を伴わない体質を左右する要因として注目されている。例えば、糖尿病、高血圧症、肥満等の生活習慣病、リュウマチ、アレルギー等の免疫疾患、あるいは癌等の疾患に対する罹りやすさが、遺伝子多型に起因することが知られている。また、薬剤代謝(薬の効き方)やヒト白血球組織適合型抗原等も遺伝子多型によって支配されていると考えられている。さらに、繰り返し単位の繰り返し頻度は、ヒトによって異なるので、個人の同定を行うことができる。 Genetic polymorphism is spread within a population with a certain frequency. For this reason, it does not adversely affect survival (reproduction), but has attracted attention as a factor that affects the constitution without any changes in traits. For example, it is known that gene susceptibility to susceptibility to lifestyle diseases such as diabetes, hypertension and obesity, immune diseases such as rheumatism and allergies, and diseases such as cancer. In addition, drug metabolism (how the drug works) and human leukocyte histocompatibility antigens are considered to be governed by genetic polymorphism. Furthermore, since the repetition frequency of the repeating unit varies from person to person, an individual can be identified.
ハンチントン病では、4番染色体短腕の第一遺伝子に存在するマイクロサテライト多型(繰り返し単位:CAg)の繰り返し反復数が36回以上と、異常に多い。この配列はグルタミンをコードする。このため、グルタミンの長大な鎖を生じ、これが転写機構を阻害するため、ハンチントン病を発症すると考えられている。また、血糖値をコントロールするインスリン遺伝子の近傍には、14塩基の繰り返し単位を有するVNTR多型(繰り返し単位:5’−ACAggggTgTgggg−3’など数種類)が存在する。この繰り返し単位の反復数が多い場合は、少ない場合に比べて、インスリンの分泌量が多くなることが知られている。すなわち、インスリンの発現量は、VTNRの繰り返し単位の反復数によって調節されている(例えば、非特許文献1参照)。 In Huntington's disease, the number of repeats of the microsatellite polymorphism (repeating unit: CAg) present in the first gene of the short arm of chromosome 4 is abnormally large, 36 or more. This sequence encodes glutamine. This produces a long chain of glutamine, which inhibits the transcription mechanism and is thought to cause Huntington's disease. In addition, there are VNTR polymorphisms (repeating units: several types such as 5'-ACAggggTgTgggg-3 ') having a repeating unit of 14 bases in the vicinity of the insulin gene that controls blood glucose level. It is known that when the number of repeating units is large, the amount of insulin secreted is larger than when the number of repeating units is small. That is, the expression level of insulin is regulated by the number of repeating units of VTNR (see, for example, Non-Patent Document 1).
このような繰り返し塩基配列を検出する方法としては、ゲノム中に存在する繰り返し塩基配列を含む標的核酸をゲノムから増幅し、電気泳動法を用いて繰り返し検出し、その配列長から反復数を測定する方法が知られている。あるいは、ゲノム中の繰り返し塩基配列を、標識したプローブを用いて検出する方法が知られている(例えば、特許文献1、2参照)。特許文献1では、ハイブリダイズしたDNAプローブの標識シグナルを測定して、テロメアサイズを測定する。また、特許文献2では、標的核酸にハイブリダイゼージョンさせた標識プローブに励起光を照射し、標識プローブの蛍光のゆらぎを検出して反復配列長を検出している。
これらの従来の繰り返し塩基配列(VNTRおよびマイクロサテライト)の検出方法では、繰り返し領域を増幅した後に、サザンハイブリダイゼーションなどにより検出する。このため、検出時間が1〜2日要するので、迅速な検出が行えないという問題がある。 In these conventional methods for detecting repetitive base sequences (VNTR and microsatellite), a repetitive region is amplified and then detected by Southern hybridization or the like. For this reason, since detection time takes 1-2 days, there exists a problem that a quick detection cannot be performed.
また、特許文献1、2に記載の方法では、溶液中で標識分子を測定する。このため、1つの検体について、一つの反応系で測定を行う必要があり、多くの検体を同時に測定するのは容易でない。また、1つの検体を用いて多項目を検出することができない。 In the methods described in Patent Documents 1 and 2, the labeled molecule is measured in a solution. For this reason, it is necessary to measure one sample in one reaction system, and it is not easy to measure many samples simultaneously. In addition, multiple items cannot be detected using one specimen.
近年、遺伝子診断、病原菌の特定などの際に、多検体・多項目の検出をするために、DNAチップ法が頻繁に用いられるようになってきた。この方法では、多数のプローブ核酸が同一の担体に固定化されたDNAチップを用いる。固定化されたプローブ核酸がそれぞれ多項目の標的核酸と選択的にハイブリダイズする。これにより、複数の標的核酸を検出することができる。しかし、DNAチップは、定量性が低い。このため、繰り返し塩基配列の反復数を求めるなどの定量性の高さが求められる検出には適さないという問題がある。 In recent years, the DNA chip method has been frequently used to detect multiple specimens and multiple items in genetic diagnosis and identification of pathogenic bacteria. In this method, a DNA chip having a large number of probe nucleic acids immobilized on the same carrier is used. Each immobilized probe nucleic acid selectively hybridizes with a multi-item target nucleic acid. Thereby, a plurality of target nucleic acids can be detected. However, the DNA chip has low quantitativeness. For this reason, there exists a problem that it is not suitable for the detection by which the high quantitative property is calculated | required, such as calculating | requiring the number of repetitions of a repetitive base sequence.
さらに、従来の検出方法では、多数の遺伝子多型を同時に検査することが容易ではない。特に、SNPsと繰り返し塩基配列とは密接な関係がある。したがって、これらを同時に検査診断することは、より正確な遺伝子診断をするために要求される。 Furthermore, it is not easy to examine a large number of genetic polymorphisms simultaneously with conventional detection methods. In particular, SNPs and repetitive base sequences are closely related. Accordingly, simultaneous diagnosis of these is required for more accurate genetic diagnosis.
本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、複数の標的核酸中から繰り返し塩基配列の反復数を迅速にかつ定量的に検出する方法および検出キットを提供することにある。 The present invention has been made in view of the above problems, and an object thereof is to provide a method and a detection kit for rapidly and quantitatively detecting the number of repetitive base sequence repeats from a plurality of target nucleic acids.
また、本発明の別な目的は、SNPsと繰り返し多型とを同時に検出する方法および検出キットを提供することにある。 Another object of the present invention is to provide a method and a detection kit for simultaneously detecting SNPs and repeated polymorphisms.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討をした結果、繰り返し配列単位に相補的な塩基配列鎖をハイブリダイズした後に、繰り返し配列単位内の核酸を標識するとともに、内部標準として繰り返し塩基配列外の核酸を標識し、標識量を測定し、比較することで、繰り返し塩基配列の反復数を迅速にかつ定量的に検出することを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下のとおりである。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have hybridized a base sequence chain complementary to a repetitive sequence unit, and then labeled the nucleic acid in the repetitive sequence unit and repeated it as an internal standard. It was found that nucleic acids outside the base sequence were labeled, the amount of labeling was measured, and the number of repeats of the repetitive base sequence was detected rapidly and quantitatively, and the present invention was completed. That is, the present invention is as follows.
本発明の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法は、繰り返し塩基配列内の塩基配列と繰り返し塩基配列外の塩基配列とのそれぞれに、標識を導入する第1の工程と、前記標識された繰り返し塩基配列内の塩基配列と標識された繰り返し塩基配列外の塩基配列とからそれぞれに導入された標識の標識量を測定し、測定した標識量から繰り返し塩基配列内の塩基配列に導入された標識と繰り返し塩基配列外の塩基配列に導入された標識の標識量の量比を求める第2の工程とを含む。 The method for measuring the number of repetitions of a repetitive base sequence according to the present invention includes a first step of introducing a label into each of a base sequence within a repetitive base sequence and a base sequence outside the repetitive base sequence, and the labeled repetitive base The amount of label introduced into each of the base sequence within the sequence and the base sequence outside the labeled repeat base sequence is measured, and the label and repeat introduced into the base sequence within the repeat base sequence from the measured label amount And a second step of determining the ratio of the amount of label introduced into the base sequence outside the base sequence.
前記前記第1の工程の前に、繰り返し塩基配列を有する標的核酸の繰り返し配列単位に相補的な塩基鎖をハイブリダイズさせ、繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体を形成する工程を含むと、好ましい。この工程の前にプライマーを用いて繰り返し配列を有する標的核酸を増幅する工程を含めてもよい。前記プライマーには、標識が導入されていてもよい。この場合に、前記第1の工程が、前記ハイブリダイズした相補的塩基鎖の末端に標識塩基を伸長するものであってもよい。また、標識塩基が付加されている相補的な塩基鎖を用いて、標的核酸の繰り返し配列単位にハイブリダイズさせてもよい。あるいは、標識塩基が付加されている相補的な塩基鎖を用いて、標的核酸の繰り返し配列単位にハイブリダイズさせてもよい。さらに、標識塩基が付加されている相補的な塩基鎖を用いて、標的核酸の繰り返し配列以外の部分にハイブリダイズさせるものであってもよい。この場合に、前記標識塩基が付加された相補的塩基鎖を、前記複合体から解離させた後に、前記相補的塩基鎖に付加された標識塩基の量を測定することにより、繰り返し塩基配列内の塩基配列と標識された繰り返し塩基配列外の塩基配列のそれぞれに導入された標識の標識量を測定するとよい。あるいは、相補的塩基鎖を前記複合体から解離させずに標識核酸ごと標識量を測定してもよい。前記相補的塩基鎖または標的核酸は、タグ配列を有するものであってもよい。また、前記タグ配列は、非天然型核酸を含んでいてもよい。本発明の方法を用いると、繰り返し塩基配列の反復数の測定と、一塩基多型の検出とを同時に行うこともできる。 Before the first step, including a step of hybridizing a base sequence complementary to a repetitive sequence unit of a target nucleic acid having a repetitive base sequence to form a repetitive sequence unit-complementary base chain complex; preferable. A step of amplifying a target nucleic acid having a repetitive sequence using a primer may be included before this step. A label may be introduced into the primer. In this case, the first step may extend a labeled base to the end of the hybridized complementary base chain. Moreover, you may hybridize to the repeating sequence unit of a target nucleic acid using the complementary base chain to which the labeled base is added. Alternatively, it may be hybridized to a repetitive sequence unit of the target nucleic acid using a complementary base chain to which a labeled base is added. Furthermore, it may be hybridized to a portion other than the repetitive sequence of the target nucleic acid using a complementary base chain to which a labeled base is added. In this case, after the complementary base chain to which the labeled base is added is dissociated from the complex, the amount of the labeled base added to the complementary base chain is measured, thereby repeatedly in the base sequence. The labeled amount of the label introduced into each of the base sequence and the base sequence outside the labeled repeated base sequence may be measured. Alternatively, the labeled amount may be measured together with the labeled nucleic acid without dissociating the complementary base chain from the complex. The complementary base strand or target nucleic acid may have a tag sequence. The tag sequence may contain a non-natural nucleic acid. By using the method of the present invention, it is possible to simultaneously measure the number of repetitive nucleotide sequences and to detect single nucleotide polymorphisms.
本発明の繰り返し塩基配列の反復数測定キットは、繰り返し塩基配列を有する標的核酸の繰り返し配列単位に相補的に結合する相補的塩基鎖と、前記標的核酸または相補的塩基鎖を固定する固定化担体とを含むものである。前記相補的塩基鎖は、タグ配列を有していてもよい。さらに、前記相補的塩基鎖に標識核酸を延伸するための標識核酸を含んでいてもよく、あるいは前記相補的塩基鎖は、標識核酸が付加されている相補的塩基鎖であってもよい。 The kit for measuring the number of repetitions of a repetitive base sequence according to the present invention comprises a complementary base chain that complementarily binds to a repetitive sequence unit of a target nucleic acid having a repetitive base sequence, and an immobilization carrier for immobilizing the target nucleic acid or the complementary base chain Is included. The complementary base chain may have a tag sequence. Furthermore, a labeled nucleic acid for extending a labeled nucleic acid to the complementary base chain may be included, or the complementary base chain may be a complementary base chain to which a labeled nucleic acid is added.
本発明では、繰り返し部位とそれ以外の部位に異なる標識を導入する。それぞれの標識の標識量を測定し、両者の量比を求める。この量比から、繰り返し塩基配列の反復数を検出する。この結果、迅速にかつ定量的に繰り返し塩基配列の反復数を検出する方法および検出キットを提供することができる。本発明では、繰り返し部位とそれ以外の部位に導入された、異なる標識の標識量の量比から繰り返し塩基配列の反復数を検出する。この結果、反復数の異なる検体、異なる種類の繰り返し配列など、従来は別個に行っていた多項目の測定を、同時にDNAチップ上で行うことができる。また、SNPsについても、同時に検出することができる。 In the present invention, different labels are introduced at the repetitive site and other sites. Measure the labeling amount of each label and determine the ratio of the two. From this quantitative ratio, the number of repeated base sequences is detected. As a result, it is possible to provide a method and a detection kit for rapidly and quantitatively detecting the number of repeated base sequences. In the present invention, the number of repetitive base sequences is detected from the ratio of the amounts of different labels introduced into the repetitive site and other sites. As a result, multiple items such as samples with different numbers of repetitions and different types of repetitive sequences, which have conventionally been separately performed, can be simultaneously measured on the DNA chip. Also, SNPs can be detected simultaneously.
[原理]
本発明の繰り返し塩基配列の反復数を検出する方法および検出キットは、繰り返し塩基配列が一般に有する以下のような規則性を利用したものである。図1は、繰り返し塩基配列を有する核酸を模式的に示す図である。この図の例では、繰り返し塩基配列を有する核酸は、n個の繰り返し配列単位1を有している。図1(a)に示すように各繰り返し配列単位の3’末端の核酸(この図の例では、T)と繰り返し配列の5’末端外に存在する核酸(この図の例では、A)とは、一般に核酸の種類が異なる。各繰り返し配列単位1に相補的な塩基鎖をハイブリダイズする。図1(b)に示す例では、相補的塩基鎖2として、少なくとも繰り返し配列単位の5’末端側の一部に相補的であるものを用いる。次に、標識核酸を導入する。図1(c)に示すように、繰り返し配列単位の1〜(n−1)番目に結合した相補的塩基鎖には標識核酸Aが導入され、繰り返し配列単位のn番目に結合した相補的塩基鎖には標識核酸Tが導入される。あるいは、相補的塩基鎖の末端に標識核酸としてAまたはTが結合しているものを用いても、同様に標識核酸が導入される。標識核酸AまたはTが導入された相補的塩基鎖を異なる標識で検出し、両者の標識量の比をとる。この図の例では、Aが導入された相補的塩基鎖の信号強度は、内部標準であるTが導入された相補的塩基鎖の信号強度で割るので、n個の繰り返し単位を持つ標的核酸からは、(n−1)個分の信号強度となる。したがって、繰り返し配列の配列数が異なる標的核酸であっても、同時に反復数を測定することができる。
[principle]
The method and the detection kit for detecting the number of repeats of a repetitive base sequence of the present invention utilize the following regularity that a repetitive base sequence generally has. FIG. 1 is a diagram schematically showing a nucleic acid having a repetitive base sequence. In the example of this figure, a nucleic acid having a repetitive base sequence has n repetitive sequence units 1. As shown in FIG. 1A, a nucleic acid at the 3 ′ end of each repeating sequence unit (T in this example) and a nucleic acid outside the 5 ′ end of the repeating sequence (A in this example) Generally differ in the type of nucleic acid. A complementary base chain is hybridized to each repeating sequence unit 1. In the example shown in FIG. 1 (b), a complementary base chain 2 that is complementary to at least a part of the 5 ′ end side of the repetitive sequence unit is used. Next, a labeled nucleic acid is introduced. As shown in FIG. 1 (c), the labeled nucleic acid A is introduced into the complementary base chain bound to the 1st to (n-1) th of the repeating sequence unit, and the complementary base bound to the nth of the repeating sequence unit. A labeled nucleic acid T is introduced into the chain. Alternatively, a labeled nucleic acid can be similarly introduced even if a labeled nucleic acid having A or T bound to the end of a complementary base chain is used. Complementary base strands into which the labeled nucleic acid A or T has been introduced are detected with different labels, and the ratio of the amounts of both labels is determined. In the example of this figure, the signal intensity of the complementary base chain into which A is introduced is divided by the signal intensity of the complementary base chain into which T, which is an internal standard, is introduced. Therefore, from the target nucleic acid having n repeating units, Is (n-1) signal intensity. Therefore, even if the target nucleic acids have different numbers of repeat sequences, the number of repeats can be measured simultaneously.
上記の例では、n番目の繰り返し配列単位に内部標準を導入する例を説明した。内部標準を導入するのは、繰り返し配列単位に限られず、例えば、図2(a)に示すように、標識核酸中の繰り返し配列部分以外の部位であってもよい。この図の例では、標識核酸中の繰り返し配列部分以外の部位に相補的な配列2’を用いて、これに標識核酸を導入する。あるいは、図2(b)に示すように標識核酸中の繰り返し配列部分以外の部位に、標識14を導入することによってもよい。図2(b)の例では、標的核酸を固定化して繰り返し配列の配列数を測定する場合に適する。なお、図2に示す例では、n個の繰り返し単位を持つ標的核酸からは、n個分あるいは(n−1)個分の信号強度となる。また、繰り返し配列単位に対する相補的な塩基鎖は、繰り返し配列単位の一部でなく全部であってもよい。 In the above example, the example in which the internal standard is introduced into the nth repetitive sequence unit has been described. The internal standard is not limited to the repetitive sequence unit, and may be a site other than the repetitive sequence portion in the labeled nucleic acid, for example, as shown in FIG. In the example of this figure, a labeled nucleic acid is introduced into a sequence 2 'complementary to a site other than the repeated sequence portion in the labeled nucleic acid. Alternatively, as shown in FIG. 2B, the label 14 may be introduced into a site other than the repetitive sequence portion in the labeled nucleic acid. The example of FIG. 2B is suitable for the case where the target nucleic acid is immobilized and the number of repeated sequences is measured. In the example shown in FIG. 2, the signal intensity is n or (n-1) from the target nucleic acid having n repeating units. In addition, the base chain complementary to the repetitive sequence unit may be the whole, not a part of the repetitive sequence unit.
本発明を用いれば、例えば、インスリン遺伝子の近傍に存在するVNTR配列には、繰り返し配列単位:5’−ACAggggTgTgggg−3’など数種類のものが存在する。この場合であっても、繰り返し塩基配列に対応して異なる相補的塩基鎖を用い、異なる標識を導入すれば、同時に繰り返し塩基配列の反復数を測定することができる。 According to the present invention, for example, there are several types of VNTR sequences present in the vicinity of the insulin gene, such as a repetitive sequence unit: 5'-ACAggggTgTgggg-3 '. Even in this case, if different complementary base chains are used corresponding to the repetitive base sequences and different labels are introduced, the number of repetitive base sequences can be measured simultaneously.
[繰り返し塩基配列]
本発明で検出対象となる繰り返し塩基配列は、ゲノム中に存在する、繰り返し配列単位が数塩基から数十塩基であるVNTR、繰り返し配列単位が2〜4塩基であるマイクロサテライト多型などである。
[Repetitive nucleotide sequence]
The repetitive base sequences to be detected in the present invention include VNTR having a repetitive sequence unit of several to several tens of bases, microsatellite polymorphism having a repetitive sequence unit of 2 to 4 bases, and the like.
[標的核酸]
標的核酸は、繰り返し塩基配列を有するものであれば、特に制限はなく、細胞等から抽出されるゲノム遺伝子やゲノム遺伝子から酵素反応を利用して目的領域を増幅したものを用いてもよい。遺伝子の量を考慮すると、目的領域を増幅したものを用いるのが好ましい。目的領域の増幅方法は、特に制限はなく、公知の増幅方法を用いることができる。好ましい増幅方法は、耐熱性DNAポリメラーゼを用いた、ポリメラーゼ連鎖反応(以下「PCR反応」という)である。PCR反応を用いると、増幅効率が優れ、標識を導入することが容易になる。前記繰り返し塩基配列3を有する標的核酸4は、図3に示すように、プライマー5を用いて、ゲノム中のアニール部位6から、増幅される(塩基伸長部分)。使用されるプライマー5は、特に制限はなく、検出しようとする繰り返し塩基配列を増幅できるものであればよい。また、フォワードプライマー、リバースプライマーの2種類のプライマーを用いてもよい。さらに、プライマーは、2種以上の繰り返し配列を有する標的核酸を増幅できるものであってもよい。
[Target nucleic acid]
The target nucleic acid is not particularly limited as long as it has a repetitive base sequence, and a genomic gene extracted from a cell or the like or a target region amplified using an enzymatic reaction may be used. In consideration of the amount of gene, it is preferable to use an amplified target region. The method for amplifying the target region is not particularly limited, and a known amplification method can be used. A preferred amplification method is a polymerase chain reaction (hereinafter referred to as “PCR reaction”) using a thermostable DNA polymerase. When a PCR reaction is used, amplification efficiency is excellent and it is easy to introduce a label. As shown in FIG. 3, the target nucleic acid 4 having the repetitive base sequence 3 is amplified from the annealed site 6 in the genome using the primer 5 (base extension portion). The primer 5 to be used is not particularly limited as long as it can amplify a repetitive base sequence to be detected. Moreover, you may use two types of primers, a forward primer and a reverse primer. Furthermore, the primer may be capable of amplifying a target nucleic acid having two or more types of repetitive sequences.
[相補的塩基鎖]
本発明で用いる相補的塩基鎖とは、標的核酸中の繰り返し塩基配列とハイブリダイズして、二重鎖を形成できる核酸集合体をいう。相補的塩基鎖7、8は、図4に示すように、標的核酸4中の繰り返し塩基配列内の繰り返し配列単位9と結合し、繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体を形成する。相補的塩基鎖7、8は、繰り返し配列単位9の全部または一部とハイブリダイズするものであればよい。また、相補的塩基鎖7は、1種類に限らず、2種以上用いてもよい。例えば、内部標準となる相補的塩基鎖8は、標的核酸4の繰り返し塩基配列以外の部分にハイブリダイズさせるものであってもよい。この場合には、繰り返し配列単位9にハイブリダイズする相補的塩基鎖7と、標的核酸の繰り返し塩基配列以外の部分にハイブリダイズする内部標準となる相補的塩基鎖8のハイブリダイズ効率が等しいことが要求される。相補的塩基鎖7、8の長さ・配列は、特に制限はないが、好ましくは60℃以下で標的核酸とハイブリダイズし、95℃で十分解離する特性を有する配列であればよい。二重鎖の安定性が向上するからである。また、相補的塩基鎖7、8は、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、ペプチド核酸(PNA)などの集合体であればよい。好ましい相補的塩基鎖は、デオキシリボ核酸(DNA)である。
[Complementary base strand]
The complementary base chain used in the present invention refers to a nucleic acid aggregate that can hybridize with a repetitive base sequence in a target nucleic acid to form a double strand. As shown in FIG. 4, the complementary base chains 7 and 8 bind to the repetitive sequence unit 9 in the repetitive base sequence in the target nucleic acid 4 to form a repetitive sequence unit-complementary base chain complex. The complementary base chains 7 and 8 only need to hybridize with all or part of the repetitive sequence unit 9. Further, the complementary base chain 7 is not limited to one type, and two or more types may be used. For example, the complementary base strand 8 serving as an internal standard may be hybridized with a portion other than the repetitive base sequence of the target nucleic acid 4. In this case, the hybridization efficiency of the complementary base chain 7 that hybridizes to the repetitive sequence unit 9 and the complementary base chain 8 that becomes an internal standard to hybridize to a part other than the repetitive base sequence of the target nucleic acid are equal. Required. The length and sequence of the complementary base strands 7 and 8 are not particularly limited, but may be any sequence that has a characteristic of hybridizing with a target nucleic acid at 60 ° C. or lower and sufficiently dissociating at 95 ° C. This is because the duplex stability is improved. The complementary base chains 7 and 8 may be aggregates such as deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA), and peptide nucleic acid (PNA). A preferred complementary base strand is deoxyribonucleic acid (DNA).
[標識塩基の導入]
標識塩基10の導入は、(1)非標識の相補的塩基鎖をハイブリダイズした後、標識塩基を酵素反応などによって伸長して塩基鎖末端に標識を導入する、(2)標識をした相補的塩基鎖を用いてハイブリダイズする、(3)標識塩基を有するプライマーを用いて、相補的塩基鎖を遺伝子増幅して標識を導入する(内部標準を導入する場合)、などの方法により行えばよい。具体的には、塩基伸長反応、塩基連結反応、核酸の3’末端を選択的に標識するターミナルデオキシクレオチジルトランスフェラーゼ反応などを用いる。より好ましくは、酵素ポリメラーゼを用いる伸長反応である。この反応を行う場合には、ジデオキシヌクレオチドを標識塩基として用いればよい。ポリメラーゼは、塩基選択性が高く、正確に標識を導入できる。この結果、繰り返し塩基配列の配列数の検出が正確に行える。標識塩基としてジデオキシヌクレオチドを用いると、1塩基のみが伸長される。この結果、より定量性の高い検出が可能となる。標識塩基への標識を付加するのは、標識が付加された塩基または相補的塩基鎖を用いる、あるいは塩基を伸長した後または相補的塩基鎖をハイブリダイズした後に標識を付加してもよい。
[Introduction of labeled base]
The labeled base 10 is introduced by (1) hybridizing an unlabeled complementary base chain and then extending the labeled base by an enzyme reaction or the like to introduce a label at the end of the base chain. (2) Labeled complementary Hybridization using a base chain, (3) Generating a complementary base chain using a primer having a labeled base and introducing a label (in the case of introducing an internal standard), etc. . Specifically, a base extension reaction, a base ligation reaction, a terminal deoxycleotidyl transferase reaction that selectively labels the 3 ′ end of a nucleic acid, and the like are used. More preferably, it is an extension reaction using an enzyme polymerase. In carrying out this reaction, dideoxynucleotide may be used as a labeled base. Polymerase has high base selectivity and can introduce a label accurately. As a result, the number of repeated base sequences can be accurately detected. When dideoxynucleotide is used as the labeling base, only one base is extended. As a result, detection with higher quantitativeness becomes possible. The label may be added to the labeled base using a base to which the label is added or a complementary base chain, or after extending the base or after hybridizing the complementary base chain.
[標識の定量]
上記標識塩基は、繰り返し配列内および繰り返し配列外の塩基または塩基配列を、それぞれ異なる標識で検出できるものであればよい。使用できる標識としては、色素標識、放射線同位体標識、蛍光色素、りん光色素、発光色素など、標識に用いる公知の物質を用いることができる。好ましいのは、安全性・検出感度に優れ、信号が検出しやすい蛍光色素である。具体的には、シアニン(シアニン2)、アミノメチルクマリン、フルオロセイン、インドカルボシアニン(シアニン3)、シアニン3.5、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、インドカルボシアニン(シアニン5)、シアニン5.5、シアニン7などの公知の蛍光色素が挙げられる。これらの蛍光色素は、いずれの蛍光色素であっても使用できる。好ましいのは、構造の違いにより、認識が容易なシアニン系蛍光色素である。蛍光色素の検出は、蛍光顕微鏡や蛍光スキャナなどを用いる。また、標識として発光性を有する半導体微粒子を用いてもよい。このような半導体微粒子としては、例えばカドミウムセレン(CdSe)、カドミウムテルル(CdTe)、インジウムガリウムリン(InGaP)、シルバーインジウム硫化亜鉛(AgInZnS)、シリコン(Si)などが挙げられる。異なる標識を用いる場合には、同一装置で測定できるものを用いるのが好ましい。また、標識を付加した塩基または塩基配列を相補的塩基鎖に結合させるためには、相補的塩基鎖に結合可能な構造が要求される。
[Quantification of label]
The labeled base is not particularly limited as long as it can detect bases or base sequences within and outside the repeated sequence with different labels. As a label that can be used, a known substance used for labeling such as a dye label, a radioisotope label, a fluorescent dye, a phosphorescent dye, and a luminescent dye can be used. Preferred are fluorescent dyes that are excellent in safety and detection sensitivity and that are easy to detect signals. Specifically, cyanine (cyanine 2), aminomethylcoumarin, fluorescein, indocarbocyanine (cyanine 3), cyanine 3.5, tetramethylrhodamine, rhodamine red, Texas red, indocarbocyanine (cyanine 5), cyanine 5.5, well-known fluorescent dyes, such as cyanine 7, are mentioned. Any of these fluorescent dyes can be used. Preference is given to cyanine fluorescent dyes that can be easily recognized due to differences in structure. A fluorescent microscope or a fluorescent scanner is used to detect the fluorescent dye. Moreover, you may use the semiconductor fine particle which has luminescent property as a label | marker. Examples of such semiconductor fine particles include cadmium selenium (CdSe), cadmium tellurium (CdTe), indium gallium phosphide (InGaP), silver indium zinc sulfide (AgInZnS), silicon (Si), and the like. When using different labels, it is preferable to use one that can be measured with the same apparatus. Further, in order to bind a base or base sequence to which a label is added to a complementary base chain, a structure capable of binding to the complementary base chain is required.
[標識強度の測定]
標識強度は、繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体から解離した相補的塩基鎖を用いて測定してもよく、繰り返し配列−相補的塩基鎖複合体の全体で測定してもよい。解離した相補的塩基鎖の標識強度は、溶液中で測定してもよく、固定化担体に固定化して測定してもよい。繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体の全体で標識強度を測定する場合には、固定化担体に固定化して測定する。複数の標識の信号を高密度に検出する場合には、DNAチップなどの固定化担体に固定化して測定するのが、好ましい。固定化担体への固定化は、図5に示すように、タグ配列を付加した相補的塩基鎖のタグ配列と、基板12上に固定化した固定化担体13とを、ハイブリダイズすることにより行う。タグ配列11は、あらかじめ相補的塩基鎖7、8にタグ配列を付加した相補的塩基鎖を用いて複合体を形成してもよく、標識繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体から相補的塩基鎖を解離した後にタグ配列を付加してもよい。また、繰り返し配列−相補的塩基鎖複合体を固定化する場合にも、標的核酸にタグ配列を付加しておけば、同様に基板に固定化できる。
[Measurement of label strength]
The label strength may be measured using a complementary base chain dissociated from the repeating sequence unit-complementary base chain complex, or may be measured for the entire repeating sequence-complementary base chain complex. The labeling strength of the dissociated complementary base chain may be measured in a solution, or may be measured after immobilization on an immobilization carrier. When measuring the labeling intensity of the entire repeating sequence unit-complementary base chain complex, measurement is performed after immobilization on an immobilization carrier. When detecting signals of a plurality of labels at a high density, it is preferable to measure the signals by immobilizing them on an immobilization carrier such as a DNA chip. As shown in FIG. 5, the immobilization on the immobilization carrier is performed by hybridizing the tag sequence of the complementary base chain to which the tag sequence is added and the immobilization carrier 13 immobilized on the substrate 12. . The tag sequence 11 may form a complex using a complementary base chain in which the tag sequence is added to the complementary base chains 7 and 8 in advance, and the labeled base sequence-complementary base chain complex to the complementary base A tag sequence may be added after the strand is dissociated. In addition, when a repetitive sequence-complementary base chain complex is immobilized, if a tag sequence is added to the target nucleic acid, it can be similarly immobilized on the substrate.
[固定化担体]
固定化担体は、基板やビーズなどの基材に固定化されていればよい。相補的塩基鎖を基板上に固定化すると、多検体の処理が可能となるので、好ましい。
[Immobilized carrier]
The immobilization carrier only needs to be immobilized on a base material such as a substrate or beads. Immobilizing a complementary base chain on a substrate is preferable because it allows multiple samples to be processed.
固定化担体は、核酸集合体であればよい。核酸であれば、上記相補的塩基鎖あるいは標的核酸の一部(タグ配列を含む)と相補的に結合できるからである。固定化担体および上記相補的塩基鎖あるいは標的核酸のいずれかの一部(タグ配列を含む)は、天然型核酸であってもよく、非天然型核酸であってもよい。天然型核酸とは、自然界に存在する核酸を意味し、核酸に含まれる糖がすべてD体である核酸をいう。非天然型核酸とは、自然界には存在しない核酸を意味し、核酸に含まれる糖の少なくとも1つがL体である、あるいは糖の一部が修飾されている核酸をいう。特に、核酸に含まれる糖の少なくとも1つがL体である核酸をL型核酸という。非天然型核酸を用いると、選択性の高いハイブリダイゼーションが可能となる。 The immobilization carrier may be a nucleic acid aggregate. This is because the nucleic acid can be complementarily bound to the complementary base chain or a part of the target nucleic acid (including the tag sequence). The immobilization carrier and a part of the complementary base chain or the target nucleic acid (including the tag sequence) may be a natural nucleic acid or a non-natural nucleic acid. A natural nucleic acid means a nucleic acid that exists in nature, and refers to a nucleic acid in which the sugars contained in the nucleic acid are all D-forms. Non-natural nucleic acid means a nucleic acid that does not exist in nature, and refers to a nucleic acid in which at least one of the sugars contained in the nucleic acid is L-form, or a part of the sugar is modified. In particular, a nucleic acid in which at least one of the sugars contained in the nucleic acid is L-form is referred to as an L-type nucleic acid. When a non-natural nucleic acid is used, highly selective hybridization is possible.
固定化担体およびこれに相補的に結合する配列(タグ配列を含む)において、天然型のD型の糖を有する核酸を用いると、検査したい配列以外の部分がハイブリダイゼーション(クロスハイブリ)を起こす場合がある。このため、DNAチップなどを用いて解析を行う場合に、固定化されている核酸の配列を決定するのに、細心の注意が必要であった。非天然型核酸の中には、天然型核酸とはハイブリダイゼーションをしないものがある。したがって、非天然型核酸を用いると、クロスハイブリを起こすおそれのないタグ配列の設計が可能となる。 When a nucleic acid having a natural D-type sugar is used in an immobilization carrier and a sequence (including a tag sequence) that complementarily binds to the immobilization carrier, a portion other than the sequence to be examined causes hybridization (cross-hybridization). There is. For this reason, when analysis is performed using a DNA chip or the like, great care has been required to determine the sequence of the immobilized nucleic acid. Some non-natural nucleic acids do not hybridize with natural nucleic acids. Therefore, when a non-natural nucleic acid is used, it is possible to design a tag sequence that does not cause cross-hybridization.
固定化担体を基材に担持させる方法としては、特に制限されず、例えば以下に示すような公知の方法を用いることができる。例えば、ナイロンシートなどの上にDNAをスポッターと呼ばれる装置を用いて点着することにより高密度に固定する。あるいは、特開平1−505144号公報などに記載されているように、オリゴ核酸を、スポッターと呼ばれる装置を用いて、スライドガラスなどの平坦な基板の上に、点着することもできる。また、特開2000−508542号公報などに記載されているように、フォトリソグラフ法という半導体製造に用いられる技術を基にして、チップ上でオリゴ核酸を合成してもよい。さらに、特開2005−233703号公報などに記載されているように、特定の構造を有するポリマー表面に官能基を生成させ、この官能基を介して、末端アミノ核酸を共有結合により固定化することとしてもよい。 The method for supporting the immobilization carrier on the substrate is not particularly limited, and for example, the following known methods can be used. For example, DNA is fixed at a high density by spotting DNA on a nylon sheet or the like using a device called a spotter. Alternatively, as described in JP-A-1-505144, oligonucleic acid can be spotted on a flat substrate such as a slide glass using a device called a spotter. Further, as described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-508542 and the like, oligonucleic acid may be synthesized on a chip based on a technique used for semiconductor production called photolithography. Furthermore, as described in JP-A-2005-233703, etc., a functional group is generated on the surface of a polymer having a specific structure, and a terminal amino nucleic acid is immobilized by covalent bonding via this functional group. It is good.
[標識強度の測定]
担体上にハイブリダイズした標的核酸あるいは標識付加相補塩基鎖の標識の信号強度を測定することによって、繰り返し塩基配列数の定量を行う。検出器の仕様によらない定量性を実現するためには、2種以上の相補塩基鎖のハイブリダイゼーション効率の指標と標識を導入する際のポリメラーゼ伸長反応の標準化との指標となるように、濃度が既知である標識ポリヌクレオチド、あるいは濃度既知の標的核酸および相補的塩基鎖を添加して、信号強度を測定すればよい。
[Measurement of label strength]
The number of repetitive base sequences is quantified by measuring the signal intensity of the target nucleic acid hybridized on the carrier or the labeled complementary base chain. In order to achieve quantification that does not depend on the detector specifications, the concentration should be set so that it is an indicator of the hybridization efficiency of two or more complementary base strands and the standardization of the polymerase extension reaction when a label is introduced. The signal intensity may be measured by adding a labeled polynucleotide having a known concentration or a target nucleic acid having a known concentration and a complementary base strand.
本発明の検出方法を用いると、標的核酸中から繰り返し塩基配列の反復数を迅速にかつ定量的に検出することができる。繰り返し塩基配列としては、繰り返し塩基配列を有するものであれば特に制限されず、例えば、インスリン発現調節に関する繰り返し塩基配列などが検出できる。インスリン遺伝子の近傍に存在するVNTR配列には、繰り返し単位:5’−ACAggggTgTgggg−3’など数種類のものが存在する。この場合に、繰り返し塩基配列に対応して異なる相補的塩基鎖を用い、異なる標識体を用いて相補的塩基鎖を標識して、VNTR配列を検出すれば、同時に異なる種類の繰り返し塩基配列の反復数を検出することができる。本発明を用いれば、標的核酸中に異なる種類の繰り返し塩基配列である繰り返し塩基配列を有する場合にも、繰り返し塩基配列の反復数を迅速にかつ定量的に検出することができる。 By using the detection method of the present invention, the number of repetitive base sequences can be rapidly and quantitatively detected from the target nucleic acid. The repetitive base sequence is not particularly limited as long as it has a repetitive base sequence. For example, a repetitive base sequence relating to insulin expression regulation can be detected. There are several types of VNTR sequences present in the vicinity of the insulin gene, such as the repeating unit: 5'-ACAggggTgTgggg-3 '. In this case, if different complementary base chains are used corresponding to the repetitive base sequences, the complementary base chains are labeled using different labeling bodies, and the VNTR sequence is detected, the repeats of different types of repetitive base sequences can be performed simultaneously. The number can be detected. According to the present invention, even when the target nucleic acid has a repetitive base sequence that is a different type of repetitive base sequence, the number of repetitive base sequences can be rapidly and quantitatively detected.
[SNPsの検出]
本発明を用いれば、繰り返し塩基の反復数の測定とSNPsの測定を1つの固定化担体上で行うことができる。すなわち、本発明を用いれば、少量の検体量で、複数の標的核酸を用いて複数の標識化を同時に行うことができる。この結果、1つの固定化担体上で、繰り返し塩基配列の反復数の測定とSNPsタイプの検出とを行うことができる。また、繰り返し塩基配列とSNPsとが近傍に存在する場合には、1種類のプライマーセットから1種類の標的核酸を増幅し、多種類の相補的塩基鎖を用いて繰り返し塩基配列とSNPsとを同一の標的核酸から検出することができる。SNPsの検出は、例えば、SPR法を用いて、上記繰り返し塩基配列中に含まれる1塩基のミスマッチを検出することで、SNPsを測定することができる(参考文献1:アレキサンダー ダブリュ.ペーターソン(Alexander W.Peterson)、他2名、「表面でのミスマッチまたは部分マッチDNAのハイブリダイゼーション(Hybridizationn of Mismatched or Partially Matched DNA at Surfaces)」、ジャーナル オブ アメリカン ケミカル ソサイエティ(Jounal of American Chemical Society)、米国、アメリカン ケミカル ソサイエティ(American Chemical Society)、2002年、第124巻、p.14601−14607)。あるいは、塩基伸長法により塩基配列を決定して、SNPsを測定する(参考文献2:トミ パスチネン(Tomi Pastinen)、他4名、「ミニシークエンシング:オリゴヌクレオチドアレイ上でのDNA分析と診断のための特別なツール(Minisequencing:A Specific Tool for DNA Analysis and Diagnostics on Oligonucleotide Arrays)」、ゲノム リサーチ(Genome Research)、米国、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、1997年、第7巻、p.606−614)。
[Detection of SNPs]
If this invention is used, the measurement of the number of repetitions of a repeating base and the measurement of SNPs can be performed on one fixed support | carrier. That is, according to the present invention, a plurality of labels can be simultaneously performed using a plurality of target nucleic acids with a small amount of sample. As a result, it is possible to measure the number of repeated base sequences and to detect the SNPs type on one immobilization carrier. In addition, when a repetitive base sequence and SNPs are present in the vicinity, one type of target nucleic acid is amplified from one type of primer set, and the repetitive base sequence and SNPs are made identical using a plurality of types of complementary base chains. From the target nucleic acid. SNPs can be detected, for example, by detecting a mismatch of one base contained in the repetitive base sequence by using the SPR method (Reference 1: Alexander W. Peterson (Alexander). W. Peterson, et al., “Hybridization of Mismatched or Partially Matched DNA at Surfaces,” Journal of American Chemical Society, Journal of American America, USA. Chemical Society (2002), 124th, Chemical Society (American Chemical Society) Volume, p. 14601-14607). Alternatively, the base sequence is determined by the base extension method, and SNPs are measured (Reference 2: Tomi Pastinen) and four others, “Mini sequencing: for DNA analysis and diagnosis on oligonucleotide arrays ”Special Tool: A Specific Tool for DNA Analysis and Diagnostics, Vol. 7”, ”Bor, B. p.606-614).
[検出キット]
本発明の繰り返し塩基配列反復数測定キットは、繰り返し塩基配列を有する標的核酸の繰り返し配列単位に相補的に結合する相補的塩基鎖と、前記相補的塩基鎖を固定する固定化担体とを含んでいる。前記相補的塩基鎖は、タグ配列を有していてもよい。前記相補的塩基鎖に標識核酸を延伸するための標識核酸を含む、あるいは前記相補的塩基鎖は、標識核酸が付加されている相補的塩基鎖であってもよい。また、前記固定化担体が、すでに基板上に固定されている測定キットであってもよい。このような繰り返し塩基配列の反復数測定キットを用いることで、繰り返し塩基配列の反復数を容易に検出することができる。
[Detection kit]
The repetitive base sequence repeat number measurement kit of the present invention includes a complementary base chain that complementarily binds to a repetitive sequence unit of a target nucleic acid having a repetitive base sequence, and an immobilization carrier that fixes the complementary base chain. Yes. The complementary base chain may have a tag sequence. A labeled nucleic acid for extending a labeled nucleic acid to the complementary base chain may be included, or the complementary base chain may be a complementary base chain to which a labeled nucleic acid is added. The immobilization carrier may be a measurement kit that is already immobilized on a substrate. By using such a kit for measuring the number of repeats of a repeated base sequence, the number of repeats of the repeated base sequence can be easily detected.
以下本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明は実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Examples will be given below to describe the present invention in detail, but the present invention is not limited to the examples.
(実施例1)
[ヒトIL1RN(IL−1receptor antagonist)に含まれるVNTRの反復数検出](相補的塩基鎖を解離させる場合)
(ポリヌクレオチドの合成)
IL1RNに含まれるVNTR領域(配列番号1)を増幅するため、この配列番号1の繰り返し領域を網羅できるフォワードプライマー、リバースプライマーを合成した。このプライマーは、反復数が2〜6回のいずれのVNTRを持つ領域であっても増幅可能である。また、繰り返し配列単位に対する相補的塩基鎖(配列番号2)を合成した。合成はオペロンバイオテクノロジー株式会社に委託してD型核酸を用いて行った。
配列番号2の相補的塩基鎖はVNTRの反復数検出用と同時に、内部標準検出用にも用いることが可能なように設計した。
[Detection of repeat number of VNTR contained in human IL1RN (IL-1 receptor antagonist)] (when dissociating complementary base chain)
(Synthesis of polynucleotide)
In order to amplify the VNTR region (SEQ ID NO: 1) contained in IL1RN, a forward primer and a reverse primer that can cover the repeated region of SEQ ID NO: 1 were synthesized. This primer can be amplified in any region having VNTR of 2 to 6 repeats. In addition, a complementary base chain (SEQ ID NO: 2) for the repeating sequence unit was synthesized. The synthesis was outsourced to Operon Biotechnology Co., Ltd. using D-type nucleic acid.
The complementary base chain of SEQ ID NO: 2 was designed so that it could be used not only for detecting the number of VNTR repeats but also for detecting an internal standard.
(PCRによるVNTR配列を含む領域の増幅)
HEK293(ヒト胎児腎細胞由来)細胞およびHL60(ヒト前骨髄性白血病細胞由来)細胞を用いて、核酸抽出キット「QIAmp」((株)キアゲン製)で、ゲノムDNAを抽出した。該ゲノムDNAに、下記試薬1を添加して、下記条件1により、IL1RNに含まれるVNTR配列を増幅した。
<試薬1>
以下の試薬を含む50μl溶液を各サンプルにつき、それぞれ調製した。
フォワードプライマー 15 pmol
リバースプライマー 15 pmol
緩衝液 5 μl
2mM dNTP 5 μl
25mM MgSO4 2 μl
KOD−plus−DNAポリメラーゼ(TOYOBO) 1 U
抽出DNA溶液 50 ng
<増幅条件1>
95℃・5分
95℃・30秒、55℃・30秒、68℃・30秒(35サイクル)
(Amplification of region containing VNTR sequence by PCR)
Genomic DNA was extracted with a nucleic acid extraction kit “QIAmp” (manufactured by Qiagen) using HEK293 (derived from human embryonic kidney cells) cells and HL60 (derived from human promyelocytic leukemia cells) cells. The following reagent 1 was added to the genomic DNA, and the VNTR sequence contained in IL1RN was amplified under the following condition 1.
<Reagent 1>
A 50 μl solution containing the following reagents was prepared for each sample.
Forward primer 15 pmol
Reverse primer 15 pmol
Buffer 5 μl
2 mM dNTP 5 μl
25 mM MgSO 4 2 μl
KOD-plus-DNA polymerase (TOYOBO) 1 U
Extracted DNA solution 50 ng
<Amplification condition 1>
95 ℃, 5 minutes
95 ℃, 30 seconds, 55 ℃, 30 seconds, 68 ℃, 30 seconds (35 cycles)
(アガロースゲル電気泳動による評価)
上記PCR反応後増幅された部分の長さを電気泳動により評価した。電気泳動の条件は、2%アガロースゲルを、20×TAE Buffer((株)インビトロジェン製)を20倍希釈した展開液を用いて、100Vで30分間泳動した。泳動後、エチジウムブロマイド水溶液で核酸を染色し、増幅した標的核酸の長さを求めた。その結果、HEK293細胞由来の標的核酸断片は851bp/1023bpに、HL60細胞由来の標的核酸断片は1023bpであった。このことから、それぞれの反復数は2回と4回のヘテロおよび4回のホモであると見積もられた。
(Evaluation by agarose gel electrophoresis)
The length of the amplified portion after the PCR reaction was evaluated by electrophoresis. Electrophoresis was performed by running a 2% agarose gel at 100 V for 30 minutes using a developing solution in which 20 × TAE Buffer (manufactured by Invitrogen) was diluted 20 times. After electrophoresis, the nucleic acid was stained with an aqueous ethidium bromide solution, and the length of the amplified target nucleic acid was determined. As a result, the target nucleic acid fragment derived from HEK293 cells was 851 bp / 1023 bp, and the target nucleic acid fragment derived from HL60 cells was 1023 bp. From this, it was estimated that the number of each iteration was 2 and 4 hetero and 4 homo.
(標識塩基を用いた標識塩基の取り込み)
上記PCR反応物は、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(GEヘルスケアバイオサイエンス(株))を用いて精製した。該精製物に下記試薬2を添加して、下記条件2にて酵素法により標識塩基を取り込ませた。ポリヌクレオチド3、4はそれぞれ、Cy3標識ddATP、Cy5標識ddUTPが正常に取り込まれるかどうかを確認するためのポリヌクレオチドである。標準化用ポリヌクレオチド5、6はポリヌクレオチド3、4に結合し、3、4を鋳型として一塩基伸長反応させ、それぞれ標準化用ポリヌクレオチド5、6の末端を標識化し、反応が正常に進行していることを確認するためのポリヌクレオチドである。また、ポリヌクレオチド3〜6の塩基配列は、それぞれ表2の配列番号3から6に対応する塩基配列である。
(Incorporation of labeled base using labeled base)
The PCR reaction product was purified using GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.). The following reagent 2 was added to the purified product, and a labeled base was incorporated by the enzymatic method under the following condition 2. Polynucleotides 3 and 4 are polynucleotides for confirming whether Cy3-labeled ddATP and Cy5-labeled ddUTP are normally incorporated. The polynucleotides 5 and 6 for standardization bind to the polynucleotides 3 and 4, and the bases of the polynucleotides 5 and 6 for standardization are labeled with the bases 3 and 4 as templates, and the reaction proceeds normally. It is a polynucleotide for confirming that it exists. The base sequences of polynucleotides 3 to 6 are base sequences corresponding to SEQ ID NOs: 3 to 6 in Table 2, respectively.
なお、標識塩基を取り込ませた後、サーマルサイクラーを用いて、95℃に保ち、繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体を解離させた。この操作により標識核酸が付加されたタグ配列付相補的塩基鎖を得た。
<試薬2>
以下の試薬を含む20μl溶液を、それぞれのサンプルに対して調製した。
PCR精製物(標的核酸) 100 ng
タグ配列付相補的塩基鎖 20.3 pmol
10mM Cy3標識ddATP 1 μl
10mM Cy5標識ddUTP 1 μl
10mM ddGTP 1 μl
10mM ddCTP 1 μl
緩衝液 2 μl
Thermo sequenase polymerase 8 U
ポリヌクレオチド3 12.5 ng
ポリヌクレオチド4 12.5 ng
標準化用ポリヌクレオチド5 0.3 pmol
標準化用ポリヌクレオチド6 0.3 pmol
<反応条件2>
95℃・2分
95℃・20秒、60℃・15秒(30サイクル)
95℃・5分
0℃・3分
<Reagent 2>
A 20 μl solution containing the following reagents was prepared for each sample.
PCR purified product (target nucleic acid) 100 ng
Complementary base chain with tag sequence 20.3 pmol
10 mM Cy3-labeled ddATP 1 μl
10 mM Cy5-labeled ddUTP 1 μl
1 mM 10 mM ddGTP
1 mM 10 mM ddCTP
Buffer 2 μl
Thermo sequence polymerase 8 U
Polynucleotide 3 12.5 ng
Polynucleotide 4 12.5 ng
Polynucleotide 5 for standardization 0.3 pmol
Polynucleotide 6 for standardization 0.3 pmol
<Reaction condition 2>
95 ℃, 2 minutes
95 ℃ for 20 seconds, 60 ℃ for 15 seconds (30 cycles)
95 ℃, 5 minutes
0 ℃, 3 minutes
(DNA固定化担体の作成)
ポリメチルメタクリレート(PMMA)基板(コスモグラス押し出し板、厚さ:1mm、(株)クラレ製)を、温度65℃の10Nの水酸化ナトリウム溶液に12時間浸漬した。このPMMA基板を、純水、0.1Nの塩酸水溶液、純水の順で洗浄した。
(Preparation of DNA immobilization carrier)
A polymethyl methacrylate (PMMA) substrate (Cosmo glass extruded plate, thickness: 1 mm, manufactured by Kuraray Co., Ltd.) was immersed in a 10N sodium hydroxide solution at a temperature of 65 ° C. for 12 hours. The PMMA substrate was washed with pure water, 0.1N hydrochloric acid aqueous solution, and pure water in this order.
各アンチタグ配列同士のクロスハイブリがないように設計した、5’末端がアミノ化された4種類のアンチタグ配列のD型核酸相補鎖を合成し、固定化担体(アンチタグ配列)とした。 Four types of anti-tag sequence D-type nucleic acid complementary strands designed so as to avoid cross-hybridization between the anti-tag sequences and aminated at the 5 'end were synthesized and used as an immobilization carrier (anti-tag sequence).
合成した4種類のアンチタグ配列の相補鎖DNAをそれぞれ純水に0.3nmol/μLの濃度に溶かした後、リン酸緩衝液(pH 5.5)を用いて0.03nmol/μLに希釈した。また、基板表面のカルボン酸と固定化DNAの末端アミノ基とを縮合させるために、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)を、終濃度50mg/mLとなるように加えた。 Each of the four types of synthesized complementary DNAs of the anti-tag sequence was dissolved in pure water at a concentration of 0.3 nmol / μL, and then diluted to 0.03 nmol / μL using a phosphate buffer (pH 5.5). Further, in order to condense the carboxylic acid on the substrate surface with the terminal amino group of the immobilized DNA, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) is added so that the final concentration is 50 mg / mL. added.
(ハイブリダイゼーション溶液の調製)
標識核酸が付加されたタグ配列付相補的塩基鎖と上記固定化されたアンチタグ配列とのハイブリダイズは以下のように行った。以下に用いる15×SSCは、20×SSC(0.3M クエン酸ナトリウム二水和物、3M NaCl溶液:シグマ社製)を純水にて3/4に希釈したものを意味する。
(Preparation of hybridization solution)
Hybridization of the complementary base chain with a tag sequence to which a labeled nucleic acid was added and the immobilized anti-tag sequence was performed as follows. 15 × SSC used below means 20 × SSC (0.3 M sodium citrate dihydrate, 3 M NaCl solution: manufactured by Sigma) diluted to 3/4 with pure water.
30mg/mLのBSA(ウシ血清アルブミン)、15×SSC、0.3wt%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、0.01wt%サケ精子DNA(上記各濃度は、いずれも終濃度)を含む水溶液を作製した。これと上記標識核酸が付加されたタグ配列付相補的塩基鎖溶液を3:1で混合し、このタグ配列と同一のタグ配列である、Cy3標識ポリヌクレオチド(ポリヌクレオチド7)またはCy5標識ポリヌクレオチド(ポリヌクレオチド8)をそれぞれ0.01pmol添加し、全量が40μLとなるように調製した。 An aqueous solution containing 30 mg / mL BSA (bovine serum albumin), 15 × SSC, 0.3 wt% SDS (sodium dodecyl sulfate), 0.01 wt% salmon sperm DNA (each of the above concentrations is a final concentration) was prepared. . This is mixed with a complementary nucleotide chain solution with a tag sequence to which the labeled nucleic acid is added at a ratio of 3: 1, and a Cy3 labeled polynucleotide (polynucleotide 7) or a Cy5 labeled polynucleotide, which is the same tag sequence as the tag sequence (Polynucleotide 8) was added in an amount of 0.01 pmol, and the total amount was 40 μL.
(固定化担体への固定化)
上記固定化担体が担持された基板上に、上記ハイブリダイゼーション溶液40μLを載せ、カバーグラスで覆い、42℃で4時間インキュベートした後、カバーグラスを剥離して洗浄・乾燥した。
(Immobilization to immobilization carrier)
40 μL of the hybridization solution was placed on the substrate carrying the immobilization carrier, covered with a cover glass, incubated at 42 ° C. for 4 hours, and then the cover glass was peeled off, washed and dried.
(標識量の測定)
上記基板を、DNAチップ用のスキャナ(Perkin Elmer社製、Scan Array Express)にセットして、信号強度を測定した。測定条件は、レーザー出力90%、フォトマルチプライヤーの感度を、ポリヌクレオチド7および8で検出される、Cy3およびCy5の信号強度が同程度になるように調節した。ここで、信号強度とは、各スポット内の蛍光強度の平均値をいう。結果を表3に示す。
The substrate was set on a DNA chip scanner (Perkin Elmer, Scan Array Express), and the signal intensity was measured. The measurement conditions were such that the laser output was 90% and the sensitivity of the photomultiplier was adjusted so that the signal intensities of Cy3 and Cy5 detected by the polynucleotides 7 and 8 were comparable. Here, the signal intensity refers to an average value of fluorescence intensity in each spot. The results are shown in Table 3.
表3から、HEK293細胞由来の信号強度比(Cy3/Cy5)は2であり、理論値との比較より、その繰り返し塩基配列の反復数は3回もしくは2回と4回のヘテロであると判断できる。同様に、HL60細胞由来の信号強度比(Cy3/Cy5)は3であり、理論値との比較より、その繰り返し数は4回であると判断できる。この表から、繰り返し配列単位−相補的鎖複合体形成後に、相補的塩基鎖に標識核酸を導入すると、繰り返し塩基配列の反復数が、正確に定量できることがわかった。 From Table 3, the signal intensity ratio (Cy3 / Cy5) derived from HEK293 cells is 2, and it is determined that the number of repeats of the repeated nucleotide sequence is 3 times or 2 times and 4 times heterozygous by comparison with the theoretical value. it can. Similarly, the signal intensity ratio (Cy3 / Cy5) derived from HL60 cells is 3, and it can be determined that the number of repetitions is 4 from comparison with the theoretical value. From this table, it was found that when the labeled nucleic acid was introduced into the complementary base strand after the formation of the repeated sequence unit-complementary strand complex, the number of repeats of the repeated base sequence could be accurately quantified.
(実施例2)
[標識付プライマーを用いたヒトIL1RNに含まれるVNTRの反復数検出](標識核酸を固定して分析する場合)
(ポリヌクレオチドの合成)
IL1RNに含まれるVNTR領域(配列番号1)を増幅するため、この配列番号1の繰り返し領域を網羅できるフォワードプライマー、リバースプライマーおよび繰り返し配列単位に対する相補的塩基配列ポリヌクレオチド(配列番号2)を合成した。
(Example 2)
[Detection of the number of repeats of VNTR contained in human IL1RN using a labeled primer] (When labeled nucleic acid is immobilized and analyzed)
(Synthesis of polynucleotide)
In order to amplify the VNTR region (SEQ ID NO: 1) contained in IL1RN, a forward primer capable of covering the repeat region of SEQ ID NO: 1, a reverse primer and a complementary base sequence polynucleotide (SEQ ID NO: 2) for the repeat sequence unit were synthesized. .
フォワードプライマーには非天然型核酸(L型核酸)を用いたタグ配列を付加した。また、フォワードプライマーの5’末端には、Cy3標識を導入した。リバースプライマーは、D型核酸で合成した。このプライマーは、反復数が2〜6回のいずれのVNTRを持つ領域であっても増幅可能である。 A tag sequence using a non-natural nucleic acid (L-type nucleic acid) was added to the forward primer. A Cy3 label was introduced at the 5 'end of the forward primer. The reverse primer was synthesized with D-type nucleic acid. This primer can be amplified in any region having VNTR of 2 to 6 repeats.
相補的塩基は、5’末端にCy5標識を導入した。 The complementary base introduced a Cy5 label at the 5 'end.
L型核酸を含むDNAの合成は、DNA/RNA DNA自動合成機(Applied Biosystems社製)を用いて行った。また、L型核酸として、Beta−L−deoxy Adenosine(n−bz)CED phosphoramidite、Beta−L−deoxy Cytidine(n−bz)CED phosphoramidite、Beta−L−deoxy Guanosine(n−ibu)CED phosphoramidite、Beta−L−deoxy Thmidine CED phosphoramidite(ChemGenes Corporation製)を、D型核酸としてdeoxy Adenosine(n−bz)CED phosphoramidite、deoxy Cytidine(n−bz)CED phosphoramidite、deoxy Guanosine(n−ibu)CED phosphoramidite、deoxy Thmidine CED phosphoramidite(ChemGenes Corporation製)を用いた。 Synthesis of DNA containing L-type nucleic acid was performed using a DNA / RNA DNA automatic synthesizer (Applied Biosystems). Further, as L-type nucleic acids, Beta-L-deoxy Adenosine (n-bz) CED phosphoramidite, Beta-L-deoxy Cytidine (n-bz) CED phosphoramidite, Beta-L-deoxy guanidine (B-L-deoxy guanidine) -L-deoxy Thmidine CED phosphoramidite (manufactured by ChemGenes Corporation) as a D-type nucleic acid, deoxy Adenosine (n-bz) CED phosphoramidite, deoxy Cytidine (n-bz) sphoramidite, using deoxy Thmidine CED phosphoramidite (manufactured by ChemGenes Corporation).
リバースプライマーおよび、5’末端にCy3標識を導入したフォワードプライマー、5’末端にCy5標識を導入した相補的塩基鎖は、オペロンバイオテクノロジー株式会社に委託した。 The reverse primer and the forward primer introduced with Cy3 label at the 5 'end and the complementary base chain introduced with Cy5 label at the 5' end were commissioned to Operon Biotechnology Co., Ltd.
(PCRによるVNTR配列を含む領域の増幅)
実施例1と同様に抽出したヒトゲノムDNAに、下記試薬3を添加して、上記条件1により、IL1RNに含まれるVNTR配列を増幅した。
<試薬3>
以下の試薬を含む50μl溶液を各サンプルにつき、それぞれ調製した。
Cy3標識タグ付フォワードプライマー 20 pmol
リバースプライマー 0.2 pmol
緩衝液 5 μl
2mM dNTP 5 μl
25mM MgSO4 2 μl
KOD−plus−DNAポリメラーゼ(TOYOBO) 1 U
抽出DNA溶液 50 ng
(Amplification of region containing VNTR sequence by PCR)
The following reagent 3 was added to human genomic DNA extracted in the same manner as in Example 1, and the VNTR sequence contained in IL1RN was amplified under the above condition 1.
<Reagent 3>
A 50 μl solution containing the following reagents was prepared for each sample.
Cy3-labeled forward primer with 20 pmol
Reverse primer 0.2 pmol
Buffer 5 μl
2 mM dNTP 5 μl
25 mM MgSO 4 2 μl
KOD-plus-DNA polymerase (TOYOBO) 1 U
Extracted DNA solution 50 ng
さらに、実施例1と同様に電気泳動を行った。泳動後、反復数が2回である標的核酸を抽出した。 Further, electrophoresis was performed in the same manner as in Example 1. After the electrophoresis, a target nucleic acid having 2 repeats was extracted.
(繰り返し塩基配列―相補鎖複合体の形成)
上記PCR反応物はGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(GEヘルスケアバイオサイエンス(株))を用いて精製した。
(Repetitive base sequence-complementary chain complex formation)
The PCR reaction product was purified using GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.).
精製した標的核酸100ngに、100μMに溶解した前記Cy5標識相補的塩基鎖を1μL添加し、全量が20μLとなるように、純水で希釈した5×SSCを加えた。この溶液を95℃、5分インキュベート後、氷上で5分静置した。 To 100 ng of the purified target nucleic acid, 1 μL of the Cy5-labeled complementary base chain dissolved in 100 μM was added, and 5 × SSC diluted with pure water was added so that the total amount became 20 μL. This solution was incubated at 95 ° C. for 5 minutes and then allowed to stand on ice for 5 minutes.
(固定化担体への固定化)
タグ配列に相補的な配列を、L型核酸を用いて合成した。また、得られた各タグ配列に相補的な配列は5’末端にアミノ基を付加しており、実施例1に記載した手法を用いて基板に固定化した。
(Immobilization to immobilization carrier)
A sequence complementary to the tag sequence was synthesized using L-type nucleic acid. Further, the obtained sequence complementary to each tag sequence has an amino group added to the 5 ′ end, and was immobilized on the substrate using the method described in Example 1.
前記繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体溶液10μLを、実施例1に記載したハイブリダイゼーション試薬30μL、Cy3標識ポリヌクレオチド(ポリヌクレオチド7)またはCy5標識ポリヌクレオチド(ポリヌクレオチド8)をそれぞれ0.01pmol添加し、混合した。 10 μL of the repetitive base sequence-complementary base chain complex solution, 30 μL of the hybridization reagent described in Example 1, and Cy3 labeled polynucleotide (polynucleotide 7) or Cy5 labeled polynucleotide (polynucleotide 8) were each 0.01 pmol. Added and mixed.
L型のタグ配列に相補的な配列を固定化した基板に、上記ハイブリダイゼーション溶液を添加し、実施例1に記載した手法で固定化を行った。 The hybridization solution was added to a substrate on which a sequence complementary to the L-type tag sequence was immobilized, and immobilization was performed by the method described in Example 1.
(標識量の測定)
上記基板を、DNAチップ用のスキャナ(Perkin Elmer社製、Scan Array Express)にセットして、信号強度を測定した。測定条件は、レーザー出力90%、フォトマルチプライヤーの感度を、ポリヌクレオチド7および8で検出される、Cy3およびCy5の信号強度が同程度になるように調節した。ここで、信号強度とは、各スポット内の蛍光強度の平均値をいう。結果を表4に示す。
The substrate was set on a DNA chip scanner (Perkin Elmer, Scan Array Express), and the signal intensity was measured. The measurement conditions were such that the laser output was 90% and the sensitivity of the photomultiplier was adjusted so that the signal intensities of Cy3 and Cy5 detected by the polynucleotides 7 and 8 were comparable. Here, the signal intensity refers to an average value of fluorescence intensity in each spot. The results are shown in Table 4.
表4より、標識付プライマーを用いた標的核酸−相補的塩基鎖複合体による反復数の測定においても、繰り返し塩基配列の反復数に伴った蛍光強度比の増加が測定されることが示された。また、L型核酸を用いたタグ配列であっても、D型と同程度の感度が得られることがわかった。 From Table 4, it was shown that the increase in the fluorescence intensity ratio with the number of repetitions of the repeated base sequence was also measured in the measurement of the number of repetitions using the target nucleic acid-complementary base chain complex using the labeled primer. . Further, it was found that even a tag sequence using an L-type nucleic acid can have the same sensitivity as that of the D-type.
(実施例3)
[VNTR反復数とSNPsの同時検出]
(ポリヌクレオチドの合成)
SNPs検出用ポリヌクレオチドとして、4箇所のSNPs領域が増幅可能なプライマーをそれぞれ合成した。また、各SNPsの検出には公知の手法である一塩基伸長法(参考文献2)を用い、この手法に適したポリヌクレオチドを合成した。合成はオペロンバイオテクノロジー株式会社に委託した。
(Example 3)
[Simultaneous detection of VNTR repeat number and SNPs]
(Synthesis of polynucleotide)
Primers capable of amplifying four SNPs regions were synthesized as polynucleotides for detecting SNPs. In addition, a single-base extension method (Reference Document 2), which is a known technique, was used to detect each SNP, and a polynucleotide suitable for this technique was synthesized. The synthesis was commissioned to Operon Biotechnology Co., Ltd.
それぞれのプライマーおよび繰り返し塩基配列の配列数測定用相補的塩基鎖はD型核酸によって合成し、さらに相補的塩基鎖にはタグ配列間のクロスハイブリがないように設計されたD型核酸タグ配列を付加した。 Complementary base strands for measuring the number of sequences of each primer and repetitive base sequence are synthesized with D-type nucleic acid, and D-type nucleic acid tag sequence designed so that there is no cross-hybridization between tag sequences in the complementary base strand. Added.
(PCRによるSNPsを含む領域の増幅)
HEK293(ヒト胎児腎細胞由来)細胞のゲノムDNAを実施例1に記載した手法で抽出した。下記試薬4を添加して、実施例1に記載の条件1により、IL1RNに含まれるVNTR配列および、4箇所のSNPsを含む領域をそれぞれに増幅した。
<試薬4>
以下の試薬を含む50μl溶液を各サンプルにつき、それぞれ調製し、計5本の反応液を得た。
フォワードプライマー 15 pmol
リバースプライマー 15 pmol
緩衝液 5 μl
2mM dNTP 5 μl
25mM MgSO4 2 μl
KOD−plus−DNAポリメラーゼ(TOYOBO) 1 U
抽出DNA溶液 50 ng
(Amplification of region containing SNPs by PCR)
HEK293 (human embryonic kidney cell-derived) genomic DNA was extracted by the method described in Example 1. The following reagent 4 was added, and conditions 1 described in Example 1 were used to amplify the VNTR sequence contained in IL1RN and the region containing 4 SNPs, respectively.
<Reagent 4>
A 50 μl solution containing the following reagents was prepared for each sample to obtain a total of five reaction solutions.
Forward primer 15 pmol
Reverse primer 15 pmol
Buffer 5 μl
2 mM dNTP 5 μl
25 mM MgSO 4 2 μl
KOD-plus-DNA polymerase (TOYOBO) 1 U
Extracted DNA solution 50 ng
(標識塩基を用いた相補塩基の取り込み)
上記PCR反応物はGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(GEヘルスケアバイオサイエンス(株))を用いてそれぞれ精製した。
(Incorporation of complementary bases using labeled bases)
The PCR reaction product was purified using GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.).
得られた精製物に下記試薬5を添加して、実施例1に記載の条件2にて酵素法により標識塩基を取り込ませた。
<試薬5>
以下の試薬を含む20μl溶液を、それぞれのサンプルに対して調製し、計5本の反応液を得た。
PCR精製物(標的核酸) 100 ng
タグ付相補的塩基鎖 0.3 pmol
10mM Cy3標識ddATP 1 μl
10mM Cy5標識ddUTP 1 μl
10mM ddGTP 1 μl
10mM ddCTP 1 μl
緩衝液 2 μl
Thermo sequenase polymerase 8 U
ポリヌクレオチド3 12.5 ng
ポリヌクレオチド4 12.5 ng
標準化用ポリヌクレオチド5 0.3 pmol
標準化用ポリヌクレオチド6 0.3 pmol
The following reagent 5 was added to the purified product thus obtained, and a labeled base was incorporated by an enzymatic method under the condition 2 described in Example 1.
<Reagent 5>
A 20 μl solution containing the following reagents was prepared for each sample to obtain a total of five reaction solutions.
PCR purified product (target nucleic acid) 100 ng
Tagged complementary base chain 0.3 pmol
10 mM Cy3-labeled ddATP 1 μl
10 mM Cy5-labeled ddUTP 1 μl
1 mM 10 mM ddGTP
1 mM 10 mM ddCTP
Buffer 2 μl
Thermo sequence polymerase 8 U
Polynucleotide 3 12.5 ng
Polynucleotide 4 12.5 ng
Polynucleotide 5 for standardization 0.3 pmol
Polynucleotide 6 for standardization 0.3 pmol
(固定化担体への固定化)
5’末端にアミノ基を付加したD型核酸により、タグ配列に相補的な鎖を合成した。合成はオペロンバイオテクノロジー株式会社に委託した。次に、実施例1に記載の手法を用いて、これらのタグ配列に相補的な鎖を固定化した基板を作製した。
(Immobilization to immobilization carrier)
A strand complementary to the tag sequence was synthesized with a D-type nucleic acid having an amino group added to the 5 ′ end. The synthesis was commissioned to Operon Biotechnology Co., Ltd. Next, using the method described in Example 1, a substrate having strands complementary to these tag sequences immobilized thereon was prepared.
上記反応液を各サンプル2μLずつ混合し、10μLの標識ポリヌクレオチド溶液を調製し、これに実施例1に記載したハイブリダイゼーション試薬30μLと、ポリヌクレオチド7および8をそれぞれ0.01pmol混合した、ハイブリダイゼーション溶液を作製した。 The above reaction solution was mixed with 2 μL of each sample to prepare 10 μL of a labeled polynucleotide solution, which was mixed with 30 μL of the hybridization reagent described in Example 1 and 0.01 pmol of each of polynucleotides 7 and 8. A solution was made.
上記DNA固定化基板に、上記ハイブリダイゼーション溶液を添加し、実施例1に記載した手法で固定化を行った。 The hybridization solution was added to the DNA immobilization substrate, and immobilization was performed by the method described in Example 1.
(標識量の測定)
上記基板を、DNAチップ用のスキャナ(Perkin Elmer社製、Scan Array Express)にセットして、信号強度を測定した。測定条件は、レーザー出力90%、フォトマルチプライヤーの感度を、ポリヌクレオチド7および8で検出される、Cy3およびCy5の信号強度が同程度になるように調節した。ここで、信号強度とは、各スポット内の蛍光強度の平均値をいう。結果を表5に示す。
The substrate was set on a DNA chip scanner (Perkin Elmer, Scan Array Express), and the signal intensity was measured. The measurement conditions were such that the laser output was 90% and the sensitivity of the photomultiplier was adjusted so that the signal intensities of Cy3 and Cy5 detected by the polynucleotides 7 and 8 were comparable. Here, the signal intensity refers to an average value of fluorescence intensity in each spot. The results are shown in Table 5.
SNPタイプは、相補的な標識塩基との相補的に結合する。表5の結果より、SNP1および、SNP2のSNPタイプはA/Tのヘテロ、SNP3および、SNP4のSNPタイプはAのホモであると判断される。この結果は、公知の手法であるシークエンス法の結果と整合性を得た。さらに、VNTR反復数の判断においても、前述の結果と同様に蛍光強度比が2となり、その反復数は3回もしくは2回と4回のヘテロと判別できた。このことから、タグ配列を固定化した固定化担体を用いることで、SNPsとVNTR配列の同時検出が可能であることが示された。
The SNP type binds complementarily to a complementary labeled base. From the results of Table 5, it is determined that the SNP types of SNP1 and SNP2 are A / T hetero, and the SNP types of SNP3 and SNP4 are A homo. This result was consistent with the result of a sequence method which is a known method. Further, in the determination of the number of VNTR repeats, the fluorescence intensity ratio was 2, similarly to the above result, and the number of repeats could be discriminated as 3 or 2 and 4 hetero. From this, it was shown that SNPs and VNTR sequences can be detected simultaneously by using an immobilized carrier on which a tag sequence is immobilized.
1 繰り返し配列単位
2 相補的塩基鎖
3 繰り返し塩基配列
4 標的核酸
5 プライマー
6 アニール部位
7、8 相補的塩基鎖
9 繰り返し塩基配列
10 標識塩基
11 タグ配列
12 基板
13 固定化担体
14 標識
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Repeating sequence unit 2 Complementary base chain 3 Repeating base sequence 4 Target nucleic acid 5 Primer 6 Annealing site 7, 8 Complementary base chain 9 Repeating base sequence 10 Labeled base 11 Tag sequence 12 Substrate 13 Immobilization carrier 14 Label
Claims (15)
前記標識された繰り返し塩基配列内の塩基配列と標識された繰り返し塩基配列外の塩基配列とからそれぞれに導入された標識の標識量を測定し、測定した標識量から繰り返し塩基配列内の塩基配列に導入された標識と繰り返し塩基配列外の塩基配列に導入された標識
の標識量の量比を求める第2の工程と
を含む、繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。 A first step of introducing a label into each of the base sequence within the repeat base sequence and the base sequence outside the repeat base sequence;
The labeled amount of the label introduced into each of the base sequence within the labeled repetitive base sequence and the base sequence outside the labeled repetitive base sequence is measured, and the measured label amount is converted into the base sequence within the repetitive base sequence. A method for measuring the number of repetitions of a repetitive base sequence, comprising: a second step of obtaining an amount ratio of the amount of label introduced to a base sequence outside the repetitive base sequence and the introduced label.
繰り返し塩基配列を有する標的核酸の繰り返し配列単位に相補的な塩基鎖をハイブリダイズさせ、繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体を形成する工程を含む、請求項1に記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。 Before the first step,
The repeat of a repetitive base sequence according to claim 1, comprising a step of hybridizing a base chain complementary to a repetitive sequence unit of a target nucleic acid having a repetitive base sequence to form a repetitive sequence unit-complementary base chain complex. Number measurement method.
プライマーを用いて繰り返し配列を有する標的核酸を増幅する工程と
前記繰り返し塩基配列を有する標的核酸の繰り返し配列単位に相補的な塩基鎖をハイブリダイズさせ、繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体を形成する工程を含む、請求項1に記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。 Before the first step,
Amplifying a target nucleic acid having a repetitive sequence using a primer, and hybridizing a base chain complementary to the repetitive sequence unit of the target nucleic acid having the repetitive base sequence to form a repetitive sequence unit-complementary base chain complex The measuring method of the repetition number of the repetitive base sequence of Claim 1 including the process to perform.
前記相補的塩基鎖に付加された標識塩基の量を測定することにより、繰り返し塩基配列内の塩基配列と標識された繰り返し塩基配列外の塩基配列のそれぞれに導入された標識の標識量を測定する、請求項5または6に記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。 After dissociating the complementary base chain to which the labeled base has been added from the complex,
By measuring the amount of the labeled base added to the complementary base chain, the labeled amount of the label introduced into each of the base sequence within the repeated base sequence and the base sequence outside the labeled repeated base sequence is measured. The method for measuring the number of repetitions of a repetitive base sequence according to claim 5 or 6.
前記標的核酸または相補的塩基鎖を固定する固定化担体と
を含む、繰り返し塩基配列の反復数測定キット。 A complementary base chain that complementarily binds to a repetitive sequence unit of a target nucleic acid having a repetitive base sequence;
A kit for measuring the number of repetitive base sequences, comprising an immobilization carrier for immobilizing the target nucleic acid or complementary base chain.
Furthermore, it contains the labeled nucleic acid for extending | stretching a labeled nucleic acid to the said complementary base chain, or the said complementary base chain is a complementary base chain to which the labeled nucleic acid is added. A kit for measuring the number of repeated nucleotide sequences.
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