JP2008074732A - Method for maintaining activity of bone morphonogenetic protein and activity promoter - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヘパラン硫酸及び／又はヘパリンを用い骨誘導因子であるＢＭＰの活性を維持する方法に関するものである。 The present invention relates to a method for maintaining the activity of BMP, which is an osteoinductive factor, using heparan sulfate and / or heparin.
まず、本出願書類において用いる略号を説明する。
ＨＳ：ヘパラン硫酸
Ｈｅｐ：ヘパリン
ＢＭＰ：骨形成因子（Bone morphogenetic protein）
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動
骨組織は、骨吸収と骨形成からなる骨代謝が一定のバランスを保ちながら繰り返されている動的組織である。骨吸収と骨形成の均衡は、骨形成を担当する骨芽細胞と骨吸収を担当する破骨細胞の両方により厳密に調節されており（非特許文献１）、この均衡が崩れると、骨組織は異常をきたし、種々の疾患を呈する。
First, abbreviations used in the application documents will be described.
HS: Heparan sulfate Hep: Heparin BMP: Bone morphogenetic protein
GAG: Glycosaminoglycan SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide electrophoresis Bone tissue is a dynamic tissue in which bone metabolism consisting of bone resorption and bone formation is repeated while maintaining a certain balance. The balance between bone resorption and bone formation is strictly regulated by both osteoblasts responsible for bone formation and osteoclasts responsible for bone resorption (Non-patent Document 1). Causes abnormalities and presents with various diseases.
ＨｅｐやＨＳをはじめとするＧＡＧは、細胞外マトリクスの構成成分の一つとして生体内に存在しており、近年、Ｈｅｐを単独投与することによって骨芽細胞の分化を阻害し、骨粗鬆症を誘発するといった報告や、他の増殖因子との相互作用により生物学的活性を持つという報告がなされている（非特許文献２、３）。
GAGs such as Hep and HS are present in vivo as one of the components of the extracellular matrix, and in recent years, administration of Hep alone inhibits osteoblast differentiation and induces osteoporosis. And reports that it has biological activity by interaction with other growth factors (
ＢＭＰは、異所性骨誘導活性を示す物質であり、皮下組織又は筋組織内の未分化間葉系細胞に作用して、これを軟骨芽細胞又は骨芽細胞に分化させ、軟骨又は骨を形成させる活性タンパク質である。このＢＭＰは、マウス、ラット、ウサギなどの小動物においてはマイクログラムのオーダーで骨形成を誘導することができるが、サルのような高等哺乳動物においては、小動物の場合と比較して骨形成誘導能が低く、骨形成誘導を得るためには通常ミリグラムオーダーのＢＭＰが必要だということが知られている。この原因としては動物種の違いによりＢＭＰの細胞応答性が異なることなどが考えられるが、ＢＭＰが安定して有効濃度を保持されていない、すなわち移植部位からのＢＭＰの速やかな消失や負のフィードバック機構、内因性の阻害物質の存在が疑われている（非特許文献４，５）。ＢＭＰの大量投与では予期できない副作用の危険性があり、従って、体内において安定かつ有効濃度を維持し、より少ない量のＢＭＰ投与量で骨形成を誘導しうる方法の開発が求められている。
BMP is a substance exhibiting ectopic osteoinductive activity and acts on undifferentiated mesenchymal cells in subcutaneous tissue or muscle tissue to differentiate it into chondroblasts or osteoblasts, and Active protein to be formed. This BMP can induce bone formation on the order of micrograms in small animals such as mice, rats, and rabbits, but in higher mammals such as monkeys, it can induce bone formation compared to small animals. It is known that a BMP of the order of milligrams is usually necessary to obtain osteogenesis induction. This may be due to differences in cell responsiveness of BMP depending on the animal species, but BMP is not stably maintained at an effective concentration, that is, rapid disappearance of BMP from the transplantation site or negative feedback. The mechanism and existence of endogenous inhibitors are suspected (
本発明は、ＨＳ及び／又はＨｅｐをＢＭＰと共存させることにより、低濃度のＢＭＰで骨形成を誘導し、骨欠損を有効に治療しうる薬剤を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a drug capable of effectively treating bone defects by inducing bone formation with a low concentration of BMP by allowing HS and / or Hep to coexist with BMP.
本発明の発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＨＳ及びＨｅｐがＢＭＰの活性を有意に持続させることを見いだし、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the inventors of the present invention have found that HS and Hep significantly maintain the activity of BMP, and have completed the present invention.
すなわち本発明は、ＨＳ及び／又はＨｅｐを共存させることを特徴とする、ＢＭＰ−２の活性の維持方法（以下、「本発明方法」という。）を提供する。 That is, the present invention provides a method for maintaining the activity of BMP-2 (hereinafter referred to as “the method of the present invention”) characterized in that HS and / or Hep coexist.
また、本発明方法を用いることにより、ＨＳ及び／又はＨｅｐを有効成分として含んでなる、ＢＭＰ−２の活性維持剤（以下、「本発明維持剤」という。）を提供する。 Further, by using the method of the present invention, an activity maintenance agent for BMP-2 (hereinafter referred to as “the maintenance agent of the present invention”) comprising HS and / or Hep as an active ingredient is provided.
また本発明は、ＢＭＰ−２並びにＨＳ及び／又はＨｅｐを有効成分として含んでなる、細胞増殖促進剤（以下、「本発明促進剤１」という。）を提供する。
The present invention also provides a cell growth promoter (hereinafter referred to as “the
また本発明は、ＢＭＰ−２並びにＨＳ及び／又はＨｅｐを有効成分として含んでなる、細胞の分化促進剤（以下、「本発明促進剤２」という。）を提供する。
The present invention also provides a cell differentiation promoting agent (hereinafter referred to as “the present
上記本発明促進剤１及び２をあわせて単に「本発明促進剤」という。
The
本発明促進剤は「細胞」が、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞及び歯根膜由来細胞の群から選ばれる１又は２以上の細胞であることが好ましく、骨若しくは軟骨の形成促進剤又は再生促進剤として用いられることがさらに好ましく、特に歯周組織の形成促進又は再生促進剤として用いられることが極めて好ましい。 In the promoter of the present invention, the “cell” is preferably one or more cells selected from the group of osteoblasts, chondroblasts, cementoblasts, bone marrow-derived mesenchymal stem cells and periodontal ligament-derived cells, More preferably, it is used as a bone or cartilage formation promoter or regeneration promoter, and particularly preferably used as a periodontal tissue formation promoter or regeneration promoter.
本発明により、ＢＭＰの活性を維持する方法が提供される。また、共存させるＨＳ及び／又はＨｅｐの濃度を調節することにより、ＢＭＰの活性を調節する方法が提供される。また本発明促進剤が提供される。 The present invention provides a method for maintaining the activity of BMP. Moreover, the method of adjusting the activity of BMP is provided by adjusting the density | concentration of HS and / or Hep to coexist. Moreover, this invention promoter is provided.
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
＜１＞ 本発明方法
本発明は、ＨＳ及び／又はＨｅｐを共存させることを特徴とする、ＢＭＰ−２の活性の維持方法である。
Hereinafter, the present invention will be described in detail by the best mode for carrying out the invention.
<1> Method of the present invention The present invention is a method for maintaining the activity of BMP-2, characterized by allowing HS and / or Hep to coexist.
本発明方法において用いる「ＨＳ」及び「Ｈｅｐ」は広く市販されているもの（例えば生化学工業（株）社製）を用いることができる。またこれらは既知の方法を用いて適宜調製することができる。 As “HS” and “Hep” used in the method of the present invention, those commercially available (for example, manufactured by Seikagaku Corporation) can be used. Moreover, these can be suitably prepared using a known method.
本発明方法において用いる「ＢＭＰ−２」は強力な骨分化誘導性を有しており、筋肉内に存在する骨分化に感受性をもつ幹細胞に作用し、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞への分化の振り分けを行う。またＢＭＰ−２は、前骨芽細胞に作用し、アルカリ性ホスファターゼ（以下、ＡＬＰと略記する。）活性、副甲状腺ホルモンに対する応答性、オステオカルシン産生、コラーゲン合成等を上昇させて骨芽細胞への分化を誘導するタンパク質であり広く市販されているものを用いることができる。また既知の方法を用いて適宜調製することもできる。 “BMP-2” used in the method of the present invention has strong osteoinductivity and acts on stem cells sensitive to bone differentiation present in muscles, and can be applied to chondrocytes, osteoblasts, and adipocytes. Perform differentiation. BMP-2 acts on preosteoblasts and increases alkaline phosphatase (hereinafter abbreviated as ALP) activity, responsiveness to parathyroid hormone, osteocalcin production, collagen synthesis, etc., and differentiation into osteoblasts. It is possible to use a commercially available protein that induces. Moreover, it can also prepare suitably using a known method.
本発明方法において用いる「共存」とはＨＳ及び／又はＨｅｐとＢＭＰ−２とが相互に接触する状態である限りにおいて特に限定されない。例えば、これらを培地に同時に添加してもよく、ＨＳ及び／又はＨｅｐが存在する培地中に後からＢＭＰ−２を添加してもよい。 “Coexistence” used in the method of the present invention is not particularly limited as long as HS and / or Hep and BMP-2 are in contact with each other. For example, these may be added simultaneously to the medium, or BMP-2 may be added later to the medium in which HS and / or Hep is present.
また、共存させる条件もＨＳ及び／又はＨｅｐのＢＭＰ−２の活性の持続効果及びＢＭＰ−２の活性自体に悪影響を与えない限りにおいて特に限定されないが、２５〜４５℃程度であることが好ましく、３０℃〜４０℃であることがより好ましく、３５〜３８℃であることが極めて好ましい。 Further, the coexisting conditions are not particularly limited as long as they do not adversely affect the sustaining effect of BMP-2 activity of HS and / or Hep and the activity of BMP-2 itself, but it is preferably about 25 to 45 ° C., It is more preferably 30 ° C to 40 ° C, and most preferably 35 to 38 ° C.
また、ＢＭＰ−２とＨＳ及び／又はＨｅｐとを共存させるときのそれぞれの濃度の割合も特に限定はされず、その持続させる目的に応じて当業者が適宜選択できるが、例えば１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−２に対して０．１〜１００μｇ／ｍＬ、１〜１０μｇ／ｍＬ等の条件で行うことができる。 Moreover, the ratio of each concentration when BMP-2 and HS and / or Hep coexist is not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the purpose of sustaining, for example, 100 ng / mL BMP. -2 to 0.1-100 μg / mL, 1-10 μg / mL and the like.
ＡＬＰ活性は、幹細胞や骨芽細胞の前駆細胞が骨芽細胞に分化する際のその分化の程度を示す指標となるものであり、この活性が高いほど骨形成能が高いことを示すものである。 The ALP activity is an index indicating the degree of differentiation of progenitor cells of stem cells and osteoblasts into osteoblasts, and the higher this activity, the higher the bone forming ability. .
また、本発明方法において用いる「ＢＭＰ−２の活性の維持」とは、ＢＭＰ−２を単独で投与した場合その活性が消失してしまうような期間（本実施例１で示す実験条件において細胞を培養した場合の６日以降の期間）であっても、活性を保持することをいう。この維持の効果を測定する方法は後述する実施例１の通りである。すなわち実施例１の条件において、６日以上活性を有していればＢＭＰ−２の活性を維持している。 In addition, “maintaining the activity of BMP-2” used in the method of the present invention means a period in which the activity disappears when BMP-2 is administered alone (cells under the experimental conditions shown in Example 1). Even if it is a period after 6 days in the case of culturing), it means that the activity is retained. The method for measuring the effect of this maintenance is as in Example 1 described later. That is, in the condition of Example 1, the activity of BMP-2 is maintained if the activity is 6 days or longer.
また後述する実施例からわかるように、ＢＭＰ−２の活性は共存させるＨＳ及び／又はＨｅｐの濃度依存的に抑制することができる。また、ＨＳ及び／又はＨｅｐの濃度によって維持されるＢＭＰ−２の活性も調節することができる。その活性を増強の方向へ調節させるには、実施例の条件で６日以上ＨＳ及び／又はＨｅｐをＢＭＰ−２と共存させることで、通常ならば消失してしまうＢＭＰ−２の活性が維持されているので、例えば１〜１０μｇ／ｍＬ投与し、６日以上共存させることにより増強できる。また、共存させてから４日程度までは濃度依存的に抑制させる方向に調節することができる。このことから、本発明方法は、ＢＭＰ−２の活性調節方法としての思想を含有するものである。
＜２＞ 本発明維持剤
本発明方法を応用することにより、ＨＳ及び／又はＨｅｐを有効成分として含んでなる、ＢＭＰ−２の活性維持剤を提供することができる。
Moreover, as can be seen from the examples described later, the activity of BMP-2 can be suppressed depending on the concentration of HS and / or Hep that coexist. The activity of BMP-2 maintained by the concentration of HS and / or Hep can also be regulated. In order to adjust the activity in the direction of enhancement, the activity of BMP-2, which normally disappears, is maintained by allowing HS and / or Hep to coexist with BMP-2 for 6 days or more under the conditions of the examples. Therefore, it can be enhanced by, for example, administering 1 to 10 μg / mL and allowing it to coexist for 6 days or more. Moreover, it can adjust to the direction made to suppress depending on density | concentration for about 4 days after making it coexist. Therefore, the method of the present invention includes the idea as a method for regulating the activity of BMP-2.
<2> Maintenance agent of the present invention By applying the method of the present invention, an activity maintenance agent of BMP-2 comprising HS and / or Hep as an active ingredient can be provided.
本発明維持剤によりＢＭＰ−２の活性は初期（例えば本明細書実施例１の条件において細胞を培養した場合の４日程度の期間）の段階ではその活性は抑制されるが、ＢＭＰ−２の活性が消失してしまうような期間（本実施例１で示す実験条件において細胞を培養した場合の６日以降の期間）も本発明維持剤を用いることによりその活性を維持することができる。 The maintenance agent of the present invention suppresses the activity of BMP-2 at the initial stage (for example, a period of about 4 days when cells are cultured under the conditions of Example 1 of the present specification). The activity can be maintained by using the maintenance agent of the present invention even during a period in which the activity disappears (a period after 6 days when cells are cultured under the experimental conditions shown in Example 1).
本発明維持剤のＢＭＰ−２の活性が維持されることが望まれる細胞や組織への適用方法も、本発明維持剤による維持効果が発揮される限りにおいて特に限定されず、本発明維持剤の具体的用途に応じて適宜選択することができる。例えば細胞や組織への適応方法もその具体的用途に応じて適宜選択できる。例えば細胞や組織の実験用試薬として用いる場合には、培養液等に本発明維持剤を添加してこれを用いて細胞や組織を培養してもよいし、細胞や組織に本発明維持剤を直接添加してもよい。 The method of applying the maintenance agent of the present invention to cells and tissues where it is desired that the activity of BMP-2 is maintained is not particularly limited as long as the maintenance effect of the maintenance agent of the present invention is exhibited. It can select suitably according to a specific use. For example, a method for adapting to cells and tissues can be appropriately selected according to the specific application. For example, when used as an experimental reagent for cells or tissues, the maintenance agent of the present invention may be added to a culture solution or the like, and the cells or tissues may be cultured using the same. It may be added directly.
本発明維持剤は、ＢＭＰ−２の維持が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。 The maintenance agent of the present invention can be administered to an animal in a state where maintenance of BMP-2 is desired.
本発明維持剤を医薬として用いる場合、そのエンドトキシン濃度は、溶液形態の剤とした場合においては０．３ＥＵ／ｍＬ以下であることが好ましい。エンドトキシン濃度は、当業者に周知慣用のエンドトキシン測定法を用いて測定することができるが、カブトガニ・アメボサイト・ライセート成分を用いるリムルス試験法が好ましい。なお、ＥＵ（エンドトキシン単位）は、日本工業規格生化学試薬通則（ＪＩＳ Ｋ８００８）、又は米国薬局方等に従って測定・算出できる。 When the maintenance agent of the present invention is used as a medicine, the endotoxin concentration is preferably 0.3 EU / mL or less in the case of a solution form agent. The endotoxin concentration can be measured using a conventional endotoxin measurement method well known to those skilled in the art, but the Limulus test method using horseshoe crab, amebocyte, lysate components is preferred. In addition, EU (endotoxin unit) can be measured and calculated in accordance with Japanese Industrial Standard Biochemical Reagent General Rules (JIS K8008) or the United States Pharmacopoeia.
また、本発明維持剤はＨＳ及び／又はＨｅｐのＢＭＰ−２の活性の持続効果に悪影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分（例えば、ヒアルロン酸）や、慣用の安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用することができる。 In addition, the maintenance agent of the present invention has other pharmaceutically active ingredients (for example, hyaluronic acid), conventional stabilizers, emulsifiers, as long as it does not adversely affect the sustained effect of HS and / or Hep BMP-2 activity. Ingredients usually used for pharmaceuticals such as osmotic pressure adjusting agent, pH adjusting agent, buffering agent, tonicity agent, preservative, soothing agent, coloring agent, excipient, binder, lubricant, disintegrant, etc. are used. can do.
本発明維持剤を医薬とする場合、その投与量は、投与の目的（予防、悪化防止、症状の改善又は治療）、疾患の種類、患者の症状、性別、年齢、体重、投与部位、投与方法等
によって個別に設定されるべきものであり特に限定されないが、成人１人１回あたり概ね、ＨＳ又はＨｅｐの量として１ｎｇ／投与部位〜３０ｍｇ／投与部位程度を投与することができる。
When the maintenance agent of the present invention is used as a medicine, the dose is determined according to the purpose of administration (prevention, prevention of deterioration, improvement or treatment of symptoms), disease type, patient symptoms, sex, age, weight, administration site, administration method Although it should be set individually according to the above and the like, it is not particularly limited. In general, 1 ng / dose site to 30 mg / dose site can be administered as an amount of HS or Hep per adult.
また本発明維持剤は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて経口投与または非経口投与することができる。 Further, the maintenance agent of the present invention is prepared in a form to be prepared (oral administration such as tablets, pills, capsules, powders, granules, syrups; parenteral administration such as injections, drops, external preparations, suppositories). Depending on the above, it can be administered orally or parenterally.
また本発明維持剤は、ＨＳ及び／又はＨｅｐがＢＭＰ−２と共存しているときの濃度を変化させることによりＢＭＰ−２の活性を調節する活性調節剤としても使用でき、その概念も包含するものである。 The maintenance agent of the present invention can also be used as an activity regulator that regulates the activity of BMP-2 by changing the concentration when HS and / or Hep coexists with BMP-2, and includes the concept thereof. Is.
本発明維持剤において用いる「ＢＭＰ−２」、「ＨＳ」、「Ｈｅｐ」及び「共存」等の用語は本発明方法と同じ意義で用いられる。
＜３＞本発明促進剤１
本発明促進剤１はＢＭＰ−２並びにＨＳ及び／又はＨｅｐを有効成分として含んでなる、細胞増殖促進剤である。
Terms such as “BMP-2”, “HS”, “Hep” and “coexistence” used in the maintenance agent of the present invention are used in the same meaning as in the method of the present invention.
<3>
The
ＢＭＰ−２は、未分化間葉系細胞に作用して、これを軟骨芽細胞又は骨芽細胞に分化させ、軟骨又は骨を形成させる活性タンパク質であり、その活性を維持することにより細胞の増殖を促進することができる。 BMP-2 is an active protein that acts on undifferentiated mesenchymal cells and differentiates them into chondroblasts or osteoblasts to form cartilage or bone. By maintaining this activity, cell proliferation Can be promoted.
したがって本発明促進剤１は、前記本発明方法を利用しＨＳ及び／又はＨｅｐがＢＭＰ−２の活性を維持することにより、長い時間ＢＭＰ−２の細胞増殖能を維持することができる剤である。
Therefore, this
本発明促進剤１により、細胞の増殖が促進される効果は濃度依存的に初期の段階では抑制されるが、その活性が長期にわたり維持されることにより細胞の増殖を促進することができる。
The effect of promoting cell growth by the
本発明促進剤１の、促進が望まれている細胞や組織への適用方法も、本発明促進剤１による促進効果が発揮される限りにおいて特に限定されず、本発明促進剤１の具体的用途に応じて適宜選択することができる。実験試薬としての例示としては本発明維持剤又は実施例を参照されたい。
The application method of the
本発明促進剤１を医薬とする場合、その投与量は、投与の目的（予防、悪化防止、症状の改善又は治療）、疾患の種類、患者の症状、性別、年齢、体重、投与部位、投与方法等
によって個別に設定されるべきものであり特に限定されないが、成人１人１回あたり概ね、ＢＭＰ−２の量として１ｐｇ／投与部位〜３０ｍｇ／投与部位程度を投与することができる。
When the
本発明促進剤１を医薬とする場合、これが投与される動物も特に限定されないが、脊椎動物が好ましく、哺乳動物がより好ましく、ヒトが特に好ましい。
When the
本発明促進剤１は、細胞の増殖が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。特に、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、又は歯根膜由来細胞の増殖が望まれている状態にある動物に投与されることが好ましい。このような細胞の増殖が望まれている状態としては、例えば歯周疾患、骨折、骨欠損、骨粗鬆症、関節疾患、整形外科的疾患（離断性骨軟骨炎、変形性膝関節症など）、腫瘍等に罹患している場合や、歯科治療（歯周治療など）、整形外科治療（培養細胞移植術、骨穿孔術、骨軟骨柱移植術など）、腫瘍摘出術による骨移植、骨補填が施された直後の状態等が例示される。
The
また本発明促進剤１を骨若しくは軟骨の形成促進剤又は再生促進剤として用いる場合には、骨若しくは軟骨の形成促進又は再生促進が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。骨若しくは軟骨の形成促進又は再生促進が望まれている状態の例示は、前記の細胞の増殖の場合と同様である。
Further, when the
本発明において骨形成促進作用とは、骨や軟骨の形成作用を促すものであれば特に限定されず、例えば、間葉系幹細胞からの得が細胞への分化促進作用、未分化間葉系細胞からの骨芽細胞への分化促進作用、前骨芽細胞からの骨芽細胞への分化促進作用、骨基質の形成促進作用、骨基質の石灰化作用、骨芽細胞からの骨細胞への分化促進作用、軟骨内骨化誘導作用等が例示される。また、骨形成促進作用の有無については、特に限定されないが実施例のようにＡＬＰ活性の測定を行うことにより簡便に測定することができる。 In the present invention, the bone formation promoting action is not particularly limited as long as it promotes the action of forming bone or cartilage. For example, the action obtained from mesenchymal stem cells is the differentiation promoting action into cells, and the undifferentiated mesenchymal cells. -Promoting differentiation from osteoblast to osteoblast, promoting osteogenesis from pre-osteoblast, promoting formation of bone matrix, calcification of bone matrix, differentiation from osteoblast to bone cell Examples thereof include an promoting action and an endochondral ossification inducing action. Further, the presence or absence of the bone formation promoting action is not particularly limited, but it can be easily measured by measuring the ALP activity as in Examples.
また、歯周組織の形成促進剤又は再生促進剤として用いる場合には、歯周組織の形成促進又は再生促進が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。歯周組織の形成促進又は再生促進が望まれている状態の例示は、前記の細胞の増殖の場合と同様である。 Further, when used as a periodontal tissue formation promoter or regeneration promoter, it can be administered to an animal in a state where promotion of periodontal tissue formation or regeneration is desired. An example of a state in which periodontal tissue formation promotion or regeneration promotion is desired is the same as in the case of cell proliferation.
その他の本発明促進剤１の好ましい条件は、前述した本発明維持剤を参照されたい。
For other preferable conditions of the
また、本発明促進剤１において用いる「ＢＭＰ−２」、「ＨＳ」及び「Ｈｅｐ」の用語は本発明方法と同じ意義で用いられる。
＜４＞本発明促進剤２
本発明促進剤２は、ＢＭＰ−２並びにＨＳ及び／又はＨｅｐを有効成分として含んでなる、細胞の分化促進剤である。
The terms “BMP-2”, “HS”, and “Hep” used in the
<4>
The
本発明促進剤２は、前記本発明方法を利用しＨＳ及び／又はＨｅｐがＢＭＰ−２の活性を維持することにより、より長い時間ＢＭＰ−２の細胞の分化作用を維持する方法を利用したものである。
This
本発明促進剤２の、促進が望まれている細胞や組織への適用方法も、本発明促進剤２による促進効果が発揮される限りにおいて特に限定されず、本発明促進剤２の具体的用途に応じて適宜選択することができる。実験試薬としての例示としては本発明維持剤又は実施例を参照されたい。
The method of applying the
本発明促進剤２は、細胞の分化が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。特に、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、又は歯根膜由来細胞の分化が望まれている状態にある動物に投与されることが好ましい。このような細胞の分化が望まれている状態の例示は、前記の本発明促進剤１における場合と同様である。
The
本発明促進剤２を医薬とする場合、その投与量は、投与の目的（予防、悪化防止、症状の改善又は治療）、疾患の種類、患者の症状、性別、年齢、体重、投与部位、投与方法等
によって個別に設定されるべきものであり特に限定されないが、成人１人１回あたり概ね、ＢＭＰ−２の量として１ｐｇ／投与部位〜３０ｍｇ／投与部位程度を投与することができる。
When the
また、その他の本発明促進剤２の好ましい条件や好ましい投与形態等は前述した本発明維持剤や本発明促進剤１等を参照されたい。
For the other preferable conditions and preferable dosage forms of the
本発明促進剤で用いられる、「ＢＭＰ−２」、「ＨＳ」、「Ｈｅｐ」並びに本発明促進剤を医薬として用いる場合の好ましい条件等は本発明促進剤１と同様である。
“BMP-2”, “HS”, “Hep” used in the accelerator of the present invention, and preferable conditions for using the accelerator of the present invention as a medicament are the same as those of the
以下、本発明を実施例により更に具体的に詳説するが、本発明は以下の具体例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the following specific examples.
参考例１
ＡＬＰ活性のＢＭＰ−２濃度依存性
マウス頭頂骨由来前骨芽細胞様細胞（MC3T3-E1細胞）を５％のウシ胎児血清（ベーリンガー社製、以下ＦＢＳと略記する。）含有Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ａｌｐｈａ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ社製、以下αＭＥＭと略記する。）培地にて、３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。２４時間の培養の後、４０、８０ng/mLの遺伝子組換えヒトBMP-2（rhBMP-2、山之内製薬社製）添加又は無添加の条件にて培養した。ALP活性の定量的解析は、Fujiiらの方法（例えば、非特許文献６参照）に従い、Sigma Fast p-nitrophenyl phosphate tablet setを用いて行った。その結果を図１に示す。
Reference example 1
BLP-2 concentration dependence of ALP activity Minimal Essential Medium Alpha Medium containing 5% fetal bovine serum (manufactured by Boehringer, hereinafter abbreviated as FBS) of mouse parietal bone-derived preosteoblast-like cells (MC3T3-E1 cells) (Gibco, hereinafter abbreviated as αMEM.) Cultured at 37 ° C. in a CO 2 incubator for 24 hours. After culturing for 24 hours, the cells were cultured with or without 40 or 80 ng / mL recombinant human BMP-2 (rhBMP-2, manufactured by Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.). Quantitative analysis of ALP activity was performed using Sigma Fast p-nitrophenyl phosphate tablet set according to the method of Fujii et al. (For example, see Non-Patent Document 6). The result is shown in FIG.
図１に示す通り、MC3T3-E1細胞において、rhBMP-2刺激により濃度依存的に骨芽細胞への分化を誘導することがわかる。 As shown in FIG. 1, it can be seen that MC3T3-E1 cells induce differentiation into osteoblasts in a concentration-dependent manner by rhBMP-2 stimulation.
実施例１
ＨＳ及びＨｅｐのＢＭＰ−２によるＡＬＰ活性の促進作用に及ぼす影響
MC3T3-E1細胞を、５％ＦＢＳを含むαＭＥＭ（コントロール）培地、ＨＳ（生化学工業社製）若しくはＨｅｐ（生化学工業社製）のみをそれぞれ１００μｇ／ｍＬ添加した同培地又はＨＳ若しくはＨｅｐを０〜１００μｇ／ｍＬ添加し、さらに８０ng/mLのrhBMP-2を含む培地で、３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。その後さらに、それぞれの細胞を２、４及び６日間培養し、参考例１と同様の方法でＡＬＰ活性を測定した。その結果を図２〜７に示す。
Example 1
Effect of HS and Hep on the promotion of ALP activity by BMP-2
MC3T3-E1 cells were mixed with αMEM (control) medium containing 5% FBS, HS (manufactured by Seikagaku Corporation) or Hep (manufactured by Seikagaku Corporation) alone at 100 μg / mL, respectively, or HS or Hep was 0. ˜100 μg / mL was added, and further cultured in a medium containing 80 ng / mL rhBMP-2 in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours. Thereafter, each cell was further cultured for 2, 4 and 6 days, and ALP activity was measured in the same manner as in Reference Example 1. The results are shown in FIGS.
コントロールと比較することにより、ＨＳ及びＨｅｐの単独投与では、ＡＬＰ活性は低下していることがわかる。また図２、３、５及び６の結果より、ＢＭＰ−２との併用投与の際におけるＨＳ及びＨｅｐの濃度依存的にＡＬＰ活性を抑制していることがわかる。図４及び７より６日後の結果よりＢＭＰ−２単独の場合と比較して、ＨＳ又はＨｅｐとの併用投与の場合の方が、ＡＬＰ活性が高いことがわかる。これらの結果よりＨＳ又はＨｅｐと共存させることによってＢＭＰの活性が維持されることがわかる。 By comparing with the control, it can be seen that ALP activity is reduced by single administration of HS and Hep. In addition, the results shown in FIGS. 2, 3, 5 and 6 indicate that ALP activity is suppressed depending on the concentration of HS and Hep upon combined administration with BMP-2. 4 and 7, it can be seen from the results after 6 days that the ALP activity is higher in the case of combined administration with HS or Hep than in the case of BMP-2 alone. These results show that the activity of BMP is maintained by coexisting with HS or Hep.
実施例２
ＧＡＧのOsterix ｍＲＮＡ及びRunx2 ｍＲＮＡの発現に及ぼす影響
次にＢＭＰ−２が発現する転写因子である、Osterix及びRunx2に及ぼすＨＳ及びＨｅｐの影響についてＲＴ−ＰＣＲ法（逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応法）を行うことにより検討した。
Example 2
The effect of GAG on Osterix mRNA and Runx2 mRNA expression Next, the effect of HS and Hep on Osterix and Runx2, which are transcription factors expressed by BMP-2, is determined by RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction). We examined by doing.
MC3T3-E1細胞を５％ＦＢＳ含有αＭＥＭ培地に播種し、１２ウェルプレート中で２４時間培養した。細胞濃度を４×１０５個／ｍＬに調整し、ここにＨｅｐ、ＨＳそれぞれ単独で１００μｇ／ｍＬ、１００ng/mLのＢＭＰ−２、１００μｇ／ｍＬのＨｅｐと１００ng/mLのＢＭＰ−２とを共存させたもの又は１００μｇ／ｍＬのＨＳと１００ng/mLのＢＭＰ−２とを共存させたものをそれぞれ添加し、４，１２，７２時間培養した。 MC3T3-E1 cells were seeded in 5% FBS-containing αMEM medium and cultured in 12-well plates for 24 hours. The cell concentration was adjusted to 4 × 10 5 cells / mL, and here, Hep and HS alone were 100 μg / mL, 100 ng / mL BMP-2, 100 μg / mL Hep and 100 ng / mL BMP-2, respectively. And 100 μg / mL HS and 100 ng / mL BMP-2 coexisting were added, respectively, and cultured for 4, 12, 72 hours.
培養後、細胞を回収し、Total RNA Extraction Miniprep System（バイオジーン社製）を使用し、Total RNAを抽出した。その後Dnase Iにて処理し、oligo-dT primer を使用し逆転写を行った。 After culturing, the cells were collected, and total RNA was extracted using Total RNA Extraction Miniprep System (manufactured by Biogene). Thereafter, it was treated with Dnase I, and reverse transcription was performed using oligo-dT primer.
その後ＲＴ−ＰＣＲを行った（９分間 ９５℃、３５サイクル、４０秒間 ９４℃、４０秒間 ６０℃、９分間 ７２℃）。PCRプライマーとしては以下のプライマーを用いた。また対照としてはグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（以下、ＧＡＰＤＨと略記する。）用いた。
使用したプライマー
Osterix-forward：5’-ctggggaaaggaggcacaaagaag-3’
Osterix-reverse：5’-gggttaaggggagcaaagtcagat-3’
Runx2-forward：5’-ccagatgggactgtggttacc-3’
Runx2-reverse：5’-acttggtgcagagttcaggg-3’
GAPDH-forward: 5’-accacagtccatgccatcac-3’
GAPDH-reverse: 5’-tccaccaccctgttgctgta-3’
ＰＣＲを行ったものを、２％アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチルブロマイドにて染色を行った。その結果得られた電気泳動図を図８及び９に示す。
RT-PCR was then performed (9 minutes 95 ° C., 35 cycles, 40 seconds 94 ° C., 40
Primers used
Osterix-forward: 5'-ctggggaaaggaggcacaaagaag-3 '
Osterix-reverse: 5'-gggttaaggggagcaaagtcagat-3 '
Runx2-forward: 5'-ccagatgggactgtggttacc-3 '
Runx2-reverse: 5'-acttggtgcagagttcaggg-3 '
GAPDH-forward: 5'-accacagtccatgccatcac-3 '
GAPDH-reverse: 5'-tccaccaccctgttgctgta-3 '
Those subjected to PCR were electrophoresed using a 2% agarose gel and stained with ethyl bromide. The resulting electropherograms are shown in FIGS.
Osterixの発現において、ＢＭＰ−２のみを投与したものと比較してＨＳ又はＨｅｐをＢＭＰ−２と併用投与した場合には投与３日後に強く発現していることがわかる。また、投与後１２時間後のバンドを見ると、ＨｅｐとＢＭＰ−２の併用投与ではバンドが見えなかったが、ＨＳとＢＭＰ−２との併用投与ではバンドが見られた。この結果から本発明を医薬として用いる際、ＢＭＰ−２とＨｅｐとの併用に比較して、ＨＳとの併用投与の方が初期の段階から効果があることが示唆される。 It can be seen that in the expression of Osterix, when HS or Hep was administered in combination with BMP-2 in comparison with those administered with BMP-2 alone, it was strongly expressed 3 days after administration. Moreover, when the band 12 hours after administration was seen, the band was not seen in the combined administration of Hep and BMP-2, but the band was seen in the combined administration of HS and BMP-2. This result suggests that when using the present invention as a pharmaceutical, the combined administration with HS is more effective than the initial combination as compared with the combined use of BMP-2 and Hep.
またRunx2の発現に関しても同様の結果が得られた。 Similar results were obtained for Runx2 expression.
実施例３
ＧＡＧ及びＢＭＰ−２のSmad1/5/8及びp38のシグナル伝達活性に及ぼす影響
次にＢＭＰに関連するシグナル伝達物質のSmadとp38に及ぼす影響を調べた。ＢＭＰは２種類のセリン−スレオニンキナーゼ型レセプターに結合し、Ｓｍａｄと呼ばれる分子を介して細胞内にシグナル伝達することが知られている。
Example 3
Effects of GAG and BMP-2 on Smad1 / 5/8 and p38 signaling activities Next, the effects of BMP-related signaling substances on Smad and p38 were examined. It is known that BMP binds to two types of serine-threonine kinase type receptors and transmits signals into cells via a molecule called Smad.
MC3T3-E1細胞を５％ＦＢＳ含有αＭＥＭ培地に播種し、６ ウェルプレート中で２４時間培養した。細胞濃度を４×１０５個／ｍＬに調整し、ここにＨｅｐ、ＨＳそれぞれ単独で１００μｇ／ｍＬ、１００ng/mLのＢＭＰ−２又はＨｅｐ若しくはＨＳとＢＭＰ−２とを共存させたものをそれぞれ添加し、２４時間培養した。 MC3T3-E1 cells were seeded in αMEM medium containing 5% FBS and cultured in 6-well plates for 24 hours. Adjust the cell concentration to 4 × 10 5 cells / mL, and add Hep and HS alone to 100 μg / mL and 100 ng / mL of BMP-2, or a mixture of Hep or HS and BMP-2, respectively. And cultured for 24 hours.
得られた試料を還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ゲル濃度７．５％）に付し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたタンパク質をウエスタンブロッティングの常法に従ってニトロセルロース膜に転写した。転写後の膜を、１０％スキムミルク及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（以下、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０と略記する。）で洗浄した。 The obtained sample was subjected to SDS-PAGE (gel concentration: 7.5%) under reducing conditions, and the protein separated by SDS-PAGE was transferred to a nitrocellulose membrane according to a conventional method of Western blotting. The transferred membrane was washed with PBS containing 10% skim milk and 0.1% Tween 20 (hereinafter abbreviated as PBS-Tween 20).
膜を、１次抗体（phospho-Smad1/5/8、phospho-p38及びp38）と共に４℃で一昼夜インキュベートし、その膜を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。
The membrane was incubated overnight with primary antibodies (phospho-
次いで、膜を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３，０００倍に希釈したホースラディッシュペルオキシターゼ結合抗ウサギＩｇＧ二次抗体（アマシャムバイオサイエンス社製）と共に１時間震盪しながらインキュベートし、その膜をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。
The membrane was then incubated with a horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG secondary antibody (Amersham Biosciences) diluted 3,000-fold with PBS-
次いで、ＥＣＬ検出キット（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて前記抗体に反応したタンパク質を検出した。その結果を図１０及び１１に示す。 Subsequently, the protein which reacted with the said antibody was detected using ECL detection kit (made by Amersham Bioscience). The results are shown in FIGS.
p-smad1/5/8及びp-p38の３０分後及び６０分後に関しては、共にＢＭＰ−２単独及びＨｅｐ又はＨＳとの併用の場合にバンドが現れているが、Ｈｅｐと併用の場合はバンドが薄かった。このことからも、Ｈｅｐと併用投与の場合には初期の段階での抑制効果が強いことがわかる。 About 30 minutes and 60 minutes after p-smad1 / 5/8 and p-p38, bands appear both in the case of BMP-2 alone and in combination with Hep or HS, but in the case of combination with Hep. The band was thin. This also shows that the inhibitory effect at the initial stage is strong in the case of combined administration with Hep.
これらの実施例よりＨＳ、ＨｅｐはＢＭＰによる骨芽細胞分化増強作用を初期には抑制するものの、ＢＭＰによる作用の遷延効果を有していることが示唆された。また、ＨＳの方が初期の抑制効果が低いため、初期の段階からＢＭＰの効果を持続させることが期待される。 From these examples, it was suggested that HS and Hep have the effect of prolonging the action of BMP, although they initially suppress the action of enhancing the differentiation of osteoblasts by BMP. In addition, since HS has a lower initial suppression effect, it is expected to maintain the BMP effect from the initial stage.
Claims (7)
The promoter according to claim 6, wherein the promoter is used as a periodontal tissue formation promoting or regeneration promoting agent.
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