JP2008187934A - Method for producing succinic acid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、コハク酸の生産方法に関する。詳細には、特定の乳酸菌を用いたコハク酸の生産方法に関する。 The present invention relates to a method for producing succinic acid. Specifically, the present invention relates to a method for producing succinic acid using a specific lactic acid bacterium.
プラスチックは軽くて、強く、耐久性があり加工しやすい等の利点から現代社会において多量に利用されてきたが、最近では地球温暖化や廃棄物増加につながるなど問題点が指摘されている。そこで環境に配慮した資源循環型社会への担い手として生分解性プラスチックへの期待が高まっている。代表的な生分解性プラスチックには乳酸を原料とするポリ乳酸（ PLA ）とコハク酸を原料とするポリブチレンサクシネート（ PBS ）がある。PLAは硬質であるのに対し、PBSは軟質という特徴があることから用途によって使い分けることが可能である。 Plastics have been used in large quantities in modern society because of their advantages of being light, strong, durable, and easy to process. Recently, however, problems such as global warming and increased waste have been pointed out. Therefore, expectations for biodegradable plastics are increasing as a leader in an environmentally friendly resource recycling society. Typical biodegradable plastics include polylactic acid (PLA) using lactic acid as a raw material and polybutylene succinate (PBS) using succinic acid as a raw material. PLA is hard, whereas PBS is soft, so it can be used properly depending on the application.
PBSはコハク酸と1,4-ブタンジオールを原料とし、脱水重縮合により合成される。しかし、現在コハク酸は石油資源を原料として生産されているためバイオマス資源による発酵生産が強く望まれている。 PBS is synthesized by dehydration polycondensation using succinic acid and 1,4-butanediol as raw materials. However, since succinic acid is currently produced using petroleum resources as raw materials, fermentation production using biomass resources is strongly desired.
従来のコハク酸の生産方法としては、例えば、特開平５−６８５７６号公報には、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）をＮＡＤＨ又はＮＡＤを含む培養液中で振盪培養した後、反応液を遠心分離し、上澄み中のコハク酸を回収するコハク酸の製造法が記載されている（特許文献１）。 As a conventional method for producing succinic acid, for example, in JP-A-5-68576, Brevibacterium flavum is shake-cultured in a culture solution containing NADH or NAD, and then the reaction solution is centrifuged. A method for producing succinic acid that separates and recovers succinic acid in the supernatant is described (Patent Document 1).
また、特開２００５−２１１０４１号公報には、乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡシンターゼなどの発現が抑制された大腸菌、枯草菌、酵母、コリネバクテリウムを用い、好気的に菌体を培養した後、培地で嫌気発酵させるコハク酸の製造法が記載されている（特許文献２）。 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-211041 discloses aerobic culture of Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, and corynebacterium in which the expression of lactate dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase, acetyl CoA synthase, etc. is suppressed. After that, a method for producing succinic acid that is subjected to anaerobic fermentation in a culture medium is described (Patent Document 2).
また、特開２００６−６３４４号公報には、反応液に外部から炭酸ガスを供給しながら、反応液中でコリネ型細菌を嫌気的に作用させてコハク酸を含む有機酸を製造する方法が記載されている（特許文献３）。 Japanese Patent Laid-Open No. 2006-6344 describes a method for producing an organic acid containing succinic acid by anaerobically acting coryneform bacteria in the reaction solution while supplying carbon dioxide gas to the reaction solution from the outside. (Patent Document 3).
また、特開２００６−３０５５４０号公報には、稲藁を硫酸で糖化した糖化原料を含む培地にクルイエロミセス・サーモトレランス（Kluyreromyces thermotolerans）を添加し、乳酸及びコハク酸を生産する方法が記載されている（特許文献４）。
ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）は乳酸桿菌の一種で、植物性発酵食品や人の腸管内など幅広い場所に存在し、プロバイオティクスの面においても有用な乳酸菌である。その中でもラクトバシルス プランタラムWCFS1株は2002年にMichiel Kleerebezemらが中心となりその全ゲノムのシークエンス解析が行われた。現在ではインターネット上の NCBI、DDBJ 等のデータベースにその全塩基配列が登録されているため、代謝工学（ metabolic engineering ）を行う上で非常に有用な菌株である。 Lactobacillus plantarum is a kind of lactobacilli, is present in a wide range of places such as plant fermented foods and human intestinal tract, and is also a useful lactic acid bacterium in terms of probiotics. Among them, Lactobacillus plantarum WCFS1 strain was analyzed in 2002 by Michiel Kleerebezem et al. At present, the entire base sequence is registered in databases such as NCBI and DDBJ on the Internet, so it is a very useful strain for metabolic engineering.
ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）NCIMB8826株はそのゲノムデータと過去の研究により、不完全なTCA回路を保持していることが明らかとなっており、コハク酸合成経路が存在している。 Lactobacillus plantarum NCIMB8826 strain has been revealed by the genomic data and past studies to have an incomplete TCA cycle, and a succinic acid synthesis pathway exists.
従って、本発明は、代謝工学によりラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）NCIMB8826株のグルコース代謝経路を改変し、有用有機酸であるコハク酸を生産させることを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to modify the glucose metabolic pathway of Lactobacillus plantarum NCIMB8826 strain by metabolic engineering to produce succinic acid which is a useful organic acid.
上記の課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を行ったところ、特定の乳酸菌を用いてコハク酸生産を行わせることにより、コハク酸の生産量を高めることができるとの知見を得た。本発明はかかる知見に基づきなされたものであり、［１］乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損させた乳酸菌を、炭素源及び二酸化炭素源を含有する培地に添加し、培養することにより、前記乳酸菌にコハク酸を生成させることを特徴とする、コハク酸の生産方法を提供するものである。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted intensive studies and found that production of succinic acid can be increased by causing succinic acid production using specific lactic acid bacteria. Obtained. The present invention has been made on the basis of such findings. [1] A lactic acid bacterium deficient in a lactate dehydrogenase gene is added to a medium containing a carbon source and a carbon dioxide source and cultured, whereby succinic acid is added to the lactic acid bacterium. The present invention provides a method for producing succinic acid, characterized by producing succinic acid.
本発明の好ましい態様は次のとおりである。
［２］前記乳酸菌が、ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）であることを特徴とする、前記［１］に記載のコハク酸の生産方法；
［３］前記乳酸菌が、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が導入されたピルビン酸カルボキシラーゼ高発現株であることを特徴とする、前記［１］又は［２］に記載のコハク酸の生産方法；
［４］前記乳酸菌が、ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＮＩＴＥ ＡＰ−３０７菌株であることを特徴とする、前記［１］又は［２］に記載のコハク酸の生産方法；
［５］前記乳酸菌が、ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＮＩＴＥ ＡＰ−３０８菌株であることを特徴とする、前記［１］〜［３］のいずれか１項に記載のコハク酸の生産方法；
［６］前記炭素源が、グルコースであることを特徴とする、前記［１］〜［５］のいずれか１に記載のコハク酸の生産方法；
［５］前記炭素源の添加量が、0.1〜20 重量％であることを特徴とする、前記［１］〜［６］のいずれか１に記載のコハク酸の生産方法；
［８］前記二酸化炭素源が、炭酸水素ナトリウムであることを特徴とする、前記［１］〜［７］のいずれか１に記載のコハク酸の生産方法；
［９］前記二酸化炭素源の添加量が、10〜200 ｍＭであることを特徴とする、［１］〜［８］のいずれか１に記載のコハク酸の生産方法；
［１０］前記培養が、通性嫌気条件下又は嫌気条件下で行われることを特徴とする、前記［１］〜［９］のいずれか１に記載のコハク酸の生産方法。
Preferred embodiments of the present invention are as follows.
[2] The method for producing succinic acid according to [1], wherein the lactic acid bacterium is Lactobacillus plantarum;
[3] The method for producing succinic acid according to [1] or [2] above, wherein the lactic acid bacterium is a pyruvate carboxylase high expression strain into which a pyruvate carboxylase gene is introduced;
[4] The method for producing succinic acid according to the above [1] or [2], wherein the lactic acid bacterium is Lactobacillus plantarum NITE AP-307 strain;
[5] The method for producing succinic acid according to any one of [1] to [3], wherein the lactic acid bacterium is Lactobacillus plantarum NITE AP-308 strain;
[6] The method for producing succinic acid according to any one of [1] to [5], wherein the carbon source is glucose;
[5] The method for producing succinic acid according to any one of [1] to [6], wherein the carbon source is added in an amount of 0.1 to 20% by weight;
[8] The method for producing succinic acid according to any one of [1] to [7], wherein the carbon dioxide source is sodium hydrogen carbonate;
[9] The method for producing succinic acid according to any one of [1] to [8], wherein an addition amount of the carbon dioxide source is 10 to 200 mM;
[10] The method for producing succinic acid according to any one of [1] to [9], wherein the culture is performed under facultative anaerobic conditions or anaerobic conditions.
本発明によれば、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損させた乳酸菌を用いて培養することにより、効率よくコハク酸を生産させることができるため、従来、石油資源を原料として生産されていたコハク酸を、バイオマス資源を原料として、発酵というマイルドな条件でコハク酸を生産することが可能になる。 According to the present invention, since succinic acid can be efficiently produced by culturing using a lactic acid bacterium deficient in the lactic acid dehydrogenase gene, succinic acid that has been conventionally produced using petroleum resources as a raw material is It becomes possible to produce succinic acid using the resources as raw materials under mild conditions of fermentation.
本発明は、既述のとおり、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損させた乳酸菌を、炭素源及び二酸化炭素源を含有する培地に添加し、培養することにより、前記乳酸菌にコハク酸を生成させることを特徴とする、コハク酸の生産方法である。 As described above, the present invention is characterized in that a lactic acid bacterium deficient in a lactic acid dehydrogenase gene is added to a medium containing a carbon source and a carbon dioxide source and cultured to produce succinic acid in the lactic acid bacterium. This is a method for producing succinic acid.
乳酸菌としては、ゲノム情報が解読され代謝経路を把握しやすいという理由および取り扱いの容易性等の観点から、ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）であることが好ましい。 As a lactic acid bacterium, Lactobacillus plantarum is preferable from the viewpoints of easy understanding of genomic pathways and metabolic pathways and ease of handling.
乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損させた乳酸菌は、公知の遺伝子工学の手法を用いて製造することができる。例えば、ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）を2ml培養し、alkalin lysis procedure（Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. ( 1989 ) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press.）を用いてプラスミドpMH101を抽出する。そして、このプラスミドを用いてエレクトロポーレーション法によりラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）を形質転換する（Aarnikunnas J, Von Weymarn N, Ronnholm K, Leisola M, Palva A (2003) Metabolic engineering of Lactobacillus fermentum for production of mannitol and pure L-lactic acid or pyruvate. Biotechnol Bioeng 82:653-663）。これにより、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が欠損されたラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）を得ることができる。 Lactic acid bacteria deficient in the lactate dehydrogenase gene can be produced using known genetic engineering techniques. For example, 2 ml of Lactobacillus plantarum is cultured and alkalin lysis procedure (Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press.) Is used to extract plasmid pMH101. Then, Lactobacillus plantarum is transformed by electroporation using this plasmid (Aarnikunnas J, Von Weymarn N, Ronnholm K, Leisola M, Palva A (2003) Metabolic engineering of Lactobacillus fermentum for production of mannitol and pure L-lactic acid or pyruvate. Biotechnol Bioeng 82: 653-663). Thereby, Lactobacillus plantarum lacking the lactate dehydrogenase gene can be obtained.
上述したような、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が欠損した乳酸菌としては、例えば、ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＮＩＴＥ ＡＰ−３０７菌株を挙げることができる。 Examples of the lactic acid bacteria deficient in the lactic acid dehydrogenase gene as described above include Lactobacillus plantarum NITE AP-307 strain.
前記乳酸菌は、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が導入されたピルビン酸カルボキシラーゼ高発現株であることが好ましい。乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が欠損し、かつ、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が導入された乳酸菌は、ピルビン酸をオキサロ酢酸への変換を促進し、コハク酸の収率を向上させることができる。また、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が欠損し、かつ、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が導入された乳酸菌は、二酸化炭素源の添加に応じてコハク酸の収量を向上させることができる。 The lactic acid bacterium is preferably a pyruvate carboxylase high expression strain into which a pyruvate carboxylase gene has been introduced. Lactic acid bacteria lacking the lactate dehydrogenase gene and introduced with the pyruvate carboxylase gene can promote the conversion of pyruvate to oxaloacetate and improve the yield of succinic acid. In addition, lactic acid bacteria lacking the lactate dehydrogenase gene and having the pyruvate carboxylase gene introduced can improve the yield of succinic acid according to the addition of a carbon dioxide source.
ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を乳酸菌に導入する方法としては、公知の遺伝子工学の手法を用いて製造することができる。例えば、図２に示す乳酸菌用発現プラスミドpMHを用いることができる。 As a method for introducing the pyruvate carboxylase gene into lactic acid bacteria, it can be produced using a known genetic engineering technique. For example, the expression plasmid pMH for lactic acid bacteria shown in FIG. 2 can be used.
乳酸菌用発現プラスミドpMHはラクトバシルス ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のmapAオペロンのプロモーター領域を利用し、システイン濃度依存的に挿入遺伝子の発現量を調節できる。また、発現タンパク質のN-末端側6残基のヒスチジンを付加するため、His抗体による western blot解析を行うことで容易に発現の有無を確認することが出来る。 The expression plasmid pMH for lactic acid bacteria can regulate the expression level of the inserted gene in a cysteine concentration-dependent manner using the promoter region of the mapA operon of Lactobacillus reuteri. In addition, since histidine at the 6-residue N-terminal side of the expressed protein is added, the presence or absence of expression can be easily confirmed by Western blot analysis using a His antibody.
得られた乳酸菌用発現プラスミドpMH を用いてラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子( pyc ) をクローニングし、ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）に形質転換を行う（Aarnikunnas J, Von Weymarn N, Ronnholm K, Leisola M, Palva A ( 2003 ) Metabolic engineering of Lactobacillus fermentum for production of mannitol and pure L-lactic acid or pyruvate. Biotechnol Bioeng 82:653-663）。これにより、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が導入されたラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）を得ることができる。 Using the resulting expression plasmid pMH for lactic acid bacteria, the Lactobacillus plantarum pyruvate carboxylase gene (pyc) was cloned and transformed into Lactobacillus plantarum (Aarnikunnas J, Von Weymarn N, Ronnholm K, Leisola M, Palva A (2003) Metabolic engineering of Lactobacillus fermentum for production of mannitol and pure L-lactic acid or pyruvate. Biotechnol Bioeng 82: 653-663). Thereby, Lactobacillus plantarum into which the pyruvate carboxylase gene has been introduced can be obtained.
なお、上述した、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子欠損株の製造と、ピルビン酸カルボキシラーゼ高発現株の製造の順序は問わない。 The order of the production of the above-described lactate dehydrogenase gene-deficient strain and the production of the pyruvate carboxylase high-expression strain are not limited.
上述したような、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が欠損し、かつ、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が導入された乳酸菌としては、例えば、ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＮＩＴＥ ＡＰ−３０８菌株を挙げることができる。 Examples of the lactic acid bacterium that is deficient in the lactate dehydrogenase gene and into which the pyruvate carboxylase gene has been introduced can include Lactobacillus plantarum NITE AP-308 strain.
培養に用いる培地は、乳酸菌が増殖し、コハク酸を生産するための基質となるものである。乳酸菌は菌体増殖と物質生産を並行して行うため、培地としては、乳酸菌培養に一般的に用いられる種々の培地を用いることができる。培地は液体培地でも固体培地でもよいが、コハク酸を回収する工程を考慮すれば、液体培地を選択することが好ましい。 The medium used for the culture is a substrate for lactic acid bacteria to grow and produce succinic acid. Since lactic acid bacteria perform cell growth and substance production in parallel, various media generally used for lactic acid bacteria culture can be used. The medium may be a liquid medium or a solid medium, but it is preferable to select a liquid medium in consideration of the step of recovering succinic acid.
好適な液体培地としては、例えば、ＭＲＳ培地、ＧＹＰ培地等を挙げることができる。この中でも、ＭＲＳ培地を用いることがより好ましい。 Examples of suitable liquid medium include MRS medium and GYP medium. Among these, it is more preferable to use an MRS medium.
炭素源は、乳酸菌が解糖系を介してピルビン酸を生合成するための基質となるものである。炭素源としては、乳酸菌が資化できるものであれば特に限定されないが、入手の容易性及びコスト等の観点からはグルコースであることが好ましい。なお、ＭＲＳ培地を用いる場合は、グルコースが含まれている。 The carbon source serves as a substrate for lactic acid bacteria to biosynthesize pyruvic acid via a glycolytic system. The carbon source is not particularly limited as long as it can assimilate lactic acid bacteria, but glucose is preferable from the viewpoint of availability and cost. In addition, when using a MRS culture medium, glucose is contained.
前記培地中の炭素源の添加量は、培養条件及び対糖収率等を考慮して適宜決定することができるが、0.1〜20重量％であることが好ましく、0.3〜10重量％であることがより好ましく、0.5〜5重量％であることがさらに好ましい。なお、炭素源は、培地を調製する際に添加しても、培養中に継続的に添加してもよい。 The addition amount of the carbon source in the medium can be appropriately determined in consideration of the culture conditions and the yield to sugar, but is preferably 0.1 to 20% by weight, preferably 0.3 to 10% by weight. Is more preferably 0.5 to 5% by weight. The carbon source may be added when preparing the medium or continuously during the culture.
二酸化炭素源は、解糖系で生合成されたピルビン酸をオキサロ酢酸へと変換しＴＣＡ回路に移行する際に固定される二酸化炭素の供給源となるものである。培地中に二酸化炭素源がもともと含まれていれば、積極的に二酸化炭素源を添加しなくても先述した乳酸菌はコハク酸を生産することは可能であるが、コハク酸の収量を向上させる観点からは、二酸化炭素源を培地中に添加することが好ましい。 The carbon dioxide source is a source of carbon dioxide that is fixed when pyruvate biosynthesized in a glycolytic system is converted into oxaloacetate and transferred to the TCA circuit. If the medium originally contains a carbon dioxide source, the lactic acid bacteria described above can produce succinic acid without actively adding a carbon dioxide source, but the viewpoint of improving the yield of succinic acid. From this, it is preferable to add a carbon dioxide source to the medium.
二酸化炭素源としては、例えば、炭酸水素ナトリウム、ＣＯ２ガス、炭酸カルシウム等を挙げることができる。なお、二酸化炭素源は、培地を調製する際に添加しても、培養中に継続的に添加してもよい。 Examples of the carbon dioxide source include sodium hydrogen carbonate, CO2 gas, calcium carbonate, and the like. The carbon dioxide source may be added when preparing the medium, or may be continuously added during the culture.
前記二酸化炭素源の添加量は、培地のｐＨ及びコハク酸の収率等を考慮して適宜決定することができるが、10〜200 ｍＭであることが好ましく、50〜150 ｍＭであることがより好ましい。 The addition amount of the carbon dioxide source can be appropriately determined in consideration of the pH of the medium, the yield of succinic acid, and the like, but is preferably 10 to 200 mM, more preferably 50 to 150 mM. preferable.
前記培養は、乳酸菌が通性嫌気性菌又は嫌気性菌であることを考慮すれば、通性嫌気条件下又は嫌気条件下で行われることが好ましい。例えば、培養は静置培養で行うことができる。但し、本実施形態においては、所望のコハク酸収量を得るためには窒素等のガス置換は必須ではない。 Considering that the lactic acid bacteria are facultative anaerobic bacteria or anaerobic bacteria, the culture is preferably performed under facultative anaerobic conditions or anaerobic conditions. For example, the culture can be performed by static culture. However, in the present embodiment, replacement of gas such as nitrogen is not essential in order to obtain a desired succinic acid yield.
前記培地のｐＨは、乳酸菌の至適ｐＨ等を考慮すれば、ｐＨ6〜8に調整することが好ましい。なお、二酸化炭素源の添加量に応じて培地ｐＨは上昇するが、その場合はｐＨ調整剤等を添加して培地のｐＨを調整することもできる。
The pH of the medium is preferably adjusted to
培養温度は、15〜45 ℃の範囲で適宜決定することができるが、乳酸菌の至適温度を考慮すれば、25〜40 ℃に設定することが好ましい。 The culture temperature can be appropriately determined in the range of 15 to 45 ° C, but is preferably set to 25 to 40 ° C in view of the optimum temperature of lactic acid bacteria.
１．ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）NCIMB8826 によるコハク酸生産における炭酸水素ナトリウムの影響
（１）ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）NCIMB8826 株はゲノム情報よりコハク酸合成経路を遺伝子的に保持していることが知られている。コハク酸は主に解糖系で得られるホスホエノールピルビン酸、またはピルビン酸より、オキサロ酢酸、リンゴ酸、フマル酸を経て合成される（図１）。この経路において、ホスホエノールピルビン酸、またはピルビン酸をオキサロ酢酸へと変換するためには二酸化炭素を固定することが必須である。
1. Effect of sodium bicarbonate on succinic acid production by Lactobacillus plantarum NCIMB8826 (1) Lactobacillus plantarum NCIMB8826 strain is known to genetically hold succinic acid synthesis pathway from genomic information ing. Succinic acid is synthesized mainly from phosphoenolpyruvate or pyruvate obtained by glycolysis via oxaloacetate, malic acid and fumaric acid (FIG. 1). In this pathway, it is essential to fix carbon dioxide in order to convert phosphoenolpyruvate or pyruvate into oxaloacetate.
本試験では、CO2 源として炭酸水素ナトリウムを用いてラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）を培養することで、コハク酸生産量の上昇を試みた。 In this test, succinic acid production was increased by culturing Lactobacillus plantarum using sodium bicarbonate as a CO 2 source.
（２）供試菌株とプラスミド
本試験に用いる供試菌株としては、ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）NCIMB8826を使用した。このNCIMB8826は、National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteriaに保存されている菌株である。本試験に用いるプラスミドとしては、pMH::pycを使用した。このpMH::pycは、ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）NCIMB8826にpyc遺伝子を発現させるためのプラスミドである。
(2) Test strain and plasmid As a test strain used in this test, Lactobacillus plantarum NCIMB8826 was used. NCIMB8826 is a strain preserved in the National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria. PMH :: pyc was used as the plasmid used in this test. This pMH :: pyc is a plasmid for expressing the pyc gene in Lactobacillus plantarum NCIMB8826.
（３）生育条件と有機酸生産
ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）NCIMB8826 株はMRS 培地（ Difco 社製）を用いて、37℃で静置培養した。
(3) Growth Conditions and Organic Acid Production Lactobacillus plantarum NCIMB8826 strain was statically cultured at 37 ° C. using MRS medium (manufactured by Difco).
有機酸を生産させるため、試験管によりラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）NCIMB8826 株を2ml、14〜16時間前培養し、MRS培地に200mM の炭酸水素ナトリウムを加えた培地10mlに1/100 〜1/1000 接種した。 In order to produce an organic acid, 2 ml of Lactobacillus plantarum NCIMB8826 strain was pre-cultured in a test tube for 14 to 16 hours, and 1/100 to 1/1 in 10 ml of MRS medium supplemented with 200 mM sodium bicarbonate. 1000 vaccinations.
（４）HPLCによる有機酸分析
24時間後の培養液2mlを遠心分離（15000rpm, 4℃, 1min ）し、上清中の有機酸をHPLC（ Waters 社製）により解析した。
(4) Organic acid analysis by HPLC
After 24 hours, 2 ml of the culture solution was centrifuged (15000 rpm, 4 ° C., 1 min), and the organic acid in the supernatant was analyzed by HPLC (manufactured by Waters).
（５）結果・考察
表１に、MRS培地とMRS培地＋200mM炭酸水素ナトリウムによる24時間後の培養上清中の有機酸をHPLC にて定量した結果を示した。
(5) Results / Discussion Table 1 shows the results obtained by quantifying the organic acid in the culture supernatant after 24 hours with MRS medium and MRS medium + 200 mM sodium bicarbonate by HPLC.
表１に示すように、両培地共に主要代謝産物は乳酸であるが炭酸水素ナトリウムを加えた培地で 4.67 mM のコハク酸の産生が見られた。 As shown in Table 1, production of 4.67 mM succinic acid was observed in the medium added with sodium bicarbonate although the main metabolite was lactic acid in both mediums.
これらのことよりNCIMB8826 株は機能を有したコハク酸合成経路をもち、炭酸水素ナトリウムを二酸化炭素源とし、コハク酸を生産する能力があることが示唆された。 These results suggest that NCIMB8826 strain has a functional succinic acid synthesis pathway and has the ability to produce succinic acid using sodium bicarbonate as a carbon dioxide source.
２．ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）のピルビン酸カルボキシラーゼ（以下「PC」と称する）過剰発現株の作成
（１）乳酸菌用発現プラスミドの作成
PC を過剰発現するにあたり、乳酸菌用発現プラスミド（以下「pMH」と称する）を作成した（図２）。
2. Construction of Lactobacillus plantarum pyruvate carboxylase (hereinafter referred to as “PC”) overexpression strain (1) Construction of expression plasmid for lactic acid bacteria
When overexpressing PC, an expression plasmid for lactic acid bacteria (hereinafter referred to as “pMH”) was prepared (FIG. 2).
pMH はラクトバシルス ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の mapA オペロンのプロモーター領域を利用し、システイン濃度依存的に挿入遺伝子の発現量を調節できる。また、発現タンパク質の N-末端側に6残基のヒスチジンを付加するため、His 抗体によるウェスタンブロット解析を行うことで発現の有無を確認することができる。 pMH uses the promoter region of the mapA operon of Lactobacillus reuteri and can regulate the expression level of the inserted gene in a cysteine concentration-dependent manner. In addition, since 6-residue histidine is added to the N-terminal side of the expressed protein, the presence or absence of expression can be confirmed by Western blot analysis using His antibody.
（２）PC高発現株の作出
pMH を用いてラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子( pyc ) をクローニングし、ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）NCIMB8826 株に形質転換を行った（Aarnikunnas J, Von Weymarn N, Ronnholm K, Leisola M, Palva A ( 2003 ) Metabolic engineering of Lactobacillus fermentum for production of mannitol and pure L-lactic acid or pyruvate. Biotechnol Bioeng 82:653-663）。得られた形質転換体をNCIMB8826 (pMH::pyc) 株とした。
(2) Creation of strains with high PC expression
Lactobacillus plantarum pyruvate carboxylase gene (pyc) was cloned using pMH and transformed into Lactobacillus plantarum NCIMB8826 strain (Aarnikunnas J, Von Weymarn N, Ronnholm K, Leisholm K, Leisholm K, Leisholm M, Palva A (2003) Metabolic engineering of Lactobacillus fermentum for production of mannitol and pure L-lactic acid or pyruvate. Biotechnol Bioeng 82: 653-663). The obtained transformant was designated as NCIMB8826 (pMH :: pyc) strain.
（３）培養条件と有機酸分析
NCIMB8826 ( pMH ) 株とNCIMB8826 ( pMH::pyc ) 株を用い、上記１（３）と同様の条件で培養し、培養上清中の有機酸をHPLCにより分析した。
(3) Culture conditions and organic acid analysis
NCIMB8826 (pMH) and NCIMB8826 (pMH :: pyc) strains were used and cultured under the same conditions as in 1 (3) above, and the organic acid in the culture supernatant was analyzed by HPLC.
（４）結果・考察
培養開始から24時間後の培養上清中のコハク酸をHPLC にて定量した結果を図３に示した。コントロール株とPC 過剰発現株を比較するとコハク酸産生量にほとんど変化が見られなかった。このことより、ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）はピルビン酸を乳酸へと変換する酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（以下「LDH」と称する）とピルビン酸の基質親和性が非常に強く、既存のPC を過剰発現することではグルコース代謝経路を改変し、コハク酸を生産することは出来ないことが示された。
(4) Results and discussion The results of quantifying succinic acid in the culture supernatant 24 hours after the start of culture by HPLC are shown in FIG. When the control strain and the PC overexpressing strain were compared, there was almost no change in succinic acid production. This indicates that Lactobacillus plantarum has an extremely strong substrate affinity between lactate dehydrogenase (hereinafter referred to as “LDH”), an enzyme that converts pyruvate into lactic acid, and pyruvate. It was shown that expression does not modify the glucose metabolic pathway and cannot produce succinic acid.
３．ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum） LDH 欠損株を宿主としたピルビン酸カルボキシラーゼ過剰発現株の作成
（１）LDH 欠損株によるPC 過剰発現株の作出
NCIMB8826 ( pMH101 ) 株を2ml培養し、alkalin lysis procedure（Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. ( 1989 ) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press.）を用いてプラスミドpMH101 を抽出した。このプラスミドを用いてエレクトロポーレーション法により、LDH欠損株であるラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）VL103株に形質転換を行った（Aarnikunnas J, Von Weymarn N, Ronnholm K, Leisola M, Palva A ( 2003 ) Metabolic engineering of Lactobacillus fermentum for production of mannitol and pure L-lactic acid or pyruvate. Biotechnol Bioeng 82:653-663）。得られた形質転換体をVL103( pMH::pyc )とした。なお、前記VL103株はラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＮＩＴＥ ＡＰ−３０７菌株であり、前記VL103( pMH::pyc )はラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＮＩＴＥ ＡＰ−３０８菌株である。以下、ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＮＩＴＥ ＡＰ−３０７菌株を「VL103株」と表記し、ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＮＩＴＥ ＡＰ−３０８菌株を「VL103 ( pMH::pyc )株」と表記する。さらに、コントロールとして、ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）VL103株にPC遺伝子を含まないベクターを導入したVL103( pMH ) 株を作成し、以下、「VL103( pMH ) 株」と表記する。
3. Lactobacillus plantarum (Lactobacillus plantarum) Creation of pyruvate carboxylase overexpression strain using LDH deficient strain as a host (1) Production of PC overexpression strain using LDH deficiency strain
NCIMB8826 (pMH101) strain is cultured in 2 ml and alkalin lysis procedure (Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press.) Plasmid pMH101 was used to extract. The plasmid was transformed into the LDH-deficient Lactobacillus plantarum VL103 strain by electroporation (Aarnikunnas J, Von Weymarn N, Ronnholm K, Leisola M, Palva A (2003)). Metabolic engineering of Lactobacillus fermentum for production of mannitol and pure L-lactic acid or pyruvate. Biotechnol Bioeng 82: 653-663). The obtained transformant was designated as VL103 (pMH :: pyc). The VL103 strain is a Lactobacillus plantarum (Lactobacillus plantarum) NITE AP-307 strain, and the VL103 (pMH :: pyc) is a Lactobacillus plantarum (Lactobacillus plantarum) NITE AP-308 strain. Hereinafter, the Lactobacillus plantarum (Lactobacillus plantarum) NITE AP-307 strain is referred to as “VL103 strain”, and the Lactobacillus plantarum NITE AP-308 strain is referred to as “VL103 (pMH :: pyc) strain”. Further, as a control, a VL103 (pMH) strain in which a vector not containing a PC gene was introduced into a Lactobacillus plantarum VL103 strain was prepared, and hereinafter referred to as “VL103 (pMH) strain”.
（２）培養条件と有機酸分析
VL103 株とVL103 ( pMH::pyc ) 株を用い、上記１（３）と同様の条件で培養し、培養上清中の有機酸をHPLCにより分析した。また、添加する炭酸水素ナトリウム（NaHCO3）の濃度を50、100、150mM とし、培養液の濁度を660nm の波長で分光高度計を用いて測定した。
(2) Culture conditions and organic acid analysis
Using the VL103 strain and VL103 (pMH :: pyc) strain, the cells were cultured under the same conditions as in 1 (3) above, and the organic acid in the culture supernatant was analyzed by HPLC. The concentration of sodium bicarbonate (NaHCO 3 ) to be added was 50, 100, and 150 mM, and the turbidity of the culture solution was measured using a spectrophotometer at a wavelength of 660 nm.
なお、コントロールとして、wild-type のラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）NCIMB8826株 と、PC遺伝子が導入されたラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）NCIMB8826株 (pMH::pyc) についても上記と同様に培養し、培養上清中の有機酸を測定した。 As a control, wild-type Lactobacillus plantarum NCIMB8826 strain and Lactobacillus plantarum NCIMB8826 strain (pMH :: pyc) introduced with the PC gene were cultured in the same manner as described above. The organic acid in the culture supernatant was measured.
（３）結果・考察
イ MRS 培地中の炭酸水素ナトリウム（NaHCO3）濃度と、wild-type ( NCIMB8826 ) 株とLDH 欠損株でのPC過剰発現と、コハク酸生産の関係を図４に示した。
(3) Results and discussion Fig. 4 shows the relationship between sodium bicarbonate (NaHCO 3 ) concentration in MRS medium, PC overexpression in wild-type (NCIMB8826) and LDH-deficient strains, and succinic acid production. .
LDH欠損株であるVL103株およびVL103 ( pMH::pyc ) 株は、wild-type であるNCIMB8826 株及び NCIMB8826（ pMH::pyc )株と比較して著しくコハク酸生産量が多いことが判明した。VL103 株は炭酸水素ナトリウム依存的に生育が悪くなり、コハク酸生産量も減少した。このことから、添加する炭酸水素ナトリウム（NaHCO3）の量は50mMで十分であることが判明した。一方、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が導入されたVL103 ( pMH::pyc ) 株は炭酸水素ナトリウム依存による生育抑制が改善され、炭酸水素ナトリウム依存的にコハク酸生産量が増加した。 The LDH-deficient strains VL103 and VL103 (pMH :: pyc) were found to produce significantly more succinic acid than the wild-type strains NCIMB8826 and NCIMB8826 (pMH :: pyc). The VL103 strain grew poorly depending on sodium bicarbonate, and succinic acid production decreased. From this, it was found that 50 mM of sodium bicarbonate (NaHCO 3 ) was sufficient. On the other hand, the VL103 (pMH :: pyc) strain into which the pyruvate carboxylase gene was introduced was improved in suppression of growth due to dependence on sodium bicarbonate, and succinic acid production increased in dependence on sodium bicarbonate.
ロ 24、48、72時間後の培養上清中の有機酸濃度をHPLCにより定量した結果を図５に示した。図５は、VL103 ( pMH )株とVL103 ( pMH::pyc ) 株の有機酸生産と生育曲線を示す図である。図５において、（Ａ）はPC遺伝子が導入されていないVL103 ( pMH )株を添加した培地に炭酸水素ナトリウム（NaHCO3）を添加しなかった場合を示し、（Ｂ）はPC遺伝子が導入されたVL103 ( pMH::pyc ) 株を添加した培地に炭酸水素ナトリウム（NaHCO3）を添加しなかった場合を示し、（Ｃ）は前記VL103 ( pMH::pyc ) 株を添加した培地に炭酸水素ナトリウム（NaHCO3）を添加した場合を示す。 (B) The results of quantifying the organic acid concentration in the culture supernatant after 24, 48 and 72 hours by HPLC are shown in FIG. FIG. 5 is a diagram showing organic acid production and growth curves of the VL103 (pMH) and VL103 (pMH :: pyc) strains. In FIG. 5, (A) shows the case where sodium bicarbonate (NaHCO 3 ) was not added to the medium containing the VL103 (pMH) strain into which the PC gene was not introduced, and (B) was the case where the PC gene was introduced. The case where sodium hydrogen carbonate (NaHCO 3 ) was not added to the medium supplemented with the VL103 (pMH :: pyc) strain was shown, and (C) shows the bicarbonate added to the medium supplemented with the VL103 (pMH :: pyc) strain. The case where sodium (NaHCO 3 ) is added is shown.
図５（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、LDH欠損株であるVL103 ( pMH ) 株及びVL103 ( pMH::pyc ) 株は有機酸として主にコハク酸を生産し、乳酸をほとんど生産しない。図５（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、PCを過剰発現させたVL103 (pMH::pyc) 株は、到達O.D. がVL103 (pMH) よりも１ほど下がる。しかしながら、VL103 (pMH::pyc)は、72時間後のコハク酸生産量は、約5g/lまで増加した。また、図５（Ｃ）に示すように、炭酸水素ナトリウムを加えPCを過剰発現させると、菌体増殖は図５（Ａ）のVL103 ( pMH ) 株に比べ著しく低下するが、72時間後のコハク酸生産量は約7g/l（58 mMに相当）まで増加した。 As shown in FIGS. 5A to 5C, the LDH-deficient strains VL103 (pMH) and VL103 (pMH :: pyc) produce mainly succinic acid as an organic acid and hardly produce lactic acid. . As shown in FIGS. 5A and 5B, the VL103 (pMH :: pyc) strain in which PC was overexpressed has a reaching O.D. that is about 1 lower than that of VL103 (pMH). However, VL103 (pMH :: pyc) increased succinic acid production after 72 hours to about 5 g / l. In addition, as shown in FIG. 5 (C), when sodium bicarbonate is added and PC is overexpressed, the cell growth is remarkably reduced as compared with the VL103 (pMH) strain of FIG. Succinic acid production increased to about 7 g / l (equivalent to 58 mM).
この結果より、乳酸菌としてVL103 (pMH::pyc) 株を用い、培地に炭酸水素ナトリウムを加え培養することで、菌体増殖に対して、より効率よくコハク酸を生産できることが示された。 From these results, it was shown that succinic acid can be produced more efficiently for cell growth by using VL103 (pMH :: pyc) strain as a lactic acid bacterium and adding sodium bicarbonate to the medium and culturing.
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| JP2014150748A (en) * | 2013-02-06 | 2014-08-25 | Sekisui Chem Co Ltd | Mutant microorganisms and methods for producing succinic acid |
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