JP2008011748A

JP2008011748A - ヌクレアーゼ活性の促進法

Info

Publication number: JP2008011748A
Application number: JP2006184824A
Authority: JP
Inventors: Yoshiharu Sasaki; 義晴佐々木; Daisuke Miyoshi; 大輔三好; Naoki Sugimoto; 直己杉本
Original assignee: Fine Co Ltd
Current assignee: Fine Co Ltd
Priority date: 2006-07-04
Filing date: 2006-07-04
Publication date: 2008-01-24

Abstract

【課題】核酸分解時間の短縮と使用するヌクレアーゼの使用量の削減によるコスト削減を達成することができるヌクレアーゼ活性の促進法を提供すること。
【解決手段】ヌクレアーゼを用いた核酸分解反応において、ヌクレアーゼ活性向上を目的とし、各種分子クラウディング剤（ポリエチレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、Ｆｉｃｏｌｌ、グリセロール、デキストラン、１，３−プロパンジオール、１，２−ジメトキジエタン、ベタインを含む全ての親水性高分子、多糖類および有機溶媒からなる群から選ばれた１種または２種以上）存在下で核酸分解反応を行うヌクレアーゼ活性の促進法。
【選択図】図１

Description

この発明は、核酸分解酵素であるヌクレアーゼを活性化して核酸の分解を促進する方法に関するものである。

ヌクレアーゼは核酸分解酵素であり、創薬、化粧品、食品添加物、酵素製剤、遺伝子工学等の分野において広く使用されている。これまで核酸を分解する際、それぞれの用途に応じて各種ヌクレアーゼが使用されていた。

例えば、酵母エキスの製造においてヌクレアーゼが用いられていた（例えば、特許文献１参照）。
特開平１１−３３２５１０号公報（請求項５、請求項６、段落０００８，０００９）

しかしながら、これら各種ヌクレアーゼ等の酵素類は高価なものであり、工業的なスケールで使用する際にはコストがかかるという問題があり、また、実験スケールにおいても、ヌクレアーゼのターンオーバーを防ぐため酵素量は最小限に抑える必要があった。

そこでこの発明の課題は、各種ヌクレアーゼによる核酸分解において、ヌクレアーゼ活性を促進させ、核酸分解時間の短縮と使用するヌクレアーゼの使用量の削減によるコスト削減を達成することができるヌクレアーゼ活性の促進法を提供することにある。

上記のような課題を解決するため、請求項１の発明は、ヌクレアーゼを用いた核酸分解反応において、ヌクレアーゼ活性向上を目的とし、各種分子クラウディング剤存在下で核酸分解反応を行うヌクレアーゼ活性の促進法である。

上記各種分子クラウディング剤としては、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、Ｆｉｃｏｌｌ、グリセロール、デキストラン、１，３−プロパンジオール、１，２−ジメトキジエタン、ベタインを含む全ての親水性高分子、多糖類および有機溶媒からなる群から選ばれた１種または２種以上が挙げられる。

また、請求項２の発明は、上記請求項１に記載のヌクレアーゼ活性の促進法において、分子クラウディング剤として分子量が２００〜３５０００の範囲内にあるポリエチレングリコールを用いた構成を採用したものである。

また、請求項３の発明は、上記請求項１または２に記載のヌクレアーゼ活性の促進法において、各種分子クラウディング剤の濃度が０．１〜３０ｗｔ％の範囲にある構成を採用したものである。

上記各種分子クラウディング剤の濃度としては、更に５〜２０ｗｔ％の範囲が好ましい。

また、請求項４の発明は、上記請求項１乃至３のいずれかの項に記載のヌクレアーゼ活性の促進法において、Deoxyribonuclease I,S1 Nuclease、Mung Bean Nuclease、BAL31 Nuclease、Micrococcal Nuclease、Ribonuclease H、RNase T2を含む全てのエンド型ヌクレアーゼから選ばれた１種または２種以上のヌクレアーゼを使用した構成を採用したものである。

この発明によれば、ヌクレアーゼ活性を促進させることにより、少量の酵素で、迅速に核酸を完全に分解させることが可能となる。

従って、医薬、化粧品、食料業界において核酸分解物を使用する際、この発明の方法によってヌクレアーゼ消化を行うことにより、酵素の使用量減、および酵素反応時間短縮化に伴う大幅なコスト削減が得られ、また、遺伝子工学等研究分野における核酸分解工程の迅速化が得られることになる。

分子量２００〜３５０００の範囲にあるポリエチレングリコールの濃度５〜２０ｗｔ％の存在下、エンド型ヌクレアーゼを用いて核酸分解反応を行う。

１００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ₂および２０ｗｔ％の分子クラウディング剤（ポリエチレングリコール類、エチレングリコール、ジエチレングリコール、Ｆｉｃｏｌｌ又はグリセロール）存在下で０．１４６Ｕのヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅＩ）を用いてｐＨ７．０、３７℃で反応を行った。なお基質として２０μＭの２９ｍｅｒｄｓＤＮＡを使用した。その結果、ヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅＩ）に及ぼす各種クラウディング剤の影響を図１に示す。なお、図１中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示す。

図１で示すように、各種分子クラウディング剤存在下では、ヌクレアーゼの核酸分解能が向上したのがわかった。

なかでもポリエチレングリコール類存在下では核酸分解能が著しく向上したのがわかった。即ち、反応時間３０分で、分子クラウディング剤非存在下では基質がおよそ８０％残存しているのに対し、ポリエチレングリコール類存在下では、基質は完全に消化された。

核酸分解反応におけるヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅＩ）に及ぼす２０ｗｔ％クラウディング剤の影響を示すグラフ

Claims

ヌクレアーゼを用いた核酸分解反応において、ヌクレアーゼ活性向上を目的とし、各種分子クラウディング剤（ポリエチレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、Ｆｉｃｏｌｌ、グリセロール、デキストラン、１，３−プロパンジオール、１，２−ジメトキジエタン、ベタインを含む全ての親水性高分子、多糖類および有機溶媒からなる群から選ばれた１種または２種以上）存在下で核酸分解反応を行うことを特徴とするヌクレアーゼ活性の促進法。
分子クラウディング剤として分子量が２００〜３５０００の範囲内にあるポリエチレングリコールを用いたことを特徴とする請求項１に記載のヌクレアーゼ活性の促進法。
各種分子クラウディング剤の濃度が０．１〜３０ｗｔ％の範囲にあることを特徴とする請求項１または２に記載のヌクレアーゼ活性の促進法。
Deoxyribonuclease I,S1 Nuclease、Mung Bean Nuclease、BAL31 Nuclease、Micrococcal Nuclease、Ribonuclease H、RNase T2を含む全てのエンド型ヌクレアーゼから選ばれた１種または２種以上のヌクレアーゼを使用した請求項１乃至３のいずれかの項に記載のヌクレアーゼ活性の促進法。