JP2008007478A - 神経線維の伸展用薬剤の位置を制御する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 神経細胞の線維の伸展を促す薬剤の制御できなかった。
【手段】神経反発因子の機能を阻害する抗体又は薬剤もしくは神経線維の伸展を促す薬剤を表面に結合させた磁性体からなるナンワイヤを体内の神経細胞近傍に注入する第一工程と、体外から前記注入したナノワイヤに磁力を与えて誘導し所定位置で鎖状にして配置する第二工程からなることを特徴とする構成を採用した。
【選択図】図12

Description

本願発明は、 生体内で神経細胞から伸びる神経線維の伸展用薬剤の位置を制御する方法に関するものである。

生体内に神経細胞を移植することにより、いったん失われた神経系統が回復することが知見されている。
しかし、その部位によっては神経系統の回復がなされなかったり、所望どおりの回復がなされない等の問題も生じていた。
特に脳内においては、神経線維の伸展が行われにくく、またその方向も制御できないことから、脳内での神経系統の回復は不可能とされていた。

本発明は、このような実情に鑑み、広範囲の部位において、所望どおりの神経系統の回復が行えるようにすることを目的とする。

本発明の発明者らが先に出願（特願２００５−３０４５７８号）した多機能ナノワイヤを有効に利用することでこの問題を解決するに至ったものである。

つまり上記課題を以下のようにして解決した。
本発明１の神経線維の伸展用薬剤の位置を制御する方法は、神経反発因子の機能を阻害する抗体又は薬剤もしくは神経線維の伸展を促す薬剤を表面に結合させた磁性体からなるナンワイヤを体内の神経細胞近傍に注入する第一工程と、体外から前記注入したナノワイヤに磁力を与えて誘導し所定位置で鎖状にして配置する第二工程からなることを特徴とする構成を採用した。

本発明２の神経線維の伸展用薬剤の位置を制御する方法は、発明１のナノワイヤは鉄を主成分とする直径３００ｎｍ以下、長さ３００μｍ以下であることを特徴とする構成を採用した。

本発明３の神経線維の伸展用薬剤の位置を制御する方法は、発明１又は２のナノワイヤに、その位置を検出するマーカー用の蛍光物質が結合してあることを特徴とする構成を採用した。

本発明１により、神経線維を伸展させたい部位に神経反発因子の機能を阻害する抗体又は薬剤もしくは神経線維の伸展を促す薬剤を鎖状に配置することができたので、仮に生体内に神経反発因子やその他の伸展阻害要因があっても、規定されたルートに沿って神経線維を進展させることができた。
また、ナノワイヤが磁性体よりなるから、外部からの磁力により血液などの運搬手段によらずに体内で移動させることができるようなった。
これは、血流が弱い脳内などの部位においても上記同様な効果を得ることができる点で、神経系統の回復の可能性を飛躍的に大きくすることができる大きな要素になる。
また、ナノワイヤが極微小な直径と長さを有するものであることから、体内での移動において大きなダメージを与えることもなくなった。
さらに、マーカー用の蛍光物質が結合することにより、位置の確認が容易になるので、神経細胞の注入位置を決定することも容易になった。

本発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。

本発明のナノワイヤは、直径３００ｎｍ以下、長さ３００μｍ以下のナノワイヤの表面に抗体又は薬剤が結合されている。そして、このナノワイヤは鉄を主成分として形成されている。ここで、鉄を主成分として形成されているとは、鉄がナノワイヤ全体に対して重量比で５０％以上であることを言い、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上である。鉄は強磁性体であるため磁場による操作が可能であり、また人体への影響が小さいため、鉄を主成分とする多機能ナノワイヤは医療、生体分野で利用することができる。なお、このナノワイヤは、少なくとも鉄を含む複数種の金属が長手方向に交互に並んで形成されていてもよい。鉄以外の金属としては、たとえば、金、銅、鉛などが挙げられるが、医療、生体分野での利用を考慮すると金であることが好ましい。

また、本発明における抗体又は薬剤は、ナノワイヤの表面に化学的に結合されていてもよいし、物理的に付着して直接固定されて結合されていてもよい。あるいは、エポキシ基、ビニル基、アミノ基およびカルボキシル基のうちの少なくともいずれかの官能基をナノワイヤの表面に導入し、その官能基に有機物を結合させるようにしてもよい。ナノワイヤ表面への官能基の導入は、たとえば、官能基としてエポキシ基、ビニル基、アミノ基またはカルボキシ基を持つシランカップリング剤でナノワイヤを表面処理して、前記官能基をナノワイヤの表面に導入することが考慮される。

本発明においてナノワイヤに結合されるものとしては、蛍光物質、タンパク質、核酸、または生分解性ポリマーや多糖類などの各種の高分子が例示され、特に限定されるものではない。本願発明では、蛍光物質、ケモカイン、デキストラン、ポリ乳酸、ポリスチレン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミンなどが好適なものとして考慮される。そして、これら複数種の有機物がナノワイヤ表面に結合されていてもよい。

次に、本発明のナノワイヤの製造方法について説明する。

まず、シュウ酸や硫酸などの電解液中でアルミニウムを陽極酸化してその表面に細孔が形成された陽極酸化ポーラスアルミナ作製する。そして、この陽極酸化ポーラスアルミナを鋳型として、ナノポーラス内に鉄を電解析出により充填しナノワイヤを形成する。アルミニウムの表面に形成された細孔の孔径や長さは、電解液の組成や電流密度、電解時間等を適宜に設定することで孔径３００ｎｍ以下、長さ３００μｍ以下に制御することができ、得られるナノワイヤについてその直径が３００ｎｍ以下、長さ３００μｍ以下のものを作製することができる。それぞれの下限値は、製法の観点から、直径が約１０ｎｍ、長さが約１μｍである。なお、鉄を含む複数種の金属を交互に電解析出させることで、鉄とそれ以外の金属とが長手方向に交互に並んだナノワイヤを形成することができる。鉄以外の金属としては、たとえば、金、ニッケルなどを例示することができる。

形成したナノワイヤは、非常に弱い酸またはアルカリで陽極酸化ポーラスアルミナを溶かすことで取り出すことができる。

ナノワイヤ表面に有機物を結合させる方法としては各種の方法が考慮される。たとえば、後述する実施例の場合では、有機物（蛍光物質：ｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）が添加されたエタノール中にナノワイヤを浸漬させることにより、この有機物を結合させることができる。あるいは、シランカップリング剤、チタンカップリング剤等のカップリング剤でナノワイヤを表面処理して有機物を結合させるようにしてもよい。

本願発明は、ナノワイヤを用いて神経細胞網を再生させる方法を提供する。本願発明のナノワイヤは、その表面に結合された有機物によって神経線維の伸展の制御を可能にする。さらに、強磁性体である鉄を主成分とするため、容易に磁場によりその運動を制御することが可能である。異方性の大きい（つまり、長さ／直径が約１０００である）ため、反磁場係数が長手方向を０とすると他の２方向は１／２ずつである。球の場合は各方向等しく１／３である。そのため、磁場中に同じ体積の鉄の球とナノワイヤを置いた場合、ナノワイヤには球に比べ遥かに強い磁気力が作用するため磁気ビーズよりも磁場による運動の制御が容易である。

以下に実施例を示し、さらに詳しく説明する。もちろん以下の例によって本発明が限定されることはない。

使用するナノワイヤの例
＜実施例１＞
高純度アルミニウムシートをアセトンで洗浄後、室温、４０Ｖで０．３規定のシュウ酸中で陽極酸化を行なった。これにより直径５０ｎｍの孔をアルミニウムシートに三角格子上状に開けることができた。次に、この孔が形成されたアルミニウムシート（陽極酸化ポーラスアルミナ）を電極として５０Ｈｚ、２８Ｖで電解析出を行った。電解液は硫酸鉄とホウ酸の水溶液である。これにより、図１に示すように、鉄がナノポーラス内に析出し、陽極酸化ポーラスアルミナを鋳型としてナノワイヤが作製された。

次に、ポーラスアルミナを溶かしナノワイヤを取り出した。ナノワイヤは直径３０ｎｍ、長さ約１０μｍであった。これをエタノールに懸濁させた後、エタノールに溶かした蛍光物質（Ｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｒｉｎ）を添加して攪拌後約一日放置した。洗浄後、乾燥させてから蛍光顕微鏡で確認したところ、ナノワイヤが蛍光を発していることが確認できた。図２は蛍光顕微鏡によるナノワイヤの観察写真である。ナノワイヤが青い蛍光を発していることがわかる。図３は、ナノワイヤの表面に蛍光物質が結合した状態を示す概念図である。
＜実施例４＞
実施例２で作製した上半分が露出しているナノワイヤの表面処理のため、等圧滴下漏斗に脱水トルエン５０ｍｌをとり５ｍｌのアミノ基を持つシランカップリング剤を添加した。次いで、三口フラスコに乾燥させたナノワイヤ５ｍｇ及び５ｍｌのトリエチルアミンを添加して窒素雰囲気下で４８時間攪拌した。その後、遠心分離や磁場による分離によってデカンデーション後、トルエン、テトラヒドロフラン、メタノールで洗浄した。洗浄後、減圧乾燥し、アミノ基を表面に付けたナノワイヤを得た。図５はナノワイヤの上半分にアミノ基が結合された状態を示している。

このアミノ基に蛍光物質、一本鎖ＤＮＡ、モノクロナール抗体、ケモカイン、デキストラン、ポリ乳酸、ポリスチレンなどの有機物を付けることは通常の有機化学反応により問題なくできることが確認された。この概念図を図６に示す。

また、残りの陽極酸化ポーラスアルミナを溶かし、ナノワイヤの下半分に別の有機物を結合させることができることを確認した。この概念図を図７に示す。
＜実施例５＞
官能基としてエポキシ基、ビニル基またはカルボキシル基を持つカップリング剤を用いた場合でも、実施例４と同様の操作により、前記官能基をナノワイヤの表面に付けることが可能であることが確認された。

（体内に注入したナノワイヤを移動させる例）
ナノワイヤの磁場による整列を見るために、死んだラットの脳内にナノワイヤを注射器で注入した。その後、脳の外側に直径１ｃｍ、０．２Ｔの永久磁石を置き約１時間放置した。脳の断面を切り顕微鏡で観察したところ、図９に示すようにナノワイヤは注入地点から磁石の方へ数ミリ移動し、注入点から線状に並んでいるのが観察された。
同じくラットの脳内にナノワイヤを注入後Ｘ線ＣＴで観察したところ、図１０に示すように明確にナノワイヤの凝集状態が見えた。これによりＸ線ＣＴで観測可能なことは分かった。また、磁場計測を行ったところ、明らかにナノワイヤがあるときと無いときで変化があり、磁場によってナノワイヤの存在が観測されることが分かった。

図１１、図１２は、ナノワイヤに沿って神経線維が伸展する状態を示した模式図であり、神経線維は、ナノワイヤに保持されている薬剤の作用により、このナノワイヤ近くにおいて伸展することとなる。

図１３〜図１７は、ナノワイヤを体内で位置制御する為に装置の例を示したものである。
頭部保持台（２）は、アーム（５）の移動を許す空間を維持する為に土台（１）を介してベッドなどに固定できるようにしてある。
前記ア−ム（５）と頭部保持台（２）とは、中心軸（３）にて相対的に回転自在に組み付けられている。
前記中心軸（３）にネジ付けられた締め付けナット（４）の締緩により、前記アーム（５）の中心軸周り（図中上下方向）に回転および位置固定出来るようにしてある。
前記アーム（５）には、磁石固定台（６）をアームの長さ方向（図中左右方向）に移動できるように、溝（５１）が形成してある。 この溝（５１）に磁石固定台（６）の一部を保持してある。
磁石固定台（６）は、磁石を固定する台（６１）の上面に４個のローラ（６２）を回転自在に保持して、溝（５１）内にいれ、溝（５１）内を移動可能にしてアーム（５）に取り付けてある。
（６３）は前記台（６１）の一側部に上下方向に回転自在にして取り付けたブレーキレバーで、バネ（図外）によりブレーキ（６５）が常にアーム（５）に当たって、その移動を阻止するようにしてある。
ブレーキ（６５）とブレーキレバー（６３）とは、ｌの字状のアングルで構成し、その一端部をブレーキ（６５）とし、他辺をブレーキレバー（６３）として、小中心軸により、台（６１）に取り付けてある。
（６４）は、保持レバーであって、溝（５１）内を移動させるに当たり手指を掛けて力を加えやすいように、台（６１）に固定してある。
このようにして、頭部保持台（２）上に置いた頭部に対し、半球状の所望位置に磁石を配置することができるようにしてある。
このようにして、三次元的に任意の位置で、脳の外側から内部に向かって磁力を与えることが出来るようにしてある。
なお、磁石固定台（６）は磁石のみならず、体内のナノワイヤに付けた蛍光体を感知するセンサーなどを取り付け、ナノワイヤの位置を感知しながら、磁石の作動を制御し、ナノワイヤを適切な位置に移動させるようにもできる。

発明の利用分野

本発明は、神経再生技術上、最も困難とされた、神経繊維の伸展を制御できる可能性を与える点で、今後の神経医療に大きな可能性を与えることができるものである。

ナノワイヤがナノポーラス内に形成された陽極酸化ポーラスアルミナの断面図である。 ナノワイヤがナノポーラス内に形成された陽極酸化ポーラスアルミナの断面図である。 ナノワイヤの表面に蛍光物質が結合した状態を示す概念図である。 陽極酸化ポーラスアルミナの一部を溶かしてナノワイヤの上半分程度を露出させた状態を示す陽極酸化ポーラスアルミナの断面図である。 ナノワイヤの上半分にアミノ基が結合された状態を示す陽極酸化ポーラスアルミナの断面図である。 アミノ基に有機物が結合された状態を示す陽極酸化ポーラスアルミナの断面図である。 ナノワイヤの表面に複数種の抗体と薬剤及び蛍光物質が結合した状態を示す概念図である。 ナノワイヤの拡大写真 ラットの脳内で並んだナノワイヤの写真 ラットの脳内で並んだナノワイヤのＸ線ＣＴの画像 ナノワイヤ近くに注入した神経細胞の伸展を示す模式図 ナノワイヤに沿って伸展した神経線維を示す模式図 本方法を実施する為の装置を示す側面図 図１３で示す装置のアームを示す底面図 図１３で示す装置のアームに保持された磁石固定台を示す拡大右側面図 図１３で示す装置の磁石固定台を示す拡大正面図 図１３で示す装置の磁石固定台を示す拡大底面図

符号の説明

（１）土台
（２）頭部保持台
（３）中心軸
（４）締め付けナット
（５）アーム
（５１）溝
（６）磁石固定台
（６１）磁石を固定する台
（６２）ローラ
（６３）ブレーキレバー
（６５）ブレーキ
（６４）保持レバー

Claims (3)

1. 生体内で神経細胞から伸びる神経線維の伸展用薬剤の位置を制御する方法であって、神経反発因子の機能を阻害する抗体又は薬剤もしくは神経線維の伸展を促す薬剤を表面に結合させた磁性体からなるナンワイヤを体内の神経細胞近傍に注入する第一工程と、体外から前記注入したナノワイヤに磁力を与えて誘導し所定位置で鎖状にして配置する第二工程からなることを特徴とする神経線維の伸展用薬剤の位置を制御する方法。
2. 請求項１に記載の神経線維の伸展を制御する方法において、前記ナノワイヤは鉄を主成分とする直径３００ｎｍ以下、長さ３００μｍ以下であることを特徴とする神経線維の進展用薬剤の位置を制御する方法。
3. 請求項１又は２に記載の神経線維の進展を制御する方法において、前記ナノワイヤには、その位置を検出するマーカー用の蛍光物質が結合してあることを特徴とする神経線維の伸展用薬剤の位置を制御する方法。