JP2008136757A - Filter material, device and method for suppressing inflammatory cytokine production - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得るためのフィルター材、フィルター装置、および炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得る方法に関する。 The present invention relates to a filter material, a filter device, and a method for obtaining a leukocyte-containing solution in which inflammatory cytokine production is suppressed, and a filter material for obtaining a leukocyte-containing solution in which inflammatory cytokine production is suppressed.
腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ：ＴＮＦ）はｉｎ ｖｉｔｒｏ で腫瘍細胞を傷害する因子としてＣａｒｓｗｅｌｌらによって初めて報告され（非特許文献１）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ−α）、Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ−βの3種が知られている。ＴＮＦ−αは単球／マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ケラチノサイトなどから産生されるが、感染性疾患、免疫障害、自己免疫病、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、腫瘍形成等と関連があることが実証されてきている（非特許文献２）。特にＴＮＦ−αの産生はグラム陰性敗血症、内毒性ショック、クローン病、および関節リウマチにおいて劇的に誘導されている。このような広く様々な徴候にＴＮＦ−αが関係することから、この炎症性サイトカインを標的とする治療は重要である。 Tumor necrosis factor (TNF) was first reported by Carswell et al. As a factor that damages tumor cells in vitro (Non-patent Document 1), TNF-α, TNF-β (Lymphoxin-α), Lymphotoxin-β. Three types are known. TNF-α is produced from monocytes / macrophages, T cells, B cells, keratinocytes, etc., but is associated with infectious diseases, immune disorders, autoimmune diseases, graft-versus-host disease (GVHD), tumorigenesis, etc. (Non-patent Document 2). In particular, TNF-α production has been dramatically induced in Gram-negative sepsis, endotoxic shock, Crohn's disease, and rheumatoid arthritis. Because TNF-α is involved in such a wide variety of symptoms, treatment targeting this inflammatory cytokine is important.
一方、インターロイキン６（以下、「ＩＬ−６」と略記する）は、Ｂ細胞刺激因子としてクローニングされた２６ｋＤの糖蛋白であり、Ｔ細胞やＢ細胞、単球、繊維芽細胞、皮膚ケラチノサイト、血管内皮細胞、腎メサンギウム細胞、脳アストロサイト、骨芽細胞で産生されるが、心筋症、心肥大、心筋梗塞、狭心症などの心疾患、関節リウマチ、全身性エリスマトーデス、全身性強皮症、リウマチ熱、多発性筋炎、結節性動脈周囲炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病、キャッスルマン病および自己免疫性溶血性貧血など各種自己免疫疾患、メサンギウム増殖性腎炎、ＩｇＡ腎炎、ループス腎炎、骨粗鬆症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、乾癬、胸膜炎、潰瘍性大腸炎、アテローム硬化症、活動性慢性肝炎、アルコール性肝硬変症、痛風、および各種脳炎など炎症疾患、多発性骨髄腫、心房内粘膜腫、腎癌、肺腺癌、悪性中皮腫、卵巣癌および癌悪液質など肉芽腫を伴う疾患との関係が明らかになってきている。 On the other hand, interleukin 6 (hereinafter abbreviated as “IL-6”) is a 26 kD glycoprotein cloned as a B cell stimulating factor, and includes T cells, B cells, monocytes, fibroblasts, skin keratinocytes, Produced by vascular endothelial cells, renal mesangial cells, brain astrocytes, and osteoblasts, cardiomyopathy, cardiac hypertrophy, myocardial infarction, angina, and other heart diseases, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, generalized strong Various autoimmune diseases such as dermatosis, rheumatic fever, polymyositis, periarteritis nodosa, Sjogren's syndrome, Behcet's disease, Castleman's disease and autoimmune hemolytic anemia, mesangial proliferative nephritis, IgA nephritis, lupus nephritis, osteoporosis Bronchial asthma, atopic dermatitis, psoriasis, pleurisy, ulcerative colitis, atherosclerosis, active chronic hepatitis, alcoholic cirrhosis, The relationship with wind and inflammatory diseases such as encephalitis, multiple myeloma, intra-atrial mucosal tumor, renal cancer, lung adenocarcinoma, malignant mesothelioma, ovarian cancer and cancer cachexia is clearly associated with the disease It has become to.
関節リウマチは関節滑膜を病変の主座とする原因不明の炎症性疾患である。その関節腔内ではＴＮＦ−α、ＩＬ−６などの炎症性サイトカインが過剰に産生され、リンパ球浸潤、滑膜増殖、破骨細胞による軟骨組織破壊といった関節病変形成に関与していることが明らかとなった（非特許文献３）。これらサイトカインなどによってドライブされた炎症細胞や滑膜細胞は、さまざまなシグナル伝達分子を介して持続的な活性化、細胞増殖を引き起こす（非特許文献４）。ＴＮＦ−αを過剰発現させたモデル動物では関節炎が惹起され、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体による中和によって関節炎の改善が認められており（非特許文献５）、また抗ＩＬ−６抗体の投与によっても症状の改善が認められている（非特許文献６）。 Rheumatoid arthritis is an inflammatory disease of unknown cause with the synovial membrane as the main lesion. It is clear that inflammatory cytokines such as TNF-α and IL-6 are excessively produced in the joint cavity and are involved in joint lesion formation such as lymphocyte infiltration, synovial proliferation, and cartilage destruction by osteoclasts. (Non-Patent Document 3). Inflammatory cells and synovial cells driven by these cytokines or the like cause sustained activation and cell proliferation via various signal transduction molecules (Non-patent Document 4). Arthritis is induced in model animals overexpressing TNF-α, and arthritis has been improved by neutralization with anti-TNF-α monoclonal antibody (Non-patent Document 5), and administration of anti-IL-6 antibody Has also been observed to improve symptoms (Non-Patent Document 6).
抗ＴＮＦ−α抗体をはじめとするＴＮＦ阻害剤は、関節リウマチの他、クローン病、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、血管炎、成人発症スティル病、ベーチェット病、関節リウマチに合併する肺線維症、２次性アミロイド症、そしてサルコイドーシスなどへの適応拡大に向けた治験が進められている（非特許文献７）。一方、抗ＩＬ−６抗体も、糸球体腎炎、骨粗鬆症に対する効果が報告されている（非特許文献８、９）。以上のことから、ＴＮＦ−αやＩＬ−６などの炎症性サイトカイン活性を減弱させる抗サイトカイン療法は種々の疾患に対し有効である。 In addition to rheumatoid arthritis, TNF inhibitors including anti-TNF-α antibody are pulmonary fibrosis associated with Crohn's disease, ankylosing spondylitis, psoriatic arthritis, vasculitis, adult-onset Still's disease, Behcet's disease, rheumatoid arthritis Clinical trials are underway to expand indications to secondary amyloidosis and sarcoidosis (Non-patent Document 7). On the other hand, anti-IL-6 antibodies have also been reported to have effects on glomerulonephritis and osteoporosis (Non-patent Documents 8 and 9). From the above, anti-cytokine therapy that attenuates inflammatory cytokine activity such as TNF-α and IL-6 is effective for various diseases.
これまでにＴＮＦ阻害製剤として、抗ＴＮＦ−α抗体としてインフリキシマブ（レミケード（登録商標））、アダリムマブ（ヒュミラ（登録商標））や、ＴＮＦ−α受容体蛋白としてエタネルセプト（エンブレル（登録商標））が用いられている。しかし、これら製剤は優れた効果を発揮する一方、後述するように多くの問題点がある。インフリキシマブ単回投与後の再燃を克服するために行われた反復投与では抗キメラ抗体（中和抗体）の産生によるものと思われる効果減弱が報告されている。重篤な副作用としては、悪性リンパ腫のリスクが上昇すること、間質性肺炎の発症リスクが高いことが報告されている。また、感染症リスクを高めるとされ、結核の発症リスクを7倍にするほか、カリニ肺炎、真菌症などの細胞内寄生感染症が報告されている。その他、急性反応として、掻痒感、蕁麻疹などの皮膚症状、胸痛、呼吸困難などの心肺症状、アナフィラキシーショックなどが報告されている（非特許文献７）。エタネルセプトにおいてもインフリキシマブ同様悪性リンパ腫の発生頻度が高まることが懸念されており、その他、重篤な感染症として腎盂腎炎、感染性関節炎、肺炎、気管支炎、腹腔内膿瘍、蜂窩織炎、骨髄炎、敗血症などが報告されている。即ち、関節リウマチ等の疾患において、抗ＴＮＦ−α抗体をはじめとする炎症性サイトカイン阻害剤が使用されてきているが、安全性の面では十分といえず、さらに改良された炎症性サイトカイン活性の減弱効果を示す治療方法の開発が望まれている。 So far, infliximab (Remicade (registered trademark)) and adalimumab (Humilla (registered trademark)) have been used as anti-TNF-α antibodies, and etanercept (Emblel (registered trademark)) has been used as a TNF-α receptor protein. It has been. However, while these preparations exhibit excellent effects, there are many problems as described later. It has been reported that repeated administrations performed to overcome relapse after a single administration of infliximab have attenuated effects that may be due to the production of anti-chimeric antibodies (neutralizing antibodies). As serious side effects, it is reported that the risk of malignant lymphoma increases and the risk of developing interstitial pneumonia is high. In addition to increasing the risk of infectious diseases, the risk of tuberculosis is increased by 7 times, and intracellular parasitic infections such as carini pneumonia and mycosis have been reported. In addition, skin reactions such as pruritus and urticaria, chest pain, cardiopulmonary symptoms such as dyspnea, anaphylactic shock, and the like have been reported as acute reactions (Non-patent Document 7). As with infliximab, the incidence of malignant lymphoma is also a concern for etanercept, and other serious infections such as pyelonephritis, infectious arthritis, pneumonia, bronchitis, intraabdominal abscess, cellulitis, osteomyelitis, Sepsis has been reported. That is, inflammatory cytokine inhibitors such as anti-TNF-α antibodies have been used in diseases such as rheumatoid arthritis, but it is not sufficient in terms of safety, and further improved inflammatory cytokine activity. Development of a treatment method that exhibits an attenuation effect is desired.
一方、不織布などをフィルター材として患者末梢血液から白血球を選択的に除去し、活性化白血球による障害作用を軽減する白血球除去療法が知られており、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ又は悪性関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病などの治療に用いられている。しかしながら、従来の白血球除去療法には抗サイトカイン療法の効果は認められていなかった。 On the other hand, leukocyte removal therapy that selectively removes leukocytes from the patient's peripheral blood using non-woven fabric as a filter material to reduce the damaging effect of activated leukocytes is known. Systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis or malignant rheumatoid arthritis, ulcer It is used to treat ulcerative colitis and Crohn's disease. However, the effect of anti-cytokine therapy has not been recognized in conventional leukocyte removal therapy.
エチレン−ビニルアルコール共重合体は、親水性、血液適合性を特徴とする高分子化合物として知られ、中空糸の製造方法（特許文献１）或いは不織布の製造方法（特許文献２）が提案されている。また、親水性に優れた特徴から、エチレン−ビニルアルコール共重合体により親水化されたポリスルホン中空糸の製造方法（特許文献３）やエチレン−ビニルアルコール共重合体等の親水性高分子の脱水縮合によって親水化された疎水性材料及びその方法（特許文献４）が提案されている。しかしながら、上述の公知技術にはこれらの材料による炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得るためのフィルター材、フィルター装置、および炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得る方法に関しては何ら開示されていない。また、エチレン−ビニルアルコール共重合体により被覆された不織布に関する公知技術はこれまで報告されていない。 An ethylene-vinyl alcohol copolymer is known as a polymer compound characterized by hydrophilicity and blood compatibility, and a hollow fiber production method (Patent Document 1) or a nonwoven fabric production method (Patent Document 2) has been proposed. Yes. In addition, because of its excellent hydrophilicity, a method for producing a polysulfone hollow fiber hydrophilized with an ethylene-vinyl alcohol copolymer (Patent Document 3) and dehydration condensation of hydrophilic polymers such as an ethylene-vinyl alcohol copolymer And a hydrophobic material hydrophilized by the method (Patent Document 4). However, the above-mentioned known technology relates to a filter material for obtaining a leukocyte-containing liquid in which the production of inflammatory cytokines by these materials is suppressed, a filter device, and a method for obtaining a leukocyte-containing liquid in which the production of inflammatory cytokines is suppressed. Nothing is disclosed. Moreover, the well-known technique regarding the nonwoven fabric coat | covered with the ethylene-vinyl alcohol copolymer has not been reported until now.
以上述べたように、現在までのところ、炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得るためのフィルター材、装置、および方法は知られていない。
本発明は、抗サイトカイン療法に用いられる炎症性サイトカイン阻害剤の副作用の問題点に鑑み、炎症性サイトカインの産生が抑制された安全な白血球含有液を取得することのできるフィルター材、フィルター装置、および炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得る方法を提供することにある。 In view of the problem of side effects of inflammatory cytokine inhibitors used in anti-cytokine therapy, the present invention provides a filter material, a filter device, and a filter material that can obtain a safe leukocyte-containing liquid in which the production of inflammatory cytokines is suppressed. An object of the present invention is to provide a method for obtaining a leukocyte-containing solution in which inflammatory cytokine production is suppressed.
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討したところ、白血球の少なくとも一部を除去するフィルター担体の表面が、エチレン−ビニルアルコール共重合体により被覆されているフィルター材に白血球含有液を流すと、該フィルター材で濾過された白血球含有液は、フィルター材を通過する前の白血球含有液に比べて炎症性サイトカインの産生能が著しく抑制されていることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors diligently studied to solve the above-mentioned problems. As a result, a leukocyte-containing liquid was applied to a filter material in which the surface of a filter carrier for removing at least a part of leukocytes was coated with an ethylene-vinyl alcohol copolymer. When flowed, the leukocyte-containing liquid filtered with the filter material was found to have significantly reduced ability to produce inflammatory cytokines compared to the leukocyte-containing liquid before passing through the filter material, and the present invention was completed. It came.
即ち本発明は以下のような構成からなる。
（１）白血球の少なくとも一部を除去する性能を有するフィルター担体の表面がエチレン−ビニルアルコール共重合体で被覆されており、該エチレン−ビニルアルコール共重合体のエチレン含量が２０ｍｏｌ％以上７０ｍｏｌ％以下であることを特徴とする、単核球の炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得るためのフィルター材。
（２）前記フィルター材のエチレン−ビニルアルコール共重合体の被覆量が単位表面積あたり０．２ｍｇ／ｍ2以上２００ｍｇ／ｍ2以下である（１）記載の単核球の炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得るためのフィルター材。
（３）前記フィルター担体が織布または／および不織布である（１）または（２）記載の単核球の炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得るためのフィルター材。
（４）前記織布または／および不織布のモノフィラメントの平均繊維直径が０．５μｍ以上５０μｍ以下であり、且つ嵩密度が０．０５ｇ／ｃｍ3 以上０．５ｇ／ｃｍ 3 以下である（３）記載の単核球の炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得るためのフィルター材。
（５）前記フィルター担体が粒子集合体である（１）または（２）記載の単核球の炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得るためのフィルター材。
（６）前記粒子の球相当直径が０．１ｍｍ以上５ｍｍ以下である（５）記載の単核球の炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得るためのフィルター材。
（７）白血球の少なくとも一部を除去する性能を有するフィルター材がエチレン−ビニルアルコール不織布および／またはエチレン−ビニルアルコール粒子からなることを特徴とする、単核球の炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得るためのフィルター材。
（８）少なくとも入口と出口とを有する容器に、該容器内を入口側空間と出口側空間に隔てるように（１）乃至（７）の何れかに記載のフィルター材を充填してなる、単核球の炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得るためのフィルター装置。
（９）白血球の少なくとも一部を除去する性能を有するフィルター材の表面がエチレン−ビニルアルコール共重合体であるフィルター材に、単核球を含む白血球含有液を接触させることにより該単核球の炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得る方法。
（１０）前記フィルター材が（１）乃至（７）の何れかに記載のフィルター材である（９）記載の単核球の炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得る方法。
That is, the present invention has the following configuration.
(1) The surface of a filter carrier having the ability to remove at least part of leukocytes is coated with an ethylene-vinyl alcohol copolymer, and the ethylene content of the ethylene-vinyl alcohol copolymer is 20 mol% or more and 70 mol% or less. A filter material for obtaining a leukocyte-containing liquid in which the production of inflammatory cytokines of mononuclear cells is suppressed, characterized in that:
(2) The coating amount of the ethylene-vinyl alcohol copolymer of the filter material is 0.2 mg / m 2 or more and 200 mg / m 2 or less per unit surface area, and suppresses the production of inflammatory cytokines of mononuclear cells according to (1) Filter material for obtaining a white blood cell-containing liquid.
(3) The filter material for obtaining a leukocyte-containing liquid in which the production of inflammatory cytokines of mononuclear cells is suppressed according to (1) or (2), wherein the filter carrier is a woven fabric and / or a nonwoven fabric.
(4) the average fiber diameter of the woven fabric and / or nonwoven monofilament is at 0.5μm or 50μm or less, and a bulk density of less 0.05 g / cm 3 or more 0.5 g / cm 3 (3), wherein A filter material for obtaining a leukocyte-containing liquid in which the production of inflammatory cytokines of mononuclear cells is suppressed.
(5) The filter material for obtaining a leukocyte-containing liquid in which the production of inflammatory cytokines of mononuclear cells is suppressed according to (1) or (2), wherein the filter carrier is a particle aggregate.
(6) The filter material for obtaining a leukocyte-containing solution in which the production of inflammatory cytokines of mononuclear cells is suppressed according to (5), wherein the spherical equivalent diameter of the particles is 0.1 mm or more and 5 mm or less.
(7) Production of inflammatory cytokines of mononuclear cells is suppressed, wherein the filter material having the ability to remove at least a part of leukocytes is composed of an ethylene-vinyl alcohol nonwoven fabric and / or ethylene-vinyl alcohol particles. Filter material for obtaining a leukocyte-containing solution.
(8) A container having at least an inlet and an outlet is filled with the filter material according to any one of (1) to (7) so as to separate the inside of the container into an inlet side space and an outlet side space. A filter device for obtaining a leukocyte-containing liquid in which the production of inflammatory cytokines in nuclei is suppressed.
(9) A white blood cell-containing solution containing mononuclear cells is brought into contact with a filter material whose surface is an ethylene-vinyl alcohol copolymer having a performance of removing at least a part of white blood cells. A method for obtaining a leukocyte-containing liquid in which inflammatory cytokine production is suppressed.
(10) The method for obtaining a leukocyte-containing liquid in which production of inflammatory cytokines of mononuclear cells is suppressed according to (9), wherein the filter material is the filter material according to any one of (1) to (7).
本発明の炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得るためのフィルター材、フィルター装置、および方法を用いることにより、炎症性サイトカイン阻害剤を用いなくても、炎症性サイトカインの産生が抑制された白血球含有液を得ることができるので、安全で、副作用の少ない、抗サイトカイン療法の新たな方法が提供できる。
本発明の炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得るためのフィルター材、フィルター装置、および方法を用いることにより、炎症性サイトカインに起因した疾患、または炎症性サイトカインにより増悪する疾患、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、クローン病、シェーグレン症候群、ベーチェット病、キャッスルマン病などの自己免疫疾患、細菌感染症、細菌感染に伴う敗血症などに対し、予防効果若しくは治療効果が期待される。
By using the filter material, filter device, and method for obtaining a leukocyte-containing liquid with suppressed inflammatory cytokine production according to the present invention, the production of inflammatory cytokines is suppressed without using an inflammatory cytokine inhibitor. Therefore, a new method of anti-cytokine therapy that is safe and has few side effects can be provided.
By using the filter material, the filter device, and the method for obtaining a leukocyte-containing liquid in which production of inflammatory cytokines of the present invention is suppressed, diseases caused by inflammatory cytokines, or diseases that are exacerbated by inflammatory cytokines, for example, Expected to have preventive or therapeutic effects on rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, ulcerative colitis, Crohn's disease, Sjogren's syndrome, Behcet's disease, Castleman's disease and other autoimmune diseases, bacterial infections, and sepsis associated with bacterial infections Is done.
本発明について、以下具体的に説明する。
本発明で言う白血球の少なくとも一部を除去するフィルター担体とは、織布、不織布、綿状繊維集合体、粒子集合体、スポンジ状多孔体等の形態を持ち、これらのフィルター担体の持つ空間に白血球含有液を流したときに、白血球がこれらの素材表面に接触し、白血球の少なくとも一部がフィルター担体の表面や物理的な孔構造の一部に粘着、吸着などの機序で捕捉されるものであって、その表面がエチレン−ビニルアルコール共重合体によって被覆処理されていないものをいう。フィルター担体の詳細については、後述する。
The present invention will be specifically described below.
The filter carrier that removes at least a part of the white blood cells referred to in the present invention is in the form of woven fabric, nonwoven fabric, cotton-like fiber aggregate, particle aggregate, sponge-like porous body, etc. When the leukocyte-containing solution is flowed, the leukocytes come into contact with the surface of these materials, and at least some of the leukocytes are trapped on the surface of the filter carrier or part of the physical pore structure by a mechanism such as adhesion or adsorption. It means that whose surface is not coated with an ethylene-vinyl alcohol copolymer. Details of the filter carrier will be described later.
本発明で言うエチレン−ビニルアルコール共重合体とは、エチレンとビニルアルコールの共重合体であるが、一般的には酢酸ビニルモノマーとエチレンを共重合させて得られるエチレン−酢酸ビニル共重合体を鹸化して製造される。
エチレン−ビニルアルコール系共重合体は、ランダム、ブロック、グラフト等いずれのタイプの共重合体であっても良いが、該共重合体のエチレン含量は２０ｍｏｌ％以上７０ｍｏｌ％以下の範囲にある必要がある。疎水的な性質を持つエチレン含量が２０ｍｏｌ％未満では、フィルター担体に対する接着性が低くなる傾向にあり、フィルター担体とエチレン−ビニルアルコール共重合体被覆層の剥離が起こる危険性が高まる。又、７０ｍｏｌ％を越えると被覆層の親水性が失われる傾向にあり、非選択的な吸着が増加するなど好ましくない性質を示す。接着性と親水性のバランスから更に好ましいのは２５〜５０ｍｏｌ％であり、２９〜４４ｍｏｌ％が最も好ましい。
The ethylene-vinyl alcohol copolymer referred to in the present invention is a copolymer of ethylene and vinyl alcohol. Generally, an ethylene-vinyl acetate copolymer obtained by copolymerizing a vinyl acetate monomer and ethylene is used. Manufactured by saponification.
The ethylene-vinyl alcohol copolymer may be any type of copolymer such as random, block, and graft, but the ethylene content of the copolymer needs to be in the range of 20 mol% to 70 mol%. is there. If the ethylene content having a hydrophobic property is less than 20 mol%, the adhesion to the filter carrier tends to be low, and the risk of peeling of the filter carrier and the ethylene-vinyl alcohol copolymer coating layer increases. On the other hand, if it exceeds 70 mol%, the hydrophilicity of the coating layer tends to be lost, and unfavorable properties such as increased non-selective adsorption are exhibited. More preferably, it is 25-50 mol% from the balance of adhesiveness and hydrophilicity, and 29-44 mol% is the most preferable.
本発明で用いるエチレン−ビニルアルコール共重合体の重量平均分子量（Ｍｗ）の範囲としては１万以上３００万以下であることが好ましい。Ｍｗが１万未満の場合、滅菌処理、特に放射線滅菌処理を実施した際にポリマーの分子量が低下し、水に対する溶出量が増加するため好ましくない。またＭｗが３００万を超えると、コーティングする際の溶剤への溶解度が低下する、また重合の際、安定して製造できないなどの懸念があり好ましくない。より好ましくは２万以上２００万以下である。なお、Ｍｗは種々の公知の方法により求められるが、本発明においてはポリエチレンオキサイドを標準とするゲルパーミエーションクロマトグラフィー（以下、「ＧＰＣ」と略す）による測定を採用している。 The range of the weight average molecular weight (Mw) of the ethylene-vinyl alcohol copolymer used in the present invention is preferably 10,000 to 3,000,000. When Mw is less than 10,000, the molecular weight of the polymer decreases and the elution amount with respect to water increases when sterilization treatment, particularly radiation sterilization treatment is performed. On the other hand, if Mw exceeds 3 million, there is a concern that the solubility in a solvent at the time of coating decreases, and that stable production cannot be achieved during polymerization. More preferably, it is 20,000 to 2,000,000. In addition, although Mw is calculated | required by various well-known methods, the measurement by the gel permeation chromatography (henceforth "GPC") which uses polyethylene oxide as a standard is employ | adopted in this invention.
本発明のフィルター材は、白血球含有液を濾過し得る細孔を有し、白血球の少なくとも一部を除去するフィルター担体にエチレン−ビニルアルコール共重合体を被覆しているものである。また、本発明に係る炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得る方法で使用するフィルター材は、白血球の少なくとも一部を除去する性能を有するフィルター材の表面がエチレン−ビニルアルコール共重合体であればどのようなフィルター材であっても良く、例えば、フィルター担体の表面がエチレン−ビニルアルコール共重合体で被覆されたフィルター材の他、フィルター材そのものがエチレン−ビニルアルコール共重合体から成る不織布または粒子なども含まれる。 The filter material of the present invention has pores through which a leukocyte-containing liquid can be filtered, and a filter carrier that removes at least a part of leukocytes is coated with an ethylene-vinyl alcohol copolymer. Further, the filter material used in the method for obtaining a leukocyte-containing solution with suppressed inflammatory cytokine production according to the present invention is such that the surface of the filter material having the ability to remove at least part of leukocytes is an ethylene-vinyl alcohol copolymer. Any filter material may be used. For example, in addition to a filter material in which the surface of the filter carrier is coated with an ethylene-vinyl alcohol copolymer, the filter material itself is made of an ethylene-vinyl alcohol copolymer. Nonwoven fabric or particles are also included.
本発明のエチレン−ビニルアルコール共重合体をフィルター担体に被覆する方法は、フィルター担体の細孔を著しく閉塞させることなく、かつフィルター担体表面が著しく露出することなく均一に被覆できる方法であれば特に制限はなく各種の方法を用いることができる。例えば、エチレン−ビニルアルコール共重合体を溶解した溶液にフィルター担体を含浸させる方法、エチレン−ビニルアルコール共重合体を溶解した溶液をフィルター担体に吹き付ける方法、モノマーをフィルター担体表面にグラフト重合させる方法などが挙げられる。この中でもエチレン−ビニルアルコール共重合体を溶解した溶液にフィルター担体を含浸させる方法は、コーティング層を均一にでき、コストも低いことより好ましい方法である。即ち、フィルター担体を、水混和性有機溶剤単独又は、水混和性有機溶剤と水との混合溶剤に溶解したエチレン−ビニルアルコール共重合体溶液にフィルター担体を浸漬し、その後フィルター担体から余分な溶液を除去した後、乾燥する方法である。 The method of coating the filter carrier with the ethylene-vinyl alcohol copolymer of the present invention is particularly suitable if it can be uniformly coated without significantly blocking the pores of the filter carrier and without significantly exposing the surface of the filter carrier. There are no restrictions and various methods can be used. For example, a method in which a filter carrier is impregnated with a solution in which an ethylene-vinyl alcohol copolymer is dissolved, a method in which a solution in which an ethylene-vinyl alcohol copolymer is dissolved is sprayed on the filter carrier, a method in which a monomer is graft-polymerized on the surface of the filter carrier, etc. Is mentioned. Among these, the method of impregnating the filter carrier with a solution in which the ethylene-vinyl alcohol copolymer is dissolved is more preferable because the coating layer can be made uniform and the cost is low. That is, the filter carrier is immersed in an ethylene-vinyl alcohol copolymer solution dissolved in a water-miscible organic solvent alone or in a mixed solvent of a water-miscible organic solvent and water, and then an excess solution is removed from the filter carrier. And then drying.
エチレン−ビニルアルコール共重合体を溶解させる有機溶剤は水混和性有機溶剤であり、該溶剤の沸点以下の温度で水に対する溶解度が２０重量％以上を示し、かつヒルデブランドの溶解度パラメーターが９．５（ｃａｌ・ｃｍ-3）1/2以上の有機溶剤が好ましい。ここでヒルデブランドの溶解度パラメーターとは、Ｊ．Ｈ．Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ，Ｒ．Ｌ．Ｓｃｏｔｔ“Ｔｈｅ Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｎｅｌｅｃｔｒｏｙｔｅｓ，３ｒｄ Ｅｄ．”（Ｄｏｖｅｒ Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されているδ値をいい、（１）式により算出できる。
σ ＝ （Ｅ／Ｖ） 1/2 ・・・（１）
ここで、Ｅは凝集エネルギー（ｃａｌ ｍｏｌ-1）であり、Ｖはモル体積（ｃｍ3 ｍｏｌ-1）である。
The organic solvent in which the ethylene-vinyl alcohol copolymer is dissolved is a water-miscible organic solvent, the solubility in water is 20% by weight or more at a temperature below the boiling point of the solvent, and the Hildebrand solubility parameter is 9.5. An organic solvent of (cal · cm −3 ) 1/2 or more is preferable. Here, the solubility parameter of Hildebrand is defined as “J. H. Hildebrand, R.A. L. The δ value described in Scott “The Solubility of Nonelectrolytes, 3rd Ed.” (Dover Pub., New York) is used, and can be calculated by the equation (1).
σ = (E / V) 1/2 (1)
Here, E is the cohesive energy (cal mol −1 ), and V is the molar volume (cm 3 mol −1 ).
好ましい有機溶剤の例としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔ−ブタノール、シクロヘキサノール等のアルコール類、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール類、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ホルムアミド、エチレンクロルヒドリン等が挙げられる。これらの中でもn−プロパノール、エタノール、及びジメチルスルホキシドはエチレン−ビニルアルコール共重合体の溶解性も良く、低毒性であることから特に好ましい。 Examples of preferable organic solvents include alcohols such as methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, sec-butanol, t-butanol and cyclohexanol, polyhydric alcohols such as ethylene glycol, propylene glycol and glycerin, tetrahydrofuran and dioxane. Dimethylformamide, dimethylsulfoxide, dimethylacetamide, formamide, ethylene chlorohydrin and the like. Among these, n-propanol, ethanol, and dimethyl sulfoxide are particularly preferable because the ethylene-vinyl alcohol copolymer has good solubility and low toxicity.
これらの有機溶剤は単独でも用いられるが、混和溶剤系でも用いることができ、特に水との混和溶剤系は好ましい。エチレン−ビニルアルコール共重合体は非極性で疎水性を示すエチレン部分と、極性で親水性のビニルアルコール部分とで構成されている。極性の強い溶剤系に溶解させ、例えば非極性で疎水性のフィルター担体に被覆した場合、非極性のエチレン部分がフィルター担体側に局在し、極性のビニルアルコール部分が表面側に局在しやすいと考えられる。この現象は被覆層とフィルター担体の接着性が向上し、かつ被覆層表面の親水性が向上することから好ましい現象である。上記の有機溶剤に水を加え混合溶剤系とすることは溶剤の極性をより強くすることになり、上記現象が促進され好ましい。加える水の割合はエチレン−ビニルアルコール共重合体の溶解性を阻止しない範囲内で大きい方が好ましく、エチレン−ビニルアルコール系共重合体のエチレン含量、溶液の温度等によりその割合は異なるが、例えば５〜６０重量％が好ましい範囲として挙げられる。 These organic solvents can be used alone, but can also be used in a mixed solvent system, and a mixed solvent system with water is particularly preferable. The ethylene-vinyl alcohol copolymer is composed of a non-polar and hydrophobic ethylene portion and a polar and hydrophilic vinyl alcohol portion. When dissolved in a strongly polar solvent system, for example, when coated on a non-polar and hydrophobic filter carrier, the non-polar ethylene moiety is localized on the filter carrier side and the polar vinyl alcohol moiety is likely to be localized on the surface side. it is conceivable that. This phenomenon is a preferable phenomenon because the adhesion between the coating layer and the filter carrier is improved and the hydrophilicity of the coating layer surface is improved. It is preferable to add water to the above organic solvent to form a mixed solvent system because the polarity of the solvent is further increased and the above phenomenon is promoted. The ratio of water to be added is preferably large within a range not inhibiting the solubility of the ethylene-vinyl alcohol copolymer, and the ratio varies depending on the ethylene content of the ethylene-vinyl alcohol copolymer, the temperature of the solution, etc. A preferable range is 5 to 60% by weight.
被覆に用いるエチレン−ビニルアルコール共重合体濃度は被覆に適した任意の濃度を選択できるが、例えば０．００５〜１０重量％程度の濃度が適している。溶液濃度が０．００５重量％未満であると表面に被覆されるポリマーが少なくなるため好ましくない。一方１０重量％以上の場合、溶液粘度が高くなり取り扱い性が低下するため好ましくない。上記の観点より、さらに好ましくは、溶液濃度は０．０２重量％以上５重量％未満である。 The ethylene-vinyl alcohol copolymer concentration used for coating can be selected from any concentration suitable for coating, but for example, a concentration of about 0.005 to 10% by weight is suitable. If the solution concentration is less than 0.005% by weight, the amount of polymer coated on the surface decreases, which is not preferable. On the other hand, the case of 10% by weight or more is not preferable because the solution viscosity becomes high and the handleability is lowered. From the above viewpoint, the solution concentration is more preferably 0.02 wt% or more and less than 5 wt%.
被覆に用いるエチレン−ビニルアルコール共重合体溶液の温度は特に限定されるものではないが、一般に高温の方がエチレン−ビニルアルコール共重合体の溶解性は良く、溶液の粘度も低下するため好ましく、室温から１００℃までの範囲が好ましい。 The temperature of the ethylene-vinyl alcohol copolymer solution used for coating is not particularly limited, but in general, a higher temperature is preferable because the solubility of the ethylene-vinyl alcohol copolymer is better and the viscosity of the solution also decreases. A range from room temperature to 100 ° C is preferred.
被覆処理はフィルター担体を一定の形状に切断してバッチ式に処理することもできるが、連続したフィルター担体を長手方向に走行させ連続的に処理することもでき、後者は生産性に優れた好ましい方法である。被覆処理は一回の処理で完結しても良いが、比較的低濃度で数回の処理を繰り返すこともできる。 The coating treatment can be performed batchwise by cutting the filter carrier into a certain shape, but the continuous filter carrier can be run continuously in the longitudinal direction, and the latter is preferably excellent in productivity. Is the method. The coating process may be completed by a single process, but the process can be repeated several times at a relatively low concentration.
被覆処理に用いるエチレン−ビニルアルコール共重合体溶液の乾燥方法は通常の乾燥方法、例えば真空乾燥、熱風乾燥等を使用することができ、連続したフィルター担体を走行状態で連続的に乾燥することもできる。乾燥温度は特に限定されるものではないが、支持体が熱により変形を受けない温度であれば良い。 As a drying method of the ethylene-vinyl alcohol copolymer solution used for the coating treatment, a normal drying method such as vacuum drying or hot air drying can be used, and a continuous filter carrier can be continuously dried in a running state. it can. The drying temperature is not particularly limited as long as the temperature at which the support is not deformed by heat.
また、被覆処理の前に、エチレン−ビニルアルコール共重合体とフィルター担体との接着性をより高めるため、フィルター担体の表面を酸、アルカリなどの適当な薬品で処理したり、プラズマを照射したりすることもできる。更に、エチレン−ビニルアルコール共重合体の被覆処理後に１００℃以上の熱を加える熱処理や、１００Ｇｙ以上のγ線、電子線などの放射線を照射する後加工を施し、フィルター担体とエチレン−ビニルアルコール共重合体との接着性を更に強化することもできる。 In addition, in order to further improve the adhesion between the ethylene-vinyl alcohol copolymer and the filter carrier before the coating treatment, the surface of the filter carrier is treated with an appropriate chemical such as acid or alkali, or plasma is irradiated. You can also Further, after the coating treatment of the ethylene-vinyl alcohol copolymer, a heat treatment in which a heat of 100 ° C. or more is applied, or a post-processing to irradiate a radiation such as a γ ray or an electron beam of 100 Gy or more is performed. The adhesiveness with the polymer can be further strengthened.
このようにして被覆したフィルター担体表面の被覆層の平均厚みは４０オングストローム以上１μｍ以下が好ましく、被覆量はフィルター担体の単位表面積あたり０．２ｍｇ／ｍ2以上２００ｍｇ／ｍ2 以下であることが好ましい。平均厚みが４０オングストローム未満、或いは被覆量が０．２ｍｇ／ｃｍ2未満では炎症性サイトカイン産生が抑制されなくなる傾向にあるので好ましくない。平均厚みが１μｍを超える、或いは被覆量が２００ｍｇ／ｍ2 を超えるとフィルター担体の細孔が閉塞してしまう部分が生じたり、コストが高くなったりするため好ましくない。被覆層の平均厚みは４０〜８００オングストローム、被覆量は０．５ｍｇ〜１００ｍｇ／ｍ2であることがより好ましく、更に、被覆層の平均厚みは４０〜６００オングストローム、被覆量は０．７ｍｇ〜５０ｍｇ／ｍ2であることが更に好ましく、平均厚みは４０〜６００オングストローム、被覆量は１ｍｇ〜２０ｍｇ／ｍ2であることが最も望ましい。被覆層の平均厚みは、オージェ電子分光法（ＡＥＳ）、二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ）、電子プローブ微小部分析法（ＥＰＭＡ）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）、多重全反射赤外線分光計を用いる赤外線吸光光度法（ＡＴＲ−ＩＲ）などの表面分析方法によって測定することができる。 The average thickness of the coating layer on the surface of the filter carrier thus coated is preferably 40 angstroms or more and 1 μm or less, and the coating amount is preferably 0.2 mg / m 2 or more and 200 mg / m 2 or less per unit surface area of the filter carrier. . An average thickness of less than 40 angstroms or a coating amount of less than 0.2 mg / cm 2 is not preferable because the production of inflammatory cytokines tends to be suppressed. If the average thickness exceeds 1 μm, or the coating amount exceeds 200 mg / m 2 , it is not preferable because the pores of the filter carrier are clogged and the cost is increased. The average thickness of the coating layer is more preferably 40 to 800 angstroms and the coating amount is preferably 0.5 mg to 100 mg / m 2 , and the average thickness of the coating layer is 40 to 600 angstroms and the coating amount is 0.7 mg to 50 mg. / more preferably m is 2, the average thickness of 40 to 600 Å, the coating amount is most preferably a 1Mg～20mg / m 2. The average thickness of the coating layer is Auger electron spectroscopy (AES), secondary ion mass spectrometry (SIMS), electron probe microanalysis (EPMA), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), scanning electron microscope (SEM) It can be measured by a surface analysis method such as infrared spectrophotometry (ATR-IR) using a multiple total reflection infrared spectrometer.
本発明の被覆量は次のように測定する。即ち、前述した方法で被覆された不織布から任意の円形状に切り抜いたフィルターの重量を電子天秤で秤量する。次いで秤量後のフィルター材を評価ポリマーの良溶媒約１００ｍＬ中に浸漬させ、６０〜７０℃の恒温槽中で１〜２時間振蕩する。浸漬処理後、取り出したフィルター材を６０〜７０℃の乾燥機中で２時間程度、恒量になるまで乾燥する。なお、この処理によりフィルター材に評価ポリマーが残っていないことをＮＭＲ測定等で確認することもできる。乾燥後のフィルター材を電子天秤で秤量することにより被覆に用いられたエチレン−ビニルアルコール共重合体量が算出できる。次いで、フィルター担体の表面積の測定を行う。単位面積あたりのフィルター担体の表面積はＢＥＴ法、Ｌａｎｇｍｕｒｉ法等公知の方法を用いて測定することができる。フィルター担体が繊維の場合は平均繊維径値及び繊維比重値等を用いて計算により求めることも可能である。これらの数値をもとに、（２）式に従い評価試料の被覆量を算出することができる。
被覆量（ｍｇ／ｍ2）＝（浸漬処理前フィルター材の重量（ｍｇ）−浸漬処理後乾燥済フィルター材の重量（ｍｇ））／〔（浸漬処理後乾燥済フィルター材の重量（ｇ））×（フィルター担体１ｇ当たりの全表面積（ｍ2／ｇ））〕・・・（２）
The coating amount of the present invention is measured as follows. That is, the weight of the filter cut into an arbitrary circular shape from the nonwoven fabric coated by the above-described method is weighed with an electronic balance. Next, the weighed filter material is immersed in about 100 mL of a good solvent for the polymer to be evaluated, and shaken in a constant temperature bath at 60 to 70 ° C. for 1 to 2 hours. After the immersion treatment, the taken out filter material is dried in a dryer at 60 to 70 ° C. for about 2 hours until the weight becomes constant. In addition, it can also confirm by NMR measurement etc. that the evaluation polymer does not remain in a filter material by this process. The amount of ethylene-vinyl alcohol copolymer used for coating can be calculated by weighing the dried filter material with an electronic balance. Next, the surface area of the filter carrier is measured. The surface area of the filter carrier per unit area can be measured using a known method such as the BET method or the Langmuri method. When the filter carrier is a fiber, it can be obtained by calculation using an average fiber diameter value, a fiber specific gravity value, and the like. Based on these numerical values, the coating amount of the evaluation sample can be calculated according to the equation (2).
Covering amount (mg / m 2 ) = (weight of filter material before immersion treatment (mg) −weight of filter material dried after immersion treatment (mg)) / [(weight of filter material dried after immersion treatment (g)) X (total surface area per gram of filter carrier (m 2 / g))] (2)
また、被覆処理されていない不織布について同様に被覆量の算出を行い、そこで得られた値を（１）の被覆量から差し引くことにより、より精密に測定を行うことが可能である。 Moreover, it is possible to measure more precisely by calculating the coating amount in the same manner for a non-coated nonwoven fabric and subtracting the value obtained from the coating amount of (1).
本発明のフィルター担体とは、白血球含有液を濾過し得る細孔を有し、白血球の少なくとも一部を除去するものであれば特に限定はなく、何れの形態を有する物も含まれるが、以下に代表例を説明する。 The filter carrier of the present invention is not particularly limited as long as it has pores capable of filtering the leukocyte-containing liquid and removes at least a part of leukocytes, and includes any form. A typical example will be described.
不織布、織布、綿状繊維集合体などの繊維状媒体をフィルター担体とする場合、平均繊維直径は０．５μｍ以上５０μｍ以下が好ましく、より好ましくは０．５μｍ以上２０μｍ以下である。また、平均孔径は２μｍ以上２００μｍ以下が好ましく、より好ましくは２μｍ以上１００μｍ以下である。更に嵩密度は０．０５ｇ／ｃｍ3以上０．５ｇ／ｃｍ3以下であることが好ましく、より好ましくは０．０７ｇ／ｃｍ3以上０．２５ｇ／ｃｍ3以下である。平均繊維直径が０．５μｍ未満、平均孔径が２μｍ未満、嵩密度が０．５ｇ／ｃｍ3 を超えると血球の目詰まりや圧力損失の増大を引き起こし易くなる傾向があり、好ましくない。また、平均繊維直径が５０μｍを超え、平均孔径が２００μｍを超え、嵩密度が０．０５ｇ／ｃｍ3未満になると白血球を捕捉できなくなる傾向にあるため好ましくない。 When a fibrous medium such as a nonwoven fabric, woven fabric, or cotton-like fiber aggregate is used as a filter carrier, the average fiber diameter is preferably 0.5 μm or more and 50 μm or less, more preferably 0.5 μm or more and 20 μm or less. The average pore diameter is preferably 2 μm or more and 200 μm or less, and more preferably 2 μm or more and 100 μm or less. Furthermore the bulk density is preferably not more than 0.05 g / cm 3 or more 0.5 g / cm 3, more preferably 0.07 g / cm 3 or more 0.25 g / cm 3 or less. If the average fiber diameter is less than 0.5 μm, the average pore diameter is less than 2 μm, and the bulk density exceeds 0.5 g / cm 3 , it tends to cause clogging of blood cells and an increase in pressure loss, which is not preferable. Further, when the average fiber diameter exceeds 50 μm, the average pore diameter exceeds 200 μm, and the bulk density is less than 0.05 g / cm 3 , leukocytes cannot be captured, which is not preferable.
なお、本発明における平均繊維直径とは、以下の方法に従って求められる値をいう。即ち、フィルター支持体を構成する繊維状媒体から実質的に均一と認められる部分をサンプリングし、走査電子顕微鏡などを用いて、写真に撮る。サンプリングに際しては、繊維体の有効濾過断面部分を、一辺が０．５ｃｍの正方形によって区分し、その中から６ケ所をランダムサンプリングする。ランダムサンプリングするには、例えば上記各部分に番地を指定した後、乱数表を使うなどの方法で、必要箇所の区分を選べば良い。またサンプリングした各区分について、３ケ所以上好ましくは５ケ所以上を拡大倍率２５００倍で写真に撮る。サンプリングした各区分について中央部分及びその近傍の箇所の写真を撮っていき、その写真に撮られた繊維の合計本数が１００本を超えるまで写真を撮る。ここで直径とは、繊維軸に対して直角方向の繊維の幅をいう。測定した全ての繊維の直径の和を、繊維の数で割った値を平均繊維直径とする。但し、複数の繊維が重なり合っており、他の繊維の陰になってその幅が測定できない場合、また複数の繊維が溶融するなどして、太い繊維になっている場合、更に著しく直径の異なる繊維が混在している場合、等の場合には、これらのデータは削除する。 In addition, the average fiber diameter in this invention means the value calculated | required according to the following method. That is, a portion that is recognized as being substantially uniform is sampled from the fibrous medium constituting the filter support, and photographed using a scanning electron microscope or the like. At the time of sampling, the effective filtration cross-section portion of the fibrous body is divided by a square having a side of 0.5 cm, and 6 locations are randomly sampled. In order to perform random sampling, for example, after specifying an address for each of the above parts, a classification of necessary portions may be selected by using a random number table or the like. Further, for each sampled section, a photograph is taken at a magnification of 2500 at 3 or more, preferably 5 or more. For each sampled section, take a picture of the central part and its vicinity, and take pictures until the total number of fibers taken in the picture exceeds 100. Here, the diameter means the width of the fiber in the direction perpendicular to the fiber axis. A value obtained by dividing the sum of the diameters of all the measured fibers by the number of fibers is defined as an average fiber diameter. However, when multiple fibers overlap each other and their width cannot be measured behind other fibers, or when multiple fibers melt and become thick fibers, fibers with significantly different diameters If there is a mixture of these, these data are deleted.
また、本発明におけるフィルター担体の平均孔径とは、水銀ポロシメーター（島津製作所、ポアサイザ９３２０または同等の装置）で測定した値であり、水銀がフィルター担体の細孔に全く入っていない状態を水銀圧入量０％、フィルター担体の全ての細孔に入っている状態を水銀圧入量１００％とした時、水銀圧入量５０％にあたる点が本発明でいう平均孔径である。尚、水銀ポロシメーターでの測定は１〜２６５０ｐｓｉａの圧力範囲で測定する。 In addition, the average pore diameter of the filter carrier in the present invention is a value measured with a mercury porosimeter (Shimadzu Corporation, Pore Sizer 9320 or an equivalent device), and a state where mercury is not contained in the pores of the filter carrier at all. The average pore diameter referred to in the present invention is that the amount of mercury intrusion is 50% when the state of 0% and mercury intrusion amount is 100%. In addition, the measurement with a mercury porosimeter is measured in the pressure range of 1-2650 psia.
また、本発明のおける嵩密度とは、繊維重量（ｇ）を繊維のかたまりが占める体積（ｃｍ3）で割った値（ｇ／ｃｍ3）である。 The bulk density in the present invention is a value (g / cm 3 ) obtained by dividing the fiber weight (g) by the volume (cm 3 ) occupied by the fiber mass.
連続孔を有するスポンジ状多孔体をフィルター担体とする場合には、２μｍ以上２００μｍ以下の平均孔径を有することが好ましく、２μｍ以上１００μｍ以下の平均孔径を有することが更に好ましい。平均孔径が２μｍ未満であると血球目詰まりや圧力損失の増大を引き起こし好ましくない。また、平均孔径が２００μｍを超えると白血球を捕捉できなくなる傾向にあるため好ましくない。 When a sponge-like porous body having continuous pores is used as a filter carrier, it preferably has an average pore size of 2 μm to 200 μm, and more preferably 2 μm to 100 μm. An average pore size of less than 2 μm is not preferable because it causes clogging of blood cells and an increase in pressure loss. Further, if the average pore diameter exceeds 200 μm, it tends to be impossible to capture leukocytes, which is not preferable.
粒子集合体をフィルター担体とする場合には、粒子は０．１ｍｍ以上５ｍｍ以下の球相当直径を有することが好ましく、０．５ｍｍ以上３ｍｍ以下の球相当直径を有することが更に好ましい。ここで粒子の球相当直径とは、体積が同一の球を想定したときのその球の直径をいう。粒子の球相当直径が０．１ｍｍ未満であると白血球含有液の移送に高い圧力を要し、それにより溶血を引き起こす傾向にある。また、血栓の生成による目詰まりを引き起こす可能性が高くなるため好ましくない。一方、粒子の球相当直径が５ｍｍより大きいと単位体積あたりの表面積が減少するので処理効率が低下する傾向になるため好ましくない。粒子径は、ふるい法、遠心沈降法、レーザー回折散乱法、動的光散乱法、画像処理、細孔電気抵抗法等の方法によって測定することができる。例えば細孔電気抵抗法は以下のようにして測定する方法である。即ち、電解質溶液（電解質の溶けた水溶液または有機溶剤）中の小さな径の細孔（アパチャー）に一定の電流を流し、その系の電気抵抗を計測する。電解質溶液中に粒子を均一に懸濁させ、陰圧により粒子が細孔を通過するようにする。粒子が細孔を通過することによって排除された電解液の体積により変化する細孔の電気抵抗（インピーダンス）が電圧パルスの変化によって計測される。この電圧パルス高を計測処理して、粒子の体積分布ヒストグラムを得ることができる。 When the particle aggregate is used as a filter carrier, the particles preferably have a sphere equivalent diameter of 0.1 mm to 5 mm, and more preferably have a sphere equivalent diameter of 0.5 mm to 3 mm. Here, the sphere equivalent diameter of a particle means the diameter of the sphere when assuming a sphere having the same volume. When the equivalent sphere diameter of the particles is less than 0.1 mm, a high pressure is required for the transfer of the leukocyte-containing liquid, thereby tending to cause hemolysis. Moreover, since possibility that the clogging by the production | generation of a thrombus will be caused becomes high, it is not preferable. On the other hand, when the equivalent sphere diameter of the particles is larger than 5 mm, the surface area per unit volume is decreased, so that the processing efficiency tends to be lowered, which is not preferable. The particle diameter can be measured by methods such as a sieving method, centrifugal sedimentation method, laser diffraction scattering method, dynamic light scattering method, image processing, pore electrical resistance method and the like. For example, the pore electrical resistance method is a method of measuring as follows. That is, a constant current is passed through small pores (apertures) in an electrolyte solution (aqueous solution or organic solvent in which the electrolyte is dissolved), and the electrical resistance of the system is measured. The particles are uniformly suspended in the electrolyte solution, and the negative pressure causes the particles to pass through the pores. The electrical resistance (impedance) of the pores, which varies with the volume of the electrolyte removed by passing the particles through the pores, is measured by the change in voltage pulse. By measuring the voltage pulse height, a particle volume distribution histogram can be obtained.
本発明のフィルター担体の材質としては、血球にダメージを与えにくいものであれば特に限定はなく各種のものを用いることができ、有機高分子、無機物、金属等が例として挙げられる。その中でも有機高分子は切断等の加工性に優れるため好ましい素材である。有機高分子としては、例えば、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、セルロース、セルロースアセテート、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、ポリトリフルオロエチレン、ポリトリフルオロクロロビニル、フッ化ビニリデン−テトラフルオロエチレン共重合体、ポリ（メタ）アクリレート、ブタジエン−アクリロニトリルコポリマー、ポリエーテル−ポリアミドブロック共重合体等が挙げられるが、本発明のフィルター担体は上記例示に限定されるものではない。 The material of the filter carrier of the present invention is not particularly limited as long as it does not easily damage blood cells, and various materials can be used, and examples thereof include organic polymers, inorganic substances, metals, and the like. Among them, an organic polymer is a preferable material because it has excellent processability such as cutting. Examples of the organic polymer include polyurethane, polyacrylonitrile, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, polystyrene, polysulfone, polyethersulfone, cellulose, cellulose acetate, cellulose diacetate, cellulose triacetate, polyethylene, polypropylene, polyethylene terephthalate, polybutylene terephthalate, Polyvinyl fluoride, polyvinylidene fluoride, nylon, polytrifluoroethylene, polytrifluorochlorovinyl, vinylidene fluoride-tetrafluoroethylene copolymer, poly (meth) acrylate, butadiene-acrylonitrile copolymer, polyether-polyamide block copolymer Examples of the filter carrier of the present invention are not limited to the above examples.
また、本発明のエチレン−ビニルアルコール不織布、および／または粒子とは、エチレン−ビニルアルコール共重合体よりなる不織布および／または粒子のことで、フィルター材そのものがエチレン−ビニルアルコール共重合体からなるから被覆処理する必要がなく、そのままで炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得るためのフィルター材として好適に用いることができる。 The ethylene-vinyl alcohol nonwoven fabric and / or particles of the present invention are nonwoven fabrics and / or particles made of an ethylene-vinyl alcohol copolymer, and the filter material itself is made of an ethylene-vinyl alcohol copolymer. It can be suitably used as a filter material for obtaining a leukocyte-containing liquid in which inflammatory cytokine production is suppressed as it is without the need for a coating treatment.
上述した炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得るためのフィルター材を、入口と出口とを有する適当な大きさの容器に充填することにより、炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得るためのフィルター装置とすることができる。容器形状としては、入口と出口を有する容器であれば特に限定はないが、フィルター材の形状に応じた形状であることが好ましい。例えば、フィルター材が平板状の場合には、四角形、六角形などの多角形や、円形、楕円形などの曲線からなる扁平形状であればよい。より詳細には、容器は入口側容器と出口側容器から構成され、両者がフィルター材を直接あるいは支持体を介して挟み込むことによりフィルター内部を二室に分け、扁平状のフィルター装置を形成するような形状であれば好ましい。また、別の例として、フィルター材が円筒状の場合には、容器も同様に円筒状であることが好ましい。より詳細には、容器は、フィルター材を収容する筒状胴部と入口を有する入口側ヘッダーおよび出口を有する出口側ヘッダーから構成され、ポッティング加工により、容器内部が入口から導入された白血球含有液が円筒状のフィルター材の外周部から内周部（または内周部から外周部）に流れるように二室に分け、円筒状のフィルター装置を形成するような形状であれば好ましい。 A leukocyte-containing solution in which the production of inflammatory cytokines is suppressed by filling the above-mentioned filter material for obtaining a leukocyte-containing solution in which inflammatory cytokine production is suppressed into a container of an appropriate size having an inlet and an outlet. To obtain a filter device. The shape of the container is not particularly limited as long as it is a container having an inlet and an outlet, but is preferably a shape corresponding to the shape of the filter material. For example, when the filter material is flat, it may be a flat shape made of a polygon such as a quadrangle or a hexagon, or a curve such as a circle or an ellipse. More specifically, the container is composed of an inlet-side container and an outlet-side container, and both of them divide the inside of the filter into two chambers by sandwiching the filter material directly or via a support so as to form a flat filter device. Any shape is preferable. As another example, when the filter material is cylindrical, the container is preferably cylindrical as well. More specifically, the container is composed of a cylindrical body portion that stores the filter material, an inlet-side header having an inlet, and an outlet-side header having an outlet, and the inside of the container is introduced from the inlet by potting. Is preferably divided into two chambers so as to flow from the outer peripheral portion of the cylindrical filter material to the inner peripheral portion (or from the inner peripheral portion to the outer peripheral portion) to form a cylindrical filter device.
前記容器の材質は、硬質性樹脂や可撓性樹脂の何れでも良く、硬質性樹脂の場合、素材はフェノール樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、ホルムアルデヒド樹脂、尿素樹脂、ケイ素樹脂、ＡＢＳ樹脂、ポリアミド、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、スチレン−ブタジエン共重合体等が挙げられる。可撓性樹脂の場合、可撓性の合成樹脂製のシート状または円筒状成型物から形成されるのが好ましく、素材は軟質ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリエチレンやポリプロピレンのようなポリオレフィン、スチレン−ブタジエン−スチレン共重合体の水添物、スチレン−イソプレン−スチレン共重合体またはその水添物等の熱可塑性エラストマー、および熱可塑性エラストマーとポリオレフィン、エチレン−エチルアクリレート等の軟化剤との混合物等が好適な材料として挙げられる。 The material of the container may be either a hard resin or a flexible resin. In the case of a hard resin, the material is phenol resin, acrylic resin, epoxy resin, formaldehyde resin, urea resin, silicon resin, ABS resin, polyamide, Examples thereof include polyurethane, polycarbonate, polyvinyl chloride, polyethylene, polypropylene, polysulfone, polyethylene terephthalate, polybutylene terephthalate, and styrene-butadiene copolymer. In the case of a flexible resin, it is preferably formed from a sheet or cylindrical molded product made of a flexible synthetic resin, and the material is soft polyvinyl chloride, polyurethane, ethylene-vinyl acetate copolymer, polyethylene or polypropylene. Such as polyolefins, hydrogenated products of styrene-butadiene-styrene copolymers, thermoplastic elastomers such as styrene-isoprene-styrene copolymers or hydrogenated products thereof, and thermoplastic elastomers and polyolefins, ethylene-ethyl acrylate, etc. A suitable material is a mixture with a softening agent.
本発明のフィルター材または／およびフィルター装置は、照射滅菌、湿熱滅菌、薬剤滅菌、ガス滅菌、乾熱滅菌等公知の方法で滅菌できるが、プライミング操作が簡便に実施できる点より充填液でフィルター材を飽和含水率以上の湿潤状態に保持し、滅菌することが好ましい。更に好ましくはガンマ線、電子線等の放射線を照射する照射滅菌または高圧蒸気滅菌等の湿熱滅菌により良好に滅菌できる。充填液は、ポリマーの劣化を起こさない液ならば何れの液体も良好に用いられるが、水または生体にとって害の少ない水溶性物質の水溶液であることが望ましい。 The filter material and / or filter device of the present invention can be sterilized by a known method such as irradiation sterilization, wet heat sterilization, drug sterilization, gas sterilization, dry heat sterilization, etc. Is preferably kept in a wet state with a saturated water content or higher and sterilized. More preferably, it can be sterilized satisfactorily by irradiation sterilization in which radiation such as gamma rays or electron beams is irradiated, or by wet heat sterilization such as high-pressure steam sterilization. Any liquid can be used as the filling liquid as long as it does not cause deterioration of the polymer. However, it is desirable that the filling liquid be water or an aqueous solution of a water-soluble substance that is less harmful to a living body.
生体にとって害の少ない水溶性物質とは、塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム等の塩類、グリセリン、クエン酸ナトリウム、ゼラチン、カゼイン等の水溶性有機化合物の様に水に溶ける物質で、しかも生体にとって害の少ない物質であり、多量の場合には生体にとって有害な物質であってもプライミング操作程度の簡単な洗浄操作により、フィルター外に該物質を洗い流す事ができ、少量の残存であれば生体にとって害の少ない物質も含まれる。また、水に溶解させる事によって等張溶液を作り易い物質は特に好ましく用いられる。これらの物質は単独で用いても良く、混合して用いても良い。好ましい水溶性物質の例としては、塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウムであり、最も好ましくは塩化ナトリウムである。飽和含水率以上の湿潤状態とは、フィルター担体が完全に水または生体にとって害の少ない水溶性物質の水溶液に浸漬された状態でも良いし、フィルター担体を前もって充分加湿し、担体自身の飽和含水量以上の湿潤状態にするだけでも良い。要は、少なくともフィルター担体がフィルター担体の飽和含水量と同等かそれよりも余計な水分にさらされていれば良いのであって、その程度は問わない。 Water-soluble substances that are less harmful to the living body are water-soluble substances such as sodium chloride, sodium carbonate, sodium bicarbonate, sodium phosphate, sodium hydrogen phosphate, sodium pyrosulfite, and other salts, glycerin, sodium citrate, gelatin, and casein. A substance that is soluble in water, such as an organic compound, and that is less harmful to the living body. In the case of a large amount, even if it is harmful to the living body, the substance is removed from the filter by a simple cleaning operation similar to the priming operation. If the remaining amount is small, substances that are less harmful to the living body are also included. In addition, a substance that can easily form an isotonic solution by dissolving in water is particularly preferably used. These substances may be used alone or in combination. Examples of preferred water-soluble substances are sodium chloride, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, sodium phosphate, sodium hydrogen phosphate, sodium pyrosulfite, most preferably sodium chloride. The wet state above the saturated water content may be a state in which the filter carrier is completely immersed in water or an aqueous solution of a water-soluble substance that is less harmful to the living body, or the filter carrier is sufficiently humidified in advance and the saturated water content of the carrier itself You may just make it the above moist state. In short, it is sufficient that at least the filter carrier is exposed to moisture equal to or more than the saturated water content of the filter carrier, and the degree thereof does not matter.
好ましい水溶性物質の濃度としては、０重量％以上５．０重量％以下である。濃度が５．０重量％より大きくなると、プライミング操作によって水溶性物質を除去し難くなるため好ましくない。また、濃度が０．０１重量％以上のときポリマーの溶出をより抑制できることから、より好ましくは０．０１重量％以上４．０重量％以下、更に好ましくは０．１重量％以上３．０重量％以下である。 A preferable concentration of the water-soluble substance is 0% by weight or more and 5.0% by weight or less. When the concentration is higher than 5.0% by weight, it is difficult to remove the water-soluble substance by the priming operation. Further, since elution of the polymer can be further suppressed when the concentration is 0.01% by weight or more, it is more preferably 0.01% by weight or more and 4.0% by weight or less, and further preferably 0.1% by weight or more and 3.0% by weight. % Or less.
上述した炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得るためのフィルター装置に、少なくとも単核球を含む白血球含有液を流し、炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得ることができる。 A leukocyte-containing solution containing at least mononuclear cells is allowed to flow through the filter device for obtaining the leukocyte-containing solution in which the production of inflammatory cytokines is suppressed, and a leukocyte-containing solution in which the production of inflammatory cytokines is suppressed can be obtained.
本発明でいう白血球含有液とは、例示すると、全血液、赤血球濃厚液、血小板濃厚液、血漿、或いはこれらを、血液を変性させない緩衝液で希釈した液体等が挙げられる。白血球含有液には、抗凝固剤を添加することができる。抗凝固剤の種類としては、ヘパリンナトリウム、ヘパリンカルシウム、ダルテパリンナトリウム等のヘパリン、あるいは、メシル酸ナファモスタットやメシル酸ガベキサート等の蛋白分解酵素阻害剤、及びクエン酸ナトリウム液、ＡＣＤ−Ａ、ＡＣＤ−Ｂ、ＣＰＤ、等のクエン酸系抗凝固剤等が好適に用いられる。 Examples of the leukocyte-containing solution in the present invention include whole blood, erythrocyte concentrate, platelet concentrate, plasma, or a liquid obtained by diluting these with a buffer that does not denature blood. An anticoagulant can be added to the leukocyte-containing solution. The types of anticoagulants include heparin such as heparin sodium, heparin calcium and dalteparin sodium, or protease inhibitors such as nafamostat mesylate and gabexate mesylate, and sodium citrate solution, ACD-A, ACD Citric acid anticoagulants such as -B and CPD are preferably used.
白血球含有液１Ｌに対する抗凝固剤の注入量としては、例えばヘパリンや低分子量ヘパリンの場合、１００単位以上２０００単位以下、より好ましくは３００単位以上１５００単位以下である。また、メシル酸ナファモスタットの場合、２ｍｇ以上４０ｍｇ以下、より好ましくは６ｍｇ以上３０ｍｇ以下である。また、ＡＣＤ−Ａ、ＡＣＤ−Ｂ液の場合、２０ｍＬ以上１６０ｍＬ以下、より好ましくは３０ｍＬ以上１２５ｍＬ以下の範囲で有効に使用できる。 In the case of heparin or low molecular weight heparin, the injection amount of the anticoagulant for 1 L of leukocyte-containing liquid is, for example, 100 units or more and 2000 units or less, more preferably 300 units or more and 1500 units or less. In the case of nafamostat mesylate, it is 2 mg to 40 mg, more preferably 6 mg to 30 mg. Moreover, in the case of ACD-A and ACD-B liquid, it can be effectively used in the range of 20 mL to 160 mL, more preferably 30 mL to 125 mL.
本発明のフィルター装置に白血球含有液を流す方法としては、例えば、ポンプ等を用いたあらゆる公知の手段を用いることができる。ポンプは、構造としてはローラーポンプ、フィンガーポンプ等が有用に用いられるが、特に本発明では５ｍＬ／ｍｉｎ〜５００ｍＬ／ｍｉｎの流量範囲で精度よく送液できるものが好ましい。白血球含有液の流量範囲としては１０ｍＬ／ｍｉｎ以上２００ｍＬ／ｍｉｎ以下であることがより好ましい。流量が１０ｍＬ／ｍｉｎ未満の場合、フィルター装置内での血球の滞留が起こりやすくなるためあまり好ましくない。一方、２００ｍＬ／ｍｉｎより早い場合、高いずり応力が働くため白血球の活性化等の問題があるため好ましくない。以上の観点より、血液流量の更に好ましい範囲は１５ｍＬ／ｍｉｎ以上１５０ｍＬ／ｍｉｎ以下、最も好ましくは２０ｍＬ／ｍｉｎ以上１００ｍＬ／ｍｉｎ以下である。 As a method for flowing the leukocyte-containing liquid through the filter device of the present invention, for example, any known means using a pump or the like can be used. As the structure of the pump, a roller pump, a finger pump, or the like is usefully used. In the present invention, a pump that can accurately feed liquid in a flow rate range of 5 mL / min to 500 mL / min is preferable. The flow rate range of the leukocyte-containing liquid is more preferably 10 mL / min to 200 mL / min. When the flow rate is less than 10 mL / min, the retention of blood cells in the filter device tends to occur, which is not preferable. On the other hand, when it is faster than 200 mL / min, a high shear stress acts, which causes problems such as leukocyte activation, which is not preferable. From the above viewpoint, a more preferable range of the blood flow rate is 15 mL / min or more and 150 mL / min or less, and most preferably 20 mL / min or more and 100 mL / min or less.
本発明の炎症性サイトカイン産生が抑制された白血球含有液を得るためのフィルター装置は白血球含有液から白血球の少なくとも一部を除去することを特徴とする。除去される白血球としては単球、リンパ球等の単核球があげられるが特に限定されない。本発明のフィルター装置の白血球の除去能力については、単核球除去率が２０％〜９０％の範囲であることが望ましい。本発明でいう単核球除去率とは、フィルター装置入口に導入される白血球含有液の単核球濃度と、フィルター装置出口から導出される白血球含有液の単核球濃度より下式（３）により求められる。
単核球除去率（％）＝（１−出口側血液の単核球濃度／入口側血液の単核球濃度）×１００・・・（３）
The filter device for obtaining a leukocyte-containing liquid in which production of inflammatory cytokines of the present invention is suppressed is characterized in that at least a part of leukocytes is removed from the leukocyte-containing liquid. Examples of leukocytes to be removed include mononuclear cells such as monocytes and lymphocytes, but are not particularly limited. Regarding the leukocyte removal ability of the filter device of the present invention, it is desirable that the mononuclear cell removal rate is in the range of 20% to 90%. The mononuclear cell removal rate as used in the present invention is expressed by the following formula (3) from the mononuclear cell concentration of the leukocyte-containing liquid introduced into the filter device inlet and the mononuclear cell concentration of the leukocyte-containing liquid derived from the filter device outlet. Is required.
Mononuclear cell removal rate (%) = (1-mononuclear cell concentration of outlet side blood / mononuclear cell concentration of inlet side blood) × 100 (3)
単核球除去率が２０％未満の場合、炎症性サイトカイン産生細胞の除去量が十分でなく、炎症性サイトカイン産生能の抑制効果が小さくなるため好ましくない。単核球除去率が９０％を超えると、炎症性サイトカインを産生しない細胞まで除去してしまうため、細胞あたりの炎症性サイトカイン産生能の抑制効果が小さくなるため好ましくない。より好ましくは単核球除去率３０％〜８５％、更に好ましくは単核球除去率４０〜８０％である。 When the mononuclear cell removal rate is less than 20%, the removal amount of inflammatory cytokine-producing cells is not sufficient, and the effect of suppressing the ability to produce inflammatory cytokines becomes small, which is not preferable. When the mononuclear cell removal rate exceeds 90%, even cells that do not produce inflammatory cytokines are removed, which is not preferable because the effect of suppressing the ability to produce inflammatory cytokines per cell is reduced. More preferably, the mononuclear cell removal rate is 30% to 85%, and still more preferably the mononuclear cell removal rate is 40 to 80%.
本発明の炎症性サイトカインとは、生体内における様々な炎症症状を引き起こす原因因子として関与するサイトカインのことをいい、具体的にはＴＮＦ−αやＩＬ−６、ＩＬ−１、ＩＬ−８などがあげられる。単核球の炎症性サイトカイン産生能は様々な方法によって測定することができるが、例えば以下のような方法がある。
Ａ）白血球含有液から例えばフィコール法により単核球を分離する。
Ｂ）フィトヘマグルチニンを添加して３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで１８〜２４時間培養する。
Ｃ）培養終了後遠心して上清を回収し、
Ｄ）上清中に含まれるＴＮＦ−α、ＩＬ−６濃度を市販のＥＬＩＳＡキットを用いて測定する。
The inflammatory cytokine of the present invention refers to a cytokine involved as a causative factor causing various inflammatory symptoms in vivo, and specifically includes TNF-α, IL-6, IL-1, IL-8 and the like. can give. The ability of mononuclear cells to produce inflammatory cytokines can be measured by various methods. For example, there are the following methods.
A) Mononuclear cells are separated from the leukocyte-containing solution by, for example, the Ficoll method.
B) Phytohemagglutinin is added and cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 18-24 hours.
C) After completion of the culture, centrifuge to collect the supernatant,
D) TNF-α and IL-6 concentrations contained in the supernatant are measured using a commercially available ELISA kit.
次に実施例をあげて本発明を更に具体的に説明する。 Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
[実施例１〜６、比較例１]
平均繊維直径が１．７μｍのポリエチレンテレフタレートからなる不織布（目付６６ｇ／ｍ2、嵩密度０．１７ｇ／ｃｍ3）をエチレン含量が２９ｍｏｌ％のエチレン−ビニルアルコール共重合体によって被覆した。被覆の方法は、エチレン−ビニルアルコール共重合体を０．００５重量％（実施例１）、０．０１重量％（実施例２）、０．０２５重量％（実施例３）、０．１重量％（実施例４）、０．５重量％（実施例５）、１．０重量％（実施例６）となるように５８％プロパノールに溶解し、この溶液に不織布を浸漬後、取り出した不織布をローラー間に通すことにより余分な溶液を除去し、４０℃〜５０℃の温風により乾燥させることにより行った。
[Examples 1 to 6, Comparative Example 1]
A nonwoven fabric made of polyethylene terephthalate having an average fiber diameter of 1.7 μm (weight per unit: 66 g / m 2 , bulk density: 0.17 g / cm 3 ) was coated with an ethylene-vinyl alcohol copolymer having an ethylene content of 29 mol%. The coating method was as follows: ethylene-vinyl alcohol copolymer of 0.005% by weight (Example 1), 0.01% by weight (Example 2), 0.025% by weight (Example 3), 0.1% by weight % (Example 4), 0.5% by weight (Example 5), 1.0% by weight (Example 6) were dissolved in 58% propanol, and the nonwoven fabric was taken out after being immersed in this solution. Was passed between rollers to remove excess solution and dried with hot air of 40 ° C to 50 ° C.
被覆量を測定するために、被覆された不織布から任意に直径２５ｍｍの円形状に切り抜いたフィルター材の重量を電子天秤で秤量した。次いで秤量後のフィルター材を、１ｍｇに対し１ｍｌの割合で５８％ｎ−プロパノール中に浸漬させ、６０〜７０℃の恒温槽中で２時間振蕩した。浸漬処理後、取り出したフィルターを６０〜７０℃の乾燥機中で２時間乾燥した。乾燥後のフィルターを電子天秤で秤量することにより被覆に用いられたエチレン−ビニルアルコール共重合体量を算出した。次いで、フィルター担体の表面積を平均繊維径値及び繊維比重値を用いて計算により求めた。これらの数値をもとに、（２）式に従い評価試料の被覆量を算出した。被覆されていない不織布についても同様に被覆量の算出を行い、得られた値を前記評価試料の被覆量の値から差し引くことにより、最終的な被覆量を算出した。 In order to measure the coating amount, the weight of a filter material arbitrarily cut into a circular shape having a diameter of 25 mm from the coated nonwoven fabric was weighed with an electronic balance. Next, the weighed filter material was immersed in 58% n-propanol at a rate of 1 ml per 1 mg, and shaken in a thermostatic bath at 60 to 70 ° C. for 2 hours. After the immersion treatment, the removed filter was dried in a dryer at 60 to 70 ° C. for 2 hours. The amount of ethylene-vinyl alcohol copolymer used for coating was calculated by weighing the dried filter with an electronic balance. Next, the surface area of the filter carrier was determined by calculation using the average fiber diameter value and fiber specific gravity value. Based on these numerical values, the coating amount of the evaluation sample was calculated according to the equation (2). For the non-coated nonwoven fabric, the coating amount was calculated in the same manner, and the final coating amount was calculated by subtracting the obtained value from the coating amount value of the evaluation sample.
被覆後の不織布を、直径６．８ｍｍの大きさに裁断後、容量２００ｍＬの容器に不織布１５ｇ、充填液として生理食塩液を充填した状態でガンマ線滅菌（照射線量２５ｋＧｙ）を実施した。滅菌後の不織布１枚を入口と出口を有する容量１ｍＬのポリエチレン製カラムに充填し、実施例１〜６のフィルター装置を作製した。また、エチレン−ビニルアルコール共重合体を被覆しない不織布を充填したフィルター装置（比較例１）もあわせて作製した。 The coated non-woven fabric was cut into a size of 6.8 mm in diameter, and then gamma sterilization (irradiation dose 25 kGy) was carried out in a state in which a container with a capacity of 200 mL was filled with 15 g of non-woven fabric and physiological saline as a filling solution. One non-woven fabric after sterilization was filled into a 1 mL polyethylene column having an inlet and an outlet, and filter devices of Examples 1 to 6 were produced. A filter device (Comparative Example 1) filled with a non-woven fabric not coated with an ethylene-vinyl alcohol copolymer was also produced.
健常人より採取した血液からフィコール法により末梢血単核球を分離した。この単核球をＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）に１．２×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌで分散させ、５．５ｍｌをシリンジポンプ（テルモ社製）を用いて、上記の方法で作製したフィルター装置に通過させた。通過後の細胞を回収し、１．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製後、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（シグマ社製）を１０μｇ／ｍｌ添加して３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで１８時間培養した。培養終了後遠心して上清を回収した。回収した培養上清中のＴＮＦ−α、ＩＬ−６濃度を市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定した。ＴＮＦ−α、ＩＬ−６の濃度は、比較例１のフィルター装置を通過させた末梢血単核球のＴＮＦ−α、ＩＬ−６産生量を１００％として、実施例１〜６のフィルター装置通過後の末梢血単核球由来のＴＮＦ−α、ＩＬ−６産生量を相対値として表示した。本発明のエチレン−ビニルアルコール共重合体で被覆した不織布を充填したフィルター装置を通過させたヒト単核球のＰＨＡ刺激によるＴＮＦ−α及びＩＬ−６の産生は著しく抑制されていた（表１参照）。 Peripheral blood mononuclear cells were isolated from blood collected from healthy individuals by the Ficoll method. The mononuclear cells were dispersed in RPMI 1640 medium (manufactured by Invitrogen) at 1.2 × 10 6 cells / ml, and 5.5 ml was dispersed in the filter device prepared by the above method using a syringe pump (manufactured by Terumo). I let it pass. The cells after passage are collected and adjusted to 1.0 × 10 6 cells / ml, then phytohemagglutinin (PHA) (manufactured by Sigma) is added at 10 μg / ml and cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 18 hours. did. After completion of the culture, the supernatant was collected by centrifugation. The TNF-α and IL-6 concentrations in the collected culture supernatant were measured using a commercially available ELISA kit (manufactured by R & D Systems). The concentrations of TNF-α and IL-6 were passed through the filter devices of Examples 1 to 6 with the TNF-α and IL-6 production amounts of peripheral blood mononuclear cells passed through the filter device of Comparative Example 1 being 100%. Later TNF-α and IL-6 production amounts derived from peripheral blood mononuclear cells were displayed as relative values. Production of TNF-α and IL-6 by PHA stimulation of human mononuclear cells passed through a filter device filled with a nonwoven fabric coated with the ethylene-vinyl alcohol copolymer of the present invention was remarkably suppressed (see Table 1). ).
[実施例７〜１１、比較例２]
平均繊維直径が２．５μｍのポリエチレンテレフタレートからなる不織布（目付９０ｇ／ｍ2、嵩密度０．２４ｇ／ｃｍ3）をエチレン含量が２５％（実施例７）、２９％（実施例８）、３２％（実施例９）、３８％（実施例１０）、４４％（実施例１１）のエチレン−ビニルアルコール共重合体によって被覆した。被覆の方法は、各エチレン−ビニルアルコール共重合体を０．５重量％となるように５８％プロパノールに溶解し、この溶液に不織布を浸漬後、取り出した不織布をローラー間に通すことにより余分な溶液を除去し、４０℃〜５０℃の温風により乾燥させることにより行った。被覆後の不織布を用いて、実施例１〜６と同様な方法により、被覆量測定、フィルター装置の作製（実施例７〜１１）を行った。また、エチレン−ビニルアルコール共重合体を被覆しない不織布を充填したフィルター装置（比較例２）もあわせて作製した。
[Examples 7 to 11, Comparative Example 2]
A non-woven fabric made of polyethylene terephthalate having an average fiber diameter of 2.5 μm (weight per unit: 90 g / m 2 , bulk density: 0.24 g / cm 3 ) has an ethylene content of 25% (Example 7), 29% (Example 8), 32 % (Example 9), 38% (Example 10), and 44% (Example 11) of ethylene-vinyl alcohol copolymer. In the coating method, each ethylene-vinyl alcohol copolymer was dissolved in 58% propanol so as to be 0.5% by weight, the nonwoven fabric was immersed in this solution, and then the removed nonwoven fabric was passed between rollers. The solution was removed and dried by warm air of 40 ° C to 50 ° C. Using the coated non-woven fabric, the coating amount was measured and filter devices were prepared (Examples 7 to 11) in the same manner as in Examples 1 to 6. A filter device (Comparative Example 2) filled with a non-woven fabric not coated with an ethylene-vinyl alcohol copolymer was also produced.
上記で作製したフィルター装置を用いて、実施例１〜６と同様な方法によりＴＮＦ−α、ＩＬ−６濃度を測定した。ＴＮＦ−α、ＩＬ−６の濃度は、比較例２のフィルター装置を通過させた末梢血単核球のＴＮＦ−α、ＩＬ−６産生量を１００％として、実施例７〜１１のフィルター装置通過後の末梢血単核球由来のＴＮＦ−α、ＩＬ−６産生量を相対値として表示した。本発明のエチレン−ビニルアルコール共重合体で被覆した不織布を充填したフィルター装置を通過させたヒト単核球のＰＨＡ刺激によるＴＮＦ−α及びＩＬ−６の産生は著しく抑制されていた（表２参照）。 Using the filter device prepared above, TNF-α and IL-6 concentrations were measured by the same method as in Examples 1-6. The concentrations of TNF-α and IL-6 were passed through the filter devices of Examples 7 to 11 with the TNF-α and IL-6 production amounts of peripheral blood mononuclear cells passed through the filter device of Comparative Example 2 being 100%. Later TNF-α and IL-6 production amounts derived from peripheral blood mononuclear cells were displayed as relative values. Production of TNF-α and IL-6 by PHA stimulation of human mononuclear cells passed through a filter device filled with a nonwoven fabric coated with the ethylene-vinyl alcohol copolymer of the present invention was remarkably suppressed (see Table 2). ).
[実施例１２、比較例３]
平均繊維直径が１０μｍのポリエチレンテレフタレートからなる不織布（目付１００ｇ／ｍ2、嵩密度０．２１ｇ／ｃｍ3）をエチレン含量が２９％のエチレン−ビニルアルコール共重合体によって被覆した。被覆の方法は、エチレン−ビニルアルコール共重合体を０．３重量％となるように５８％プロパノールに溶解し、この溶液に不織布を浸漬後、取り出した不織布をローラー間に通すことにより余分な溶液を除去し、４０℃〜５０℃の温風により乾燥させることにより行った。
[Example 12, Comparative Example 3]
A nonwoven fabric made of polyethylene terephthalate having an average fiber diameter of 10 μm (100 g / m 2 in basis weight, 0.21 g / cm 3 in basis weight) was coated with an ethylene-vinyl alcohol copolymer having an ethylene content of 29%. The coating method involves dissolving an ethylene-vinyl alcohol copolymer in 58% propanol so as to be 0.3% by weight, immersing the non-woven fabric in this solution, and passing the taken-out non-woven fabric between rollers. Was removed and dried by warm air of 40 ° C to 50 ° C.
被覆後の不織布を、直径６．８ｍｍの大きさに裁断後、容量２００ｍＬの容器に不織布１５ｇ、充填液として生理食塩液を充填した状態でガンマ線滅菌（照射線量２５ｋＧｙ）を実施した。滅菌後の不織布１枚を入口と出口を有する容量１ｍＬのポリエチレン製カラムに充填し、実施例１２のフィルター装置を作製した。また、エチレン−ビニルアルコール共重合体を被覆しない不織布を充填したフィルター装置（比較例３）もあわせて作製した。 The coated non-woven fabric was cut into a size of 6.8 mm in diameter, and then gamma sterilization (irradiation dose 25 kGy) was carried out in a state in which a container with a capacity of 200 mL was filled with 15 g of non-woven fabric and physiological saline as a filling solution. One non-woven fabric after sterilization was packed into a 1 mL polyethylene column having an inlet and an outlet to produce a filter device of Example 12. A filter device (Comparative Example 3) filled with a non-woven fabric not coated with an ethylene-vinyl alcohol copolymer was also produced.
上記で作製したフィルター装置を用いて、実施例１〜６と同様な方法によりＴＮＦ−α、ＩＬ−６濃度を測定した。ＴＮＦ−α、ＩＬ−６の濃度は、比較例３のフィルター装置を通過させた末梢血単核球のＴＮＦ−α、ＩＬ−６産生量を１００％として、実施例１２のフィルター装置通過後の末梢血単核球由来のＴＮＦ−α、ＩＬ−６産生量を相対値として表示した。本発明のエチレン−ビニルアルコール共重合体で被覆した不織布を充填したフィルター装置を通過させたヒト単核球のＰＨＡ刺激によるＴＮＦ−α及びＩＬ−６の産生は著しく抑制されていた（表３参照）。 Using the filter device prepared above, TNF-α and IL-6 concentrations were measured by the same method as in Examples 1-6. The concentrations of TNF-α and IL-6 were adjusted to 100% of the amount of TNF-α and IL-6 produced by the peripheral blood mononuclear cells passed through the filter device of Comparative Example 3, and after passing through the filter device of Example 12. Peripheral blood mononuclear cell-derived TNF-α and IL-6 production were displayed as relative values. Production of TNF-α and IL-6 by PHA stimulation of human mononuclear cells passed through a filter device filled with a nonwoven fabric coated with the ethylene-vinyl alcohol copolymer of the present invention was remarkably suppressed (see Table 3). ).
[実施例１３、比較例４]
実施例１２と同様な方法により、平均繊維直径が１０μｍのポリエチレンテレフタレートからなる不織布（目付１００ｇ／ｍ2、嵩密度０．２１ｇ／ｃｍ3）をエチレン含量が２９％のエチレン−ビニルアルコール共重合体によって被覆した。被覆後の不織布を、直径６．８ｍｍの大きさに裁断後、容量２００ｍＬの容器に不織布１５ｇ、充填液として生理食塩液を充填した状態でガンマ線滅菌（照射線量２５ｋＧｙ）を実施した。滅菌後の不織布１０枚を入口と出口を有する容量１ｍＬのポリエチレン製カラムに充填し、実施例１３のフィルター装置を作製した。また、エチレン−ビニルアルコール共重合体を被覆しない不織布を充填したフィルター装置（比較例４）もあわせて作製した。
[Example 13, comparative example 4]
In the same manner as in Example 12, an ethylene-vinyl alcohol copolymer having an ethylene content of 29% was prepared from a non-woven fabric made of polyethylene terephthalate having an average fiber diameter of 10 μm (100 g / m 2 in basis weight, 0.21 g / cm 3 in bulk density). Coated. The coated non-woven fabric was cut into a size of 6.8 mm in diameter, and then gamma sterilization (irradiation dose 25 kGy) was carried out in a state in which a container with a capacity of 200 mL was filled with 15 g of non-woven fabric and physiological saline as a filling solution. Ten sterilized nonwoven fabrics were packed into a 1 mL polyethylene column having an inlet and an outlet, and a filter device of Example 13 was produced. A filter device (Comparative Example 4) filled with a non-woven fabric not coated with an ethylene-vinyl alcohol copolymer was also produced.
健常人より採取した血液５．５ｍｌをシリンジポンプ（テルモ社製）を用いて、上記の方法で作製したカラムに通過させた。通過後の細胞を回収し、フィコール法により末梢血単核球を分離した。この単核球をＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）で１．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製後、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（シグマ社製）を１０μｇ／ｍｌ添加して３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで１８時間培養した。培養終了後遠心して上清を回収した。回収した培養上清中のＴＮＦ−α、ＩＬ−６濃度を実施例１〜６と同様な方法により測定した。ＴＮＦ−α、ＩＬ−６の濃度は、比較例４のＴＮＦ−α、ＩＬ−６濃度を１００％として、実施例１３のＴＮＦ−α、ＩＬ−６濃度を相対値として表示した。本発明のエチレン−ビニルアルコール共重合体で被覆した不織布を充填したフィルター装置を通過させたヒト単核球は、ＰＨＡ刺激によるＴＮＦ−α及びＩＬ−６の産生が抑制されていた（表４参照）。 Using a syringe pump (manufactured by Terumo), 5.5 ml of blood collected from a healthy person was passed through the column prepared by the above method. The cells after passage were collected, and peripheral blood mononuclear cells were separated by Ficoll method. This mononuclear cell was prepared at 1.0 × 10 6 cells / ml in RPMI 1640 medium (manufactured by Invitrogen), phytohemagglutinin (PHA) (manufactured by Sigma) was added at 10 μg / ml, and 37 ° C., 5% CO 2. Cultured in an incubator for 18 hours. After completion of the culture, the supernatant was collected by centrifugation. TNF-α and IL-6 concentrations in the collected culture supernatant were measured by the same method as in Examples 1-6. Concentrations of TNF-α and IL-6 were expressed as relative values of the TNF-α and IL-6 concentrations of Example 13 with the TNF-α and IL-6 concentrations of Comparative Example 4 being 100%. Production of TNF-α and IL-6 by PHA stimulation was suppressed in the human mononuclear cells passed through the filter device filled with the nonwoven fabric coated with the ethylene-vinyl alcohol copolymer of the present invention (see Table 4). ).
[実施例１４、比較例５]
球相当直径が２ｍｍのセルロースジアセテート粒子を、エチレン含量が４４％のエチレン−ビニルアルコール共重合体によって被覆した（実施例１４）。被覆の方法は、エチレン−ビニルアルコール共重合体を０．５重量％となるように５８％プロパノールに溶解し、この溶液に粒子を浸漬後、取り出した粒子をメッシュ上で静置して余分な溶液を除去し、温風により乾燥させることにより行った。必要により、上記被覆操作を数回繰り返した。
被覆後の粒子を、直径６．８ｍｍの入口と出口を有する容量１ｍＬのポリエチレン製カラムに充填し、充填液として生理食塩液を充填して実施例１４のフィルター装置を作製した。また、エチレン−ビニルアルコール共重合体を被覆しない粒子を充填した比較例５のフィルター装置もあわせて作製した。
[Example 14, comparative example 5]
Cellulose diacetate particles having a sphere equivalent diameter of 2 mm were coated with an ethylene-vinyl alcohol copolymer having an ethylene content of 44% (Example 14). In the coating method, an ethylene-vinyl alcohol copolymer is dissolved in 58% propanol so as to be 0.5% by weight, and the particles are immersed in this solution. The solution was removed and dried with warm air. If necessary, the above coating operation was repeated several times.
The coated particles were packed into a 1 mL polyethylene column having an inlet and an outlet with a diameter of 6.8 mm, and a physiological saline solution was filled as a filling solution to produce a filter device of Example 14. Further, a filter device of Comparative Example 5 filled with particles not coated with ethylene-vinyl alcohol copolymer was also produced.
上記で作製したフィルター装置を用いて、実施例１〜６と同様な方法によりＩＬ−６濃度を測定した。ＩＬ−６の濃度は、比較例５のフィルター装置を通過させた末梢血単核球のＩＬ−６産生量を１００％として、実施例１４のフィルター装置通過後の末梢血単核球由来のＩＬ−６産生量を相対値として表示した。本発明のエチレン−ビニルアルコール共重合体で被覆した不織布を充填したフィルター装置を通過させたヒト単核球のＰＨＡ刺激によるＩＬ−６の産生は抑制されていた（表５参照）。ＴＮＦ−αについても同様な方法で測定することができる。 Using the filter device prepared above, the IL-6 concentration was measured by the same method as in Examples 1-6. The concentration of IL-6 was defined as the IL-6 production amount of peripheral blood mononuclear cells passed through the filter device of Comparative Example 5 being 100%, and the IL derived from peripheral blood mononuclear cells after passing through the filter device of Example 14 -6 production was displayed as a relative value. IL-6 production by PHA stimulation of human mononuclear cells passed through a filter device filled with a nonwoven fabric coated with the ethylene-vinyl alcohol copolymer of the present invention was suppressed (see Table 5). TNF-α can also be measured by the same method.
本発明の炎症性サイトカイン産生が抑制された血液を得るためのフィルター材、フィルター装置および方法は、医療の現場で、抗体を用いない抗サイトカイン療法に応用可能であり、また輸血用血液の炎症性サイトカイン産生抑制にも有用である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The filter material, filter device, and method for obtaining blood with suppressed inflammatory cytokine production according to the present invention can be applied to anti-cytokine therapy without using antibodies in the medical field, and the inflammatory property of blood for transfusion. It is also useful for suppressing cytokine production.
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