JP2008193940A - Method for purifying polyhydroxybutyrate - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ポリヒドロキシ酪酸を産生させた微生物からポリヒドロキシ酪酸を精製するポリヒドロキシ酪酸精製方法に関する。 The present invention relates to a polyhydroxybutyric acid purification method for purifying polyhydroxybutyric acid from a microorganism that has produced polyhydroxybutyric acid.
一般的なプラスチックは、石油などの化石原料から製造されており、化学的に安定な物質であるため広く使用されている。しかし、化学的に安定な物質であるため、廃棄された場合には土壌中や水中の微生物による生分解を受けにくく、永年に亘って環境中に残存することになる。また、石油などから製造されているため、焼却すると有毒ガスを排出したり、多量の二酸化炭素を排出したりするため、環境保全の観点から好ましくない。 General plastics are widely used because they are manufactured from fossil raw materials such as petroleum and are chemically stable. However, since it is a chemically stable substance, when it is discarded, it is difficult to be biodegraded by microorganisms in the soil or water and remains in the environment for many years. Moreover, since it is manufactured from petroleum etc., if it incinerates, a toxic gas will be discharged | emitted or a lot of carbon dioxide will be discharged | emitted, and it is unpreferable from a viewpoint of environmental conservation.
このような状況を鑑みて、近年では、微生物等によって比較的容易に生分解される生分解性プラスチックが脚光を浴びている。生分解性プラスチックは、使用時は一般的なプラスチックと同じような機能を有し、使用後は自然界の土壌中や水中に生息する微生物によって低分子化合物に生分解され、最終的には水や二酸化炭素に生分解される。 In view of such a situation, in recent years, biodegradable plastics that are relatively easily biodegraded by microorganisms and the like have attracted attention. Biodegradable plastics have the same functions as general plastics when they are used, and after use, they are biodegraded into low molecular weight compounds by microorganisms that live in the natural soil and water. Biodegraded to carbon dioxide.
このような生分解性プラスチックの一つに脂肪族ポリエステルがある。なかでも、ポリヒドロキシ酪酸（polyhydroxybutyrate）は、微生物による生分解性がよく、例えば、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属などの根粒菌のほか、特許文献１に記載されているように、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、アチオロージウム（Athiorhodium）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、バチルス（Bacillus）属、ノカルジア（Nocardia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、リゾビウム（Rhizobium）属、スピリルム（Spirillum）属など、種々の微生物によって比較的容易かつ大量に産生することができるので、今後、多方面で大いに使用されると考えられている。 One such biodegradable plastic is aliphatic polyester. Among them, polyhydroxybutyrate has good biodegradability by microorganisms, for example, in addition to rhizobia such as Sinorhizobium genus, as described in Patent Document 1, the genus Alcaligenes, Relatively easy with various microorganisms, including the genus Athiorhodium, Azotobacter, Bacillus, Nocardia, Pseudomonas, Rhizobium, and Spirillum Since it can be produced in large quantities, it is considered that it will be used greatly in various fields in the future.
ここで、微生物によって産生されたポリヒドロキシ酪酸を精製する一般的な方法として、クロロホルムなどの有機溶媒を用いて抽出して精製するソックスレー抽出法があるが、これよりも簡便な方法として、前記した特許文献１には、３−ヒドロキシブチレートポリマー（ポリヒドロキシ酪酸と同義）含有微生物細胞からの３−ヒドロキシブチレートポリマー以外の細胞物の除去方法が記載されている。 Here, as a general method for purifying polyhydroxybutyric acid produced by a microorganism, there is a Soxhlet extraction method in which extraction is performed using an organic solvent such as chloroform, but a simpler method is described above. Patent Document 1 describes a method for removing cellular substances other than 3-hydroxybutyrate polymer from microbial cells containing 3-hydroxybutyrate polymer (synonymous with polyhydroxybutyric acid).
特許文献１に記載されている除去方法は、３−ヒドロキシブチレートポリマー含有微生物細胞の水性懸濁液を少なくとも１種の可溶化剤で消化することにより該細胞中の３−ヒドロキシブチレートポリマー以外の細胞物質を可溶化させ、次いで３−ヒドロキシブチレートポリマーを含む不溶性残留物を懸濁液から分離することからなる、３−ヒドロキシブチレートポリマー含有微生物細胞からの３−ヒドロキシブチレートポリマー以外の細胞物を除去するものである。そして、水性懸濁液を消化する消化工程において、（ｉ）その消化工程が、可溶化剤としてタンパク質分解酵素組成物を用いる一またはそれ以上の段階を含み、そして水性懸濁液をその消化工程の前または消化工程中かつそのタンパク質分解酵素での消化段階の前に１００℃以上の温度にまで加熱すること、（ｉｉ）（ａ）その消化工程が、可溶化剤としてホスホリパーゼを用いる少なくとも一つの段階をも含むか、または（ｂ）酵素での消化後に不溶性残留物を過酸化水素で処理することを特徴としている。 The removal method described in Patent Document 1 is obtained by digesting an aqueous suspension of 3-hydroxybutyrate polymer-containing microbial cells with at least one solubilizing agent, thereby removing the 3-hydroxybutyrate polymer in the cells. Other than 3-hydroxybutyrate polymer from microbial cells containing 3-hydroxybutyrate polymer, comprising solubilizing the cellular material of and then separating the insoluble residue comprising 3-hydroxybutyrate polymer from the suspension It removes cellular material. And in the digestion step of digesting the aqueous suspension, (i) the digestion step comprises one or more steps using a proteolytic enzyme composition as a solubilizing agent, and the aqueous suspension is digested Heating to a temperature of 100 ° C. or higher before or during the digestion step and prior to the digestion step with the proteolytic enzyme, (ii) (a) at least one of the digestion steps using phospholipase as a solubilizer Or (b) treating the insoluble residue with hydrogen peroxide after digestion with the enzyme.
また、特許文献２には、生体内に合成保持された高分子微粒子を、そのままの形状で取得することができ、それを成形工程を経ずにそのまま微粒子状での用途に利用可能とすることを目的として、高分子微粒子を有する生体を取得する工程と、該生体と、該高分子微粒子以外の生体成分を可溶化する可溶化剤と、を接触させて該高分子微粒子を含む混合物を得る工程と、該混合物から該高分子微粒子を回収する工程と、回収された高分子微粒子を該高分子微粒子の融点以下の温度で乾燥させて、該高分子微粒子の形状を保ったままの高分子微粒子の乾燥品を得る工程と、を有することを特徴とする高分子微粒子の製造方法が記載されている。 Further, in Patent Document 2, polymer fine particles synthesized and held in a living body can be obtained as they are, and can be used as they are without being subjected to a molding process. For the purpose of obtaining a mixture containing the polymer fine particles by contacting the living body with a solubilizing agent that solubilizes biological components other than the polymer fine particles. A step of recovering the polymer fine particles from the mixture, and drying the recovered polymer fine particles at a temperature not higher than the melting point of the polymer fine particles to maintain the shape of the polymer fine particles. And a process for obtaining a dried product of the fine particles.
そして、この特許文献２には、この高分子微粒子がポリヒドロキシアルカノエートを主成分とし、このポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシ酪酸またはポリヒドロキシ吉草酸であること、この可溶化剤として次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素濃度０．０５〜５重量％）を用いること、この可溶化剤と生体を接触させる前に、ｐＨ９以上のアルカリ水溶液と生体を接触させること、可溶化剤と生体を接触させる前に、生体成分を分解する酵素（リゾチーム）を含んだ水溶液と生体を接触させること、および、可溶化剤と生体を接触させる前に、生体を加圧破砕あるいは超音波破砕すること、遠心分離による濃縮と水による洗浄で高分子微粒子の洗浄、回収を行うことが記載されている。 In Patent Document 2, the polymer fine particles are mainly composed of polyhydroxyalkanoate, the polyhydroxyalkanoate is polyhydroxybutyric acid or polyhydroxyvaleric acid, and hypochlorous acid is used as the solubilizer. Before using sodium (effective chlorine concentration of 0.05 to 5% by weight), bringing the solubilizer into contact with the living body, contacting the living body with an alkaline aqueous solution of pH 9 or higher, and bringing the solubilizer into contact with the living body In addition, an aqueous solution containing an enzyme (lysozyme) that decomposes biological components is brought into contact with the living body, and the biological body is subjected to pressure crushing or ultrasonic crushing before contacting the living body with the solubilizer, by centrifugation. It describes that the fine polymer particles are washed and collected by concentration and washing with water.
しかしながら、ソックスレー抽出法は、例えば、１ｋｇのポリヒドロキシ酪酸を抽出するのに、最低でも１ｋｇのクロロホルムを必要とするので高コストとなるだけでなく、クロロホルムなどの有機溶媒を大量に用いるので環境保全の観点から大量生産に適さないという問題がある。 However, the Soxhlet extraction method, for example, requires at least 1 kg of chloroform to extract 1 kg of polyhydroxybutyric acid, which is not only expensive, but also uses a large amount of an organic solvent such as chloroform, thus protecting the environment. In view of this, there is a problem that it is not suitable for mass production.
また、特許文献１に記載の３−ヒドロキシブチレートポリマー含有微生物細胞からの３−ヒドロキシブチレートポリマー以外の細胞物の除去方法では、水性懸濁液をその消化工程の前または消化工程中かつそのタンパク質分解酵素での消化段階の前に１００℃以上の温度にまで加熱する必要があるため操作が煩雑となる。また、不溶性残留物中の３−ヒドロキシブチレートポリマーの含量、すなわち純度が良くないため、製品の原料として工業的に用いる場合、得られた３−ヒドロキシブチレートポリマーをさらに精製する必要があるという問題がある。 In addition, in the method for removing cellular substances other than 3-hydroxybutyrate polymer from 3-hydroxybutyrate polymer-containing microbial cells described in Patent Document 1, an aqueous suspension is used before or during the digestion step and during the digestion step. Since it is necessary to heat to a temperature of 100 ° C. or higher before the digestion step with the proteolytic enzyme, the operation becomes complicated. Further, since the content of 3-hydroxybutyrate polymer in the insoluble residue, that is, the purity is not good, it is necessary to further purify the obtained 3-hydroxybutyrate polymer when used industrially as a raw material for products. There's a problem.
そして、特許文献２に記載の高分子微粒子の製造方法では、高分子微粒子以外の生体成分を可溶化する可溶化剤（次亜塩素酸ナトリウム）や、生体成分を分解する酵素（リゾチーム）が適切でない（リゾチームは、主として、細胞壁などのペプチドグリカンのβ１→４結合を加水分解する酵素である。）ために、脂質やタンパク質などを可溶化させることができず、最終産物中に脂質やタンパク質が混入する可能性がある。
遠心分離による濃縮と水による洗浄を所定回数繰り返すことで、最終産物中に混入する脂質やタンパク質を除去し得るが、そのような操作は煩雑であるだけでなく、大量生産に適さないという問題がある。
また、高分子微粒子以外の生体成分を可溶化させる反応を促進させるためにｐＨ９以上のアルカリ水溶液を用いることが記載されているが、そのような操作をすると、使用したｐＨ９以上のアルカリ水溶液を廃棄する際に、これを中和する作業が必要となるため、操作が煩雑となるだけでなく、時間的にも費用的にもコストが嵩むという問題がある。
In the method for producing polymer fine particles described in Patent Document 2, a solubilizer (sodium hypochlorite) for solubilizing biological components other than the polymer fine particles and an enzyme (lysozyme) for degrading biological components are appropriate. (Lysozyme is mainly an enzyme that hydrolyzes β1 → 4 bonds of peptidoglycans such as cell walls.) So lipids and proteins cannot be solubilized, and lipids and proteins are mixed in the final product. there's a possibility that.
By repeating the concentration by centrifugation and washing with water a predetermined number of times, lipids and proteins mixed in the final product can be removed, but such operations are not only complicated, but also not suitable for mass production. is there.
In addition, it is described that an alkaline aqueous solution having a pH of 9 or more is used in order to promote a reaction for solubilizing biological components other than the polymer fine particles. However, when such an operation is performed, the alkaline aqueous solution having a pH of 9 or more is discarded. When this is done, there is a problem that not only the operation becomes complicated, but also the cost increases in terms of time and cost because an operation for neutralizing this is required.
本発明は前記問題に鑑みてなされたものであり、低コストで大量生産に適し、かつ簡便な操作で高純度のポリヒドロキシ酪酸を精製することのできるポリヒドロキシ酪酸精製方法を提供することを課題とする。 The present invention has been made in view of the above problems, and provides a method for purifying polyhydroxybutyric acid that is suitable for mass production at low cost and that can purify high-purity polyhydroxybutyric acid by a simple operation. And
前記課題を解決した本発明に係るポリヒドロキシ酪酸精製方法は、微生物に産生させたポリヒドロキシ酪酸を精製するポリヒドロキシ酪酸精製方法であって、前記ポリヒドロキシ酪酸を産生させた前記微生物を含む水溶液を細胞破砕装置にかけて前記微生物を破砕し、前記ポリヒドロキシ酪酸を含む不溶性残渣と、水溶性不純物と、を得た後、前記不溶性残渣を中性の水溶液に懸濁して前記ポリヒドロキシ酪酸を含む懸濁液を得、この懸濁液に酵素および界面活性剤を加えて混和し、混和した懸濁液に含まれるポリヒドロキシ酪酸を沈殿させ、沈殿させた前記ポリヒドロキシ酪酸を洗浄液で洗浄するものである。 The polyhydroxybutyric acid purification method according to the present invention that has solved the above problems is a polyhydroxybutyric acid purification method for purifying polyhydroxybutyric acid produced by a microorganism, and an aqueous solution containing the microorganism that has produced the polyhydroxybutyric acid. The microorganism is crushed by a cell crushing device to obtain an insoluble residue containing polyhydroxybutyric acid and water-soluble impurities, and then the insoluble residue is suspended in a neutral aqueous solution to contain the polyhydroxybutyric acid. A liquid is obtained, and an enzyme and a surfactant are added to and mixed with the suspension, polyhydroxybutyric acid contained in the mixed suspension is precipitated, and the precipitated polyhydroxybutyric acid is washed with a washing solution. .
このように、本発明に係るポリヒドロキシ酪酸精製方法は、ポリヒドロキシ酪酸を産生させた微生物を細胞破砕装置で破砕することで、微生物に内包されているポリヒドロキシ酪酸を水溶液中に放出させる。このポリヒドロキシ酪酸は水溶液に不溶性であるので、微生物由来の不溶性の物質（例えば、脂質や不溶性のタンパク質など）とともに不溶性の残渣（不溶性残渣）として得ることができる。つまり、微生物由来の水溶性の不純物（水溶性不純物）と分別して得ることができる。そのため、水溶性不純物を廃棄等することで、ある程度精製されたポリヒドロキシ酪酸を得ることができる。そして、この不溶性残渣を中性の水溶液に懸濁して、ポリヒドロキシ酪酸を含む懸濁液を得る。その後、この懸濁液に酵素および界面活性剤を加えて混和することで、懸濁液中のポリヒドロキシ酪酸以外の不溶性の物質を分解して溶液中に可溶化させるとともに、ポリヒドロキシ酪酸を沈殿させる。そして、沈殿させたポリヒドロキシ酪酸を洗浄液で洗浄することによって、これを高純度に精製することができる。 Thus, the polyhydroxybutyric acid purification method according to the present invention releases the polyhydroxybutyric acid contained in the microorganisms into the aqueous solution by crushing the microorganisms that produced the polyhydroxybutyric acid with the cell crushing device. Since this polyhydroxybutyric acid is insoluble in an aqueous solution, it can be obtained as an insoluble residue (insoluble residue) together with insoluble substances derived from microorganisms (for example, lipids and insoluble proteins). That is, it can be obtained by separating from water-soluble impurities (water-soluble impurities) derived from microorganisms. Therefore, polyhydroxybutyric acid purified to some extent can be obtained by discarding water-soluble impurities. Then, the insoluble residue is suspended in a neutral aqueous solution to obtain a suspension containing polyhydroxybutyric acid. Thereafter, an enzyme and a surfactant are added to the suspension and mixed to decompose insoluble substances other than polyhydroxybutyric acid in the suspension so that they are solubilized in the solution and polyhydroxybutyric acid is precipitated. Let Then, by washing the precipitated polyhydroxybutyric acid with a washing liquid, it can be purified with high purity.
本発明に係るポリヒドロキシ酪酸精製方法は、破砕懸濁工程と、混和工程と、沈殿工程と、精製工程と、を含んでなる。
このように、本発明に係るポリヒドロキシ酪酸精製方法は、破砕懸濁工程によって、容器に入れられた、ポリヒドロキシ酪酸を産生させた微生物を含む水溶液を細胞破砕装置にかけて微生物を破砕して、ポリヒドロキシ酪酸を含む不溶性残渣と、水溶性不純物と、を得た後、この不溶性残渣を中性の水溶液に懸濁してポリヒドロキシ酪酸を含む懸濁液を得る。そして、混和工程によって、破砕懸濁工程で得た懸濁液に、酵素および界面活性剤を加えて混和し、次いで、沈殿工程によって、混和した懸濁液を３０℃から５０℃で１０分間から２時間静置して、微生物由来のポリヒドロキシ酪酸以外の不溶性残渣を可溶化させて懸濁液に溶解させるとともにポリヒドロキシ酪酸を沈殿させる。そして、精製工程によって、容器内の懸濁液を廃棄し、容器内に沈殿させたポリヒドロキシ酪酸を少なくとも１回以上洗浄液で洗浄するという簡便な操作で、ポリヒドロキシ酪酸を高純度に精製することができる。
The polyhydroxybutyric acid purification method according to the present invention includes a crushing suspension process, a mixing process, a precipitation process, and a purification process.
Thus, the method for purifying polyhydroxybutyric acid according to the present invention uses a crushing suspension process to crush microorganisms by applying an aqueous solution containing microorganisms that have produced polyhydroxybutyric acid to a cell crushing device. After obtaining an insoluble residue containing hydroxybutyric acid and water-soluble impurities, the insoluble residue is suspended in a neutral aqueous solution to obtain a suspension containing polyhydroxybutyric acid. Then, in the mixing step, the enzyme and the surfactant are added to the suspension obtained in the crushing suspension step and mixed, and then in the precipitation step, the mixed suspension is added at 30 to 50 ° C. for 10 minutes. It is allowed to stand for 2 hours to solubilize insoluble residues other than microorganism-derived polyhydroxybutyric acid and dissolve them in the suspension, while precipitating polyhydroxybutyric acid. And purifying polyhydroxybutyric acid with high purity by a simple operation of discarding the suspension in the container and washing the polyhydroxybutyric acid precipitated in the container at least once with the washing liquid in the purification step. Can do.
ポリヒドロキシ酪酸を産生させる微生物としては、根粒菌を用いるのが好ましく、前記根粒菌としては、シノリゾビウム属を用いるのがより好ましく、シノリゾビウム・フレディイを用いるのがさらに好ましい。 As the microorganism for producing polyhydroxybutyric acid, it is preferable to use rhizobia, and as the rhizobia, it is more preferable to use the genus Synorizobium, and it is even more preferable to use Synorizobium fredii.
このように、ポリヒドロキシ酪酸を産生させる微生物として根粒菌を用いると、本発明に係るポリヒドロキシ酪酸精製方法のように簡便な操作であっても高純度に精製されたポリヒドロキシ酪酸を得ることができる。また、根粒菌の中でもシノリゾビウム属を用いると、前記したような簡便な操作で高純度に精製したポリヒドロキシ酪酸を確実に得ることができ、シノリゾビウム・フレディイを用いると、前記したような簡便な操作で高純度に精製されたポリヒドロキシ酪酸をより確実に得ることができる。 Thus, when rhizobia is used as a microorganism for producing polyhydroxybutyric acid, highly purified polyhydroxybutyric acid can be obtained even with a simple operation as in the method for purifying polyhydroxybutyric acid according to the present invention. it can. In addition, the use of the genus Synorizobium among rhizobia can surely obtain highly purified polyhydroxybutyric acid by the simple operation as described above, and the simple operation as described above can be obtained by using Synorizobium fredii. Thus, polyhydroxybutyric acid purified to a high purity can be obtained more reliably.
本発明で用いる界面活性剤としては、陰イオン界面活性剤を用いるのが好ましい。
このように、本発明に係るポリヒドロキシ酪酸精製方法では、界面活性剤として陰イオン界面活性剤を用いると、微生物の細胞質膜や、細胞質中に存在する脂質などを分解し、懸濁液に可溶化させることができる。したがって、懸濁液に陰イオン界面活性剤を加えて混和した後に、その懸濁液を廃棄するだけでポリヒドロキシ酪酸以外の物質を効率良く除去することができる。
As the surfactant used in the present invention, an anionic surfactant is preferably used.
As described above, in the method for purifying polyhydroxybutyric acid according to the present invention, when an anionic surfactant is used as a surfactant, the cytoplasmic membrane of microorganisms, lipids present in the cytoplasm, and the like are decomposed to make a suspension. Can be solubilized. Therefore, substances other than polyhydroxybutyric acid can be efficiently removed simply by discarding the suspension after adding an anionic surfactant to the suspension and mixing.
そして、本発明で用いる陰イオン界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム、オクチル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム、テトラデシル硫酸ナトリウム、およびステアリル硫酸ナトリウムのうちの一つまたは二つ以上を含むものを用いるのが好ましい。
このような陰イオン界面活性剤を用いれば、微生物の細胞質膜や、細胞質中に存在する脂質などをより良好に分解し、懸濁液に可溶化させることができ、また、水などの極性の高い溶媒に不溶なタンパク質なども変性させることが可能であり、これを懸濁液に可溶化させることもできる。したがって、懸濁液に陰イオン界面活性剤を加えて混和した後に、その懸濁液を廃棄するだけでポリヒドロキシ酪酸以外の物質をより効率良く除去することができる。
As the anionic surfactant used in the present invention, one containing one or more of sodium dodecyl sulfate, sodium octyl sulfate, sodium myristyl sulfate, sodium tetradecyl sulfate, and sodium stearyl sulfate is used. preferable.
By using such an anionic surfactant, the cytoplasmic membrane of microorganisms and lipids present in the cytoplasm can be decomposed better and solubilized in the suspension, and polar substances such as water can be used. Proteins that are insoluble in high solvents can also be denatured and solubilized in suspension. Therefore, after adding an anionic surfactant to the suspension and mixing, substances other than polyhydroxybutyric acid can be more efficiently removed simply by discarding the suspension.
本発明で用いる酵素としては、リポタンパク質リパーゼおよび中性プロテアーゼのうち少なくとも一種であるのが好ましい。
このような酵素を用いると、脂質やタンパク質などのポリヒドロキシ酪酸以外の物質を分解して懸濁液に可溶化させることができる。したがって、懸濁液に陰イオン界面活性剤を加えて混和した後に、その懸濁液を廃棄するだけでポリヒドロキシ酪酸以外の物質をさらに効率良く除去することができる。
The enzyme used in the present invention is preferably at least one of lipoprotein lipase and neutral protease.
When such an enzyme is used, substances other than polyhydroxybutyric acid such as lipids and proteins can be decomposed and solubilized in the suspension. Therefore, substances other than polyhydroxybutyric acid can be more efficiently removed simply by discarding the suspension after adding an anionic surfactant to the suspension and mixing.
本発明に係るポリヒドロキシ酪酸精製方法によれば、低コストで大量生産に適し、かつ簡便な操作で高純度のポリヒドロキシ酪酸を精製することができる。 According to the method for purifying polyhydroxybutyric acid according to the present invention, high-purity polyhydroxybutyric acid can be purified by a simple operation that is suitable for mass production at low cost.
本発明の特徴は、破砕した微生物を酵素および界面活性剤によって処理し、懸濁液（中性の水溶液）中に可溶化させることで、微生物中に蓄えられたポリヒドロキシ酪酸（polyhydroxybutyrate；以下、単に「ＰＨＢ」と称する。）、またはＰＨＢを主体とするポリエステル化合物を高純度に精製する点にある。 A feature of the present invention is that the crushed microorganism is treated with an enzyme and a surfactant and solubilized in a suspension (neutral aqueous solution), whereby polyhydroxybutyrate (polyhydroxybutyrate; hereinafter) It is simply referred to as “PHB”), or a polyester compound mainly comprising PHB is purified to a high purity.
なお、前記したＰＨＢを主体とするポリエステル化合物とは、微生物がＰＨＢを産生するとともに、ＰＨＢと共重合し得る他の脂肪族ポリエステル、例えば、ポリヒドロキシ吉草酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンアジペート、ポリリンゴ酸などを不可避的または意図的に含む、ＰＨＢを主体としたポリエステル化合物またはその誘導体を意味する。また、他の物質などを不可避的に含むポリエステル化合物とは、用いた微生物株がＰＨＢを産生する際に副産物として、前記した脂肪族ポリエステルのいずれかを産生するために、これが含まれてしまう場合のポリエステル化合物を意味し、他の物質などを意図的に含むポリエステル化合物とは、例えば、遺伝子組み換え等の技術を用いて、ＰＨＢとともに前記した脂肪族ポリエステルのいずれかを産生させるように形質転換した微生物株を作製し、かかる微生物株によって産生された、前記した脂肪族ポリエステルのいずれかを含むＰＨＢを主体とするポリエステル化合物を意味する。以下、「ＰＨＢ」または「ＰＨＢを主体とするポリエステル化合物」を総称して、単に「ＰＨＢ」という。 The above-mentioned polyester compound mainly composed of PHB refers to other aliphatic polyesters that can be copolymerized with PHB while microorganisms produce PHB, such as polyhydroxyvaleric acid, polylactic acid, polycaprolactone, polyethylene succinate. It means a polyester compound mainly composed of PHB or a derivative thereof, which inevitably or intentionally contains polybutylene succinate, polybutylene adipate, polymalic acid and the like. In addition, the polyester compound that inevitably contains other substances and the like, when the microorganism strain used produces PHB as a by-product when producing any of the above-mentioned aliphatic polyesters. The polyester compound intentionally containing other substances is transformed to produce any of the above-mentioned aliphatic polyesters together with PHB using, for example, a technique such as genetic recombination. It means a polyester compound mainly composed of PHB produced by a microorganism strain and produced by such a microorganism strain and containing any of the above-mentioned aliphatic polyesters. Hereinafter, “PHB” or “polyester compound mainly composed of PHB” is generically referred to as “PHB”.
なお、本発明では、ＰＨＢを産生させた微生物を用いてＰＨＢを得るものであるが、微生物の取り扱いや微生物からＰＨＢを精製する際に行う必要な操作について、発明を実施するための最良の形態および実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いることができる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いることができる。また、当業者であれば本明細書の記載および前記した標準的なプロトコール集などの記載から容易に本発明を再現することができる。 In the present invention, PHB is obtained using a microorganism that has produced PHB. However, the best mode for carrying out the invention is necessary for handling microorganisms and necessary operations for purifying PHB from microorganisms. Unless otherwise specified in the examples, J. Sambrook, EF Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York ( 2001); FM Ausubel, R. Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, JA Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd. The described method, or a modified or modified method thereof can be used. In addition, when using commercially available reagent kits and measuring devices, unless otherwise explained, protocols attached to them can be used. Further, those skilled in the art can easily reproduce the present invention from the description of the present specification and the description of the standard protocol collection described above.
以下、本発明に係るＰＨＢ精製方法を実施するための最良の形態について詳細に説明する。
前記した特徴を有する本発明に係るＰＨＢ精製方法は、具体的には、ＰＨＢを産生させた微生物を含む水溶液を細胞破砕装置にかけて微生物を破砕し、ＰＨＢを含む不溶性残渣と、水溶性不純物と、を得た後、得られた不溶性残渣を中性の水溶液に懸濁してＰＨＢを含む懸濁液を得、この懸濁液に酵素および界面活性剤を加えて混和し、混和した懸濁液に含まれるＰＨＢを沈殿させ、沈殿させたＰＨＢを洗浄液で洗浄することにより、ＰＨＢを高純度に精製する。
Hereinafter, the best mode for carrying out the PHB purification method according to the present invention will be described in detail.
Specifically, the PHB purification method according to the present invention having the above-described characteristics is obtained by crushing a microorganism by applying an aqueous solution containing a microorganism that has produced PHB to a cell crushing apparatus, an insoluble residue containing PHB, a water-soluble impurity, After that, the insoluble residue obtained is suspended in a neutral aqueous solution to obtain a suspension containing PHB. The enzyme and the surfactant are added to the suspension and mixed, and the mixed suspension is mixed. The PHB contained is precipitated, and the precipitated PHB is washed with a washing solution, whereby the PHB is purified to a high purity.
より具体的には、破砕懸濁工程Ｓ１と、混和工程Ｓ２と、沈殿工程Ｓ３と、精製工程Ｓ４と、を含んでなるＰＨＢ精製方法を例示することができる。以下、各工程の内容について、図１を参照して説明する。なお、図１は、本発明に係るＰＨＢ精製方法の一実施形態の各工程のフローを示す図である。 More specifically, a PHB purification method comprising a disruption suspension step S1, a mixing step S2, a precipitation step S3, and a purification step S4 can be exemplified. Hereinafter, the contents of each step will be described with reference to FIG. In addition, FIG. 1 is a figure which shows the flow of each process of one Embodiment of the PHB refinement | purification method based on this invention.
破砕懸濁工程Ｓ１は、容器に入れられた、ＰＨＢを産生させた微生物を含む水溶液を細胞破砕装置にかけて、この微生物を破砕し、ＰＨＢを含む不溶性残渣と、水溶性不純物とを得た後、水溶性不純物を除去して不溶性残渣のみを得、この不溶性残渣を後記する中性の水溶液に懸濁して、ＰＨＢを含む懸濁液を得る工程である。 In the crushing suspension step S1, the aqueous solution containing the microorganism that produced PHB was put in a container and applied to a cell crushing device to crush the microorganism to obtain an insoluble residue containing PHB and water-soluble impurities. In this process, water-soluble impurities are removed to obtain only an insoluble residue, and the insoluble residue is suspended in a neutral aqueous solution to be described later to obtain a suspension containing PHB.
なお、破砕懸濁工程Ｓ１における、容器に入れられた、ＰＨＢを産生させた微生物を含む水溶液としては、かかる微生物を培養した培養液をそのまま用いることも可能であるが、微生物の破砕操作を迅速且つ確実に行うため、かかる微生物を培養した後、遠心分離や限外濾過によって微生物のペレットを得、このようにして得たペレットを後記する容器に入れた後に、後記する水溶液で懸濁したものを用いるのが好ましい。本発明においては前記したような操作（すなわち、ＰＨＢを産生させた微生物を含む水溶液を得る工程）も破砕懸濁工程Ｓ１に含まれる。なお、得られたペレットを後記する水溶液で懸濁する場合は、ペレットが固形物として確認できない程度に懸濁すればよく、懸濁濃度の高低は特に限定されるものではない。なお、ここでの遠心分離は、ＰＨＢを産生させた微生物を沈殿させて回収することができればよく、特に限定されるものではないが、例えば、１５０００回転／分（ｒｐｍ）、３分間で行うことができる。 In addition, as the aqueous solution containing the microorganism that has produced PHB in the disruption suspension step S1, the culture solution in which such a microorganism is cultured can be used as it is. In order to ensure the performance, after culturing such microorganisms, pellets of the microorganisms are obtained by centrifugation or ultrafiltration, and the pellets thus obtained are placed in a container described later and then suspended in an aqueous solution described later. Is preferably used. In the present invention, the operation as described above (that is, a step of obtaining an aqueous solution containing a microorganism that has produced PHB) is also included in the disruption suspension step S1. In addition, when suspending the obtained pellet with the aqueous solution mentioned later, what is necessary is just to suspend so that a pellet cannot be confirmed as a solid substance, and the level of suspension concentration is not specifically limited. The centrifugation here is not particularly limited as long as the microorganisms that produced PHB can be precipitated and collected. For example, the centrifugation is performed at 15000 revolutions / minute (rpm) for 3 minutes. Can do.
ここで用いる容器としては、ＰＨＢを産生させた微生物を含む溶液が漏洩等しないように保持できる容器であれば特に限定されるものではなく、例えば、ビーカーや試験管、三角フラスコなどの各種の容器を用いることができるほか、かかる微生物を培養した培養瓶やバイオリアクターであってもよい。 The container used here is not particularly limited as long as it can hold the solution containing the microorganisms that produced PHB so as not to leak. For example, various containers such as beakers, test tubes, and Erlenmeyer flasks. In addition, a culture bottle or a bioreactor in which such a microorganism is cultured may be used.
また、ＰＨＢを産生させた微生物としては、例えば、ＰＨＢを産生させた根粒菌を用いるのが好ましく、そのような根粒菌としては、例えば、シノリゾビウム属（Sinorhizobium属）を用いるのが好ましく、シノリゾビウム・フレディイ（Sinorhizobium fredii）を用いるのがより好ましい。かかる微生物を用いると、増殖期から微生物体内でＰＨＢの産生が開始されるので比較的多量のＰＨＢを得ることができ、また、培養過程でＰＨＢ含有率が下がりにくく、培養液のｐＨコントロールをしなくてもよいので好適である。しかし、本発明で用いることのできるＰＨＢを産生させた微生物はこれらに限定されるものではなく、例えば、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、アチオロージウム（Athiorhodium）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、バチルス（Bacillus）属、ノカルジア（Nocardia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、リゾビウム（Rhizobium）属、スピリルム（Spirillum）属などを用いることもでき、さらに、遺伝子組み換え等の技術により形質転換させた微生物を用いることもできる。
なお、これらの微生物によるＰＨＢの産生は、各種の微生物に適した培養方法で培養したり、培養中に必要な操作等を行ったりすることにより適宜に産生させることができる。そのため、ＰＨＢを産生させる方法については特に限定されるものではない。
In addition, as the microorganism that produced PHB, for example, it is preferable to use a rhizobia that produced PHB, and as such a rhizobia, for example, the genus Sinorhizobium is preferably used. It is more preferable to use Freddie (Sinorhizobium fredii). When such a microorganism is used, PHB production is started in the microorganism from the growth phase, so that a relatively large amount of PHB can be obtained. In addition, the PHB content is hardly lowered during the culturing process, and the pH of the culture solution is controlled. This is preferable because it is not necessary. However, the microorganisms that produced PHB that can be used in the present invention are not limited to these. For example, the genus Alcaligenes, the genus Athiorhodium, the genus Azotobacter, and the genus Bacillus. Nocardia genus, Pseudomonas genus, Rhizobium genus, Spirillum genus, etc., and microorganisms transformed by a technique such as genetic recombination can also be used.
In addition, the production of PHB by these microorganisms can be appropriately produced by culturing by a culture method suitable for various microorganisms or performing necessary operations during the culture. Therefore, the method for producing PHB is not particularly limited.
また、細胞破砕装置にかける際の水溶液としては、操作の簡便化、低コスト化の観点から、水、蒸留水、純水、滅菌水などを用いることができるが、後記する中性の水溶液を用いてもよい。 In addition, as an aqueous solution used in the cell disruption apparatus, water, distilled water, pure water, sterilized water, or the like can be used from the viewpoint of easy operation and cost reduction. It may be used.
細胞破砕装置としては、前記した微生物の細胞壁や細胞膜などを破壊し、当該微生物に内包されているＰＨＢを前記した水溶液中に放出させることのできる装置であればよく、例えば、微生物を高圧・高速で小さな固定穴に通すことで微生物を破砕する高圧細胞破砕装置を好適に用いることができる。かかる高圧細胞破砕装置を用いると、微生物の破砕処理が早く、大量処理ができ、かつ安価で行うことができる。なお、本発明で用いることのできる細胞破砕装置は、これに限定されるものではなく、超音波によって微生物を破砕する超音波細胞破砕装置、ビーズによって微生物を破砕するビーズ式細胞破砕装置、ホモジナイザーなども好適に用いることができる。 Any cell disruption apparatus may be used as long as it can destroy the cell wall or cell membrane of the microorganism and release PHB contained in the microorganism into the aqueous solution. A high-pressure cell crushing device that crushes microorganisms by passing through a small fixing hole can be suitably used. When such a high-pressure cell disruption apparatus is used, the microorganisms can be rapidly disrupted, processed in large quantities, and inexpensively. The cell crushing apparatus that can be used in the present invention is not limited to this, but an ultrasonic cell crushing apparatus that crushes microorganisms by ultrasonic waves, a bead-type cell crushing apparatus that crushes microorganisms using beads, a homogenizer, etc. Can also be suitably used.
そして、細胞破砕装置にかけて、ＰＨＢを含む不溶性残渣と、水溶性不純物と、を得た後、水溶性不純物を除去し、ＰＨＢを含む不溶性残渣のみを得るためには、静置あるいは遠心分離するなどして不溶性残渣を沈殿させ、上清をデカントで廃棄することで行うことができるほか、濾別することなどによっても行うことができる。
このようにして得られた不溶性残渣のみを中性の水溶液に懸濁して、ＰＨＢを含む懸濁液を得る。
In order to obtain an insoluble residue containing PHB and water-soluble impurities through a cell crushing apparatus, and then removing the water-soluble impurities and obtaining only an insoluble residue containing PHB, it is allowed to stand still or centrifuged. In addition, the insoluble residue can be precipitated, and the supernatant can be discarded by decantation, or by filtration.
Only the insoluble residue thus obtained is suspended in a neutral aqueous solution to obtain a suspension containing PHB.
かかる中性の水溶液は、ｐＨ６〜８程度のバッファーを用いると環境負荷が少なく好適であるが、後記する酵素の至適ｐＨなどの関係からｐＨ５〜６程度のバッファーやｐＨ８〜９程度のバッファーであれば用いることができる。このようなバッファーとしては、例えば、リン酸バッファーやトリス塩酸バッファーなどを挙げることができる。リン酸バッファーは、例えば、０．０１〜０．３Ｍとするのが好ましく、０．０５〜０．１Ｍとするのがより好ましい。また、トリス塩酸バッファーは、例えば、０．０１〜０．３Ｍとするのが好ましく、０．０５〜０．１Ｍとするのがより好ましい。 Such a neutral aqueous solution is suitable when a buffer having a pH of about 6 to 8 is used because it has a low environmental burden and is preferably a buffer of about pH 5 to 6 or a buffer of about pH 8 to 9 because of the optimum pH of the enzyme described later. If you can, you can use it. Examples of such a buffer include a phosphate buffer and a tris hydrochloric acid buffer. For example, the phosphate buffer is preferably 0.01 to 0.3M, more preferably 0.05 to 0.1M. In addition, the Tris-HCl buffer is preferably, for example, 0.01 to 0.3M, and more preferably 0.05 to 0.1M.
次工程の混和工程Ｓ２は、破砕懸濁工程Ｓ１で得た懸濁液に、酵素および界面活性剤を加えて混和する工程である。
破砕懸濁工程Ｓ１で得ることのできた懸濁液には、微生物由来の脂質やタンパク質、糖類などのＰＨＢ以外の物質が含まれている。
特に、脂質は疎水性部分を含み得るため、ＰＨＢとともに精製されるおそれがあり、その結果として、ＰＨＢの純度を低下させる可能性がある。したがって、本発明では、中性条件下で脂質をできる限り取り除く必要がある。
また、タンパク質には、水のような極性の高い溶媒に可溶なタンパク質（可溶性タンパク質）と、例えば、リポタンパク質や糖タンパク質などのように、翻訳後修飾を受けて複合タンパク質とならなければ、極性の高い溶媒に可溶化しないタンパク質（不溶性タンパク質）がある。このような不溶性タンパク質も前記した脂質と同様、ＰＨＢとともに精製されるおそれがあり、ＰＨＢの純度を低下させる可能性がある。したがって、本発明では、中性条件下でこのようなタンパク質をできる限り取り除く必要がある。
The next mixing step S2 is a step of adding and mixing the enzyme and the surfactant to the suspension obtained in the crushing suspension step S1.
The suspension obtained in the disruption suspension step S1 contains substances other than PHB, such as lipids, proteins and sugars derived from microorganisms.
In particular, lipids may contain a hydrophobic moiety and thus may be purified with PHB, resulting in a decrease in PHB purity. Therefore, in the present invention, it is necessary to remove as much lipid as possible under neutral conditions.
In addition, the protein must be a protein that is soluble in a highly polar solvent such as water (soluble protein) and a complex protein that has undergone post-translational modifications, such as lipoproteins and glycoproteins, There are proteins that are not solubilized in highly polar solvents (insoluble proteins). Such an insoluble protein may be purified together with PHB like the above-described lipid, and may reduce the purity of PHB. Therefore, in the present invention, it is necessary to remove such proteins as much as possible under neutral conditions.
混和工程Ｓ２で混和する酵素は、加水分解酵素を用いるのが好ましく、中性条件下で失活しない加水分解酵素を用いるのがより好ましく、中性条件に至適ｐＨを有する加水分解酵素を用いるのがさらに好ましい。また、加水分解酵素としては、脂質分解酵素やタンパク質分解酵素を用いるのが好ましく、中性条件下で失活しない脂質分解酵素やタンパク質分解酵素を用いるのがより好ましく、中性条件に至適ｐＨを有する脂質分解酵素やタンパク質分解酵素を用いるのが好ましい。このような脂質分解酵素やタンパク質分解酵素を用いると、脂質やタンパク質を加水分解して、懸濁液に可溶化させることが可能となる。 The enzyme to be mixed in the mixing step S2 is preferably a hydrolase, more preferably a hydrolase that is not inactivated under neutral conditions, and a hydrolase having an optimum pH under neutral conditions. Is more preferable. In addition, it is preferable to use a lipolytic enzyme or a proteolytic enzyme as a hydrolase, more preferably a lipolytic enzyme or a proteolytic enzyme that is not inactivated under neutral conditions, and has an optimum pH for neutral conditions. It is preferred to use a lipolytic enzyme or a proteolytic enzyme having When such a lipolytic enzyme or proteolytic enzyme is used, it becomes possible to hydrolyze the lipid or protein and solubilize it in the suspension.
かかる脂質分解酵素としては、リポタンパク質リパーゼ（lipoprotein lipase）を用いるのが好ましい。リポタンパク質リパーゼは、細胞質に含まれている中性脂肪の一つであるトリアシルグリセロールを分解してグリセロールと脂肪酸を生成することにより、脂質を懸濁液中に可溶化させることができる。このようなリポタンパク質リパーゼとしては、例えば、微生物（Microorganism）由来やシュードモナス属（Pseudomonas sp.）由来のリポタンパク質リパーゼ（EC3.1.1.34）などを用いることができ、東洋紡社製の製品名ＬＰＬ−３１４、ＬＰＬ−３１１などを好適に用いることができる。 As such lipolytic enzyme, it is preferable to use lipoprotein lipase. Lipoprotein lipase can solubilize lipids in suspension by decomposing triacylglycerol, which is one of the neutral fats contained in the cytoplasm, to produce glycerol and fatty acids. As such a lipoprotein lipase, for example, a lipoprotein lipase (EC3.1.1.34) derived from a microorganism (Microorganism) or a Pseudomonas genus (Pseudomonas sp.) Can be used, and a product name LPL manufactured by Toyobo Co., Ltd. -314, LPL-311, etc. can be used suitably.
また、前記したタンパク質分解酵素としては、ｐＨ６〜８の中性条件下でタンパク質を分解することのできる中性プロテアーゼ（neutral protease）を用いるのが好ましいが、ｐＨ５程度の弱酸性条件下でタンパク質を分解することのできるプロテアーゼや、ｐＨ９程度の弱アルカリ性条件下でタンパク質を分解することのできるプロテアーゼも用いることができる（説明の便宜上、以下、これらを「中性プロテアーゼ」という。）。中性プロテアーゼを用いることにより、懸濁液に不溶であった不溶性タンパク質を可溶化することができる。また、中性プロテアーゼを用いることにより、溶液（懸濁液）をｐＨ５よりも小さい酸性またはｐＨ９よりも大きいアルカリ性に調整する作業をする必要がなくなり、さらに、廃棄する際の中和作業自体を省くか、または省力化することができるので操作が簡便となるだけでなく、低コスト化を図ることができる。なお、このようなタンパク質分解酵素は、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼの別を問わず用いることができる。 Moreover, as the above-mentioned proteolytic enzyme, it is preferable to use a neutral protease capable of degrading the protein under neutral conditions of pH 6 to 8, but the protein under the weakly acidic condition of about pH 5 is used. A protease capable of degrading or a protease capable of degrading a protein under a weak alkaline condition of about pH 9 can also be used (for convenience of explanation, these are hereinafter referred to as “neutral protease”). By using a neutral protease, it is possible to solubilize insoluble proteins that were insoluble in the suspension. Further, by using a neutral protease, there is no need to adjust the solution (suspension) to an acidity lower than pH 5 or an alkalinity higher than pH 9, and further, the neutralization operation itself at the time of disposal is omitted. In addition, since the labor can be saved, not only the operation becomes simple, but also the cost can be reduced. Such a proteolytic enzyme can be used regardless of whether it is an endopeptidase or an exopeptidase.
このような中性プロテアーゼとしては、例えば、リゾープス・オリゼ（Rhizopus oryzae）由来、またはアスペルギルス・メレウス（Aspergillus melleus）やアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）などのアスペルギルス属（Aspergillus sp.）由来、またはバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）やバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）などのバチルス属（Bacillus sp.）由来の中性プロテアーゼなどを用いることができ、例えば、東洋紡社製の製品名ＮＥＰ−７０１、天野エンザイム社製の製品名ペプチダーゼＲ、プロテアーゼＰ「アマノ」３Ｇ、プロテアーゼＮＬ「アマノ」、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ、ウマミザイムＧ、ノボザイムズ社製の製品名アルカラーゼ、サビナーゼ、エバラーゼ、ニュートラーゼ、Novozym243などを好適に用いることができる。 Examples of such neutral proteases are derived from Rhizopus oryzae, or from Aspergillus sp., Such as Aspergillus melleus and Aspergillus oryzae, or from Bacillus sp. Neutral proteases derived from Bacillus sp. Such as Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus and Bacillus licheniformis can be used, for example, manufactured by Toyobo Co., Ltd. Product name NEP-701, product name Peptidase R manufactured by Amano Enzyme, Protease P “Amano” 3G, Protease NL “Amano”, Protease N “Amano” G, Protease A “Amano” G, Protease S “Amano” G, Umamizyme G The product names Alcalase, Sabinase, Everase, Neutase, Novozym 243 and the like manufactured by Novozymes can be preferably used.
混和工程Ｓ２で混和する界面活性剤は、中性条件下で溶液（懸濁液）中の細胞質膜を分解して可溶化したり、脂質を可溶化したりすることができ、また、不溶性タンパク質に結合して可溶化させたりすることができるものであればよく、そのような界面活性剤としては、陰イオン界面活性剤を好適に用いることができる。このような陰イオン界面活性剤としては、高級アルコール系、脂肪酸系、直鎖アルキルベンゼン系、アルファオレフィン系、ノルマルパラフィン系のいずれをも用いることが可能であるが、中でも、高級アルコール系の陰イオン界面活性剤を用いるのが好ましい。高級アルコール系の陰イオン界面活性剤としては、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウムなどを用いるのが好ましい。アルキル硫酸エステルナトリウムとしては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いるのが好ましいが、オクチル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム、テトラデシル硫酸ナトリウム、およびステアリル硫酸ナトリウムのうち一つを用いることができるほか、これらの中から選択された二つ以上を併用することができる。 The surfactant to be mixed in the mixing step S2 can dissolve and solubilize the cytoplasmic membrane in the solution (suspension) under neutral conditions, solubilize the lipid, and insoluble protein. Any surfactant can be used as long as it can be bound and solubilized, and an anionic surfactant can be suitably used as such a surfactant. As such anionic surfactants, any of higher alcohols, fatty acids, linear alkylbenzenes, alpha olefins, and normal paraffins can be used. It is preferable to use a surfactant. As the higher alcohol anionic surfactant, it is preferable to use sodium alkyl sulfate ester, sodium alkyl ether sulfate, or the like. For example, sodium dodecyl sulfate (SDS) is preferably used as the sodium alkyl sulfate ester, but one of sodium octyl sulfate, sodium myristyl sulfate, sodium tetradecyl sulfate, and sodium stearyl sulfate can be used. Two or more selected from can be used in combination.
なお、本発明で用いることのできる界面活性剤は、これらに限定されるものではなく、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルなどの非イオン界面活性剤や、アルキルアミノ脂肪酸ナトリウム、アルキルベタイン、アルキルアミンオキシドなどの両性イオン界面活性剤、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩などの陽イオン界面活性剤なども用いることが可能である。 The surfactant that can be used in the present invention is not limited to these, and nonionic surfactants such as polyoxyethylene alkyl ether and polyoxyethylene alkylphenyl ether, alkylamino fatty acid sodium, alkyl Zwitterionic surfactants such as betaines and alkylamine oxides, and cationic surfactants such as alkyltrimethylammonium salts, dialkyldimethylammonium salts and alkylpyridinium salts can also be used.
前記した界面活性剤の濃度は、中性条件下で前記した効果を奏することができれば特に限定されるものではない。ドデシル硫酸ナトリウムを用いる場合は、例えば、１〜１０ｇ／Ｌとするのが好ましい。ドデシル硫酸ナトリウムの濃度が１ｇ／Ｌよりも少ないと、ドデシル硫酸ナトリウムの濃度が低すぎるために前記した効果を十分に奏することができない。また、ドデシル硫酸ナトリウムの濃度が１０ｇ／Ｌよりも大きいと、もはや前記した効果が飽和してしまい、経済的に無駄である。 The concentration of the surfactant described above is not particularly limited as long as the above-described effects can be obtained under neutral conditions. When using sodium dodecyl sulfate, it is preferable to set it as 1-10 g / L, for example. When the concentration of sodium dodecyl sulfate is less than 1 g / L, the concentration of sodium dodecyl sulfate is too low to sufficiently exhibit the above-described effect. On the other hand, if the concentration of sodium dodecyl sulfate is higher than 10 g / L, the above-described effect is no longer saturated and it is economically useless.
本発明の混和工程Ｓ２においては、酵素と界面活性剤とを懸濁液に同時に加えて混和してもよいが、これらを異時に加えて混和してもよい。
酵素と界面活性剤とを同時に加えて混和する場合、酵素と界面活性剤とを厳密な意味で同時に懸濁液に加えて混和することに限定されず、多少の時間差を許容するものである。このように、酵素と界面活性剤とを懸濁液に同時に加えて混和すると、操作を簡便かつ迅速に行える利点がある。
一方、酵素と界面活性剤とを異時に加えて混和するとは、例えば、懸濁液に酵素を加えた後にこれらを混和する操作を行い（酵素混和工程（図示せず））、その後に界面活性剤を加えて混和する（界面活性剤混和工程（図示せず））というように、酵素の添加および混和をする操作と、界面活性剤の添加および混和をする操作と、をある程度の時間差をもって行うことをいう。このように、酵素と界面活性剤とを懸濁液に異時に加えて混和する、より好ましくは、酵素を界面活性剤よりも早期に懸濁液に加えて混和すると、界面活性剤によって酵素が早期に失活する可能性を低減させることができる。したがって、酵素と界面活性剤とを異時に加えて混和する場合、酵素による処理および界面活性剤による処理をより確実に行い得る利点がある。
In the mixing step S2 of the present invention, the enzyme and the surfactant may be added to the suspension at the same time, and may be mixed at different times.
When the enzyme and the surfactant are added and mixed at the same time, the enzyme and the surfactant are not limited to being added to the suspension and mixed at the same time in a strict sense, and a slight time difference is allowed. Thus, when the enzyme and the surfactant are simultaneously added to the suspension and mixed, there is an advantage that the operation can be performed easily and rapidly.
On the other hand, mixing an enzyme and a surfactant at different times means, for example, adding an enzyme to a suspension and then mixing them (enzyme mixing step (not shown)), and then surface activity. Addition and mixing of the agent (surfactant mixing step (not shown)), the operation of adding and mixing the enzyme and the operation of adding and mixing the surfactant are performed with a certain time difference. That means. Thus, when an enzyme and a surfactant are added to the suspension at a different time and mixed, more preferably, when the enzyme is added to the suspension earlier than the surfactant and mixed, the surfactant causes the enzyme to be mixed. The possibility of deactivation at an early stage can be reduced. Therefore, when the enzyme and the surfactant are added and mixed at different times, there is an advantage that the treatment with the enzyme and the treatment with the surfactant can be more reliably performed.
混和工程Ｓ２における混和操作は、酵素および界面活性剤を懸濁液に加えた後に、これらが均一となるように全体を混和させる。このとき、酵素の失活を防ぐため、界面活性剤を加えた懸濁液が泡立たないよう静かに混和するのがより好ましい。 In the mixing operation in the mixing step S2, the enzyme and the surfactant are added to the suspension, and then the whole is mixed so that they are uniform. At this time, in order to prevent inactivation of the enzyme, it is more preferable to mix gently so that the suspension to which the surfactant is added does not foam.
次工程の沈殿工程Ｓ３は、混和工程Ｓ２で混和した懸濁液を、例えば、３０℃から５０℃で１０分間から２時間静置することで、混和工程Ｓ２で加えた酵素および界面活性剤によって懸濁液中の微生物由来の脂質やタンパク質などのＰＨＢ以外の不溶性残渣を分解して可溶化させ、これを懸濁液に溶解する一方、懸濁液中のＰＨＢのみを沈殿させる工程である。 In the next precipitation step S3, the suspension mixed in the mixing step S2 is allowed to stand, for example, at 30 to 50 ° C. for 10 minutes to 2 hours, so that the enzyme and the surfactant added in the mixing step S2 In this step, insoluble residues other than PHB such as microorganism-derived lipids and proteins in the suspension are decomposed and solubilized and dissolved in the suspension, while only PHB in the suspension is precipitated.
ここで、静置してＰＨＢを沈殿させる場合、静置する温度が３０℃よりも低いと、ＰＨＢ以外の不溶性残渣を十分に分解して可溶化することができないおそれがある。また、静置する温度が５０℃を超えると、酵素が失活しやすくなるので、懸濁液中のＰＨＢ以外の不溶性残渣を十分に分解して可溶化することができないおそれがある。 Here, in the case where PHB is allowed to settle by allowing to stand, if the temperature to stand still is lower than 30 ° C., insoluble residues other than PHB may not be sufficiently decomposed and solubilized. Moreover, since the enzyme is easily deactivated when the standing temperature exceeds 50 ° C., there is a possibility that insoluble residues other than PHB in the suspension cannot be sufficiently decomposed and solubilized.
静置する時間が１０分間より短いと、加えた酵素の量にもよるが、酵素による加水分解反応が十分に行われないおそれがあり、精製したＰＨＢに微生物由来の脂質やタンパク質などの不溶性残渣が残留してしまうおそれがある。また、静置する時間が２時間よりも長いと、酵素による反応が終息してしまうため、時間的コストの観点から好ましくない。なお、静置する時間は、より好ましくは３０分間から９０分間である。 If the standing time is shorter than 10 minutes, although depending on the amount of enzyme added, there is a possibility that the hydrolysis reaction by the enzyme may not be sufficiently performed, and insoluble residues such as lipids and proteins derived from microorganisms in the purified PHB May remain. Further, if the standing time is longer than 2 hours, the reaction by the enzyme ends, which is not preferable from the viewpoint of time cost. The time for standing still is more preferably 30 minutes to 90 minutes.
ＰＨＢの沈殿は、静置することで自然になされるものであるが、懸濁液中のＰＨＢの大きさが小さいほど沈殿しにくくなる傾向がある。そのため、ＰＨＢの収量をより向上させたい場合は、遠心分離を行ってもよい。遠心分離の条件は適宜に設定し得るが、例えば、１０００〜２００００ｒｐｍ、５〜１０分間程度で行うことができる。 PHB precipitation is naturally carried out by standing, but the smaller the PHB size in the suspension, the more difficult it is to precipitate. Therefore, if it is desired to further improve the yield of PHB, centrifugation may be performed. Centrifugation conditions can be set as appropriate. For example, the centrifugation can be performed at 1000 to 20000 rpm for about 5 to 10 minutes.
そして、次工程の精製工程Ｓ４は、沈殿工程Ｓ３後、容器内の懸濁液を廃棄した後、容器内に沈殿させたＰＨＢを少なくとも１回以上洗浄液で洗浄してＰＨＢを精製する工程である。
懸濁液は、デカントで簡単に廃棄することができるが、例えば、アスピレーション等の他の手段によっても廃棄することができる。なお、懸濁液を廃棄する際は、沈殿したＰＨＢを廃棄してしまわないため、例えば、適宜の孔径を有するフィルターなどを用いて懸濁液のみを廃棄するようにするとよい。
洗浄液は、例えば、蒸留水、純水、超純水、滅菌水などを好適に用いることができるが、ＰＨＢの変性を伴わないでＰＨＢを洗浄できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、メタノール、エタノール、プロパノールなどの低級アルコールや、水と低級アルコールの混合溶液なども用いることができる。
Then, the purification step S4 of the next step is a step of purifying the PHB by washing the PHB precipitated in the container at least once with the washing liquid after discarding the suspension in the container after the precipitation step S3. .
The suspension can be easily discarded by decanting, but can also be discarded by other means such as aspiration. When the suspension is discarded, the precipitated PHB is not discarded. For example, it is preferable to discard only the suspension using a filter having an appropriate pore size.
For example, distilled water, pure water, ultrapure water, sterilized water, or the like can be suitably used as the cleaning liquid, but the cleaning liquid is not particularly limited as long as it can wash PHB without denaturation of PHB. For example, a lower alcohol such as methanol, ethanol, propanol, a mixed solution of water and a lower alcohol, or the like can be used.
以上に説明したように、本発明のＰＨＢ精製方法によれば、酵素と界面活性剤を好適化して中性条件下でも良好に作用させることができたので、クロロホルムなどの有機溶媒を用いる必要もなく、また、ＰＨＢ以外の不溶性残渣を可溶化（消化）させるために１００℃以上の温度で加熱する必要もなく、低コストで大量生産に適し、かつ簡便な操作で高純度のＰＨＢを精製することができる。また、アルカリ水溶液を用いず、中性の水溶液を用いるので、使用した水溶液を廃棄する際にかかる水溶液を中和する必要もない点でも、操作が簡便となり、かつ時間的にも費用的にも低コスト化を図ることができる。 As described above, according to the PHB purification method of the present invention, the enzyme and the surfactant can be optimized and can be made to work well even under neutral conditions. Therefore, it is necessary to use an organic solvent such as chloroform. In addition, it is not necessary to heat at a temperature of 100 ° C. or higher to solubilize (digest) insoluble residues other than PHB, and it is suitable for mass production at a low cost and purifies high-purity PHB by a simple operation. be able to. In addition, since a neutral aqueous solution is used without using an alkaline aqueous solution, it is not necessary to neutralize the aqueous solution when discarding the used aqueous solution, and the operation is simple and time and cost are also reduced. Cost reduction can be achieved.
なお、このようにして精製したＰＨＢの乾燥品を得たい場合は、前記した精製工程Ｓ４後、精製したＰＨＢを乾燥させる乾燥工程（図示せず）を行うとよい。ＰＨＢの乾燥は、自然乾燥、凍結乾燥などによって行うことができるが、内圧が高くなることで雰囲気温度が上昇することを防止し、ＰＨＢの変性を防止するため、および乾燥時間短縮のため真空乾燥するのが好ましい。 In addition, when it is desired to obtain a dried product of PHB purified in this way, a drying step (not shown) for drying the purified PHB may be performed after the above-described purification step S4. PHB can be dried by natural drying, freeze drying, etc., but vacuum drying is performed to prevent the ambient temperature from rising due to high internal pressure, to prevent modification of PHB, and to shorten the drying time. It is preferable to do this.
次に、本発明のポリヒドロキシ酪酸精製方法について、本発明の要件を満たす実施例と、本発明の要件を満たさない比較例とを対比して、具体的に説明する。 Next, the polyhydroxybutyric acid purification method of the present invention will be specifically described by comparing an example satisfying the requirements of the present invention with a comparative example not satisfying the requirements of the present invention.
（１）ＰＨＢを得るための材料および用法
まず、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）より提供して頂いたシノリゾビウム・フレディイIFO-14780（Sinorhizobium fredii IFO-14780）を、前々培養（５ｍＬ）、前培養（１００ｍＬ）、本培養（３Ｌ）ともに、下記表１および表２に示す組成の培養液で培養した。表１および表２に示す各試薬のうち、酵母エキスは和光純薬社製のものを用いた。なお、その他の試薬は、特級試薬であれば各社から販売されているものを用いることができる。
(1) Materials and usages for obtaining PHB First, Sinorhizobium fredii IFO-14780, provided by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Biotechnology Headquarters, Biogenetic Resources Division (NBRC) Each of the pre-culture (5 mL), pre-culture (100 mL), and main culture (3 L) was cultured in a culture solution having the composition shown in Table 1 and Table 2 below. Among the reagents shown in Tables 1 and 2, yeast extract manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used. As other reagents, those sold by various companies can be used as long as they are special grade reagents.
前々培養および前培養は、３０℃、１５０ｒｐｍの条件で２４時間旋回振とうにて行い、本培養は、前培養完了後、３Ｌの培養液に、前培養で培養した培養液（１００ｍＬ）を３本分投入し、ファーメンターにてｐＨ７を維持しつつ、３０℃、２５０〜５００ｒｐｍの撹拌速度で４８時間行った。ファーメンターでの撹拌速度は、溶存酸素にあわせて任意で設定した。前々培養は５ｍＬ容フラスコ（バッフルなし）で行い、前培養は５００ｍＬ容フラスコ（バッフル付き）を使用した。本培養で用いたファーメンターは、ＭＢＳ社製ＣＵＬＬＡＮ ＣＬＮ−１００００を使用し、滅菌には、ＥＹＥＬＡ社製のオートクレーブを使用した。滅菌条件は、１２０℃、２０分間であった。 Pre-culture and pre-culture are performed by rotating and shaking for 24 hours under the conditions of 30 ° C. and 150 rpm. After the completion of the pre-culture, 3 L of the culture solution (100 mL) cultured in the pre-culture is added to 3 L of the culture solution. This amount was added and maintained at 30 ° C. and a stirring speed of 250 to 500 rpm for 48 hours while maintaining pH 7 with a fermenter. The stirring speed at the fermenter was arbitrarily set according to the dissolved oxygen. Pre-culture was performed in a 5 mL flask (without baffle), and a 500 mL flask (with baffle) was used for preculture. The fermenter used in the main culture was CULLAN CLN-10000 manufactured by MBS, and an autoclave manufactured by EYELA was used for sterilization. The sterilization conditions were 120 ° C. and 20 minutes.
このようにして培養した本培養の培養液から５０ｍＬ採取し、１５０００ｒｐｍで３分間の遠心分離を行い、ペレット状の湿菌体（シノリゾビウム・フレディイ）と、上澄み液と、に分離し、上澄み液を除去した。なお、遠心分離機は、ＫＵＢＯＴＡ社製６２００を用いて、１５０００ｒｐｍ、３分間の条件で行った。そして、得られたペレット状の湿菌体が十分に懸濁されるように、５０ｍＬの蒸留水を加えて混和し、シノリゾビウム・フレディイを含む水溶液を得た。 50 mL is collected from the culture solution of the main culture thus cultured, centrifuged at 15000 rpm for 3 minutes, and separated into pellet-like wet cells (Sinorizobium fredii) and supernatant solution. Removed. In addition, the centrifuge was performed on condition of 15000 rpm and 3 minutes using 6200 by KUBOTA. Then, 50 mL of distilled water was added and mixed so that the obtained pellet-shaped wet cells were sufficiently suspended to obtain an aqueous solution containing Sinolizobium fredii.
かかる水溶液に含まれるシノリゾビウム・フレディイの破砕は、高圧細胞破砕装置であるＣｏｎｓｔａｎｔＳｙｓｔｅｍｓ社製ワンショットモデルを用いて、０．２８ＧＰａ（４０ｋｐｓｉ）の圧力で２回行った。
シノリゾビウム・フレディイを破砕した後、ＫＵＢＯＴＡ社製６２００を用いて、１５０００ｒｐｍ、３分間の条件で遠心分離を行い、上澄み液（水溶性不純物）を除去し、ペレット状の不溶性残渣を得た。かかる遠心分離による操作を３回繰り返した。
Crushing of Sinorizobium fredii contained in the aqueous solution was performed twice at a pressure of 0.28 GPa (40 kpsi) using a one-shot model manufactured by Constant Systems, which is a high-pressure cell crushing apparatus.
After crushing Sinorizobium fredii, it was centrifuged at 15000 rpm for 3 minutes using 6200 manufactured by KUBOTA, and the supernatant (water-soluble impurities) was removed to obtain a pellet-like insoluble residue. This operation by centrifugation was repeated three times.
得られたペレットから５ｍｇずつ２８個のマイクロチューブに分取して、０．１Ｍリン酸バッファー（ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＯＨ、ｐＨ７）を１．５ｍＬ加えてサンプル１〜２８とした。 Samples 1 to 28 were prepared by dispensing 5 mg each of the obtained pellets into 28 microtubes and adding 1.5 mL of 0.1 M phosphate buffer (KH 2 PO 4 , NaOH, pH 7).
かかるサンプル５〜２８に対して、下記表３に示す脂質分解酵素およびタンパク質分解酵素の少なくとも一方と、界面活性剤とを添加した。比較対象のため、サンプル１、２には、界面活性剤のみを添加し、サンプル３、４には、脂質分解酵素、タンパク質分解酵素、界面活性剤のいずれも添加しなかった。 To these samples 5 to 28, at least one of a lipolytic enzyme and a proteolytic enzyme shown in Table 3 below and a surfactant were added. For comparison, only the surfactant was added to samples 1 and 2, and none of the lipolytic enzyme, proteolytic enzyme, or surfactant was added to samples 3 and 4.
ここで、界面活性剤は、ナカライテスク社製のドデシル硫酸ナトリウム（表３においてＳＤＳと表記する。）を用いた。
酵素は、東洋紡社製のＮＥＰ−７０１およびＬＰＬ−３０１、天野エンザイム社製のＹＬ−ＮＬ、大和化成社製のTunicase（登録商標）、ナカライテスク社製の塩化リゾチーム（Ｌｙｓ−Ｃｌ）、和光純薬社製のリゾチーム（Ｌｙｓ）を用いた。
なお、ＮＥＰ−７０１は中性プロテアーゼであり、ＬＰＬ−３１１はシュードモナス属（Pseudomonas sp.）由来のリポタンパク質リパーゼであり、ＹＬ−ＮＬは酵母の細胞壁を分解するプロテアーゼであり、Tunicase（登録商標）はグルカナーゼとプロテアーゼの混合製剤であり、塩化リゾチームおよびリゾチームはムコ多糖類を加水分解する酵素である。
本発明では、酵素および界面活性剤ごとに２連で検討した。なお、表３において、「−」および「０」は、酵素や界面活性剤を含有していないことを示す。
Here, sodium dodecyl sulfate (indicated in Table 3 as SDS) manufactured by Nacalai Tesque, Inc. was used as the surfactant.
The enzymes include NEP-701 and LPL-301 manufactured by Toyobo, YL-NL manufactured by Amano Enzyme, Tunicase (registered trademark) manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd., lysozyme chloride (Lys-Cl) manufactured by Nacalai Tesque, and Jun Wako A lysozyme (Lys) manufactured by Yakuhin Co., Ltd. was used.
NEP-701 is a neutral protease, LPL-311 is a lipoprotein lipase derived from Pseudomonas sp., YL-NL is a protease that degrades the cell wall of yeast, and Tunicase (registered trademark). Is a mixed preparation of glucanase and protease, and lysozyme chloride and lysozyme are enzymes that hydrolyze mucopolysaccharides.
In the present invention, the enzyme and the surfactant were examined in duplicate. In Table 3, “-” and “0” indicate that no enzyme or surfactant is contained.
表３に示すサンプル１〜２８を静かに混和した後、４０℃で１時間静置した。そして、マイクロチューブ内の懸濁液をピペッティングにより廃棄して、シノリゾビウム・フレディイの産生したＰＨＢを含む不溶性残渣を得た。その後、１．５ｍＬの蒸留水で３回洗浄し、洗浄したＰＨＢを真空乾燥機で真空乾燥した。 Samples 1-28 shown in Table 3 were gently mixed and then allowed to stand at 40 ° C. for 1 hour. Then, the suspension in the microtube was discarded by pipetting to obtain an insoluble residue containing PHB produced by Synorizobium fredii. Thereafter, it was washed with 1.5 mL of distilled water three times, and the washed PHB was vacuum dried with a vacuum dryer.
（２）純度の測定
次に、こうして得られたサンプル１〜２８のＰＨＢをガスクロマトグラフィーにかけてＰＨＢの純度を、G. Braunegg, B.Sonnleitner, R. M. Lafferty, Europian Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, 6, 29-37 (1978)に準じて、以下のようにして測定した。まず、予め調製した１ｍＬのメチルエステル反応液（ナカライテスク社製のメタノール９７ｍＬ、濃硫酸３ｍＬ、安息香酸０．２９ｇ（いずれもナカライテスク社製））と、１ｍＬのクロロホルム（ナカライテスク社製）と、精確に秤量した５ｍｇのサンプル１〜２８のＰＨＢと、を容器に入れて密封し、１００℃で４時間反応させた。水冷後、蒸留水を１ｍＬ入れて激しく撹拌した。その後、静置して水層と有機溶剤層とを分離した後、有機溶剤層をガスクロマトグラフィーで分析した。なお、ガスクロマトグラフィーで使用したカラムは、ジーエルサイエンス社製GC14A SUSID3φ×1m Reoplex400 15% Chromosorb WAW 60/80を用いた。ガスクロマトグラフィーの条件は、インジェクター温度２００℃、ＦＩＤ検出器温度２００℃であった。
(2) Determination of purity Next, PHB of samples 1 to 28 obtained in this way was subjected to gas chromatography to determine the purity of PHB to be determined by G. Braunegg, B. Sonnleitner, RM Lafferty, European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, 6, According to 29-37 (1978), it measured as follows. First, 1 mL of methyl ester reaction solution prepared in advance (97 mL of methanol produced by Nacalai Tesque, 3 mL of concentrated sulfuric acid, 0.29 g of benzoic acid (both manufactured by Nacalai Tesque)), and 1 mL of chloroform (manufactured by Nacalai Tesque) Then, accurately weighed 5 mg of the sample 1-28 PHB was sealed in a container and reacted at 100 ° C. for 4 hours. After cooling with water, 1 mL of distilled water was added and stirred vigorously. Then, after leaving still and isolate | separating a water layer and an organic-solvent layer, the organic-solvent layer was analyzed by the gas chromatography. The column used in gas chromatography was GC14A SUSID3φ × 1 m Reoplex400 15% Chromosorb WAW 60/80 manufactured by GL Sciences. The conditions of gas chromatography were an injector temperature of 200 ° C. and an FID detector temperature of 200 ° C.
算出されたサンプル１〜２８のＰＨＢの純度と、前記したように酵素および界面活性剤ごとに２連で検討しているので、酵素および界面活性剤ごとの純度の平均（以下、「純度（平均）」とする。）を算出して下記表４に示した。本発明においては、純度（平均）が９８％以上であるものを合格（実施例（表４の備考欄参照））とし、純度（平均）が９８％未満のものを不合格（比較例（表４の備考欄参照））とした。 Since the PHB purity of the samples 1 to 28 calculated and the enzyme and the surfactant are examined in duplicate for each of the samples as described above, the average purity (hereinafter referred to as “purity (average) ) ") Is calculated and shown in Table 4 below. In the present invention, a sample having a purity (average) of 98% or more is regarded as acceptable (Example (see remarks column in Table 4)), and a sample having a purity (average) of less than 98% is rejected (Comparative Example (Table)). 4)))).
表４に示すように、サンプル７、８、１１、１２は、純度（平均）がそれぞれ９８％以上となり合格（実施例）となった。これは、酵素や界面活性剤の選定がよかったため、これらが良好に作用したためと考えられる。
一方、サンプル１〜６、９、１０、１３〜２８は、純度（平均）がそれぞれ９８％未満となり不合格（比較例）となった。これは、酵素や界面活性剤の選定がよくなかったため、これらが良好に作用できなかったためと考えられる。
As shown in Table 4, Samples 7, 8, 11, and 12 had a purity (average) of 98% or more, respectively, and passed (Examples). This is thought to be due to the good selection of enzymes and surfactants, which worked well.
On the other hand, samples 1 to 6, 9, 10, and 13 to 28 each had a purity (average) of less than 98%, and were rejected (comparative example). This is probably because the enzymes and surfactants were not properly selected, so that they could not work well.
以上、本発明のポリヒドロキシ酪酸精製方法について、発明を実施するための最良の形態および実施例を示して具体的に説明したが、本発明の趣旨はこれらの記載に何ら限定されるものではなく、その権利範囲は、特許請求の範囲の記載に基づいて広く解釈されなければならない。また、当業者であれば、本発明の発明を実施するための最良の形態および実施例の記載に基づいて容易に変更、改変して本発明のポリヒドロキシ酪酸精製方法と均等な方法を得ることができ、そのようなものも本発明のポリヒドロキシ酪酸精製方法に含まれる。 The polyhydroxybutyric acid purification method of the present invention has been specifically described with reference to the best mode and examples for carrying out the invention, but the gist of the present invention is not limited to these descriptions. The scope of rights should be construed broadly based on the claims. In addition, those skilled in the art can easily change and modify based on the description of the best mode for carrying out the invention of the present invention and the examples to obtain a method equivalent to the polyhydroxybutyric acid purification method of the present invention. Such a method is also included in the polyhydroxybutyric acid purification method of the present invention.
Ｓ１ 破砕懸濁工程
Ｓ２ 混和工程
Ｓ３ 沈殿工程
Ｓ４ 精製工程
S1 Disruption and suspension process S2 Mixing process S3 Precipitation process S4 Purification process
Claims (8)
前記ポリヒドロキシ酪酸を産生させた前記微生物を含む水溶液を細胞破砕装置にかけて前記微生物を破砕し、前記ポリヒドロキシ酪酸を含む不溶性残渣と、水溶性不純物と、を得た後、前記不溶性残渣を中性の水溶液に懸濁して前記ポリヒドロキシ酪酸を含む懸濁液を得、この懸濁液に酵素および界面活性剤を加えて混和し、混和した懸濁液に含まれるポリヒドロキシ酪酸を沈殿させ、沈殿させた前記ポリヒドロキシ酪酸を洗浄液で洗浄することを特徴とするポリヒドロキシ酪酸精製方法。 A polyhydroxybutyric acid purification method for purifying polyhydroxybutyric acid produced by a microorganism,
An aqueous solution containing the microorganism that has produced the polyhydroxybutyric acid is applied to a cell crushing device to crush the microorganism to obtain an insoluble residue containing the polyhydroxybutyric acid and water-soluble impurities, and then the insoluble residue is neutralized. A suspension containing the polyhydroxybutyric acid is obtained by suspending in an aqueous solution of the above, and an enzyme and a surfactant are added to and mixed with the suspension, and the polyhydroxybutyric acid contained in the mixed suspension is precipitated and precipitated. A method for purifying polyhydroxybutyric acid, wherein the polyhydroxybutyric acid is washed with a washing solution.
容器に入れられた、前記ポリヒドロキシ酪酸を産生させた前記微生物を含む水溶液を細胞破砕装置にかけて前記微生物を破砕して、前記ポリヒドロキシ酪酸を含む不溶性残渣と、水溶性不純物と、を得た後、前記不溶性残渣を中性の水溶液に懸濁してポリヒドロキシ酪酸を含む懸濁液を得る破砕懸濁工程と、
前記破砕懸濁工程で得た前記懸濁液に、酵素および界面活性剤を加えて混和する混和工程と、
前記混和工程後、混和した前記懸濁液を３０℃から５０℃で１０分間から２時間静置して、前記微生物由来の前記ポリヒドロキシ酪酸以外の不溶性残渣を可溶化させて前記懸濁液に溶解させるとともに前記ポリヒドロキシ酪酸を沈殿させる沈殿工程と、
前記沈殿工程後、前記容器内の懸濁液を廃棄し、前記容器内に沈殿させたポリヒドロキシ酪酸を少なくとも１回以上洗浄液で洗浄して精製する精製工程と、
を含むことを特徴とするポリヒドロキシ酪酸精製方法。 A polyhydroxybutyric acid purification method for purifying polyhydroxybutyric acid produced by a microorganism,
After obtaining the insoluble residue containing the polyhydroxybutyric acid and the water-soluble impurities by crushing the microorganism by applying an aqueous solution containing the microorganism that has produced the polyhydroxybutyric acid in a container to a cell crushing device , A crushing suspension process in which the insoluble residue is suspended in a neutral aqueous solution to obtain a suspension containing polyhydroxybutyric acid;
A mixing step in which an enzyme and a surfactant are added to and mixed with the suspension obtained in the crushing suspension step;
After the mixing step, the mixed suspension is allowed to stand at 30 ° C. to 50 ° C. for 10 minutes to 2 hours to solubilize the insoluble residue other than the polyhydroxybutyric acid derived from the microorganism to form the suspension. A precipitation step of dissolving and precipitating the polyhydroxybutyric acid;
After the precipitation step, the suspension in the vessel is discarded, and the purification step of purifying the polyhydroxybutyric acid precipitated in the vessel at least once with a washing solution;
A method for purifying polyhydroxybutyric acid, comprising:
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| JP (1) | JP2008193940A (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114591499A (en) * | 2022-03-17 | 2022-06-07 | 珠海麦得发生物科技股份有限公司 | Preparation method and application of poly (R) -3-hydroxybutyrate |
| WO2022215335A1 (en) | 2021-04-09 | 2022-10-13 | 株式会社カネカ | Method for producing recycled water |
| CN115807044A (en) * | 2022-11-09 | 2023-03-17 | 华南理工大学 | Method for efficiently extracting and purifying high-purity polyhydroxyalkanoate |
Citations (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5882723A (en) * | 1980-04-30 | 1983-05-18 | インペリアル・ケミカル・インダストリ−ズ・ピ−エルシ− | Manufacture of shape from 3-hydroxybutyric polymer |
| JPS60145097A (en) * | 1983-11-23 | 1985-07-31 | インペリアル・ケミカル・インダストリ−ズ・ピ−エルシ− | Removal of cell substance other than 3-hydroxybutyrate polymer from microorganism containing 3-hydroxybutyrate polymer |
| JPH05336982A (en) * | 1992-06-11 | 1993-12-21 | Kanebo Ltd | Method for separating and purifying polyhydroxy organic acid ester |
| JPH07135985A (en) * | 1993-11-18 | 1995-05-30 | Mitsubishi Gas Chem Co Inc | Method for extracting poly-3-hydroxylactic acid |
| JPH07177894A (en) * | 1993-12-22 | 1995-07-18 | Mitsubishi Gas Chem Co Inc | Separation and purification of poly-3-hydroxybutyric acid |
| JPH10248587A (en) * | 1997-03-17 | 1998-09-22 | Kubota Corp | Production of biodegradable polymer using sludge as raw material |
| JP2001046094A (en) * | 1999-08-10 | 2001-02-20 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | Separation and purification of poly-3-hydroxyalkanoic acid |
| JP2001340095A (en) * | 2000-03-28 | 2001-12-11 | Canon Inc | Method for separating polyhydroxyalkanoic acid from biological cell |
| JP2002306190A (en) * | 2001-04-10 | 2002-10-22 | Canon Inc | Method for separating/recovering poly-3-hydroxyalkanoic acid from biological cell |
| JP2003047495A (en) * | 2001-03-27 | 2003-02-18 | Canon Inc | Method for producing polyhydroxyalkanoate and apparatus therefor |
| JP2004250629A (en) * | 2003-02-21 | 2004-09-09 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | Preparation process of polyhydroxyalkanoic acid |
| WO2005059153A1 (en) * | 2003-12-19 | 2005-06-30 | Tianan Biologic Material Co., Ltd. Ningbo | A METHOD FOR SEPARATING, EXTRACTING AND PURIFING POLY- β -HYDROXYALKANOATES (PHA’s) DIRECTLY FROM BACTERIAL FERMENTED BROTH |
| JP2005295894A (en) * | 2004-04-12 | 2005-10-27 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | Method for biologically producing 3-hydroxyalkanoic acid and 3-hydroxyalkanoic acid oligomer |
| US20060084161A1 (en) * | 2003-01-20 | 2006-04-20 | Yoshifumi Yanagita | Method of collecting highly pure polyhydroxyalkanoate from microbial cells |
| JP2007028987A (en) * | 2005-07-27 | 2007-02-08 | Asahi Breweries Ltd | Method for separating and purifying polyhydroxyalkanoic acid |
-
2007
- 2007-02-13 JP JP2007031688A patent/JP2008193940A/en active Pending
Patent Citations (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5882723A (en) * | 1980-04-30 | 1983-05-18 | インペリアル・ケミカル・インダストリ−ズ・ピ−エルシ− | Manufacture of shape from 3-hydroxybutyric polymer |
| JPS60145097A (en) * | 1983-11-23 | 1985-07-31 | インペリアル・ケミカル・インダストリ−ズ・ピ−エルシ− | Removal of cell substance other than 3-hydroxybutyrate polymer from microorganism containing 3-hydroxybutyrate polymer |
| JPH05336982A (en) * | 1992-06-11 | 1993-12-21 | Kanebo Ltd | Method for separating and purifying polyhydroxy organic acid ester |
| JPH07135985A (en) * | 1993-11-18 | 1995-05-30 | Mitsubishi Gas Chem Co Inc | Method for extracting poly-3-hydroxylactic acid |
| JPH07177894A (en) * | 1993-12-22 | 1995-07-18 | Mitsubishi Gas Chem Co Inc | Separation and purification of poly-3-hydroxybutyric acid |
| JPH10248587A (en) * | 1997-03-17 | 1998-09-22 | Kubota Corp | Production of biodegradable polymer using sludge as raw material |
| JP2001046094A (en) * | 1999-08-10 | 2001-02-20 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | Separation and purification of poly-3-hydroxyalkanoic acid |
| JP2001340095A (en) * | 2000-03-28 | 2001-12-11 | Canon Inc | Method for separating polyhydroxyalkanoic acid from biological cell |
| JP2003047495A (en) * | 2001-03-27 | 2003-02-18 | Canon Inc | Method for producing polyhydroxyalkanoate and apparatus therefor |
| JP2002306190A (en) * | 2001-04-10 | 2002-10-22 | Canon Inc | Method for separating/recovering poly-3-hydroxyalkanoic acid from biological cell |
| US20060084161A1 (en) * | 2003-01-20 | 2006-04-20 | Yoshifumi Yanagita | Method of collecting highly pure polyhydroxyalkanoate from microbial cells |
| JP2004250629A (en) * | 2003-02-21 | 2004-09-09 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | Preparation process of polyhydroxyalkanoic acid |
| WO2005059153A1 (en) * | 2003-12-19 | 2005-06-30 | Tianan Biologic Material Co., Ltd. Ningbo | A METHOD FOR SEPARATING, EXTRACTING AND PURIFING POLY- β -HYDROXYALKANOATES (PHA’s) DIRECTLY FROM BACTERIAL FERMENTED BROTH |
| JP2005295894A (en) * | 2004-04-12 | 2005-10-27 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | Method for biologically producing 3-hydroxyalkanoic acid and 3-hydroxyalkanoic acid oligomer |
| JP2007028987A (en) * | 2005-07-27 | 2007-02-08 | Asahi Breweries Ltd | Method for separating and purifying polyhydroxyalkanoic acid |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022215335A1 (en) | 2021-04-09 | 2022-10-13 | 株式会社カネカ | Method for producing recycled water |
| CN114591499A (en) * | 2022-03-17 | 2022-06-07 | 珠海麦得发生物科技股份有限公司 | Preparation method and application of poly (R) -3-hydroxybutyrate |
| CN114591499B (en) * | 2022-03-17 | 2023-06-13 | 珠海麦得发生物科技股份有限公司 | Preparation method and application of poly (R) -3-hydroxybutyrate |
| CN115807044A (en) * | 2022-11-09 | 2023-03-17 | 华南理工大学 | Method for efficiently extracting and purifying high-purity polyhydroxyalkanoate |
| CN115807044B (en) * | 2022-11-09 | 2023-10-13 | 华南理工大学 | Method for efficiently extracting and purifying high-purity polyhydroxyalkanoate |
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