JP2008022844A - Method for producing optically active d-homoserine and d-homoserine lactone - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、農薬・医薬品中間体として有用な光学活性なＤ−ホモセリン又はその等価体であるＤ−ホモセリンラクトンの新規な製造方法に関する。 The present invention relates to a novel process for producing optically active D-homoserine useful as an agrochemical / pharmaceutical intermediate or D-homoserine lactone which is an equivalent thereof.
Ｄ−ホモセリンは、抗生物質ノカルデシン（nocardicin）Ａ、サイトメガロウイルスのプロテアーゼ阻害剤、抗癌剤であるＲａｓファルネシル基転移酵素阻害剤などの薬剤の構成要素であり、これらの薬剤を量産する際の原料として使用される。また、Ｄ−ホモセリンはＤ−アミノ酸であるため、農薬及び医薬分野において大量かつ安価な供給が望まれている。 D-homoserine is a component of drugs such as the antibiotic nocardicin A, cytomegalovirus protease inhibitor, and anticancer drug Ras farnesyltransferase inhibitor, and is used as a raw material for mass production of these drugs. used. Further, since D-homoserine is a D-amino acid, a large amount and a low-cost supply are desired in the agricultural chemical and pharmaceutical fields.
光学活性なＤ−ホモセリンの製造としては、α−アミノ−γ−ブチロラクトンをフサリウム属、シリンドロカルポン属、及びジベレラ属からなる群より選ばれた属に属する微生物を用いて不斉加水分解する方法（特許文献１）が知られている。しかし、この方法は、立体選択性のないα−アミノ−γ−ブチロラクトンの自発的加水分解が不可避である為、得られるＤ−ホモセリンの光学純度が低い。また、Ｄ−ホモセリンラクトンの製造法として、優先晶出法（非特許文献１）等が知られているが、産物の鏡像体過剰率が明らかにされていない上に、操作が煩雑であり、工業的には適当ではない。 For the production of optically active D-homoserine, α-amino-γ-butyrolactone is asymmetrically hydrolyzed using a microorganism belonging to a genus selected from the group consisting of Fusarium, Cylindrocarp, and Gibberella. A method (Patent Document 1) is known. However, since this method inevitably undergoes spontaneous hydrolysis of α-amino-γ-butyrolactone having no stereoselectivity, the optical purity of the obtained D-homoserine is low. Further, as a method for producing D-homoserine lactone, a preferential crystallization method (Non-patent Document 1) and the like are known, but the enantiomeric excess of the product is not clarified, and the operation is complicated. It is not industrially appropriate.
このように、現在、光学活性なＤ−ホモセリン及びＤ−ホモセリンラクトンを簡便に、且つ、工業的に製造する方法は知られていない。 Thus, there is currently no known method for easily and industrially producing optically active D-homoserine and D-homoserine lactone.
従って、本発明の目的は、簡便かつ効率的なＤ−ホモセリン及びＤ−ホモセリンラクトンの製造方法、並びにそのための手段を提供することである。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a simple and efficient method for producing D-homoserine and D-homoserine lactone, and means for the same.
本発明者は、前記課題を解決するため、Ｄ−ホモセリンに対しＬ−ホモセリンを選択的に資化分解する微生物をスクリーニングした結果、アルスロバクター属に属する微生物の中にそのような選択的資化分解活性を有する微生物を見出し、それを用いることにより、ラセミ体ＤＬ−ホモセリン中のＬ−ホモセリンを消失せしめ、光学活性なＤ−ホモセリンを簡便に取得し得ることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいてなされたものである。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventor screened a microorganism that selectively assimilates and decomposes L-homoserine with respect to D-homoserine. It was found that by using a microorganism having a pyrolytic activity and using it, L-homoserine in racemic DL-homoserine can be eliminated, and optically active D-homoserine can be easily obtained. The present invention has been made based on such knowledge.
すなわち、本発明は、アルスロバクター属（Arthrobacter）に属し、かつＤ−ホモセリンに対しＬ−ホモセリンを選択的に資化分解することができる微生物に関する。該微生物としては、例えばアルスロバクター・エスピー２−２（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９１４）、アルスロバクター・ニコチノボランス２−３（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９１５）若しくはアルスロバクター・エスピー２−７（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９１６）、又はそれらの誘導株が挙げられる。 That is, the present invention relates to a microorganism that belongs to the genus Arthrobacter and can selectively assimilate L-homoserine relative to D-homoserine. Examples of the microorganism include Arthrobacter sp. 2-2 (FERM P-20914), Arthrobacter nicotinovorans 2-3 (FERM P-20915), and Arthrobacter sp. 2-7 (FERM P- 20916), or derivatives thereof.
また本発明は、上記の少なくとも１種の微生物又はその培養物とＤＬ−ホモセリン又はその塩とを接触させてＬ−ホモセリン又はその塩を分解し、Ｄ−ホモセリン又はその塩を採取することを特徴とする、Ｄ−ホモセリン又はその塩の製造方法に関する。上記製造方法により得られるＤ−ホモセリン又はその塩は、９０％ｅ．ｅ．以上の鏡像体過剰率を有することが好ましい。 In addition, the present invention is characterized in that D-homoserine or a salt thereof is collected by bringing L-homoserine or a salt thereof into contact with DL-homoserine or a salt thereof by contacting at least one microorganism or a culture thereof. The present invention relates to a method for producing D-homoserine or a salt thereof. D-homoserine or a salt thereof obtained by the above production method has 90% e.e. e. It is preferable to have the above enantiomeric excess.
さらに本発明は、上記の少なくとも１種の微生物又はその培養物とＤＬ−ホモセリン又はその塩とを接触させてＬ−ホモセリン又はその塩を分解し、Ｄ−ホモセリン又はその塩を採取し、該Ｄ−ホモセリン又はその塩を脱水環化することを特徴とする、Ｄ−ホモセリンラクトンの製造方法に関する。 The present invention further comprises contacting at least one microorganism as described above or a culture thereof with DL-homoserine or a salt thereof to decompose L-homoserine or a salt thereof, collecting D-homoserine or a salt thereof, -It relates to a method for producing D-homoserine lactone, characterized by dehydrating cyclization of homoserine or a salt thereof.
またさらに本発明は、上記の少なくとも１種の微生物又はその培養物を含有することを特徴とするＬ−ホモセリン分解剤に関する。 Furthermore, the present invention relates to an L-homoserine degrading agent characterized by containing at least one kind of microorganism or a culture thereof.
本発明により、Ｌ−ホモセリンを選択的に資化分解する微生物が提供される。かかる微生物は、ＤＬ−ホモセリン中のＬ−ホモセリンのみを選択的に分解するため、この微生物を利用して医薬品又は化学薬品の製造原料として有用なＤ−ホモセリン及びＤ−ホモセリンラクトンを簡便かつ効率的に製造することができる。 The present invention provides a microorganism that selectively assimilates and decomposes L-homoserine. Since such microorganisms selectively decompose only L-homoserine in DL-homoserine, D-homoserine and D-homoserine lactone, which are useful as raw materials for producing pharmaceuticals or chemicals, can be easily and efficiently utilized. Can be manufactured.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、アルスロバクター属に属し、かつＤ−ホモセリンに対しＬ−ホモセリンを選択的に資化分解することができる微生物、並びにこれらを利用したＤ−ホモセリン及びＤ−ホモセリンラクトンの製造方法及びＬ−ホモセリン分解剤を提供する。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention relates to a microorganism that belongs to the genus Arthrobacter and can selectively assimilate L-homoserine with respect to D-homoserine, and a method for producing D-homoserine and D-homoserine lactone using these microorganisms, and An L-homoserine degrading agent is provided.
アルスロバクター属に属し、かつＬ−ホモセリンを選択的に資化分解することができる微生物は、アルスロバクター属に属する微生物の中からスクリーニングによって得ることができる。例えば、代表的な菌株としては、アルスロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）２−２、アルスロバクター・ニコチノボランス（Arthrobacter nicotinovorans）２−３及びアルスロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）２−７が挙げられる。本発明者は、土壌からこれらの菌株を単離し、これらの菌株がＬ−ホモセリンを選択的に資化分解することを見出した。これらの微生物の菌学的性質は、実施例１に示す通りである。 A microorganism belonging to the genus Arthrobacter and capable of selectively assimilating L-homoserine can be obtained by screening from microorganisms belonging to the genus Arthrobacter. For example, representative strains include Arthrobacter sp. 2-2, Arthrobacter nicotinovorans 2-3, and Arthrobacter sp. 2- 7 is mentioned. The inventor has isolated these strains from soil and found that these strains selectively assimilate L-homoserine. The bacteriological properties of these microorganisms are as shown in Example 1.
本発明に係る微生物は、後述する微生物の菌学的性質を指標として、土壌、河川水、湖沼水、汚泥などから、Ｌ−ホモセリンに対する選択的資化性に基づき、平板分離法や集積培養法などのスクリーニングを行うことにより得ることができる。 The microorganism according to the present invention is based on the selective assimilation of L-homoserine from soil, river water, lake water, sludge, etc., using the microbiological properties of the microorganism described below as an index, and the plate separation method and the enrichment culture method. It can obtain by performing screening.
なお、アルスロバクター・エスピー２−２、アルスロバクター・ニコチノボランス２−３及びアルスロバクター・エスピー２−７は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００６年５月１８日付で寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９１４、ＦＥＲＭ Ｐ−２０９１５、及びＦＥＲＭ Ｐ−２０９１６が与えられている。 In addition, Arthrobacter SP2-2, Arthrobacter Nicotinobolans 2-3 and Arthrobacter SP2-7 are the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology patent microorganism deposit center (Tsukuba, Ibaraki, Japan). The deposit was made on May 18, 2006 at 1-chome, 1-chome, 1-center, 6) and was given the deposit numbers FERM P-20914, FERM P-20915, and FERM P-20916, respectively.
本発明においては、上記のアルスロバクター・エスピー２−２、アルスロバクター・ニコチノボランス２−３及びアルスロバクター・エスピー２−７が好ましいが、これらの誘導株も同様に好ましい。「誘導体」とは、上記菌株から天然に又は化学的若しくは物理的処理によって誘導される菌株であって、依然としてＤ−ホモセリンに対しＬ−ホモセリンを選択的に資化分解する能力を保持する菌株を指す。微生物は、その培養条件（例えば培地組成、温度など）や、化学的若しくは物理的処理（例えばγ線照射など）によって変異が誘発されることが知られている。本発明においては、Ｌ−ホモセリンを選択的に資化分解する能力を保持する限り、そのような誘導株も好ましく用いることができる。ある菌株がＬ−ホモセリンを選択的に資化分解する能力を保持する能力は、例えば実施例２に記載のように、ＤＬ−ホモセリンを含む培養液中で菌株を一定時間にわたり培養し、培養後の培養液中のＤ−ホモセリン含量又はＬ−ホモセリン含量を測定することによって簡便に確認することができる。 In the present invention, the above-mentioned Arthrobacter sp. 2-2, Arthrobacter nicotinovorans 2-3 and Arthrobacter sp. 2-7 are preferable, but these derived strains are also preferable. A “derivative” is a strain that is derived from the above strain naturally or by chemical or physical treatment and still retains the ability to selectively assimilate L-homoserine relative to D-homoserine. Point to. It is known that a microorganism is induced to be mutated by its culture conditions (for example, medium composition, temperature, etc.) and chemical or physical treatment (for example, γ-irradiation). In the present invention, such a derivative strain can also be preferably used as long as it retains the ability to selectively assimilate L-homoserine. The ability of a certain strain to retain the ability to selectively assimilate L-homoserine is, for example, as described in Example 2, after culturing the strain in a culture solution containing DL-homoserine for a certain period of time. This can be easily confirmed by measuring the D-homoserine content or the L-homoserine content in the culture medium.
本発明に係る微生物は、Ｌ−ホモセリンを選択的に資化分解するものであるため、これを用いて、ＤＬ−ホモセリン中のＬ−ホモセリンのみを資化分解し、Ｄ−ホモセリンを簡便かつ効率的に取得することができる。また、このようにして得たＤ−ホモセリンをＤ−ホモセリンラクトンに脱水環化することによって、Ｄ−ホモセリンラクトンを効率的に製造することができる。 Since the microorganism according to the present invention selectively assimilates and decomposes L-homoserine, it is used to assimilate and decompose only L-homoserine in DL-homoserine so that D-homoserine can be easily and efficiently used. Can be obtained. Moreover, D-homoserine lactone can be efficiently produced by dehydrating and cyclizing D-homoserine thus obtained to D-homoserine lactone.
従って、本発明に係るＤ−ホモセリン又はＤ−ホモセリンラクトンの製造方法（以下、「本製造方法」ともいう）は、Ｌ−ホモセリンを選択的に資化分解する微生物を利用することにより、ＤＬ−ホモセリン又はその塩中のＬ−ホモセリン又はその塩を選択的に分解し、Ｄ−ホモセリン又はその塩を製造することを特徴とするものである。 Therefore, the method for producing D-homoserine or D-homoserine lactone according to the present invention (hereinafter, also referred to as “the present production method”) uses a microorganism that selectively assimilates and decomposes L-homoserine. L-homoserine or a salt thereof in homoserine or a salt thereof is selectively decomposed to produce D-homoserine or a salt thereof.
本製造方法では、ＤＬ−ホモセリン又はその塩を、上述した微生物の菌体又はその培養物と接触させることで、ＤＬ−ホモセリン又はその塩中のＬ−ホモセリン又はその塩を選択的に分解することができる。出発物質であるラセミ体ＤＬ−ホモセリン又はその塩は、市販品を利用してもよいし（例えば昭和化学カタログ番号0808-8121）、又は化学合成により得てもよい。例えば、ＤＬ−ホモセリンは、（ＲＳ）−α−アミノ−γ−ブチロラクトンの加水分解によって得ることができる（Armstrong M.D., J. Amer. Chem. Soc.,第70巻第1756〜1759項,1948年）。また、ＤＬ−ホモセリンの塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、臭化水素酸塩などの塩が挙げられる。 In this production method, DL-homoserine or a salt thereof is selectively decomposed by bringing DL-homoserine or a salt thereof into contact with the above-mentioned microbial cell or a culture thereof, thereby DL-homoserine or a salt thereof in DL-homoserine or a salt thereof. Can do. The racemic DL-homoserine or a salt thereof as a starting material may be a commercially available product (for example, Showa Chemical Catalog No. 0808-8121) or obtained by chemical synthesis. For example, DL-homoserine can be obtained by hydrolysis of (RS) -α-amino-γ-butyrolactone (Armstrong MD, J. Amer. Chem. Soc., 70: 1756-1759, 1948). ). Examples of the salt of DL-homoserine include salts such as hydrochloride, sulfate, nitrate, and hydrobromide.
本製造方法に使用する微生物又はその培養物は、前述した微生物のうちの１種を単独で、又は複数種を組み合わせて使用することができ、また１種又は複数種の微生物から調製された培養物を使用してもよい。 The microorganism used in this production method or a culture thereof can be used alone or in combination of a plurality of the above-mentioned microorganisms, and is a culture prepared from one or more microorganisms. You may use things.
微生物の培養物を得るには、通常の培養条件を用いて上記微生物を培養すればよく、例えば、培地として、炭素源、窒素源、無機塩類を含有する培地を用いて、各種培養条件を用いて培養を行うことができる。炭素源としては、澱粉又はその組成画分、焙焼デキストリン、加工澱粉、澱粉誘導体、物理処理澱粉及びα−澱粉等の炭水化物などを用いることができる。具体例としては、例えば、可溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘薯澱粉、デキストリン、アミロペクチン、アミロース等が挙げられる。窒素源としては、ポリペプトン、カゼイン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー又は大豆若しくは大豆粕等の抽出物等の有機窒素源物質、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素化合物を用いることができる。そして、無機塩類としては、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄等の鉄イオン含有化合物、リン酸カリウム塩、リン酸ナトリウム塩等のリン酸塩、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化カルシウム等のカルシウム塩、塩化ナトリウム等のナトリウム塩を用いることができる。また培地は、固体培地及び液体培地のいずれも使用することができる。培養方法も特に限定されるものではなく、振盪培養、通気撹拌培養、静置培養などの公知の培養方法を用いることができる。ここで、培養の最適条件に関しては、用いる微生物の種類により異なるため、上記培地及び培養方法は用いる微生物に適するものに適宜選択及び調製される。また、温度、ｐＨ、培養期間等のその他の培養条件も、微生物が生育し、Ｌ−ホモセリンの分解能力を保持し得る条件であれば適宜選択されて培養が行われることが好ましい。例えば、培養は、振盪培養若しくは通気撹拌培養等の好気的条件下において、培地をｐＨ３〜９の範囲、好ましくはｐＨ６〜８に調整し、温度１０〜５０℃の範囲、好ましくは２０〜３０℃で実施し、通常１〜１５日間培養するのが望ましい。 In order to obtain a culture of microorganisms, the above microorganisms may be cultured using normal culture conditions. For example, a medium containing a carbon source, a nitrogen source, and inorganic salts is used as a medium, and various culture conditions are used. Can be cultured. As the carbon source, starch or a composition fraction thereof, roasted dextrin, modified starch, starch derivative, physically-treated starch, carbohydrate such as α-starch, and the like can be used. Specific examples include soluble starch, corn starch, potato starch, sweet potato starch, dextrin, amylopectin, and amylose. As the nitrogen source, organic nitrogen source materials such as polypeptone, casein, meat extract, yeast extract, corn steep liquor or extracts such as soybean or soybean meal, and inorganic nitrogen compounds such as ammonium sulfate and ammonium phosphate can be used. Examples of inorganic salts include ferrous chloride, ferric chloride, ferrous sulfate, ferric sulfate, and other iron ion-containing compounds, phosphates such as potassium phosphate and sodium phosphate, magnesium sulfate Magnesium salts such as calcium chloride, calcium salts such as calcium chloride, and sodium salts such as sodium chloride can be used. As the medium, either a solid medium or a liquid medium can be used. The culture method is not particularly limited, and a known culture method such as shaking culture, aeration stirring culture, or stationary culture can be used. Here, since the optimum conditions for culture vary depending on the type of microorganism used, the medium and the culture method are appropriately selected and prepared as appropriate for the microorganism used. Moreover, it is preferable that other culture conditions such as temperature, pH, and culture period are appropriately selected and cultured as long as the microorganism can grow and can maintain the ability to decompose L-homoserine. For example, the culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture, and the medium is adjusted to a pH range of 3 to 9, preferably 6 to 8, and a temperature range of 10 to 50 ° C., preferably 20 to 30 It is desirable to carry out at 0 ° C. and culture for 1 to 15 days.
ここで微生物の培養物は、その培養物のまま使用してもよいし、培養物を濾過、遠心分離若しくは脱水等の精製処理を行って使用してもよいし、又は培養物を水等で希釈して使用してもよい。 Here, the culture of the microorganism may be used as it is, or the culture may be used after purification treatment such as filtration, centrifugation or dehydration, or the culture with water or the like. It may be used after diluting.
微生物又はその培養物の形態は特に限定されず、微生物の菌体又はその培養物のそのままの形態、微生物の菌体又はその培養物を適当な溶媒中に溶解若しくは懸濁した形態、あるいは微生物の菌体又はその培養物を保存可能なように凍結又は乾燥した形態など、任意の形態をとることができる。このような形態は、当技術分野で公知の方法に従って適宜調製することができる。 The form of the microorganism or the culture thereof is not particularly limited, and the microorganism body or the culture form as it is, the microorganism body or the culture dissolved or suspended in an appropriate solvent, or the microorganism Arbitrary forms, such as a frozen or dried form so that a microbial cell or its culture | cultivation can be preserve | saved, can be taken. Such a form can be appropriately prepared according to a method known in the art.
使用する微生物の菌体又はその培養物の量は、使用する微生物の種類、ＤＬ−ホモセリンの存在量などを考慮して、望ましい結果が得られるように決定しうる。 The amount of the microorganism used or its culture can be determined in consideration of the type of microorganism to be used, the abundance of DL-homoserine, and the like so as to obtain a desired result.
さらに、Ｌ−ホモセリンの選択的分解をさらに効率的に行うために、上記微生物又はその培養物と共にその他の追加成分を使用してもよく、そのような追加成分としては、限定するものではないが、リン酸二水素カリウムなどのリン酸塩や酵母エキス、ビオチン等が挙げられる。 Furthermore, in order to perform the selective degradation of L-homoserine more efficiently, other additional components may be used together with the microorganism or the culture thereof, and such additional components are not limited. And phosphate such as potassium dihydrogen phosphate, yeast extract, biotin and the like.
本製造方法においては、上記微生物又はその培養物を、ＤＬ−ホモセリンと接触させるが、ここで「接触」とは、ＤＬ−ホモセリンと共に上記微生物の菌体を培養すること、ＤＬ−ホモセリンと上記微生物の菌体又は培養物とを混合すること、ＤＬ−ホモセリンに上記微生物の菌体又はその培養物を散布すること、上記微生物の菌体又はその培養物を不織布等に接種したものをＤＬ−ホモセリンに静置することなどを指す。 In this production method, the microorganism or culture thereof is brought into contact with DL-homoserine. Here, “contact” means culturing the cells of the microorganism together with DL-homoserine, DL-homoserine and the microorganism. A mixture of microbial cells or culture of the above, spraying the microbial cells of the microorganism or a culture thereof on DL-homoserine, and inoculating a non-woven fabric or the like with the microbial cells or culture of the microorganism. It refers to standing still.
好ましい方法の１つとしては、ＤＬ−ホモセリンを含む培地で前記微生物を培養する方法である。この場合、ＤＬ−ホモセリン溶液に必要に応じ炭素源、窒素源、無機塩等を加えて培地とする。培地組成は特に限定されるものではなく、上述した微生物の培養に適切なものであればよい。培養は、振盪培養若しくは通気撹拌培養等の好気的条件下において、培地をｐＨ３〜９の範囲、好ましくはｐＨ６〜８に調整し、温度１０〜５０℃の範囲、好ましくは、２０〜３０℃で実施し、通常１〜１５日間培養するのが望ましいが、この条件以外にあっても微生物が生育し、Ｌ−ホモセリンが消失する条件であれば何ら制限されない。 One preferred method is a method of culturing the microorganism in a medium containing DL-homoserine. In this case, a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt or the like is added to the DL-homoserine solution as necessary to form a culture medium. The medium composition is not particularly limited as long as it is suitable for culturing the microorganisms described above. The culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture, and the medium is adjusted to a pH range of 3 to 9, preferably pH 6 to 8, and a temperature range of 10 to 50 ° C, preferably 20 to 30 ° C. In general, it is desirable to culture for 1 to 15 days, but there is no limitation as long as microorganisms grow and L-homoserine disappears even under other conditions.
また他の好ましい方法としては、肉汁培地など適当な培地で前記微生物を培養し、得られた菌体をＤＬ−ホモセリン溶液に懸濁し、震盪又は通気攪拌する方法である。Ｌ−ホモセリンの資化を促す為に飢餓培養等の処理を菌体に対して施してもよい。ＤＬ−ホモセリン溶液の組成には何ら限定は無く、必要に応じ、無機塩類やビタミン等を加えてもよい。菌体懸濁液のｐＨや温度等の諸条件は、使用する微生物、ＤＬ−ホモセリン含有量、採用する培養方法などによって異なるが、Ｌ−ホモセリンが活発に資化され、消失する条件であれば何ら限定されるものではなく、当業者であれば適宜設定することができる。 Another preferred method is a method in which the microorganism is cultured in a suitable medium such as a broth medium, and the obtained cells are suspended in a DL-homoserine solution and shaken or agitated. In order to promote utilization of L-homoserine, the cells may be subjected to treatment such as starvation culture. There is no limitation on the composition of the DL-homoserine solution, and inorganic salts and vitamins may be added as necessary. Various conditions such as pH and temperature of the cell suspension vary depending on the microorganism to be used, DL-homoserine content, the culture method to be employed, etc., as long as L-homoserine is actively assimilated and disappears. It is not limited at all and can be appropriately set by those skilled in the art.
以上の操作によりホモセリンのＤ−体を含む培養液又は懸濁液が得られるので、通常の単離・精製方法、例えば遠心分離、タンパク質又は核酸分解試薬を使用して、微生物菌体又はその他の培養成分を取り除く。続いて、Ｄ−ホモセリンは、溶媒を留去することにより採取できる。更に必要に応じて、再結晶、再沈殿、クロマトグラフィー等の当技術分野で公知の任意の方法を単独で又は組み合わせて用いることによりＤ−ホモセリンを精製することができる。 Since the culture solution or suspension containing homoserine D-form is obtained by the above operation, microbial cells or other microorganisms can be obtained using conventional isolation / purification methods such as centrifugation, protein or nucleic acid degradation reagents. Remove culture components. Subsequently, D-homoserine can be collected by distilling off the solvent. Further, if necessary, D-homoserine can be purified by using any method known in the art such as recrystallization, reprecipitation, chromatography and the like alone or in combination.
このようにして製造されるＤ−ホモセリンは、光学純度（鏡像体過剰率）が高い。例えば、Ｄ−ホモセリンの鏡像体過剰率は、約７０％ｅ．ｅ．以上、好ましくは約８０％ｅ．ｅ．以上、より好ましくは約９０％ｅ．ｅ．以上、最も好ましくは９５％〜１００％ｅ．ｅ．である。 The D-homoserine produced in this way has high optical purity (enantiomeric excess). For example, the enantiomeric excess of D-homoserine is about 70% e.e. e. Or more, preferably about 80% e.e. e. Or more, more preferably about 90% e.e. e. Or more, most preferably 95% to 100% e.e. e. It is.
また、ホモセリンとホモセリンラクトンは平衡混合物として存在し、この平衡は、酸性条件下ではホモセリンラクトン方向に、そしてアルカリ性条件ではホモセリンの方向に傾くことが知られている。従って、上述のようにして得られたＤ−ホモセリンを酸性条件下での還流などの公知の方法で脱水環化することによって、Ｄ−ホモセリンラクトンを製造することができる。例えば、２規定濃度の塩酸で、２時間の煮沸処理を行うことにより、ホモセリンはホモセリンラクトンに変換することができる。しかしながら、本製造方法においては、ホモセリンからホモセリンラクトンを製造する公知の方法であれば特に限定されるものではない。 It is known that homoserine and homoserine lactone exist as an equilibrium mixture, and this equilibrium is inclined toward the homoserine lactone direction under acidic conditions and toward the homoserine direction under alkaline conditions. Therefore, D-homoserine lactone can be produced by dehydrating and cyclizing D-homoserine obtained as described above by a known method such as reflux under acidic conditions. For example, homoserine can be converted to homoserine lactone by boiling for 2 hours with 2N hydrochloric acid. However, the production method is not particularly limited as long as it is a known method for producing homoserine lactone from homoserine.
以上のようにして、本発明に係る微生物又はその培養物を用いることにより、簡便かつ効率的にＤ−ホモセリン及びＤ−ホモセリンラクトンを製造できる。 As described above, D-homoserine and D-homoserine lactone can be produced simply and efficiently by using the microorganism according to the present invention or a culture thereof.
また本発明に係る微生物は、Ｌ−ホモセリンを選択的に資化分解することができるものであるため、本発明はさらに、上記微生物又はその培養物を含むＬ−ホモセリンの分解剤を提供する。 Further, since the microorganism according to the present invention can selectively assimilate and decompose L-homoserine, the present invention further provides a degrading agent for L-homoserine containing the microorganism or a culture thereof.
本分解剤は、前述した微生物のうちの１種を単独で、又は複数種を組み合わせて含有することができ、また１種又は複数種の微生物から調製された培養物を含有してもよい。 The present degrading agent can contain one kind of the aforementioned microorganisms alone or in combination of plural kinds thereof, and may contain a culture prepared from one kind or plural kinds of microorganisms.
本分解剤の形態は特に限定されず、微生物の菌体又はその培養物のそのままの形態、微生物の菌体又はその培養物を適当な溶媒中に溶解若しくは懸濁した形態、あるいは微生物の菌体又はその培養物を保存可能なように凍結又は乾燥した形態など、任意の形態をとることができる。このような形態は、当技術分野で公知の方法に従って適宜調製することができる。 The form of the present degrading agent is not particularly limited, and the microbial cell or its culture as it is, the microbial cell or its culture dissolved or suspended in an appropriate solvent, or the microbial cell Or it can take arbitrary forms, such as the form frozen or dried so that the culture can be preserve | saved. Such a form can be appropriately prepared according to a method known in the art.
また、本分解剤は、他の成分を含んでもよい。他の成分は、微生物の菌体又はその培養物のＬ−ホモセリン選択的分解能を損なわないものであれば特に限定されるものではなく、例えば、リン酸塩などのｐＨ調整剤、酵母エキスやビオチンなどの賦活剤、カルボキシメチルセルロースや乳糖などの賦形剤等が挙げられる。 In addition, the present decomposition agent may contain other components. Other components are not particularly limited as long as they do not impair the L-homoserine selective resolution of microbial cells or their cultures. For example, pH adjusters such as phosphate, yeast extract and biotin And the like, and excipients such as carboxymethylcellulose and lactose.
本分解剤は、Ｌ−ホモセリンと接触させて使用するが、ここで「接触」とは、Ｌ−ホモセリンと共に本分解剤に含まれる菌体を培養すること、Ｌ−ホモセリンと本分解剤とを混合することなどを指す。 The decomposing agent is used in contact with L-homoserine. Here, “contact” means culturing the cells contained in the decomposing agent together with L-homoserine, and L-homoserine and the decomposing agent. Refers to mixing.
また、使用量は、使用する微生物の種類、Ｌ−ホモセリンの存在量などを考慮して、望ましい結果が得られるように決定しうる。 Further, the amount used can be determined so as to obtain a desired result in consideration of the type of microorganism used, the amount of L-homoserine present, and the like.
以下、本説明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present embodiment will be described in more detail with reference to examples. The present invention is not limited to these.
（ＲＳ）−α−アミノ−γ−ブチロラクトン臭化水素酸塩１ｇを７０ｍｌの蒸留水に溶かし、水酸化ナトリウムによりｐＨを９．５に調整後、室温に１時間放置した。この溶液にリン酸二水素カリウム０．３ｇを加え、ｐＨを７．０に調整し、オートクレーブにて１２１℃で５分間熱処理した。この処理により化学量論的に（ＲＳ）−α−アミノ−γ−ブチロラクトンは、ＤＬ−ホモセリンに開環した。 1 g of (RS) -α-amino-γ-butyrolactone hydrobromide was dissolved in 70 ml of distilled water, adjusted to pH 9.5 with sodium hydroxide, and allowed to stand at room temperature for 1 hour. To this solution, 0.3 g of potassium dihydrogen phosphate was added to adjust the pH to 7.0, followed by heat treatment at 121 ° C. for 5 minutes in an autoclave. This treatment stoichiometrically opened (RS) -α-amino-γ-butyrolactone to DL-homoserine.
この溶液に硫酸マグネシウム７水和物０．０３ｇ、塩化カルシウム２水和物０．０１ｇ、塩化ナトリウム０．０１ｇを加え、ｐＨを７．０に再調整し、蒸留水を加えて１００ｍｌに調整した後、オートクレーブにて１２１℃で１５分間加熱滅菌し集積培地とした。土壌試料０．５ｇを５ｍｌの滅菌水に懸濁し、上澄み０．５ｍｌを集積培地５ｍｌに接種し、３０℃で震盪培養した。菌が増殖し白濁が認められた場合は、集積培地を１．５％の寒天で固形化した平板培地に培養液を適宜希釈した後に塗布し、生じた微生物のコロニーを分離した。次いで、（ＲＳ）−α−アミノ−γ−ブチロラクトン臭化水素酸塩の濃度を５％に高め、０．１％の酵母エキスを追加した培地を同様に調製し、これに分離株を接種し、３０℃で震盪培養した。この培地で良好に増殖した３分離株（２−２株、２−３株、２−７株）を選び、実施例２に供した。尚、これらの分離株は、以下の菌学的性質を有する。 To this solution, 0.03 g of magnesium sulfate heptahydrate, 0.01 g of calcium chloride dihydrate and 0.01 g of sodium chloride were added, the pH was readjusted to 7.0, and distilled water was added to adjust to 100 ml. Then, it was sterilized by heating at 121 ° C. for 15 minutes in an autoclave to obtain an accumulation medium. 0.5 g of a soil sample was suspended in 5 ml of sterilized water, 0.5 ml of the supernatant was inoculated into 5 ml of the accumulation medium, and cultured with shaking at 30 ° C. When the bacteria grew and white turbidity was observed, the culture medium was appropriately diluted on a plate medium obtained by solidifying the accumulation medium with 1.5% agar and then applied, and the resulting microbial colonies were separated. Next, a medium in which the concentration of (RS) -α-amino-γ-butyrolactone hydrobromide was increased to 5% and 0.1% yeast extract was added was prepared in the same manner, and this was inoculated with the isolate. And cultured at 30 ° C. with shaking. Three isolates (2-2, 2-3, 2-7) that grew well in this medium were selected and used in Example 2. These isolates have the following mycological properties.
（１）アルスロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）２−２の菌学的性質
１．形態： 長さ１．５〜２．５μｍ、幅０．６〜０．８μｍの桿菌
２．多形性： 有り
３．グラム染色： 陽性
４．抗酸性： 無し
５．酸素に対する態度： 好気性
６．芽胞形成能： 無し
７．オキシターゼ： 陰性
８．カタラーゼ： 陽性
９．ウレアーゼ： 陰性
１０．ＤＮアーゼ： 陽性
１１．ＭＲテスト： 陰性
１２．ＶＰテスト： 陰性
１３．運動性： 無し
１４．硝酸塩還元能： 無し
１５．色素生産性： 黄色の色素を生産
１６．ゼラチンの加水分解能： 陽性
１７．エスクリンの加水分解能： 陽性
１８．澱粉の加水分解能： 陽性
１９．Ｏ−Ｆテスト： Ｄ−グルコースから酸を生成せず
２０．リボースからの酸の生成： 陰性
２１．マンニトールからの酸の生成： 陰性
２２．シュークロースからの酸の生成： 陰性
２３．キシロースからの酸の生成： 陰性
２４．マルトースからの酸の生成： 陰性
２５．ラクトースからの酸の生成： 陰性
(1) Mycological properties of Arthrobacter sp. 2-2 Form: Aspergillus having a length of 1.5 to 2.5 μm and a width of 0.6 to 0.8 μm Polymorphism: Yes 3. Gram staining: positive 4. Anti-acid: None Attitude toward oxygen: Aerobic Spore formation ability: None Oxidase: Negative 8. Catalase: Positive 9. Urease:
本菌の脂肪酸組成は、アルスロバクター属の特徴と一致した。即ち、１２−メチルテトラデカン酸及び１４−メチルヘキサデカン酸が主要な脂肪酸であった。本菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列はアルスロバクター・ニトログアジァコリクス（Arthrobacter nitroguaiacolicus）と９９％の相同性を示した。しかしながら、アルスロバクター・ニトログアジァコリクスがオキシターゼ反応陽性に対して、本菌は陰性であり、生理学的特徴は一致しなかった。また、他の既知のアルスロバクター属細菌とも生理学的特徴が一致せず、本菌は、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）により、アルスロバクター・エスピー（Arthrobactersp.）と同定された。本菌は、アルスロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）２−２と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−２０９１４として寄託されている。 The fatty acid composition of this bacterium was consistent with the characteristics of Arthrobacter. That is, 12-methyltetradecanoic acid and 14-methylhexadecanoic acid were the main fatty acids. The partial base sequence of 16S rDNA of this bacterium showed 99% homology with Arthrobacter nitroguaiacolicus. However, Arthrobacter nitroguasia collix was positive for oxidase reaction, whereas this bacterium was negative, and the physiological characteristics did not match. In addition, the physiological characteristics did not coincide with other known Arthrobacter bacteria, and this bacterium was identified as Arthrobactersp. By DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen). This bacterium is named Arthrobacter sp. 2-2 and is deposited as FERM P-20914 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Microorganism Depositary.
（２）アルスロバクター・ニコチノボランス（Arthrobacter nicotinovorans）２−３の菌学的性質
１．形態： 長さ１．５〜２．５μｍ、幅０．６〜０．８μｍの桿菌
２．多形性： 有り
３．グラム染色： 陽性
４．抗酸性： 無し
５．酸素に対する態度： 好気性
６．芽胞形成能： 無し
７．オキシターゼ： 陰性
８．カタラーゼ： 陽性
９．ウレアーゼ： 陰性
１０．ＤＮアーゼ： 陽性
１１．ＭＲテスト： 陰性
１２．ＶＰテスト： 陰性
１３．運動性： 無し
１４．硝酸塩還元能： 無し
１５．色素生産性： 黄色の色素を生産
１６．ゼラチンの加水分解能： 陽性
１７．エスクリンの加水分解能： 陽性
１８．澱粉の加水分解能： 陽性
１９．Ｏ−Ｆテスト： Ｄ−グルコースから酸を生成せず
２０．リボースからの酸の生成： 陰性
２１．マンニトールからの酸の生成： 陰性
２２．シュークロースからの酸の生成： 陰性
２３．キシロースからの酸の生成： 陰性
２４．マルトースからの酸の生成： 陰性
２５．ラクトースからの酸の生成： 陰性
２６．１０％ ＮａＣｌ存在下での生育： 陰性
(2) Mycological properties of Arthrobacter nicotinovorans 2-3 Form: Aspergillus having a length of 1.5 to 2.5 μm and a width of 0.6 to 0.8 μm Polymorphism: Yes 3. Gram staining: positive 4. Anti-acid: None Attitude toward oxygen: Aerobic Spore formation ability: None Oxidase: Negative 8. Catalase: Positive 9. Urease:
本菌の脂肪酸組成は、アルスロバクター属の特徴と一致した。即ち、１２−メチルテトラデカン酸及び１４−メチルヘキサデカン酸が主要な脂肪酸であった。本菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列は、アルスロバクター・ニコチノボランス（Arthrobacter nicotinovorans）と１００％の相同性を示した。また、生理学的諸性質もアルスロバクター・ニコチノボランスと一致した。本菌は、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）により、アルスロバクター・ニコチノボランス（Arthrobacter nicotinovorans）と同定された。本菌は、アルスロバクター・ニコチノボランス（Arthrobacter nicotinovorans）２−３と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−２０９１５として寄託されている。 The fatty acid composition of this bacterium was consistent with the characteristics of Arthrobacter. That is, 12-methyltetradecanoic acid and 14-methylhexadecanoic acid were the main fatty acids. The partial base sequence of 16S rDNA of this bacterium showed 100% homology with Arthrobacter nicotinovorans. The physiological properties were also consistent with Arthrobacter nicotinovorans. This bacterium was identified as Arthrobacter nicotinovorans by DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen). This bacterium is named Arthrobacter nicotinovorans 2-3, and is deposited as FERM P-20915 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Microorganism Depositary.
（３）アルスロバクター・エスピー（Arthrobactersp.）２−７の菌学的性質
１．形態： 長さ１．５〜２．５μｍ、幅０．６〜０．８μｍの桿菌
２．多形性： 有り
３．グラム染色： 陽性
４．抗酸性： 無し
５．酸素に対する態度： 好気性
６．芽胞形成能： 無し
７．オキシターゼ： 陰性
８．カタラーゼ： 陽性
９．ウレアーゼ： 陰性
１０．ＤＮアーゼ： 陽性
１１．ＭＲテスト： 陰性
１２．ＶＰテスト： 陰性
１３．運動性： 無し
１４．硝酸塩還元能： 無し
１５．色素生産性： 黄色の色素を生産
１６．ゼラチンの加水分解能： 陽性
１７．エスクリンの加水分解能： 陽性
１８．澱粉の加水分解能： 陽性
１９．Ｏ−Ｆテスト： Ｄ−グルコースから酸を生成せず
２０．リボースからの酸の生成： 陰性
２１．マンニトールからの酸の生成： 陰性
２２．シュークロースからの酸の生成： 陰性
２３．キシロースからの酸の生成： 陰性
２４．マルトースからの酸の生成： 陰性
２５．ラクトースからの酸の生成： 陰性
(3) Mycological properties of Arthrobactersp. 2-7 Form: Aspergillus having a length of 1.5 to 2.5 μm and a width of 0.6 to 0.8 μm Polymorphism: Yes 3. Gram staining: positive 4. Anti-acid: None Attitude toward oxygen: Aerobic Spore formation ability: None Oxidase: Negative 8. Catalase: Positive 9. Urease:
本菌の脂肪酸組成は、アルスロバクター属の特徴と一致した。即ち、１２−メチルテトラデカン酸及び１４−メチルヘキサデカン酸が主要な脂肪酸であった。本菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列はアルスロバクター・ニトログアジァコリクス（Arthrobacter nitroguaiacolicus）と９９％の相同性を示した。しかしながら、アルスロバクター・ニトログアジァコリクスがオキシターゼ反応陽性に対して、本菌は陰性であり、生理学的特徴は一致しなかった。また、他の既知のアルスロバクター属細菌とも生理学的特徴が一致せず、本菌は、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）により、アルスロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）と同定された。本菌は、アルスロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）２−７と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−２０９１６として寄託されている。 The fatty acid composition of this bacterium was consistent with the characteristics of Arthrobacter. That is, 12-methyltetradecanoic acid and 14-methylhexadecanoic acid were the main fatty acids. The partial base sequence of 16S rDNA of this bacterium showed 99% homology with Arthrobacter nitroguaiacolicus. However, Arthrobacter nitroguasia collix was positive for oxidase reaction, whereas this bacterium was negative, and the physiological characteristics did not match. In addition, the physiological characteristics did not coincide with other known Arthrobacter bacteria, and this bacterium was identified as Arthrobacter sp. By DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen). This bacterium is named Arthrobacter sp. 2-7, and has been deposited as FERM P-20916 in the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Microorganism Depositary.
本実施例では、実施例１で単離した微生物のＬ−ホモセリン分解活性について試験した。 In this example, the microorganism isolated in Example 1 was tested for L-homoserine degradation activity.
（ＲＳ）−α−アミノ−γ−ブチロラクトン臭化水素酸塩５ｇを７０ｍｌの蒸留水に溶かし、水酸化ナトリウムによりｐＨを９．５に調整後、室温に１時間放置した。この溶液にリン酸二水素カリウム０．３ｇを加え、ｐＨを７．０に調整し、オートクレーブにて１２１℃で５分間熱処理した。この処理により化学量論的に（ＲＳ）−α−アミノ−γ−ブチロラクトンは、ＤＬ−ホモセリンに開環した。 (RS) -α-amino-γ-butyrolactone hydrobromide (5 g) was dissolved in 70 ml of distilled water, adjusted to pH 9.5 with sodium hydroxide, and allowed to stand at room temperature for 1 hour. To this solution, 0.3 g of potassium dihydrogen phosphate was added to adjust the pH to 7.0, followed by heat treatment at 121 ° C. for 5 minutes in an autoclave. This treatment stoichiometrically opened (RS) -α-amino-γ-butyrolactone to DL-homoserine.
この溶液に酵母エキス０．１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．０３ｇ、塩化カルシウム２水和物０．０１ｇ、塩化ナトリウム０．０１ｇを加え、ｐＨを７．０に再調整し、蒸留水を加えて１００ｍｌに調整した後、試験管に５ｍｌずつ分注し、オートクレーブにて１２１℃で１５分間加熱滅菌した。各試験管内の培地に表１に記載した菌株をそれぞれ植菌し、３０℃で４０〜７０時間培養した。培養液から遠心分離により菌体を除き、培養液上清を得た。 To this solution, 0.1 g of yeast extract, 0.03 g of magnesium sulfate heptahydrate, 0.01 g of calcium chloride dihydrate and 0.01 g of sodium chloride were added, the pH was readjusted to 7.0, and distilled water was added. In addition, after adjusting to 100 ml, 5 ml was dispensed into a test tube and sterilized by heating at 121 ° C. for 15 minutes in an autoclave. Each of the strains listed in Table 1 was inoculated into the medium in each test tube and cultured at 30 ° C. for 40 to 70 hours. The cells were removed from the culture broth by centrifugation to obtain a culture supernatant.
培養液上清に残存しているホモセリンのＤ−体及びＬ−体は、光学分割カラム［ダイセル化学工業社製ＣｒｏｗｎＰａｋ ＣＲ（＋）］を用いた高速液体クロマトグラフィーで定量し、Ｄ−ホモセリンの残存率及び光学純度（鏡像体過剰率）を算出した。その結果は、表１に示す通りである。 The D- and L-forms of homoserine remaining in the culture supernatant are quantified by high performance liquid chromatography using an optical resolution column [CrownPak CR (+) manufactured by Daicel Chemical Industries, Ltd.] The residual ratio and optical purity (enantiomeric excess ratio) were calculated. The results are as shown in Table 1.
以上の結果から、実施例１で単離された微生物は、ＤＬ−ホモセリン中のＬ−ホモセリンを選択的に資化分解することが確認された。 From the above results, it was confirmed that the microorganism isolated in Example 1 selectively assimilate L-homoserine in DL-homoserine.
（ＲＳ）−α−アミノ−γ−ブチロラクトン臭化水素酸塩５ｇ及びリン酸二水素カリウム０．３ｇを７０ｍｌの蒸留水に溶かし、水酸化ナトリウムによりｐＨを７．０に調整後、オートクレーブにて１２１℃で１０分間熱処理した。この処理により化学量論的に（ＲＳ）−α−アミノ−γ−ブチロラクトンは、ＤＬ−ホモセリンに開環した。 (RS) -α-amino-γ-butyrolactone hydrobromide 5 g and potassium dihydrogen phosphate 0.3 g were dissolved in 70 ml of distilled water, pH was adjusted to 7.0 with sodium hydroxide, and then autoclave. Heat treatment was performed at 121 ° C. for 10 minutes. This treatment stoichiometrically opened (RS) -α-amino-γ-butyrolactone to DL-homoserine.
この溶液に酵母エキス０．１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．０３ｇ、塩化カルシウム２水和物０．０１ｇ、塩化ナトリウム０．０１ｇを加え、ｐＨを７．０に再調整し、蒸留水を加えて１００ｍｌに調整した後、試験管に５ｍｌずつ分注し、オートクレーブにて１２１℃で１５分間加熱滅菌した。この培地にアルスロバクター・ニコチノボランス２−３を接種し、３０℃で１７時間培養し、種培養とした。 To this solution, 0.1 g of yeast extract, 0.03 g of magnesium sulfate heptahydrate, 0.01 g of calcium chloride dihydrate and 0.01 g of sodium chloride were added, the pH was readjusted to 7.0, and distilled water was added. In addition, after adjusting to 100 ml, 5 ml was dispensed into a test tube and sterilized by heating at 121 ° C. for 15 minutes in an autoclave. This medium was inoculated with Arthrobacter nicotinovorans 2-3 and cultured at 30 ° C. for 17 hours to prepare a seed culture.
二本の５００ｍｌ容坂口フラスコに同じ培地を１００ｍｌずつ分注し、オートクレーブにて１２１℃で１５分間加熱滅菌した。この坂口フラスコに対し前述の種培養を５ｍｌずつ植菌し、３０℃で５３時間震盪培養した。培養液の一部を取り、光学分割カラム［ダイセル化学工業社製ＣｒｏｗｎＰａｋ ＣＲ（＋）］を用いた高速液体クロマトグラフィーでその上清を分析し、Ｌ−ホモセリンの消失を確認した後、培養液から遠心により菌体を除き、培養液上清を得た。 100 ml of the same medium was dispensed into two 500 ml Sakaguchi flasks and sterilized by heating at 121 ° C. for 15 minutes in an autoclave. The Sakaguchi flask was inoculated with 5 ml of the above seed culture, and shake-cultured at 30 ° C. for 53 hours. A part of the culture solution is taken, and the supernatant is analyzed by high performance liquid chromatography using an optical resolution column [CrownPak CR (+) manufactured by Daicel Chemical Industries, Ltd.], and the disappearance of L-homoserine is confirmed. The cells were removed from the cells by centrifugation to obtain a culture supernatant.
培養液上清のｐＨを塩酸でｐＨ７．０に調整後、沸騰水浴に入れ、９０℃以上の温度に１０分間保ち、溶存しているタンパク質等の高分子を変性させた。冷却後、遠心により沈殿物を除いた。さらに除核酸の為に２００ｍｌの培養液上清に対し１２５０ＵのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（ノバジェン社）を加え、室温に３時間放置した。 After adjusting the pH of the culture supernatant to pH 7.0 with hydrochloric acid, it was placed in a boiling water bath and kept at a temperature of 90 ° C. or higher for 10 minutes to denature dissolved polymers and other polymers. After cooling, the precipitate was removed by centrifugation. Further, 1250 U of Benzonase (Novagen) was added to 200 ml of the culture supernatant for nucleic acid removal and left at room temperature for 3 hours.
本培養液上清を、イオン交換樹脂アンバーライトＩＲ１２０Ｂ（ローム・アンド・ハース・ジャパン社）を充填したカラム（内径２６ｍｍ、長さ２００ｍｍ）に供し、水洗の後、０．２Ｍ濃度のアンモニア水で溶出を行った。ホモセリンを含む画分を集め、ｐＨを７．０に調整し、活性炭で脱色した後、ロータリーエバポレーターを用いて約２０ｍｌに濃縮した。この濃縮液に対し２５０ｍｌの熱エタノールを攪拌しつつ加え、引き続き攪拌しつつ、室温に一晩放置した。析出物を濾過により集め、エタノールで洗浄後、乾燥させ、１．６ｇのＤ−ホモセリンを得た。即ち、Ｄ−ホモセリンに対するモル収率は、４９％であった。 The main culture supernatant was applied to a column (inner diameter 26 mm, length 200 mm) packed with ion exchange resin Amberlite IR120B (Rohm and Haas Japan), washed with water, and then with 0.2M ammonia water. Elution was performed. Fractions containing homoserine were collected, pH was adjusted to 7.0, decolorized with activated carbon, and then concentrated to about 20 ml using a rotary evaporator. To this concentrate, 250 ml of hot ethanol was added with stirring, and the mixture was allowed to stand overnight at room temperature with stirring. The precipitate was collected by filtration, washed with ethanol, and dried to obtain 1.6 g of D-homoserine. That is, the molar yield based on D-homoserine was 49%.
得られたＤ−ホモセリンを光学分割カラム［ダイセル化学工業社製ＣｒｏｗｎＰａｋ ＣＲ（＋）］を用いた高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、９９．９％ｅ．ｅ．以上の光学純度を有していた。またイナートシルＯＤＳ−３カラム（４．６×２５０ｍｍ、ＧＬサイエンス社製）を用いて、７．５ｍＭの１−ペンタンスルホン酸ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．５）を移動層とする高速液体クロマトグラフィーで、本標品を分析したところ、９９．６％以上の純度を有することが確認された。 The obtained D-homoserine was analyzed by high performance liquid chromatography using an optical resolution column [CrownPak CR (+) manufactured by Daicel Chemical Industries, Ltd.]. e. It had the above optical purity. Further, using an inert syl ODS-3 column (4.6 × 250 mm, manufactured by GL Science), a 20 mM phosphate buffer (pH 2.5) containing 7.5 mM sodium 1-pentanesulfonate is used as a moving layer. When this sample was analyzed by liquid chromatography, it was confirmed that the sample had a purity of 99.6% or more.
（ＲＳ）−α−アミノ−γ−ブチロラクトン臭化水素酸塩１．５ｇ及びリン酸二水素カリウム０．０６８ｇを７ｍｌの蒸留水に溶かし、水酸化ナトリウムによりｐＨを７．０に調整後、オートクレーブにて１２１℃で１０分間熱処理した。この溶液に酵母エキス０．０２ｇを加え、ｐＨを７．０に再調整し、オートクレーブにて１２１℃で１５分間加熱滅菌した。 (RS) -α-amino-γ-butyrolactone hydrobromide 1.5 g and potassium dihydrogen phosphate 0.068 g were dissolved in 7 ml of distilled water, and the pH was adjusted to 7.0 with sodium hydroxide. For 10 minutes at 121 ° C. To this solution, 0.02 g of yeast extract was added, the pH was readjusted to 7.0, and heat sterilized at 121 ° C. for 15 minutes in an autoclave.
肉汁培地にアルスロバクター・ニコチノボランス２−３を接種し、３０℃で２４時間震盪培養した後、菌体を遠心分離により集めた。菌体を滅菌蒸留水で二回洗浄し、その１ｇ（乾燥重量０．１３ｇに相当）を上記の溶液に懸濁した。滅菌蒸留水を加えて体積を１０ｍｌに調整した後、この反応液を３０℃で好気的に震盪した。 Arthrobacter nicotinovorans 2-3 was inoculated into the broth culture medium, and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours, and then the cells were collected by centrifugation. The cells were washed twice with sterilized distilled water, and 1 g (corresponding to a dry weight of 0.13 g) was suspended in the above solution. After adding sterile distilled water to adjust the volume to 10 ml, the reaction solution was shaken aerobically at 30 ° C.
反応液を経時的に採取し、その上清に残存しているホモセリンのＤ−体及びＬ−体を光学分割カラム［ダイセル化学工業社製ＣｒｏｗｎＰａｋ ＣＲ（＋）］を用いた高速液体クロマトグラフィーで定量し、残存しているＤ−体の鏡像体過剰率を算出した。その結果を、図１に示す。７１時間の反応により、光学分割が達成された。 The reaction solution was collected over time, and homoserine D-form and L-form remaining in the supernatant were subjected to high performance liquid chromatography using an optical resolution column [CrownPak CR (+) manufactured by Daicel Chemical Industries, Ltd.]. Quantification was performed and the enantiomeric excess of the remaining D-form was calculated. The result is shown in FIG. An optical resolution was achieved with a 71 hour reaction.
本発明により、Ｌ−ホモセリンを選択的に資化分解する微生物が提供される。かかる微生物は、ＤＬ−ホモセリン中のＬ−ホモセリンのみを選択的に分解するため、この微生物を利用して医薬品又は化学薬品の製造原料として有用なＤ−ホモセリン及びＤ−ホモセリンラクトンを簡便かつ効率的に製造することができる。 The present invention provides a microorganism that selectively assimilates and decomposes L-homoserine. Since such microorganisms selectively decompose only L-homoserine in DL-homoserine, D-homoserine and D-homoserine lactone, which are useful as raw materials for producing pharmaceuticals or chemicals, can be easily and efficiently utilized. Can be manufactured.
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