JP2007532473A

JP2007532473A - キナーゼ活性に対する蛍光アッセイ

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Publication number: JP2007532473A
Application number: JP2006534248A
Authority: JP
Inventors: バーバラインペリアリ，; メリッサディー．ショルツ，
Original assignee: マサチューセッツ・インスティテュート・オブ・テクノロジー
Priority date: 2003-10-08
Filing date: 2004-10-05
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2024-10-05
Also published as: US6906194B2; US20050080242A1; JP4764342B2; US20050080243A1; US7262282B2

Abstract

本発明は、キナーゼ活性を決定するためのセンサーおよび方法を提供する。本発明は、キナーゼ認識モチーフを含有するペプチド内でキナーゼ活性を検出するためのセンサーを提供する。このセンサーは、金属結合アミノ酸、キナーゼ認識モチーフ内のリン酸化部位、βターン配列、および培体中に存在するＭｇ^２＋を備える。本発明の金属結合アミノ酸は、Ｍｇ^２＋への結合に対してキレート化により増強された蛍光（ＣＨＥＦ）を示す。本発明に従うアミノ酸残基の蛍光は、Ｍｇ^２＋に結合した場合に、少なくとも約１００％まで、好ましくは少なくとも約２００％まで、より好ましくは少なくとも約３００％まで増加する。

Description

（関連出願）
本特許文書は、特許出願番号１０／６８１，４２７（２００４年１０月８日出願）の一部継続であり、これは、本明細書中に参考として援用される。

（政府により資金提供された研究または開発）
本出願の内容は、国立衛生研究所からの知見を部分的に用いて開発された（助成金申請番号ＧＭ６４３４６）。政府は、本技術において一部の権利を有し得る。

（背景）
本発明は、蛍光読出しを用いて持続的にプロテインキナーゼ活性をモニタリングするためのセンサーを提供する。このセンサーは、プロテインキナーゼペプチド基質の最小限の摂動を必要とする。蛍光は、酵素活性に対応する反応の間、時間に対して応答する。本発明のセンサーは、インヒビターまたは基質の高スループットスクリーニング、細胞抽出物または酵素精製物における活性の検出、細胞中のキナーゼ活性の空間的局在化または時間的局在化、および複雑なシグナル伝達経路の解明において使用され得る。

プロテインキナーゼは、細胞内の調節の全ての局面に関連する。プロテインキナーゼは、ペプチドまたはタンパク質の配列においてアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）からセリン残基、トレオニン残基、またはチロシン残基へのリン酸基の転移を触媒する。各キナーゼは、リン酸化される残基の周りのアミノ酸に対して特異的である。キナーゼ活性をアッセイするための従来の方法は、不連続的であり、３２Ｐ標識されたＡＴＰを必要とし、特別な取り扱いを必要とする。多くの企業が、特殊化された蛍光キナーゼアッセイ系を市販しており、これらのアッセイ系の全ては不連続的であって、反応混合物をサンプリングする工程と、続いてその反応生成物を蛍光部分（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐａｎｖｅｒａ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ、Ｕｐｓｔａｔｅ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で標識するためのさらなる取り扱いの工程とを必要とする。リアルタイムで行われ得る連続的な蛍光アッセイは、非常に有用なものである。現在のところ、このようなアッセイが可能なセンサーの例は、ほとんど存在しない。

アプローチとしては、以下が挙げられる：リン酸化部位近くの環境感受性フルオロフォア（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）、リン酸化に対してコンフォメーション変化を受ける配列に隣接するＦＲＥＴ対（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）、またはＰＥＴクエンチの中断を引き起こすリン酸と内部キレーターとの間のＣａ^２＋キレート化（非特許文献１３）。これらのセンサーの大部分は、Ｌａｗｒｅｎｃｅおよび共同研究者らによって報告されたプローブにおいて１．５〜２．５倍増加する注目すべき例外（非特許文献１３；非特許文献１４）を除いて、非常に小さな蛍光増加か、または場合によっては蛍光減少を有する。しかし、リン酸化残基に隣接したフルオロフォアまたは非常に大きなフルオロフォアを有するこれらの型のプローブは、特定のキナーゼとの反応によって、それらの認識を妨げ得る。
Ｗｒｉｇｈｔ，Ｄ．Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９８１，７８，６０４８−６０５０Ｍｃｌｌｒｏｙ，Ｂ．Ｋ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９１，１９５，１４８−１５２Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｈ．ら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．１９９７，４１４，５５−６０Ｐｏｓｔ，Ｐ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４，２６９，１２８８０−１２８８７Ｎａｇａｉ，Ｙ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０００，１８，３１３−３１６Ｏｈｕｃｈｉ，Ｙ．ら、Ａｎａｌｙｓｔ２０００，１２５，１９０５−１９０７Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２００１，９８，１４９９７−１５００２Ｔｉｎｇ，Ａ．Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２００１，９８，１５００３−１５００８Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００１，１１，３０９１−３０９４Ｋｕｒｏｋａｗａ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６，３１３０５−３１３１０Ｓａｔｏ，Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００２，２０，２８７−２９４Ｖｉｏｌｉｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．２００３，１６１，８９９−９０９Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ａ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，１２４，３８４０−３８４１Ｙｅｈ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，２７７，１１５２７−１１５３２

（概要）
本発明は、Ｍｇ^２＋への結合に対してキレート化により増強された蛍光（ｃｈｅｌａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）（ＣＨＥＦ）を示す式（Ｉ）の新規の金属結合アミノ酸残基を提供する。「Ｓｏｘ」と称される、一つの特に好ましいアミノ酸残基（ＩＩＩ）が開示される。

本発明はまた、本発明の金属結合アミノ酸残基（Ｉ）を含むペプチドを提供する。

本発明はまた、金属結合アミノ酸残基（Ｉ）を含むペプチジルセンサーを提供する。これらのセンサーはまた、キナーゼの存在下でリン酸化され得るヒドロキシルアミノ酸を有するキナーゼ認識配列を含む。この金属結合アミノ酸残基（Ｉ）は、どちらかの側（Ｎ末端またはＣ末端）のヒドロキシルアミノ酸に位置し、そして好ましくは、βターンコンフォメーション（「βターン配列」）を想定し得る認識配列からペプチドによって分離されている。いくつかの場合において、このβターン配列は、ヒドロキシルアミノ酸から別のアミノ酸によって分離されている。

（発明の詳細な説明）
本発明は、キナーゼ認識モチーフを含有するペプチド内でキナーゼ活性を検出するためのセンサーを提供する。

本発明に従うセンサーが、図１に説明される。このセンサーは、金属結合アミノ酸、キナーゼ認識モチーフ内のリン酸化部位、βターン配列、および培体中に存在するＭｇ^２＋を備える。

上記金属結合アミノ酸は、式（Ｉ）：

のアミノ酸であって、ここで、少なくとも１つのＲ基は、−ＳＯ_２Ｘであり、Ｘは、−ＯＲ’’または−ＮＲ’’Ｒ’’’であり；
Ｒ’は、ヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり；
Ｒ’’は、Ｃ_１〜６アルキルであり；
Ｒ’’’は、水素またはアルキルであり；そして
ｎは、１、２、または３である。

本発明の金属結合アミノ酸は、Ｍｇ^２＋への結合に対してキレート化により増強された蛍光（ＣＨＥＦ）を示す。本発明に従うアミノ酸残基の蛍光は、Ｍｇ^２＋に結合した場合に、少なくとも約１００％まで、好ましくは少なくとも約２００％まで、より好ましくは少なくとも約３００％まで増加する。

好ましい実施形態において、上記金属結合アミノ酸は、式（ＩＩ）：

のアミノ酸であって、ここで、Ｘは、−ＯＲ’’または−ＮＲ’’Ｒ’’’であり、Ｒ’’は、Ｃ_１〜６アルキルであり；そしてＲ’’’は、水素またはＣ_１〜６アルキルである。好ましくは、Ｘは、環系の５位に位置する。好ましくは、Ｘは、ＮＲ’’Ｒ’’’である。好ましくは、Ｒ’’とＲ’’’との両方は、両方ともＣ_１〜６アルキルである。

別の好ましい実施形態において、上記金属結合アミノ酸は、式（ＩＩＩ）：

のアミノ酸である。残基（ＩＩＩ）は、本明細書中でＳｏｘと称される。種々のキナーゼ認識モチーフにおいてＳｏｘを含有する種々のプロテインキナーゼ基質の動態学的特性および蛍光特性は、下の表Ｉに示される。

^ａリン酸化された残基は、星印（＊）で印をつけられている。
^ｂＫ_ｍおよびＶ_ｍａｘの値は、基質および生成物の蛍光について適切に補正された、反応アッセイの初期傾きから得られた。報告された値は、別個のＨａｎｅｓプロットからの４つの値の平均である。
^ｃ励起波長：３６０ｎｍ、発光波長：４８５ｎｍ。
^ｄアッセイ条件：２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、０．３ｍＭＣａＣｌ_２、１ｍＭＡＴＰ、１ｍＭＤＴＴ、０．５μｇ／ｍｌホスファチジルセリン、０．１μｇ／ｍｌジアシルグリセロール、０．７ｎＭＰＫＣ_ａ３０℃。
^ｅ蛍光強度に対する生成物および基質の濃度の単位（単位／μＭ）から計算した。
^ｆアッセイ条件：２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４，１０ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭＡＴＰ、１ｍＭＤＴＴ、４０単位ＰＫＡ，３０℃。
^ｇ単一ペプチドの溶液（１０μＭ）から計算した。

キャッピング基は、式（ＩＶ）：

の基であり、ここで少なくとも１つのＲ基は、−ＳＯ_２Ｘであり、Ｘは、−ＯＲ’’または−ＮＲ’’Ｒ’’’であり；Ｒ’は、ヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり；Ｒ’’は、Ｃ_１〜６アルキルであり；Ｒ’’’は、水素またはＣ_１〜６アルキルであり；そしてｎは、０、１、２、または３である。上記キャッピング基（ＩＶ）は、ペプチドのＮ末端に結合し、従ってアミノ保護基として役立つ。

１つの実施形態において、ペプチドのＮ末端は、式（ＩＶ）のキャッピング基により保護されている。

本発明に従うリン酸化部位としては、キナーゼ認識モチーフ内のヒドロキシル含有アミノ酸が挙げられる。例としては、天然に存在するヒドロキシル含有アミノ酸残基（例えば、セリン、トレオニンおよびチロシン）および天然には存在しないヒドロキシル含有アミノ酸残基が挙げられる。

当該分野で公知のいずれのキナーゼ認識モチーフも、本発明に従って使用され得る。酸性残基を有する認識配列は、酸性条件下でのＭｇ^２＋増加に対するリン酸化されていないペプチドの親和性と同様に、比較配列よりもリン酸化に対してより小さい（ｌｅｓｓｏｒ）規模の蛍光増加を示し得る。本発明の金属結合アミノ酸を使用したリン酸化についてモニタリングされ得る認識モチーフの例は、表ＩＩに示される：

リン酸化され得る他のペプチド（および対応するキナーゼ）の一覧は、ＰｉｎｎａおよびＤｏｎｅｌｌａ−Ｄｅａｎａ、ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ１２２２：４１５−４３１（１９９４）の表Ｉに見出され、この全体は、本明細書中に参考として援用される。別のリストは、ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂ／ｔｅｃｈ／ｔｅｃｈ＿ｒｅｓｏｕｒｃｅ／ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｔｏｏｌｓ／ｓｕｂｓｔｒａｙｅ＿ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．ｈｔｍｌにおいてオンラインで見出され得る（２００３年９月２６日に存在したこのウェブサイトのコピーは、本出願と同時に提出された情報開示記載において提供され；そしてその全体が参考として援用される）。

上記ヒドロキシルアミノ酸は、本発明の金属結合アミノ酸残基（Ｉ）からジペプチジルβターン配列によって分離されている。このβターン配列に加えて、別のアミノ酸もまた、金属結合アミノ酸残基（Ｉ）からヒドロキシルアミノ酸を分離させ得る。チロシンキナーゼ活性のプローブについて、このさらなるアミノ酸は、代表的にはより大きなチロシン側鎖に適応するために、βターン配列に隣接したセンサー中に含まれ得る。

当該分野で公知のいずれのβターン配列もまた、本発明に従って使用され得る。Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との両方が、βターン配列の部分であり得る。好ましくは、上記金属結合アミノ酸がリン酸化部位に対してＣ末端に位置している場合、上記βターン配列はＰｒｏ−Ｇｌｙである。好ましくは、上記金属結合アミノ酸がリン酸化部位に対してＮ末端に位置している場合、上記βターン配列はＧｌｙ−Ｐｒｏである。Ｇｌｙは、配列中にさらなる結合決定基を含むように特定の他のアミノ酸で置換され得る。

１つの実施形態において、上記センサーは、配列（ＳＩＤ番号８）：

を含み、ここでＸ^１は、式（Ｉ）のアミノ酸であり；Ｘ^２およびＸ^３は、各々独立してβターン配列を一緒に形成するアミノ酸残基であり；そして、Ｘ^４は、結合またはアミノ酸残基である。この実施形態において、Ｘ^１は好ましくはＳｏｘであり、Ｘ^２はＰｒｏであり、そしてＸ^３はＧｌｙである。

別の実施形態において、上記センサーは、配列（ＳＩＤ番号９）：

を含み、ここでＸ^１は、式（Ｉ）のアミノ酸であり；Ｘ^２およびＸ^３は、各々独立してβターン配列を一緒に形成するアミノ酸残基であり；Ｘ^４は、結合またはアミノ酸残基であり；Ｘ^５は、ヒドロキシル含有アミノ酸である。この実施形態において、Ｘ^５は、好ましくはキナーゼ認識モチーフ中のヒドロキシル残基であり、そして上記キナーゼ認識モチーフの残部はＸ^５に結合されている。

別の実施形態において、上記センサーは、配列（ＳＩＤ番号１０）：

を含み、ここでＸ^１は、式（Ｉ）のアミノ酸であり；そしてＸ^２およびＸ^３は、各々独立してβターン配列を一緒に形成するアミノ酸である。この実施形態において、Ｘ^１は、好ましくはＳｏｘであり、Ｘ^２はＬｅｕであり、そしてＸ^３はＰｒｏである。

別の実施形態において、上記センサーは、配列（ＳＩＤ番号１１）：

を含み、ここでＸ^１は、式（Ｉ）のアミノ酸であり；Ｘ^２およびＸ^３は、各々独立してβターン配列を一緒に形成するアミノ酸であり；Ｘ^４は、結合またはアミノ酸残基であり；そしてＸ^５は、ヒドロキシル含有アミノ酸である。この実施形態において、Ｘ^５は、好ましくはキナーゼ認識モチーフ中のヒドロキシル残基であり、そして上記キナーゼ認識モチーフの残部はＸ^５に結合されている。

本発明のセンサーは、キナーゼ活性を検出するための方法において使用され得る。本発明の方法は、以下の工程を包含する：リン酸化部位を含むキナーゼ認識モチーフ、およびβターン配列の近くの式（Ｉ）の金属結合アミノ酸を備えるセンサーを提供する工程；上記センサーをＭｇ^２＋、リン酸供給源、およびキナーゼを含むサンプルと接触させる工程；ならびにリン酸化ペプチド生成物の存在について分析する工程。

本発明の方法は、インビトロでもインビボでも使用され得る。インビトロ適用について、この反応は、代表的にはＭｇ^２＋およびリン酸供給源を含有する緩衝剤中で実施され得る。適切な緩衝剤としては、ＨＥＰＥＳおよびＴＲＩＳが挙げられる。好ましいＭｇ^２＋供給源は、ＭｇＣｌ_２である。好ましいリン酸供給源は、ＡＴＰである。

セリン／トレオニンおよびチロシンのキナーゼが、本発明において使用され得る。例示的なキナーゼとしては、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼＣ、Ｃａ／カルモジュリン依存性キナーゼ、ＡＭＰ活性化キナーゼ、ｓ６キナーゼ、ｅＩＦ−２キナーゼ、ｐ３４^ｃｄｃ２プロテインキナーゼ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、カゼインキナーゼ−２、カゼインキナーゼ−１、グリコゲンシンターゼキナーゼ−３、Ｔｙｒ特異的プロテインキナーゼが挙げられる。

インビトロ適用について、キナーゼの濃度は、約０．５ｎＭ〜約１μＭの範囲であり得、代表的には約５００ｎＭを超えず、より好ましくは約２５０ｎＭを超えない。センサーの濃度は変動し得るが、通常は約０．１μＭ〜１０ｍＭの間の範囲である。アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）は、約１０〜１００ｍＭのストック溶液中で好ましいリン酸の供給源である。大部分のキナーゼは、約１０〜１５０μＭの範囲において、ＡＴＰについてのＫ_ｍ値を有するので、飽和濃度のＡＴＰを使用して基質についてのＫ_ｍおよびＶ_ｍａｘの値を達する。

インビボ適用について、上記センサーが細胞に内部移行する場合、十分なキナーゼ、Ｍｇ^２＋およびリン酸供給源は、細胞質ゾル中に存在する。インビボでの感知について、細胞性の内部移行配列が、このセンサー設計中に含まれ得る。適切な細胞性の内部移行配列としては、ぺネトラチン、ＨＩＶ−Ｔａｔドメインおよびポリアルギニン配列（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ，Ｍ．ら、ＴｒｅｎｄｓＰｈａｒａｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０００，２１，９９−１０３；Ｗａｄｉａ，Ｊ．Ｓ．ら、ＣｕｒｒＯｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００２，１３，５２−５６）が挙げられる。

上記キナーゼが補因子に依存する適用について、補因子の供給源はまた、サンプル中に含まれ得る。例えば、ＰＫＣに関しては、Ｃａ^２＋、リン脂質およびジアシルグリセロールの供給源が必要とされる。

本発明のセンサーは、上記金属結合アミノ酸残基（Ｉ）が光退色をしない場合に、キナーゼ反応を連続的に測定するために使用され得る。

従って、前述の詳細な説明は、限定よりも説明としてみなされることが意図され、本発明の精神および範囲を規定することが意図されるものが、全ての等価物を含む、以下の特許請求の範囲であることが理解されることが意図される。

（ペプチド合成）
Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂（０．２２ｍｍｏｌ当量）上の標準的なＦｍｏｃアミノ酸保護化学（Ｆｍｏｃａｍｉｎｏａｃｉｄｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を用いて、ペプチドを合成した。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸の上記樹脂へのカップリングを１−ベンゾトリアゾールイルオキシトリス（ピロリドン）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（１−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｙｏｘｙｔｒｉｓ（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ）ｐｈｏｐｈｏｎｉｕｍｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＰｙＢＯＰ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）またはＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウラニウムヘキサフルオロホスフェート（Ｏ−（７−ａｚａｂｅｎｚｏｔｒａｚｏｌ−１−ｙｌ）−１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒａｎｉｕｍｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＨＡＴＵ）およびＤＩＥＡを使用して行い、活性型エステルを生じた。この樹脂をジクロロメタン中で膨潤させ（５分）、次いで合成の前にＤＭＦで膨潤させた（５分）。Ｓｏｘ、ホスホセリン、ホスホスレオニン、およびホスホチロシン以外の全てのアミノ酸を、以下の代表的な手順によって添加した：Ｆｍｏｃ基の除去（ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液、３×５分）、洗浄（ＤＭＦ、５×１分）、カップリング（アミノ酸／ＰｙＢＯＰ／ＤＩＥＡ、６：６：６、ＤＭＦ中０．０５Ｍ、４５分）、リンス（ＤＭＦ、２×１分；ＤＣＭ、２×１分）。Ｓｏｘ残基をカップリングするために、各時間２当量で二重カップリングを使用した（Ｆｍｏｃ−Ｓｏｘ−ＯＨ／ＰｙＢＯＰ／ＤＩＥＡ、２：２：２、ＤＭＦ中０．１５Ｍ、２×１２０分）。リン酸アミノ酸残基をカップリングするために、ＨＡＴＵを使用した（Ｆｍｏｃ−Ｘａａ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）−ＯＨ／ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ、３：３：３、ＤＭＦ中０．０５Ｍ、３０分）。

最後の残基を添加した後、そのペプチドをアセチルキャップ（ａｃｅｔｙｌ−ｃａｐｐｅｄ）し（ピリジン／無水酢酸、２０：２０、ＤＭＦ中０．１５Ｍ、３０分）、最後の非ブロック（ｄｅｂlｏｃｋ）サイクル（ＤＭＦ中２０％ピペリジン、３×５分）を行って、形成されるいずれのＳｏｘアリールエステルも切断した。トリフルオロ酢酸／トリイソプロピルシラン／水（リン酸化されていないペプチドについて、９５：２．５：２．５、４０ｍｌ／ｍｇ樹脂、およびリン酸化ペプチドについて、１４０ｍｌ／ｍｇ樹脂）で２．５時間切断する前に、この樹脂を高真空下で一晩乾燥させた。

この結果生じた溶液を窒素の流れのもとで濃縮し、ペプチドを冷１：１ジエチルエーテル：ヘキサン溶液の添加によって沈殿させた。このペレットを冷１：１エーテル：ヘキサン（１５ｍｇ樹脂について、３×１．５ｍｌ）で粉砕し、水中に再溶解し、濾過して一晩凍結乾燥した。ペプチドを分取用逆相ＨＰＬＣ（Ｃ_１８）によって精製し、分析用ＨＰＬＣ（Ｃ_１８）によって単一のピークを含む、正しい質量（ＥＳ−ＭＳ）の画分のみを分析実験のために使用した。

^ａＣ_１８；溶媒Ａ＝水、０．１％ｖ／ｖＴＦＡ；溶媒Ｂ＝ＭｅＣＮ、０．１％ｖ／ｖＴＦＡ、５分、７％Ｂのあと３０分にわたって１０〜５０％Ｂの直線勾配を続けた。
^ｂＣ_１８；溶媒Ａ＝水、０．１％ｖ／ｖＴＦＡ；溶媒Ｂ＝ＭｅＣＮ、０．１％ｖ／ｖＴＦＡ、５分、１０％Ｂのあと３０分にわたって１５〜５０％Ｂの直線勾配を続けた。
^ｃＣ_１８；溶媒Ａ＝水、０．１％ｖ／ｖＴＦＡ；溶媒Ｂ＝ＭｅＣＮ、０．１％ｖ／ｖＴＦＡ、５分、１０％Ｂのあと３０分にわたって２０〜７０％Ｂの直線勾配を続けた。
^ｄＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭａｒｉｎｅｒ質量分析計上でＥＳ−ＭＳデータを収集した。

（ストック溶液）
Ｚｎ^２＋に対するリン酸化ペプチドの親和性に起因して、調製の後に金属イオン不純物を除去する必要性を回避するために、最も高い純度で最も低い金属含有量を有する試薬を使用した。

他に示さない限り、以下の溶液をアッセイの日の前に調製して、室温で保存した：
１）ペプチドのストック溶液を超純水（１８ＭΩ）中で調製し、その濃度をＵＶ／ＶＩＳによって決定した（フルオロフォア単位の決定された吸光係数に基づいて、１ｍＭＮａ_２ＥＤＴＡを含む０．１ＭＮａＯＨ中、３５５ｎｍにおいて５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルスルホンアミド）−８−ヒドロキシ−２−メチルキノリン、ε＝８２４７Ｍ−１ｃｍ−１）。各々異なる体積のストック溶液を使用して調製された４つの別個の溶液からの値の平均をＢｅｃｋｍａｎＤＵ７５００Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒで読み取った。ペプチドのストック溶液を４℃で保存した。

２）約３Ｍの塩化マグネシウムのストック溶液および約０．３Ｍの塩化カルシウムのストック溶液を、ＡｌｆａＡｅｓａｒ’ｓＰｕｒａｔｒｏｎｉｃ等級塩から調製した。大部分の市販の塩は、重大な不純物としてＺｎ^２＋を含み（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０００，９６，３５−４５）、Ｚｎ^２＋についてのリン酸化ペプチドの高い親和性の原因となるので使用するべきではない。Ｍｇ^２＋およびＣａ^２＋の濃度を、ＥｒｉｏｃｈｒｏｍｅＢｌａｃｋＴ（Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下でのＥＤＴＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ）の標準化溶液を用いた滴定によって決定した（Ｂａｓｓｅｔ，Ｊ．ら、Ｖｏｇｅｌ’ｓＴｅｘｔｂｏｏｋｏｆＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＩｎｏｒｇａｎｉｃＡｎａｌｙｓｉｓ；ＷｉｌｌｉａｍＣｌｏｗｅｒｓ：Ｌｏｎｄｏｎ、１９７８）。

３）２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４を、水酸化ナトリウム（９９．９９８＋％，Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液（１Ｍ）でｐＨ７．４に調整したＨＥＰＥＳ（ＳｉｇｍａＵｌｔｒａ）から調製した。

４）１２．５ｍＭＭｇＣｌ_２および０．３８ｍＭＣａＣｌ_２を含む２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４を、小体積のＭｇＣｌ_２およびＣａＣｌ_２のストック溶液を溶液３に添加することによって調製した。

５）１２．５ｍＭＭｇＣｌ_２を含む２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４を、溶液４に対する類似の方法で調製した。

６）５ｍＭジチオスレイトールを含む２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４を、第１の脱気溶液３によって調製し、次いでジチオスレイトール（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｇｒａｄｅ，Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）に添加した。この溶液を−８０℃で保存した。

７）１００ｍＭＡＴＰを、超純水（１８ＭΩ）中に溶解したアデノシン５’−三リン酸（二ナトリウム塩、ＬｏｗＭｅｔａｌｓＧｒａｄｅ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で調製し、その溶液を−８０℃で保存した。

８）２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４中の１０μｇ／ｍｌホスファチジルセリンおよび２μｇ／ｍｌジアシルグリセロールを、１０ｍｇ／ｍｌブタ脳ホスファチジルセリン（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．）および２ｍｇ／ｍｌ１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．）のクロロホルム溶液の適切な体積を組み合わせることによって調製した。このクロロホルムをエバポレートして溶液３を添加した。この溶液を、３分間隔のボルテックスと、１分間の温水浴でのインキュベートとの間を交互にし、総時間を１２分間とした。この溶液を−２０℃で保存した。

（アッセイ方法）
ＰＫＣ：アッセイの日に、１μｌアリコートのプロテインキナーゼＣ_α（ヒト、組換え、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、２０μｌの溶液４で希釈して氷上に保存した。代表的な反応は、溶液４（８４μｌ）、溶液６（１９μｌ）、溶液８（５μｌ）、溶液７（１μｌ）、および酵素のワーキングストック（１μｌ）を含んだ。適切な体積の基質のストック溶液を添加して、反応を始めた。

ＰＫＡ：アッセイの日に、１μｌアリコートのｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（触媒サブユニット、マウス、組換え、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、１０ｍＭＭｇＣｌ_２および０．３ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含有する８０μｌの５０ｍＭＴＲＩＳｐＨ７．５で希釈して氷上で維持した。代表的な反応は、溶液５（９０μｌ）、溶液６（２０μｌ）、溶液７（１μｌ）、および適切な体積の基質のストック溶液を含んだ。酵素のワーキングストック（１μｌ）を添加して反応を始めた。

（蛍光実験）
ＪｏｂｉｎＹｖｏｎ．からのＦｌｕｏｒｏｍａｘ３で蛍光実験を行い、５ｎｍの発光および励起のスリット幅を使用した。全ての実験について、３６０ｎｍの励起波長を使用した。酵素アッセイを４８５ｎｍにおける発光をモニタリングすることによって行った。

（リン酸化ペプチドおよびリン酸化されていないペプチドのスペクトル比較）
図２は、酵素を含まない適切なアッセイ混合物中のリン酸化ペプチド（実線）およびリン酸化されていないペプチド（破線）の各々１０μＭの蛍光スペクトルを示す：（ａ）Ａｃ−Ｓｏｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−（ｐ）Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ_２（ＳＩＤ番号１）、（ｂ）Ａｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−（ｐ）Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｏｘ−ＮＨ_２（ＳＩＤ番号２）、（ｃ）Ａｃ−Ｓｏｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−（ｐ）Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ_２（ＳＩＤ番号３）、（ｄ）Ａｃ−Ｓｏｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−（ｐ）Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＮＨ_２（ＳＩＤ番号４）。全てのペプチドは、４７４ｎｍにおいて最大発光波長を有するＡｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−ｐＳｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｏｘ−ＮＨ_２（ＳＩＤ番号２）を除いて、４８５ｎｍにおいて最大蛍光発光を有する。このことは、１：１複合体以外の複合体形成を示していると思われるが、最大発光波長は、１０ｍＭＭｇＣｌ_２を含むペプチド濃度の広い範囲にわたって一定である。

（蛍光データからの速度定数の決定）
この反応についてのＫ_ｍおよびＶ_ｍａｘを解くために、蛍光強度の増加から生成物形成の初期速度を決定することが必要である。このセンサーを用いて、出発物質が消費されることに起因した蛍光強度の減少に対する補正が、初期傾きから生成物形成の速度を決定するために必要とされる。任意の所定の点での蛍光強度は、以下の式から決定され得る：

ここで、Ｉ（ｔ）は、蛍光強度であり、Ｓ（ｔ）は、基質の量（μＭ）であり、Ｐ（ｔ）は、生成物の量（μＭ）であり、ｆ_ｓは、基質１μＭあたりの蛍光強度であり、そして、ｆ_ｐは、生成物１μＭあたりの蛍光強度である。任意の所定の点における基質および生成物の量は、以下の式によって関連付けられる：

ここで、Ｓ_０は、基質の初期量である。（２）を（１）に代入し、再構成すると以下式を得る：

。

この反応の初期速度は、時間が経つ間の生成物の量の変化であり、時間に関して（３）の微分をとると以下の式を得る：

。

この反応の初期傾き（ｄＩ（ｔ）／ｄｔ）を、基質代謝の最初の５％内で測定した。定数ｆ_ｐおよびｆ_ｓを、ＰおよびＳそれぞれの濃度に対する蛍光強度の直線の傾きから計算した。Ｈａｎｅｓプロット（［Ｓ］／Ｖ対Ｖ）の直線回帰を使用して、Ｋ_ｍおよびＶ_ｍａｘを見出した。

（キナーゼ反応についてのＨＰＬＣおよびＭＳのデータ）
全ての反応を蛍光光度計において行い、４０μｌの０．１ＭＮａ_２ＥＤＴＡストック溶液でクエンチし、次いで氷上で保存した。図３Ａは、ＰＫＡによるＡｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｏｘ−ＮＨ_２（ＳＩＤ番号２）（７．８μＭ）のリン酸化（１８分後、３０℃）を示す。図３Ｂは、ＰＫＡによるＡｃ−Ｓｏｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ_２（ＳＩＤ番号１）（３０μＭ）のリン酸化（１２分後、３０℃）を示す。このペプチドに対するＨＰＬＣピークの同一性を下の表３に示す。

^ａＣ１８；溶媒Ａ＝水、０．１％ｖ／ｖＴＦＡ；溶媒Ｂ＝ＭｅＣＮ、０．１％ｖ／ｖＴＦＡ、１０分、０％Ｂ、２分にわたる０〜１０％Ｂの直線勾配の後、３０分にわたる１０〜５０％Ｂび直線勾配を続けた。
^ｂＣ_１８；溶媒Ａ＝水、０．１％ｖ／ｖＴＦＡ；溶媒Ｂ＝ＭｅＣＮ、０．１％ｖ／ｖＴＦＡ、１０分、１５％Ｂに、３０分にわたる１５〜５０％Ｂの直線勾配を続けた。

（形成された生成物の量に関する蛍光およびＨＰＬＣのデータの比較）

（Ｈａｎｅｓプロット）
図４は、ＰＫＣとのＡｃ−Ｓｏｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ_２（ＳＩＤ番号１）の反応のＨａｎｅｓプロットである。ｆ_{Ｓ，ａｖｇ}＝１．１×１０５±０．３単位／μＭ、およびｆ_{Ｐ，ａｖｇ}＝６．３×１０５±１．０単位／μＭを使用して、Ｋ_ｍおよびＶ_ｍａｘの値を決定した。

図５は、ＰＫＡとのＡｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｏｘ−ＮＨ_２（ＳＩＤ番号２）の反応のＨａｎｅｓプロットである。ｆ_{Ｓ，ａｖｇ}＝２．５×１０^５±０．１単位／μＭ、およびｆ_{Ｐ，ａｖｇ}＝９．９×１０^５±０．２単位／μＭを使用して、Ｋ_ｍおよびＶ_ｍａｘの値を決定した。

図６は、ＰＫＣとのＡｃ−Ｓｏｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ_２（ＳＩＤ番号３）の反応のＨａｎｅｓプロットである。各実験の日に決定したＦ_Ｓ値およびＦ_Ｐ値を使用して、Ｋ_ｍおよびＶ_ｍａｘの値を決定した。

図１は、本発明に従うセンサーの２つの設計を示す。図１Ａでは、金属結合アミノ酸は、リン酸化部位のＮ末端である。図１Ｂにおいて、金属結合アミノ酸は、リン酸化部位のＣ末端である。図２は、酵素を含まない適切なアッセイ混合物中のリン酸化ペプチド（実線）およびリン酸化されていないペプチド（点線）の各１０μＭの蛍光スペクトルを示すグラフである：（ａ）Ａｃ−Ｓｏｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−（ｐ）Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ_２（ＳＩＤ番号１）；（ｂ）Ａｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−（ｐ）Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｏｘ−ＮＨ_２（ＳＩＤ番号２）；（ｃ）Ａｃ−Ｓｏｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−（ｐ）Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ_２（ＳＩＤ番号３）；および（ｄ）Ａｃ−Ｓｏｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−（ｐ）Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＮＨ_２（ＳＩＤ番号４）。図３Ａは、ＰＫＡによる、１８分後、３０℃における、Ａｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｏｘ−ＮＨ_２（ＳＩＤ番号２）（７．８μＭ）の反応の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の記録である。図３Ｂは、ＰＫＡによる、１２分後、３０℃における、Ａｃ−Ｓｏｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ_２（ＳＩＤ番号１）（３０μＭ）の反応のＨＰＬＣ記録である。図４は、ＰＫＣとのＡｃ−Ｓｏｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ_２（ＳＩＤ番号１）の反応のＨａｎｅｓプロットである。図５は、ＰＫＡとのＡｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｏｘ−ＮＨ_２（ＳＩＤ番号２）の反応のＨａｎｅｓプロットである。図６は、ＰＫＣとのＡｃ−Ｓｏｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ_２（ＳＩＤ番号３）のＨａｎｅｓプロットである。

Claims

（ａ）式（Ｉ）：

のアミノ酸であって、
ここで、少なくとも１つのＲ基は、−ＳＯ_２Ｘであり、Ｘは、−ＯＲ’’または−ＮＲ’’Ｒ’’’であり；
Ｒ’は、ヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり；
Ｒ’’は、Ｃ_１〜６アルキルであり；
Ｒ’’’は、水素またはアルキルであり；そして
ｎは、１、２、または３である、アミノ酸；および
（ｂ）βターン配列
を含む、ペプチド。
請求項１に記載のペプチドであって、キナーゼ認識配列をさらに含む、ペプチド。
請求項１に記載のペプチドであって、金属結合アミノ酸が、式（ＩＩ）：

のアミノ酸であり、
ここで、Ｘは、−ＯＲ’’または−ＮＲ’’Ｒ’’’であり；
Ｒ’’は、Ｃ_１〜６アルキルであり；そして
Ｒ’’’は、水素またはＣ_１〜６アルキルである、ペプチド。
請求項１に記載のペプチドであって、前記金属結合アミノ酸が、式（ＩＩＩ）：

のアミノ酸である、ペプチド。
請求項１に記載のペプチドであって、該ペプチドは、配列（ＳＩＤ番号８）：

を含み、
ここで、Ｘ^１は、式（Ｉ）：

のアミノ酸であり、
ここで、少なくとも１つのＲ基は、−ＳＯ_２Ｘであり、Ｘは、−ＯＲ’’または−ＮＲ’’Ｒ’’’であり；
Ｒ’は、ヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり；
Ｒ’’は、Ｃ_１〜６アルキルであり；
Ｒ’’’は、水素またはアルキルであり；そして
ｎは、１、２、または３である、アミノ酸であって；そして
Ｘ^２およびＸ^３は、各々独立して、βターン配列を一緒に形成するアミノ酸残基である、ペプチド。
請求項５に記載のペプチドであって、配列−Ｓｏｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−を含む、ペプチド。
請求項１に記載のペプチドであって、該ペプチドは、配列（ＳＩＤ番号９）：

を含み、
ここで、Ｘ^１は、式（Ｉ）：

のアミノ酸であって、
ここで、少なくとも１つのＲ基は、−ＳＯ_２Ｘであり、Ｘは、−ＯＲ’’または−ＮＲ’’Ｒ’’’であり；
Ｒ’は、ヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり；
Ｒ’’は、Ｃ_１〜６アルキルであり；
Ｒ’’’は、水素またはアルキルであり；そして
ｎは、１、２、または３である、アミノ酸であって；
Ｘ^２およびＸ^３は、各々独立して、βターン配列を一緒に形成するアミノ酸残基であり；
Ｘ^４は、結合またはアミノ酸残基であり；そして
Ｘ^５は、ペプチジルキナーゼ認識モチーフであって、該認識モチーフのヒドロキシルアミノ酸は、Ｘ^４に結合している、ペプチド。
請求項１に記載のペプチドであって、該ペプチドは、配列（ＳＩＤ番号１０）：

を含み、
ここで、Ｘ^１は、式（Ｉ）：

のアミノ酸であって、
ここで、少なくとも１つのＲ基は、−ＳＯ_２Ｘであり、Ｘは、−ＯＲ’’または−ＮＲ’’Ｒ’’’であり；
Ｒ’は、ヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり；
Ｒ’’は、Ｃ_１〜６アルキルであり；
Ｒ’’’は、水素またはアルキルであり；そして
ｎは、１、２、または３である、アミノ酸であって；そして
Ｘ^２およびＸ^３は、各々独立して、βターン配列を一緒に形成するアミノ酸である、ペプチド。
請求項８に記載のペプチドであって、配列−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｏｘ−を含む、ペプチド。
請求項１に記載のペプチドであって、該ペプチドは、配列（ＳＩＤ番号１１）：

を含み、
ここで、Ｘ^１は、式（Ｉ）：

のアミノ酸であって、
ここで、少なくとも１つのＲ基は、−ＳＯ_２Ｘであり、Ｘは、−ＯＲ’’または−ＮＲ’’Ｒ’’’であり；
Ｒ’は、ヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり；
Ｒ’’は、Ｃ_１〜６アルキルであり；
Ｒ’’’は、水素またはアルキルであり；そして
ｎは、１、２、または３であるアミノ酸であって；
Ｘ^２およびＸ^３は、各々独立して、βターン配列を一緒に形成するアミノ酸であり；
Ｘ^４は、結合またはアミノ酸残基であり；そして
Ｘ^５は、ペプチジルキナーゼ認識モチーフであって、該認識モチーフのヒドロキシルアミノ酸は、Ｘ^４に結合している、ペプチド。
キナーゼ活性を検出するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）（１）リン酸化部位を含むキナーゼ認識配列
（２）βターン配列；および
（３）式（Ｉ）：

のアミノ酸であって、
ここで、少なくとも１つのＲ基は、−ＳＯ_２Ｘであり、Ｘは、−ＯＲ’’または−ＮＲ’’Ｒ’’’であり；
Ｒ’は、ヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり；
Ｒ’’は、Ｃ_１〜６アルキルであり；
Ｒ’’’は、水素またはアルキルであり；そして
ｎは、１、２、または３である、アミノ酸、
を含むペプチドを提供する工程；
（ｂ）該ペプチドをＭｇ^２＋、リン酸供給源、およびキナーゼを含有するサンプルと接触させる工程；ならびに
（ｃ）リン酸化ペプチド生成物の存在について分析する工程、
を包含する、方法。
請求項１１に記載の方法であって、前記アミノ酸が、式（ＩＩ）：

のアミノ酸であり、
ここで、Ｘは、−ＯＲ’’または−ＮＲ’’Ｒ’’’であり；
Ｒ’’は、Ｃ_１〜６アルキルであり；そして
Ｒ’’’は、水素またはＣ_１〜６アルキルである、
方法。
請求項１１に記載の方法であって、前記アミノ酸が、式（ＩＩＩ）：

のアミノ酸である、方法。
請求項１１に記載の方法であって、前記ペプチドの蛍光が、Ｍｇ^２＋に結合した場合に少なくとも１００％まで増加する、方法。
請求項１１に記載の方法であって、前記キナーゼに対する前記ペプチドのＫ_ｍが、マイクロモル範囲にある、方法。
式（ＩＶ）：

のキャッピング基であって、
ここで、少なくとも１つのＲ基は、−ＳＯ_２Ｘであり、Ｘは、−ＯＲ’’または−ＮＲ’’Ｒ’’’であり；
Ｒ’は、ヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり；
Ｒ’’は、Ｃ_１〜６アルキルであり；
Ｒ’’’は、水素またはＣ_１〜６アルキルであり；そして
ｎは、０、１、２、または３である、キャッピング基。
請求項１６に記載のキャッピング基により、Ｎ末端が保護されている、ペプチド。