JP2008031043A - Chicken lif (leukemia inhibitory factor) protein and its use - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ニワトリＬＩＦタンパク質を恒常的に得るための原核生物株または真核生物細胞株、ならびに当該細胞株によって産生されるニワトリＬＩＦタンパク質およびその利用に関するものである。 The present invention relates to a prokaryotic or eukaryotic cell line for continually obtaining a chicken LIF protein, a chicken LIF protein produced by the cell line, and use thereof.
近年、生物固有の遺伝子の機能解析は、特定の遺伝子が導入された動物、または特定の遺伝子がノックアウトされた動物を作出することによって、飛躍的に進歩した。このような動物、すなわち、トランスジェニック動物は、医学生物学だけでなく広範な研究領域において使用されており、各領域における研究開発に大きな進歩をもたらしている。 In recent years, functional analysis of genes unique to living organisms has made great progress by creating animals that have been introduced with specific genes or have been knocked out of specific genes. Such animals, ie, transgenic animals, are used not only in medical biology but also in a wide range of research areas, and have brought great progress in research and development in each area.
ニワトリは、有用な産業動物であり、（１）飼育コストが低い、（２）産子数が多い、（３）卵生であるために胚操作が簡便である、などの理由によって、ウシ、ブタ、ヒツジに代わるトランスジェニック動物の有力な候補として注目されている。トランスジェニックニワトリの作出が可能になれば、有用物質を生産するために、トランスジェニックニワトリを動物工場として用いることができ、応用分野のさらなる広がりが期待できる。 The chicken is a useful industrial animal, and it has the following advantages: (1) low rearing cost, (2) high number of offspring, (3) simple embryo manipulation because it is egg laying, etc. It is attracting attention as a promising candidate for transgenic animals to replace sheep. If it becomes possible to produce a transgenic chicken, the transgenic chicken can be used as an animal factory to produce useful substances, and further expansion of the application field can be expected.
トランスジェニック動物の作出方法としては、受精卵に外来遺伝子を直接導入するトランスジェニック法、および、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を介する遺伝子導入法が挙げられる。ＥＳ細胞は、ジーンターゲッティング法によってゲノムの特定の位置に目的の遺伝子を導入したり、ノックアウトすることができることから、現在広く応用されている細胞である。ＥＳ細胞法は、内因性の遺伝子をターゲティングするための強力なツールとして使用されており、ＥＳ細胞法を用いて種々のテーゲティングマウスが作出されている。また、生殖系列によって高頻度に分化する胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）法は、ＥＳ細胞法とともに有効な手段であると考えられている。 Examples of the method for producing a transgenic animal include a transgenic method in which a foreign gene is directly introduced into a fertilized egg, and a gene introduction method through embryonic stem cells (ES cells). An ES cell is a cell that is currently widely applied because a gene of interest can be introduced into a specific position of the genome or knocked out by a gene targeting method. The ES cell method has been used as a powerful tool for targeting endogenous genes, and various targeting mice have been created using the ES cell method. Further, the embryonic germ cell (EG cell) method that differentiates with high frequency depending on the germ line is considered to be an effective means together with the ES cell method.
ＥＳ細胞を用いる場合、遺伝子操作中に細胞分化を抑制することが重要である。ＥＳ細胞を培養する際、フィーダー（ｆｅｅｄｅｒ）細胞を用いるか、または分化を抑制するための因子としてのＬＩＦ（白血病阻止因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ））を使用する必要がある。 When using ES cells, it is important to suppress cell differentiation during genetic manipulation. When culturing ES cells, it is necessary to use feeder cells or use LIF (Leukemia Inhibitory Factor) as a factor for suppressing differentiation.
白血病阻害因子（ＬＩＦ）は、ＩＬ−６ファミリーサイトカインの１つである。ＬＩＦは、マウス骨髄性白血病細胞株Ｍ１をマクロファージへと分化させる因子として同定された（例えば、非特許文献１を参照のこと）。しかし、現在では、マウスＥＳ細胞を未分化状態で維持するために必須のサイトカインであることが知られており（例えば、非特許文献２を参照のこと）、マウスＥＳ細胞培養の簡便化またはトランスジェニックマウスの作出において利用されている。また、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系を用いて作製されたマウスまたはヒト由来のリコンビナントＬＩＦタンパク質が市販されている。 Leukemia inhibitory factor (LIF) is one of the IL-6 family cytokines. LIF has been identified as a factor that causes the mouse myeloid leukemia cell line M1 to differentiate into macrophages (see, for example, Non-Patent Document 1). However, at present, it is known to be an essential cytokine for maintaining mouse ES cells in an undifferentiated state (see, for example, Non-Patent Document 2), and simplification of mouse ES cell culture or trans It is used in the production of transgenic mice. In addition, E.I. Recombinant LIF proteins derived from mouse or human produced using the E. coli expression system are commercially available.
マウス以外では、メダカ、ウサギ、ブタ、サルおよびヒトのＥＳ細胞またはＥＧ細胞がこれまでに単離されている。しかし、導入遺伝子を首尾よく生殖系へ導入し得るのはマウスおよびニワトリだけである。また、ニワトリではＥＳ細胞またはＥＧ細胞を首尾よく培養することができず、細胞の安定な系が未だ確立されていない。これまで、マウスＬＩＦリコンビナントタンパク質（ｒｍＬＩＦ）またはヒトＬＩＦリコンビナントタンパク質（ｒｈＬＩＦ）を種々のサイトカインと組合わせて使用してニワトリのＥＳ細胞またはＥＧ細胞の安定な細胞株を確立しようと試みられているが、未だ達成されていない。 Except for mice, medaka, rabbit, pig, monkey and human ES cells or EG cells have been isolated so far. However, only mice and chickens can successfully introduce the transgene into the reproductive system. In chickens, ES cells or EG cells cannot be successfully cultured, and a stable cell system has not yet been established. To date, attempts have been made to establish stable cell lines of chicken ES cells or EG cells using mouse LIF recombinant protein (rmLIF) or human LIF recombinant protein (rhLIF) in combination with various cytokines. It has not been achieved yet.
鳥類では、ＬＩＦだけでなく他のＩＬ−６ファミリーサイトカインに関しても解析が進んでいない。ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７およびＩＬ−１８の相同遺伝子がニワトリにおいて見出されているが、これらは哺乳動物におけるホモログとアミノ酸レベルで２０〜４０％程度の相同性しか有さない。また、哺乳動物由来のＩＬ−１およびＩＬ−２は、その固有の効果をニワトリ細胞に対して発揮することができない（例えば、非特許文献３および４を参照のこと）。
In birds, not only LIF but also other IL-6 family cytokines have not been analyzed. Homologous genes of IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-15, IL-16, IL-17 and IL-18 have been found in chickens, but these are homologs in mammals And about 20-40% homology at the amino acid level. Moreover, IL-1 and IL-2 derived from mammals cannot exert their inherent effects on chicken cells (see, for example,
ニワトリＥＳ細胞の培養系を確立することを目的として、本発明者らは、ニワトリのＬＩＦ遺伝子をクローニングし、原核生物宿主を用いて当該遺伝子がコードするタンパク質を組換え発現させた（例えば、特許文献１および非特許文献５を参照のこと）。
In order to establish a culture system for chicken ES cells, the present inventors cloned a chicken LIF gene and recombinantly expressed the protein encoded by the gene using a prokaryotic host (for example, patents).
具体的には、本発明者らは、ＬＰＳで刺激したニワトリ単球系白血病細胞株（ＩＮ２４）を用いたサブトラクション法によって、ニワトリＬＩＦ遺伝子断片を得、この断片の塩基配列からＲＡＣＥ法によって完全長のニワトリＬＩＦ遺伝子をクローニングした。 Specifically, the present inventors obtained a chicken LIF gene fragment by a subtraction method using a chicken monocytic leukemia cell line (IN24) stimulated with LPS, and obtained the full length from the base sequence of this fragment by the RACE method. The chicken LIF gene was cloned.
配列決定したニワトリＬＩＦ ｃＤＮＡは７８９ｂｐであり、推定２１１アミノ酸からなるＬＩＦタンパク質をコードする。ニワトリＬＩＦは、マウスＬＩＦおよびヒトＬＩＦと比較した場合、アミノ酸レベルでの相同性は３９〜４３％とかなり低いものであったが、６箇所のシステイン残基の位置は完全に保存されていた。また、種々のニワトリ細胞および組織におけるｍＲＮＡの発現解析の結果、ニワトリＬＩＦ遺伝子は、全ての細胞および組織において発現していた。 The sequenced chicken LIF cDNA is 789 bp and encodes a LIF protein consisting of a putative 211 amino acids. Chicken LIF had a very low homology at the amino acid level of 39-43% when compared to mouse LIF and human LIF, but the positions of the six cysteine residues were completely conserved. As a result of mRNA expression analysis in various chicken cells and tissues, the chicken LIF gene was expressed in all cells and tissues.
また、種々のニワトリ細胞および組織におけるニワトリＬＩＦ遺伝子の発現を確認した。さらに大腸菌を用いて作製したニワトリＬＩＦリコンビナントタンパク質が、ニワトリのＥＳ細胞またはＥＧ細胞の分化を抑制することを確認した。
これまでマウスおよび／またはニワトリのＥＳ細胞の培養には、大腸菌発現系を用いた原核型ｒｍＬＩＦが利用されている。原核型ｒｍＬＩＦは比較的簡便に生産することができるので大量生産されているが、原核型ｒｃｈＬＩＦは、大腸菌発現系では封入体（インクルージョンボディー）を形成してしまうので、タンパク質の精製効率が非常に低く、大量生産することは非常に困難であった。すなわち、ニワトリＬＩＦタンパク質を市場に供給するためには大量生産する必要があるが、大腸菌発現系ではそれが不可能であった。 To date, prokaryotic rmLIF using an E. coli expression system has been used for culturing mouse and / or chicken ES cells. Prokaryotic rmLIF is produced in large quantities because it can be produced relatively easily, but prokaryotic rchLIF forms inclusion bodies in the E. coli expression system, so protein purification efficiency is very high. Low and mass production was very difficult. That is, in order to supply chicken LIF protein to the market, it is necessary to mass-produce it, but this is not possible with the E. coli expression system.
また、大腸菌によって大量生産を行った場合、ＬＰＳなどのエンドトキシンが混入する危険性が高いので、精製タンパク質の質に致命的な影響を与え、ニワトリＬＩＦタンパク質を胚性幹細胞の培養液中に直接投与して作用させることができなくなる。そのため、大腸菌等の原核生物細胞を宿主細胞として産生させたタンパク質は、非常に厳密で高度な精製を必要とする。 In addition, when mass production is carried out with E. coli, the risk of contamination with endotoxins such as LPS is high, which has a fatal effect on the quality of the purified protein, and the chicken LIF protein is administered directly into the culture medium of embryonic stem cells. Can no longer work. For this reason, proteins produced using prokaryotic cells such as Escherichia coli as host cells require very strict and sophisticated purification.
さらに、原核生物細胞を用いて組換え発現させたタンパク質（原核型のリコンビナントタンパク質）においては、翻訳後修飾が起こらない。また、原核型のタンパク質は、正確な立体構造をとらない場合が多い。そのため、翻訳後修飾を必要とする真核生物由来のタンパク質において、その生物活性が制限されていることが多い。また、ニワトリＬＩＦタンパク質において、サイトカインとしての活性発現には糖鎖が重要であると考えられる。 Furthermore, post-translational modification does not occur in proteins that are recombinantly expressed using prokaryotic cells (prokaryotic recombinant proteins). Prokaryotic proteins often do not have an accurate three-dimensional structure. Therefore, the biological activity of proteins derived from eukaryotes that require post-translational modification is often limited. In chicken LIF protein, sugar chains are considered to be important for the expression of cytokine activity.
このように、ニワトリのＥＳ細胞またはＥＧ細胞の培養系を確立するためには、市場に容易に供給することができる程度のｒｃｈＬＩＦを得ること、および所望の生物活性を有するｒｃｈＬＩＦを得ることが必要である。 Thus, in order to establish a culture system for chicken ES cells or EG cells, it is necessary to obtain an rchLIF that can be easily supplied to the market and to obtain an rchLIF having a desired biological activity. It is.
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、正しい立体構造を取りかつ糖鎖付加型である真核型ｒｃｈＬＩＦを安定して取得すること、さらに、真核型ｒｃｈＬＩＦを用いてニワトリＥＳ細胞またはＥＧ細胞の細胞株を確立し、トランスジェニックニワトリを作出することにある。 The present invention has been made in view of the above problems, and its object is to stably obtain a eukaryotic rchLIF that takes a correct three-dimensional structure and is a glycosylated form, The purpose is to establish a cell line of chicken ES cells or EG cells using rchLIF, and to create transgenic chickens.
本発明者らは、公知の大腸菌発現系において独自の創意工夫を重ねることによって、真核型のニワトリＬＩＦリコンビナントタンパク質（ｒｃｈＬＩＦ）を取得することができ、よって本発明を完成するに至った。 The inventors of the present invention have been able to obtain eukaryotic chicken LIF recombinant protein (rchLIF) by repeating unique ingenuity in a known E. coli expression system, and thus the present invention has been completed.
すなわち、本発明に係るポリペプチドは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴としている。
That is, the polypeptide according to the present invention is a polypeptide that inhibits the differentiation of embryonic stem cells or embryonic germ cells:
(A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6; or (b) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, inserted, substituted, or added, And produced by a recombinant expression system using a eukaryotic host.
本発明に係るポリペプチドは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされ、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴としている。
The polypeptide according to the present invention is a polypeptide that inhibits the differentiation of embryonic stem cells or embryonic germ cells:
(A) a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 5; or (b) a base in which one or several bases have been deleted, inserted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 5. It is encoded by a polynucleotide comprising a sequence and is produced by a recombinant expression system using a eukaryotic host.
本発明に係るポリペプチドは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
によってコードされ、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴としている。
The polypeptide according to the present invention is a polypeptide that inhibits the differentiation of embryonic stem cells or embryonic germ cells:
(A) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5; or (b) a polynucleotide which hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising the base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 5. And is produced by a recombinant expression system using a eukaryotic host.
本発明に係るポリペプチドは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされ、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴としている。
The polypeptide according to the present invention is a polypeptide that inhibits the differentiation of embryonic stem cells or embryonic germ cells:
(A) a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5; or (b) encoded by a polynucleotide consisting of a base sequence which is at least 80% identical to the base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 5. And produced by a recombinant expression system using a eukaryotic host.
本発明に係るポリペプチドは、糖鎖が付加されていることが好ましい。 The polypeptide according to the present invention preferably has a sugar chain added thereto.
本発明に係るポリペプチドにおいて、上記糖鎖がハイマンノース型Ｎ結合、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ、シアル酸、またはβ結合ガラクトースであることが好ましい。 In the polypeptide according to the present invention, the sugar chain is preferably a high mannose type N bond, a bisecting GlcNAc, a sialic acid, or a β-linked galactose.
本発明において、上記真核生物宿主がＣＨＯ−Ｋ７細胞またはＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞であることが好ましい。 In the present invention, the eukaryotic host is preferably a CHO-K7 cell or a CHCC-OU2 cell.
本発明に係るベクターは、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。 The vector according to the present invention is characterized by comprising a polynucleotide encoding the above-mentioned polypeptide.
本発明に係る細胞は、上記のポリペプチドを安定して産生することを特徴としている。 The cell according to the present invention is characterized by stably producing the above polypeptide.
本発明に係る馴化培地は、上記の細胞を培養することによって得られることを特徴としている。 The conditioned medium according to the present invention is obtained by culturing the above-described cells.
本発明に係るポリペプチド生産方法は、上記の細胞を用いることを特徴としている。 The polypeptide production method according to the present invention is characterized by using the above-mentioned cells.
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物は、上記のポリペプチドを含むことを特徴としている。 The culture composition for culturing embryonic stem cells or embryonic germ cells according to the present invention is characterized by containing the above-mentioned polypeptide.
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物は、上記の細胞を含むことを特徴としている。 The culture composition for culturing embryonic stem cells or embryonic germ cells according to the present invention is characterized by containing the above-mentioned cells.
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物は、上記の馴化培地を含むことを特徴としている。 The culture composition for culturing embryonic stem cells or embryonic germ cells according to the present invention is characterized by containing the above-mentioned conditioned medium.
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養キットは、上記のポリペプチドを備えることを特徴としている。 A culture kit for culturing embryonic stem cells or embryonic germ cells according to the present invention is characterized by comprising the above-described polypeptide.
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養キットは、上記の細胞を備えることを特徴としている。 A culture kit for culturing embryonic stem cells or embryonic germ cells according to the present invention is characterized by comprising the above-described cells.
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養キットは、上記の馴化培地を備えることを特徴としている。 A culture kit for culturing embryonic stem cells or embryonic germ cells according to the present invention is characterized by comprising the conditioned medium described above.
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養方法は、上記のポリペプチドを用いることを特徴としている。 The culture method for culturing embryonic stem cells or embryonic germ cells according to the present invention is characterized by using the aforementioned polypeptide.
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養方法は、上記の細胞を用いることを特徴としている。 The culture method for culturing embryonic stem cells or embryonic germ cells according to the present invention is characterized by using the aforementioned cells.
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養方法は、上記の馴化培地を用いることを特徴としている。 The culture method for culturing embryonic stem cells or embryonic germ cells according to the present invention is characterized by using the conditioned medium described above.
本発明に係るトランスジェニックニワトリ作出キットは、上記のポリペプチドを備えることを特徴としている。 A transgenic chicken production kit according to the present invention comprises the above-described polypeptide.
本発明に係るトランスジェニックニワトリ作出キットは、上記の細胞を備えることを特徴としている。 A transgenic chicken production kit according to the present invention comprises the above-described cell.
本発明に係るトランスジェニックニワトリ作出キットは、上記の馴化培地を備えることを特徴としている。 A transgenic chicken production kit according to the present invention is characterized by comprising the above-mentioned conditioned medium.
本発明に係るトランスジェニックニワトリ作出方法は、上記のポリペプチドとともにニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含することを特徴としている。 The method for producing a transgenic chicken according to the present invention is characterized by including a step of culturing chicken embryonic stem cells or embryonic germ cells together with the above-mentioned polypeptide.
本発明に係るトランスジェニックニワトリ作出方法は、上記の細胞とともにニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含することを特徴としている。 The method for producing a transgenic chicken according to the present invention includes a step of culturing chicken embryonic stem cells or embryonic germ cells together with the above-mentioned cells.
本発明に係るトランスジェニックニワトリ作出方法は、上記の馴化培地とともにニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含することを特徴としている。 The method for producing a transgenic chicken according to the present invention is characterized by including a step of culturing chicken embryonic stem cells or embryonic germ cells together with the conditioned medium described above.
本発明に係る抗体は、上記のポリペプチドに特異的に結合することを特徴としている。 The antibody according to the present invention is characterized by specifically binding to the above-mentioned polypeptide.
本発明に係る抗体は、配列番号１１〜１３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合することを特徴としている。 The antibody according to the present invention is characterized by binding to a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 11 to 13.
本発明を用いれば、物理化学的に安定なニワトリＬＩＦタンパク質を安定して供給することができる。また、本発明を用いれば、これまで困難であったニワトリの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）または胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）の未分化状態をより効率よく維持させて、安定な細胞株を樹立することができる。さらに本発明を用いれば、トランスジェニックニワトリを作出することができる。 By using the present invention, a physicochemically stable chicken LIF protein can be stably supplied. Further, by using the present invention, a stable cell line can be established by efficiently maintaining the undifferentiated state of chicken embryonic stem cells (ES cells) or embryonic germ cells (EG cells), which has been difficult until now. can do. Furthermore, if the present invention is used, a transgenic chicken can be produced.
上述したように、本発明者らは、独自の創意工夫を重ねることによって、真核型のニワトリＬＩＦリコンビナントタンパク質（ｒｃｈＬＩＦ）を取得することができ、よって本発明を完成するに至った。 As described above, the present inventors have been able to obtain a eukaryotic chicken LIF recombinant protein (rchLIF) by repeating their original ingenuity, thus completing the present invention.
以下、本発明に係るポリペプチド、およびその利用について詳述する。 Hereinafter, the polypeptide according to the present invention and its use will be described in detail.
（１）ポリペプチド
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、組換え的に生成されてもよい。
(1) Polypeptide As used herein, the term “polypeptide” is used interchangeably with “peptide” or “protein”. In addition, “fragment” of a polypeptide is intended to be a partial fragment of the polypeptide. The polypeptides according to the invention may also be isolated from natural sources or produced recombinantly.
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。 The term “isolated” polypeptide or protein is intended to be a polypeptide or protein that has been removed from its natural environment. For example, recombinantly produced polypeptides and proteins expressed in a host cell can be isolated in the same manner as natural or recombinant polypeptides and proteins that have been substantially purified by any suitable technique. It is thought that there is.
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、および真核生物宿主（例えば、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリペプチドは、グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。 Polypeptides according to the present invention include natural purified products and products produced by recombinant techniques from eukaryotic hosts (including, for example, yeast cells, higher plant cells, insect cells, and mammalian cells). Depending on the host used in the recombinant production procedure, the polypeptide according to the invention may be glycosylated. Furthermore, the polypeptides according to the invention may also contain an initiating modified methionine residue in some cases as a result of host-mediated processes.
１つの局面において、本発明は、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドを提供する。本明細書中で使用される場合、「ＬＩＦ活性」は、初期胚由来の細胞の未分化状態を維持する活性、特に、ＥＳ細胞またはＥＧ細胞の分化を阻害する活性が意図される。本発明に係るポリペプチドは、特に、ニワトリのＥＳ細胞またはＥＧ細胞の分化を阻害することが好ましい。マウスまたはヒト由来のＬＩＦタンパク質は、ニワトリ胚由来の細胞に対して実用的なＬＩＦ活性を有さない。 In one aspect, the present invention provides a polypeptide having LIF activity. As used herein, “LIF activity” intends the activity of maintaining the undifferentiated state of cells derived from early embryos, particularly the activity of inhibiting the differentiation of ES cells or EG cells. In particular, the polypeptide according to the present invention preferably inhibits the differentiation of chicken ES cells or EG cells. Mouse or human derived LIF proteins do not have practical LIF activity on cells derived from chicken embryos.
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。 In one embodiment, the polypeptide according to the present invention is preferably a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体でありかつＬＩＦ活性を有するポリペプチドが好ましい。 In another embodiment, the polypeptide according to the present invention is a polypeptide variant consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and preferably has LIF activity.
本明細書中で使用される場合、「配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、配列番号１に示される塩基配列の７５〜７０７位からなるポリヌクレオチドによってコードされ、シグナル配列（配列番号１に示される塩基配列の７５位〜１４６位によってコードされる配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１〜２４位）を含む。ＬＩＦ活性を有する成熟型のポリペプチドは、当該シグナル配列が切断された形態（配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）であるが、本明細書中で使用される場合、「配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」に包含される。
As used herein, the “polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2” is encoded by a polynucleotide consisting of positions 75 to 707 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and a signal sequence ( And
このような変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。 Such variants include deletions, insertions, inversions, repeats, and type substitutions (eg, replacement of one hydrophilic residue with another, but usually strongly hydrophilic residues strongly hydrophobic In which the residues are not substituted). In particular, “neutral” amino acid substitutions in a polypeptide generally have little effect on the activity of the polypeptide.
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。 It is well known in the art that some amino acids in the amino acid sequence of a polypeptide can be easily modified without significantly affecting the structure or function of the polypeptide. Furthermore, it is also well known that there are variants in natural proteins that do not significantly alter the structure or function of the protein, not only artificially modified.
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチドのＬＩＦ活性を変化させない。 Preferred variants have conservative or non-conservative amino acid substitutions, deletions, or additions. Silent substitution, addition, and deletion are preferred, and conservative substitution is particularly preferred. These do not change the LIF activity of the polypeptides according to the invention.
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。 Representative conservative substitutions are substitutions of one amino acid for another in the aliphatic amino acids Ala, Val, Leu, and Ile; exchange of hydroxyl residues Ser and Thr, acidic residues Asp and Glu exchange, substitution between amide residues Asn and Gln, exchange of basic residues Lys and Arg, and substitution between aromatic residues Phe, Tyr.
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０ （１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。 As detailed above, further guidance on which amino acid changes are likely to be phenotypically silent (ie likely not to have a significantly detrimental effect on function) can be found in Bowie, J. . U. “Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substations”, Science 247: 1306-1310 (1990), which is incorporated herein by reference.
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法（変異誘発法）に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望のＬＩＦ活性を有するか否かを容易に決定し得る。 One skilled in the art can readily mutate one or several amino acids in the amino acid sequence of a polypeptide using well-known techniques. For example, according to a known point mutation introduction method (mutagenesis method), an arbitrary base of a polynucleotide encoding a polypeptide can be mutated. In addition, a deletion mutant or an addition mutant can be prepared by designing a primer corresponding to an arbitrary site of a polynucleotide encoding a polypeptide. Furthermore, by using the methods described herein, it can be easily determined whether or not the produced mutant has a desired LIF activity.
１つの局面において、本実施形態に係るポリペプチドは、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなるポリペプチドであることが好ましい。このような変異ポリペプチドは、上述したように、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
In one aspect, the polypeptide according to this embodiment is a polypeptide having LIF activity,
(A) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6; or (b) a polymorph comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, inserted, substituted, or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: A peptide is preferred. As described above, such a mutant polypeptide is not limited to a polypeptide having a mutation artificially introduced by a known mutant polypeptide production method, and a naturally occurring polypeptide is isolated and purified. It may be what you did.
他の局面において、本実施形態に係るポリペプチドは、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされることが好ましい。
In another aspect, the polypeptide according to this embodiment is a polypeptide having LIF activity,
(A) a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 5; or (b) a base in which one or several bases have been deleted, inserted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 5. It is preferably encoded by a polynucleotide consisting of a sequence.
別の局面において、本実施形態に係るポリペプチドは、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
によってコードされることが好ましい。
In another aspect, the polypeptide according to this embodiment is a polypeptide having LIF activity,
(A) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5; or (b) a polynucleotide which hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising the base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 5. Is preferably encoded by
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。 Hybridization is described in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory (1989). Usually, the higher the temperature and the lower the salt concentration, the higher the stringency (harder to hybridize), and a more homologous polynucleotide can be obtained. The appropriate hybridization temperature varies depending on the base sequence and the length of the base sequence. For example, when a DNA fragment consisting of 18 bases encoding 6 amino acids is used as a probe, a temperature of 50 ° C. or lower is preferable.
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、本明細書中においてより詳細に考察されるような検出用プローブとしても有用である。 As used herein, the term “stringent hybridization conditions” refers to hybridization solution (50% formamide, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate. (Containing pH 7.6), 5 × Denhart solution, 10% dextran sulfate, and 20 μg / ml denatured sheared salmon sperm DNA) overnight at 42 ° C., then 0.1 × at about 65 ° C. It is intended to wash the filter in SSC. Depending on the polynucleotide that hybridizes to a “portion” of the polynucleotide, at least about 15 nucleotides (nt) of the reference polynucleotide, and more preferably at least about 20 nt, even more preferably at least about 30 nt, and even more preferably about Polynucleotides (either DNA or RNA) that hybridize to polynucleotides longer than 30 nt are contemplated. Polynucleotides (oligonucleotides) that hybridize to “parts” of such polynucleotides are also useful as detection probes as discussed in more detail herein.
さらに別の局面において、本実施形態に係るポリペプチドは、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされることが好ましい。
In yet another aspect, the polypeptide according to this embodiment is a polypeptide having LIF activity,
(A) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5; or (b) at least 80% identical to the base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, more preferably at least 85%, 90%, It is preferably encoded by a polynucleotide comprising a base sequence that is 92%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical.
例えば、「本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照（ＱＵＥＲＹ）塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチド」によって、対象塩基配列が、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照塩基配列の１００ヌクレオチチド（塩基）あたり５つまでの不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を含み得ることを除いて、参照配列に同一である、ということが意図される。換言すれば、参照塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチドを得るために、参照配列における塩基の５％までが、欠失され得るかまたは別の塩基で置換され得るか、あるいは参照配列における全塩基の５％までの多くの塩基が、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの不一致は、参照塩基配列の５’または３’末端位置または参照配列における塩基中で個々にかまたは参照配列内の１以上の隣接した群においてのいずれかで分散されて、これらの末端部分の間のどこでも起こり得る。この参照配列は、本明細書中で記載されるように、配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、改変体、誘導体またはアナログであり得る。 For example, the target base sequence encodes the polypeptide according to the present invention by “a polynucleotide comprising a base sequence at least 95% identical to the reference (QUERY) base sequence of the polynucleotide encoding the polypeptide according to the present invention”. It is intended to be identical to the reference sequence, except that it may contain up to 5 mismatches per 100 nucleotides (bases) of the reference sequence of the polynucleotide. In other words, up to 5% of the bases in the reference sequence can be deleted or replaced with another base to obtain a polynucleotide comprising a base sequence that is at least 95% identical to the reference base sequence, or Many bases up to 5% of the total bases in the reference sequence can be inserted into the reference sequence. These discrepancies in the reference sequence are distributed either individually at the 5 ′ or 3 ′ end position of the reference base sequence or at the base in the reference sequence or in one or more adjacent groups within the reference sequence. Can occur anywhere between the end parts of This reference sequence can be a polynucleotide, variant, derivative or analog encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, as described herein.
任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号１に示される塩基配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）を使用して決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の最も良好な相同性セグメントを見出す（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２〜４８９（１９８１））。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを用いて、特定の配列が、本発明に従う参照配列に対して、例えば、９５％同一であるか否かを決定する場合は、同一性のパーセントが参照塩基配列の全長にわたって計算され、そして参照配列におけるヌクレオチド数全体の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。
Any particular nucleic acid molecule is, for example, at least 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% relative to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 Whether or not they are the same is determined by a known computer program (for example, Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Package,
特定の実施形態では、参照（ＱＵＥＲＹ）配列（本発明に係る配列）と対象配列との間の同一性（全体的な配列整列ともいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇらのアルゴリズム（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７〜２４５（１９９０））に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。％同一性を計算するために、ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象塩基配列の長さ（どちらかより短い方）である。この実施形態に従って、対象配列が、５’または３’欠失に起因して（内部の欠失が理由ではなく）ＱＵＥＲＹ配列よりも短い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、同一性パーセントを算定する場合に、対象配列の５’短縮化および３’短縮化を考慮しないという事実を考慮して、手動の補正が結果に対してなされる。ＱＵＥＲＹ配列と比較して５’末端または３’末端が短縮化された対象配列については、同一性パーセントは、一致／整列していない、対象配列の５’および３’であるＱＵＥＲＹ配列の塩基数を、ＱＵＥＲＹ配列の総塩基のパーセントとして計算することにより補正される。ヌクレオチドが一致／整列しているか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントが、指定されたパラメーターを使用する上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントスコアに到達する。この補正されたスコアが、本実施形態の目的で使用されるものである。ＱＵＥＲＹ配列と一致／整列していない対象配列の５’塩基および３’塩基の外側の塩基のみが、ＦＡＳＴＤＢ整列に示されるように、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的で計算される。例えば、９０塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００塩基のＱＵＥＲＹ配列と整列される。その欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従ってＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基の一致／整列を示さない。１０個の不対合塩基は、配列の１０％（整合していない５’末端および３’末端での塩基の数／ＱＵＥＲＹ配列中の塩基の総数）を表し、そのため１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。残りの９０残基が完全に整合する場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００塩基のＱＵＥＲＹ配列と比較される。この場合、その欠失は内部欠失であり、そのためＱＵＥＲＹ配列と整合／整列しない対象配列の５’末端または３’末端の塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正されない。再度、ＱＵＥＲＹ配列と整合／整列しない対象配列の５’末端および３’末端の塩基のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本実施形態の目的のためにはなされない。 In certain embodiments, the identity (also referred to as global sequence alignment) between a reference (QUERY) sequence (sequence according to the invention) and a subject sequence is determined by the algorithm of Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6). : 237-245 (1990)). Preferred parameters used in FASTDB alignment of DNA sequences to calculate% identity are: Matrix = Unity, k-tuple = 4, Mismatch Penalty = 1, Joining Penalty = 30, Randomization Group Length = 0, Cutoff Score = 1, Gap Penalty = 5, Gap Size Penalty = 0.05, Window Size = 500, or the length of the target base sequence (whichever is shorter). According to this embodiment, if the subject sequence is shorter than the QUERY sequence (due to an internal deletion) due to a 5 ′ or 3 ′ deletion, the FASTDB program calculates the percent identity, Manual corrections are made to the results in view of the fact that 5 ′ and 3 ′ shortenings of the subject sequence are not considered. For subject sequences that are truncated at the 5 'end or 3' end relative to the QUERY sequence, the percent identity is the number of bases in the QUERY sequence that are 5 'and 3' of the subject sequence that are not matched / aligned Is calculated as a percentage of the total base of the QUERY sequence. The determination of whether a nucleotide is matched / aligned is determined by the result of the FASTDB sequence alignment. This percentage is then subtracted from the percent identity calculated by the above FASTDB program using the specified parameters to arrive at a final percent identity score. This corrected score is used for the purpose of this embodiment. Only bases outside the 5 'and 3' bases of the subject sequence that do not match / align with the QUERY sequence are calculated for the purpose of manually adjusting the percent identity score, as shown in the FASTDB alignment. For example, a 90 base subject sequence is aligned with a 100 base QUERY sequence to determine percent identity. The deletion occurs at the 5 'end of the subject sequence, so the FASTDB alignment does not show a match / alignment of the first 10 bases at the 5' end. Ten unpaired bases represent 10% of the sequence (number of bases at unmatched 5 'and 3' ends / total number of bases in the QUERY sequence), so 10% is converted by the FASTDB program Subtracted from the calculated percent identity score. If the remaining 90 residues are perfectly matched, the final percent identity is 90%. In another example, a 90 residue subject sequence is compared to a 100 base QUERY sequence. In this case, the deletion is an internal deletion, so there is no base at the 5 'or 3' end of the subject sequence that is not aligned / aligned with the QUERY sequence. In this case, the percent identity calculated by FASTDB is not manually corrected. Again, only the 5 'and 3' terminal bases of the subject sequence that do not match / align with the QUERY sequence are manually corrected. No other manual correction is made for the purposes of this embodiment.
さらなる実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、糖鎖が付加されていることが好ましい。本実施形態に係るポリペプチドは、特定の糖鎖が付加されていることによって、物理化学的に安定でありかつ生物活性が高い。好ましい糖鎖としては、ハイマンノース型Ｎ結合、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ、シアル酸、またはβ結合ガラクトースが挙げられる。 In a further embodiment, the polypeptide according to the present invention preferably has a sugar chain added thereto. The polypeptide according to this embodiment is physicochemically stable and has high biological activity due to the addition of a specific sugar chain. Preferable sugar chains include high mannose type N bond, bisecting GlcNAc, sialic acid, or β-linked galactose.
特定の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、受託番号［ ］によって示される細胞（寄託手続き中）によって産生されることを特徴としている。本実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、上記細胞より分泌された成熟形態のｒｃｈＬＩＦである。成熟形態ｒｃｈＬＩＦは、シグナルペプチドが切断されており、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる（対応するｃＤＮＡ配列は配列番号５に示される塩基配列からなる）。本実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、受託番号［ ］によって示される細胞によって産生されることによって、常に一定条件で、均質なタンパク質として精製することができる。 In a particular embodiment, the polypeptide according to the invention is characterized in that it is produced by the cell indicated by the deposit number [] (during the deposit procedure). In this embodiment, the polypeptide according to the present invention is a mature form of rchLIF secreted from the cells. The mature form rchLIF has a signal peptide cleaved and consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (the corresponding cDNA sequence consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5). In the present embodiment, the polypeptide according to the present invention can be purified as a homogeneous protein under constant conditions by being produced by the cell indicated by the accession number [].
本発明に係るポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。 The polypeptide according to the present invention may be a polypeptide in which amino acids are peptide-bonded, but is not limited thereto, and may be a complex polypeptide including a structure other than the polypeptide. As used herein, examples of the “structure other than the polypeptide” include sugar chains and isoprenoid groups, but are not particularly limited.
また、本発明に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。 The polypeptide according to the present invention may include an additional polypeptide. Examples of the additional polypeptide include epitope-tagged polypeptides such as His, Myc, and Flag.
また、本発明に係るポリペプチドは、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製されてもよい。 In addition, the polypeptide according to the present invention may be in a state where a polynucleotide encoding the polypeptide according to the present invention is introduced into a host cell and the polypeptide is expressed in the cell, or a cell, tissue, etc. It may be isolated and purified from.
他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係るポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加され得る。 In other embodiments, the polypeptides of the invention can be recombinantly expressed in a modified form such as a fusion protein. For example, additional amino acids, particularly charged amino acid regions, of the polypeptides according to the invention may be used in host cells to improve stability and persistence during purification or subsequent manipulation and storage. It can be added to the N-terminus or C-terminus of the polypeptide.
本実施形態に係るポリペプチドは、例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列であるタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）にＮ末端またはＣ末端へ付加され得る。このような配列は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、タグアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）（本明細書中に参考として援用される）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されている。他のそのような融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端にてＦｃに融合される本実施形態に係るポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。 The polypeptide according to this embodiment can be added to the N-terminus or C-terminus, for example, to a tag label (tag sequence or marker sequence) that is a sequence encoding a peptide that facilitates purification of the fused polypeptide. Such sequences can be removed prior to final preparation of the polypeptide. In certain preferred embodiments of this aspect of the invention, the tag amino acid sequence is a hexa-histidine peptide (eg, a tag provided in a pQE vector (Qiagen, Inc.), among many of them Are publicly and / or commercially available. For example, Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989) (incorporated herein by reference), hexahistidine provides convenient purification of the fusion protein. The “HA” tag is another peptide useful for purification corresponding to an epitope derived from influenza hemagglutinin (HA) protein, which is described in Wilson et al., Cell 37: 767 (1984) (herein). Which is incorporated by reference). Other such fusion proteins include a polypeptide according to this embodiment or a fragment thereof fused to Fc at the N or C terminus.
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、下記で詳述されるように組換え生成されてもよい。 In another embodiment, the polypeptides according to the invention may be produced recombinantly as detailed below.
組換え生成は、当該分野において周知の方法を使用して行なうことができ、例えば、以下に詳述されるようなベクターおよび細胞を用いて行なうことができる。 Recombinant production can be performed using methods well known in the art, for example using vectors and cells as detailed below.
下記に詳細に記載するように、本発明に係るポリペプチドは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物、培養キットまたは培養方法において有用である。 As described in detail below, the polypeptides according to the present invention are useful in culture compositions, culture kits or culture methods for culturing embryonic stem cells or embryonic germ cells.
このように、本発明に係るポリペプチドは、ニワトリ胚細胞の未分化状態を維持することができるポリペプチドであって、少なくとも、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるかまたはその活性を保持した変異体であればよいといえる。すなわち、上記ポリペプチドと特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とが連結されたポリペプチドも本発明に含まれることに留意すべきである。また、上記ポリペプチドと特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とは、それぞれの機能を阻害しないように適切なリンカーペプチドで連結されていてもよい。 Thus, the polypeptide according to the present invention is a polypeptide that can maintain the undifferentiated state of chicken embryo cells, and at least comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or retains its activity. It can be said that a mutant is sufficient. That is, it should be noted that the present invention includes a polypeptide in which the above-described polypeptide and an arbitrary amino acid sequence having a specific function (for example, a tag) are linked. Moreover, the said polypeptide and arbitrary amino acid sequences which have a specific function (for example, tag) may be connected with the appropriate linker peptide so that each function may not be inhibited.
つまり、本発明の目的は、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるＬＩＦ活性を有するポリペプチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。 That is, an object of the present invention is to provide a polypeptide having LIF activity, and does not exist in the polypeptide production method specifically described in the present specification. Therefore, it should be noted that polypeptides having LIF activity obtained by methods other than the above methods also belong to the technical scope of the present invention.
（２）ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド
１つの局面において、本発明は、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
(2) Polynucleotide or oligonucleotide In one aspect, the present invention provides a polynucleotide encoding a polypeptide having LIF activity or a fragment thereof. As used herein, the term “polynucleotide” is used interchangeably with “gene”, “nucleic acid” or “nucleic acid molecule” and is intended to be a polymer of nucleotides. As used herein, the term “base sequence” is used interchangeably with “nucleic acid sequence” or “nucleotide sequence” and refers to the sequence of deoxyribonucleotides (abbreviated A, G, C, and T). As shown. The “polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof” means a polynucleotide containing the sequence shown by each deoxynucleotide A, G, C and / or T of SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof Is intended.
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。 The polynucleotide according to the present invention may exist in the form of RNA (eg, mRNA) or in the form of DNA (eg, cDNA or genomic DNA). DNA can be double-stranded or single-stranded. Single-stranded DNA or RNA can be the coding strand (also known as the sense strand) or it can be the non-coding strand (also known as the antisense strand).
また本発明に係るポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに融合され得る。 The polynucleotide according to the present invention can be fused to the polynucleotide or oligonucleotide encoding the tag tag (tag sequence or marker sequence) described above on the 5 'side or 3' side.
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個（または数百個以上）結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、合成されてもよい。 As used herein, the term “oligonucleotide” is intended to be a combination of several to several tens (or several hundreds) nucleotides, and is used interchangeably with “polynucleotide”. . Oligonucleotides are called dinucleotides (dimers) and trinucleotides (trimers) as short ones, and are represented by the number of nucleotides polymerized such as 30 mers or 100 mers as long ones. Oligonucleotides can be produced as fragments of longer polynucleotides or synthesized.
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、少なくとも１２ｎｔ（ヌクレオチド）、好ましくは約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図される。少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメントによって、例えば、配列番号１に示される塩基配列からの２０以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば配列番号１に示される塩基配列が提供されるので、当業者は，配列番号１に基づくＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。 Oligonucleotides according to the present invention are intended to be fragments of a length of at least 12 nt (nucleotide), preferably about 15 nt, and more preferably at least about 20 nt, even more preferably at least about 30 nt, and even more preferably at least about 40 nt. Is done. By a fragment having a length of at least 20 nt, for example, a fragment comprising 20 or more consecutive bases from the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is contemplated. With reference to this specification, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is provided, so that those skilled in the art can easily prepare a DNA fragment based on SEQ ID NO: 1. For example, restriction endonuclease cleavage or ultrasonic shearing can be readily used to create fragments of various sizes. Alternatively, such fragments can be made synthetically. Appropriate fragments (oligonucleotides) are synthesized by Applied Biosystems Incorporated (ABI, 850 Lincoln Center Dr., Foster City, CA 94404) type 392 synthesizer and the like.
別の局面において、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその変異体にハイブリダイズすることが好ましい。「変異体」は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。 In another aspect, the oligonucleotide according to the present invention preferably hybridizes to a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a variant thereof. A “variant” can occur naturally, such as a natural allelic variant. By “allelic variant” is intended one of several interchangeable forms of a gene occupying a given locus on the chromosome of an organism. Non-naturally occurring variants can be generated, for example, using mutagenesis techniques well known in the art.
別の局面において、本発明は、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその変異体のフラグメントまたはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。 In another aspect, the present invention provides an oligonucleotide consisting of a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, a fragment of a variant thereof, or a complementary sequence thereof.
本発明に係るオリゴヌクレオチドがＬＩＦ活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、本発明に係るポリヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして本発明に係るポリペプチドを作製するために使用され得ることを容易に理解する。本発明に係るポリペプチドをコードしない本発明に係るオリゴヌクレオチドの他の用途としては、以下が挙げられる：（１）ｃＤＮＡライブラリー中のｖｈｄ遺伝子またはその対立遺伝子もしくはスプライシング改変体の単離；（２）ｖｈｄ遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、分裂中期染色体スプレッドへのインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）（Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載される）；および（３）特定の組織におけるｖｈｄのｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析。 Even when the oligonucleotide according to the present invention does not encode a polypeptide having LIF activity, those skilled in the art will produce the polypeptide according to the present invention using the polynucleotide according to the present invention as a primer for polymerase chain reaction (PCR). Easy to understand that can be used for. Other uses of the oligonucleotides according to the invention that do not encode the polypeptides according to the invention include: (1) Isolation of the vhd gene or its alleles or splicing variants in a cDNA library; 2) In situ hybridization to metaphase chromosomal spreads (eg, “FISH”) to provide the exact chromosomal location of the vhd gene (Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Technologies, Pergamon Press, New York ( (1988)); and (3) Northern blot analysis to detect vhd mRNA expression in specific tissues.
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった１本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡメカニズムによる遺伝子発現操作のためのツールとして使用することができる。アンチセンスＲＮＡ技術によって、内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少が観察される。本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。 The polynucleotide or oligonucleotide according to the present invention includes not only double-stranded DNA but also single-stranded DNA or RNA such as a sense strand and an antisense strand constituting the DNA. The polynucleotide or oligonucleotide according to the present invention can be used as a tool for gene expression manipulation by an antisense RNA mechanism. With antisense RNA technology, a decrease in the gene product derived from the endogenous gene is observed. The polynucleotide or oligonucleotide according to the present invention may contain a sequence such as an untranslated region (UTR) sequence or a vector sequence (including an expression vector sequence).
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得する方法としては、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離する種々の公知の方法が挙げられる。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製して、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすれば、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得することができる。このようなプローブとしては、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）であればよい。このようなハイブリダイゼーションによって選択されるポリヌクレオチドとしては、天然のポリヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されない。 Examples of the method for obtaining the polynucleotide or oligonucleotide according to the present invention include various known methods for isolating a DNA fragment containing the polynucleotide or oligonucleotide according to the present invention. For example, by preparing a probe that specifically hybridizes with a part of the base sequence of the polynucleotide according to the present invention and screening a genomic DNA library or cDNA library, the polynucleotide or oligonucleotide according to the present invention is obtained. Can be acquired. Such a probe may be a polynucleotide (oligonucleotide) that specifically hybridizes to at least part of the base sequence of the polynucleotide according to the present invention or its complementary sequence. Polynucleotides selected by such hybridization include, but are not limited to, natural polynucleotides.
本発明に係るポリヌクレオチドを取得する別の方法として、ＰＣＲを用いる方法が挙げられる。このＰＣＲ増幅方法は、例えば、本発明に係るポリヌクレオチドのｃＤＮＡの５’側および／または３’側の配列（またはその相補配列）を利用してプライマーを調製する工程、これらのプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等をテンプレートにしてＰＣＲ増幅する工程を包含することを特徴としており、本方法を使用すれば、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得することができる。 Another method for obtaining the polynucleotide according to the present invention is a method using PCR. In this PCR amplification method, for example, a step of preparing a primer using the 5 ′ side and / or 3 ′ side sequence (or its complementary sequence) of the cDNA of the polynucleotide of the present invention, using these primers It includes a step of PCR amplification using genomic DNA (or cDNA) or the like as a template. If this method is used, a large amount of DNA fragments containing the polynucleotide of the present invention can be obtained.
本発明に係るポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、ＩＮ２４（ニワトリ単核球白血病細胞株）、肝臓、または胸腺のような生物材料であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）が意図される。 The source for obtaining the polynucleotide according to the present invention is not particularly limited, but is preferably a biological material such as IN24 (chicken mononuclear leukemia cell line), liver, or thymus. As used herein, the term “biological material” intends a biological sample (a tissue sample or cell sample obtained from an organism).
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを用いれば、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを検出することによって、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドを発現する生物を容易に検出することができる。 By using the polynucleotide or oligonucleotide according to the present invention, an organism expressing a polypeptide having LIF activity can be easily detected by detecting the hybridizing polynucleotide.
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するハイブリダイゼーションプローブまたはＬＩＦ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することによって、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドを発現する生物または組織を容易に検出することができる。なおさらに、上記オリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用して、上記生物体またはその組織もしくは細胞におけるＬＩＦ活性を有するポリペプチドの発現を抑制することができる。 The polynucleotide or oligonucleotide according to the present invention is used as a hybridization probe for detecting a polynucleotide encoding a polypeptide having LIF activity or as a primer for amplifying a polynucleotide encoding a polypeptide having LIF activity. By this, an organism or tissue expressing a polypeptide having LIF activity can be easily detected. Still further, the oligonucleotide can be used as an antisense oligonucleotide to suppress the expression of a polypeptide having LIF activity in the organism or its tissue or cell.
つまり、本発明の目的は、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるＬＩＦ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。 That is, an object of the present invention is to provide a polynucleotide that encodes a polypeptide having LIF activity, and an oligonucleotide that hybridizes with the polynucleotide, and is specifically described in the present specification. It does not exist in the production method of polynucleotides and oligonucleotides. Therefore, it should be noted that a polynucleotide encoding a polypeptide having LIF activity obtained by other than the above methods also belongs to the technical scope of the present invention.
（３）本発明に係るポリペプチドまたはポリヌクレオチドの利用
（Ａ）ベクター
本発明は、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドを産生するために使用されるベクターを提供する。本発明に係るベクターは、上述した本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されないが、ｐＧＥＸ、ｐＳｅｃＴａｇ２などが好ましい。例えば、ＬＩＦ活性を有するポリペプチド（シグナル配列を含んでも含まなくてもよい）をコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
(3) Use of polypeptide or polynucleotide according to the present invention (A) Vector The present invention provides a vector used for producing a polypeptide having LIF activity. The vector according to the present invention is not particularly limited as long as it contains the polynucleotide encoding the polypeptide according to the present invention described above, but pGEX, pSecTag2, etc. are preferable. For example, a recombinant expression vector into which a polynucleotide cDNA encoding a polypeptide having LIF activity (which may or may not include a signal sequence) is inserted. A method for producing a recombinant expression vector includes, but is not limited to, a method using a plasmid, phage, cosmid or the like.
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。 The specific type of vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in a host cell can be appropriately selected. That is, according to the type of the host cell, a promoter sequence is appropriately selected in order to reliably express the polynucleotide according to the present invention, and a vector in which this and the polynucleotide according to the present invention are incorporated into various plasmids is used as an expression vector. Use it.
本発明に係る発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。発現ベクターの作製は、制限酵素および／またはリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って行うことができる。発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。 The expression vector according to the present invention contains an expression control region (for example, promoter, terminator, and / or origin of replication) depending on the type of host to be introduced. Examples of the promoter for yeast include glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase promoter and PH05 promoter, and examples of the promoter for filamentous fungi include amylase and trpC. Examples of animal cell host promoters include viral promoters (eg, SV40 early promoter, SV40 late promoter, etc.). The expression vector can be prepared according to a conventional technique using a restriction enzyme and / or ligase. Transformation of the host with the expression vector can also be performed according to conventional techniques.
上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物などから慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）に従って、目的タンパク質を回収、精製することができる。 After the host transformed with the above expression vector is cultured, cultivated or raised, conventional techniques (for example, filtration, centrifugation, cell disruption, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography) are used from the culture. Etc.), the target protein can be recovered and purified.
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養については、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、またはネオマイシン、Ｚｅｏｃｉｎ、ジェネティシン、ブラストシジンＳ、ハイグロマイシンＢなどの薬剤耐性遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養については、カナマイシン、Ｚｅｏｃｉｎ、アクチノマイシンＤ、セフォタキシム、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ピューロマイシン、テトラサイクリンまたはアンピシリンなどの薬剤耐性遺伝子が挙げられる。ニワトリ由来の細胞を用いる場合は、ジェネティシンまたはネオマイシンは適しておらず、Ｚｅｏｃｉｎが好ましい。 The expression vector preferably contains at least one selectable marker. Such markers include, for eukaryotic cell cultures, dihydrofolate reductase or drug resistance genes such as neomycin, Zeocin, geneticin, blasticidin S, hygromycin B, and E. coli. For culture in E. coli and other bacteria, drug resistance genes such as kanamycin, Zeocin, actinomycin D, cefotaxime, streptomycin, carbenicillin, puromycin, tetracycline or ampicillin can be mentioned. When using chicken-derived cells, geneticin or neomycin is not suitable, and Zeocin is preferred.
上記選択マーカーを用いれば、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明に係るポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光ポリペプチドＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るポリペプチドをＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。 By using the above selection marker, it can be confirmed whether or not the polynucleotide according to the present invention has been introduced into the host cell, and whether or not it is reliably expressed in the host cell. Alternatively, the polypeptide according to the present invention may be expressed as a fusion polypeptide. For example, the green fluorescent protein GFP (Green Fluorescent Protein) derived from Aequorea jellyfish is used as a marker, and the polypeptide according to the present invention is used as a GFP fusion polypeptide. It may be expressed as
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、動物細胞（例えば、ニワトリ由来の培養細胞（ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞、ＬＭＨ細胞）、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）などを挙げることができるが、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞が好ましい。 The host cell is not particularly limited, and various conventionally known cells can be suitably used. Specifically, for example, yeast (budding yeast Saccharomyces cerevisiae, fission yeast Schizosaccharomyces pombe), nematode (Caenorhabditis elegans), Xenopus laevis oocyte, animal cell (eg, chicken cell CC (eg -OU2 cells, LMH cells), CHO cells, COS cells, and Bowes melanoma cells), among which CHCC-OU2 cells are preferred.
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るポリペプチドを昆虫で発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。 A method for introducing the expression vector into a host cell, that is, a transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a liposome method, or a DEAE dextran method can be suitably used. . For example, when expressing the polypeptide of the present invention in insects, an expression system using baculovirus may be used.
本発明に係るベクターを使用して上記ポリヌクレオチドを生物または細胞に導入すれば、当該生物または細胞中にＬＩＦ活性を有するポリペプチドを発現させることができる。 When the above-described polynucleotide is introduced into an organism or cell using the vector according to the present invention, a polypeptide having LIF activity can be expressed in the organism or cell.
このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む真核細胞発現用ベクターであればよいといえる。 Thus, it can be said that the vector according to the present invention may be any eukaryotic cell expression vector including at least a polynucleotide encoding the polypeptide according to the present invention.
つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する真核細胞発現用ベクターを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種およびベクター作製方法を用いて取得した真核細胞発現用ベクターも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。 That is, an object of the present invention is to provide a vector for expression of a eukaryotic cell containing a polynucleotide encoding the polypeptide according to the present invention, and each of the vectors specifically described in the present specification. It does not exist in vector species and cell types, and vector production methods and cell introduction methods. Accordingly, it should be noted that eukaryotic cell expression vectors obtained using vector species and vector production methods other than those described above also belong to the technical scope of the present invention.
（Ｂ）形質転換体
本発明は、上述したＬＩＦ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含むことが意図される。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物、植物または動物が挙げられる。
(B) Transformant The present invention provides a transformant into which a polynucleotide encoding the above-mentioned polypeptide having LIF activity has been introduced. As used herein, the term “transformant” is intended to include not only cells, tissues or organs, but also individual organisms. In addition, the organism to be transformed is not particularly limited, and examples thereof include various microorganisms, plants and animals exemplified in the host cell.
本発明に係る形質転換体は、上述したＬＩＦ活性を有するポリペプチドが発現されることを特徴とする。本発明に係る形質転換体は、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドが安定的に発現することが好ましい。 The transformant according to the present invention is characterized in that the above-mentioned polypeptide having LIF activity is expressed. The transformant according to the present invention preferably stably expresses a polypeptide having LIF activity.
一実施形態において、本発明に係る形質転換体は、本発明に係るベクターを、ポリペプチドが発現され得るように真核生物中に導入することによって取得される。好ましくは、本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリペプチドを安定して発現する細胞である。最も好ましくは、本発明に係る形質転換体は、受託番号［ ］によって示される細胞である。受託番号［ ］によって示される細胞より分泌されたｒｃｈＬＩＦは成熟形態である。成熟形態ｒｃｈＬＩＦは、シグナルペプチドが切断されており、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる（対応するｃＤＮＡ配列は配列番号５に示される塩基配列からなる）。本発明に係るポリペプチドを安定的に発現する細胞は、ＥＳ細胞またはＥＧ細胞を培養する際のフィーダー細胞として使用することができる。 In one embodiment, the transformant according to the present invention is obtained by introducing the vector according to the present invention into a eukaryote so that the polypeptide can be expressed. Preferably, the transformant according to the present invention is a cell that stably expresses the polypeptide according to the present invention. Most preferably, the transformant according to the present invention is a cell indicated by the accession number []. RchLIF secreted from the cell indicated by the accession number [] is the mature form. The mature form rchLIF has a signal peptide cleaved and consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (the corresponding cDNA sequence consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5). Cells stably expressing the polypeptide according to the present invention can be used as feeder cells when culturing ES cells or EG cells.
（Ｃ）ポリペプチドの生産方法
本発明は、本発明に係るポリペプチドを生産する方法を提供する。本発明に係るポリペプチドの生産方法を用いれば、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドを低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することが可能となる。また、本発明に係るポリペプチドの生産方法を用いれば、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドを容易に生産することが可能となる。
(C) Polypeptide production method The present invention provides a method for producing a polypeptide according to the present invention. If the method for producing a polypeptide according to the present invention is used, it is possible to provide a polypeptide having LIF activity at low cost and under a low environmental load. Moreover, if the method for producing a polypeptide according to the present invention is used, a polypeptide having LIF activity can be easily produced.
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るベクターを用いることを特徴とする。 In one embodiment, the method for producing a polypeptide according to the present invention is characterized by using the vector according to the present invention.
本実施形態の１つの局面において、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、真核生物宿主を用いる組換え発現系を用いることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、本発明に係るポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能に宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる上記ポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。 In one aspect of this embodiment, the polypeptide production method according to this embodiment preferably uses a recombinant expression system using a eukaryotic host. When a recombinant expression system is used, the polynucleotide according to the present invention is incorporated into a recombinant expression vector, and then introduced into a host so that it can be expressed by a known method, and the polypeptide obtained by translation in the host is purified. Such a method can be adopted. The recombinant expression vector may or may not be a plasmid, as long as the target polynucleotide can be introduced into the host. Preferably, the method for producing a polypeptide according to this embodiment includes a step of introducing the vector into a host.
このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。 Thus, when introducing a foreign polynucleotide into a host, the expression vector preferably incorporates a promoter that functions in the host so as to express the foreign polynucleotide. The method for purifying a recombinantly produced polypeptide differs depending on the host used and the nature of the polypeptide, but the target polypeptide can be purified relatively easily by using a tag or the like.
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを天然または組換え的に発現する細胞または組織から当該ポリペプチドを精製することを特徴とする。本発明に係るポリペプチドは、成熟形態で細胞から分泌されるので、本発明に係るポリペプチドを天然または組換え的に発現する細胞の培養上清から回収することができる。好ましい細胞としては、受託番号［ ］によって示される細胞が挙げられる。このような細胞を用いる場合、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、培養上清を回収する工程を包含する。また、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上述したポリペプチドを精製する工程をさらに包含してもよい。 In another embodiment, the method for producing a polypeptide according to the present invention is characterized in that the polypeptide is purified from cells or tissues that naturally or recombinantly express the polypeptide according to the present invention. Since the polypeptide according to the present invention is secreted from cells in a mature form, it can be recovered from the culture supernatant of cells that naturally or recombinantly express the polypeptide according to the present invention. Preferable cells include cells indicated by the accession number []. When such cells are used, the method for producing a polypeptide according to the present invention includes a step of recovering the culture supernatant. Moreover, the method for producing a polypeptide according to this embodiment may further include a step of purifying the above-described polypeptide.
本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを含む細胞または組織の抽出液から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。 The method for producing a polypeptide according to the present invention preferably further includes a step of purifying the polypeptide from an extract of cells or tissues containing the polypeptide according to the present invention. The step of purifying a polypeptide is to prepare a cell extract from cells or tissues by a well-known method (for example, a method in which a cell or tissue is disrupted and then centrifuged to collect a soluble fraction). Known methods (eg ammonium sulfate precipitation or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography, and lectin chromatography) The step of purifying by a) is preferred, but not limited thereto. Most preferably, high performance liquid chromatography (“HPLC”) is used for purification.
つまり、本発明の目的は、真核生物宿主を用いてＬＩＦ活性を有するポリペプチドを生産する方法を提供することにあるのであって、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。 That is, an object of the present invention is to provide a method for producing a polypeptide having LIF activity using a eukaryotic host, and a production method including steps other than the above-described various steps is also provided. It should be noted that it belongs to the technical scope of the invention.
（Ｄ）培養組成物、培養キットまたは培養方法
本発明は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を含む培養組成物を提供する。本発明に係る培養組成物は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞が、培養培地中に含まれる形態であっても、必要に応じて培養培地に添加される形態であってもよい。本発明に係る培養組成物に含まれるポリペプチドは、上述したポリペプチドの生産方法に従って産生されたポリペプチドであることが好ましい。本明細書中で使用される場合、本発明に係る細胞を培養して得た馴化培地自体もまた培養組成物に包含される。
(D) Culture composition, culture kit or culture method The present invention provides a culture composition comprising the polypeptide according to the present invention or the cell according to the present invention. The culture composition according to the present invention may be a form in which the polypeptide according to the present invention or the cell according to the present invention is contained in a culture medium, or may be added to the culture medium as necessary. Good. The polypeptide contained in the culture composition according to the present invention is preferably a polypeptide produced according to the above-described polypeptide production method. As used herein, the conditioned medium itself obtained by culturing the cells of the present invention is also included in the culture composition.
本発明に係るポリペプチドを含む培養組成物は、胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、特に、ニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を使用することが好ましい。 The culture composition containing the polypeptide according to the present invention is used for culturing embryonic stem cells or embryonic germ cells, in particular, for culturing chicken embryonic stem cells or embryonic germ cells. Preference is given to using peptides or cells according to the invention.
本発明はまた、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を備える培養キットを提供する。本発明に係る培養キットは、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を単独で備えても、必要に応じて他の試薬をさらに備えてもよい。本発明に係る培養キットに備えられるポリペプチドは、上述したポリペプチドの生産方法に従って産生されたポリペプチドであることが好ましい。 The present invention also provides a culture kit comprising the polypeptide according to the present invention or the cell according to the present invention. The culture kit according to the present invention may include the polypeptide according to the present invention or the cell according to the present invention alone, or may further include other reagents as necessary. The polypeptide provided in the culture kit according to the present invention is preferably a polypeptide produced according to the above-described polypeptide production method.
本発明に係るポリペプチドを備える培養キットは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、特に、ニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を使用することが好ましい。本発明に係る培養キットは、本発明に係る細胞を培養して得た馴化培地を備えてもよい。 The culture kit comprising the polypeptide according to the present invention is used for culturing embryonic stem cells or embryonic germ cells, in particular, for culturing chicken embryonic stem cells or embryonic germ cells. Or it is preferable to use the cell which concerns on this invention. The culture kit according to the present invention may include a conditioned medium obtained by culturing the cells according to the present invention.
本発明はさらに、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を用いる培養方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る培養方法は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を培養培地中に添加する工程を包含する。本発明に係る培養方法において使用されるポリペプチドは、上述したポリペプチドの生産方法に従って産生されたポリペプチドであることが好ましい。 The present invention further provides a culture method using the polypeptide according to the present invention or the cell according to the present invention. In one embodiment, the culture method according to the present invention includes a step of adding the polypeptide according to the present invention or the cell according to the present invention to a culture medium. The polypeptide used in the culture method according to the present invention is preferably a polypeptide produced according to the above-described polypeptide production method.
本発明に係るポリペプチドを用いる培養方法は、胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、特に、ニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を使用することが好ましい。本発明に係る培養方法は、本発明に係る細胞を培養して得た馴化培地を用いてもよい。 The method of culturing using the polypeptide according to the present invention comprises a polypeptide according to the present invention for culturing embryonic stem cells or embryonic germ cells, in particular for culturing chicken embryonic stem cells or embryonic germ cells. Or it is preferable to use the cell which concerns on this invention. The culturing method according to the present invention may use a conditioned medium obtained by culturing the cells according to the present invention.
（Ｅ）トランスジェニックニワトリを作出するためのキットおよび方法
本発明は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を備えるトランスジェニックニワトリを作出するためのキットを提供する。本発明に係るキットは、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を単独で備えても、必要に応じて他の試薬をさらに備えてもよい。本発明に係るキットに備えられるポリペプチドは、上述したポリペプチドの生産方法に従って産生されたポリペプチドであることが好ましい。
(E) Kit and method for producing a transgenic chicken The present invention provides a kit for producing a transgenic chicken comprising the polypeptide of the present invention or the cell of the present invention. The kit according to the present invention may include the polypeptide according to the present invention or the cell according to the present invention alone, or may further include other reagents as necessary. The polypeptide provided in the kit according to the present invention is preferably a polypeptide produced according to the above-described polypeptide production method.
本発明に係るキットは、トランスジェニックニワトリを作出する際に、ニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞の未分化状態を維持するために、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を使用することが好ましい。本発明に係るトランスジェニックニワトリを作出するためのキットは、本発明に係る細胞を培養して得た馴化培地を備えてもよい。 The kit according to the present invention uses the polypeptide according to the present invention or the cell according to the present invention in order to maintain the undifferentiated state of a chicken embryonic stem cell or embryonic germ cell when producing a transgenic chicken. It is preferable to do. The kit for producing the transgenic chicken according to the present invention may include a conditioned medium obtained by culturing the cells according to the present invention.
本発明はさらに、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を用いてトランスジェニックニワトリを作出するための方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る培養方法は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞とともにニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含する。本発明に係る培養方法において使用されるポリペプチドは、上述したポリペプチドの生産方法に従って産生されたポリペプチドであることが好ましい。 The present invention further provides a method for producing a transgenic chicken using a polypeptide according to the present invention or a cell according to the present invention. In one embodiment, the culture method according to the present invention includes a step of culturing chicken embryonic stem cells or embryonic germ cells with the polypeptide according to the present invention or the cells according to the present invention. The polypeptide used in the culture method according to the present invention is preferably a polypeptide produced according to the above-described polypeptide production method.
本発明に係るトランスジェニックニワトリ作出方法は、トランスジェニックニワトリを作出する際に、ニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞とともに培養してこれらの細胞の未分化状態を維持することが好ましい。本発明に係るトランスジェニックニワトリを作出するための方法は、本発明に係る細胞を培養して得た馴化培地を用いてもよい。 In the transgenic chicken production method according to the present invention, when producing a transgenic chicken, these embryonic stem cells or embryonic germ cells are cultured together with the polypeptide of the present invention or the cell of the present invention and these cells are cultured. It is preferable to maintain the undifferentiated state. The method for producing the transgenic chicken according to the present invention may use a conditioned medium obtained by culturing the cells according to the present invention.
トランスジェニックニワトリを作出するためには、ニワトリの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）または胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）を首尾よく継代培養しなければならない。ニワトリＥＳ様細胞およびＥＧ様細胞について、従来の培養方法は、トランスジェニックニワトリを作製するには大きな問題点を有する。具体的には、ＥＳ様細胞およびＥＧ様細胞について、公知のいずれの培養方法を用いて培養しても全能性（生殖系列（精子または卵子）に分化する能力）を維持しているのは初代培養時のみであり、継代培養後は全能性を消失している。このことは、ＥＳ様細胞およびＥＧ様細胞へ遺伝子を導入した後、継代培養を経てトランスジェニックニワトリを作出することが不可能であることを示す。 In order to produce transgenic chickens, chicken embryonic stem cells (ES cells) or embryonic germ cells (EG cells) must be successfully subcultured. For chicken ES-like cells and EG-like cells, conventional culture methods have significant problems in producing transgenic chickens. Specifically, it is primary that ES-like cells and EG-like cells maintain totipotency (ability to differentiate into germline (sperm or ovum)) even if they are cultured using any known culture method. It is only at the time of culturing and has lost its totipotency after subculture. This indicates that it is impossible to produce a transgenic chicken through subculture after introducing a gene into ES-like cells and EG-like cells.
ニワトリＥＳ様細胞を培養する方法を以下に示す。 A method for culturing chicken ES-like cells is shown below.
４．５ｇ／ＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ） ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を基本培地とし、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１０％ウシ胎仔血清、２％ニワトリ血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸、１μＭの各ヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジン）、０．１６ｍＭ β−メルカプトエタノールとともに、サイトカインを添加した培地を用いる。添加するサイトカインとしては、従来、ＦＧＦ２（１ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＩＧＦ−１（１〜５ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＩＬ−１１（１ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＳＣＦまたはマウスＳＣＦ（１ｎｇ／ｍＬ）、マウスＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）（必要に応じてさらに哺乳類由来のＩＬ−６ファミリーサイトカイン数種、可溶型ＩＬ−６受容体など）が用いられているが、これらの代わりに、またはこれらに加えて、本発明に係るポリペプチド（すなわち、ｒｃｈＬＩＦタンパク質）を用い、以下の手順に従って培養を行う：
１．放卵直後の受精卵から濃厚卵白を取り除き、胚を上向きに置く。
２．胚が中央に位置するように濾紙で作製したリングをかぶせ、リングの外枠に沿ってはさみで胚をカットする。
３．濾紙リングに張り付いた胚をピンセットで取り出し、卵黄のついた方を上にしてＰＢＳ中に置き、卵黄を丁寧に取り除く。
４．胚の明領域（中心部分）を直径２〜３ｍｍのピペット等で抜き、抜いた細胞塊を回収する。
５．低濃度のトリプシン等で細胞塊をばらばらにする。
６．１０５×細胞／ｃｍ２の割合で上記培養液中に細胞を播き、７．５％ＣＯ２条件下にて３７℃で培養する。
７．細胞の状態を確認しながら３〜６日毎に培地交換を行う。
８．ＳＳＥＡ−１もしくはＥＭＡ−１の抗原が発現維持されているか否か、またはアルカリフォスファタ-ゼ活性によって、胚の未分化状態が維持されているか否かを判断する。
4.5 g / L Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) high glucose (Invitrogen) as a basic medium, 2 mM L-glutamine, 100 U / mL penicillin, 100 μg / mL streptomycin, 10% fetal calf serum, 2% chicken serum A medium supplemented with cytokine is used together with 1 mM sodium pyruvate, 1% non-essential amino acid, 1 μM of each nucleotide (adenosine, guanosine, cytidine, uridine, thymidine), 0.16 mM β-mercaptoethanol. As cytokines to be added, conventionally, FGF2 (1 ng / mL), human IGF-1 (1 to 5 ng / mL), human IL-11 (1 ng / mL), human SCF or mouse SCF (1 ng / mL), mouse LIF (10 ng / mL) (if necessary, several IL-6 family cytokines derived from mammals, soluble IL-6 receptors, etc.) are used, but instead of these, or in addition to these, Using the polypeptide according to the present invention (ie, rchLIF protein), culturing is performed according to the following procedure:
1. Remove the thick egg white from the fertilized egg immediately after egg release and place the embryo upward.
2. Cover the ring made of filter paper so that the embryo is in the center, and cut the embryo with scissors along the outer frame of the ring.
3. The embryo stuck to the filter paper ring is taken out with tweezers, placed in PBS with the yolk on top, and the yolk is carefully removed.
4). The bright region (center portion) of the embryo is extracted with a pipette having a diameter of 2 to 3 mm, and the removed cell mass is recovered.
5. Dissociate the cell mass with a low concentration of trypsin or the like.
6. Cells are seeded in the culture medium at a rate of 6.10 5 × cells / cm 2 and cultured at 37 ° C. under 7.5% CO 2 conditions.
7). The medium is changed every 3 to 6 days while checking the state of the cells.
8). It is determined whether the expression of SSEA-1 or EMA-1 antigen is maintained, or whether the undifferentiated state of the embryo is maintained by alkaline phosphatase activity.
ニワトリＥＧ様細胞を培養する方法を以下に示す。 A method for culturing chicken EG-like cells is shown below.
４．５ｇ／ＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ） ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅを基本培地とし、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１０％ウシ胎仔血清、２％ニワトリ血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸、１μＭの各ヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジン）、０．１６ｍＭ β−メルカプトエタノール、２０μｇ／ｍＬ ｃｏｎａｌｂｕｍｉｎとともに、サイトカインを添加した培地を用いる。添加するサイトカインとしては、従来、ＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＩＧＦ−１（１０ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＩＬ−１１（０．０４ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＳＣＦまたはマウスＳＣＦ（５ｎｇ／ｍＬ）、マウスＬＩＦ（５〜１０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）が用いられているが、これらの代わりに、またはこれらに加えて、本発明に係るポリペプチド（すなわち、ｒｃｈＬＩＦタンパク質）を用いて培養を行う。 4.5 g / L Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) with high glucose as the basic medium, 2 mM L-glutamine, 100 U / mL penicillin, 100 μg / mL streptomycin, 10% fetal calf serum, 2% chicken serum, 1 mM pyrvin A medium supplemented with cytokine is used together with sodium acid, 1% non-essential amino acid, 1 μM of each nucleotide (adenosine, guanosine, cytidine, uridine, thymidine), 0.16 mM β-mercaptoethanol, 20 μg / mL conalbumin. As cytokines to be added, conventionally, FGF2 (10 ng / mL), human IGF-1 (10 ng / mL), human IL-11 (0.04 ng / mL), human SCF or mouse SCF (5 ng / mL), mouse LIF (5-10 units / mL) are used, but instead of these, or in addition to these, the polypeptide according to the present invention (that is, rchLIF protein) is used for cultivation.
ニワトリＥＧ様細胞の培養には孵卵２．５日ごろに胚血液中に存在する循環始原生殖細胞（ｃＰＧＣ）または孵卵５〜５．５日ごろに生殖原基に到達した生殖腺始原生殖細胞（ｇＰＧＣ）の利用が行われているが、培養が可能と報告されているのはｇＰＧＣである。以下にその手順を述べる：
１，孵卵５日ごろの受精卵から生殖原基に相当する部分を取り出す。
２．０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液中で生殖原基をばらばらにし、５％ＣＯ２条件下、上記培地中にて３７℃で７〜１０日間培養する。
３．緩やかなピペッティング操作でＥＧ様細胞のコロニーを回収し、先に培養しておいたニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）上にて、上記培地中、５％ＣＯ２条件下にて３７℃で７〜１０日間培養する。
４．ＳＳＥＡ−１もしくはＥＭＡ−１の抗原が発現維持されているか否か、またはＰＡＳ染色陽性であるか否かによって、胚の未分化状態が維持されているか否かを判断する。
For the culture of chicken EG-like cells, circulating primordial germ cells (cPGC) present in embryonic blood around 2.5 days of incubation or gonadal primordial germ cells (gPGC) reaching the germinal primordium around 5 to 5.5 days of incubation. Although being used, it is gPGC that has been reported to be capable of culturing. Here are the steps:
1. Remove the part corresponding to the germline from fertilized eggs around 5 days of incubation.
2. Separate germ primordium in 0.25% trypsin-EDTA solution and incubate in the above medium at 37 ° C. for 7-10 days under 5% CO 2 condition.
3. A colony of EG-like cells was recovered by gentle pipetting, and was cultured on chick embryo fibroblasts (CEF) previously cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 in the above medium. Incubate for 10 days.
4). Whether or not the undifferentiated state of the embryo is maintained is determined based on whether the expression of SSEA-1 or EMA-1 is maintained or whether PAS staining is positive.
トランスジェニックニワトリを作出するためには、遺伝子を導入した後少なくとも４〜５代の継代が可能なニワトリＥＳ様細胞およびＥＧ様細胞を得る必要がある。本発明に係る真核型のニワトリＬＩＦポリペプチド（ｒｃｈＬＩＦ）は、マウスＬＩＦタンパク質（ｒｍＬＩＦ）よりも効果が明らかに高い。このようなｒｃｈＬＩＦを用いることによって、添加サイトカインを減らすことが可能であり、真核型ニワトリＬＩＦをベースにした全能性維持および生殖系列への分化能維持を実現することができる培地および培養方法を開発することができる。また、このような培地および培養方法を用いる、有用遺伝子を導入した後のニワトリＥＳ様細胞およびＥＧ様細胞の継代培養時において、組み込まれた遺伝子が相同遺伝子組み換えで導入されていることを確認し、選抜されたＥＳ細胞またはＥＧ細胞をニワトリ胚に戻して、キメラを作出する。さらに、戻し交配を行えば、トランスジェニックニワトリを得ることができる。 In order to produce a transgenic chicken, it is necessary to obtain chicken ES-like cells and EG-like cells that can be passaged for at least 4 to 5 generations after introduction of the gene. The eukaryotic chicken LIF polypeptide (rchLIF) according to the present invention is clearly more effective than the mouse LIF protein (rmLIF). By using such rchLIF, it is possible to reduce the amount of added cytokines, and to develop a medium and a culture method that can realize totipotency maintenance based on eukaryotic chicken LIF and differentiation ability maintenance to the germline. Can be developed. Also, using such a medium and culture method, confirm that the integrated gene has been introduced by homologous recombination during subculture of chicken ES-like cells and EG-like cells after the introduction of useful genes. Then, the selected ES cell or EG cell is returned to the chicken embryo to produce a chimera. Furthermore, transgenic chicken can be obtained by backcrossing.
（Ｆ）抗体
本発明は、本発明に係るポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。より詳細には、本発明に係る抗体は、ニワトリＬＩＦタンパク質には結合するがマウスＬＩＦタンパク質には結合しない。
(F) Antibody The present invention provides an antibody that specifically binds to the polypeptide of the present invention. More particularly, the antibody according to the present invention binds to chicken LIF protein but not to mouse LIF protein.
一実施形態において、本発明に係る抗体は、ＬＩＦタンパク質依存的なＳＴＡＴ３活性化を阻害することができる。すなわち、本実施形態に係る抗体は、ＬＩＦ活性を阻害することができる。好ましくは、本実施形態に係る抗体は、配列番号１１〜１３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合する。好ましくは、本実施形態に係る抗体は、モノクローナル抗体である。 In one embodiment, the antibody according to the present invention can inhibit LIF protein-dependent STAT3 activation. That is, the antibody according to this embodiment can inhibit LIF activity. Preferably, the antibody according to this embodiment binds to a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 11 to 13. Preferably, the antibody according to this embodiment is a monoclonal antibody.
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるべきではない。 The invention is illustrated in more detail by the following examples, but should not be limited thereto.
〔実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるニワトリＬＩＦタンパク質の発現〕
本発明者らは、非特許文献５に記載の方法に従って、原核型のｒｃｈＬＩＦを精製した。原核型のＬＩＦは、図１に示すような塩基配列およびアミノ酸配列を有する。図２には、ニワトリＬＩＦアミノ酸配列をヒトまたはマウスのＬＩＦアミノ酸配列と比較した。
Example 1: E.E. Expression of chicken LIF protein in E. coli]
The present inventors purified prokaryotic rchLIF according to the method described in
原核型のｒｃｈＬＩＦを、電気泳動によって分離した後、ゲルをＣＢＢ染色によって可視化した（図３）。その結果、原核型ｒｃｈＬＩＦは、純度が９０％以上であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約１９ｋＤａのおおよその分子量を有することがわかった（１ｍＬ培養から１〜５μｇ）。 After prokaryotic rchLIF was separated by electrophoresis, the gel was visualized by CBB staining (FIG. 3). As a result, it was found that the prokaryotic rchLIF had a purity of 90% or more and an approximate molecular weight of about 19 kDa on SDS-PAGE (1 to 5 μg from 1 mL culture).
〔実施例２：ＣＨＯ細胞におけるニワトリＬＩＦタンパク質の発現〕
使用した真核生物細胞用発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を図４に示す。このベクターは分泌シグナルとしてＩｇκ鎖リーダー配列と、検出精製用タンパクとしてＣ末にはｍｙｃエピトープおよびポリヒスチジンＴａｇとが付加されている。なお、本実施形態において、真核型ｒｃｈＬＩＦの発現実験にｐＳｅｃＴａｇ２Ａを利用したが、他のベクターも利用可能であることを当業者は容易に理解する。
[Example 2: Expression of chicken LIF protein in CHO cells]
The eukaryotic cell expression vector pSecTag2A (Invitrogen) used is shown in FIG. In this vector, an Igκ chain leader sequence is added as a secretion signal, and a myc epitope and polyhistidine Tag are added to the C terminus as a protein for detection and purification. In this embodiment, pSecTag2A was used for the expression experiment of eukaryotic rchLIF, but those skilled in the art can easily understand that other vectors can be used.
ＬＰＳで刺激したＩＮ２４細胞から抽出した総ＲＮＡをテンプレートとして、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するプライマー（ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＣＧＡＧ：配列番号７）およびＸｈｏＩ部位を有するプライマー（ＣＣＣＴＣＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＧＧＴＡ：配列番号８）を用いるＲＴ−ＰＣＲを行い、シグナルペプチドを有さない成熟型のニワトリＬＩＦ ｃＤＮＡをクローニングした。このｃＤＮＡは、シグナルペプチドをコードする領域を含んでいない。このｃＤＮＡを、ｐＳｅｃＴａｇ２Ａベクターのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入して、ベクター（ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ−ＬＩＦｍｈ）を作製した。このベクターをＣＨＯ−Ｋ１細胞にリポフェクション法を用いて導入した。リポフェクション法は、ＰｏｌｙＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて定法に従って行った。ベクターを導入した細胞を、Ｚｅｏｃｉｎ含有培地中で培養することによって、Ｚｅｏｃｉｎ耐性遺伝子を安定して保有する細胞（すなわち、導入遺伝子を安定して保有する細胞）を選択して、所望の細胞をクローニングした。クローニングした細胞を数ヶ月間Ｚｅｏｃｉｎ添加培地中で培養することによって真核型ｒｃｈＬＩＦを安定して発現する細胞株を得た。 Using a total RNA extracted from LPS-stimulated IN24 cells as a template, a primer having a HindIII site at the 5 ′ end (CCAAGCTTGCGGGCGCTCGCTGGGACGAGAG: SEQ ID NO: 7) and a primer having an XhoI site (CCCTCGAGCCGCGGGGCTGAGGTGGAGGTA: SEQ ID NO: 8) are used. The mature chicken LIF cDNA without signal peptide was cloned. This cDNA does not contain the region encoding the signal peptide. This cDNA was inserted into the HindIII / XhoI site of the multiple cloning site (MCS) of the pSecTag2A vector to prepare a vector (pSecTag2A-LIFmh). This vector was introduced into CHO-K1 cells using the lipofection method. The lipofection method was performed according to a standard method using PolyFect Transfection Reagent (QIAGEN). By culturing the cells into which the vector has been introduced in a medium containing Zeocin, cells that stably carry the Zeocin resistance gene (that is, cells that stably carry the transgene) are selected, and the desired cells are cloned. did. By culturing the cloned cells in a medium supplemented with Zeocin for several months, a cell line stably expressing eukaryotic rchLIF was obtained.
真核型ｒｃｈＬＩＦを安定して発現する細胞株をＺｅｏｃｉｎ含有培地中で生育させた後、培養上清を回収し、フィルターろ過（φ２２ｎｍ）によって培養上清中の不溶性の不純物を除去した。Ｈｉｓ−Ｔａｇタンパク質の精製にはＰｒｏＢｏｎｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。１ｍＬのレジンに対して４０ｍＬの培養上清を吸着させ、レジンの４倍量の洗浄液で８回洗浄した後、溶出した（レジンと等量の溶出液×１０回）。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ゲルの銀染色および抗ＬＩＦ抗体（ＨＵＬ２）（または抗ｔａｇ抗体）を用いたイムノブロッティング解析に供して、目的のバンドの溶出されている画分を回収した。抗ＬＩＦ抗体（ＨＵＬ２）については、以下の実施例７で詳述する。
After growing a cell line stably expressing eukaryotic rchLIF in a medium containing Zeocin, the culture supernatant was recovered, and insoluble impurities in the culture supernatant were removed by filter filtration (φ22 nm). ProBond (Invitrogen) was used for purification of His-Tag protein. 40 mL of the culture supernatant was adsorbed with respect to 1 mL of the resin, washed 8 times with a
回収したタンパク質をＰＢＳで透析した。タンパク質量を定量した後、液体窒素で急冷して−８０℃で凍結保存した。また、精製した真核型ｒｃｈＬＩＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、銀染色した（図７）。真核型ｒｃｈＬＩＦを安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株は、１ｍＬ培養上清中０．５μｇの真核型ｒｃｈＬＩＦを産生した。 The recovered protein was dialyzed against PBS. After quantifying the amount of protein, it was quenched with liquid nitrogen and stored frozen at -80 ° C. The purified eukaryotic rchLIF was subjected to SDS-PAGE and then silver stained (FIG. 7). The CHO-K1 cell line that stably expresses eukaryotic rchLIF produced 0.5 μg of eukaryotic rchLIF in 1 mL culture supernatant.
〔実施例３：ニワトリ細胞におけるニワトリＬＩＦタンパク質の発現〕
ニワトリ細胞を用いて取得したｒｃｈＬＩＦは、ＣＨＯ産生真核型ｒｃｈＬＩＦより活性が強いことが期待されるので、ニワトリ細胞株に真核型ｒｃｈＬＩＦを産生させることを試みた。
[Example 3: Expression of chicken LIF protein in chicken cells]
Since rchLIF obtained using chicken cells is expected to be more active than CHO-producing eukaryotic rchLIF, an attempt was made to produce eukaryotic rchLIF in a chicken cell line.
ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるＩｇκ鎖リーダー配列、ｍｙｃエピトープおよびポリヒスチジンＴａｇの部分を全て配列番号３および図５に示した塩基配列に置き換えて挿入したベクターを構築した（ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ−ｃＬＩＦｈ）。この塩基配列から翻訳される真核型ｒｃｈＬＩＦのアミノ酸配列を配列番号４および図５に示す。配列番号３および図５に示した塩基配列は、ニワトリ細胞株に真核型ｒｃｈＬＩＦを発現させ、分泌された真核型ｒｃｈＬＩＦの精製が簡便であるように、開始コドンおよびリーダー配列を含むニワトリＬＩＦ遺伝子の塩基配列全長の終始コドンの直前に６×ヒスチジンタグの塩基配列を付加している。図５に示すように、このアミノ酸配列中のリーダー部分（図中下線部）はニワトリ細胞中の翻訳後修飾により切断され、リーダー部分が除かれた形態で真核型ｒｃｈＬＩＦが細胞外に分泌される。配列中には原核型にはない糖鎖が付加されることが予想される領域を示す。 A vector was constructed in which the Igκ chain leader sequence in pSecTag2A (Invitrogen), the myc epitope, and the polyhistidine Tag were all replaced with the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 3 and FIG. 5 (pSecTag2A-cLIFh). The amino acid sequence of eukaryotic rchLIF translated from this base sequence is shown in SEQ ID NO: 4 and FIG. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and FIG. 5 is a chicken LIF containing an initiation codon and a leader sequence so that a chicken cell line can express a eukaryotic rchLIF and to facilitate purification of the secreted eukaryotic rchLIF. A 6 × histidine tag base sequence is added immediately before the start codon of the entire length of the gene base sequence. As shown in FIG. 5, the leader portion (underlined in the figure) in this amino acid sequence was cleaved by post-translational modification in chicken cells, and eukaryotic rchLIF was secreted extracellularly in a form in which the leader portion was removed. The In the sequence, a region where a sugar chain not present in the prokaryotic type is expected to be added is shown.
ニワトリ細胞株としては、ＬＭＨ細胞が、組換え発現系によく使用されている。ＬＭＨ細胞は市販されており、増殖力が強いため培養が容易であり、遺伝子導入効率も高いので、タンパク質の強制発現などによく使われている（エストロジェンレセプター強制発現ＬＭＨ株はＡＴＣＣより市販されており、ホルモン応答研究などで広く使われている）。ＬＭＨ細胞を用いてｒｃｈＬＩＦを取得することを試みたが、ニワトリＬＩＦ発現ベクターを導入してｒｃｈＬＩＦを強制発現させるとＬＭＨ細胞の死滅が生じ、どのような工夫を重ねてもｒｃｈＬＩＦを安定的に産生する細胞株を得ることができなかった。 As a chicken cell line, LMH cells are often used in recombinant expression systems. LMH cells are commercially available, and because of their strong proliferative potential, they are easy to culture and have high gene transfer efficiency, so they are often used for forced expression of proteins (the estrogen receptor forced expression LMH strain is commercially available from ATCC). Widely used in hormone response studies). We tried to obtain rchLIF using LMH cells, but when chickLIF expression vector was introduced and rchLIF was forcibly expressed, LMH cells were killed, and rchLIF was produced stably no matter what means Cell line could not be obtained.
ＬＭＨ細胞以外にニワトリ由来の接着系細胞株としてＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞が知られている。しかし、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は市販されておらず、増殖力が弱く、細胞培養が難しく、遺伝子導入効率が低いという欠点を有する。遺伝子導入効率が低く増殖力も弱い細胞は組換え発現には適さないことは当業者には明らかであり、実際、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞を用いてタンパク質を強制発現させた報告は皆無であった。よって、ニワトリＬＩＦ組換えタンパク質をニワトリ由来の細胞から取得することは一見不可能であった。 In addition to LMH cells, CHCC-OU2 cells are known as chicken-derived adhesion cell lines. However, CHCC-OU2 cells are not commercially available, and have the disadvantages that their proliferation ability is weak, cell culture is difficult, and gene transfer efficiency is low. It is clear to those skilled in the art that cells with low gene transfer efficiency and weak growth ability are not suitable for recombinant expression. In fact, there have been no reports of forced expression of proteins using CHCC-OU2 cells. Therefore, it was impossible at first glance to obtain chicken LIF recombinant protein from chicken-derived cells.
本発明者らは、ＬＭＨ細胞の死滅の原因がｒｃｈＬＩＦの生物活性（すなわち、文化抑制作用）に起因すると考え、ＬＭＨなど分化程度の高い細胞の利用は難しいが、ニワトリ初期胚線維芽細胞由来であるＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は、培養条件を首尾よく設定すれば、ＬＩＦ発現依存的な細胞の死滅が生じることなく、ＬＩＦ強制発現下でも正常に増殖するのではないかと考えた。そこで、本発明者らは、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞を用いてｒｃｈＬＩＦの取得を試みた。ＣＨＣＣ−ＯＵ２は、ＬＭＨ細胞など他のニワトリ培養細胞株よりも増殖力および遺伝子導入効率がはるかに劣るため、培養およびクローニングを行なうために試行錯誤を重ねた。しかし、本発明者らは、培養条件等工夫を重ねることによってｒｃｈＬＩＦを安定に発現するＣＨＣＣ−ＯＵ２株を得ることに成功した（図６）。 The present inventors consider that the cause of the death of LMH cells is due to the biological activity of rchLIF (that is, the culture suppressive action), and it is difficult to use cells with a high degree of differentiation such as LMH. A certain CHCC-OU2 cell was thought to proliferate normally even under LIF forced expression without causing death of cells dependent on LIF expression if the culture conditions were set successfully. Therefore, the present inventors tried to obtain rchLIF using CHCC-OU2 cells. Since CHCC-OU2 has much lower proliferation ability and gene transfer efficiency than other chicken cell lines such as LMH cells, trial and error were repeated for culturing and cloning. However, the present inventors have succeeded in obtaining a CHCC-OU2 strain that stably expresses rchLIF by devising culture conditions and the like (FIG. 6).
具体的には、ＬＰＳで刺激したＩＮ２４細胞から抽出した総ＲＮＡをテンプレートとして、５’末端にＮｈｅＩ部位を有するプライマー（ＧＣＧＣＴＡＧＣＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＡＴＣＣＣＣ：配列番号９）およびＥｃｏＲＩ部位を有するプライマー（ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＣＧＣＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＡＧ：配列番号１０）を用いるＲＴ−ＰＣＲを行い、シグナルペプチドを有するニワトリＬＩＦ ｃＤＮＡをクローニングした。このｃＤＮＡは、シグナルペプチドをコードする領域を含んでいる。このｃＤＮＡを、ｐＳｅｃＴａｇ２Ａベクターのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）周辺のＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入して、ベクター（ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ−ｃＬＩＦｈ）を作製した。このベクターをＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞にリポフェクション法を用いて導入した。リポフェクション法は、ＰｏｌｙＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて定法に従って行った。ベクターを導入した細胞を、Ｚｅｏｃｉｎ含有培地中で培養することによって、Ｚｅｏｃｉｎ耐性遺伝子を安定して保有する細胞（すなわち、導入遺伝子を安定して保有する細胞）を選択して、所望の細胞をクローニングした。クローニングした細胞を数ヶ月間Ｚｅｏｃｉｎ添加培地中で培養することによって真核型ｒｃｈＬＩＦを安定して発現する細胞株を得た。 Specifically, using a total RNA extracted from LPS-stimulated IN24 cells as a template, a primer having a NheI site at the 5 ′ end (GCGCTAGCCATGAGGCTCATCCCC: SEQ ID NO: 9) and a primer having an EcoRI site (CGGAATTCACGCGGGGCTGGGTAG: SEQ ID NO: 10) RT-PCR used was performed, and the chicken LIF cDNA having a signal peptide was cloned. This cDNA contains a region encoding a signal peptide. This cDNA was inserted into the NheI / EcoRI site around the multiple cloning site (MCS) of the pSecTag2A vector to prepare a vector (pSecTag2A-cLIFh). This vector was introduced into CHCC-OU2 cells using the lipofection method. The lipofection method was performed according to a standard method using PolyFect Transfection Reagent (QIAGEN). By culturing the cells into which the vector has been introduced in a medium containing Zeocin, cells that stably carry the Zeocin resistance gene (that is, cells that stably carry the transgene) are selected, and the desired cells are cloned. did. By culturing the cloned cells in a medium supplemented with Zeocin for several months, a cell line stably expressing eukaryotic rchLIF was obtained.
その結果、上述した培養条件下では、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は、ｒｃｈＬＩＦを強制発現させても死滅しなかった。 As a result, CHCC-OU2 cells did not die even when rchLIF was forcibly expressed under the culture conditions described above.
具体的には、上述したｐＳｅｃＴａｇ２Ａ−ｃＬＩＦｈをニワトリＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞株にリポフェクション法により導入した。導入後に細胞をＺｅｏｃｉｎ含有培地を用いて培養することによって、Ｚｅｏｃｉｎ耐性遺伝子を安定に保有する細胞（ベクターを安定に保有する）を選択した。その際、一過性の発現が終了した細胞の死滅が起こり、生細胞の密度は著しく低下し、最終的には、単独の細胞がディッシュに点在する程度となる。通常このような低密度でのＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞の培養は困難であり、次第に分裂能を失い死滅する。そこで、９０％馴化培地による培地交換を週一回程度行い、継代は月一度程度にまで控えた。継代の際のトリプシン処理はできるだけ短時間（３分程度）とし、細胞回収のための遠心分離も１０００ｒｐｍで３分間程度と、できるだけ細胞にダメージが加わらないようにした。このようにして数ヶ月間Ｚｅｏｃｉｎ添加培地中で培養することによって真核型ｒｃｈＬＩＦを安定して発現する細胞株（すなわち、導入遺伝子を安定に保有する細胞）を選択し、コロニークローニングによってクローニングした。樹立した真核型ｒｃｈＬＩＦ産生細胞株を、常法に従って−８０℃で凍結保存した。 Specifically, the above-described pSecTag2A-cLIFh was introduced into a chicken CHCC-OU2 cell line by the lipofection method. After the introduction, the cells were cultured using a Zeocin-containing medium to select cells stably harboring the Zeocin resistance gene (having a vector stably). At that time, cells that have been transiently terminated are killed, the density of living cells is significantly reduced, and finally, only single cells are scattered in the dish. Usually, culturing CHCC-OU2 cells at such a low density is difficult and gradually loses its ability to divide and die. Therefore, medium exchange with 90% conditioned medium was performed about once a week, and passage was refrained to about once a month. The trypsin treatment at the time of subculture was made as short as possible (about 3 minutes), and the centrifugation for cell recovery was carried out at 1000 rpm for about 3 minutes so that the cells were not damaged as much as possible. Thus, by culturing in a Zeocin-added medium for several months, a cell line that stably expresses eukaryotic rchLIF (ie, a cell that stably holds the transgene) was selected and cloned by colony cloning. The established eukaryotic rchLIF-producing cell line was stored frozen at −80 ° C. according to a conventional method.
タンパク質に付加したＨｉｓ−Ｔａｇを利用して、ニッケルカラムによりタンパク質を精製した。具体的には、真核型ｒｃｈＬＩＦを安定して発現する細胞株をＺｅｏｃｉｎ含有培地中で生育させた後、培養上清を回収し、フィルターろ過（φ２２ｎｍ）によって培養上清中の不溶性の不純物を除去した。Ｈｉｓ−Ｔａｇタンパク質の精製にはＰｒｏＢｏｎｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。１ｍＬのレジンに対して４０ｍＬの培養上清を吸着させ、レジンの４倍量の洗浄液で８回洗浄した後、溶出した（レジンと等量の溶出液×１０回）。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ゲルの銀染色および抗ＬＩＦ抗体（ＨＵＬ２）（または抗ｔａｇ抗体）を用いたイムノブロッティング解析に供して、目的のバンドの溶出されている画分を回収した。
The protein was purified by a nickel column using His-Tag added to the protein. Specifically, after growing a cell line that stably expresses eukaryotic rchLIF in a medium containing Zeocin, the culture supernatant is recovered, and insoluble impurities in the culture supernatant are removed by filter filtration (φ22 nm). Removed. ProBond (Invitrogen) was used for purification of His-Tag protein. 40 mL of the culture supernatant was adsorbed with respect to 1 mL of the resin, washed 8 times with a
回収したタンパク質をＰＢＳで透析した。タンパク質量を定量後、液体窒素で急冷して−８０℃で凍結保存した。また、精製した真核型ｒｃｈＬＩＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、銀染色した（図７）。真核型ｒｃｈＬＩＦを安定に発現するＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞株は、増殖速度は遅いが、真核型ｒｃｈＬＩＦの大量調製が可能となった（１ｍＬ培養上清から５μｇ）。 The recovered protein was dialyzed against PBS. After quantifying the amount of protein, it was quenched with liquid nitrogen and stored frozen at -80 ° C. The purified eukaryotic rchLIF was subjected to SDS-PAGE and then silver stained (FIG. 7). Although the CHCC-OU2 cell line stably expressing eukaryotic rchLIF has a slow growth rate, large-scale preparation of eukaryotic rchLIF is possible (5 μg from 1 mL culture supernatant).
図７に示すように、真核型ｒｃｈＬＩＦは、ＣＨＯ産生またはＣＨＣＣ−ＯＵ２産生のいずれもが原核型ｒｃｈＬＩＦよりも泳動度が遅く、複数のバンドとして検出された。 As shown in FIG. 7, eukaryotic rchLIF was detected as a plurality of bands with both CHO production or CHCC-OU2 production having a slower electrophoretic mobility than prokaryotic rchLIF.
次に、抗ＬＩＦ抗体（ＨＵＬ２）を用いたウエスタンブロッティング法により、ｒｃｈＬＩＦを検出した。具体的には、１００ｎｇ／レーンのタンパク質を、１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、１８０ｍＶで３時間の条件下でＩｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に転写した。このメンブレンを、５％脱脂粉乳中にて室温で１時間ブロッキングした後、一次抗体（上述した抗ＬＩＦ抗体（ＨＵＬ２））とともに４℃で一晩インキュベートした。メンブレンを洗浄した後、二次抗体（ＨＲＰ標識化抗マウスＩｇ抗体）とともに室温で１時間インキュベートした。メンブレンを洗浄した後、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ（アマシャム）を用いて目的のバンドを検出した。その結果、図８に示したように、ＣＨＯ産生真核型ｒｃｈＬＩＦは２０〜３７ｋＤａの間に、ニワトリ細胞株産生真核型ｒｃｈＬＩＦは１９〜３０ｋＤａの間に、いずれも数本のバンドとして検出された。これは、糖鎖の付加の状況が異なることに起因して異なる分子量の真核型ｒｃｈＬＩＦが産生されていることを示す。 Next, rchLIF was detected by Western blotting using an anti-LIF antibody (HUL2). Specifically, 100 ng / lane of protein was separated by SDS-PAGE using 12.5% polyacrylamide gel, and then transferred to Immun-Blot PVDF Membrane (BIO-RAD) at 180 mV for 3 hours. did. The membrane was blocked in 5% nonfat dry milk at room temperature for 1 hour, and then incubated with a primary antibody (the above-described anti-LIF antibody (HUL2)) at 4 ° C. overnight. After the membrane was washed, it was incubated with a secondary antibody (HRP-labeled anti-mouse Ig antibody) at room temperature for 1 hour. After washing the membrane, the target band was detected using ECL Plus (Amersham). As a result, as shown in FIG. 8, CHO-producing eukaryotic rchLIF was detected as several bands between 20 and 37 kDa, and chicken cell line-produced eukaryotic rchLIF was detected between 19 and 30 kDa. It was. This indicates that eukaryotic rchLIF having different molecular weights are produced due to the difference in the situation of sugar chain addition.
〔実施例４：真核型ニワトリＬＩＦタンパク質における糖鎖付加〕
１００ｎｇ／レーンのタンパク質を１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、１８０ｍＶで３時間の条件下でＩｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に転写した。このメンブレンをメタノールで処理した後、ＴＢＳで洗浄した。次いで、ＴＢＳ中５％のＢＳＡを用いて、このメンブレンを室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳ中１％のレクチン液とともに室温で１時間インキュベートした。レクチンとしては、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｌｅｃｔｉｎ Ｋｉｔ Ｉ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いた。ＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて、レクチンが特異的に結合したバンドを検出した。
[Example 4: Glycosylation in eukaryotic chicken LIF protein]
100 ng / lane of protein was separated by SDS-PAGE using 12.5% polyacrylamide gel, and then transferred to Immun-Blot PVDF Membrane (BIO-RAD) at 180 mV for 3 hours. This membrane was treated with methanol and then washed with TBS. The membrane was then blocked with 5% BSA in TBS for 1 hour at room temperature and incubated with 1% lectin solution in TBS for 1 hour at room temperature. Biotinylated Lectin Kit I (Vector Laboratories Inc.) was used as the lectin. After washing with TBS-T, a band specifically bound to lectin was detected using VECTASTAIN Elite ABC Kit (Vector Laboratories Inc.).
レクチン（ＣｏｎＡ、ＲＣＡ、ＷＧＡ）染色を行った結果を図９に示す。図９に示したように真核型ｒｃｈＬＩＦが特異的に染色された。 The results of lectin (ConA, RCA, WGA) staining are shown in FIG. As shown in FIG. 9, eukaryotic rchLIF was specifically stained.
この結果より、全ての真核型ｒｃｈＬＩＦはハイマンノース型Ｎ結合の糖鎖、バイセクティングＧｌｃＮＡｃおよびシアル酸を有すること（ＣｏｎＡ、およびＷＧＡ）、ニワトリ細胞株産生真核型ｒｃｈＬＩＦはβ結合ガラクトースを有すること（ＲＣＡ）が示された。以上の結果から、真核型ｒｃｈＬＩＦは、糖鎖付加において、ＣＨＯ産生系とニワトリ細胞産生系との間で異なることがわかった。 From this result, all eukaryotic rchLIFs have high-mannose N-linked sugar chains, bisecting GlcNAc and sialic acid (ConA and WGA), and chicken cell line-produced eukaryotic rchLIF has β-linked galactose. (RCA) was shown. From the above results, it was found that eukaryotic rchLIF differs between CHO production system and chicken cell production system in glycosylation.
〔実施例５：種々のｒｃｈＬＩＦの生物活性〕
ｒｃｈＬＩＦの生物活性はニワトリＥＳ細胞（ニワトリ胚盤葉細胞）の未分化状態を維持する活性として測定することができる。
[Example 5: Biological activity of various rchLIF]
The biological activity of rchLIF can be measured as the activity of maintaining the undifferentiated state of chicken ES cells (chick blastoderm cells).
精製した真核型ｒｃｈＬＩＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）をニワトリＥＳ細胞の培養系に添加して８日間培養した。ＬＩＦ非添加の条件下では、ニワトリＥＳ細胞は嚢胞性胚葉体を形成し未分化状態が維持されない（図１０−１）。原核型ｒｃｈＬＩＦを添加した条件下では、ニワトリＥＳ細胞は未分化状態を７日間維持したが、培養８日目には嚢胞性胚葉体が出現した（図１０−２）。ＣＨＯ産生真核型ｒｃｈＬＩＦ添加の条件下では、小型の嚢胞性胚葉体が多数検出され、未分化状態が維持されていない（図１０−３）。これらに対して、ニワトリ細胞株産生真核型ｒｃｈＬＩＦ添加の条件下では、ニワトリＥＳ細胞が８日間の培養後も未分化状態を維持し、かつ嚢胞性胚葉体がほとんど形成されていないことがわかった（図１０−４）。 Purified eukaryotic rchLIF (20 ng / ml) was added to a chicken ES cell culture system and cultured for 8 days. Under conditions where LIF is not added, chicken ES cells form cystic embryoid bodies and are not maintained in an undifferentiated state (FIG. 10-1). Under the condition where prokaryotic rchLIF was added, the chicken ES cells were maintained in an undifferentiated state for 7 days, but cystic embryoid bodies appeared on the 8th day of culture (FIG. 10-2). Under the condition of addition of CHO-producing eukaryotic rchLIF, many small cystic embryoid bodies were detected, and the undifferentiated state was not maintained (FIG. 10-3). On the other hand, it was found that under the condition of chicken cell line-produced eukaryotic rchLIF, chicken ES cells remained undifferentiated after 8 days of culture, and cystic embryoid bodies were hardly formed. (FIG. 10-4).
以上の結果は、ニワトリＥＳ細胞の培養にはｒｃｈＬＩＦであれば効果（未分化状態の維持）を奏するが、原核型ｒｃｈＬＩＦよりも真核型ｒｃｈＬＩＦの方がより好ましく、特にニワトリ細胞が産生する真核型ｒｃｈＬＩＦが最も効果が高いことを示す。また、原核型ｒｃｈＬＩＦよりも真核型ｒｃｈＬＩＦの方がニワトリＥＳ細胞の未分化状態を長く維持することがわかった。 The above results indicate that rchLIF is effective for culturing chicken ES cells (maintaining undifferentiated state), but eukaryotic rchLIF is more preferable than prokaryotic rchLIF, and in particular, the true cell produced by chicken cells. It shows that karyotype rchLIF is most effective. It was also found that eukaryotic rchLIF maintains the undifferentiated state of chicken ES cells longer than prokaryotic rchLIF.
〔実施例６：種々のｒｃｈＬＩＦの安定性〕
これまでの結果からニワトリＥＳ細胞の培養系にニワトリ細胞株が産生した真核型ｒｃｈＬＩＦの効果が高いことがわかった。そこで次に糖鎖付加によるタンパク質の安定性の試験を行った。原核型ｒｃｈＬＩＦおよび真核型ｒｃｈＬＩＦを高温（５０℃または８０℃）で６時間保温した場合、さらに、酸性（ｐＨ２．８）またはアルカリ性（ｐＨ１０．６）で６時間室温インキュベートして、リコンビナントタンパク質分解の程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて解析した。また各処理条件による生物活性の変化をニワトリＥＳ細胞培養系へ添加して調べた。
[Example 6: Stability of various rchLIFs]
From the results thus far, it was found that the eukaryotic rchLIF produced by the chicken cell line was highly effective in the chicken ES cell culture system. Therefore, the stability of the protein by glycosylation was next tested. When prokaryotic rchLIF and eukaryotic rchLIF are incubated at high temperature (50 ° C. or 80 ° C.) for 6 hours, they are further incubated at room temperature for 6 hours at acidic (pH 2.8) or alkaline (pH 10.6) to thereby provide recombinant proteolysis. The degree of was analyzed using SDS-PAGE. In addition, changes in biological activity due to each treatment condition were added to the chicken ES cell culture system and examined.
その結果、図１１に示したように原核型ｒｃｈＬＩＦでは８０℃の熱処理とアルカリ処理でバンドの減少が確認された。また真核型ｒｃｈＬＩＦでは８０℃処理により低分子のバンドの減少が認められたがそれ以外にバンドの減少は認められず、種々の処理に対して真核型ｒｃｈＬＩＦは極めて安定であることがわかった。 As a result, as shown in FIG. 11, in the prokaryotic rchLIF, a decrease in the band was confirmed by heat treatment at 80 ° C. and alkali treatment. In addition, in eukaryotic rchLIF, a decrease in the low molecular weight band was observed by treatment at 80 ° C., but no other decrease in the band was observed. It was.
次に、原核型ｒｃｈＬＩＦまたは真核型ｒｃｈＬＩＦをニワトリＥＳ細胞の培養系に２０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加して嚢胞性胚葉体の出現を指標にＬＩＦの生物活性を測定した。 Next, prokaryotic rchLIF or eukaryotic rchLIF was added to the chicken ES cell culture system at a concentration of 20 ng / ml, and the biological activity of LIF was measured using the appearance of cystic embryoid bodies as an index.
その結果、図１２に示したように、原核型ｒｃｈＬＩＦを使用した場合には多数の嚢胞性胚葉体の出現が認められたが、真核型ｒｃｈＬＩＦを使用した場合にニワトリＥＳ細胞は、円形のコロニーを形成したまま嚢胞性胚葉体の出現は全く認められなかった。以上の結果は、真核型ｒｃｈＬＩＦはその生物活性においても種々の処理に対して極めて安定であることを示している。 As a result, as shown in FIG. 12, when a prokaryotic rchLIF was used, a large number of cystic embryoid bodies were observed, but when a eukaryotic rchLIF was used, chicken ES cells were circular. The appearance of cystic embryoid bodies was not observed at all while colonies were formed. The above results indicate that eukaryotic rchLIF is extremely stable against various treatments even in its biological activity.
〔実施例７：ニワトリＬＩＦタンパクに対する抗体〕
原核型ニワトリＬＩＦタンパク質全長を免疫原として抗ＬＩＦ抗体を作製した。免疫原はフロイントアジュバンドと等量で混合し、マウスに腹腔内注射により免疫した。追加免疫を初回免疫後２週間おきに行い、四次免疫まで行った。四次免疫を細胞融合の３日前に行ない、尾静脈注射による免疫を行った。
[Example 7: Antibody to chicken LIF protein]
An anti-LIF antibody was prepared using the entire prokaryotic chicken LIF protein as an immunogen. The immunogen was mixed in an equal volume with Freund's adjuvant and the mice were immunized by intraperitoneal injection. Booster immunization was carried out every 2 weeks after the first immunization and up to the fourth immunization. The fourth immunization was performed 3 days before cell fusion, and immunization was performed by tail vein injection.
マウスより採血して得られたポリクローナル抗体を用いて、結合特異性を調べたところ、得られた抗体は、マウスＬＩＦタンパク質とニワトリＬＩＦタンパク質との間の交差反応を示さなかった。 When the binding specificity was examined using a polyclonal antibody obtained by collecting blood from a mouse, the obtained antibody did not show a cross reaction between the mouse LIF protein and the chicken LIF protein.
上述の実施例で示したように、胚盤葉細胞に対する生物活性および／またはＳＴＡＴ３のリン酸化において、ｒｃｈＬＩＦとｒｍＬＩＦとの間で違いがあることが明らかである。この違いは、両者間のアミノ酸配列が大きく異なることに起因し、その結果、リガンド／レセプター相互作用が異なっていることが考えられる。そこで、ＬＩＦにおけるリガンド／レセプター相互作用に関連する領域を解析することを目的として、ｒｃｈＬＩＦとレセプターとの結合に関与することが予想される領域（すなわち、ｒｃｈＬＩＦの親水性領域）に対する抗体を作製した。 As demonstrated in the above examples, it is clear that there is a difference between rchLIF and rmLIF in biological activity against blastoderm cells and / or phosphorylation of STAT3. This difference is attributed to the fact that the amino acid sequences between the two differ greatly, and as a result, the ligand / receptor interaction may be different. Therefore, for the purpose of analyzing the region related to the ligand / receptor interaction in LIF, an antibody against a region expected to be involved in the binding of rchLIF to the receptor (ie, the hydrophilic region of rchLIF) was prepared. .
具体的には、シグナルペプチドを除いた成熟型ニワトリＬＩＦタンパク質のアミノ酸第２３〜３５位（ＥＱＴＲＲＱＶＡＬＬＮＡＴ：配列番号１１）、第９６〜１１１位（ＧＮＩＴＲＤＱＥＥＬＮＰＭＡＫＥ：配列番号１２）、または第１４８〜１６４位（ＧＬＩＳＮＬＴＣＬＬＣＫＨＹＮＩＦ：配列番号１３）からなる合成ペプチドとキャリアータンパク質（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ，Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標） Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｃＫＬＨ，ＰＩＥＲＣＥ）との複合体を免疫原とした。免疫原は水酸化アルミニウムゲルアジュバンドと等量で混合し、マウスに腹腔内注射により免疫した。追加免疫を初回免疫後２週間おきに行い、四次免疫まで行った。四次免疫を細胞融合の３日前に行い、尾静脈注射による免疫を行った。 Specifically, amino acids 23 to 35 (EQTRRQVALLNAT: SEQ ID NO: 11), 96 to 111 (GNITRDQEEELNPMAKE: SEQ ID NO: 12), or 148 to 164 of the mature chicken LIF protein excluding the signal peptide ( A complex of a synthetic peptide consisting of GLISNLTCCLCKHYNIF (SEQ ID NO: 13) and a carrier protein (keyhole limpet hemocyanin (KLH, Image (registered trademark) Maleimide Activated mcKLH, PIERCE)) was used as an immunogen for the immunogen. The mice were immunized by intraperitoneal injection, boosted every 2 weeks after the first immunization, and up to the fourth immunization. Immediately 3 days before, immunization was performed by tail vein injection.
マウスより採血して得られたポリクローナル抗体を用いて、結合特異性を調べたところ、いずれの抗体においてもマウスＬＩＦタンパク質とニワトリＬＩＦタンパク質との間の交差反応は検出されなかった。さらに、これらの抗体は、ｒｃｈＬＩＦ依存的なＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害した。ｓ
さらに、ニワトリＬＩＦタンパク質全長に対するモノクローナル抗体および上記ペプチドに対するモノクローナル抗体を作製した。四次免疫を行った後、血清中の抗体価が十分上昇したことを確認したマウスから脾臓を摘出し、脾細胞を回収した。脾細胞は融合用親株細胞（ＳＰ２／０−Ａｇ１４）と融合させ、ＨＡＴ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎ ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｍ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）選択培地中で、融合細胞を選択した。ｒｃｈＬＩＦを抗原としたＥＬＩＳＡ法およびウエスタンブロット法（ＷＢ）を用いて、抗ニワトリＬＩＦ抗体を産生するハイブリドーマを選抜し、限界希釈法によりクローニングを行い、ニワトリＬＩＦタンパク質全長に対するマウス抗ニワトリＬＩＦモノクローナル抗体（ＨＵＬ１）および成熟型ニワトリＬＩＦタンパク質のアミノ酸第１４８〜１６４位（配列番号１３）を特異的に認識するマウス抗ニワトリＬＩＦモノクローナル抗体（ＨＵＬ２）を得た。さらに、Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてこれらの抗体のサブクラスを調べたところ、ＨＵＬ１はＩｇＧ２ｂ、ＨＵＬ２はＩｇＡであることが確認された。
When the binding specificity was examined using a polyclonal antibody obtained by collecting blood from a mouse, no cross-reaction between the mouse LIF protein and the chicken LIF protein was detected in any antibody. Furthermore, these antibodies inhibited rchLIF-dependent STAT3 phosphorylation. s
Furthermore, a monoclonal antibody against the full length of chicken LIF protein and a monoclonal antibody against the above peptide were prepared. After the fourth immunization, the spleen was removed from the mouse, which was confirmed that the antibody titer in the serum was sufficiently increased, and the spleen cells were collected. The spleen cells were fused with the parent cell for fusion (SP2 / 0-Ag14), and the fused cells were selected in a HAT (hypoxanthine aminoterinthymidine invitrogen) selection medium. A hybridoma producing an anti-chicken LIF antibody was selected by ELISA and Western blotting (WB) using rchLIF as an antigen, cloned by limiting dilution, and mouse anti-chicken LIF monoclonal antibody against the full length of chicken LIF protein ( A mouse anti-chicken LIF monoclonal antibody (HUL2) that specifically recognizes
得られたモノクローナル抗体はいずれも、ウエスタンブロッティング解析の結果、原核型ニワトリＬＩＦタンパク質および真核型ニワトリＬＩＦタンパク質の両方を強く認識することがわかった。特に、ＨＵＬ２は、ｒｃｈＬＩＦ依存的な胚盤葉細胞のＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害した。 As a result of Western blotting analysis, it was found that all of the obtained monoclonal antibodies strongly recognized both prokaryotic chicken LIF protein and eukaryotic chicken LIF protein. In particular, HUL2 inhibited STAT3 phosphorylation of blastoderm cells dependent on rchLIF.
ニワトリＬＩＦタンパク質（ｒｃｈＬＩＦ）は、ニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害して未分化状態を維持させるために有効である。特に、真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生された真核型ｒｃｈＬＩＦは、物理化学的に安定であり、かつ生物活性が非常に高い。本発明者らは、このような真核型ｒｃｈＬＩＦを安定に供給することができる細胞を得ることによって、トランスジェニックニワトリの作出に不可欠なニワトリＬＩＦタンパク質を大量生産することを可能にした。このような真核型ｒｃｈＬＩＦを用いれば、所望のトランスジェニックニワトリを容易に作出することができ、所望の動物工場として活用することができる。 Chicken LIF protein (rchLIF) is effective in inhibiting the differentiation of chicken embryonic stem cells or embryonic germ cells to maintain an undifferentiated state. In particular, eukaryotic rchLIF produced by a recombinant expression system using a eukaryotic host is physicochemically stable and has a very high biological activity. The present inventors have made it possible to mass-produce chicken LIF protein that is indispensable for the production of transgenic chickens by obtaining cells that can stably supply such eukaryotic rchLIF. By using such a eukaryotic rchLIF, a desired transgenic chicken can be easily produced and utilized as a desired animal factory.
Claims (26)
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴とするポリペプチド。 A polypeptide that inhibits differentiation of embryonic stem cells or embryonic germ cells, comprising:
(A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6; or (b) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, inserted, substituted, or added, And a polypeptide produced by a recombinant expression system using a eukaryotic host.
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされ、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴とするポリペプチド。 A polypeptide that inhibits differentiation of embryonic stem cells or embryonic germ cells, comprising:
(A) a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 5; or (b) a base in which one or several bases have been deleted, inserted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 5. A polypeptide encoded by a polynucleotide comprising a sequence and produced by a recombinant expression system using a eukaryotic host.
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
によってコードされ、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴とするポリペプチド。 A polypeptide that inhibits differentiation of embryonic stem cells or embryonic germ cells, comprising:
(A) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5; or (b) a polynucleotide which hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising the base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 5. A polypeptide encoded by and produced by a recombinant expression system using a eukaryotic host.
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされ、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴とするポリペプチド。 A polypeptide that inhibits differentiation of embryonic stem cells or embryonic germ cells, comprising:
(A) a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5; or (b) encoded by a polynucleotide consisting of a base sequence which is at least 80% identical to the base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 5. And a polypeptide produced by a recombinant expression system using a eukaryotic host.
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