JP2008110943A - モノクローナル抗体の作成方法 - Google Patents

Abstract

【課題】モノクローナル抗体の作成方法とそのモノクローナル抗体の作成方法により得られたモノクローナル抗体を提供する。
【解決手段】タンパク質・ＲＮＡ複合体を動物に投与、免疫化し、免疫化された動物から得られた目的の抗体産成細胞をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を得、得られたハイブリドーマ細胞を培養することによりモノクローナル抗体を得る。タンパク質としてはリボソーム構成タンパク質、中でもＰ０及び／又はＰ１及び／又はＰ２が好適に用いられる。ＲＮＡとしてはリボソームＲＮＡ、中でもリボソーム２８Ｓ ＲＮＡが好適に用いられる。タンパク質・ＲＮＡ複合体としては、Ｐ０・Ｐ１・Ｐ２・ＲＮＡ複合体が好適に用いられる。動物としてはマウス、中でも自己免疫モデルマウスが好適に用いられる。
【選択図】図１

Description

本発明は、モノクローナル抗体の作成方法及びそのモノクローナル抗体の作成方法により得られたモノクローナル抗体に関する。

モノクローナル抗体は、その特異的分子認識能と分子機構抑制効果により、基礎生命科学研究はもとより、検査診断や臨床医療等で広く利用されている。一般に、抗体作成の為に、単離した標的抗原タンパク質または合成ペプチドをアジュバントと呼ばれる免疫系促進剤とともにマウスに投与、免疫化し、目的の抗体産成細胞をミエローマ細胞とのハイブリドーマとして得る方法が用いられている。しかしながら一般の方法では必ずしも抗原タンパク質の分子機能を効率よく抑制する良質の抗体が得られない場合が多いという問題がある。

一方、ヒト全身性の自己免疫疾患（ＳＬＥ）の患者血清中に検出される自己抗体は、生体内タンパク質やＲＮＡの機能部位を認識する有効なものが得られる場合が多いことが知られている（非特許文献１及び２）。そのため、一部の自己抗体は自己免疫（ＳＬＥ）モデルマウスの脾臓をミエローマ細胞と直接融合することでモノクローナル抗体として得られおり、抗ＤＮＡ抗体や抗Ｓｍ抗体（非特許文献３及び４）等の一部の自己抗体について成功している。しかし自然発生的に活性化する抗体産成細胞を拾うこの手法では得られる自己抗体の種類に限界があるという問題がある（非特許文献３）。

ところで、自己免疫疾患で自己抗体が産出されるしくみとして、自己の抗原自体に対する免疫応答が寄与すると考えるアンチジェンドリブン（ａｎｔｉｇｅｎ ｄｒｉｖｅｎ）説が有力視されており（非特許文献５）、その詳細なしくみを分子レベルで探るうえで抗原部位の構造・機能解析が行われてきた。そして、様々な自己抗原が知られるなかで、抗Ｐ抗原はその構造面の特徴が最もよく解析されているものの一つである。

そして、モノクローナル抗Ｐ抗体（ＩｇＧ）に関して、これまで本発明代表者らの研究を含め２件の報告がある（非特許文献６及び７）。これらはいずれも単離したＰ１／Ｐ２抗原タンパク質をアジュバント混在下でマウスに投与し、いずれの場合も、１クローンのみの抗Ｐ抗体を単離している。本発明代表者の経験では、従来法による免疫化ではＰ１特異抗体とＰ２特異抗体の産生が主で、Ｐ１とＰ２およびＰ０のＣ末端共通エピトープに対する抗Ｐ抗体の産生頻度が極めて低い。したがって、発生率の低い他の多くの自己抗体を得る為には、この従来型免疫法では困難が予想される、といった問題がある。
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そこで、本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、従来の方法では得ることが困難であった、良質なモノクローナル抗体を効率的に作成するためのモノクローナル抗体の作成方法を提供することを目的とする。

本発明代表者らはこれまで、８０種類のタンパク質と高分子ＲＮＡより構成されるリボソームに対してＳＬＥ患者が産出する自己抗体を解析し、（１）Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２の三種のタンパク質の共通Ｃ末端配列とリボソームＲＮＡの一部位に対する抗体が優先的に産出されること、また、（２）これらのタンパク質とＲＮＡ部位が安定な複合体を形成することを証明し、これら成分がリボソーム中の一部位で強力な抗原提示部位を形成することを示してきた（図１）。

そこで、上記の知見より、本発明者らは自己抗体産出の刺激を提供する抗原として、単離された抗原タンパク質より、Ｐ０・Ｐ１・Ｐ２・ＲＮＡ複合体が有効であるだろうという発想に至った。

そして、上記課題に鑑みて鋭意検討した結果、自己抗原タンパク質・ＲＮＡ複合体を変性させることなく、ＳＬＥモデルマウス（ＭＲＬ／ｌｐｒ）に投与し免疫化することにより、非常に効果的にモノクローナル抗体が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。

さらにこの方法により、抗Ｐ抗体エピトープのリン酸化型と強く反応する抗体と、リン酸化型／非リン酸化型と同等に反応する抗体の二種類をクローン化することに成功した。

すなわち、本発明の請求項１記載のモノクローナル抗体の作成方法は、タンパク質・ＲＮＡ複合体を動物に投与、免疫化し、免疫化された動物から得られた目的の抗体産成細胞をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を得、得られたハイブリドーマ細胞を培養することによりモノクローナル抗体を得ることを特徴とする。

本発明の請求項２記載のモノクローナル抗体の作成方法は、請求項１において、前記タンパク質がリボソーム構成タンパク質であることを特徴とする請求項１記載のモノクローナル抗体の作成方法。

本発明の請求項３記載のモノクローナル抗体の作成方法は、請求項２において、前記リボソーム構成タンパク質がＰ０及び／又はＰ１及び／又はＰ２であることを特徴とする。

本発明の請求項４記載のモノクローナル抗体の作成方法は、請求項１において、前記ＲＮＡがリボソームＲＮＡであることを特徴とする。

本発明の請求項５記載のモノクローナル抗体の作成方法は、請求項４において、前記リボソームＲＮＡがリボソーム２８Ｓ ＲＮＡであることを特徴とする。

本発明の請求項６記載のモノクローナル抗体の作成方法は、請求項１において、前記タンパク質・ＲＮＡ複合体がＰ０・Ｐ１・Ｐ２・ＲＮＡ複合体であることを特徴とする。

本発明の請求項７記載のモノクローナル抗体の作成方法は、請求項１において、前記動物がマウスであることを特徴とする。

本発明の請求項８記載のモノクローナル抗体の作成方法は、請求項７において、前記マウスが自己免疫モデルマウスであることを特徴とする。

本発明の請求項９記載のモノクローナル抗体は、請求項１〜８記載のモノクローナル抗体の作成方法により得られたことを特徴とする。

本発明は、自己抗体のモノクローン化という視点に立脚しており、そのため、本発明によれば、自己免疫疾患の発症機序を探る基礎医学研究において特に有効に利用することができる。また、モノクローナル抗体は、分子識別や分子構造・機能研究のプローブとして基礎生命科学の幅広い学術領域で利用されている他、分子機能を抑制する抗体は免疫医療の領域で薬剤として直接利用されている。そのため、新たな良質の抗体産出をもたらす本発明は基礎生命科学や臨床医学の分野で広く利用することができる。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明のモノクローナル抗体の作成方法は、タンパク質・ＲＮＡ複合体を動物に投与、免疫化し、免疫化された動物から得られた目的の抗体産成細胞をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を得、得られたハイブリドーマ細胞を培養することによりモノクローナル抗体を得ることを特徴とする。なお、抗原の免疫化、抗体産生細胞とミエローマ細胞の融合、ハイブリドーマ細胞の培養は、特定の方法に限定されるものではなく、通常用いられる方法により行うことができる。

前記タンパク質としてはリボソーム構成タンパク質、中でもＰ０及び／又はＰ１及び／又はＰ２が好適に用いられる。

そして、前記ＲＮＡとしてはリボソームＲＮＡ、中でもリボソーム２８Ｓ ＲＮＡが好適に用いられる。

また、前記タンパク質・ＲＮＡ複合体としては、上記のタンパク質Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２により形成されたＰ０・Ｐ１・Ｐ２複合体とＲＮＡを組み合わせたＰ０・Ｐ１・Ｐ２・ＲＮＡ複合体が好適に用いられる。

ここで、Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２は、ヒトＳＬＥ患者の３０−４０％で検出される抗−Ｐ抗体の抗原となるリボソーム構成タンパク質であり、抗Ｐ自己抗原エピトープを共有している。また、この抗Ｐ自己抗原エピトープには、リン酸化を受けるアミノ酸（セリン）が含まれている。そして、生体内のリボソームではこれらタンパク質はリン酸化されているので、形成したＰ０・Ｐ１・Ｐ２複合体はカゼインキナーゼII処理等により、リン酸化されて使用されることが好ましい。

そして、Ｐ０・Ｐ１・Ｐ２・ＲＮＡ複合体としては、リン酸化されたＰ０・Ｐ１・Ｐ２複合体、およびこれらが結合するリボソーム２８Ｓ ＲＮＡの断片とからなるタンパク質・ＲＮＡ複合体であるＰ０・Ｐ１・Ｐ２・リボソーム２８Ｓ ＲＮＡ複合体が好適に用いられる（図１）。

そして、本発明のモノクローナル抗体の作成方法において、前記動物としては、マウス、中でも自己免疫モデルマウスが好適に用いられる。

本発明のモノクローナル抗体は、以上のようなモノクローナル抗体の作成方法により得られる。

中でも、Ｐ０・Ｐ１・Ｐ２・リボソーム２８Ｓ ＲＮＡ複合体を抗原として得られた、モノクローナル自己抗体である抗Ｐ抗体は、（ａ）リン酸化型と非リン酸化型のエピトープ両者と同等に反応する抗体と（ｂ）リン酸化型エピトープとより強く反応する抗体の二種類で、ともにリボソームと効率よく結合し機能を阻害するものであった。

以上のような本発明の抗体作成方法は、抗Ｐ抗体のような主要抗体ばかりでなく、他の多くの自己抗体のモノクローン化のための有効な方法となると考えられる。また、健常人の末梢血中にも自己を認識するリンパ球が低いレベルで存在しており、種々の成分に対する自己反応性の抗体が生体内で産出されることが示唆されている（Bouneaud, C., Kourilsky, P., and Bousso, P. (2000) Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: A large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840.）。

以下に本発明の実施例によって、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。

（リボソーム中の抗Ｐ自己抗原成分からのタンパク質・ＲＮＡ複合体再構成とマウスの免疫化）
リボソームの自己免疫標的となる部位を構成するタンパク質Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２およびこれら複合体が結合するリボソームＲＮＡ部位をそれぞれ発現精製した。Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２のC末端側のアミノ酸配列は共通で、この部位に抗Ｐ自己抗原エピトープが含まれる。またこの部位のアミノ酸配列にはセリン残基が含まれカゼインキナーゼによりリン酸化を受けることが知られている（Hasler, P., Brot. N, Weissbach, H., Parnassa, A. P., and Elkon, K. B. (1991) Ribosomal proteins P0, P1, and P2 are phosphorylated by casein kinase II at their conserved carboxyl termini. J. Biol. Chem. 266, 13815-13820.）。抗原タンパク質およびＲＮＡ断片を混合し、複合体を再構成した後、カゼインキナーゼ処理し、リン酸化を行った。この複合体を精製後、未変性状態でＳＬＥモデルマウスＭＲＬの足底に投与・免疫化した。免疫化されたマウスからの鼠徑部リンパ細胞とミエローマ細胞間ハイブリドーマ細胞から高頻度に抗Ｐ抗体が検出された。

以下、詳細に説明する。

抗Ｐ自己抗原エピトープを共有する三種のリボソームタンパク質Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２のそれぞれの遺伝子を大腸菌発現用プラスミドに組み込み、それぞれを大腸菌細胞に導入しタンパク質を発現させた。そして各タンパク質を、各種カラムクロマトグラフィーを用い精製した。その後、Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２を混合しタンパク質複合体を形成させた（図１）。抗Ｐエピトープにはリン酸化を受けるアミノ酸（セリン）が含まれ、生体内のリボソームではこれらタンパク質はリン酸化されているので、形成したＰ０・Ｐ１・Ｐ２複合体をカゼインキナーゼII処理し、リン酸化した。一方、抗２８Ｓ ＲＮＡ自己抗体が反応するリボソーム２８Ｓ ＲＮＡの１９２２−２０２０残基部位断片は対応する遺伝子をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼにより試験管内で転写し、合成した。その後、Ｐ０・Ｐ１・Ｐ２複合体とＲＮＡ断片を混合し、形成したタンパク質・ＲＮＡ複合体をショ糖密度勾配超遠心法により精製した。得られたＰ０・Ｐ１・Ｐ２・ＲＮＡ複合体を、アジュバンドと混合することなく、直接ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの足底に投与し免疫化した（図１）。そして、免疫化されたマウスからの鼠徑部リンパ細胞をミエローマ細胞（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１）と融合させ、ハイブリドーマを９６穴培養プレートで培養した。
（効果的モノクローナル自己抗体産出への効果）
得られたハイブリドーマ細胞が抗原複合体に対する抗体を産出しているかどうか各細胞の培地中に産出・放出された抗体の反応性を、免疫化に使用したＰ０・Ｐ１・Ｐ２・ＲＮＡ複合体抗原を用いて、ＥＬＩＳＡ法により解析した。抗原に対し反応する抗体を産出するハイブリドーマ細胞を全てについてクローン化を行った。最終的に得られたハイブリドーマクローンのそれぞれが産出する抗体について、タンパク質成分（Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２）との反応性はウエスタンブロット法で解析し、またＲＮＡ断片に対する反応性は、標識合成ＲＮＡを用いた免疫沈降法により解析した。

一連の免疫実験を二回行い、産出抗体を分析した（表１）。

一回目では得られたハイブリドーマ細胞が少なく、９クローンについて注目した。その結果、９クローンのうち１クローンがＰ０、Ｐ１、Ｐ２のＣ末端共通エピトープを認識する目的の抗Ｐ抗体であった。各タンパク質成分と特異的に反応する抗Ｐ０抗体、抗Ｐ１抗体、抗Ｐ２抗体や抗ＲＮＡ抗体を産出するハイブリドーマは得られなかった。

二回目の実験では多くのハイブリドーマ細胞が得られ、４６クローンについて産出抗体の反応性を分析した。
（本実施例で得られた抗Ｐ抗体の反応性）
免疫実験２で得られたモノクローナル抗体の４６クローン中２種類（９Ｄ５、４Ｈ１１）について、ラットリボソームタンパク質（Ａ）、カイコリボソームタンパク質（Ｂ）との反応性を分析した。約１０ｐｍｏｌのリボソーム中に含まれる全タンパク質成分をＳＤＳ処理後に電気泳動で分離し、ニトロセルロース膜に転写した。それを一定量の９Ｄ５、４Ｈ１１モノクローナル抗体と反応させ、以下、通常のイミュノブロット法を行った。その結果、Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２の三種のタンパク質と反応する抗Ｐ抗体が３４クローンから検出された。図２より、矢印で示す通り２種類のモノクローナル抗Ｐ抗体ともラット、カイコ両リボソームから調製したＰ０／Ｐ１／Ｐ２と交差反応し、典型的な抗Ｐ抗体の性質を示した（カイコについてはＰ１、Ｐ２の分子量が極めて近いためバンドが重なっている）。その他、２クローンから抗Ｐ０特異抗体の産出が認められたがＰ1、Ｐ2、およびＲＮＡ成分と特異的に反応する抗体産出細胞は検出されなかった。

ところで、本発明代表者らは１９９０年に、Ｐ１−Ｐ２二量体を抗原として、アジュバントを用いた従来型のマウス免疫化を試みている（非特許文献６）。この際、標準マウスＢａｌｂ ｃ、および自己免疫モデルマウスの一種、（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスを免疫化したが、いずれの場合も主な産出抗体は抗Ｐ１抗体と抗Ｐ２抗体で、得られた抗Ｐ抗体は（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスを用いた際の１クローンだけであった。これらの知見は、本抗体産出系が抗Ｐ自己抗体を優先的に産出させる点で優れていることを示している。
（抗原タンパク質のリン酸化による本実施例により得られた抗Ｐ抗体との反応性への効果）
本発明ではまた、リン酸化型蛋白質との反応性がわずかに異なる、二種類の抗Ｐモノクローナル抗体が得られた。一つはエピトープ部位に含まれるセリン残基のリン酸化型抗原とより強く反応する抗体、もう一方はこのセリン残基のリン酸化型と非リン酸化型で同等に反応する抗体である（図３Ａ、Ｂ）。それらの代表例として、９Ｄ５と４Ｈ１１の二種類のモノクローナル抗体の反応性を示す。

Ａ：ＥＬＩＳＡタイタープレートの各ウェルに２０ｐｍｏｌの抗原サンプルを次のように吸着させた；Ｐ１^-、非リン酸化型Ｐ１；Ｐ１⁺、リン酸化型Ｐ１；Ｐ２^-、非リン酸化型Ｐ２；Ｐ２⁺、リン酸化型Ｐ２；Ｃ、抗原タンパク質無添加。一定量の９Ｄ５（上）、４Ｈ１１（下）と反応させ、以下通常のＥＬＩＳＡ法により分析した。

Ｂ：Ａに示す各抗原（１０ｐｍｏｌ）をＳＤＳ処理後電気泳動で分離し、ニトロセルロース膜に転写した。それをＡと同様に２種類の抗体と反応させ、以下通常のイミュノブロット法にて分析した。

Ａ、Ｂとも９Ｄ５はリン酸化型蛋白質とより強く反応しているのに対し、４Ｈ１１はリン酸化型／非リン酸化型蛋白質とも同等に反応している。

以上のように、本発明により、このような二種類の抗Ｐ抗体をクローン化し、それらの存在を明確に示すことに成功した。
（本実施例により得られた抗Ｐ抗体によるリボソーム機能抑制効果の測定）
さらに、得られた抗Ｐ抗体によるリボソーム機能抑制効果を測定した。２．５ｐｍｏｌのラット８０Ｓリボソーム（Ａ）、甲殻類（アルテミア・サリーナ）８０Ｓリボソーム(Ｂ)に対し精製した９Ｄ５、４Ｈ１１モノクローナル抗体をそれぞれ１−３μｇ添加後、リボソーム翻訳因子（ＥＦ２）依存のＧＴＰ加水分解活性（ＧＴＰａｓｅ活性）を測定した。その結果、両タイプの抗体ともほぼ同等に、リボソームの翻訳因子に依存したＧＴＰ加水分解活性を効率よく抑制した（図４Ａ、Ｂ）。

これらの結果より、得られた両抗体とも、リボソーム機能構造を認識することが示された。前述したように、自己抗体は生体高分子の機能構造の有効なプローブとなるが、本発明は、多くの有効なモノクローナル自己抗体の調製と利用に活用できる可能性が示唆された。

本実施例における、リボソーム中の抗Ｐ自己抗原成分からのタンパク質・ＲＮＡ複合体再構成とマウスの免疫化を示す概略図である。 Ａ：本実施例で得られた９Ｄ５及び４Ｈ１１と、ラットリボソームタンパク質の反応性を示すイミュノブロット法の結果を示す写真である。

Ｂ：本実施例で得られた９Ｄ５及び４Ｈ１１とカイコリボソームタンパク質の反応性を示すイミュノブロット法の結果を示す写真である。
Ａ：本実施例において得られた９Ｄ５及び４Ｈ１１の反応性を示すＥＬＩＳＡ法による結果を示す写真である。

Ｂ：本実施例において得られた９Ｄ５及び４Ｈ１１の反応性を示すイミュノブロット法による結果を示す写真である。
Ａ：ラット８０Ｓリボソームに対し精製した９Ｄ５及び４Ｈ１１によるリボソーム機能抑制効果を示すグラフである。

Ｂ：甲殻類（アルテミア・サリーナ）８０Ｓリボソームに対し精製した９Ｄ５及び４Ｈ１１によるリボソーム機能抑制効果を示すグラフである。

Claims (9)

1. タンパク質・ＲＮＡ複合体を動物に投与、免疫化し、免疫化された動物から得られた目的の抗体産成細胞をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を得、得られたハイブリドーマ細胞を培養することによりモノクローナル抗体を得ることを特徴とするモノクローナル抗体の作成方法。
2. 前記タンパク質がリボソーム構成タンパク質であることを特徴とする請求項１記載のモノクローナル抗体の作成方法。
3. 前記リボソーム構成タンパク質がＰ０及び／又はＰ１及び／又はＰ２であることを特徴とする請求項２記載のモノクローナル抗体の作成方法。
4. 前記ＲＮＡがリボソームＲＮＡであることを特徴とする請求項１記載のモノクローナル抗体の作成方法。
5. 前記リボソームＲＮＡがリボソーム２８Ｓ ＲＮＡであることを特徴とする請求項４記載のモノクローナル抗体の作成方法。
6. 前記タンパク質・ＲＮＡ複合体がＰ０・Ｐ１・Ｐ２・ＲＮＡ複合体であることを特徴とする請求項１記載のモノクローナル抗体の作成方法。
7. 前記動物がマウスであることを特徴とする請求項１記載のモノクローナル抗体の作成方法。
8. 前記マウスが自己免疫モデルマウスであることを特徴とする請求項７記載のモノクローナル抗体の作成方法。
9. 請求項１〜８記載のモノクローナル抗体の作成方法により得られたことを特徴とするモノクローナル抗体。