JP2008125365A - High purity plasmalogen preparation method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、高純度なプラスマローゲンの調製法に関する。 The present invention relates to a method for preparing a high-purity plasmalogen.
リン脂質は生物界に広く存在し、生体膜を構成する主要成分の１つであることで知られる脂質成分である。リン脂質は、グリセロールを基本骨格とするグリセロリン脂質と、スフィンゴシン塩基を基本骨格とするスフィンゴリン脂質とに分類される。グリセロリン脂質には、グリセロールの1位及び2位に長鎖脂肪酸がエステル結合したジアシル型リン酸の他、グリセロールの1位に脂肪酸ではなく長鎖アルコールがビニルエーテル結合したアルケニルアシル型リン脂質（プラスマローゲンと呼ばれる）、同様にグリセロールの1位に長鎖アルキル基を有するエーテル型リン脂質も存在する。 Phospholipid is a lipid component that is widely present in the living world and is known to be one of the main components constituting a biological membrane. Phospholipids are classified into glycerophospholipids having glycerol as a basic skeleton and sphingophospholipids having a sphingosine base as a basic skeleton. Glycerophospholipids include diacyl phosphates in which long-chain fatty acids are ester-bonded at the 1- and 2-positions of glycerol, as well as alkenyl acyl-type phospholipids in which long-chain alcohols instead of fatty acids are vinyl-ether-bonded to 1-position of glycerol (plasmalogens) Similarly, there are ether-type phospholipids having a long-chain alkyl group at the 1-position of glycerol.
魚類を含む全ての動物は、ジアシル型リン脂質を主要なリン脂質として有する一方、少量のプラスマローゲンをも確実に有している。プラスマローゲンは、一般に、脳、心筋、神経細胞などの大量に酸素を消費する組織に特徴的に多く含まれており、抗酸化活性を有することが認められている。プラスマローゲンの機能についてはまだ不明な点が多いが、ごく最近、海産動物のホヤ由来のプラスマローゲンに、アルツハイマー型認知症の予防効果のあることも報告された。また、プラスマローゲンについては神経細胞のアポトーシスによるDNA断片化を抑制することや、β-アミロイドペプチド蓄積による脳の学習機能低下を軽減することも指摘されている（非特許文献１）。このように、生理活性リン脂質であるプラスマローゲンには大きな関心が寄せられている。 All animals, including fish, have diacyl phospholipids as the major phospholipids, but also reliably have small amounts of plasmalogens. Plasmalogens are generally abundantly contained in tissues that consume a large amount of oxygen, such as brain, heart muscle, and nerve cells, and are recognized to have antioxidant activity. Although there are still many unclear points about the function of plasmalogens, it has recently been reported that plasmalogens derived from the sea squirt of marine animals have a preventive effect on Alzheimer-type dementia. In addition, plasmalogens have been pointed out to suppress DNA fragmentation due to apoptosis of nerve cells and to reduce brain learning function degradation due to β-amyloid peptide accumulation (Non-patent Document 1). Thus, plasmalogens, which are physiologically active phospholipids, are of great interest.
プラスマローゲンとジアシル型リン脂質とは化学構造や性状が類似しているため、プラスマローゲンのみを脂質画分からそのままの形態（インタクトな形態）で単離することは極めて困難である。脂質画分中のプラスマローゲンの定量方法としては、ヨード法と誘導体化法が確立されているが（非特許文献２及び３）、これらの方法ではプラスマローゲンをそのままの形態で単離することは不可能である。現在、市場に供給されているプラスマローゲンの純度は20％程度であり、より純度の高いプラスマローゲンの提供が求められている。 Since plasmalogens and diacyl-type phospholipids have similar chemical structures and properties, it is extremely difficult to isolate only plasmalogens from the lipid fraction in their intact form (intact form). As a method for quantifying plasmalogens in lipid fractions, an iodine method and a derivatization method have been established (Non-patent Documents 2 and 3). In these methods, however, plasmalogens can be isolated as they are. Impossible. Currently, the purity of plasmalogens supplied to the market is about 20%, and there is a demand for providing plasmalogens with higher purity.
一方、従来のグリセロリン脂質の製造方法としては、酸無水法や酸クロリド法などがある。さらに特許文献１及び２には、単一の脂肪酸組成を有するリン脂質と脂肪酸等とを1,3位特異性リパーゼを用いて微水条件下でエステル交換させることによって、目的の脂肪酸組成を有するジアシル型リン脂質を製造する方法が開示されている。しかしながら、これらの方法ではプラスマローゲンを製造することはできず、高純度なプラスマローゲンを提供できる方法の開発がなおも求められている。 On the other hand, conventional methods for producing glycerophospholipids include an acid anhydride method and an acid chloride method. Furthermore, Patent Documents 1 and 2 have a desired fatty acid composition by transesterifying a phospholipid having a single fatty acid composition, a fatty acid, and the like under a slight water condition using a 1,3-position specific lipase. A method for producing diacyl phospholipids is disclosed. However, plasmalogens cannot be produced by these methods, and development of a method capable of providing high-purity plasmalogens is still required.
ところで、近年、魚油などの水産油脂の利用に注目が集まっている。水産油脂は、エイコサペンタエン酸やドコサヘキサエン酸などの高度不飽和脂肪酸を多く含むことを共通の成分的特徴としており、この点で植物性油脂や陸上動物油脂と区別される。これら高度不飽和脂肪酸が中性脂肪の低下、血小板凝集抑制効果などの各種生理機能を有することから、水産油脂は健康面での有用性が期待されている。しかし、高度不飽和脂肪酸は生体内では中性脂肪、リン脂質などの形態で存在するため、高度不飽和脂肪酸のより効果的な利用のためにはこれら脂質成分の調製法のさらなる開発が不可欠である。水産油脂については、従来用いてきた家畜油脂よりも感染因子の混入リスクが少ないと考えられるため、安全性の面でも利用が期待されている。 By the way, in recent years, attention has been focused on utilization of marine oils and fats such as fish oil. Marine fats and oils have a common component characteristic of containing a large amount of highly unsaturated fatty acids such as eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid, and are distinguished from vegetable oils and terrestrial animal fats in this respect. Since these highly unsaturated fatty acids have various physiological functions such as a reduction in neutral fat and a platelet aggregation inhibitory effect, marine fats and oils are expected to be useful in health. However, since highly unsaturated fatty acids exist in the form of neutral fats and phospholipids in vivo, further development of methods for preparing these lipid components is indispensable for more effective utilization of highly unsaturated fatty acids. is there. Marine oils and fats are expected to be used in terms of safety because they are considered to have less risk of contamination with infectious agents than conventional animal fats and oils.
本発明は、水産物由来の高純度なプラスマローゲンを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a high-purity plasmalogen derived from a marine product.
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、1,3位特異的リパーゼを用いて、プラスマローゲン（アルケニルアシル型リン脂質）を分解することなく、ジアシル型リン脂質を特異的に分解できることを見出し、この知見に基づき本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have used diacyl phospholipids without degrading plasmalogens (alkenyl acyl phospholipids) using the 1,3-position specific lipase. Based on this finding, the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下を包含する。
[1] 水産油脂と1,3位特異的リパーゼとを反応させた後、プラスマローゲンを分離することを特徴とする、プラスマローゲンの調製方法。
[2] 水産油脂が魚油である、上記[1]に記載の方法。
[3] 1,3位特異的リパーゼが、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）由来のものである、上記[1]又は[2]に記載の方法。
[4] プラスマローゲンがコリン型プラスマローゲンである、上記[1]〜[3]に記載の方法。
That is, the present invention includes the following.
[1] A method for preparing a plasmalogen, comprising reacting a marine oil and fat with a 1,3-position specific lipase and then separating the plasmalogen.
[2] The method according to [1] above, wherein the marine fat is fish oil.
[3] The method according to [1] or [2] above, wherein the 1,3-position specific lipase is derived from Rhizopus oryzae.
[4] The method according to [1] to [3] above, wherein the plasmalogen is a choline-type plasmalogen.
本発明のプラスマローゲンの調製方法によれば、水産油脂から高純度のプラスマローゲンを容易に製造することができる。 According to the method for preparing plasmalogens of the present invention, high-purity plasmalogens can be easily produced from marine oils and fats.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明では、水産油脂と1,3位特異的リパーゼとを反応させることによりジアシル型リン脂質を特異的に分解し、その反応物からプラスマローゲンを分離することによって、水産油脂由来のプラスマローゲンをより高純度で調製する方法に関する。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the present invention, by reacting a marine oil and fat with a 1,3-position specific lipase, the diacyl-type phospholipid is specifically decomposed, and the plasmalogen derived from the marine fat is separated by separating the plasmalogen from the reaction product. It relates to a method of preparing with higher purity.
本発明の方法で用いる水産油脂は、水中に生息する任意の動物（例えば、マグロ、カツオ、サンマ、イワシ等の魚類、鯨やアザラシ等の海獣、イカやタコ等の軟体動物、ヒトデ、クラゲ、ウニなど）由来の油脂であってよい。限定するものではないが、水産油脂としては、例えば、魚油、肝油、海獣油（鯨油など）、イカ油、魚蝋などが挙げられる。本発明の方法で用いる水産油脂は、プラスマローゲンを多く含む組織、例えば心臓（心筋）、脳などに由来する油脂であることがより好ましい。これら水産油脂に含まれるプラスマローゲンは、高度不飽和脂肪酸を比較的高い含量で有する。生体組織からの水産油脂の調製は、常法に従って行えばよいが、例えば試料に数倍量のクロロホルム−メタノール（2:1）混液を加え、振とう混合し、脂質抽出を行うことによって調製できる（藤野安彦著、「脂質分析法入門」学会出版センター、1978年、を参照）。本発明で用いる水産油脂は、例えば水中に生息する任意の動物の臓器又は組織から有機溶剤等を用いて常法により全脂質を抽出して得られた脂質画分であってよい。本発明で用いる水産油脂はまた、そのようにして得た脂質画分からさらに分離したリン脂質画分であってもよいし、それら脂質画分又はリン脂質画分を含有するように調製された任意の被験試料であってもよい。 Aquatic fats and oils used in the method of the present invention may be any animal that inhabits the water (for example, fish such as tuna, skipjack, saury, sardine, sea animals such as whales and seals, molluscs such as squid and octopus, starfish, jellyfish, The oil may be derived from sea urchins or the like. Although not limited, as fishery fats and oils, fish oil, liver oil, sea animal oil (such as whale oil), squid oil, and fish wax are mentioned, for example. The aquatic fats and oils used in the method of the present invention are more preferably fats and oils derived from tissues rich in plasmalogens, such as the heart (myocardium) and brain. Plasmalogens contained in these marine oils and fats have a relatively high content of highly unsaturated fatty acids. Preparation of aquatic fats and oils from biological tissues may be carried out according to a conventional method. For example, it can be prepared by adding several times the amount of chloroform-methanol (2: 1) mixture to a sample, shaking and mixing to perform lipid extraction. (Refer to Yasuhiko Fujino, “Introduction to Lipid Analysis”, Society of Science Publishing Center, 1978). The marine fats and oils used in the present invention may be a lipid fraction obtained by extracting total lipids from an organ or tissue of any animal living in water using an organic solvent or the like by a conventional method. The aquatic fats and oils used in the present invention may also be a phospholipid fraction further separated from the lipid fraction thus obtained, and any lipid fraction or any phospholipid fraction prepared to contain the phospholipid fraction. It may be a test sample.
以上のようにして調製した水産油脂は、主要なリン脂質であるジアシル型リン脂質以外に、プラスマローゲン（アルケニルアシル型リン脂質）、アルキルアシル型リン脂質などのリン脂質を含有する。本発明の方法では、水産油脂中のプラスマローゲンを分解させないようにジアシル型リン脂質を特異的に分解することにより、プラスマローゲン画分に混入するジアシル型リン脂質を低減させ、プラスマローゲンの精製度を向上させることができる。 The aquatic fats and oils prepared as described above contain phospholipids such as plasmalogens (alkenyl acyl phospholipids) and alkylacyl phospholipids in addition to the main phospholipid diacyl phospholipids. In the method of the present invention, diacyl phospholipids are specifically decomposed so as not to decompose plasmalogens in marine fats and oils, thereby reducing diacyl phospholipids mixed in the plasmalogen fraction, and the degree of plasmalogen purification. Can be improved.
ところで、水産油脂中のリン脂質画分の分析結果については、これまでに様々な報告がなされている。例えば、スケトウダラ心臓から調製したコリン型リン脂質画分中には、ジアシル型リン脂質、プラスマローゲン（アルケニルアシル型リン脂質）、アルキルアシル型リン脂質がそれぞれ54.8％、7.2％、38.0％含まれており、一方、エタノールアミン型リン脂質画分中には、ジアシル型リン脂質、プラスマローゲン（アルケニルアシル型リン脂質）、アルキルアシル型リン脂質がそれぞれ64.3％、29.7％、6.0％含まれていた（Kikuchi K. et al., Comp. Biochem. Physiol., (1999) 124B, p.1-6）。また、下記表１のような心臓中のリン脂質含量とリン脂質組成についての分析結果も報告されている（Kikuchi K. et al., Comp. Biochem. Physiol., (1999) 124B, p.1-6）。 By the way, various reports have been made so far regarding analysis results of phospholipid fractions in marine fats and oils. For example, the choline-type phospholipid fraction prepared from walleye pollock contains 54.8%, 7.2%, and 38.0% of diacyl-type phospholipid, plasmalogen (alkenylacyl-type phospholipid), and alkylacyl-type phospholipid, respectively. On the other hand, the ethanolamine phospholipid fraction contained 64.3%, 29.7%, and 6.0% diacyl phospholipid, plasmalogen (alkenyl acyl phospholipid), and alkylacyl phospholipid, respectively ( Kikuchi K. et al., Comp. Biochem. Physiol., (1999) 124B, p.1-6). In addition, analysis results on the phospholipid content and phospholipid composition in the heart as shown in Table 1 below have been reported (Kikuchi K. et al., Comp. Biochem. Physiol., (1999) 124B, p.1). -6).
このように、水産油脂中に占めるプラスマローゲンの割合は、通常、比較的少ないことが知られている。 Thus, it is known that the proportion of plasmalogen in the marine oil is usually relatively small.
一方、本発明の方法において用いる1,3位特異的リパーゼは、脂質の1位（sn-1位）及び3位（sn-3位）のエステル結合を特異的に分解することができるリパーゼをいう。例えば、中性脂肪の主要成分であるトリアシルグリセロールには、脂肪酸が結合しているエステル結合が1位、2位、及び3位に存在する。またジアシル型リン脂質には、脂肪酸が結合しているエステル結合が1位及び2位に存在する。従って1,3位特異的リパーゼは、トリアシルグリセロールのグリセロール骨格の1位と3位、及びジアシル型リン脂質のグリセロール骨格の1位のエステル結合に作用し、それらを分解することができる。一方、2位のみに脂肪酸がエステル結合しており1位及び3位にはエステル結合を有しないプラスマローゲンには、1,3位特異的リパーゼは全く作用せず、分解することができない。具体的な1,3位特異的リパーゼとしては、例えば、リゾプス属、ムコール属、アスペルギルス属、ユーロチウム属、クロモバクテリウム属、ペニシリウム属、シュードモナス属などの微生物（真菌又は細菌）由来の1,3位特異的リパーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。1,3位特異的リパーゼは、リパーゼF、膵リパーゼなどであってもよい。その好適な1,3位特異的リパーゼは、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）由来のリパーゼ（リパーゼF）であり、例えばリパーゼF-AP15として天野エンザイム社から製造販売されている。 On the other hand, the 1,3-position specific lipase used in the method of the present invention is a lipase capable of specifically decomposing the ester bond at the 1-position (sn-1 position) and 3-position (sn-3 position) of lipids. Say. For example, triacylglycerol, which is a main component of neutral fat, has ester bonds to which fatty acids are bonded at the 1st, 2nd and 3rd positions. In the diacyl phospholipid, an ester bond to which a fatty acid is bonded is present at the 1-position and the 2-position. Therefore, the 1,3-position specific lipase acts on the ester bond at the 1-position and 3-position of the glycerol skeleton of triacylglycerol and the 1-position of the glycerol skeleton of diacyl phospholipid, and can decompose them. On the other hand, the 1- and 3-position specific lipases do not act at all on plasmalogens having fatty acid ester-bonded only at the 2-position and no ester bonds at the 1- and 3-positions, and cannot be decomposed. Specific examples of the 1,3-specific lipase include 1,3 derived from microorganisms (fungi or bacteria) such as Rhizopus sp., Mucor sp., Aspergillus sp., Eurotium sp., Chromobacterium sp., Penicillium sp., Pseudomonas sp. Examples include position-specific lipases, but are not limited thereto. The 1,3-position specific lipase may be lipase F, pancreatic lipase, or the like. The preferred 1,3-position specific lipase is a lipase derived from Rhizopus oryzae (lipase F), for example, manufactured and sold by Amano Enzyme as lipase F-AP15.
水産油脂と1,3位特異的リパーゼとは、個々のリパーゼの至適pH、至適温度などの性状に従って常法により反応させればよい。通常は、水産油脂を含む溶液に1,3位特異的リパーゼを添加し、該リパーゼの活性が認められる条件下でインキュベートすればよい。具体的には後述の実施例を参照することができるが、リゾプス・オリゼ由来のリパーゼを例にとって簡潔に説明すると、水産油脂に有機溶媒（ベンゼン／エタノール(1:1)混液など）を添加して脂質を可溶化し、その脂質溶液にリゾプス・オリゼ由来の1,3位特異的リパーゼを添加し、pH5.0〜8.0（より好ましくはpH7.0）、25℃〜45℃（より好ましくは37℃）の条件下で30分〜2時間（より好ましくは30分間）インキュベートすることにより、水産油脂とその1,3位特異的リパーゼとを反応させることができる。1,3位特異的リパーゼの添加量としては、限定するものではないが、典型的には、油脂100マイクログラム当たり0.25ミリグラム〜1ミリグラムを用いる。この反応により、水産油脂中のジアシル型リン脂質を特異的に分解することができる。この反応においては、当該水産油脂中に含まれるジアシル型リン脂質の50％以上が分解されることが好ましい。この反応により、ジアシル型リン脂質は2-リゾ体（2-アシルリゾリン脂質）と遊離脂肪酸へと分解されるが、プラスマローゲン（特に好ましくは、コリン型プラスマローゲン）は分解されずに残存する（図１）。
ここで、本発明におけるジアシル型リン脂質は、化１の式で表される。
The marine oil and fat and the 1,3-position specific lipase may be reacted by a conventional method according to the properties such as optimum pH and optimum temperature of each lipase. Usually, a 1,3-position specific lipase may be added to a solution containing aquatic fats and oils and incubated under conditions where the activity of the lipase is observed. Specifically, the examples described later can be referred to, but in brief, taking a lipase derived from Rhizopus oryzae as an example, an organic solvent (such as a benzene / ethanol (1: 1) mixture) is added to the marine oil. Solubilize the lipid, add lipase-specific lipase derived from Rhizopus oryzae to the lipid solution, pH 5.0-8.0 (more preferably pH 7.0), 25 ° C-45 ° C (more preferably Incubating for 30 minutes to 2 hours (more preferably 30 minutes) under the condition of 37 ° C.), the marine oil and fat can react with its 1,3-position specific lipase. The addition amount of the 1,3-position specific lipase is not limited, but typically, 0.25 milligram to 1 milligram per 100 micrograms of fat is used. By this reaction, the diacyl phospholipid in the marine oil can be specifically decomposed. In this reaction, it is preferable that 50% or more of the diacyl phospholipid contained in the marine oil is decomposed. By this reaction, diacyl phospholipid is decomposed into 2-lyso form (2-acyl lysophospholipid) and free fatty acid, but plasmalogen (particularly preferably choline-type plasmalogen) remains without being decomposed (FIG. 1).
Here, the diacyl type phospholipid in the present invention is represented by the formula 1.
化１の式中、R1CH2及びR2COは脂肪酸残基を示し、Xはコリン、エタノールアミン、セリンなどの含窒素アルコール基を示す。 In the formula (1), R 1 CH 2 and R 2 CO represent fatty acid residues, and X represents a nitrogen-containing alcohol group such as choline, ethanolamine, or serine.
また本発明におけるプラスマローゲン（アルケニルアシル型リン脂質）は、化２の式で表される。 The plasmalogen (alkenyl acyl type phospholipid) in the present invention is represented by the formula 2.
化２の式中、CH=CHR1はビニルエーテル結合した長鎖アルコール残基を示し、R2COは脂肪酸残基を示し、Xはコリン、エタノールアミン、セリンなどの含窒素アルコール基を示す。例えば、コリン型プラスマローゲン（コリンプラスマローゲンとも呼ぶ）は、Xが-CH2CH2N+(CH3)3となる化２の式で表される。 In the formula (2), CH = CHR 1 represents a vinyl ether-bonded long chain alcohol residue, R 2 CO represents a fatty acid residue, and X represents a nitrogen-containing alcohol group such as choline, ethanolamine or serine. For example, choline-type plasmalogen (also referred to as choline plasmalogen) is represented by the formula 2 in which X is —CH 2 CH 2 N + (CH 3 ) 3 .
上記の通り、ジアシル型リン脂質は1位と2位に脂肪酸がエステル結合しているのに対し、全てのプラスマローゲンでは1位に長鎖アルコールがビニルエーテル結合し、2位に脂肪酸がエステル結合している。本発明の方法では、ジアシル型リン脂質は1,3位特異的リパーゼによってエステル結合が分解されリゾ体となるが、プラスマローゲンは1,3位特異的リパーゼによっては分解されない。ジアシル型リン脂質とプラスマローゲンとは構造や性状が非常に類似しているために別々の画分に分離することは困難であるが、1,3位特異的リパーゼによってジアシル型リン脂質が分解されたリゾ体は、プラスマローゲンと容易に分離することができる。 As described above, diacyl phospholipids have fatty acid ester bonds at the 1st and 2nd positions, whereas in all plasmalogens, long chain alcohols are vinyl ether bonded at the 1st position and fatty acids are ester bonded at the 2nd position. ing. In the method of the present invention, the diacyl phospholipid is decomposed into a lyso form by the ester bond being degraded by the 1,3-position specific lipase, but the plasmalogen is not degraded by the 1,3-position specific lipase. Diacyl phospholipids and plasmalogens are very similar in structure and properties, so it is difficult to separate them into separate fractions, but diacyl phospholipids are degraded by the 1,3-position specific lipase. The lyso form can be easily separated from the plasmalogen.
上記のようにして水産油脂と1,3位特異的リパーゼとを反応させた後、必要があればリパーゼを失活させて反応を停止させてから、そのリパーゼ反応物よりプラスマローゲンの分離を行う。リパーゼ反応物からのプラスマローゲンの分離とは、そのリパーゼ反応物に含まれる他の脂質成分の少なくとも一部からプラスマローゲン画分を分離することを意味する。プラスマローゲンの分離は、脂質を分画又は分離できる通常の技法に従って行えばよく、例えば、薄層クロマトグラフィー（TLC）、高速液体クロマトグラフィーなどによって、ジアシル型リン脂質由来のリゾリン脂質と遊離脂肪酸をプラスマローゲンから取り除くことができる。こうして分離されたプラスマローゲン画分には、プラスマローゲンが高含量で含まれている。このプラスマローゲン画分には、プラスマローゲン以外の成分（アルキルアシル型リン脂質やジアシル型リン脂質など）が残存していてもよいが、材料とした水産油脂のリン脂質組成と比較してプラスマローゲンの純度（含有率）がより高いことが好ましい。このプラスマローゲン画分は、常法によりクロマトグラフィーカラムから溶出するなどして採取した後、さらに精製してもよい。この方法においてプラスマローゲン画分中に濃縮されるプラスマローゲンは、コリン型プラスマローゲン、エタノールアミン型プラスマローゲン、セリン型プラスマローゲンなどであってよいが、より好ましくはコリン型プラスマローゲンである。 After reacting marine oil and fat with 1,3-position specific lipase as described above, if necessary, the lipase is deactivated to stop the reaction, and then plasmalogen is separated from the lipase reaction product. . Separation of plasmalogen from the lipase reaction product means separation of the plasmalogen fraction from at least a part of other lipid components contained in the lipase reaction product. Plasmalogens may be separated according to a conventional technique capable of fractionating or separating lipids. For example, lysophospholipids derived from diacyl phospholipids and free fatty acids are separated by thin layer chromatography (TLC), high performance liquid chromatography, etc. Can be removed from plasmalogen. The plasmalogen fraction thus separated contains a high content of plasmalogen. In this plasmalogen fraction, components other than plasmalogen (such as alkylacyl-type phospholipids and diacyl-type phospholipids) may remain, but the plasmalogen is compared with the phospholipid composition of the marine oil used as the material. It is preferable that the purity (content rate) of is higher. This plasmalogen fraction may be collected by elution from a chromatography column by a conventional method and then further purified. The plasmalogen concentrated in the plasmalogen fraction in this method may be a choline-type plasmalogen, ethanolamine-type plasmalogen, serine-type plasmalogen, or the like, more preferably a choline-type plasmalogen.
水産油脂からこのようにして調製されるプラスマローゲン（画分）は、エイコサペンタエン酸（EPA）やドコサヘキサエン酸（DHA）などの高度不飽和脂肪酸を、好ましくはグリセロール骨格の2位に、高含量で含みうる。従って本発明の方法で得られる水産油脂由来のプラスマローゲン（画分）は、種々の有利な生理活性が知られている高度不飽和脂肪酸の供給源としても有用である。水産油脂由来のプラスマローゲンが高度不飽和脂肪酸を多く含むことは、Kikuchi K. et al., "Fatty acid composition of choline and ethanolamine glycerophospholipid subclasses in heart tissue of mammals and migratory and demersal fish." Comp. Biochem. Physiol. (1999) 124B, p.1-6にも報告されている。この文献では、心筋プラスマローゲンの主要脂肪酸組成（mol％）が示されている。例えばウシ（対照）、マグロ、カツオ由来の心筋コリン型プラスマローゲンは、それぞれ、脂肪酸18:2(n-6)を52.5、1.2、0.4（mol％）、20:4(n-6)を16.2、9.7、6.7（mol％）、20:5(n-3)を1.0、4.1、5.0（mol％）、22:6(n-3)を3.8、45.0、52.9（mol％）、24:1を（未検出）、17.0、14.9（mol％）含むと報告されている。一方、ウシ（対照）、マグロ、カツオ由来の心筋エタノールアミン型プラスマローゲンは、それぞれ、脂肪酸18:2(n-6)を40.8、0.8、0.2（mol％）、20:4(n-6)を37.7、13.6、8.4（mol％）、20:5(n-3)を0.6、2.8、7.3（mol％）、22:6(n-3)を（未検出）、65.3、66.4（mol％）、24:1を（未検出）、5.5、5.0（mol％）含むと報告されている。 Plasmalogens (fractions) prepared in this way from marine oils and fats are highly unsaturated fatty acids such as eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA), preferably in the 2nd position of the glycerol skeleton, with a high content. May be included. Accordingly, the plasmalogen (fraction) derived from aquatic fats and oils obtained by the method of the present invention is also useful as a source of highly unsaturated fatty acids known to have various advantageous physiological activities. The fact that plasmalogens derived from aquatic fats and oils contain a large amount of highly unsaturated fatty acids has been reported by Kikuchi K. et al., "Fatty acid composition of choline and ethanolamine glycerophospholipid subclasses in heart tissue of mammals and migratory and demersal fish." Comp. Biochem. Physiol. (1999) 124B, p.1-6. In this document, the main fatty acid composition (mol%) of myocardial plasmalogen is shown. For example, myocardial cholinergic plasmalogens derived from bovine (control), tuna and skipjack are fatty acid 18: 2 (n-6) 52.5, 1.2, 0.4 (mol%), 20: 4 (n-6) 16.2 9.7, 6.7 (mol%), 20: 5 (n-3) 1.0, 4.1, 5.0 (mol%), 22: 6 (n-3) 3.8, 45.0, 52.9 (mol%), 24: 1 (Not detected), 17.0, 14.9 (mol%) are reported. On the other hand, myocardial ethanolamine plasmalogens derived from bovine (control), tuna and skipjack are fatty acid 18: 2 (n-6) 40.8, 0.8, 0.2 (mol%), 20: 4 (n-6), respectively. 37.7, 13.6, 8.4 (mol%), 20: 5 (n-3) 0.6, 2.8, 7.3 (mol%), 22: 6 (n-3) (not detected), 65.3, 66.4 (mol%) ), 24: 1 (not detected), 5.5, 5.0 (mol%).
一方、水産油脂由来のプラスマローゲンの機能の一部として、アルツハイマー型認知症の予防効果があることも知られている（特開2004-26803号公報）。水産油脂由来のプラスマローゲンは、従来の牛脳由来のもののように感染因子の混入のリスクが少なく、その点で安全性が高く有用である。 On the other hand, it is also known that as a part of the function of plasmalogen derived from marine oils and fats, there is an effect of preventing Alzheimer-type dementia (Japanese Patent Laid-Open No. 2004-26803). Plasmalogens derived from marine oils and fats have a low risk of contamination with infectious agents like those derived from conventional bovine brain, and are highly safe and useful in that respect.
以上記載のような本発明のプラスマローゲンの調製方法を用いれば、水産資源からプラスマローゲンを高純度で調製することができる。具体的な適用例としては、まず、水中に生息する様々な動物の臓器又は組織、例えば水産廃棄物である魚類の心臓や頭部などから、有機溶剤等を用いて全脂質を抽出する。その水産廃棄物としては、限定するものではないが、工業的には、大型魚類であるカツオ・マグロ類、未利用魚の心臓や頭部等が好適に用いられる。次いで、抽出した脂質画分を、ケイ酸カラムクロマトグラフィー法などの従来の任意の脂質分画法により、リン脂質画分（プラスマローゲンが含まれる）と中性脂質画分等に分離することができる。このリン脂質画分は、例えば含窒素アルコール基に基づく分離操作などにより、コリン型、エタノールアミン型などの各種リン脂質画分へとさらに分離してもよい。そのようにして得られる各種リン脂質画分には、通常、ジアシル型リン脂質とプラスマローゲンが混在する。例えば、コリン型リン脂質画分には、（ジアシル型）ホスファチジルコリン、及びコリン型プラスマローゲンが含まれる。またエタノールアミン型リン脂質画分には、（ジアシル型）ホスファチジルエタノールアミン、及びエタノールアミン型プラスマローゲンが含まれる。そこで、以上のように調製した脂質画分又は各リン脂質画分に、本発明の方法に従って1,3位特異的リパーゼを作用させることにより、それらの画分に含まれるジアシル型リン脂質を該リパーゼで分解し、一方でプラスマローゲンを残存させることができる。この反応後の溶液からは、例えばケイ酸カラムクロマトグラフィー法等の脂質分画法を用いることにより、プラスマローゲンを容易に分離精製することができる。 By using the plasmalogen preparation method of the present invention as described above, plasmalogen can be prepared with high purity from marine resources. As a specific application example, first, total lipids are extracted from various animal organs or tissues inhabiting underwater, for example, the heart or head of fish as fishery waste, using an organic solvent or the like. The fishery waste is not limited, but industrially, bonito and tuna, which are large fishes, and the heart and head of unused fish are preferably used. Subsequently, the extracted lipid fraction can be separated into a phospholipid fraction (including plasmalogen), a neutral lipid fraction, and the like by any conventional lipid fractionation method such as silicic acid column chromatography. it can. This phospholipid fraction may be further separated into various phospholipid fractions such as choline type and ethanolamine type by a separation operation based on a nitrogen-containing alcohol group, for example. The various phospholipid fractions thus obtained usually contain a mixture of diacyl phospholipid and plasmalogen. For example, the choline-type phospholipid fraction includes (diacyl-type) phosphatidylcholine and choline-type plasmalogen. The ethanolamine type phospholipid fraction contains (diacyl type) phosphatidylethanolamine and ethanolamine type plasmalogen. Therefore, the 1,3-position specific lipase is allowed to act on the lipid fraction or each phospholipid fraction prepared as described above according to the method of the present invention, whereby the diacyl-type phospholipid contained in those fractions is converted into the above-mentioned fraction. It can be degraded by lipase while plasmalogens can remain. From the solution after this reaction, plasmalogens can be easily separated and purified by using a lipid fractionation method such as silicic acid column chromatography.
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
本実施例では、1,3位特異的リパーゼである真菌リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）由来のリパーゼF-AP15（一般名：リパーゼF；天野エンザイム社製）を使用した。さらに、ジアシル型リン脂質として卵黄ホスファチジルコリン（PC）（和光純薬社製）を、プラスマローゲンとして1-O-1'-(Z)-オクタデセニル-2-オレオニル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（合成コリン型プラスマローゲン；Avanti Polar Lipids, Inc.）を用いた。 In this example, lipase F-AP15 (generic name: lipase F; manufactured by Amano Enzyme) derived from the fungus Rhizopus oryzae, which is a lipase specific for position 1 and 3, was used. Furthermore, egg yolk phosphatidylcholine (PC) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as diacyl phospholipid, and 1-O-1 '-(Z) -octadecenyl-2-oleonyl-sn-glycero-3-phosphocholine (synthesis) as plasmalogen Choline-type plasmalogen (Avanti Polar Lipids, Inc.) was used.
まず、ガラス製小試験管に、100マイクログラム相当のPC又は1-O-1'-(Z)-オクタデセニル-2-オレオニル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンのクロロホルム溶液を採取し、それを蒸発乾固後、その残渣にベンゼン／エタノール(1:1)混液 10マイクロリットルを添加し、脂質を可溶化した。このようにして調製した脂質溶液に、50mM Tris-HCl (pH7.0)、2.7mM デオキシコール酸ナトリウム、5mM CaCl2からなる反応混合液 88マイクロリットルを加えた。最後に、リパーゼF-AP15溶液を添加し、反応溶液の全量を130マイクロリットルに調整した後、37℃で30分間反応を行った。添加したリパーゼF-AP15の量は250マイクログラム、500マイクログラム、750マイクログラム、1000マイクログラムであった。 First, 100 micrograms of PC or 1-O-1 '-(Z) -octadecenyl-2-oleonyl-sn-glycero-3-phosphocholine in chloroform was collected in a small glass test tube and evaporated. After drying, 10 microliters of a benzene / ethanol (1: 1) mixture was added to the residue to solubilize the lipid. To the lipid solution thus prepared, 88 microliters of a reaction mixture composed of 50 mM Tris-HCl (pH 7.0), 2.7 mM sodium deoxycholate and 5 mM CaCl 2 was added. Finally, lipase F-AP15 solution was added to adjust the total amount of the reaction solution to 130 microliters, and then the reaction was performed at 37 ° C. for 30 minutes. The amount of lipase F-AP15 added was 250 micrograms, 500 micrograms, 750 micrograms and 1000 micrograms.
反応後、クロロホルム／メタノール(2:1)混液 650マイクロリットルを各試験管に加え、ボルテックスで撹拌することにより、リパーゼ反応を停止させた。試験管の静置後、下層のクロロホルム層をパスツールピペットで採取し、それをエバポレーターで濃縮し、そこから脂質を回収した。濃縮した脂質にクロロホルム／メタノール(3:10)混液 13マイクロリットルを加えて溶解後、その10マイクロリットルを、吸着剤としてシリカゲルを塗布した薄層クロマトグラフィー（TLC）プレートに着点させた。TLCプレートの展開には、クロロホルム／メタノール／酢酸／水(55:17:3:2)混液とn-ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸(80:20:1)混液の溶媒系を用いた。展開後、プレートに50％硫酸溶液を噴霧し、それをホットプレート上で５分間加熱して、出現する脂質スポットを記録した。その結果を図２に示す。また同様に用意したTLCプレートについて、n-ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（80:20:1）混液の溶媒系を用いて、別途展開を行った。その結果を図３に示す。 After the reaction, the lipase reaction was stopped by adding 650 microliters of a chloroform / methanol (2: 1) mixture to each test tube and stirring by vortexing. After the test tube was allowed to stand, the lower chloroform layer was collected with a Pasteur pipette, concentrated with an evaporator, and lipid was collected therefrom. The concentrated lipid was dissolved by adding 13 microliters of a chloroform / methanol (3:10) mixed solution, and then 10 microliters was spotted on a thin layer chromatography (TLC) plate coated with silica gel as an adsorbent. For the development of the TLC plate, a solvent system of chloroform / methanol / acetic acid / water (55: 17: 3: 2) and n-hexane / diethyl ether / acetic acid (80: 20: 1) was used. After development, the plate was sprayed with a 50% sulfuric acid solution and heated on a hot plate for 5 minutes to record the appearing lipid spots. The result is shown in FIG. Similarly, the prepared TLC plate was separately developed using a solvent system of n-hexane / diethyl ether / acetic acid (80: 20: 1) mixed solution. The result is shown in FIG.
図２に示すように、リパーゼF-AP15との反応により、ホスファチジルコリン（PC）はリゾホスファチジルコリン（リゾPC）へと加水分解された。このリゾホスファチジルコリンについては、ホスファチジルコリンやプラスマローゲンのスポットと移動度において明確に区別できた。またリゾホスファチジルコリンの生成量はリパーゼF-AP15の添加量の増加に伴って増加した。さらに、リパーゼF-AP15との反応により、ホスファチジルコリン（PC）は加水分解され、遊離脂肪酸も生成することが示された（図３）。 As shown in FIG. 2, phosphatidylcholine (PC) was hydrolyzed to lysophosphatidylcholine (lysoPC) by the reaction with lipase F-AP15. This lysophosphatidylcholine was clearly distinguished in terms of mobility and phosphatidylcholine and plasmalogen spots. The amount of lysophosphatidylcholine increased with increasing amount of lipase F-AP15. Furthermore, it was shown that phosphatidylcholine (PC) was hydrolyzed by reaction with lipase F-AP15 to produce free fatty acids (FIG. 3).
これに対し、ホスファチジルコリンとは異なり、1-O-1'-(Z)-オクタデセニル-2-オレオニル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンは、リパーゼF-AP15によって加水分解を受けなかった。図２及び３に示される通り、TLCプレート上には、1-O-1'-(Z)-オクタデセニル-2-オレオニル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（コリン型プラスマローゲン）の分解産物であるリゾプラスマローゲンや、遊離脂肪酸のスポットは全く出現しなかった。すなわちこのコリン型プラスマローゲンは、リパーゼF-AP15によって全く分解されなかった。 In contrast, unlike phosphatidylcholine, 1-O-1 ′-(Z) -octadecenyl-2-oleonyl-sn-glycero-3-phosphocholine was not hydrolyzed by lipase F-AP15. As shown in FIGS. 2 and 3, it is a degradation product of 1-O-1 ′-(Z) -octadecenyl-2-oleonyl-sn-glycero-3-phosphocholine (choline type plasmalogen) on the TLC plate. There were no lysoplasmalogens or free fatty acid spots. That is, this choline-type plasmalogen was not degraded at all by lipase F-AP15.
以上の結果から、1,3位特異的リパーゼを用いれば、プラスマローゲンをインタクトな形態で維持しながら、ジアシル型リン脂質を分解できること、そして、ジアシル型リン脂質が分解されて生成されるリゾ体はプラスマローゲンと明確に分離され得ることが示された。 From the above results, it is possible to degrade diacyl phospholipids while maintaining plasmalogens in an intact form by using a 1,3-position specific lipase, and a lyso form produced by degradation of diacyl phospholipids It was shown that can be clearly separated from plasmalogens.
本発明のプラスマローゲンの調製方法は、プラスマローゲンを高純度で取得するために使用されうる。本発明の方法では、特に、水産油脂に特徴的であり様々な生理機能を有する高度不飽和脂肪酸（EPAやDHAなど）を含有するプラスマローゲンを調製することができる。 The method for preparing plasmalogens of the present invention can be used to obtain plasmalogens with high purity. In the method of the present invention, a plasmalogen containing polyunsaturated fatty acids (EPA, DHA, etc.) that are characteristic of marine oils and fats and have various physiological functions can be prepared.
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