JP2008139275A - Skin sensitization test method - Google Patents

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昌彦 岡本
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a test method for skin sensitization of a test substance. <P>SOLUTION: The test method for skin sensitization of a test substance includes: mixing a test substance with peptide or protein and reacting them for a predetermined time; and then determining presence or absence of interaction between them in the mixture by using mass spectrometry (MS), wherein the peptide or protein includes a peptide containing a cysteine residue or a lysine residue. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、被験物質のペプチドとの相互作用を検出することを特徴とする皮膚感作性の検定方法に関する。 The present invention relates to a method for assaying skin sensitization, which comprises detecting an interaction between a test substance and a peptide.

従来、被験物質の皮膚感作性を検出する目的においてはMaximization試験、Buehler試験、Local Lymph Node Assay（LLNA）等が実施されている。Maximization試験においてはモルモットに被験物質をFreund's Complete Adjuvantと混合して皮内投与し、1週間後に被験物質を経皮適用し、さらに2週間後に被験物質を経皮適用して紅斑、浮腫等の皮膚反応を観察する。Buehler試験においては被験物質をモルモットに週１〜3回、合計３〜１０回経皮適用した後、被験物質を経皮適用して紅斑、浮腫等の皮膚反応を観察する。LLNAでは、被験物質を経皮適用した後、約1週間後にトリチウム標識したチミジンを投与してリンパ球の増殖を調べる。
これら生物学的な試験法に代わる皮膚感作性物質の検出手法として、システイン或いはリジン残基を含有するペプチド又はたんぱく質との反応を質量分析（MS）又はクロマトグラフ法とMSを結合したハイフン化技術を使用した検出方法が、Katoら、山下らにより報告されている（特許文献１〜３及び非特許文献１）また、皮膚感作性の検定方法ではないが、アレルギー性喘息を誘発する気道感作物質の検出方法としてリジン残基を含有するペプチドと反応させて反応生成物を高速液体クロマトグラフ（HPLC）で分析する方法がUrban Wassらにより報告されている（非特許文献２）。
さらに、ペプチドの代わりにヒト血清アルブミンを用いて反応生成物をHPLCで分析して、被験物質の気道感作性を検出する方法をDorothy L. Gauggelらが報告している（非特許文献３）。
特開２００３−１４７６１ 特開２００３−１０１５４ 特開２００３−１４７６２ The Journal of Toxicological Sciences, 2003; 28:19-24、 Scand. J. Work Environ. Health 1990; 16:208-214）。 J. Applied Toxicol. 1993; 13: 307-313 Conventionally, for the purpose of detecting the skin sensitization of a test substance, a Maximization test, a Buehler test, a Local Lymph Node Assay (LLNA) and the like have been performed. In the Maximization test, the test substance is mixed with Freund's Complete Adjuvant in the guinea pig and administered intradermally. After 1 week, the test substance is applied transdermally, and after 2 weeks, the test substance is applied transdermally to the skin such as erythema and edema. Observe the reaction. In the Buehler test, the test substance is applied transdermally to guinea pigs 1 to 3 times a week for a total of 3 to 10 times, and then the test substance is applied transdermally to observe skin reactions such as erythema and edema. In LLNA, after the test substance is applied transdermally, tritium-labeled thymidine is administered about 1 week later to examine lymphocyte proliferation.
As a detection method for skin sensitizers as an alternative to these biological test methods, the reaction with peptides or proteins containing cysteine or lysine residues can be hyphenated by combining mass spectrometry (MS) or chromatographic methods with MS. A detection method using a technique has been reported by Kato et al. And Yamashita et al. (Patent Literatures 1 to 3 and Non-Patent Literature 1). Although not a skin sensitization assay method, airways that induce allergic asthma Urban Wass et al. Reported a method for detecting a sensitizer by reacting with a peptide containing a lysine residue and analyzing the reaction product by high performance liquid chromatography (HPLC) (Non-patent Document 2).
Furthermore, Dorothy L. Gauggel et al. Reported a method for detecting the respiratory sensitization of a test substance by analyzing the reaction product by HPLC using human serum albumin instead of peptide (Non-patent Document 3). .
JP 2003-14761 A JP2003-10154 JP2003-14762 The Journal of Toxicological Sciences, 2003; 28: 19-24, Scand. J. Work Environ. Health 1990; 16: 208-214). J. Applied Toxicol. 1993; 13: 307-313

上記のMaximization試験、Buehler試験及びLLNAはいずれも被験物質を動物に投与し、その免疫応答を検出するものである。そのため、動物を飼育する施設が必要であり、また、最短でも約1週間の期間が必要なため多数のサンプルを検討することには適さなかった。また、動物愛護上も代替法の開発が望まれていた。 The above Maximization test, Buehler test and LLNA all administer a test substance to an animal and detect its immune response. For this reason, a facility for raising animals is necessary, and a period of at least about one week is necessary, so it was not suitable for examining a large number of samples. In addition, the development of alternative methods for animal welfare has been desired.

このような状況下、本発明者らは、低分子の被験物質とペプチドやたんぱく質などの相互作用のうち、従来の技術では検出が困難な水素結合、π-π相互作用やイオン結合などの弱い相互作用を検出することが出来れば、広く被験物質の皮膚感作性を評価できる可能性があることに着目し、例えば、弱い相互作用を検出できるエレクトロスプレイ・イオン化（ESI）法 或いはコールド・スプレイ・イオン化（CSI）法を用いて、被験物質とペプチド等が相互作用した複合体に相当するイオンを与えるかどうかについて検討した。その結果、皮膚感作性を示す被検物質は、ある種のペプチドと相互作用し、複合体に相当するイオンを与えること、さらには、皮膚感作性を示さない被験物質では、複合体に相当するイオンを与えないことから、皮膚感作性の有無と複合体形成能の間には相関関係があることを見出し、本発明に至った。
すなわち、本発明はペプチド又はたんぱく質と被験物質を混合し一定時間反応させた後、混合物を質量分析（MS）法を用いて、それらの相互作用の有無を測定することを特徴とする被験物質の皮膚感作性の検定方法を提供するものである。 Under such circumstances, the present inventors, among the interaction between a low molecular weight test substance and a peptide or protein, have weak hydrogen bonds, π-π interactions, ionic bonds, etc. that are difficult to detect with conventional techniques. Focusing on the possibility that the skin sensitization of the test substance can be widely evaluated if the interaction can be detected, for example, the electrospray ionization (ESI) method or the cold spray that can detect weak interactions・ Ionization (CSI) method was used to examine whether ions corresponding to the complex in which the test substance interacts with the peptide were given. As a result, a test substance exhibiting skin sensitization interacts with a certain peptide and gives ions corresponding to the complex. Since no corresponding ions were given, it was found that there was a correlation between the presence or absence of skin sensitization and the ability to form a complex, and the present invention was achieved.
That is, the present invention comprises a test substance characterized by mixing a peptide or protein and a test substance and reacting them for a predetermined time, and then measuring the presence or absence of the interaction of the mixture using mass spectrometry (MS). An assay method for skin sensitization is provided.

本発明の皮膚感作性物質の検出方法では、被験物質とペプチドやたんぱく質と共有結合を形成しない場合にも、その皮膚感作性の有無が判断出来るので非常に有効である。 The method for detecting a skin sensitizing substance of the present invention is very effective because the presence or absence of the skin sensitization can be determined even when a covalent bond is not formed with a test substance and a peptide or protein.

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明におけるペプチド又はたんぱく質としてはシステイン又はリジン残基を1個以上含むものが挙げられる。
本発明の測定においては、被験物質又はペプチドやたんぱく質を通常、溶媒に溶かして用いる。
被験物質の溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、などの有機溶媒、又はこれらの混合溶媒が用いられる。
ペプチド又はたんぱく質の溶媒としては、水又は酢酸系もしくはリン酸系などの緩衝液又はこれらと有機溶媒との混合溶媒などがあげられる。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
Examples of the peptide or protein in the present invention include those containing one or more cysteine or lysine residues.
In the measurement of the present invention, the test substance or peptide or protein is usually dissolved in a solvent and used.
As a solvent for the test substance, an organic solvent such as methanol, ethanol, acetonitrile, acetone, or a mixed solvent thereof is used.
Examples of the peptide or protein solvent include water, a buffer solution such as acetic acid or phosphoric acid, or a mixed solvent of these with an organic solvent.

ペプチド又はたんぱく質及び被験物質の試料濃度としては、例えば、０．０１μMから１M程度の濃度をあげることができる。より好ましくは、例えば、１０ｍMから１００ｍMの範囲をあげることが出来る。 Examples of the sample concentration of the peptide or protein and the test substance include a concentration of about 0.01 μM to 1M. More preferably, for example, the range of 10 mM to 100 mM can be raised.

また、混合（反応）温度としては、４℃から６０℃程度の範囲をあげることが出来る。より好ましくは、例えば３７℃付近をあげることができる。なお、溶解に用いる溶媒及び試料濃度はペプチド又はたんぱく質及び被験物質の性質に応じて適宜選ぶことができる。 Further, the mixing (reaction) temperature may be in the range of about 4 ° C to 60 ° C. More preferably, for example, around 37 ° C. can be raised. The solvent used for dissolution and the sample concentration can be appropriately selected according to the properties of the peptide or protein and the test substance.

本発明方法において、まず上記のようなペプチド又はたんぱく質を溶解した溶液と被験物質を溶解した溶液を混合して例えば、約３７℃の温度で一定時間反応させ試料溶液を調製する。
このように調製された溶液を分析し、被験物質及びペプチド又はたんぱく質のピーク以外の反応生成物のピークを検出する。 In the method of the present invention, first, a solution in which a peptide or protein as described above is dissolved and a solution in which a test substance is dissolved are mixed and reacted at a temperature of about 37 ° C. for a predetermined time to prepare a sample solution.
The solution prepared in this way is analyzed, and the peak of the reaction product other than the peak of the test substance and the peptide or protein is detected.

試料溶液を分析する方法としては、質量分析（MS）を用いることができる。本発明方法では、複数成分からなる試料であってもそれらが各成分の分子量が異なる場合は、試料溶液をそのままMS分析に供してもよい。 Mass spectrometry (MS) can be used as a method for analyzing the sample solution. In the method of the present invention, even if a sample is composed of a plurality of components, if the molecular weights of the components are different, the sample solution may be directly subjected to MS analysis.

本発明方法に用いることのできる質量分析法としてはイオン化法に、例えば、マトリクス支援レーザーイオン化（MALDI）法、エレクトロスプレーイオン化（ESI）法、大気圧イオン化（API）法、高速原子衝撃イオン化（FAB）法などを挙げることができるが、より好ましくはエレクトロスプレーイオン化（ESI）法 或いはコールド・スプレイ・イオン化（CSI）法をあげることができる。 Examples of mass spectrometry that can be used in the method of the present invention include ionization methods such as matrix-assisted laser ionization (MALDI), electrospray ionization (ESI), atmospheric pressure ionization (API), and fast atom bombardment ionization (FAB). The electrospray ionization (ESI) method or the cold spray ionization (CSI) method can be more preferable.

このようなイオン化法に使用可能な市販のイオン源としては、MALDI法の場合、島津／KRATOS社製 、PE バイオシステムズ社製、マイクロマス社製、Bruker Daltonics Inc.社製のものなどが挙げられる。 またESI法の場合、Thermo Electron社製、マイクロマス社製、サイエックス社製、Hewlett-Packard社製、PE バイオシステムズ社製、日本電子社製のものなどが挙げられる。
更に、CSI法の場合は、日本電子社製、Bruker Daltonics Inc.社製の装置などを挙げることができる。 Examples of commercially available ion sources that can be used for such ionization methods include those produced by Shimadzu / KRATOS, PE Biosystems, Micromass, and Bruker Daltonics Inc. in the case of MALDI. . In the case of the ESI method, those manufactured by Thermo Electron, Micromass, Sciex, Hewlett-Packard, PE Biosystems, JEOL and the like can be mentioned.
Furthermore, in the case of the CSI method, devices manufactured by JEOL Ltd. and Bruker Daltonics Inc. can be exemplified.

質量分析計としては、磁場型、四重極型、イオントラップ型、フーリエ変換−イオンサイクロトン共鳴型、飛行時間型の質量分析計をあげることができる。 Examples of the mass spectrometer include a magnetic field type, a quadrupole type, an ion trap type, a Fourier transform-ion cyclotron resonance type, and a time-of-flight type mass spectrometer.

試料溶液を上記のようにして分析し、それぞれ被験物質、ペプチド又はたんぱく質単独の溶液の質量スペクトルを比較し、両者に認められないイオンを確認することにより、被験物質とペプチド又はたんぱく質から生成したイオンを検出することができる。
該分析に、例えば、ESI法或いはCSI法を用いると、共有結合などの化学反応を介した相互作用だけでなく、水素結合やイオン結合などの弱い相互作用による複合体についても質量分析が可能となり、質量スペクトルから得られる情報に基づいて、複合体構造等を解析し、相互作用の有無を特定することができる。 Analyzing the sample solution as described above, comparing the mass spectra of solutions of the test substance, peptide or protein alone, respectively, and confirming the ions not found in both, the ions generated from the test substance and the peptide or protein Can be detected.
For example, if the ESI method or CSI method is used for the analysis, mass spectrometry can be performed not only for interactions through chemical reactions such as covalent bonds, but also for complexes due to weak interactions such as hydrogen bonds and ionic bonds. Based on the information obtained from the mass spectrum, the complex structure and the like can be analyzed to identify the presence or absence of interaction.

本発明方法によって得られる質量スペクトルにおいては、複合体に相当する分子量が明瞭に認められるので、その解析が容易であり、従来法では検出が難しかった弱い相互作用によって複合体が生成したということを確認する上できわめて有利である。 In the mass spectrum obtained by the method of the present invention, since the molecular weight corresponding to the complex is clearly recognized, the analysis is easy, and the complex was generated by weak interaction that was difficult to detect by the conventional method. This is extremely advantageous for confirmation.

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。測定条件は以下の通りである。
装置：日本電子社製 JMS-T100型 飛行時間型質量分析計
イオン化法：ESI 或いはCSIモード
ニードル電圧：３３００V
オリフィス1：７９V
リングレンズ電圧：１２V
脱溶媒室温度：OFF
オリフィス1温度：OFF
スプレイヤー温度：室温
イオン源温度：−２０℃から３７℃
分解能：６０００
反応液流量：0.5mL／hr
実施例にペプチドと被験物質を反応させ、CSI法またはESI法にて両者の複合体を検出した例を記載した。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to these. The measurement conditions are as follows.
Equipment: JEOL JMS-T100 time-of-flight mass spectrometer Ionization method: ESI or CSI mode Needle voltage: 3300V
Orifice 1: 79V
Ring lens voltage: 12V
Desolvation chamber temperature: OFF
Orifice 1 temperature: OFF
Sprayer temperature: Room temperature Ion source temperature: -20 ° C to 37 ° C
Resolution: 6000
Reaction liquid flow rate: 0.5mL / hr
In the examples, a peptide and a test substance were reacted, and an example in which the complex of both was detected by the CSI method or the ESI method was described.

［実施例１］（ペプチドと被験物質との反応液をCSI法で検出）
被験物質として、２−ベンゾチアゾール（MBT） を用いた。
被験物質の１０ｍMのメタノール溶液と、pH４、７又は９の１０ｍM 酢酸アンモニウム緩衝液に溶解した１ｍMのグルタチオン溶液をモル比１０：１、溶液容量比１：１の割合にて混合し、３７℃で１時間インキュベート後、反応液をCSI法にて分析した。MSは日本電子社製 JMS-T100型質量分析計をもちい、イオン化方法はCSI法にて分析した。
CSI法で分析したところ、BTZについてグルタチオンとの化学反応を介しない複合体の形成による新たなイオンが検出され、この質量スペクトルからグルタチオンと被験物質が共有結合を介しない弱い相互作用によって複合体を形成したと考えられる。 [Example 1] (Detection of reaction solution of peptide and test substance by CSI method)
2-Benzothiazole (MBT) was used as a test substance.
A 10 mM methanol solution of the test substance and a 1 mM glutathione solution dissolved in 10 mM ammonium acetate buffer at pH 4, 7 or 9 were mixed at a molar ratio of 10: 1 and a solution volume ratio of 1: 1, and the mixture was mixed at 37 ° C. After incubation for 1 hour, the reaction solution was analyzed by the CSI method. MS used a JMS-T100 mass spectrometer manufactured by JEOL Ltd., and the ionization method was analyzed by the CSI method.
Analysis by the CSI method revealed that new ions were detected due to the formation of a complex that does not involve chemical reaction with glutathione for BTZ, and the complex was detected from this mass spectrum by weak interaction between glutathione and the test substance not via a covalent bond. It is thought that it formed.

［実施例２］
被験物質として、１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン（MNNG） を用いた以外は、実施例１と同様に実施した。
CSI法で分析したところ、MNNGについてグルタチオンとの化学反応を介しない複合体の形成による新たなイオンが検出され、この質量スペクトルからグルタチオンと被験物質が共有結合を介しない弱い相互作用によって複合体を形成したと考えられる。 [Example 2]
The test was performed in the same manner as in Example 1 except that 1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine (MNNG) was used as a test substance.
As a result of analysis by CSI method, a new ion was detected due to the formation of a complex not involving chemical reaction with glutathione for MNNG, and the complex was detected from this mass spectrum by weak interaction between glutathione and the test substance not via a covalent bond. It is thought that it formed.

［実施例３］（ペプチドと被験物質との反応液をESI法で検出）
被験物質として、2,4-ジニトロ-1-クロロベンゼン(DNCB)を用いた。
被験物質の１０ｍMのメタノール溶液と、pH7.2の１０ｍM 酢酸アンモニウム緩衝液に溶解した１ｍMのグルタチオン溶液を容量比１：１の割合にて混合し、３７℃で１時間インキュベート後、反応液をESI法にて分析した。MSは日本電子社製 JMS-T100型質量分析計を用い、イオン化方法はESI法にて分析した。
ESI法で分析したところ、DNCBについてグルタチオンとの共有結合を介した複合体の形成（m/z474.09705，［GSH+DNCB-Cl］+ のイオンから確認できる）による新たなイオンが検出され、この質量スペクトルからグルタチオンと被験物質が共有結合を介した相互作用によって複合体が形成されていることが確認された。 [Example 3] (Detection of reaction solution of peptide and test substance by ESI method)
2,4-Dinitro-1-chlorobenzene (DNCB) was used as a test substance.
A 10 mM methanol solution of the test substance and a 1 mM glutathione solution dissolved in 10 mM ammonium acetate buffer at pH 7.2 were mixed at a volume ratio of 1: 1, incubated at 37 ° C. for 1 hour, and then the reaction solution was ESI. Analysis by the method. MS was a JMS-T100 mass spectrometer manufactured by JEOL Ltd., and the ionization method was analyzed by the ESI method.
As a result of analysis by ESI, new ions were detected due to the formation of a complex of DNCB via covalent bond with glutathione (m / z474.09705, which can be confirmed from [GSH + DNCB-Cl] + ions) From this mass spectrum, it was confirmed that a complex was formed by interaction between glutathione and the test substance via a covalent bond.

［実施例４］（ペプチドと被験物質との反応液をESI法で検出）
被験物質として、２−ベンゾチアゾール（MBT）を用いた。
被験物質の１０ｍMのメタノール溶液と、pH7.2の１０ｍM 酢酸アンモニウム緩衝液に溶解した１ｍMのタフトシン（Tuftsin）溶液を容量比１：１の割合にて混合し、３７℃で１時間インキュベート後、反応液をESI法にて分析した。MSは日本電子社製 JMS-T100型質量分析計を用い、イオン化方法はESI法にて分析した。
ESI法で分析したところ、m/z668.65960 [Tuftsin＋MBT+H]+ 及び m/z 752.17608 [2Tuftsin+3MBT+2H]2+ にMBTについてタフトシンとの化学反応を介しない複合体の形成による新たなイオンが検出され、この質量スペクトルからタフトシンと被験物質が共有結合を介しない弱い相互作用によって複合体を形成したと考えられる。 [Example 4] (Detection reaction mixture of peptide and test substance by ESI method)
2-Benzothiazole (MBT) was used as a test substance.
A 10 mM methanol solution of the test substance and a 1 mM Tuftsin solution dissolved in 10 mM ammonium acetate buffer at pH 7.2 were mixed at a volume ratio of 1: 1, incubated at 37 ° C. for 1 hour, and then reacted. The liquid was analyzed by ESI method. MS was a JMS-T100 mass spectrometer manufactured by JEOL Ltd., and the ionization method was analyzed by the ESI method.
Analysis by the ESI method revealed that m / z668.65960 [Tuftsin + MBT + H] + and m / z 752.17608 [2Tuftsin + 3MBT + 2H] 2+ showed a new complex due to the formation of a complex not involving chemical reaction with tuftsin for MBT From this mass spectrum, it is considered that a complex was formed by weak interaction between tuftsin and the test substance not via a covalent bond.

［実施例５］（タンパク質と被験物質との反応液をESI法で検出）
被験物質として、2,4-ジニトロ-1-クロロベンゼン(DNCB）、１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン（MNNG）を用いた。
被験物質の１０ｍｇ/ｍｌのアセトン溶液と、pH7.2の0.07M 酢酸アンモニウム緩衝液に溶解した0.06ｍMの牛血清アルブミン（BSA）溶液を溶液容量比１：１９の割合にて混合し、３７℃で１時間インキュベート後、反応液をESI法にて分析した。MSは日本電子社製 JMS-T100型質量分析計を用い、イオン化方法はESI法にて分析した。
ESI法で分析したところ、いずれの被験物質についてもコントロールのBSAのMSスペクトルと比較して有意な分子量の増加が観測された。この質量スペクトルからBSAと被験物質が共有結合を介しない弱い相互作用によって複合体を形成したと考えられる。 [Example 5] (Detection of reaction solution of protein and test substance by ESI method)
As test substances, 2,4-dinitro-1-chlorobenzene (DNCB) and 1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine (MNNG) were used.
A 10 mg / ml acetone solution of a test substance and a 0.06 mM bovine serum albumin (BSA) solution dissolved in a 0.07 M ammonium acetate buffer solution at pH 7.2 were mixed at a solution volume ratio of 1:19 at 37 ° C. Then, the reaction solution was analyzed by ESI method. MS was a JMS-T100 mass spectrometer manufactured by JEOL Ltd., and the ionization method was analyzed by the ESI method.
When analyzed by the ESI method, a significant increase in molecular weight was observed for all test substances compared to the MS spectrum of the control BSA. From this mass spectrum, it is considered that BSA and the test substance formed a complex by a weak interaction without a covalent bond.

［比較例１］
被験物質として、サリチル酸メチル（MS） を用いた以外は、実施例１と同様に実施した。
CSI法で分析したところ、サリチル酸メチルについてグルタチオンとの化学反応を介しない複合体の形成による新たなイオンは検出されなかった。
なお、サリチル酸メチルは、皮膚感作性が認められていない。 [Comparative Example 1]
The same procedure as in Example 1 was performed except that methyl salicylate (MS) was used as a test substance.
As a result of analysis by CSI method, no new ions were detected for methyl salicylate due to the formation of a complex not via chemical reaction with glutathione.
In addition, the skin sensitization property of methyl salicylate is not recognized.

［比較例２］
被験物質として、フェノール(POH) を用いた以外は、実施例１と同様に実施した。ESI法で分析したところ、フェノールについてグルタチオンとの化学反応を介しない複合体の形成による新たなイオンは検出されなかった。なお、フェノールには、皮膚感作性が認められていない。 [Comparative Example 2]
The test was performed in the same manner as in Example 1 except that phenol (POH) was used as a test substance. When analyzed by the ESI method, no new ions were detected due to complex formation of phenol without the chemical reaction with glutathione. Phenol does not show skin sensitization.

［比較例３］
被験物質として、サリチル酸メチル（MS） を用いた以外は、実施例１と同様に実施した。ESI法で分析したところ、サリチル酸メチルについてタフトシンとの化学反応を介しない複合体の形成による新たなイオンは検出されなかった。なお、サリチル酸メチルには、皮膚感作性が認められていない。 [Comparative Example 3]
The same procedure as in Example 1 was performed except that methyl salicylate (MS) was used as a test substance. When analyzed by the ESI method, no new ions were detected for methyl salicylate due to the formation of a complex not via chemical reaction with tuftsin. In addition, skin sensitization has not been observed with methyl salicylate.

［比較例４］
被験物質として、サリチル酸メチル（MS） を用いた以外は、実施例５と同様に実施した。ESI法で分析したところ、サリチル酸メチルについては、コントロールのBSAのMSスペクトルと比較して有意な質量数の増加は観測されなかった。なお、サリチル酸メチルには、皮膚感作性が認められていない。
被験物質とグルタチオンとの反応液をCSI法で分析した結果を図２〜６に示す。
DNCBとグルタチオンとの反応液をESI法で分析した結果を図７に、MBTとタフトシンとの反応液をCSI法で分析した結果を図８〜１０に、被験物質とBSAとの反応液をCSI法で分析した結果を図１１〜１３に示す。比較例を図１４〜１６に示す。 [Comparative Example 4]
The same procedure as in Example 5 was performed except that methyl salicylate (MS) was used as a test substance. When analyzed by the ESI method, no significant increase in mass number was observed for methyl salicylate compared to the MS spectrum of the control BSA. In addition, skin sensitization has not been observed with methyl salicylate.
The results of analyzing the reaction solution of the test substance and glutathione by the CSI method are shown in FIGS.
The results of analyzing the reaction solution of DNCB and glutathione by the ESI method are shown in FIG. 7, the results of analyzing the reaction solution of MBT and tuftsin by the CSI method are shown in FIGS. 8 to 10, and the reaction solution of the test substance and BSA are shown in CSI. The results analyzed by the method are shown in FIGS. Comparative examples are shown in FIGS.

グルタチオン（GSH）溶液（ｐＨ 7.3）のCSI法によるMSスペクトルである。It is a MS spectrum by the CSI method of a glutathione (GSH) solution (pH 7.3). ２−ベンゾチアゾールとグルタチオン（GSH）との反応液（ｐＨ 7.3）のCSI法によるMSスペクトルである。図から共有結合を介しない弱い相互作用によって複合体を形成したことがわかる。It is a MS spectrum by the CSI method of the reaction liquid (pH 7.3) of 2-benzothiazole and glutathione (GSH). From the figure, it can be seen that the complex was formed by a weak interaction without a covalent bond. 図２の部分拡大図である。FIG. 3 is a partially enlarged view of FIG. 2. １−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン（MNNG）とグルタチオン（GSH）との反応液（ｐＨ 7.3）のCSI法によるMSスペクトルである。図から共有結合を介しない弱い相互作用によって複合体を形成したことがわかる。It is a MS spectrum by the CSI method of the reaction liquid (pH 7.3) of 1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine (MNNG) and glutathione (GSH). From the figure, it can be seen that the complex was formed by a weak interaction without a covalent bond. 図４の部分拡大図である。It is the elements on larger scale of FIG. サリチル酸メチル（MS）とグルタチオン（GSH）との反応液のCSI法によるMSスペクトル（部分拡大図）である。サリチル酸メチルとグルタチオン が複合体を形成しなかったことがわかる。It is a MS spectrum (partially enlarged view) of the reaction solution of methyl salicylate (MS) and glutathione (GSH) by the CSI method. It can be seen that methyl salicylate and glutathione did not form a complex. DNCBとグルタチオン（GSH）との反応液（ｐＨ 7.3）のMSスペクトルである。図からDNCBについてグルタチオンとの共有結合を介した複合体の形成（m/z474.09705，［GSH+DNCB-Cl］+ のイオンから確認できる）による新たなイオンが検出され、この質量スペクトルからグルタチオンと被験物質が共有結合を介した相互作用によって複合体が形成されていることがわかる。It is a MS spectrum of the reaction liquid (pH 7.3) of DNCB and glutathione (GSH). From the figure, new ions were detected due to complex formation of DNCB with glutathione via covalent bond (m / z474.09705, confirmed from [GSH + DNCB-Cl] + ion), and glutathione was detected from this mass spectrum. It can be seen that a complex is formed by the interaction between the test substance and the test substance via a covalent bond. ２−ベンゾチアゾール（MBT）とタフトシン（Tuftsin）との反応液（ｐＨ 7.3）のMSスペクトルである。m/z668.65960 [Tuftsin＋MBT+H]+ 及び m/z 752.17608 [2Tuftsin+3MBT+2H]2+ にMBTについてタフトシンとの化学反応を介しない複合体の形成による新たなイオンが検出され、この質量スペクトルからタフトシンと被験物質が共有結合を介しない弱い相互作用によって複合体を形成したことがわかる。It is a MS spectrum of the reaction liquid (pH 7.3) of 2-benzothiazole (MBT) and tuftsin (Tuftsin). m / z668.65960 [Tuftsin + MBT + H] + and m / z 752.17608 [2Tuftsin + 3MBT + 2H] 2+ new ions were detected due to complex formation of MBT without chemical reaction with tuftsin. From the spectrum, it can be seen that a complex was formed by weak interaction between tuftsin and the test substance without a covalent bond. 図８のm/z668.65960 [Tuftsin＋MBT+H]+ 付近の部分拡大図である。FIG. 10 is a partially enlarged view of the vicinity of m / z 668.65960 [Tuftsin + MBT + H] + in FIG. 8. 図８のm/z 752.17608 [2Tuftsin+3MBT+2H]2+ の部分拡大図である。FIG. 9 is a partially enlarged view of m / z 752.17608 [2Tuftsin + 3MBT + 2H] 2+ in FIG. 8. 牛血清アルブミン（BSA）溶液（ｐＨ 7.2）のMSスペクトルのうち、一番強度の高い16価イオンの部分を拡大したスペクトルである。It is the spectrum which expanded the part of the 16-valent ion with the highest intensity | strength among the MS spectrum of a bovine serum albumin (BSA) solution (pH 7.2). （DNCB）と牛血清アルブミン（BSA）との反応液（ｐＨ 7.2）のMSスペクトルのうち、一番強度の高い16価イオンの部分を拡大したスペクトルである。図からコントロールのBSAのスペクトルに比べて分子量が増加していることから複合体を形成したことがわかる。It is a spectrum obtained by enlarging the most intense 16-valent ion portion in the MS spectrum of a reaction solution (pH 7.2) of (DNCB) and bovine serum albumin (BSA). From the figure, it can be seen that a complex was formed because the molecular weight increased compared to the spectrum of the control BSA. １−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン（MNNG）と牛血清アルブミン（BSA）との反応液（ｐＨ 7.2）のMSスペクトルのうち、一番強度の高い16価イオンの部分を拡大したスペクトルである。図からコントロールのBSAのスペクトルに比べて分子量が増加していることから複合体を形成したことがわかる。The spectrum of the MS spectrum of the reaction solution (pH 7.2) of 1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine (MNNG) and bovine serum albumin (BSA) in which the most intense 16-valent ion portion is enlarged. It is. From the figure, it can be seen that a complex was formed because the molecular weight increased compared to the spectrum of the control BSA. フェノール（POH）とグルタチオン（GSH）との反応液のMSスペクトルである。フェノール（POH）とグルタチオンが複合体を形成しなかったことがわかる。It is a MS spectrum of the reaction liquid of phenol (POH) and glutathione (GSH). It can be seen that phenol (POH) and glutathione did not form a complex. サリチル酸メチル（MS）とタフトシン（Tuftsin）との反応液（ｐＨ 7.2）のMSスペクトル（部分拡大図）である。図からサリチル酸メチルとTuftsinが複合体を形成しなかったことがわかる。It is a MS spectrum (partially enlarged view) of a reaction solution (pH 7.2) of methyl salicylate (MS) and tuftsin (Tuftsin). The figure shows that methyl salicylate and Tuftsin did not form a complex. サリチル酸メチル（MS）と牛血清アルブミン（BSA）溶液との反応液（ｐＨ 7.2）のMSスペクトルのうち、一番強度の高い16価イオンの部分を拡大したスペクトルである。図からコントロールのBSAのスペクトルに比べて分子量が増加していないことからサリチル酸メチルとBSAが複合体を形成しなかったことがわかる。It is the spectrum which expanded the part of the 16-valent ion with the highest intensity | strength among MS spectra of the reaction liquid (pH 7.2) of methyl salicylate (MS) and a bovine serum albumin (BSA) solution. From the figure, it can be seen that methyl salicylate and BSA did not form a complex because the molecular weight did not increase compared to the spectrum of control BSA.

Claims (3)

ペプチド又はたんぱく質と被験物質を混合し一定時間反応させた後、混合物を質量分析（MS）法を用いて、それらの相互作用の有無を測定することを特徴とする被験物質の皮膚感作性の検定方法。 After the peptide or protein and the test substance are mixed and reacted for a certain period of time, the mixture is subjected to mass spectrometry (MS), and the presence or absence of the interaction is measured. Test method. ペプチド又はたんぱく質が、システイン残基或いはリジン残基を含むペプチドである請求項１に記載の検定方法。 The assay method according to claim 1, wherein the peptide or protein is a peptide containing a cysteine residue or a lysine residue. 質量分析（MS）法が、エレクトロスプレイ・イオン化（ESI）法 或いはコールド・スプレイ・イオン化（CSI）法である請求項１又は２に記載の検定方法。 The assay method according to claim 1 or 2, wherein the mass spectrometry (MS) method is an electrospray ionization (ESI) method or a cold spray ionization (CSI) method.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2022085762A1 (en) 2020-10-22 2022-04-28 富士フイルム株式会社 Reagent for measuring skin sensitization, compound, and method for measuring skin sensitization

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