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JP2007525171A - Modification of the binding affinity for FcRn or serum half-life of the antibody by mutagenesis - Google Patents

Modification of the binding affinity for FcRn or serum half-life of the antibody by mutagenesis

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JP2007525171A
JP2007525171A JP2006509927A JP2006509927A JP2007525171A JP 2007525171 A JP2007525171 A JP 2007525171A JP 2006509927 A JP2006509927 A JP 2006509927A JP 2006509927 A JP2006509927 A JP 2006509927A JP 2007525171 A JP2007525171 A JP 2007525171A
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Abstract

本発明は、アミノ酸残基250、314及び428から成るグループの中から選択された重鎖定常領域由来の少なくとも1つのアミノ酸が未修飾抗体の中に存在するものと異なるもう1つのアミノ酸で置換され、かくして未修飾抗体に比べてFcRnに対する結合親和力及び/又は血清半減期を改変している、IgGクラスの修飾された抗体を提供している。 The present invention, at least one amino acid from the selected heavy chain constant region from the group consisting of amino acid residues 250, 314 and 428 is replaced by another amino acid different from that present in the unmodified antibody thus it has to modify binding affinity and / or serum half-life for FcRn compared to the unmodified antibody, and provides for a modified antibody of class IgG.

Description

本発明は、免疫学及びタンパク質工学処理の分野に関する。 The present invention relates to the field of immunology and protein engineering. 特に、本発明は、そのFc領域内での1又は複数のアミノ酸修飾の結果として改変されたFcRnに対する結合親和力又は改変された血清半減期を有するIgGクラスの修飾された抗体に関する。 In particular, the present invention relates to a modified antibody of class IgG with binding affinity or altered serum half-lives for FcRn, which is modified as a result of one or more amino acid modifications in the Fc region thereof.

抗体は、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質である。 Antibodies are proteins that exhibit binding specificity to a specific antigen. 未変性(すなわち天然に発生するか又は野生型)の抗体は、通常、2つの同一の軽(L)鎖と2つの同一の重(H)鎖から成る約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。 Antibodies of native (ie, whether or wild-type naturally occurring) are usually of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) about 150,000 daltons consisting of a chain of heterotetrameric glycoproteins, it is. 図1に示されているように、各軽鎖は、1つの共有ジスルフィド結合によって重鎖にリンクされ、一方ジスルフィドリンケージの数は、異なる免疫グロブリンイソタイプの重鎖の間で変動する。 As shown in FIG. 1, each light chain is linked to a heavy chain by one covalent disulfide bond, while the number of disulfide linkages varies among the heavy chains of different immunoglobulin isotypes. 各々の重鎖は、1つの端部に可変ドメイン(V H )とそれに続く一定数の定常ドメインを有する。 Each heavy chain has a variable domain (V H) and a number of constant domains followed by the one end. 各々の軽鎖は、一端に可変ドメイン(V L )を、もう一方の端部に定常ドメインを有する。 Each light chain has a variable domain at one end (V L) and a constant domain at its other end. 軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第1の定常ドメインと整列させられる。 The constant domain of the light chain is aligned with the first constant domain of the heavy chain.

可変ドメインの或る部分は、抗体間で広範に配列が異なり、各々の特定の抗体のその特定の抗原に対する結合特異性の原因となっている。 Certain portions of the variable domains differ extensively in sequence among antibodies and are responsible for binding specificity for its particular antigen of each particular antibody. 定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接関与せず、さまざまなエフェクタ機能を示す。 The constant domains are not involved directly in binding an antibody to an antigen, but exhibit various effector functions. 重鎖のCRGのアミノ酸配列に応じて、抗体又は免疫グロブリンは異なるクラスに割当てられる可能性がある。 Depending on the CRG amino acid sequence of the heavy chains, antibodies or immunoglobulins which may be assigned to different classes. ヒトにおいては、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMという5つの主要クラス(イソタイプ)の免疫グロブリンが存在し、そのうちのいくつかは、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4ならびにIgA1及びIgA2といったようなサブクラス(亜型)にさらに分割される。 In humans, IgA, IgD, IgE, exists immunoglobulins five major classes IgG and IgM (isotypes), some of which, IgG1, IgG2, subclasses such as IgG3, and IgG4 as well as IgA1 and IgA2 It is further divided into (subtype).

未変性IgG構造の概略的表示が図1に示されており、ここには未変性抗体分子のさまざまな部分が示されている。 Schematic representation of the native IgG structure is shown in Figure 1, there is shown various portions of the native antibody molecule. 重鎖定常領域は、C H 1、ヒンジ領域、C H 2、C H 3を内含する。 The heavy chain constant region is entailment the C H 1, hinge region, C H 2, C H 3 . 抗体のパパイン消化は2つのフラグメント、Fab及びFcを産生する。 Papain digestion of antibodies produces two fragments, Fab and Fc. Fc フラグメントはC H 2、C H 3及びヒンジ領域の一部分から成る。 Fc fragment consists of a portion of the C H 2, C H 3 and the hinge region. ヒトIgG1Fcフラグメントの結晶構造は、これまでにすでに決定されている(Deisenhofer, Biochemistry 20:2361-2370(1981))。 The crystal structure of human IgG1Fc fragments have already been determined so far (Deisenhofer, Biochemistry 20: 2361-2370 (1981)). ヒトIgG分子においては、Fcフラグメントは、Cys226に対するヒンジ領域N末端のパパイン分割によって生成される。 In human IgG molecules, Fc fragment is generated by papain division of the hinge region N-terminal to Cys226. 従って、ヒトIgG重鎖Fc領域は、位置226にあるアミノ酸残基からC末端までの伸張として通常定義づけされる(Kabat et al.,「免疫学的に有利なタンパク質の配列」第5版、米国保健機構、Bethesda. MD,(1991)のEU指標に従って番号づけされる;EU番号づけスキームは以下で使用されている)。 Therefore, the human IgG heavy chain Fc region is usually defined as the stretch from the amino acid residue at position 226 to the C-terminus (Kabat et al., "Sequence of immunologically advantageous protein" Fifth Edition, . it is used in the EU numbering scheme below); US health Organization, Bethesda MD, numbering is as according to the EU index of (1991).

Fc領域は、抗体のエフェクタ機能にとって不可欠である。 Fc region is essential for antibody effector function. エフェクタ機能には、補体依存性細胞障害(CDC)の開始、食作用及び抗体依存性細胞障害(ADCC)の開始及びトランスサイトーシスによる細胞障壁を横断する抗体の移送、が含まれる。 The effector function, initiation of complement dependent cytotoxicity (CDC), the transfer of antibodies across the cell barrier according to the start and transcytosis of phagocytosis and antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), are included. さらに、Fc領域は、IgGクラスの抗体の血清半減期を維持するためにきわめて重要である(Ward 及び Ghetie, Ther.Immunol. 2:77-94(1995))。 Furthermore, Fc region is critical for maintaining the serum half-life of the antibody of IgG class (Ward and Ghetie, Ther.Immunol 2:. 77-94 (1995)).

研究により、新生児のFcレセプタ(FcRn)に対するFCの結合がIgG抗体の血清半減期を媒介するということがわかっている。 Studies binding of FC against neonatal Fc receptor (FcRn) has found that mediates the serum half-life of IgG antibody. FcRnは、膜内外α鎖と可溶性β鎖(β2-ミクログロブリン)から成るヘテロ2量体である。 FcRn is a heterodimer consisting of a transmembrane α chain and a soluble β chain (beta2-microglobulin). FcRnはクラスI MHC分子と22〜29%の配列同一性を共有し、MHCペプチド結合溝の非機能的バージョンを有する。 FcRn shares the Class I MHC molecules and 22 to 29% sequence identity, with a non-functional version of the MHC peptide-binding groove. FcRnのα1及びα2ドメインは、Fc領域のCH 2及びCH 3ドメインと相互作用する(Raghavan et al., Immunity 1;303-315(1994))。 Α1 and α2 domains of FcRn interact with CH 2 and CH 3 domains of the Fc region (Raghavan et al, Immunity 1; . 303-315 (1994)).

抗体の血清半減期をFcRnがいかに調節し得るかについてのモデルが提案されてきた。 Model of the serum half-life of the antibody whether FcRn might regulate how have been proposed. 図2に示されているように、IgGは、非特異的飲作用を通して内皮細胞により取上げられ、その後、酸性エンドソーム内に入る。 As shown in FIG. 2, IgG is taken up by endothelial cells through non-specific pinocytosis, then it enters into the acidic endosomes. FcRnはエンドソーム内で酸性pH(<6.5)でIgGを結合させ、血流内で塩基性pH(>7.4)でIgGを放出する。 FcRn is <to bind the IgG with (6.5, basic pH in the bloodstream acidic pH) in the endosome releasing IgG in (> 7.4). 従って、FcRnは、リソソーム分解経路からIgGをサルベージする。 Accordingly, FcRn is salvages IgG from lysosomal degradation pathway. 血清IgGレベルが減少した場合、増加した量のIgGがサルベージされるようにIgG結合のためにより多くの分子が利用可能である。 If serum IgG levels decrease, more of the molecule by for IgG binding so that an increased amount of IgG is salvaged is available. 逆に、血清IgGレベルが上昇すると、FcRnは飽和状態となり、かくして分解させられる飲作用を受けたIgGの割合は増大する(Ghetie 及び Ward, Annu, Rev. Immunol. 18:739〜766(2000))。 Conversely, if serum IgG levels rise, FcRn becomes saturated, thus the proportion of pinocytosed which is caused to decompose IgG increases (Ghetie and Ward, Annu, Rev. Immunol 18:. 739~766 (2000) ).

上述のモデルと一貫して、数多くの研究の結果は、抗体のFcRn結合に対する親和力と血清半減期の間の相関関係を裏づけている(Ghetie 及びWard, 同書)。 Consistent with the above model, the results of numerous studies support a correlation between the affinity and serum half-life for FcRn binding antibody (Ghetie and Ward, ibid.). 注目に値すべきことに、このような相関関係は、その野生型親分子よりも高いFcRnに対する結合親和力をもつ工学処理された抗体にまで拡張されてきた。 That noted deserve to, such correlation has been extended to engineered antibodies with binding affinity for higher FcRn than their wild-type parent molecules.
Ghetie et al.,は、マウスIgG1 Fc-ヒンジフラグメント内で位置252、位置254及び位置256を無作為に変異誘発させた。 Ghetie et al., A mouse IgG1 Fc-hinge fragment located within 252 to randomly mutagenized position 254 and position 256. 1つの突然変異体は、野生型のものと比べて、マウスのFcRnについての3.5倍高い親和力と2つのマウス系統においてそれぞれ約23%又は65%長い半減期を示した(Ghetie et al.,Nat. Biotechnol.15:637-640(1997))。 One mutant, as compared to that of wild-type, about 23%, or 65%, respectively, in 3.5-fold higher affinity and two mouse strains for FcRn mice showed long half-life (Ghetie et al., Nat . Biotechnol.15: 637-640 (1997)).

Shields et al., は、ヒトIgG1抗体のFc領域内で残基を改変するのにアラニン走査変異誘発を使用した。 Shields et al., Was used alanine scanning mutagenesis to alter residues in the Fc region of a human IgG1 antibody. 彼らは、野生型に比べヒトFcRnについてのより高い結合親和力をもつ複数の突然変異体を発見したが、位置250、314又は428における突然変異を同定しなかった(Shields et al., J.Biol. Chem.276:6591-6604(2001))。 They have been found several mutants with a higher binding affinity for human FcRn than the wild-type and did not identify mutations at positions 250, 314 or 428 (Shields et al., J.Biol . Chem.276: 6591-6604 (2001)).
Martin et al.,は、他の数多くのものの中でも特に位置250、314及び428を含めて、FcRnに対する結合を増大させるためヒトIgG Fc内の一定数の位置における変異誘発を提案した。 Martin et al.,, Including the particular position 250, 314 and 428 among other numerous ones proposed mutagenesis at a number of locations within the human IgG Fc to increase binding to FcRn. しかしながら、Martin et al.により提案された突然変異体のいずれも、FcRnに対する結合のために構築又はテストされていない(Martin et al., Mol. Cell 7:867-877(2001))。 However, none of Martin et al The proposed mutants, not built or tested for binding to FcRn. (Martin et al, Mol Cell 7:.. 867-877 (2001)).

Dall' Acqua e al. は、マウスFcRnに対するヒトIgG1ヒンジ-Fcフラグメントファージ提示ライブラリの無作為変異誘発及びスクリーニングについて記述した。 Dall 'Acqua e al. Has been described random mutagenesis and screening of human IgG1 hinge--Fc fragment phage display libraries against mouse FcRn. 彼らは、位置428-436の無作為変異誘発を開示したが、位置428における変異誘発をマウスFcRn結合親和力に対する何らかの効果をもつものとして同定しておらず、この位置における野生型メチオニンアミノ酸が効率の良い結合にとって有利であると述べた(Dall'Acqua et al.,J.Immunol. 169-5171-5180(2002))。 They have been disclosed random mutagenesis of positions 428-436, not identified mutagenesis at position 428 as having any effect on mouse FcRn binding affinity, wild-type methionine amino acid at this position is the efficiency of was said to be advantageous for good binding (Dall'Acqua et al., J.Immunol. 169-5171-5180 (2002)).

Kim et al.は、Fc領域の位置253、位置310又は位置435でアミノ酸置換によりヒトIgG1を変異誘発させた。 Kim et al., The position of the Fc region 253, and the human IgG1 mutagenized by amino acid substitution at position 310 or position 435. 彼らは、突然変異体Fcヒンジフラグメントが、野生型IgG1 Fcヒンジフラグメントに比較してマウスにおける血清半減期を減少させることを発見し、Ile253、His310及びHis435がIgG血清半減期を調節する上で中心的役割を果たすという結論を下した(Kim et al., Eur.J.Immunol. 29:2819-2825(1999))。 They centered on the mutant Fc hinge fragment was found to decrease the serum half-life in mice compared to the wild-type IgG1 Fc hinge fragment, Ile253, His310 and His435 regulates IgG serum half-life It concluded that role (Kim et al, Eur.J.Immunol 29:.. 2819-2825 (1999)).
Homick et al, は、キメラヒトIgG1抗体のFc領域内の位置253での単一アミノ酸置換が、マウス体内のクリアランスを加速し、中実腫瘍の免疫シンチグラフィを改善することを示した(Hormick et al., J. Nucl. Med.41:355-362(2000))。 Homick et al, is a single amino acid substitution at position 253 in the Fc region of a chimeric human IgG1 antibody accelerates clearance in mice body, in the shown to improve immune scintigraphy real tumors (Hormick et al ., J. Nucl Med.41:. 355-362 (2000)).

米国特許第6,165,745号は、抗体をコードするDNAセグメント内に突然変異を導入することにより生物学的半減期が減少した抗体を産生する方法を開示している。 U.S. Patent No. 6,165,745 discloses a method of producing an antibody which biological half-life is reduced by introducing a mutation into the DNA segment encoding the antibody. 該突然変異には、Fc-ヒンジドメインの位置253、310、311、433又は434におけるアミノ酸置換が含まれている。 The said mutation includes an amino acid substitution at position 253,310,311,433 or 434 of the Fc- hinge domain. 米国特許第6,165,745号の全開示ならびに本明細書に引用されているその他全ての米国特許第参考文献の全開示が、本明細書に引用により組込まれる。 The entire disclosure of U.S. entire disclosure and all other cited in the U.S. Patent No. references Patent No. 6,165,745 is incorporated by reference herein.
米国特許第5,530,101;5,585,089;5.693,761;5,693,762;及び6,180,370号は、免疫グロブリンのヒト型化を開示している。 U.S. Patent 5,530,101; 5,585,089; 5.693,761; 5,693,762; and No. 6,180,370 disclose the immunoglobulin humanized.

米国特許第6,277,375B1号は、位置252におけるトレオニンからロイシンへ、位置254におけるセリンからセリンへ又は位置256におけるトレオニンからフェニルアラニンへのアミノ酸置換を含む、野生IgGとの関係において増大した血清半減期を有する突然変異体IgG分子を含む組成物を開示している。 U.S. Patent No. 6,277,375B1 is leucine threonine at position 252, amino acid substitution from threonine at serine or position 256 from serine at position 254 to phenylalanine, has a serum half-life increased relative to the wild-IgG a composition comprising a mutant IgG molecule disclose. 位置433、435又は436にアミノ酸置換を伴う突然変異体 IgGも同様に開示されている。 Mutant IgG with an amino acid substitution at position 433, 435 or 436 is also disclosed as well.
米国特許出願第20020098193A1号及びPCT公報WO97/34621号は、Fcヒンジ領域内に少なくとも1つのアミノ酸置換を有し、IgGとの関係において増大した血清半減期をもつ突然変異体IgG分子を開示している。 U.S. Patent Application No. 20020098193A1 No. and PCT Publication WO97 / thirty-four thousand six hundred and twenty-one, has at least one amino acid substitution in the Fc hinge region, disclose mutant IgG molecules having a serum half-life increased in relation to the IgG there. しかしながら、位置250、314又は428における突然変異についていかなる実験上の裏づけも提供されていない。 However, it not provided also support on any experiments for mutations at positions 250, 314 or 428.

米国特許第6,528,624号は、ヒトIgG Fc領域のアミノ酸位置270、322、326、327、329、331、333及び334のうちの1又は複数におけるアミノ酸置換を含んで成る、ヒトIgG Fc領域を含んだ抗体の変異体を開示している。 U.S. Patent No. 6,528,624, comprising an amino acid substitution at one or more of amino acid positions 270,322,326,327,329,331,333 and 334 of the human IgG Fc region, including the human IgG Fc region It discloses a variant of an antibody.
PCT公報WO98/05787号は、その誘発された毒性を減少させるべくBR96抗体の位置310〜331においてアミノ酸を欠失又は置換させることを開示しているが、改変されたFcRnに対する結合を結果としてもたらすアミノ酸修飾を開示していない。 PCT Publication No. WO98 / 05787, which discloses that to deletion or substitution of amino acids at positions 310 to 331 of the BR96 antibody in order to reduce its induced toxicity, resulting in binding to the modified FcRn as a result It does not disclose amino acid modifications.

PCT公報WO00/42072号は、Fc領域内の残基の番号付けがEU指標のものであるものとして、Fc領域のアミノ酸位置238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439、及び447のうちのいずれか1つ又は複数の位置におけるアミノ酸修飾を含む、改変されたFcRn結合親和力をもつ変異体Fc領域を含んだポリペプチドを開示している(Kabat et al.,前掲書中)。 PCT Publication WO00 / No. 42072 is as the numbering of the residues in the Fc region is that of the EU index, the amino acid positions of the Fc region 238,252,253,254,255,256,265,272,286, 288,303,305,307,309,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,386,388,400,413,415,424,433,434,435,436, 439, and comprises an amino acid modification at any one or more of positions 447, discloses a polypeptide containing a variant Fc region with altered FcRn binding affinity (Kabat et al., supra Shochu).

PCT公報WO02/060919A2号は、野生型IgG 定常ドメインをもつIgGの半減期に比べて増大した半減期を有し、かつ1又は複数のアミノ酸修飾が251、253、255、285〜290、308〜314、385〜389及び428〜435のうちの1又は複数にある、野生型IgG 定常ドメインとの関係において1又は複数のアミノ酸修飾を含むIgG 定常ドメインを含んだ修飾されたIgGを開示している。 PCT Publication WO02 / No. 060919A2 has an increased half-life compared to the half-life of the IgG with wild-type IgG constant domain, and 1 or more amino acid modifications 251,253,255,285~290,308~ there 314,385~389 and one or more of 428-435, discloses a modified IgG containing IgG constant domain comprising one or more amino acid modifications relative to the wild-type IgG constant domain . しかしながら、FcRnに対する改変された結合を伴う位置314又は428における突然変異の例は全く開示されていない。 However, examples of mutations at positions 314 or 428 with altered binding to FcRn are not disclosed at all.

Martin, WL(「タンパク質-タンパク質認識:新生児のFcレセプタ及び免疫グロブリンG」という題の博士論文、カリフォルニア工科大学(2001年))は、FcRn結合親和力を増大し得る、位置250及び428を含めたラットガンマ-2a定常領域の複数のFc位置における理論上の突然変異を提案している。 Martin, WL ( "protein - protein recognition: neonatal Fc receptor and immunoglobulin G" that the doctoral thesis entitled, California Institute of Technology (2001)), may increase the binding affinity for FcRn, including positions 250 and 428 It proposes mutations theoretical in several Fc positions of the rat gamma -2a constant region. Martinは、なかでも位置250でバリンをイソロイシンで置換する又は位置428でロイシンをフェニルアラニンで置換する可能性を示唆している。 Martin is a leucine or in position 428 replaced valine isoleucine at inter alia position 250 suggests the possibility of substituting phenylalanine. Martinは、位置314についていかなる置換も示唆していない。 Martin does not suggest any substitution for position 314. Martinは、これらの提案された突然変異のいずれについても、FcRnに対する増大した結合親和力を実証していない。 Martin, for any of these proposed mutations have not demonstrated binding affinity was increased for FcRn.

以上で記述した刊行物は、IgGクラスの抗体の血清半減期又はFcRn結合親和力が、Fc領域の位置250、位置314又は位置428におけるアミノ酸修飾により改変され得ることを示していなかった。 Publications described above, the serum half-life or FcRn binding affinity of the antibody of IgG class, the position of the Fc region 250, did not show that may be modified by an amino acid modification at position 314 or position 428. 本発明は、結合に対する効果を有し得るもののpH依存性結合には必要でないかもしれないFcRn接触部位近くのFc残基を選択するために分子モデリングを使用した。 The present invention was used molecular modeling to select the FcRn contact sites near Fc residues that may not be necessary for pH-dependent binding but may have an effect on binding. アミノ酸修飾は、IgGクラスの免疫グロブリン重鎖の定常領域の位置250、314又は428で行なわれた。 Amino acid modifications were made at position 250, 314 or 428 of the constant region of an immunoglobulin heavy chain of class IgG. 前記修飾を含む抗体の血清半減期又はFcRn結合親和力は改変され、従って未修飾抗体のものとは異なっていた。 Serum half-life or FcRn binding affinity of an antibody comprising said modifications were altered, that of unmodified antibody thus was different.

本発明は、FcRnについてのIgG分子の親和力を改変(すなわち増大又は減少)させるヒトIgG分子の定常ドメイン中の複数の突然変異を発明人らが同定したことに基づくものである。 The present invention is based on the inventors have found several mutations in the constant domain of a human IgG molecule that alter the affinity (i.e. increase or decrease) of the IgG molecule for FcRn were identified. 本発明は、対応する未修飾抗体との関係において改変されたFcRn結合親和力及び/又は血清半減期を有する修飾された抗体を提供する。 The present invention provides for a modified antibody having a binding affinity for FcRn and / or serum half-life that has been modified relative to the corresponding unmodified antibody. 抗体及びその他の生物活性分子のin vivo半減期(すなわち被験者の血清又はその他の組織内での残存性)は、抗体(又はその他のあらゆる薬学的分子)の投与の量及び頻度を決定する重要な臨床的パラメータである。 in vivo half-life of the antibody and other bioactive molecule (i.e. persistence in the serum or other tissues of a subject) an important to determine the amount and frequency of administration of the antibody (or any other pharmaceutical molecule) it is a clinical parameter. 従って、増大した(又は減少した)半減期をもつ抗体を含めたこのような分子は、薬学的に多大な重要性をもつ。 Accordingly, such molecules, including antibodies with increased (or decreased) half-life, with a pharmaceutically great importance.

本発明は、IgG定常ドメイン又はそのフラグメントがFcRnについての親和力を増大(又は減少)させるべく(好ましくはアミノ酸置換によって)修飾されている、(好ましくはヒトIgG由来の)修飾されたIgG定常ドメイン又はそのFcRn結合部分(好ましくはFc又はヒンジ-Fcドメイン)の存在によって増大した(又は減少した)in vivo半減期を有する、修飾された分子(好ましくは抗体)に関する。 The present invention, in order IgG constant domain or fragment thereof increases the affinity for FcRn (or decreased) (preferably by amino acid substitution) are modified, (preferably from a human IgG) modified IgG constant domain, or FcRn-binding portion (preferably Fc or hinge -Fc domains) have increased (or decreased) in vivo half-life by the presence of, relating to the modified molecule (preferably an antibody).
特定の実施形態においては、本発明は、FcRnレセプタとのヒンジ-Fcドメインの相互作用に直接的又は間接的に関与するものとして構造研究によって同定された位置におけるアミノ酸残基の変化により、そのin vivo半減期が延長(又は短縮)されている。 In certain embodiments, the present invention is, by a change in the amino acid residue at a position identified in the interaction of the hinge -Fc domain by structural studies as being directly or indirectly involved with the FcRn receptor, their in vivo half-life is extended (or shortened). 修飾されたIgGクラス抗体に関する。 On a modified class IgG antibody.

好ましい実施態様においては、修飾されたIgGクラス抗体は、ダクリズマブ(daclizumab)、フォントリズマブ(fontolizumab)、ビシリズマブ(visilizumab)及びM200から成る群から選択される。 In a preferred embodiment, the modified class IgG antibodies, daclizumab (daclizumab), fontolizumab (fontolizumab), is selected from the group consisting of visilizumab (visilizumab) and M200.
好ましい実施形態においては、定常ドメイン(又はそのフラグメント)は、pH7.4よりもpH6.0でさらに高いFcRc親和力を有する。 In a preferred embodiment, the constant domain (or fragment thereof) has a higher FcRc affinity at pH6.0 than pH 7.4. すなわち、FcRn結合親和力のpH依存性は、野生型pH依存性を模倣する。 That, pH dependence of FcRn binding affinity mimics the wild-type pH dependency. 変形実施形態においては、本発明の修飾された抗体は、未修飾抗体との関係において改変されたpH依存性プロフィールを示していてよい。 In alternative embodiments, the modified antibodies of the present invention may have a pH-dependent profiles that have been modified relative to the unmodified antibody. このような改変されたpH依存性プロフィールは治療用又は診断用の利用分野において有用であり得る。 Such altered pH dependence profiles may be useful in FIELD therapeutic or diagnostic.

一部の実施形態においては、本発明の抗体修飾は、ADCC又はCDCといったその他の抗体エフェクタ機能を改変させることなくFcRn結合及び/又は血清半減期を改変させることになる。 In some embodiments, the antibody modifications of the present invention would alter FcRn binding and / or serum half-life without altering other antibody effector functions such as ADCC or CDC. 特に好ましい実施形態においては、本発明の修飾された抗体は、Fc-ガンマレセプタ又はC1qに対する結合の変化を全く示さない。 In a particularly preferred embodiment, the modified antibodies of the present invention do not show any change in the binding to Fc- gamma receptor or CIq. 変形実施形態においては、本発明の抗体修飾は、増大した(又は減少した)エフェクタ機能ならびに増大した血清半減期を結果としてもたらし得る。 In alternative embodiments, the antibody modifications of the present invention may result in increased (or decreased) effector functions as well as increased serum half-life as a result. 特に好ましい実施形態においては、本発明の修飾された抗体は、増大した(又は減少した)ADCC活性ならびに増大した血清半減期を有し得る。 In a particularly preferred embodiment, the modified antibodies of the present invention may have an increased (or decreased) ADCC activities as well as increased serum half-life.
本発明の修飾は修飾された抗体(又はその他の分子)の生物学的利用能(例えば粘膜表面又はその他の標的組織)を改変(すなわち増大又は減少)させることもできるということを指摘しておくべきである。 It is pointed out that the modification of the present invention can also be altered bioavailability of the modified antibodies (or other molecules) (e.g. mucosal surfaces or other target tissues) (i.e. increase or decrease) it should.

好ましい実施形態においては、本発明は、アミノ酸残基250、314及び428から成るグループの中から選択された重鎖定常領域由来の少なくとも1つのアミノ酸が未修飾抗体内に存在するものとは異なるアミノ酸残基で置換されている、IgGクラスの修飾された抗体を提供している。 In a preferred embodiment, the present invention is different amino acid at least in one amino acid from the heavy chain constant region selected from the group consisting of amino acid residues 250, 314 and 428 are present in the unmodified antibody are replaced by residues provides a modified antibody of class IgG. 好ましくはこの置換は、未修飾の野生型抗体との関係において前記修飾された抗体のFcRn結合親和力及び/又は血清半減期を改変させる。 Preferably this substitution may alter the binding affinity for FcRn and / or serum half-life of said modified antibody relative to the unmodified wild-type antibody. 本発明はさらに、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基250がグルタミン酸又はグルタミンで置換されているか又は重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428がフェニルアラニン又はロイシンで置換されている、未修飾抗体と比べて増大したFcRn結合親和力及び増大した血清半減期をもつ修飾された抗体を提供している。 The invention further than amino acid residue 250 from the heavy chain constant region amino acid residue 428 from or heavy chain constant region is substituted with glutamic acid or glutamine is substituted with phenylalanine or leucine, the unmodified antibody It provides a modified antibody having a binding affinity for FcRn and increased serum half-life increased Te.

本発明はさらに、(a)重鎖定常領域由来のアミノ酸残基250がグルタミン酸で置換され、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428がフェニルアラニン置換されている;(b)重鎖定常領域由来のアミノ酸残基250がグルタミンで置換され、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428がフェニルアラニンで置換されている;又は(c)重鎖定常領域由来のアミノ酸残基250がグルタミンで置換され、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428がロイシンで置換されている、未修飾抗体と比べて増大したFcRn結合親和力及び/又は増大した血清半減期を有する修飾された抗体を提供している。 The present invention further, (a) amino acid residue 250 from the heavy chain constant region is substituted with glutamic acid and amino acid residue 428 from the heavy chain constant region is phenylalanine substituted; (b) a heavy chain constant regions from amino acid residue 250 is substituted with glutamine and amino acid residue 428 from the heavy chain constant region is substituted with phenylalanine; or (c) amino acid residue 250 from the heavy chain constant region is substituted with glutamine, Jukusarijo amino acid residue 428 from the constant region is substituted with leucine, and provides for a modified antibody having a binding affinity for FcRn and / or increased serum half-life increased as compared to the unmodified antibody.

本発明はさらに、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基314が、未修飾抗体内に存在するものとは異なるもう1つのアミノ酸で置換されている、未修飾抗体と比べて減少したFcRn結合親和力及び/又は減少した血清半減期を有する修飾された抗体を提供する。 The present invention further provides the amino acid residue 314 from the heavy chain constant region, and those present in the unmodified antibody has been replaced with a different another amino acid, FcRn binding affinity and decreased compared to the unmodified antibody / or to provide a modified antibody having a reduced serum half-life.
本発明はさらに、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基250が、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、リジン、フェルニアラニン、プロリン、トリプトファン又はチロシンで置換されている、又は重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、又はバリンで置換されている、未修飾抗体と比べて減少したFcRn結合親和力及び/又は減少した血清半減期をもつ修飾された抗体を提供している。 The present invention further provides the amino acid residue 250 from the heavy chain constant region is substituted with arginine, asparagine, aspartic acid, lysine, Fel d alanine, proline, is substituted with tryptophan, or tyrosine, or heavy chain constant region from amino acid residue FcRn group 428, alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, lysine, proline, serine, threonine, is substituted with tyrosine, or valine, was reduced as compared to the unmodified antibody the modified antibodies with binding affinity and / or reduced serum half-life has to offer.

本発明は同様に、残基250、314及び428から成るグループの中から選択された少なくとも1つのアミノ酸残基が天然に発生するIgGクラス抗体の中に存在するものと異なっており、かくして天然に発生する抗体との関係において前記抗体のFcRn結合親和力及び/又は血清半減期を改変する、天然に発生するIgGクラス抗体と実質的に同一の定常領域をもつ抗体をも提供する。 The present invention also is different at least in one amino acid residue selected from the group consisting of residues 250, 314 and 428 are present in the IgG class antibody naturally occurring, thus naturally altering FcRn binding affinity and / or serum half-life of said antibody relative to the antibody to occur, also provides antibodies with IgG class antibody and substantially the same constant regions occurring in nature. 好ましい実施形態においては、天然に発生するIgGクラス抗体は、ヒトIgG1、IgG2、IgG2M3、IgG3又はIgG4分子の重鎖定常領域を含む。 In a preferred embodiment, IgG class antibodies naturally occurring comprises a heavy chain constant region of a human IgG1, IgG2, IgG2M3, IgG3 or IgG4 molecule. 同様に好ましい実施形態においては、天然に発生するIgGクラス抗体と実質的に同一の定常領域をもつ抗体の重鎖定常領域由来のアミノ酸残基250がグルタミン酸又はグルタミンであるか、又は重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428はフェニルアラニン又はロイシンである。 In a likewise preferred embodiment, if the IgG class antibody substantially the amino acid residue 250 from the heavy chain constant region of the antibody having the same constant regions occurring in nature is glutamic acid or glutamine, or a heavy chain constant region amino acid residue 428 from is phenylalanine or leucine. その他の好ましい実施形態においては、天然に発生するIgGクラス抗体と実質的に同一である定常領域をもつ抗体は、位置250にグルタミン酸残基そして位置428にフェニルアラニン残基を有するか;又はアミノ酸残基250がグルタミンであり、アミノ酸残基428がフェニルアラニンであるか又は;アミノ酸残基250がグルタミンであり、アミノ酸残基428がロイシンである。 In other preferred embodiments, either the antibody having a constant region substantially identical to IgG class antibodies produced naturally has a phenylalanine residue to a glutamate residue and position 428 to position 250; or an amino acid residue 250 is glutamine, or amino acid residue 428 is phenylalanine; an amino acid residue, 250 glutamine, amino acid residue 428 is leucine.

いくつかの実施形態においては、天然に発生するIgGクラス抗体定常領域と実質的に同一の定常領域をもつ抗体は、天然に発生する抗体の中に存在するものと異なる位置314のアミノ酸残基を内含し、かくして天然に発生する抗体との関係においてFcRn結合親和力を減少させかつ/又は血清半減期を減少させる。 In some embodiments, antibodies with the IgG class antibody constant region substantially identical to the constant region that occurs naturally, the amino acid residue at position 314 different from that present in the antibody naturally occurring and entailment, thus reducing the cause and / or serum half-life reduces the binding affinity for FcRn relative to the naturally occurring antibody. 実施形態には、アミノ酸残基314が、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンである抗体が含まれる。 The embodiment, the amino acid residue 314, alanine, arginine, aspartic acid, asparagine, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, or valine It contains antibodies. 1つの好ましい実施形態においては、アミノ酸残基314はアルギニンである。 In one preferred embodiment, the amino acid residue 314 is arginine.

その他の実施形態においては、天然に発生するIgGクラス抗体定常領域と実質的に同一の定常領域をもつ抗体は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、リジン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン又はチロシンから成るグループの中から選択された位置250のアミノ酸残基を内含し、かくして、天然に発生する抗体との関係においてFcRn結合親和力を減少させかつ/又は血清半減期を減少させる。 In other embodiments, antibodies with the IgG class antibody constant region substantially identical to the constant region that occurs naturally, arginine, asparagine, aspartic acid, lysine, phenylalanine, proline, the group consisting of tryptophan or tyrosine and entailment of the amino acid residues of the selected position 250 from, thus, reduce the reduce the binding affinity for FcRn relative to the naturally occurring antibody and / or serum half-life. 同様にして、位置428のアミノ酸残基は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、又はバリンから成るグループの中から選択されたアミノ酸残基と置換され得、かくして、天然に発生する抗体との関係において、FcRn結合親和力を減少させかつ/又は血清半減期を減少させる。 Similarly selected, the amino acid residue at position 428, alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, lysine, proline, serine, threonine, from the group consisting of tyrosine, or valine It can be substituted with amino acid residues, thus, in relation to the naturally occurring antibody, thereby reducing and / or serum half-life decreased FcRn binding affinity.

本発明はさらに、未修飾抗体の中に存在するものと異なるアミノ酸で、アミノ酸残基250、314及び428から成るグループの中から選択された重鎖定常領域由来の少なくとも1つのアミノ酸を置換し、かくして、前記未修飾抗体のFcRn結合親和力及び/又は血清半減期の改変をひき起こす段階を含んで成る、IgGクラスの抗体を修飾する方法を提供している。 The present invention further provides a different amino acid present in the unmodified antibody, and replacing at least one amino acid from the heavy chain constant region selected from the group consisting of amino acid residues 250, 314 and 428, Thus, there is provided a method of modifying the comprising the step of causing altered FcRn binding affinity and / or serum half-life of the unmodified antibody, the IgG class antibody.

本発明はさらに、 The present invention further provides,
(a) アミノ酸残基250、314及び428から成るグループの中から選択された重鎖定常領域由来の少なくとも1つのアミノ酸が、未修飾抗体の中に存在するものとは異なるアミノ酸で置換されていおり、かくしてFcRn結合親和力及び/又は血清半減期の改変を引き起こす、免疫グロブリン重鎖の定常領域を少なくともコードするDNAに操作可能な形でリンクされた適切なプロモータを含んで成る発現ベクター(好ましく複製可能な発現ベクター)を調製する段階; (A) at least one amino acid from the heavy chain constant region selected from the group consisting of amino acid residues 250, 314 and 428, which have been substituted with a different amino acid than that present in the unmodified antibody thus FcRn causes modification of binding affinity and / or serum half-life, the expression vector comprising a suitable promoter linked operably form a DNA encoding at least a constant region of immunoglobulin heavy chain (can preferably replicate preparing a Do expression vector);
(b) 宿主細胞を前記ベクターで形質転換する段階;及び (c) 前記修飾された抗体を産生するべく前記形質転換済み宿主細胞を培養する段階、 Step (b) transforming a host cell with said vector; and (c) step of culturing the transformant already host cells to produce said modified antibody,
を含んで成る、未修飾抗体と比べた場合に改変されたFcRnに対する結合親和力及び/又は改変された血清半減期を有するIgGクラスの修飾された抗体を生産する方法をも提供する。 Comprising also provides a method of producing modified antibody of class IgG with binding affinity and / or altered serum half-lives for FcRn which is modified when compared to the unmodified antibody.

任意には、かかる方法にはさらに、相補的免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAに対し操作可能な形でリンクされたプロモータを含む第2の発現ベクター(好ましく複製可能な発現ベクター)を調製する段階及びさらに前記第2の発現ベクターで前記細胞系統を形質転換させる段階がさらに含まれる。 Optionally, prepared further to this method, a second expression vector comprising a promoter linked operably form to DNA encoding a complementary immunoglobulin light chain (preferably a replicable expression vector) stage and step of further transforming said cell line with said second expression vector is further included.

本発明は同様に、改変された半減期を有する本発明の修飾された免疫グロブリン(毒素及び放射性核種と接合された免疫グロブリンを含む)、タンパク質及びその他の生物活性分子を用いた薬学組成物及び予防及び治療方法をも内含する。 The present invention also provides (including toxins and bonded immunoglobulin radionuclides) modified immunoglobulins of the present invention having a modified half-life, pharmaceutical compositions with proteins and other bioactive molecules, and also entailment the prevention and treatment methods. 同様に内含されているのは、改変された半減期をもつ本発明の修飾された免疫グロブリン、タンパク質及びその他の生物活性分子を用いた診断方法である。 Similarly what is entailed is a modified immunoglobulin, protein and diagnostic method using the other bioactive molecules of the present invention with altered half-life. 好ましい実施形態においては、本発明のアミノ酸修飾は、治療用又は診断用抗体の血清半減期を延長するために使用することができる。 In preferred embodiments, amino acid modifications of the present invention can be used to extend the serum half-life of a therapeutic or diagnostic antibody. 例えば、本発明は、対応する未修飾抗体のものよりも少なくとも約1.3倍長いin vivo除去半減期をもつIgGクラスの修飾された治療用又は診断用抗体を提供する。 For example, the present invention provides a corresponding at least about 1.3 times longer in vivo modified therapeutic or diagnostic antibody of class IgG with an elimination half-life than that of the unmodified antibody. 残基250、314及び428から成るグループの中から選択された少なくとも1つのアミノ酸残基が未修飾抗体の中に存在するものとは異なっている修飾された治療用又は診断用抗体。 At least one modified therapeutic or diagnostic antibody wherein the amino acid residue is different from that present in the unmodified antibody selected from the group consisting of residues 250, 314 and 428. 好ましい実施形態においては、修飾された治療用又は診断用抗体は、対応する未修飾抗体のものに比べ少なくとも1.3倍、1.5倍、1.8倍、1.9倍又は2.0倍超長いin vivo除去半減期を有する。 In a preferred embodiment, the modified therapeutic or diagnostic antibody, at least 1.3 times compared with that of the corresponding unmodified antibody, 1.5-fold, 1.8-fold, 1.9-fold or 2.0-fold super long in vivo elimination half-life .

本発明は同様に、対応する未修飾抗体のものよりも少なくとも約1.3倍低いin vivoクリアランスを有するIgGクラスの修飾された治療用又は診断用抗体をも提供する。 The present invention also provides for a modified therapeutic or diagnostic antibody of class IgG comprising at least about 1.3-fold lower in vivo clearance than that of the corresponding unmodified antibody. 残基250、314及び428から成るグループの中から選択された少なくとも1つのアミノ酸残基が未修飾抗体の中に存在するものとは異なっている修飾された治療用又は診断用抗体。 At least one modified therapeutic or diagnostic antibody wherein the amino acid residue is different from that present in the unmodified antibody selected from the group consisting of residues 250, 314 and 428. 好ましい実施形態においては、修飾された治療用又は診断用抗体は、対応する未修飾抗体のものに比べて少なくとも1.3倍、1.5倍、1.8倍、2.0倍、2.3倍、2.5倍、2.8倍又は3.0倍超低いin vivoクリアランスを有する。 In a preferred embodiment, the modified therapeutic or diagnostic antibody, at least 1.3 times as compared with that of the corresponding unmodified antibody, 1.5, 1.8, 2.0 times, 2.3 times, 2.5 times, 2.8 times or 3.0 double super have a low in vivo clearance.
好ましい実施態様においては、治療抗体は、ダクリズマブ、フォントリズマブ、ビシリズマブ及びM200から成る群から選択される。 In a preferred embodiment, the therapeutic antibody, daclizumab, fontolizumab, is selected from the group consisting of visilizumab and M200.

本発明はさらに、対応する未修飾抗体のものよりも少なくとも約1.3倍高い濃度-時間曲線下のin vivo面積をもつIgGクラスの修飾された治療用又は診断用抗体を提供する。 The present invention further than that of the corresponding unmodified antibody at least about 1.3-fold higher concentration - provides for a modified therapeutic or diagnostic antibody of class IgG with an in vivo area under the time curve. 残基250、314及び428から成るグループの中から選択された少なくとも1つのアミノ酸残基が未修飾抗体の中に存在するものとは異なっている修飾された治療用又は診断用抗体。 At least one modified therapeutic or diagnostic antibody wherein the amino acid residue is different from that present in the unmodified antibody selected from the group consisting of residues 250, 314 and 428. 好ましい実施形態においては、修飾された治療用又は診断用抗体は、対応する未修飾抗体のものに比べ少なくとも1.3倍、1.5倍、1.8倍、2.0倍、2.3倍、2.6倍、2.8倍又は3.0倍超高いin vivo除去半減期を有する。 In a preferred embodiment, the modified therapeutic or diagnostic antibody, at least 1.3 times compared with that of the corresponding unmodified antibody, 1.5, 1.8, 2.0 times, 2.3 times, 2.6 times, 2.8 times or 3.0 times with a super-high in vivo elimination half-life.
好ましい変形実施形態においては、本発明のアミノ酸修飾は同様に、治療又は診断用抗体の血清半減期を減少させるためにも使用可能である。 In a preferred variant embodiment, the amino acid modification likewise the present invention can also be used to reduce the serum half-life of a therapeutic or diagnostic antibody. かかる治療又は診断用抗体は、当該技術分野において周知であり、本発明の以下の記述において列挙されている。 Such therapeutic or diagnostic antibodies are well known in the art and are listed in the following description of the present invention.

本発明はまた、配列番号118の軽鎖アミノ酸配列、及び配列番号119−128から選択された重鎖アミノ酸配列を含んで成る修飾された治療抗体も供給する。 The present invention also provides a light chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 118, and modified therapeutic antibody comprising a heavy chain amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 119-128 is also supplied. 本発明はまた、1又は複数のそれらの軽鎖又は重鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含んで成るベクターも供給する。 The present invention also vector also supplies comprising one or more of these polynucleotide encoding the light chain or heavy chain amino acid sequence. さらに、本発明は、このベクターを含んで成る宿主細胞を供給する。 Furthermore, the present invention provides a host cell comprising this vector.

さらに、本発明は、配列番号129の軽鎖アミノ酸配列及び配列番号130−134から選択された重鎖アミノ酸配列を含んで成る修飾された治療抗体;配列番号135の軽鎖アミノ酸配列及び配列番号136−140から選択された重鎖アミノ酸配列を含んで成る修飾された治療抗体;及び配列番号141の軽鎖アミノ酸配列及び配列番号142−146から選択された重鎖アミノ酸配列を含んで成る修飾された治療抗体を供給する。 Furthermore, the present invention is modified therapeutic antibody comprising a heavy chain amino acid sequence selected from the light chain amino acid sequence and SEQ ID NO: 130-134 in SEQ ID NO: 129; light chain of SEQ ID NO: 135 amino acid sequence and SEQ ID NO: 136 modified therapeutic antibody comprising a heavy chain amino acid sequence selected from -140; heavy chain amino acid sequence selected from the light chain amino acid sequence and SEQ ID NO: 142-146 and of SEQ ID NO: 141 is comprising at modified supplying a therapeutic antibody. 本発明はまた、上記に列挙される修飾された治療抗体の1又は複数の重鎖及び/又は軽鎖アミノ酸配列を含んで成るベクターを供給し;そして本発明は、上記に列挙されるベクターのいずれかを含んでなる宿主細胞を供給する。 The present invention also supplies a vector comprising one or more heavy and / or light chain amino acid sequence of the modified therapeutic antibodies listed above; and the invention, the vectors listed above supplying a host cell comprising any.

I. I. 改変されたFcRn結合親和力及び/又は血清半減期を有する修飾された抗体 Altered FcRn binding affinity and / or modified antibody having serum half-life
本発明をより完全に理解できるように、いくつかの定義を記す。 As the present invention may be more fully understood, it referred several definitions.
本明細書で用いられている「免疫グロブリン」及び「抗体」という語は、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされる1又は複数のポリペプチドから成るタンパク質を意味する。 The term used herein "immunoglobulin" and "antibody" refers to a protein consisting of one or more polypeptides substantially encoded by immunoglobulin genes. 認識された免疫グロブリン 遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ(γ1、γ2、γ3、γ4)、デルタ、イプシロン及びミュー定常領域遺伝子ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。 The recognized immunoglobulin genes include the kappa, lambda, alpha, gamma (γ1, γ2, γ3, γ4), delta, include epsilon and mu constant region genes, as well as the myriad immunoglobulin variable region genes. 全長免疫グロブリン「軽鎖」(約25kd又は214個のアミノ酸)は、NH2-末端にあるカッパ又はラムダ可変領域(約110のアミノ酸)及びCOOH末端にあるカッパ又はラムダ定常領域遺伝子によってコードされる。 Full-length immunoglobulin "light chains" (about 25kd or 214 amino acids) are encoded by a kappa or lambda constant region gene at the kappa or lambda variable region (about 110 amino acids) and COOH-terminal in the NH2- terminus. 全長免疫グロブリン「重鎖」(約50Kd又は446のアミノ酸)は、重鎖可変領域遺伝子(約116のアミノ酸)及び例えば(約330のアミノ酸をコードする)ガンマといったその他の上述の定常領域遺伝子の1つによってコードされる。 Full-length immunoglobulin "heavy chains" (about 50Kd or 446 amino acids) is (encoding amino acids from about 330) a heavy chain variable region gene (about 116 amino acids) and, for example, the other aforementioned constant region genes, such as gamma 1 encoded by One.

免疫グロブリンの1つの形態が、抗体の基本的構造単位を構成する。 One form of immunoglobulin constitutes the basic structural unit of an antibody. この形態は四量体であり、各々1つの軽鎖と1つの重鎖をもつ2つの同一の免疫グロブリン鎖対から成る。 This form is a tetramer and consists of two identical immunoglobulin chain pairs with each one light chain and one heavy chain. 各々の対の中で、軽鎖及び重鎖可変領域は共に、1つの抗原に対する結合を担当し、定常領域は抗体エフェクタ機能を担持する。 In each pair, the light and heavy chain variable regions together responsible for binding to one antigen, and the constant region carries a antibody effector functions. 四量体抗体に加えて、免疫グロブリンは、例えばFv、Fab及び(Fab′) 2ならびに2官能性ハイブリッド抗体(例えばLanzavecchia及びScheidegger, Eur. J. Immunol. 17:105-111(1987))を含めたさまざまなその他の形態及び1本鎖(例えば本明細書に参考として内含されているHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85;5879-5883(1988)、及びBird et al., Science, 242:423-426(1998))で存在し得る。 In addition to tetrameric antibodies, immunoglobulins, for example Fv, Fab and (Fab ') 2 as well as bifunctional hybrid antibodies (e.g., Lanzavecchia and Scheidegger, Eur J. Immunol 17:. . 105-111 (1987)) and various other forms and single chain including (for example herein are incorporated by reference Huston et al, Proc Natl Acad Sci USA, 85;..... 5879-5883 (1988), and Bird . et al, Science, 242: may be present in 423-426 (1998)). (一般的には、Hood et al.,「免疫学」、第2版、Benjamin, York(1984)、及びHunkapiller及びHood, Nature, 323:15-16(1986)を参照のこと)。 (In general, Hood et al, "Immunology", 2nd Edition, Benjamin, York (1984), and Hunkapiller and Hood, Nature, 323:. 15-16 see (1986)).

「遺伝的に改変された抗体」という語は、アミノ酸残基の配列が、未変性又は野生型抗体のものから変更された抗体を意味する。 The term "genetically altered antibodies", the sequence of amino acid residues, means the native or changed from that of the wild-type antibody antibody. 組換え型DNA技術の関与度のため、本発明は、天然の抗体内に発見されるアミノ酸配列の修飾に制限されるわけではない。 For relevance of recombinant DNA techniques, the present invention is not limited to modification of amino acid sequences found in natural antibodies. 以下で記述されているように、以前に工学処理された抗体を本発明に従って設計し直し、改変されたFcRn結合親和力及び/又は血清半減期の望ましい特徴を得ることができる。 As described below, it is possible to previously the engineered antibody redesigned in accordance with the present invention, to obtain the desired characteristics of altered FcRn binding affinity and / or serum half-life. 本発明で有用な修飾された抗体の考えられる変異体は、数多くあり、わずか1つ又は数個のアミノ酸を変更するものから、例えば可変領域又は定常領域の完全な再設計まである。 Variants Possible modified antibodies useful in the present invention are numerous, from which only change one or several amino acids, for example, to the complete redesign of the variable or constant region. 定常領域における変更は、一般に、補体固定、さまざまなFc-ガンマレセプタ及びその他のレセプタ官能基との相互作用といったような特性を改善又は改変するために行なわれることになる。 Changes in the constant region will, in general, complement fixation, will be made to improve or modify the properties, such as interaction with various Fc- gamma receptor and other receptors functional groups. 可変領域における変更は、抗原結合特性を改善するために行なわれることになる。 Changes in the variable region will be made in order to improve the antigen binding characteristics.

天然に発生するクラスIgG抗体定常領域と実質的に同一の定常領域を有する抗体というのは、存在するあらゆる定常領域が天然に発生するIgGクラス抗体の定常領域のアミノ酸配列と実質的に同一であるすなわち少なくとも約85〜90%そして好ましくは少なくとも95%同一である抗体を意味する。 Is substantially identical to the amino acid sequence of the constant region of IgG class antibodies any constant region occurs naturally present because natural class IgG antibody constant region that occurs substantially antibody having the same constant region ie, at least about 85% to 90% and preferably refers to an antibody that is at least 95% identical.
in vitro検出検定及びそのためのヒトにおける修飾された抗体のin vivo使用を含めた、本発明の数多くの好ましい使用において、本発明に従って修飾された(すなわち突然変異を受けた)キメラ、霊長類化、ヒト型化又はヒト抗体を使用することが好ましい可能性がある。 Including in vitro detection assays and in vivo use of antibodies that have been modified in humans for its, in many preferred uses of the present invention, (received a i.e. mutated) modified in accordance with the present invention a chimeric, primatized, it may be preferable to use humanized or human antibodies.

「キメラ抗体」という語は、定常領域が1つの種(標準的にはヒト)の抗体に由来し、可変領域がもう1つの種(標準的にはゲッ歯類)の抗体に由来している抗体を意味する。 The term "chimeric antibody" (typically human) constant region one species derived from an antibody of (the standard rodent) variable region another species is from the antibody It means an antibody. キメラ抗体を産生するための方法は、当該技術分野において周知である。 Methods for producing chimeric antibodies are known in the art. 例えば、本明細書にその全体が参考として内含されている、Morrison, Science 229:1202-1207(1985);Oi et al., Bio Techniques 4:214-221(1986);Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202(1989);米国特許第5,807,715;4,816,567;及び4,816,397号を参照のこと。 For example, herein in its entirety is incorporated by reference, Morrison, Science 229: 1202-1207 (1985); Oi et al, Bio Techniques 4:. 214-221 (1986); Gillies et al,. . J. Immunol Methods 125: 191-202 (1989); U.S. Pat. No. 5,807,715; 4,816,567; and references No. 4,816,397.

「霊長類型化抗体」という語は、サルの可変領域及びヒトの定常領域を含む抗体を意味する。 The term "primatized antibody" refers to an antibody comprising the variable and constant regions of a human monkey. 霊長類型化抗体を産生する方法は、当該技術分野において既知である。 Methods for producing primatized antibodies are known in the art. 例えば、本明細書にその全体が参考として内含されている米国特許第5,658,570;5,681,722;及び5,693,780号を参照のこと。 For example, in its entirety U.S. Patent No. 5,658,570 is incorporated by reference herein; see item and 5,693,780; 5,681,722.

「ヒト型化抗体」又は「ヒト型化免疫グロブリン」という語は、ヒトのフレームワーク、非ヒト抗体由来の少なくとも1つの及び好ましくは全ての相補性決定領域を含み、かつ存在するあらゆる定常領域がヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一である、すなわち少なくとも約85〜90%そして好ましくは少なくとも95%同一である免疫グロブリンを意味する。 The term "humanized antibody" or "humanized immunoglobulin" refers to a human framework comprises at least one and preferably all complementarity determining regions derived from a non-human antibody, and is any constant region present human immunoglobulin and the constant region is substantially identical, i.e. means at least about 85% to 90% and the immunoglobulin is preferably at least 95% identical. 従って、場合によってはCDRを除いて、ヒト型化免疫グロブリンの全ての部分は、1又は複数の未変性ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。 Therefore, in some cases with the exception of CDR, all parts of a humanized immunoglobulin is substantially identical to corresponding parts of one or more native human immunoglobulin sequences. 往々にして、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合を改変、好ましくは改善するべくCDR供与体抗体由来の対応する残基と置換されることになる。 Often, framework residues in the human framework regions will alter antigen binding, it will preferably be substituted with the corresponding residue from the CDR donor antibody to improve. これらのフレームワーク置換は、当該技術分野において周知の方法、例えば、抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定するためのCDRとフレームワーク残基の相互作用のモデリング及び特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって、同定される。 These framework substitutions are identified by methods well known in the art, for example, abnormal frame in modeling and specific locations of the interactions of the CDR and framework residues to identify framework residues important for antigen binding by sequence comparison to identify framework residues are identified.

例えばQueen et al.,米国特許第5,530,101;5,585,089;5,693,761;5,693,762;6,180,370号(これらは各々その全体が参考として内含されている)を参照のこと。 For example Queen et al, U.S. Patent 5,530,101;. 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 6,180,370 No. see (these respective entirety of which is incorporated by reference in). 抗体は、全て本明細書にその全体が参考として内含されている例えば、CDR-グラフティング(欧州特許第239,400号;PCT公報WO91/09967号;米国特許第5,225,539;5,530,101及び5,585,089号)ベニヤーリング又はリサーフェシング(欧州特許第592,106;欧州特許第519,596;Padlan, Mol. Immunol.,28:489-498(1991);Studnicka et al., Prot. Eng. 7:805-814(1994);Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973(1994)、及び連鎖リシャッフリング(米国特許第5,565,332号)を含めた当該技術分野において既知のさまざまな技術を用いて、抗体をヒト型化することができる。 Antibodies, for example in its entirety all herein are incorporated by reference, CDR-grafting (EP 239,400; PCT Publication No. WO91 / 09967; U.S. Pat. No. 5,225,539; No. 5,530,101 and 5,585,089) veneer over rings or resurfacing (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Mol Immunol, 28:.. 489-498 (1991); Studnicka et al, Prot Eng 7:... 805-814 (1994); Roguska et al. , Proc Natl Acad Sci 91:.... 969-973 (1994), and in various known techniques in the art, including a chain reshuffling (U.S. Pat. No. 5,565,332), humanized antibodies can do.

ヒトの患者の治療的処置のためには、完全にヒトの抗体が望ましいかもしれない。 For the therapeutic treatment of human patients, not completely might human antibody is desirable. ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列から誘導された抗体ライブラリを用いて上述のフィージ表示方法を含めて当該技術分野において既知のさまざまな方法によって作ることができる。 Human antibodies can be made by a variety of methods known in the art, including Fiji display methods described above using the induced antibodies library from human immunoglobulin sequences. 各々本明細書にその全体が参考として内含されている米国特許第4,444,887号;4,716,111号及びPCT公報WO98/46645;WO98/50433;WO98/24893;WO98/16654;WO96/34096;WO96/33735;及びWO91/10741号を参照のこと。 Each herein in its entirety U.S. Patent No. 4,444,887 which is incorporated by reference; 4,716,111 No. and PCT Publication WO98 / 46645; WO98 / 50433; WO98 / 24893; WO98 / 16654; WO96 / 34096; WO96 / 33735; and see No. WO91 / 10741.

ヒト抗体は、同様に、官能性内因性免疫グロブリンを発現する能力はないもののヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できる遺伝子導入マウスを用いても産生可能である。 Human antibodies, likewise, capable of expressing functional endogenous immunoglobulins can also be produced using transgenic mice that can express human immunoglobulin genes although not. ヒト抗体を産生するためのこの技術を概覧するためには、Lonberg 及び Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93(1995)を参照のこと。 To A review of this technology for producing human antibodies, Lonberg and Huszar, Int Rev. Immunol 13:.. 65-93 (1995) reference. ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術及びかかる抗体を産生するためのプロトコルに関する詳細な論述については、本明細書にその全体が参考として内含されているPCT公報WO98/24893;WO92/01047;WO96/34096;WO96/33735号;欧州特許第0598877号;米国特許第5,413,923;5,625,126;5,633,425;5,569,825;5,661,016;5,545,806;5,814,318;5,885,793;5,916,771;及び5,939,598号を参照のこと。 For about detailed discussion protocols for producing this technology and such antibodies for producing human antibodies and human monoclonal antibodies, PCT Publication herein in its entirety is incorporated by reference WO98 / 24893; WO92 / 01047; WO96 / 34096; No. WO96 / 96/33735; EP 0,598,877; U.S. Pat. No. 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; and references No. 5,939,598. さらに、上述のものに類似した技術を用いて、選択された抗原に向けられたヒト抗体を提供するには、Abgenix, Inc. (Fremont, CA)及びMedarex(Princeton, NJ)といった会社をそれに従事させることができる。 Furthermore, using similar techniques to those described above, to provide human antibodies directed against a selected antigen, Abgenix, Inc. (Fremont, CA) and Medarex (Princeton, NJ) engaged in it companies such it can be.

選択されたエピトープを認識する完全にヒトの抗体を、「誘導型選択」と呼ばれる技術を用いて生成することが可能である。 Fully human antibodies which recognize a selected epitope can be generated using a technique referred to as "induced selection". このアプローチでは、例えばマウス抗体といったような選択された非ヒトモノクローナル抗体が、同じエピトープを認識する完全にヒトの抗体の選択を誘導するべく使用される(Jespers et al., Biotechnology 12:899-903(1988)。 In this approach, for example, non-human monoclonal antibodies selected, such as a mouse antibody, is used to induce a complete selection of human antibody recognizing the same epitope (Jespers et al, Biotechnology 12:. 899-903 (1988).
本明細書で使用される「改変する」という語は、「増大」又は「減少」させることを意味する。 The term "modifying" as used herein, means to "increase" or "decrease".
本発明は、アミノ酸残基250、314及び428から成るグループの中から選択された重鎖定常領域由来の少なくとも1つのアミノ酸が未修飾抗体の中に存在するものと異なるアミノ酸残基と置換される、IgGクラスの修飾された抗体を提供する。 The present invention, at least one amino acid from the selected heavy chain constant region is substituted with a different amino acid residue to be present in the unmodified antibody from the group consisting of amino acid residues 250, 314 and 428 provides a modified antibody of class IgG.

クラスIgGの抗体には、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4の抗体が含まれる。 The class IgG antibody includes the antibody IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. IgG分子の重鎖の定常領域は図1に示されている。 The constant region of the heavy chain of IgG molecules is shown in Figure 1. 重鎖内の残基の番号付けは、EU指標(Kabat et al., 前掲書中)のものである。 Numbering of the residues in the heavy chain, EU index (Kabat et al., Op. Cit.) Are of. 置換は、位置250、314又は428単独で行なうことができるが、位置250と428又は位置250と314、又は位置314及び428、又は位置250、314及び428といった、そのいずれかの組合せで行なうこともでき、位置250及び428が好ましい組合せである。 Substitution can be carried out at a position 250, 314 or 428 alone, positions 250 and 428 or position 250 and 314, or position 314 and 428, or such positions 250, 314 and 428, it is carried out in any combination thereof also, it positions 250 and 428 are preferably combined.
各位置について、置換するアミノ酸は、未修飾抗体のその位置に存在するものとは異なるあらゆるアミノ酸残基であり得る。 For each position, the substituting amino acid may be a different any amino acid residue from that present in that position of the unmodified antibody.

位置250については、置換するアミノ酸は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン又はチロシンを含む(ただしこれらに制限されるわけではない)、トレオニン以外のあらゆるアミノ酸残基であり得る。 For position 250, the substituting amino acid include alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, histidine, isoleucine, lysine, leucine, methionine, asparagine, proline, glutamine, arginine, serine, valine, tryptophan or tyrosine (but not limited to), it may be any amino acid residue other than threonine.

位置314については、置換するアミノ酸は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンを含む(ただしこれらに制限されるわけではない)、ロイシン以外のあらゆるアミノ酸残基であり得る。 For position 314, the substituting amino acid include alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, histidine, isoleucine, lysine, methionine, asparagine, proline, glutamine, arginine, serine, threonine, valine, tryptophan or tyrosine (but not limited to), it may be any amino acid residue other than leucine.

位置428については、置換するアミノ酸は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンを含む(ただしこれらに制限されるわけではない)、メチオニン以外のあらゆるアミノ酸残基であり得る。 For position 428, the substituting amino acid include alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, histidine, isoleucine, lysine, leucine, asparagine, proline, glutamine, arginine, serine, threonine, valine, tryptophan or tyrosine (but not limited to), it may be any amino acid residue other than methionine.

本発明は、上述のアミノ酸置換のうちの少なくとも1つを含むIgGクラスの抗体を提供する。 The present invention provides an antibody of class IgG comprising at least one of the amino acid substitutions described above. 例えば、本発明は、位置250、314及び/又は428における上述の置換のうちの2つを含む突然変異を受けたIgG2M3定常領域を提供する。 For example, the present invention provides a IgG2M3 constant regions mutated containing two of the substitutions described above at positions 250, 314 and / or 428. 本発明によって提供される定常領域の一部の特異的置換(すなわち突然変異)のアミノ酸配列は、表1(配列番号10〜66)と図3Bに開示されている。 The amino acid sequence of some specific substitutions of the constant region provided by the present invention (i.e., mutation) is disclosed in Figure 3B and Table 1 (SEQ ID NO: 10-66).

好ましい実施形態においては、本発明は、未修飾抗体との関係において改変した血清半減期又はFcRn結合親和力を有する修飾された抗体を提供している。 In a preferred embodiment, the present invention provides for a modified antibody having a serum half-life or FcRn binding affinity was modified relative to the unmodified antibody. 本発明は、さらに、アミノ酸残基250、314及び428から成るグループの中から選択された重鎖定常領域由来の少なくとも1つのアミノ酸が未修飾抗体の中に存在するものと異なるアミノ酸残基と置換され、かくして、前記未修飾抗体の結合親和力及び/又は血清半減期に比べて修飾された抗体のFcRn結合親和力及び/又は血清半減期を改変する、IgGクラスの修飾された抗体を提供している。 The invention further substituted at least one amino acid from the heavy chain constant region selected from the group consisting of amino acid residues 250, 314 and 428 with a different amino acid residue to be present in the unmodified antibody is, thus, altering FcRn binding affinity and / or serum half-life of the modified as compared to the binding affinity and / or serum half-life of the unmodified antibody antibodies, and provides for a modified antibody of class IgG .

本発明の未修飾抗体は、全ての種の天然の抗体を内含する。 The unmodified antibodies of the present invention, the entailment natural antibodies of all species. 「天然の抗体」という語は、宿主動物により産生された全ての抗体を意味する。 The term "natural antibodies" refers to all of the antibodies produced by the host animal. 本発明の制限的な意味のない例としての天然の抗体は、ヒト抗体を産生するべく遺伝的に工学処理された遺伝子導入ゲッ歯類を含め、ヒト、ニワトリ、ヤギ及びゲッ歯類(例えばラット、マウス、ハムスター及びウサギ)に由来する抗体が含まれる(例えば本明細書にその全体が参考として内含されている Lonberg et al., 国際公開第93/12227号;米国特許第5,545,806合;及びKucherlapati, et al.,国際公開第91/10741号;米国特許第6,150,584号を参照のこと)。 Natural antibodies as examples without limiting the meaning of the present invention, including genetically engineered transgenic rodents in order to produce human antibodies, human, chicken, goats, and rodents (e.g., rats , mouse, Lonberg et al in their entirety (e.g. herein to include antibodies derived from hamster and rabbits) are incorporated by reference, WO 93/12227;. U.S. Patent 5,545,806 Go; and Kucherlapati, et al, International Publication No. WO 91/10741;. the United States that the patent see No. 6,150,584).

本発明の未修飾抗体には、同様に、天然抗体と同じアミノ酸配列をもつ組換え型抗体、又は天然抗体と比べて変更されたアミノ酸配列を有する遺伝的に改変された抗体も含まれる。 Unmodified antibodies of the present invention likewise also includes genetically altered antibodies having altered amino acid sequence compared to the recombinant antibody or naturally occurring antibodies have the same amino acid sequence as the naturally occurring antibody. これらは、原核生物及び真核生物発現系の両方を含むあらゆる発現系内で、又はファージ提示方法を用いて作ることができる(例えば本明細書にその全体が参考として内含されている Dower et al., 国際公開第91/17271号及びMcCafferty et al., 国際公開第92/01047号:米国特許第5,969,108号を参照のこと)。 They, Dower et that in any expression system including both prokaryotic and eukaryotic expression systems, or may be made using phage display methods (e.g. herein in its entirety is incorporated by reference al, WO 91/17271 Patent and McCafferty et al, International Publication No. WO 92/01047:.. see US Pat. No. 5,969,108).

本発明の未修飾抗体は、キメラ、霊長類化、ヒト型化及びヒト抗体(以上の論述参照)をも内含する。 The unmodified antibodies of the present invention, chimeric, primatized, also entailment humanized and human antibodies (see above discussion). その結果、本発明の修飾された抗体は、以前は天然抗体から誘導されていたヒト型化、霊長類化又はキメラ抗体内の位置250、314又は428にあるアミノ酸残基を置換することによって産生可能である。 Produced by a result, the modified antibodies of the present invention, previously to replace the amino acid residues in the humanized which has been derived from natural antibodies, to position 250, 314 or 428 of primatized or in chimeric antibodies possible it is.

好ましくは、キメラ抗体は、それがより長い半減期を有し、ヒト被験者に投与された時点で免疫原性が比較的低くなるような形で、げっ歯類に由来する可変領域及びヒトに由来する定常領域を含む。 Preferably, the chimeric antibody, it has a longer half-life, in a way that immunogenicity is relatively low when it is administered to a human subject, from a variable region and a human derived from rodents including a constant region. 霊長類型化抗体は、霊長類に由来する可変領域とヒトに由来する定常領域を含む。 Primatized antibodies comprise variable and constant regions derived from human derived from primates. ヒト型化抗体は、標準的に、供与体抗体(例えばマウス又はニワトリ抗体)及び重鎖及び/又は軽鎖ヒトフレームワークからの少なくとも1つのCDRを含む。 Humanized antibody, a standard, comprising at least one CDR from the donor antibodies (e.g. murine or chicken antibodies) and heavy and / or light chain human frameworks. 時として、ヒトフレームワーク内のいくつかのアミノ酸残基は、その抗原に対するヒト型化抗体の適切な結合を確保するため、供与体抗体の同等の位置にある残基により置換されることになる。 Sometimes, some amino acid residues in the human framework in order to ensure proper binding of the humanized antibody to the antigen, will be replaced by the residues at the equivalent positions of the donor antibodies . 抗体ヒト型化の詳細な指針は、各々本明細書に参考として内含されている米国特許第5,530,101;5,585,089;5,693,761,5,693,762及び6,180,370号に開示されている。 Detailed guidance antibodies humanized in US Patent 5,530,101 is incorporated by reference, each herein; disclosed in JP 5,693,761,5,693,762 and 6,180,370; 5,585,089.

本発明の未修飾抗体は、対応する天然抗体と機能的に同等である遺伝的に改変された抗体を内含することができる。 The unmodified antibodies of the present invention can be entailment the corresponding natural antibodies functionally genetically altered antibodies are comparable. 改善された安定性及び/又は治療的効果を提供するために遺伝的に改変された未修飾抗体が好まれる。 Unmodified antibody is preferred which has been genetically altered to provide for improved stability and / or therapeutic effect. 改変された抗体の例としては、アミノ酸残基の保存的置換、及び抗原結合有用性を著しく改変しないアミノ酸の1又は複数の欠失又は付加を伴うものが含まれる。 Examples of altered antibodies include those with conservative substitutions of amino acid residues, and one or more deletions or additions of not significantly modified amino antigen binding utility. 置換は、1又は複数のアミノ酸残基の変更又は修飾から、結合又は機能的有用性が維持されるかぎりの1領域の完全な再設計にまで至る可能性がある。 Substitution from changing or modifying one or more amino acid residues, it is possible to complete redesign of a region as long as the binding or functional utility is maintained. 本発明の抗体は、翻訳後に改変させることもできるし(例えばアセチル化及びリン酸化)、或いは又合成的に改変させることもできる(例えば、標識基の付着)。 Antibody of the present invention can also be modified post-translationally (eg, acetylation, and phosphorylation) or can also synthetically be modified (e.g., the attachment of a labeling group).

本発明の未修飾抗体は、可変領域の遺伝的改変を通してその抗原についての増強された結合親和力を有する抗体を内含させることができる(本明細書にその全体が参考として内含されている米国特許第6,350,861号を参照のこと)。 The unmodified antibodies of the present invention, US its entirety for antibodies can be entailment (herein having enhanced binding affinities for their antigens through genetic alterations of the variable regions are incorporated by reference see Japanese Patent No. 6,350,861). 1つの変形実施形態においては、野生型(又は未修飾)のIgGに比べて長い半減期を有する本発明の修飾されたIgGsは同様に、抗原結合部位、Fcレセプタ結合部位又は補体結合部位といったようなその生物活性部位が、野生型に比べかかる活性を増加又は減少させるべく遺伝子工学処理することで修飾されているIgGも内含し得る。 In one alternative embodiment, the modified IgGs of the present invention which have a longer half-life compared to IgG wild-type (or unmodified) is likewise an antigen binding site, such as Fc receptor binding sites or complement binding site biologically active site as is, it may also entailment IgG which have been modified by genetic engineering to increase or reduce the activity of Kakaru relative to wild-type.

本発明の未修飾抗体及び修飾された抗体は、認識されたイソタイプのうちのいずれのものであってもよいが、4つのIgGイソタイプが好ましく、IgG1及びIgG2が特に好ましい。 Unmodified antibodies and modified antibodies of the present invention may be of any of the recognized isotypes, but preferably four IgG isotypes, particularly preferably IgG1 and IgG2 are. 減少したエフェクタ機能をもつように突然変異を受けた定常領域を伴う抗体、例えば、(その全体が参考として内含されている)米国特許第5,834,597号に記述されているIgG2M3及びその他のIgG2突然変異体が内含される。 Antibodies with constant regions mutated to have reduced effector functions, for example, (the entirety of which is incorporated by reference) are described in U.S. Pat. No. 5,834,597 IgG2M3 and other IgG2 mutant the body is entailed. 好ましい態様においては、本発明における未修飾抗体R及び修飾された抗体は、ヒトIgGの重鎖定常領域を含む。 In a preferred embodiment, unmodified antibody R and the modified antibodies in the present invention comprises a heavy chain constant region of human IgG.

本発明は、IgGクラスの重鎖定常領域を含むあらゆる抗体、好ましくはIgG1、IgG2、IgG2M3、IgG3及びIgG4に適用され得る。 The present invention, any antibody comprising heavy chain constant regions of IgG class, preferably may be applied to IgG1, IgG2, IgG2M3, IgG3 and IgG4. かかる抗体の重鎖可変領域は、選択されたあらゆる抗体から誘導可能である。 Heavy chain variable regions of such antibodies can be derived from any antibodies selected. 本明細書に開示されている抗体の例には、ヒト抗B型肝炎ウイルス抗体OST577の重鎖及び軽鎖可変領域(Ehrlich et al., Hum.抗体ハイブリドーマ3:2-7(1992))、ヒトラムダ-2の軽鎖定常領域及びそれぞれヒトIgG1及びIgG2M3の重鎖定常領域を含むOST577-IgG1及びOST577-IgG2M3が内含される。 Examples of antibodies disclosed herein, the heavy and light chain variable regions of the human anti-hepatitis B virus antibody OST577 (Ehrlich et al, Hum Antibodies Hybridomas 3:.. 2-7 (1992)), human lambda OST577-IgG1 and OST577-IgG2M3 light chain constant region and each comprising a heavy chain constant region of human IgG1 and IgG2M3 -2 is entailed. 同様に本明細書で開示されているのは、ヒト型化抗-HLA-DRβ鎖対立遺伝子抗体HulD10の重鎖及び軽鎖可変領域(Kostelny et al., Int J. Cancer93:556-565(2001))、ヒトカッパの軽鎖定常領域及びそれぞれヒトIgG1及びIgG2M3の上述の重鎖定常領域を含むHulD10-IgG1及びHulD10-IgG2M3である。 Also disclosed herein, the heavy and light chain variable region (Kostelny et al of the humanized anti-HLA-DR beta chain allele antibodies HulD10, Int J. Cancer93:. 556-565 (2001 )), a Hu1D10-IgG1 and Hu1D10-IgG2M3 comprising a heavy chain constant region of the above light chain constant region and, respectively human IgG1 and IgG2M3 human kappa.

本明細書に開示されている本発明のさらなる例示には、IgGクラスの抗体の血清半減期の改変を例示するヒトIgG1、IgG2M3(IgG2の遺伝的に改変された変異体)、IgG3及びIgG4抗体の突然変異体が含まれる。 Additional examples of the present invention disclosed herein, a human IgG1 illustrating a modification of the serum half-life of the antibody of IgG class, IgG2M3 (IgG2 genetically modified variants), IgG3 and IgG4 antibodies It includes mutants of. IgG2M3の重鎖の定常領域は、IgG2重鎖定常領域の残基234及び237をアラニンと置換することによりIgG2のものから誘導される。 The constant region of the heavy chain of IgG2M3 is derived from that of IgG2 by replacing residues 234 and 237 of the IgG2 heavy chain constant region and alanine. IgG2M3の重鎖定常領域の生成は、本明細書に参考として内含されている米国特許第5,834,597号の中で開示されている。 Generation of the heavy chain constant region of IgG2M3 is disclosed in U.S. Patent No. 5,834,597 which is incorporated herein by reference.

一般に、本発明の修飾された抗体は、抗原を結合させ(好ましくは免疫特異的に、すなわち特異的抗原-抗体結合を検定するための当該技術分野において周知の免疫検定法により決定されるように、競合して非特異的結合を退け)、かつFcRn結合フラグメントを含有するあらゆる免疫グロブリン分子を内含する。 Generally, the modified antibodies of the present invention, by binding antigen (preferably immunospecifically, i.e. specific antigen - as determined by the well-known immunoassay in the art for assaying the antibody binding , it rejected non-specific binding in competition), and to entailment any immunoglobulin molecule that contain the FcRn binding fragment. かかる抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、2重特異性、多重特異性、ヒト、ヒト型化、キメラ抗体、1本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab′) 2フラグメント、ジスルフィド結合したFvs、及び、V L又はV Hドメインのいずれか又さらには場合によってはFcFn結合ドメインを含有するように工学処理された又はこのドメインに融合された抗原を特異的に結合させる相補的決定領域(CDR)さえも含むフラグメント、が含まれる。 Such antibodies include polyclonal, monoclonal, bispecific, multispecific, human, humanized, chimeric antibodies, single chain antibodies, Fab fragments, F (ab ') 2 fragments, Fvs disulfide bonds and, any addition and even in some cases even engineered or complementary determining regions that specifically binds the fusion antigen in this domain (CDR) to contain FcFn binding domain of a V L or V H domain fragment containing, are included.

本発明の修飾されたIgG分子は、与えられたあらゆる動物のIgGサブクラスを内含し得る。 Modified IgG molecules of the invention may entailment the IgG subclasses of any given animals. 例えば、ヒトにおいては、IgGクラスは、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4を内含し、マウスIgGクラスはIgG1、IgG2a、IgG2b及びIgG3を内含し;ラットIgGクラスは、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、及びIgG3を内含する。 For example, in humans, IgG class, entailment IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4, the mouse IgG class and entailment IgG1, IgG2a, IgG2b, and IgG3; rat IgG class, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c , and entailment the IgG3. 例えばラットIgG2b及びIgG2cといった或る種のIgGサブクラスが、例えばIgG1に比べて高いクリアランス速度を有することがわかっている(Medesan et al., Eur. J. Immunol, 28:2092-2100(1998))。 For example rat IgG2b and certain types of IgG subclass such IgG2c, for example as compared to IgG1 has been found to have a high clearance rate (Medesan et al, Eur J. Immunol, 28:.. 2092-2100 (1998)) . かくして、IgG1以外のIgGサブクラスを用いる場合、IgG1配列と異なる特にC H 2及びC H 3ドメイン内の残基のうちの1又は複数のものを、IgG1のもので置換し、かくしてその他のタイプのIgGのin vivo半減期を増大させることが有利であり得る。 Thus, other than IgG1 case of using IgG subclasses, those 1 or more of the residues in particular C H 2 and C H 3 domains different from the IgG1 sequence, and replaced with that of IgG1, thus other types of increasing the in vivo half-life of the IgG can be advantageous.

本発明の免疫グロブリンは、鳥類及び哺乳動物を含めたあらゆる動物に由来するものであってよい。 Immunoglobulins of the present invention may be derived from any animal, including birds and mammals. 好ましくは、抗体は、ヒト、ゲッ歯類、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ又はニワトリである。 Preferably, the antibodies are human, rodent, donkey, sheep, rabbit, goat, guinea pig, camel, horse or chicken. 本明細書で用いられている通り、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列をもつ抗体を内含し、ヒト免疫グロブリンライブラリから又は以下で記述される通りの及びKucherlapati et alにより米国特許第5,939,598号に記述されている通りの1又は複数のヒト免疫グロブリンについて遺伝子導入型である動物から、単離された抗体を含む。 As used herein, "human" antibodies, and entailment antibodies having the amino acid sequence of a human immunoglobulin, U.S. Pat by and Kucherlapati et al and are as described below or from a human immunoglobulin library from an animal is a transgenic type for one or more human immunoglobulins as described in No. 5,939,598, comprising an isolated antibody.

さらに、本発明の修飾された抗体は、単一特異性、2重特異性、3重特異性又はそれ以上の多重特異性のものであり得る。 Additionally, the modified antibodies of the present invention, monospecific, bispecific, may be of trispecific or more multispecific. 多重特異性抗体は、ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得、そうでなければ、異種ポリペプチド又は固体支持材料といった異種エピトープに特異的でもあり得る。 Multispecific antibodies may be specific for different epitopes of a polypeptide, otherwise, there may be specific for heterologous epitopes, such as a heterologous polypeptide or solid support material. 例えばPCT公報WO93/17715;WO92/08802;WO91/00360;WO92/05793号;Tutt et al., J.Immunol. 147:60-69(1991);米国特許第4,474,893;4,714,681;4,925,648;5,573,920;5,601,819号;Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553(1992)を参照のこと。 For example PCT publication WO93 / 17715; WO92 / 08802; WO91 / 00360; WO92 / 05793 Patent; Tutt et al, J.Immunol 147:.. 60-69 (1991); U.S. Patent 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819 .. No.; Kostelny et al, J. Immunol 148: 1547-1553 (1992) reference.

本発明の修飾された抗体は、その他の形ですなわち共有付着によって抗体が抗原を結合させかつ/又は抗イディオタイプ応答を生成することが妨げられないように抗体に対するあらゆるタイプの分子の共有付着によって修飾される誘導体を内含する。 Modified antibodies of the present invention, a otherwise i.e. antibody by covalent attachment is by covalent attachment of any type of molecule to the antibody such that unimpeded to produce a combined allowed and / or an anti-idiotypic response antigen to entailment modified derivatives. 例えば、制限的意味はないものの、抗体誘導体は、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護/遮断基による誘導体化、タンパク質分解分割、細胞リガンド又はその他のタンパク質に対するリンケージなどによって修飾された抗体を内含する。 For example, but not by way of limitation, the antibody derivatives include, for example glycosylation, acetylation, pegylation, phosphorylation, amidation, derivatization by known protecting / blocking groups, proteolytic split, for a cellular ligand or other protein to entailment an antibody modified such as by linkages. 数多くの化学的修飾のいずれかを、特異的化学的分割、アセチル化、ホルミル化、代謝性ツニカマイシン合成などを含めた(ただしこれらに制限されるわけではない)既知の技術により実施することができる。 Any of a number of chemical modification, specific chemical resolution may be performed by acetylation, formylation, including such metabolic tunicamycin synthesis (but not limited to) known techniques . さらに、誘導体は、1又は複数の従来のアミノ酸を含有し得る。 Additionally, the derivative may contain one or more conventional amino acid.

本発明で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え体及びファージ提示技術又はそれらの組合せの使用を含めた当該技術分野において既知の多様な技術を用いて調製可能である。 Monoclonal antibodies useful in the present invention, a hybridoma can be prepared using a variety of techniques known in the art, including the use of recombinant and phage display technologies, or a combination thereof. 例えば、モノクローナル抗体は、当該技術分野において既知であり例えばHarlow及びLane「抗体:実験室マニュアル」Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1988)内;Hammerling et al.,「モノクローナル抗体及びT-細胞ハイブリドーマ」Elsevier New York(1981)、p563〜681内(これらは両方共本明細書にその全体が参考として内含されている)で教示されているものを含めたハイブリドーマ技術を用いて産生可能である。 For example, the monoclonal antibodies are known in the art for example Harlow and Lane. "Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1988) in; Hammerling et al, "Monoclonal Antibodies and T- Cell Hybridomas "Elsevier New York (1981), can be produced using hybridoma techniques including those taught in the P563~681 (their entirety both herein are incorporated by reference) .

本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」という語は、ハイブリドーマ技術を通して産生された抗体に制限されない。 The term "monoclonal antibody" as used herein is not limited to antibodies produced through hybridoma technology. 「モノクローナル抗体」という語はあらゆる真核生物、原核生物又はファージクローンを含めた、単一のクローンから誘導される抗体を意味し、その産生方法を意味しない。 The term "monoclonal antibody" all eukaryotes, including prokaryotic, or phage clone, refers to an antibody derived from a single clone, does not mean its production method.

ハイブリドーマ技術を用いた特異的抗体のための産生及びスクリーニング方法は、日常的であり、当該技術分野において周知である。 Production and screening methods for specific antibodies using hybridoma technology are routine and well known in the art. 制限的意味のない例においては、マウスは、問題の抗原又はかかる抗原を発現する細胞で免疫化され得る。 In a non-limiting example, mice can be immunized with cells expressing the antigen or such antigen of interest. ひとたび免疫応答が検出された、例えばマウス血清内でその抗原に特異的な抗体が検出されたならば、マウスの脾臓は収獲され脾細胞は単離される。 Once an immune response is detected, e.g., antibodies specific for the antigen in the mouse serum was detected, the mouse spleen splenocytes are harvested are isolated. 次に脾細胞は周知の技術により、任意の適切な骨髄腫細胞に融合される。 Then spleen cells by well known techniques, fused to any suitable myeloma cells. ハイブリドーマが選択され、制限希釈によりクローニングされる。 Hybridomas are selected and cloned by limiting dilution. ハイブリドーマクローンはその後、抗原を結合する能力をもつ抗体を分泌する細胞のための当該技術分野において既知の方法によって検定される。 Thereafter hybridoma clones are assayed by methods known in the art for cells that secrete antibodies capable of binding the antigen. 陽性ハイブリドーマクローンをマウスに腹腔内接種することによって、一般に高レベルの抗体を含有する腹水を、生成することができる。 By inoculating intraperitoneally with positive hybridoma clones mice Ascites fluid, which generally contains high levels of antibodies, can be generated.

特異的エピトープを認識する抗体フラグメントも同様に本発明で有用であり得、周知の技術によって生成可能である。 May be useful in the present invention is similarly recognize antibody fragments specific epitopes can be generated by known techniques. 例えば、(Fabフラグメントを産生するための)パパイン又は(F(ab′) 2フラグメントを産生するための)ペプシンといった酵素を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク質分解分割により、Fab及びF(ab′) 2フラグメントを産生することができる。 For example, (Fab fragment to produce) papain or (F (ab ') 2 fragments for the production) using enzymes such as pepsin, the proteolytic splitting of immunoglobulin molecules, Fab and F (ab') capable of producing 2 fragments. F(ab′) 2フラグメントは、完全軽鎖及び重鎖の可変領域、CH1領域及びヒンジ領域を含有する。 F (ab ') 2 fragments contain the complete light chain and the variable region of the heavy chain, CH1 region and the hinge region.

例えば、ファージ提示を含めた当該技術分野において既知のさまざまな表示方法を用いて、抗体を生成することもできる。 For example, using known various display methods in the art, including phage display, it is also possible to generate antibodies. ファージ提示方法においては、官能性抗体ドメインは、それをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面上で表示される。 In phage display methods, functional antibody domains are displayed on the surface of phage particles which carry the polynucleotide sequences encoding them. 特定の実施形態においては、かかるファージは、リパートリ又は組合せ抗体ライブラリ(例えばヒト又はマウス)から発現されたFab及びFv又はジスルフィド結合で安定化されたFvといった抗原結合ドメインを表示するために利用できる。 In certain embodiments, such phage can be utilized to display the Ripatori or combinatorial antibody library (e.g., human or murine) antigen binding domain such as stabilized Fv in expressed Fab and Fv or disulfide bonds from. 問題の抗原を結合させる抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば、標識された抗原又は固体表面又はビーズに結合又は捕捉された抗原を用いて、抗原で選択又は同定可能である。 Phage expressing an antigen binding domain to bind the antigen of interest, for example, using labeled antigen or a solid surface or bound or captured antigen on the beads can be selected or identified with antigen. これらの方法で使用されるファージはfd及びMBを含め、標準的に線状ファージである。 Phage used in these methods, including fd and MB, which is a standard in filamentous phage. 抗原結合ドメインは、ファージ遺伝子III又は遺伝子VIIIタンパク質のいずれかに対する組換えにより融合されたタンパク質として発現される。 The antigen binding domains are expressed as a protein fused recombinantly to either the phage gene III or gene VIII protein.

あるいは、本発明の免疫グロブリンの修飾されたFcRn結合部分は同様に、ファージ提示系内でも発現され得る。 Alternatively, immunoglobulin modified FcRn binding portion of the present invention also may be expressed in a phage display system. 本発明の免疫グロブリン又はフラグメントを作るために使用可能なファージ提示方法の例としては、各々本明細書にその全体が参考として内含されている Brinkman et al., J.Immunol. Methods 182;41-50(1995);Ames et al., J.Immunol, Methods 184:177-186(1995);Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958(1994);Persic et al., Gene 187:9-18(1997);Burton et al., 免疫学における進歩57:191-280(1994);PCT出願第PCT/GB91/01134;PCT公報WO90/02809、WO91/10737;WO92/01047;WO92/18619;WO93/11236;WO95/15982;WO95/20401号及び米国特許第5,698,426;5,223,409;5,403,484;5,580,717;5,427,908;5,750,753;5,821,047;5,571,698;5,427,908;5,516,637;5,780,225;5,658,727;5,733,743及び5,969,108号の中で開示されたものが含まれる。 Examples of phage display methods that can be used to make an immunoglobulin or fragments of the present invention, each herein in its entirety is incorporated by reference Brinkman et al, J.Immunol Methods 182;.. 41 . -50 (1995); Ames et al, J.Immunol, Methods 184:.. 177-186 (1995); Kettleborough et al, Eur J. Immunol 24:. 952-958 (1994); Persic et al,. Gene 187:. 9-18 (1997); Burton et al, advances in immunology 57: 191-280 (1994); PCT application No. PCT / GB91 / 01134; PCT Publication WO90 / 02809, WO91 / 10737; WO92 / 01047 ; WO92 / 18619; WO93 / 11236; WO95 / 15982; WO95 / 20401 and U.S. Patent 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; of 5,733,743 and No. 5,969,108 They include those disclosed in the medium.

上述の参考文献に記述されているように、ファージ選択の後、ファージからの抗体コーディング領域は単離され、ヒト抗体を含む全抗体又は任意のその他の所望のフラグメントを生成するために使用され、例えば以下で詳述されている通り哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及び細菌を含むあらゆる所望の宿主の中で発現される。 As described in the above references, after phage selection, the antibody coding regions from the phage are isolated and used to generate whole antibodies, or any other desired fragments, including human antibodies, for example as mammalian cells are described in more detail below, insect cells, is expressed in plant cells, in any desired host, including yeast and bacteria. 例えば、Fab、Fab′、及びF(ab′) 2フラグメントを組換えにより産生するための技術を、各々その全体が参考として内含されているPCT公報WO92/22324号;Mullinax et al., Bio Techniques 12:864-869(1992);Sawai et al., Amer. J.Reprod. Immunol. 34:26-34(1995);及びBetter et al., Science240:1041-1043(1988)の中で開示されているもののような当該技術分野において既知の方法を用いて利用することもできる。 For example, Fab, Fab ', and F (ab') 2 technology to produce recombinantly fragments, each in its entirety PCT Publication WO92 / No. 22324 are incorporated by reference;. Mullinax et al, Bio Techniques 12: 864-869 (1992); Sawai et al, Amer J.Reprod Immunol 34:..... 26-34 (1995); and Better et al, Science240: disclosed in the 1041-1043 (1988) It can also be employed using methods known in the art, such as those. 1本鎖Fvs及び抗体を産生するために使用可能な技術の例としては、米国特許第4,964,778及び5,258,498号;Huston et al., 酵素学における方法、203:46-88(1991);Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:7995-7999(1993);及びSkerra et al., Science240:1038-1040(1988)の中で記述されているものが含まれる。 Examples of usable techniques to produce single chain Fvs and antibodies, U.S. Pat. Nos. 4,964,778 and 5,258,498; Huston et al, methods in Enzymology, 203:. 46-88 (1991); Shu et al ., Proc Natl Acad Sci 90:..... 7995-7999 (1993); and Skerra et al, Science240: include those described in 1038-1040 (1988).

特定の実施形態においては、修飾された抗体は、in vivoでの治療用及び/又は予防用の用途を有する。 In certain embodiments, the modified antibodies have use for therapeutic and / or prophylactic in in vivo. このように修飾可能な治療用及び予防用の抗体の例としては、ヒト型化抗呼吸器合胞体ウイルス(RSV)モノクローナル抗体であるSYNAGIS(商標)(Medimmune, MD);転移性乳ガン患者の治療用のヒト型化抗-HER2モノクローナル抗体であるHERCEPTIN(商標)(Trastuzumab)(Genentech, CA);クローン病患者の治療のためのキメラ抗-TNF-α-モノクローナル抗体であるREMICADE(商標)(インフリキシマブ)(Centocor, PA);血塊形成防止用の血小板上の抗-糖タンパク質IIb/IIIaレセプタであるREOPRO(商標)(アブシキシマブ)(Centcor);急性賢同種移植拒絶反応の予防用の免疫抑制性ヒト型化抗-CD25モノクローナル抗体であるZENA-PAX(商標)(ダクリツマブ)(Roche Pharmaceuticals, スイス)が含まれるが、これらに制限されるわけではない。 Examples of antibodies of such modifiable therapeutic and prophylactic humanized an anti-respiratory syncytial virus (RSV) monoclonal antibody SYNAGIS (TM) (Medimmune, MD); metastatic breast cancer patients treated it is a humanized anti -HER2 monoclonal antibodies of use HERCEPTIN (TM) (Trastuzumab) (Genentech, CA); which is a chimeric anti-TNF-alpha-monoclonal antibody REMICADE (TM) for the treatment of Crohn's disease patients (infliximab ) (Centocor, PA); the platelets for clot formation preventing anti - glycoprotein IIb / IIIa is a receptor REOPRO (TM) (abciximab) (Centcor); immunosuppressive human for the prevention of acute Ken allograft rejection type conductivity is an anti -CD25 monoclonal antibody ZENA-PAX (TM) (daclizumab) (Roche Pharmaceuticals, Switzerland) but are not limited thereto.

その他の例としては、ヒト型化抗CD18F(ab′)2(Genetech);ヒト型化抗-CD18F(ab′)2であるCDP860(Celltech, UK);CD4と融合された抗-HIVgp120抗体であるPRO542(Progenics/Genzyme Transgenis);ヒト抗B型肝炎ウイルス抗体であるOSTAVIR TM (Protein Design Labs/Novartis); ヒト型化抗-CMVIgG1抗体であるPROTOVIR TM (Protein Design Labs/Novaritis);抗-CD14抗体であるIC14(ICOS);ヒト型化抗-VEGF IgG1抗体であるAVASTIN TM (Genetech);キメラ抗-EGFRIgG抗体であるERBITUX TM (Im Clone Systems);ヒト型化抗αVβ3インテグリン抗体であるVITAXIN TM (Applied Molecular Evolutions / Medimmune);ヒト型化抗CD52IgG1抗体であるCampath-1H/LDP-O3(Leukosite);ヒト型化抗CD33IgG抗体であるZAMYL TM (Protein Design Labs / Kanebo);キメラ抗CD20IgG1抗体であるRITUXAN TM (IDEC Pharmaceuticals / Genentech, Roche / Zenyaku);ヒト型化抗CD22IgG抗 Other examples include humanized anti CD18F (ab ') 2 (Genetech); humanized anti -CD18F (ab') a 2 CDP860 (Celltech, UK); CD4 and fusion anti -HIVgp120 antibody there PRO542 (Progenics / Genzyme Transgenis); human anti hepatitis B virus antibody in a OSTAVIR TM (Protein Design Labs / Novartis ); PROTOVIR TM (Protein Design Labs / Novaritis) a humanized anti -CMVIgG1 antibodies; anti -CD14 an antibody IC14 (ICOS); AVASTIN TM ( Genetech) a humanized anti -VEGF IgG1 antibody; ERBITUX TM (Im Clone Systems) is a chimeric anti -EGFRIgG antibodies; VITAXIN TM is a humanized anti-αVβ3 integrin antibody a chimeric anti CD20IgG1 antibody; (Applied Molecular Evolutions / Medimmune) ; a humanized anti CD52IgG1 antibody Campath-1H / LDP-O3 ( Leukosite); ZAMYL TM (Protein Design Labs / Kanebo) is a humanized anti CD33IgG antibody there RITUXAN TM (IDEC Pharmaceuticals / Genentech, Roche / Zenyaku); humanized anti CD22IgG anti 体であるLYMPHOCIDE TM (Immuno medics); A body LYMPHOCIDE TM (Immuno medics);

ヒト型化抗-HLA-DR抗体であるREMITOGEN TM (Protein Design Labs);ヒト抗-IL8抗体であるABX-IL8(Abgenix);ヒト型化IgG1抗体であるRAPTIVA TM (Genetech / Xoma);ヒト型化抗ICAM3抗体であるICM3(ICOS);霊長類化抗CD80抗体であるIDEC-114(IDEC Pharmaceuticals / Mitsubishi);ヒト型化抗CD40L抗体であるIDEC-131(IDEC/Eisai);霊長類化抗-CD4抗体であるIDEC151(IDEC);霊長類化抗-CD23抗体であるIDEC-152(IDEC/Seikagaku);ヒト型化抗-CD3IgGであるNUV10N TM (Protein Design Labs);ヒト型化抗補体因子5(C5)抗体である5G1.1(Alexion Pharmaceuticals):ヒト抗-TNF-α抗体であるHUMIRA TM (CAT/BASF);ヒト型化抗-TNF-αFabフラグメントであるCDP870(Celltech);霊長類化抗CD4 IgGl抗体であるIDEC-151(IDEC Pharmaceuticals / Smith-Kline Beecham);ヒト抗-CD4IgG抗体であるMDX-CD4(Medarex / Eisai / Genmab);ヒト型化抗-TNF-αIgG4抗 Humanized anti-HLA-DR antibody at a REMITOGEN TM (Protein Design Labs); ABX-IL8 which is a human anti -IL8 antibody (Abgenix); RAPTIVA TM (Genetech / Xoma) a humanized IgG1 antibody; humanized anti is ICAM3 antibody ICM3 (ICOS); IDEC-114 is a primatized anti-CD80 antibody (IDEC Pharmaceuticals / Mitsubishi); a humanized anti-CD40L antibody IDEC-131 (IDEC / Eisai); primatized anti a -CD4 antibody IDEC151 (IDEC); a primatized anti -CD23 antibody IDEC-152 (IDEC / Seikagaku) ; NUV10N TM (Protein Design Labs) is a humanized anti -CD3IgG; humanized anti-complement is a factor 5 (C5) antibody 5G1.1 (Alexion Pharmaceuticals): human anti-TNF-alpha antibody in which HUMIRA TM (CAT / BASF); a humanized anti -TNF-αFab fragment CDP870 (Celltech); primates IDEC-151 is a Ruika anti CD4 IgGl antibody (IDEC Pharmaceuticals / Smith-Kline Beecham); human is an anti -CD4IgG antibody MDX-CD4 (Medarex / Eisai / Genmab); humanized anti -TNF-αIgG4 anti 体であるCDP571(Celltech); It is a body CDP571 (Celltech);

ヒト型化抗-α4β7抗体であるLDP-02(Leuko Site / Genetech);ヒト抗-CD4IgG抗体であるOrtho Clone OKT4A(Ortho Biotech);ヒト型化抗-CD40L IgG抗体であるANTOVA TM (Biogen);ヒト型化抗-VLA-4IgG抗体であるANTEGREN TM (Elan);ヒト-抗-CD64(FcγR)抗体であるMDX-33(Medarex / Centeon);ヒト型化抗-IL-5IgG4抗体であるSCH55700(Celltech / Schering);それぞれヒト型化抗IL-5及びIL-4抗体である細胞-240563及び細胞-240683(Smith Kline Beecham);ヒト型化抗-IgEIgG1抗体であるrhuMab-E25(Genentech / Novartis / Tanox Biosystems);霊長類化抗-CD23抗体であるIDEC152(IDEC Pharmaceuticals);キメラ抗CD25 IgG1抗体であるSIMULECT TM (Novartis Phamaceuticals);ヒト型化抗-β2-インテグリンIgG抗体であるLDP-01(Leukosite);ヒト抗-TGF-β2-抗体であるCAT-152(Cambridge Antibody Technology);及びキメラ抗-第VII因子抗体であるCorsevinM(C LDP-02 is a humanized anti -α4β7 antibody (Leuko Site / Genetech); human is an anti -CD4IgG antibody Ortho Clone OKT4A (Ortho Biotech); a humanized anti-CD40L IgG antibody ANTOVA TM (Biogen); humanized anti -VLA-4IgG antibody in which ANTEGREN TM (Elan); human - MDX-33 (Medarex / Centeon ) an anti -CD64 (FcγR) antibody; a humanized anti -IL-5IgG4 antibody SCH55700 ( Celltech / Schering); each cell -240563 and cell -240683 a humanized anti-IL-5 and IL-4 antibody (Smith Kline Beecham); a humanized anti -IgEIgG1 antibody rhuMab-E25 (Genentech / Novartis / Tanox Biosystems); a primatized anti -CD23 antibody IDEC152 (IDEC Pharmaceuticals); which is a chimeric anti-CD25 IgG1 antibody SIMULECT TM (Novartis Phamaceuticals); LDP -01 (Leukosite a humanized anti -β2- integrin IgG antibody ); human anti -TGF-beta2-antibody in which CAT-152 (Cambridge antibody Technology); and chimeric anti - a factor VII antibody CorsevinM (C entocor)がある。 entocor) there is.

本発明は、in vivo半減期を増大させるためのこれらの及びその他の治療用抗体の修飾を可能にし、治療用抗体のより少ない有効投薬量の投与及び/又はより頻度の少ない投薬を可能にする。 The present invention permits modification of these and other therapeutic antibodies to increase the in vivo half-life, allowing less of the effective dose administered and / or less dosage frequent than the therapeutic antibody . in vivo半減期を増大させるためのこのような修飾は、診断用免疫グロブリンを改善させるためにも同じく有用であり得る。 Such modification to increase in vivo half-life may be also useful to improve the diagnostic immunoglobulins. 例えば、診断用抗体の増大した血清半減期は、充分な診断感度を達成するためのより少ない用量の投与を可能にし得る。 For example, increased serum half-life of a diagnostic antibody may permit administration of lower doses to achieve sufficient diagnostic sensitivity. あるいは、診断用抗体の急速なクリアランスが望まれる利用分野においては、減少した血清半減期が有利であり得る。 Alternatively, in applications where rapid clearance of a diagnostic antibody is desired, it decreased serum half-life may be advantageous.

本明細書で開示されているのは、位置250、314及び428が強調されている状態の、その重鎖可変領域(配列番号1)(OST577-VH)及び定常領域(配列番号2)(IgG2M3-CH)のアミノ酸配列及びその軽鎖可変領域(配列番号4)(OST577-VL)及び定常領域(配列番号5)(LAMDA2-CL)のアミノ酸配列を含む、OST577-IgG2M3のアミノ酸配列である(図3A)。 Disclosed herein is a position 250, 314, and state 428 is highlighted, the heavy chain variable region (SEQ ID NO: 1) (OST577-VH) and constant region (SEQ ID NO: 2) (IgG2M3 comprising the amino acid sequence and amino acid sequence of the light chain variable region (SEQ ID NO: 4) (OST577-VL) and constant region (SEQ ID NO: 5) (LAMDA2-CL) of -CH), the amino acid sequence of OST577-IgG2M3 ( Figure 3A).
本明細書に開示されているのは、位置250、314及び428が強調された状態の、OST577-IgG1(配列番号3)の重鎖定常領域のアミノ酸配列である(図3C)。 Disclosed herein is a state where the position 250, 314 and 428 are highlighted, which is the amino acid sequence of the heavy chain constant region of OST577-IgG1 (SEQ ID NO: 3) (FIG. 3C).

本発明は、未修飾抗体中に存在するものと異なるもう1つのアミノ酸残基で重鎖定常領域由来のアミノ酸残基250又は428が置換されている、未修飾抗体と比較して増大したFcRn結合親和力及び/又は増大した血清半減期を有する修飾された抗体を提供している。 The present invention, unmodified antibody heavy chain constant region amino acid residues from 250 or different from those another amino acid residue present in 428 is replaced, FcRn binding was increased compared to the unmodified antibody It provides for a modified antibody having an affinity and / or increased serum half-life. 好ましくは、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基250は、グルタミン酸又はグルタミンで置換される。 Preferably, amino acid residue 250 from the heavy chain constant region is substituted with glutamic acid or glutamine. あるいは、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428は、フェニルアラニン又はロイシンで置換される。 Alternatively, amino acid residue 428 from the heavy chain constant region is substituted with phenylalanine or leucine.

1つの例においては、前記未修飾抗体は、OST577-IgG2M3又はOST577-IgG1を含む(ただしこれに制限されるわけではない)IgG1又はIgG2又はIgG2M3分子の重鎖定常領域を含んで成る。 In one example, the unmodified antibody, (but are not limited, however to) containing OST577-IgG2M3 or OST577-IgG1 comprising a heavy chain constant region of IgG1 or IgG2, or IgG2M3 molecule. IgG1、IgG2及びIgG2M3は、位置250にトレオニン残基を位置428にメチオニン残基を有する。 IgG1, IgG2 and IgG2M3 have a methionine residue at position 428 to threonine residue at position 250. 好ましくは、位置250にあるトレオニン残基は、グルタミン酸(T250E)又はグルタミン(T250Q)で置換され、位置428にあるメチオニン残基はフェニルアラニン(M428F)又はロイシン(M428L)で置換される。 Preferably, the threonine residue at position 250 is substituted with glutamic acid (T250E) or glutamine (T250Q), methionine residue at position 428 is substituted with phenylalanine (M428F) or leucine (M428L). 図3Bは、T250E(配列番号13)、T250Q(配列番号23)、M428F(配列番号52)又はM428L(配列番号57)のアミノ酸置換を有する修飾されたIgG2M3の重鎖定常領域のアミノ酸配列を開示している。 Figure 3B, T250E (SEQ ID NO: 13), T250Q (SEQ ID NO: 23), M428F (SEQ ID NO: 52) or M428L discloses the amino acid sequence of the heavy chain constant region of the modified IgG2M3 having the amino acid substitution (SEQ ID NO: 57) are doing. 図3Cは、T250D(配列番号67)、T250E(配列番号68)、T250Q(配列番号69)、M428F(配列番号70)、又はM428L(配列番号71)のアミノ酸置換を有する修飾されたIgG1の重鎖の定常領域のアミノ酸配列を開示している。 Figure 3C, T250D (SEQ ID NO: 67), T250E (SEQ ID NO: 68), T250Q (SEQ ID NO: 69), M428F (SEQ ID NO: 70), or M428L of IgG1 modified with amino acid substitutions of (SEQ ID NO: 71) Heavy It discloses the amino acid sequence of the constant region of the chain.

本発明は、未修飾抗体と比べて増大したFcRn結合親和力及び/又は増大した血清半減期を有する修飾された抗体を提供する。 The present invention provides for a modified antibody having a binding affinity for FcRn and / or increased serum half-life increased as compared to the unmodified antibody. アミノ酸修飾は、以下の置換のうちのいずれか1つであり得る; Amino acid modifications may be any one of the following substitutions;
1) 重鎖定常領域由来のアミノ酸残基250が、グルタミン酸で置換され、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428がフェニルアラニンで置換される。 1) amino acid residue 250 from the heavy chain constant region is substituted with glutamic acid and amino acid residue 428 from the heavy chain constant region is substituted with phenylalanine.
2) 重鎖定常領域由来のアミノ酸残基250がグルタミンで置換され、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428がフェニルアラニンで置換される。 2) amino acid residue 250 from the heavy chain constant region is substituted with glutamine and amino acid residue 428 from the heavy chain constant region is substituted with phenylalanine.
3) 重鎖定常領域由来のアミノ酸残基250がグルタミンで置換され、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428がロイシンで置換される。 3) amino acid residue 250 from the heavy chain constant region is substituted with glutamine and amino acid residue 428 from the heavy chain constant region is substituted with leucine.

T250E/M428F(配列番号72)、T250Q/M428F(配列番号73)又はT250Q/M428L(配列番号74)の二重アミノ酸置換を有する修飾されたIgG2M3の重鎖定常領域のアミノ酸配列は、図3Bに開示されている。 T250E / M428F (SEQ ID NO: 72), T250Q / M428F (SEQ ID NO: 73) or T250Q / M428L (SEQ ID NO: 74) amino acid sequence of the modified heavy chain constant region of IgG2M3 were having a double amino acid substitutions, in FIG. 3B It has been disclosed.
T250E/M428F(配列番号75)又はT250Q/M428L(配列番号76)の二重アミノ酸置換を有する修飾されたIgG1の重鎖定常領域のアミノ酸配列は図3Cに開示されている。 T250E / M428F (SEQ ID NO: 75) or T250Q / M428L (SEQ ID NO: 76) amino acid sequence of the modified heavy chain constant region of IgG1 were having a double amino acid substitutions disclosed in Figure 3C.
位置250及び428に記述された二重アミノ酸置換を伴う修飾された抗体は、未修飾抗体のものに比べてFcRnに対する非常に高い結合親和力を表示する。 The modified antibodies with dual amino acid substitutions described in positions 250 and 428, displays a very high binding affinity for FcRn compared to that of unmodified antibody.
本発明の好ましい実施形態においては、修飾された抗体のFcRn結合親和力及び/又は血清半減期は、少なくとも約30%、50%、80%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍又は100倍増大する。 In a preferred embodiment of the present invention, FcRn binding affinity and / or serum half-life of the modified antibody is at least about 30%, 50%, 80%, 2-fold, 3-fold, 4-fold, 5-fold, 10-fold , 15-fold, 20-fold, 25-fold, 30-fold, 40-fold, 50-fold, 60-fold, 70-fold, 80-fold, increasing 90-fold or 100-fold.

本発明は、未修飾抗体中に存在するものと異なるもう1つのアミノ酸で重鎖定常領域由来のアミノ酸残基314が置換されている、未修飾抗体と比較して減少したFcRn結合親和力及び/又は減少した血清半減期を有する修飾された抗体を提供している。 The present invention is a heavy chain constant region amino acid residues from 314 to that present in the unmodified antibody in different another amino acid is substituted, FcRn binding affinity and / or decreased compared to the unmodified antibody It provides for a modified antibody having a reduced serum half-life. 位置314にアミノ酸置換を有する修飾された抗体は減少した結合親和力を表示することが示されてきており1つの抗体の減少した血清半減期が望まれるならば位置314を修飾すべきであることを示唆している。 That modified antibodies in position 314 with an amino acid substitution should modify position 314 if decreased serum half-life of reduced binding affinity one antibody have been shown to display a is desired It suggests. 好ましくは、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基は、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンで置換されている。 Preferably, amino acid residues from the heavy chain constant region is alanine, arginine, aspartic acid, asparagine, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, or It has been replaced by valine. より好ましくは、アミノ酸置換は、位置314でのロイシンからアラニン又はアルギニンへのものである。 More preferably, amino acid substitutions are those leucine at position 314 to alanine or arginine. 例中で示されているように、ロイシンからアルギニンへの置換を含む修飾されたOST577-IgG2M3のFcRn結合親和力は、未修飾OST577-IgG2M3のものの11%まで減少させられる。 As shown in the examples, FcRn binding affinity of the modified OST577-IgG2M3 comprising a substitution from leucine to arginine is reduced to 11% of that of the unmodified OST577-IgG2M3.

図3Bに示されているように、L314Aは、位置314でロイシンからアラニンへのアミノ酸置換を有する、修飾されたIgG2M3の重鎖定常領域のアミノ酸配列を表わしている(配列番号29)。 As shown in Figure 3B, L314A has an amino acid substitution of alanine for leucine at position 314 represents the amino acid sequence of the heavy chain constant region of the modified IgG2M3 (SEQ ID NO: 29). L314Rは、位置314でロイシンからアルギニンへのアミノ酸置換を有する、修飾されたIgG2M3の重鎖定常領域のアミノ酸配列を表わしている(配列番号42)。 L314R has an amino acid substitution of arginine for leucine at position 314 represents the amino acid sequence of the heavy chain constant region of the modified IgG2M3 (SEQ ID NO: 42).

本発明は、(1)重鎖定常領域由来のアミノ酸残基250が、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、リジン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン又はチロシンで置換されている、又は(2)重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、又はバリンで置換されている、未修飾抗体と比べて減少したFcRn結合親和力及び/又は減少した血清半減期を有する修飾された抗体を提供している。 The present invention is, (1) amino acid residue 250 from the heavy chain constant region is substituted with arginine, asparagine, aspartic acid, lysine, phenylalanine, proline, it is substituted with tryptophan, or tyrosine, or (2) from the heavy chain constant region amino acid residue 428, as compared alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, lysine, proline, serine, threonine, tyrosine, or valine at is substituted, the unmodified antibody It provides for a modified antibody having a reduced binding affinity for FcRn and / or reduced serum half-life. 好ましくは、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基250は、アスパラギン酸で置換され、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428は、グリシンで置換されている。 Preferably, amino acid residue 250 from the heavy chain constant region is substituted with aspartic acid, amino acid residue 428 from the heavy chain constant region is substituted with glycine. このようなアミノ酸置換は、抗体の血清半減期を劇的に減少させることができる。 Such amino acid substitutions, can dramatically reduce the serum half-life of the antibody. 例に示されていうように、かかるアミノ酸置換を有する修飾されたOST577-IgG2M3のFcRnに対する結合親和力は、未修飾OST577-IgG2M3のものの約5〜7%にまで減少させられる。 As referred shown in Example, binding affinity for the modified OST577-IgG2M3 of FcRn having such amino acid substitutions is reduced to about 5-7% of that of the unmodified OST577-IgG2M3.

図3Bに示されているように、T250Dは、位置250でトレオニンからアスパラギン酸へのアミノ酸置換を有する修飾されたIgG2M3の重鎖定常領域のアミノ酸配列を表わしている(配列番号12)。 As shown in Figure 3B, T250D depicts the amino acid sequence of the heavy chain constant region of the modified IgG2M3 having the amino acid substitution from threonine to aspartic acid at position 250 (SEQ ID NO: 12). M428Gは、位置428でメチオニンからグリシンへのアミノ酸置換を有する修飾されたIgG2M3の重鎖定常領域のアミノ酸配列を表わしている(配列番号53)。 M428G depicts the amino acid sequence of the heavy chain constant region of the modified IgG2M3 having the amino acid substitution from methionine to glycine at position 428 (SEQ ID NO: 53).
本発明の好ましい実施形態においては、前記修飾された抗体のFcRn結合親和力及び/又は血清半減期は、少なくとも約30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%又は99%だけ減少させられる。 In a preferred embodiment of the present invention, FcRn binding affinity and / or serum half-life of said modified antibody is at least about 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90 %, 95%, 97%, is reduced by 98% or 99%.

本発明は、本明細書で記述されている修飾されたのIgG抗体好ましくは本明細書で記述されているアミノ酸置換をもつ修飾されたのIgG1、IgG2又はIgG2M3抗体の重鎖定常領域、Fc領域又はC H 2-C H 3領域を内含する。 The present invention is a heavy chain constant region of the modified of IgG1, IgG2 or IgG2M3 antibodies preferably IgG antibodies of modified are described herein have an amino acid substitutions described herein, Fc region or entailment the C H 2-C H 3 region.
本発明は同様に、配列番号10〜76のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含むポリペプチドをも内含している。 The present invention likewise has entailment also polypeptides comprising any amino acid sequence of one of SEQ ID NO: 10-76. 好ましい実施形態においては、これらのポリペプチドは、突然変異を受けたIgG1、IgG2又はIgG2M3定常領域である。 In a preferred embodiment, these polypeptides are IgG1, IgG2, or IgG2M3 constant regions mutated.

本発明の修飾された抗体の重鎖定常領域は、所望のハイブリッド重鎖を生成するため任意の選択された抗体の重鎖可変領域に対しリンクされ得る。 Heavy chain constant region of the modified antibody of the present invention may be linked to the heavy chain variable region of any selected antibody to generate the desired hybrid heavy chain. 選択された抗体の例としては、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、HSV、CD3、CD33、CMV及びIFN-γに対する抗体が含まれるが、これらに制限されるわけではない。 Examples of the selected antibodies, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, HSV, CD3, CD33, including but antibodies to CMV and IFN-gamma, being limited thereto Absent. さらに、可変領域は、ヒト、霊長類又はげっ歯類といったあらゆる種の天然の抗体のものであり得る。 Further, the variable region may be one person, of any species of native like primate or rodent antibodies. あるいは、これらは、ヒト型化抗体、遺伝的修飾を通してその抗原に対する増大した結合親和力をもつ抗体又は完全にヒトの抗体を含む(ただしこれらに制限されるわけではない)遺伝的に改変された抗体のものであり得る。 Alternatively, they humanized antibodies, antibodies or with a binding affinity that is increased for the complete antigens including human antibodies (but not limited to) through genetic modification genetically altered antibodies It may be of. このようなハイブリッド重鎖は、所望の抗体を産生するべくさまざまな軽鎖にリンクさせることができる。 Such hybrid heavy chain can be linked to various light chain to produce the desired antibody. 軽鎖は、ラムダ又はカッパのいずれの軽鎖でもあり得る。 Light chain can be any of the light chain of lambda or kappa. 抗体の血清半減期は、主としてその重鎖定常領域により決定されることから、産生された抗体の所望の血清半減期は、本明細書に記述されている重鎖定常領域内のアミノ酸置換を通して達成可能である。 Serum half-life of an antibody is accomplished primarily from being determined by its heavy chain constant region, a desired serum half-life of the antibodies produced, through amino acid substitutions in the heavy chain constant region described herein possible it is.

II. II. 改変されたFcRn結合親和力及び/又は血清半減期を有する修飾された抗体の産生 Production of modified antibodies with the altered FcRn binding affinity and / or serum half-life
本発明は、改変されたFcRn結合親和力及び/又は血清半減期をもつタンパク質特に抗体を産生する方法を提供している。 The present invention provides a method for producing a protein, especially antibody having binding affinity for FcRn and / or serum half-life that has been modified. 好ましくは、本発明は、本明細書に開示されている位置のうちの1又は複数のものにおいて一定の与えられたIgGクラスの抗体を修飾するための方法を提供している。 Preferably, the present invention provides a method for modifying antibodies of the IgG class given constant in one or more of the positions disclosed herein. これは化学的に達成することもできるし、或いは又、任意の既知の産生方法を用いた組換え型産生及び無作為又は部位特異的変異誘発により達成することもできる。 This can either be achieved chemically, or alternatively, may be accomplished by recombinant production and random or site-directed mutagenesis using any known production methods.

本発明は、未修飾抗体中に存在するものとは異なるアミノ酸でアミノ酸残基250、314及び428から成るグループの中から選択された重鎖定常領域由来の少なくとも1つのアミノ酸を置換し、かくして前記未修飾抗体のFcRn結合親和力及び/又は血清半減期の改変をひき起こす段階を含んで成る、IgGクラスの抗体の修飾方法を提供する。 The present invention replaces at least one amino acid from the heavy chain constant region selected from the group consisting of amino acid residues 250, 314 and 428 with a different amino acid than that present in an unmodified antibody, thus the comprising FcRn binding affinity and / or the step of causing a modification of the serum half-life of the unmodified antibody, provides a method of modifying an antibody of class IgG.
置換は、位置250、314又は428で単独で行なうこともでき、又、位置250と428といったようにそれらの任意の組合せで行なうこともできる。 Substitution may also be carried out solely by the position 250, 314 or 428, it can also be carried out in any combination thereof, as such positions 250 and 428.

抗体のFcRn結合親和力を増大させかつ/又はその血清半減期を増大させるためには、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基250がグルタミン酸又はグルタミンで置換されるか、又は重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428がフェニルアラニン又はロイシンで置換される。 To increase the binding affinity for FcRn increased and / or the serum half-life of an antibody, amino acid residue 250 from the heavy chain constant region is substituted with glutamic acid or glutamine, or amino acid from the heavy chain constant region residue 428 is substituted with phenylalanine or leucine. あるいは、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基250はグルタミン酸で置換され、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428はフェニルアラニンで置換される;又は、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基250がグルタミンで置換され、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428がフェニルアラニンで置換される;又は重鎖定常領域由来のアミノ酸残基250がグルタミンで置換され、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428はロイシンで置換される。 Alternatively, amino acid residue 250 from the heavy chain constant region is substituted with glutamic acid and amino acid residue 428 from the heavy chain constant region is substituted with phenylalanine; or, at amino acid residue 250 from the heavy chain constant region is glutamine substituted amino acid residue 428 from the heavy chain constant region is substituted with phenylalanine; or a heavy chain constant region from amino acid residue 250 is substituted with glutamine and amino acid residue 428 from the heavy chain constant region is leucine It is replaced. 250と428の両方における修飾は、かかる二重突然変異を有する抗体が例外的に高いFcRn結合親和力を表示することから好まれる。 250 and modification at both 428 antibodies having such double mutations is preferred because it displays an exceptionally high binding affinity for FcRn.

未修飾抗体に比べて、減少したFcRn結合親和力及び/又は減少した血清半減期を有する修飾された抗体を産生するためには、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基314が、未修飾抗体中に存在するものとは異なるもう1つのアミノ酸で置換される。 Compared to the unmodified antibody, to produce a modified antibody having a reduced binding affinity for FcRn and / or reduced serum half-life, the amino acid residue 314 from the heavy chain constant region, while the unmodified antibody than those present is replaced by a different another amino acid. 好ましくは、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基314は、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンで置換される。 Preferably, amino acid residue 314 from the heavy chain constant region is alanine, arginine, aspartic acid, asparagine, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, or substituted with valine. より好ましくは、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基314はアラニン又はアルギニンで置換される。 More preferably, amino acid residue 314 from the heavy chain constant region is substituted with alanine or arginine.

未修飾抗体に比べて、減少したFcRn結合親和力及び減少した血清半減期を有する修飾された抗体を産生するためには、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基250が、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、リジン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン又はチロシンで置換され、そうでなければ、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン又はバリンで置換される。 Compared to the unmodified antibody, to produce a modified antibody having a reduced binding affinity for FcRn and a reduced serum half-life, the amino acid residue 250 from the heavy chain constant region is substituted with arginine, asparagine, aspartic acid, lysine, phenylalanine, proline, is substituted with tryptophan, or tyrosine, otherwise, the amino acid residue 428 from the heavy chain constant region is alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, lysine , proline, serine, threonine, is substituted with tyrosine, or valine. より好ましくは、アミノ酸残基250がアスパラギン酸で置換されるか又は、アミノ酸428がグリシンで置換される。 More preferably, or amino acid residue 250 is substituted with aspartic acid, amino acid 428 is substituted with glycine.

本明細書で記述されているアミノ酸置換は、標準的組換え型DNA技術によって達成される。 Amino acid substitutions described herein are achieved by standard recombinant DNA techniques. 1つの実施形態においては、未修飾抗体をコードするDNA内にアミノ酸置換を導入するために、部位特異的変異誘発を使用することができる。 In one embodiment, in order to introduce amino acid substitutions into the DNA encoding an unmodified antibody, it can be used site-directed mutagenesis. 修飾された抗体の結果として得られたDNAは、このとき宿主細胞内に送達され、かくして修飾された抗体が産生される。 The resulting DNA of the modified antibodies, this time is delivered into a host cell, thus modified antibody is produced. 修飾された抗体のFcRn結合親和力の所望の改変は、ファージ提示技術又は当該技術分野において既知のその他のあらゆる適切な方法を用いて選択され得、結合親和力を測定することによって確認できる。 Desired modification of the binding affinity for FcRn of the modified antibodies can be confirmed by measuring in phage display techniques or the art may be selected using known any other suitable method, the binding affinity.

好ましくは、未修飾抗体と比べた場合に改変されたFcRnに対する結合親和力及び/又は改変された血清半減期を有するIgGクラスの修飾された抗体を生産する方法は、 Preferably, the method of producing modified antibody of class IgG with binding affinity and / or altered serum half-lives for FcRn which is modified when compared to the unmodified antibody,
(a) 免疫グロブリン重鎖の定常領域を少なくともコードするDNAに操作可能な形でリンクされた適切なプロモータを含んで成り、かつアミノ酸残基250、314及び428から成るグループの中から選択された重鎖定常領域由来の少なくとも1つのアミノ酸が、未修飾抗体の中に存在するものとは異なるアミノ酸で置換されかくして血清半減期の改変をひき起こす複製可能な発現ベクターを調製する段階; (A) comprises a suitable promoter linked operably form a constant region of an immunoglobulin heavy chain to DNA encoding at least, and selected from the group consisting of amino acid residues 250, 314 and 428 step in which at least one amino acid from the heavy chain constant region, to prepare a replicable expression vector which causes a modification of which thus serum half-life is replaced by a different amino acid than that present in the unmodified antibody;
(b) 宿主細胞を前記ベクターで形質転換する段階;及び (c) 前記修飾された抗体を産生するべく前記形質転換済み宿主細胞を培養する段階、 Step (b) transforming a host cell with said vector; and (c) step of culturing the transformant already host cells to produce said modified antibody,
を含んで成る。 Comprising a.

かかる方法は任意には、ステップ(a)の後に、相補的免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAに対し操作可能な形でリンクされたプロモータを含む第2の複製可能な発現ベクターを調製する段階をさらに含んで成り、かつここで前記細胞系統は前記ベクターでさらに形質転換される。 Such methods optionally after step (a), the step of preparing a second replicable expression vector comprising a promoter linked operably form to DNA encoding a complementary immunoglobulin light chain further comprising become, and the cell line in this case is further transformed with said vector.

ステップ(a)でDNAを生成するために、アミノ酸置換は、部位特異的変異誘発(Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA82:488-492(1985))、PCR変異誘発(Higuchi,「PCRプロトコル;方法及び応用ガイド」、Academic Press, San Diego(1990)pp. 177-183)、及びカセット変異誘発(Wells et al., Gene34:315-323(1985))を含む(ただしこれに制限されるわけではない)変異誘発により導入され得る。 To generate the DNA in Step (a), amino acid substitutions, site-directed mutagenesis (Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA82:.... 488-492 (1985)), PCR mutagenesis (Higuchi, "PCR . (. Wells et al, Gene34: 315-323 (1985); protocol methods and applications guide ", Academic Press, San Diego (1990) pp 177-183), and cassette mutagenesis) is limited (although in this including It is not) may be introduced by mutagenesis in Ruwake. 好ましくは、部位特異的変異誘発は、例の中で開示されているオーバーラップ・エクステンションPCR方法によって実施される(Higuchi,「PCR技術:その原理とDNA増幅への応用、Stockton Press, New York(1989)、p61〜70)。 Preferably, site-directed mutagenesis is performed by the overlap-extension PCR method disclosed in the examples (Higuchi, "PCR Technology: The principle and application to DNA amplification, Stockton Press, New York ( 1989), p61~70).

オーバーラップ・エクステンションPCR(Higuchi, 同書)の技術は、標的配列(出発DNA)内に任意の所望の突然変異(単複)を導入するために使用可能である。 Techniques overlap-extension PCR (Higuchi, ibid.) Can be used to introduce any desired mutation (s) to the target sequence (the starting DNA) within. 例えば、図4に示されているように、オーバーラップ・エクステンション方法におけるPCRの第1ラウンドには、外部プライマ(プライマ1)及び内部変異誘発プライマ(プライマ3)で、そして別途第2の外部プライマ(プライマ4)及び内部プライマ(プライマ2)で標的配列を増幅し、2つのPCRセグメント(セグメントA及びB)を生み出す段階が関与している。 For example, as shown in FIG. 4, the first round of PCR in the overlap-extension method, in the external primer (primer 1) and an internal mutagenesis primer (primer 3), and separately a second outside primer (primer 4) and to amplify the target sequences within the primer (primer 2), the step of producing two PCR segments (segments a and B) are involved. 内部変異誘発プライマ(プライマ3)は、所望の突然変異(単複)を規定する標的配列に対するミス対合を含むように設計されている。 Internal mutagenesis primer (primer 3) is designed to contain mismatches to the target sequence defining the desired mutation (s). PCRの第2ラウンドでは、PCRの第1ラウンドの産物(セグメントA及びB)が、2つの外部プライマ(プライマ1及び4)を用いてPCRにより増幅される。 In the second round of PCR, the products of the first round of PCR (segments A and B) are amplified by PCR using the two outside primers (primers 1 and 4). 結果としての全長PCRセグメント(セグメントC)は、制限酵素で消化され、結果としての制限フラグメントは適切なベクターへとクローニングされる。 As a result full-length PCR segment of (segment C) is digested with restriction enzymes, restriction fragment resulting is cloned into a suitable vector.

変異誘発の第1段階として、出発DNAは、変異誘発ベクター内に操作可能な形でクローニングされる。 As the first step of mutagenesis, the starting DNA is cloned operably form mutagenesis vector. プライマは、所望のアミノ酸置換を反映するように設計される(例中のさらなる詳細を参照のこと)。 Primer (see more details in the Examples) designed to reflect the desired amino acid substitutions. 1つの例においては、in vitro 変異誘発のために使用されるベクターを、タンパク質の発現を導くために用いることができる。 In one example, the vectors used for in vitro mutagenesis can be used to direct the expression of the protein. かくして、オーバーラップ・エクステンションPCRの結果として得られたDNAを、所望の突然変異をもつDNAを含む発現ベクターが作り上げられるような形で変異誘発ベクター内にクローニングし戻すことが可能である。 Thus, the DNA obtained as a result of the overlap-extension PCR, it can be returned cloned into mutagenesis in the vector in such a way the expression vector is created containing a DNA having the desired mutation. 出発DNAを含む変異誘発ベクターの例としては、pVAg2M3-OST577が含まれるが、これらに制限されるわけではない。 Examples of mutagenesis vector comprising the starting DNA includes but is pVAg2M3-OST577, but are not limited thereto.

例えば、位置250での突然変異は、上述のオーバーラップ・エクステンション方法を用いた2段階プロセスにおいてpVAg2M3-OST577のPinAI-BamHIフラグメント(図5Aの制限地図を参照のこと)をとり囲む領域を増幅し、次に結果として得たPCRセグメントをPinAI及びBamHIで消化させ、結果として得た制限フラグメントをpVAg2M3-OST577へとクローニングすることによって行なわれた。 For example, mutations at positions 250 amplifies a region surrounding the PinAI-BamHI fragment of pVAg2M3-OST577 in a two-step process using the overlap-extension method described above (see the restriction map in Figure 5A) the PCR segment as a next result is digested with PinAI and BamHI, the restriction fragments resulting were made by cloning into pVAg2M3-OST577. 類似の要領で、位置314又は428における突然変異は、オーバーラップ・エクステンションPCRによりPm1I-BamHIフラグメントをとり囲む領域を増幅し、次に結果として得たPCRセグメントをPm1I及びBamHIで消化させ、結果として得た制限フラグメントをpVAg2M3-OST577へとクローニングすることによって行なわれた。 In a similar manner, a mutation at position 314 or 428, and amplify the region surrounding the PmlI-BamHI fragment by overlap-extension PCR, digested the PCR segment as a next result PmlI and BamHI, resulting the resulting restriction fragment was done by cloning into pVAg2M3-OST577.

出発DNAは、修飾されようとしているACRが内含されているかぎりにおいて、未修飾抗体全体、未修飾抗体の免疫グロブリン重鎖全体、重鎖の定常領域又は未修飾抗体の重鎖定常領域の一部分をコードするDNAであり得る。 The starting DNA is as long as the ACR that is going to be modified is entailment entire unmodified antibody, whole immunoglobulin heavy chain the unmodified antibody, a portion of the heavy chain constant region of the constant region or unmodified antibody heavy chain It may be a DNA encoding.
未修飾抗体全体をコードするDNAが変異誘発のための出発DNAとして用いられる場合、修飾された抗体全体は、本明細書に記述されている方法のステップ(a)、(b)及び(c)を実施することによって産生可能である。 If the DNA encoding an entire unmodified antibody is used as the starting DNA for mutagenesis, the entire modified antibody, the step of the method described herein (a), (b) and (c) It can be produced by carrying out the. 相補的軽鎖を生成するための前記方法のステップ(a)とステップ(b)の間のステップは必要でなくなる。 Steps between steps of the method for generating the complementary light chain (a) and step (b) is no longer required.

変異誘発のための出発DNAが、未修飾抗体の重鎖全体をコードするDNAである場合、変異誘発は、修飾された重鎖全体をコードするDNAを含むベクターを発生させることになる。 The starting DNA for mutagenesis is, when a DNA encoding the heavy chain entire unmodified antibody, mutagenesis will be generated a vector comprising the DNA encoding the entire modified heavy chain. 修飾された抗体全体を産生するために、本明細書に開示された方法のステップ(a)と(b)のステップが実施される。 To produce the entire modified antibody, the step of steps of the methods disclosed herein (a) and (b) is performed. すなわち、相補的免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAに操作可能な形でリンクされた適切なプロモータを含むもう1つの複製可能な発現ベクターが同じ宿主細胞内に同時トランスフェクションされる。 That is, the complementary immunoglobulin light chain Another replicable containing the appropriate promoter linked operably shape to the DNA encoding the expression vectors are co-transfected into the same host cell. その結果、相補的軽鎖及び修飾された重鎖の両方が同じ宿主細胞内で発現され、修飾された抗体全体を発生させるため適切に組立てられる。 As a result, both the complementary light chain and modified heavy chain are expressed in the same host cell, it is suitably assembled to generate the entire modified antibody. 免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを含む前記発現ベクターの一例としてはpVAλ2-OST577が含まれるが、これに制限されるわけではない。 Although as an example of said expression vector comprising DNA encoding an immunoglobulin light chain includes pVAλ2-OST577, but are not limited thereto.

変異誘発用の出発DNAが、C H 2-C H 3セグメント又はFcドメインといったような重鎖定常領域の一部分をコードするDNAである場合、かかる修飾されたの部分的重鎖をコードする結果として得られたDNAは、まず最初に残りの未修飾重鎖と同一枠内で連結され、かくしてステップ(a)で本明細書に記述されている修飾をもつ重鎖全体をコードするDNAが生成されることになる。 As a result the starting DNA for mutagenesis, if a DNA encoding part of the heavy chain constant region, such as C H 2-C H 3 segment or an Fc domain, encoding such modified partial heavy chain the resulting DNA is initially coupled with the remaining unmodified heavy chain and the same frame within, thus DNA encoding the entire heavy chain with the modification described in this specification is generated in step (a) It becomes Rukoto. このとき、相補的軽鎖をコードするDNAを含むベクター及びかかる修飾された重鎖をコードするDNAを含むベクターで宿主細胞を同時トランスフェクションさせることによって、修飾された抗体全体が産生される。 At this time, by co-transfecting host cells with vectors containing DNA encoding the vector and such modified heavy chain containing DNA encoding a complementary light chain, the entire modified antibody is produced. 装飾済み部分的重鎖をコードするDNAと残りの未装飾重鎖の連結は、制限消化及びライゲーションといった分子生物学の技術分野において既知の標準的な分子クローニング技術を用いることによって達成可能である(Sambrook 及び Russell,「分子クローニング;実験室マニュアル」第3版 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(2001))。 Ligation of DNA and residual encoding decorative modified partial heavy chain of undecorated heavy chain can be achieved by using a known standard molecular cloning techniques in the art of molecular biology such as restriction digestion and ligation ( Sambrook and Russell, "molecular cloning: a laboratory manual", 3rd Edition Cold Spring Harbor laboratory Press, New York (2001)).

軽鎖及び重鎖は、同じ又は異なる発現ベクターの中でクローニングされ得る。 Light and heavy chains can be cloned in the same or different expression vectors. 免疫グロブリン鎖をコードするDNAセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確保する発現ベクター(単複)の中の制御配列に操作可能な形でリンクされている。 DNA segments encoding immunoglobulin chains are linked in a form operation to the control sequences in expression vectors to ensure the expression of immunoglobulin polypeptides (s). このような制御配列は、シグナル配列、プロモータエンハンサ、及び転写終結配列を内含する(全ての目的のために本明細書にその全体が参考として内含されている Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033(1989);WO90/07861;Co et al., J. Immunol. 148:1149-1154(1992);「抗体工学:実践ガイド」、Borrebaeck, Ed., Freeman, New York(1997)を参照のこと)。 Such control sequences include a signal sequence, promoter enhancer, and Queen et al herein in its entirety for transcription termination to entailment sequences (all purposes is incorporated by reference., Proc. Natl ... Acad Sci USA 86:.. 10029-10033 (1989); WO90 / 07861; Co et al, J. Immunol 148: 1149-1154 (1992); "antibody Engineering: A practical Guide", Borrebaeck, Ed,. Freeman, see New York (1997)).

宿主細胞は、リポソーム、リン酸カルシウム、電気穿孔法などといった当該技術分野において既知の技術を用いることで形質転換される(Sambrook 及びRussell, 前掲書中)。 Host cells, liposomes, calcium phosphate, in the art, such as electroporation are transformed by using known techniques (Sambrook and Russell, op. Cit.). 好ましくは、宿主細胞は、リポソーム方法を用いて一過性にトランスフェクションを受ける。 Preferably, the host cells undergo transiently transfected using the liposome method.
本発明の修飾された抗体を産生するために用いられる宿主細胞は、当該技術分野において既知のさまざまな培地内で培養可能である。 The host cells used to produce the modified antibody of the present invention can be cultured in a known variety of media in the art.
本明細書で記述されている修飾された抗体は、細胞内で、周縁質空間内で産生され得、そうでなければ培地内に直接分泌され得る。 Antibody modified are described herein, in cells, produced in the periplasmic space obtained can be directly secreted into the medium otherwise. 好ましくは、本発明における修飾された抗体は、培地内に分泌される。 Preferably, antibodies which have been modified in the present invention is secreted into the medium. 修飾された抗体を産生する宿主細胞培養の培地は、収集され、遠心分離により細胞残屑が回転させられる。 Medium of the host cell culture producing modified antibodies are collected and cell debris is rotated by centrifugation. 上清は収集されて、タンパク質発現検定に付される(例中のさらなる詳細を参照のこと)。 The supernatant is collected and subjected to the protein expression assays (see more details in the Examples).

修飾された抗体の発現は、SDS-PAGE還元性又は非還元性タンパク質ゲル分析を用いたゲル電気泳動法又はその他の当該技術分野において既知のあらゆる技術により確認される。 Expression of a modified antibody is confirmed by SDS-PAGE reducing or non-reducing protein gel analysis gel electrophoresis using or other art any technique known in the art. 修飾された抗体の発現及びその抗体の数量の両方を検出するためにELISAを使用することもできる。 The ELISA to detect both the expression of modified antibody and the quantity of the antibody may also be used.
修飾された抗体は、未修飾抗体に比べ適切な抗原結合を保持しているべきである。 Modified antibodies should retain proper antigen binding compared to the unmodified antibody. 従って、ELISAといったような免疫学の技術分野において既知の手順により、適正な抗体-抗原結合がテストされる。 Thus, by procedures known in the art of immunology, such as ELISA, proper antibody - antigen binding it is tested. 修飾された抗体が未修飾抗体のものに類似した構造的特性を有することを確認するために、付加的な実験を実施することができる。 To the modified antibody is confirmed to have similar structural characteristics to those of the unmodified antibody, it is possible to implement additional experimentation. これらの実験には、SDS-PAGE、SEC、ELISA及びプロテインA結合検定が含まれるが、それらに制限されるわけではない。 These experiments, SDS-PAGE, SEC, including but ELISA, and protein A binding assays, but are not limited to them. 結合に異なる残基が関与するもののプロテインAは、FcRnといったようなC H 2-C H 3接合部の同じ領域に結合することから、プロテインA結合検定が好まれる。 Protein A that bind to different residues are involved, from binding to the same region of the C H 2-C H 3 junction such as FcRn, protein A binding assay is preferred.

宿主細胞から調製された修飾された抗体は、ゲルろ過及びカラムクロマトグラフィ(例えばプロテインAによるアフィニティクロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ及びゲルろ過)を含め(ただしこれらに制限されるわけではない)、当該技術分野において既知の技術を用いて精製可能である。 Antibody modified prepared from host cells, but is not limited (affinity chromatography, cation exchange chromatography, anion exchange chromatography and gel filtration, for example by Protein A), including (but these gel filtration and column chromatography ), it can be purified using techniques known in the art. 薬学処方での使用のための抗体の最小受容可能純度は90%となり、95%が好ましく、98%がより好ましく、99%以上が最も好ましい。 Next minimum acceptable purity of 90% of the antibody for use in pharmaceutical formulations, preferably 95%, more preferably 98%, most preferably at least 99%.

FcRnに対する産生された抗体の結合親和力は、FcRnに対する結合のための最適条件であるpH6.0での競合結合検定を実施することによって検出可能である。 Binding affinity of antibodies produced for FcRn can be detected by performing a competitive binding assay at pH6.0 is optimal condition for binding to FcRn. 結合親和力は、Sepharose(商標)ビーズといったような固体基質上にFcRnを固定化することによってテストできる。 Binding affinities can be tested by immobilizing FcRn on a solid substrate such as a Sepharose (TM) beads. あるいは、結合親和力は、ELISAを用いて評価できる。 Alternatively, the binding affinity can be assessed using ELISA. 好ましくは、本発明は、細胞ベースのシステム内で競合結合検定を実施することによって、結合親和力をテストする。 Preferably, the present invention is by performing a competitive binding assay in a cell-based system, to test the binding affinity. 産生された修飾された抗体及び未修飾抗体の希釈系列が、1つの細胞系統好ましくはNS0細胞系統上で発現されたFcRnに対する結合について比較される。 The produced modified dilution series of the antibody and the unmodified antibody, preferably a single cell line may be compared for binding to FcRn expressed on NS0 cell line. 競合結合検定を実施するための実験手順は、例中に詳述されている。 Experimental procedure for a competition binding assay is described in detail in the examples.

本発明における実験は、抗体を産生する細胞の培養上清又は精製された抗体で類似の結合親和力結果を達成できるということを示している。 Experiments in the present invention indicate that antibodies similar binding affinity results in a culture supernatant or purified antibody in cells can be achieved to produce. 従って、結合親和力の所望の改変が達成されたことを確認する目的で、産生された抗体のFcRn結合親和力をテストするために直接上清を使用することができる。 Therefore, in order to confirm that the desired alteration of binding affinity is achieved, can be used directly supernatants to test the binding affinity for FcRn of the antibody produced. このような確認の後、産生された抗体は、より複雑な精製手順に付される。 After such check, the antibodies produced is subjected to more complex purification procedures.
修飾された抗体がpH依存的にFcRnに結合するということを確認するために、直接結合検定も実施されるべきである。 To the modified antibody to confirm that the binding to pH-dependent manner FcRn, it should also be performed directly binding assays. 特に、FcRnに対する修飾された抗体の結合親和力は、pH6.0とpH8.0の両方でテストされる(例中のさらなる詳細を参照のこと)。 In particular, the binding affinity of the modified antibodies for FcRn is (see further details in the examples) to be tested in both the pH6.0 and pH 8.0. 一般に、pH6.0での結合親和力は、pH8.0でのものを上回るはずである。 In general, binding affinity of at pH6.0 should exceed those in pH 8.0.

例えば、放射性標識されたタンパク質を用い時間の関数として血清放射能レベルを測定することによって;又は時間の関数としてELISAを用いて血清中に存在する(既知の特異性の)無傷の抗体のレベルを検定することなどのさまざまなin vitro又はin vivo手段により、生物学的安定性(又は血清半減期)を測定することができるが、増大した生物学的安定性の特に好ましい尺度は、増大した血清半減期及び減少したクリアランス速度によって立証される。 For example, by measuring the serum level of radioactivity as a function of time using a radiolabeled protein; or by using the ELISA as a function of time present in serum (of known specificity) levels of an intact antibody serum by a variety of in vitro or in vivo means, such as assaying, can measure the biological stability (or serum half-life), particularly preferred measure of increased biological stability, the increased evidenced by the half-life and decreased clearance rates were.
本発明は、本明細書で記述されている突然変異を伴う、修飾された抗体をコードするポリヌクレオチド分子、又は定常領域、Fc領域又はC H 2-C H 3領域といったような修飾された抗体の装飾済みの部分的又は完全な重鎖をコードするポリヌクレオチド分子を提供している。 The present invention involves a mutation is described herein, a polynucleotide molecule encoding a modified antibody, or a constant region, the modified antibodies, such as Fc region or C H 2-C H 3 region It provides a polynucleotide molecule encoding a decoration already partial or full heavy chains.

本発明は、本明細書で記述されている突然変異(置換)を伴う、修飾された抗体をコードするポリヌクレオチド分子、又は定常領域、Fc領域又はC H 2-C H 3領域といったような修飾された抗体の装飾済みの部分的又は完全な重鎖をコードするポリヌクレオチド分子を含むベクターを提供している。 The present invention involves a mutation (substitution) described herein, a polynucleotide molecule encoding a modified antibody, or a constant region, such as Fc region or C H 2-C H 3 region-modified It provides a vector comprising a polynucleotide molecule encoding a decoration already partial or full heavy chain of the antibody.
本発明は、本明細書に記述されている通りの前記核酸分子を含む前記ベクターを含有する宿主細胞を内含している。 The present invention is directed to entailment a host cell containing said vectors comprising said nucleic acid molecule as described in this specification. 本明細書に記述されている修飾された抗体の発現のための適切な宿主細胞は、Escherichia coliといったような原核生物又は酵母、植物、昆虫及び哺乳動物を含む真核多細胞生物から誘導される。 Suitable host cells for the expression of a modified antibody is described herein is derived from a eukaryotic multicellular organisms, including prokaryotes or yeast, such as Escherichia coli, plants, insects and mammals .

E. coliは、本発明のDNA配列をクローニングしかつ/又は発現するのに特に有用である1つの原核生物宿主である。 E. coli is one prokaryotic host particularly useful for cloning and / or expressing the DNA sequences of the present invention. 使用に適したその他の微生物宿主には、Bacillus subtilisといったような桿菌及び、Salmonella, Serratia及びさまざまなPseudomonas種といったようなその他の腸内細菌種が含まれる。 Other microbial hosts suitable for use include bacilli and such as Bacillus subtilis, Salmonella, include other enteric bacterial species, such as Serratia, and various Pseudomonas species. これらの原核生物宿主の中で、宿主細胞と相溶性ある発現制御配列(例えば複製起点)を標準的に含有する発現ベクターを作ることもできる。 In these prokaryotic hosts, host cells compatible certain expression control sequences (e.g., origins of replication) can also make expression vectors that standardly contain. さらに、ラクトースプロモータ系、トリプトファン(trp)プロモータ系、ベータ-ラクタマーゼプロモータ系、又はファージラムダからのプロモータ系といったような、任意の数のさまざまな周知のプロモータも存在し得る。 Furthermore, lactose promoter system, a tryptophan (trp) promoter system, a beta - lactamase promoter system, or such as promoter system from phage lambda, may also be present various known promoters any number. プロモータは標準的に、任意にはオペレータ配列と共に発現を制御し、転写及び翻訳を開始させ完了させるためリボソーム結合部位配列などを有している。 Promoter Typically, optionally has and the like to control the expression with an operator sequence, a ribosome binding site sequences to complete to initiate the transcription and translation.

酵母といったようなその他の細菌も同じく発現に使用することができる。 Other bacteria, such as yeast may also be used for expression as well. Saccharomycesが好ましい宿主であり、適切なベクターは、3-ホスホグリセレートキナーゼ又はその他の糖分解酵素を含めたプロモータといった発現制御配列及び複製起点、終結配列などを望まれる通りに有している。 Saccharomyces is a preferred host, with suitable vectors include 3-phosphoglycerate kinase or promoters such expression control sequences and origin of replication, including other glycolytic enzymes, and has as desired and termination sequences.

植物及び植物細胞培養を、本発明のDNA配列の発現のために使用することができる。 Plants and plant cell cultures can be used for expression of the DNA sequences of the present invention. (Larrick and Fry, Hum. Autibodies Hybridomas 2;172-189(1991);Benvenuto et al., Plant Mol. Biol.17:865-874(1991);During et al., Plant Mol. Biol.15:281-293(1990);Hiatt et al., Nature 342:76-78(1989))。 (Larrick and Fry, Hum Autibodies Hybridomas 2; 172-189 (1991); Benvenuto et al, Plant Mol Biol.17:..... 865-874 (1991); During et al, Plant Mol Biol.15: 281 . -293 (1990); Hiatt et al, Nature 342: 76-78 (1989)). 好ましい植物宿主には、例えばArabidopsis、Nicotiana tabaceum、Nicotiana rustica及びSolanum tuberosumが含まれる。 Preferred plant hosts, e.g. Arabidopsis, include Nicotiana tabaceum, Nicotiana rustica and Solanum tuberosum. 本発明の修飾された抗体をコードするポリヌクレオチド配列を発現するための好ましい発現カセットは、修飾された抗体をコードする挿入されたポリヌクレオチド配列が重複エンハンサを伴ってCaMV35Sプロモータに操作可能な形でリンクされているプラスミドpMOG18であり、pMOG18は、Sijmons et al., Bio/Technology 8:217-221(1990)の方法に従って使用される。 Preferred expression cassettes for expressing the polynucleotide sequences encoding the modified antibodies of the present invention, the inserted polynucleotide sequence encoding the modified antibody operably form a CaMV35S promoter with the duplicated enhancer a plasmid pMOG18 linked, pMOG18 is, Sijmons et al, Bio / Technology 8:. used according to the method of 217-221 (1990). あるいは、植物中の修飾された抗体の発現のための好ましい実施形態は、上述のHiatt et al., により用いられている免疫グロブリン配列に代って本発明の修飾された抗体をコードするポリヌクレオチド配列を用いて、上述のHiatt et al.の方法に従う。 Alternatively, the preferred embodiments for the expression of modified antibodies in plants, the polynucleotide encoding the modified antibodies of the present invention in place of the immunoglobulin sequences used by Hiatt et al., Above using the sequence, according to Hiatt et al. of the above-described methods. 本発明のDNA配列を発現するためには、Agrobacterium tumifaciens T-DNAベースのベクターを使用することができる;好ましくは、このようなベクターには、スペクチノマイシン耐性をコードするマーカー遺伝子又はもう1つの選択可能マーカーが含まれている。 To express the DNA sequences of the present invention can be used Agrobacterium tumifaciens T-DNA-based vectors; preferably, such a vector, the marker gene encodes a spectinomycin resistance or another It contains a selectable marker.

バキュロウイルスベースの発現系を標準的に使用して、本発明の修飾された抗体を産生するために、昆虫細胞培養を使用することもできる。 Baculovirus-based expression systems by standard used, to produce the modified antibody of the present invention, it is also possible to use insect cell culture. 修飾された抗体は、Putlitz et al., Bio/Technology 8:651-654(1990)の方法に従って修飾された抗体をコードするポリヌクレオチド配列を発現することによって産生可能である。 Modified antibodies, Putlitz et al, Bio / Technology 8:. 651-654 can be produced by expressing polynucleotide sequences encoding the modified antibodies according to the method of (1990).

微生物及び植物に加えて、本発明のポリペプチドを発現し産生するために、哺乳動物細胞培養も同様に使用可能である(Winnacker「遺伝子からクローンへ」、VCH Publishers, New York(1987)を参照)。 In addition to microorganisms and plants, reference to express and produce the polypeptides of the present invention, mammalian cell culture can be used as well (Winnacker, "From Gene to Clone", VCH Publishers, a New York (1987) ). 当該技術分野においては無傷の免疫グロブリンを分泌する能力をもつ一定数の適切な重鎖系統が開発されてきていることから、現在哺乳動物細胞が好まれており、これには、CHO細胞系統、さまざまなCOS細胞系統、HeLa細胞好ましくは骨髄腫細胞系統など又は形質転換されたB-細胞又はハイブリドーマが含まれる。 Since a number of suitable heavy lines capable of secreting intact immunoglobulins in the art have been developed, and currently preferred mammalian cells, including, CHO cell lines, various COS cell lines, HeLa cells, preferably include B- cells or hybridomas were such or transformed myeloma cell lines. これらの細胞のための発現ベクターは、発現制御配列、例えば複製起点、プロモータ、エンハンサ(Queen et al., Immunol. Rev. 89;49-68(1986))そして必要なプロセッシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写ターミネータ配列を内含し得る。 Expression vectors for these cells can include expression control sequences, such as an origin of replication, a promoter, enhancer (Queen et al, Immunol Rev. 89;.. 49-68 (1986)) and necessary processing information sites, such as ribosome binding sites, RNA splice sites may entailment polyadenylation sites, and transcriptional terminator sequences. 好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン 遺伝子、SV40、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、サイトメガロウイルスなどから誘導されたプロモータである。 Preferred expression control sequences, immunoglobulin genes, SV40, adenovirus, bovine papilloma virus, promoters derived from cytomegalovirus. 一般に、ネオ発現カセットといったような選択可能マーカーが、発現ベクター内に含まれている。 Generally, a selectable marker, such as neo expression cassette, is included in the expression vector.

本発明は、FcRnとの相互作用を通して増大した又は減少した血清半減期をもつものとして同定された部分に対して、その作用物質を接合させるか又は他の形で結合させることにより、改変されたFcRn結合親和力及び/又は血清半減期をもつ作用物質を作る方法を提供している。 The present invention is to provide increased through interaction or identified portions as having a reduced serum half-life of the FcRn, by binding or otherwise shaped joining the the agent has been modified FcRn provides a method of making an agent with binding affinity and / or serum half-life. かかる部分には、本明細書で記述されているアミノ酸置換を含む、装飾済みIgG又は装飾済みの部分的又は完全な重鎖が含まれるが、これらに制限されるわけではない。 Such moieties include amino acid substitutions described herein, including but decorated already IgG or decorative modified partial or full heavy chains of, but are not limited thereto. かかる作用物質としては、抗体、抗体フラグメント、ホルモン、レセプタリガンド、免疫毒素複合体、あらゆる種類の治療薬剤、T-細胞レセプタ結合抗原及び本発明の増大した血清半減期の部分に結合され得るその他のあらゆる作用物質が含まれることになるが、これに制限されるわけではない。 Such agents include antibodies, antibody fragments, hormones, receptor ligands, immunotoxins complexes, all kinds of therapeutic agents, T-cell receptor binding antigens, and increased serum half-life and other may be coupled to a portion of the present invention Although it will include any agent, but are not limited thereto.

改変されたin vivo安定性をもつ融合タンパク質を作り上げるためには、定常領域と操作可能な形でリンクされたかかるタンパク質を含む融合タンパク質を発現する能力をベクターに付与するべく1つの位置で上流側又は下流側のいずれであれ修飾された抗体の定常領域と同一枠内で組換え型ベクター内に、かかるタンパク質をコードするDNAセグメントを操作可能な形で取込むことができる。 To build fusion proteins with altered in vivo stability, upstream at one location in order to confer the ability to express a fusion protein comprising such a protein linked operably form a constant region vector or in in recombinant vector downstream same frame and the constant region of the modified antibodies whether in the can be incorporated DNA segments encoding such proteins operably form. 例えば制限エンドヌクレアーゼを用いた遺伝子工学処理などによる;この要領でDNAセグメントを操作するための技術は、本開示及び上述のSambrook 及び Russellといった参考文献の両方に照らして、当業者にはわかるものである。 For example due engineered with restriction endonucleases; technology to manipulate DNA segments in this manner, in the light of both references such disclosure and above Sambrook and Russell, those known to those skilled in the art is there. 上述の方法は、改善されたに生物学的安定性をもつ一連の治療用化合物の生成において使用するべく提案されている。 The method described above has been proposed to use in the generation of a series of therapeutic compounds with biological stability was improved.

かかる化合物には、例えばインタロイキン-2、インシュリン、インタロイキン-4、及びインタフェロンガンマ又さらにはT細胞レセプタさえも含まれる。 Such compounds, for example interleukin -2, insulin, interleukin -4 and interferon gamma or even include even T cell receptors. 本発明の組換え型Fcドメインは同様に、その反復的投与の必要性を緩和する可能性が高い、広範囲の薬物の安定化において使用すべきものとしても考慮されている。 Recombinant Fc domains of this invention also is likely to mitigate the need for repeated administration, and is also considered as to be used in the stabilization of a wide range of drugs. しかしながら、当該方法は、ヒトへの投与用のタンパク質の産生に制限されるものではなく、例えば免疫化プロトコル、獣医による動物の治療又はげっ歯類in vivo療法モデルにおいて使用できるもののように、増大した安定性をもつあらゆるタンパク質を大量に産生するためにも利用可能である。 However, the method is not limited to the production of proteins for human administration, e.g. immunization protocols, such as those that can be used in the treatment or rodent in vivo therapy models animal veterinary, increased in order to produce large amounts of every protein with stability it is available.

III. III. 改変されたFcRn結合親和力及び/又は血清半減期を有する修飾された抗体の使用 Use of modified antibodies with the altered FcRn binding affinity and / or serum half-life
本発明は、本明細書で記述されている修飾された抗体及び薬学的に受容可能な担体を含む組成物を提供している。 The present invention provides a composition comprising a modified antibody and a pharmaceutically acceptable carrier are described herein. 非経口投与用の組成物は、一般に、受容可能な担体好ましくは水性担体中に溶解された抗体又はそのカクテルの溶液を含む。 Compositions for parenteral administration are generally acceptable carrier preferably containing dissolved antibody or solution of the cocktail in an aqueous carrier. 例えば水、緩衝水、0.4%の塩水、0.3%のグリシンなどのさまざまな水性担体を使用することができる。 For example, water, buffered water, can be used 0.4% saline, 0.3% A variety of aqueous carriers such as glycine. これらの溶液は、無菌で一般に粒状物質を含まない。 These solutions are generally free of particulate matter in sterile. 組成物は、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムといったpH調整及び緩衝剤、毒性調整剤などのような生理学的条件を近似するのに必要とされるような薬学的に受容可能な補助物質を含有することができる。 Composition, for example, sodium acetate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, pH regulators and buffering agents such as sodium lactate, such pharmaceutically required to approximate physiological conditions such as toxicity adjusting agents It may contain acceptable auxiliary substances. これらの処方中の抗体の濃度は、非常に広範に、すなわち約0.01%未満、通常は少なくとも約0.1重量%未満から5重量%に至るまで変動することができ、主として選択された特定の投与様式に従った粘度及び流体体積に基づいて選択される。 The concentration of antibody in these formulations are very broad, i.e. less than about 0.01%, usually can vary from at least less than about 0.1 wt% up to 5 wt%, the particular mode of administration is selected primarily It is selected based on the viscosity and fluid volume in accordance with.

静脈内輸液用の標準的な組成物は、250mlの無菌リンガー溶液及び10mg〜100mgの抗体を含有するように構成され得る(「レミントンの薬学」第15版、Mack Publishing Company, Easton, PA(1980)を参照のこと)。 Standard composition for intravenous infusion is may be configured to contain a sterile Ringer's solution and 10mg~100mg antibody of 250 ml ( "Remington's Pharmaceutical" 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1980 )checking).
本発明における修飾された抗体は、さまざまな非治療目的で使用可能である。 Modified antibodies in the present invention can be used in various non-therapeutic purposes. これらは、親和力精製剤として使用できる。 These can be used as an affinity purification agent. これらは又、特定の細胞、組織又は血清中の問題の抗原の発現を検出することといったような、診断検定においても有用であり得る。 It also specific cells, such as detecting expression of an antigen tissue or serum problems, may also be useful in diagnostic assays. 診断向け利用分野においては、該抗体は標準的に、放射性同位元素、螢光標識及びさまざまな酵素基質標識を含めた検出可能な部分で標識されることになる。 In diagnostic for FIELD, the antibody as a standard, a radioisotope, will be labeled with a detectable moiety, including fluorescent labels and various enzyme substrate labels. 抗体は同様に、競合結合検定、直接及び間接サンドイッチ検定及び免疫沈降検定といったような既知のあらゆる検定方法においても利用可能である。 Antibodies Similarly, competitive binding assays can also be utilized in any known assay method, such as direct and indirect sandwich assays, and immunoprecipitation assays. 抗体は同様に、in vivo診断検定のためにも使用可能である。 Antibodies Similarly, it can also be used for in vivo diagnostic assays. 一般に、抗体は、免疫シンチグラフィを用いて抗原又はそれを発現する細胞の場所を特定できるような形で、放射性核種で標識される。 In general, antibodies in the form that can identify the location of cells expressing the antigen or it with the immune scintigraphy, are labeled with a radionuclide.

細胞活性に対する防御又は検出又は選択された細胞表面レセプタの存在又は疾病の診断に関して、修飾された抗体と共に使用するためのキットを供給することもできる。 Respect defense or detection or presence or diagnosis of a disease selected cell surface receptor for cell activity, it can also be supplied a kit for use with the modified antibodies. かくして、本発明の対象である組成物は、単独で又は所望の細胞型に特異的な付加的抗体と併用して、通常は容器の中に凍結乾燥形態で提供することができる。 Thus, the composition, object of the present invention, alone or in combination with the desired cell type specific an additional antibody, typically can be provided in lyophilized form in a container. 標識又は毒素に接合されていても又は接合されていなくてもよい修飾された抗体は、トリス、リン酸塩、炭酸塩などといったような緩衝液、安定化剤、殺生剤、不活性タンパク質例えば血清アルブミンなどの緩衝液及び使用説明書1式と共にキット内に含まれている。 Be bonded to a label or toxin antibodies may also be modified not be also or bonded, Tris, phosphate, buffer such as such as carbonate, stabilizers, biocides, inert proteins such as serum contained in the kit together with the buffer and instructions for use 1 expression, such as albumin. 一般に、これらの材料は、活性抗体の量に基づいて約5重量%未満で存在し、通常は再び抗体濃度に基づいて少なくとも約0.001重量%の合計量で存在する。 In general, these materials present in less than about 5 wt% based on the amount of active antibody, usually present in at least a total amount of about 0.001% by weight based on antibody concentration again. 往々にして、活性成分を希釈するために不活性増量剤又は賦形剤を内含することが望ましくなり、その場合、賦形剤は、合計組成物の約1〜99重量%で存在し得る。 Often, it becomes desirable to entailment inert extender or excipient to dilute the active ingredients, where the excipient may be present in from about 1 to 99% by weight of the total composition . 修飾された抗体に結合する能力をもつ第2の抗体が検定中で利用される場合、これは通常、別のバイアル内に存在することになる。 Where a second antibody capable of binding to the modified antibody is employed in the assay, which will usually be present in a separate vial. 第2の抗体は標準的に、上述の抗体処方と類似の要領で、標識に接合され処方される。 The second antibody is a standard, in a similar manner as described above for antibody formulations, which are joined to a label formulated.

修飾された抗体はさまざまな治療向け利用分野をもつ。 The modified antibodies have a variety of treatment for the use field. 修飾された抗体は、かかる抗体の投与の恩恵を受け得る、或る疾患又は障害を患う又はそれにかかりやすい患者を治療するために使用可能である。 Modified antibodies can be used may benefit from administration of such antibodies, to treat the susceptible patient suffering from or in a certain disease or disorder. 該抗体で治療可能な身体条件としては、癌;喘息といった炎症性条件;自己免疫疾患;及びウイルス感染などがある。 Treatable physical condition in said antibody, cancer; and the like, and viral infections; inflammatory conditions such as asthma; autoimmune diseases.
本明細書中に記述されている抗体により治療可能な癌には、乳癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、消化管癌、膵臓癌、グリア芽種、子宮頸癌、卵巣癌、膀胱癌、肝臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、肝癌及びさまざまなタイプの頭部及び頸部癌が含まれるがこれに制限されるわけではない。 Treatable cancers by antibodies described herein are breast, squamous cell cancer, small-cell lung cancer, non-small cell lung cancer, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer , bladder cancer, liver cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrial carcinoma, salivary gland carcinoma, kidney cancer, liver cancer, prostate cancer, Kagemongan, thyroid cancer, hepatic carcinoma and various types of head and neck cancer but it is not limited to this.

自己免疫疾患には、アジソン病、耳の自己免疫疾患、ブドウ膜炎といった眼の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎、クローン病、糖尿病(I型)、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化性、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シューグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、潰瘍性大腸炎、及び脈管炎が含まれるかこれに制限されるわけではない。 Autoimmune diseases, Addison's disease, ear autoimmune diseases, ocular autoimmune diseases such as uveitis, autoimmune hepatitis, Crohn's disease, diabetes (I-type), epididymitis, glomerulonephritis, Graves' disease , Guillain-Barre syndrome, Hashimoto's disease, hemolytic anemia, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis resistance, myasthenia gravis, pemphigus vulgaris, psoriasis, rheumatoid arthritis, sarcoidosis, scleroderma, Sjogren's syndrome, spine arthropathy, thyroiditis, ulcerative colitis, and this not being limited either include vasculitis.

本発明における減少した血清半減期をもつ修飾された抗体は、組織又は外来性微生物の破壊又は除去が望ましい疾病又は障害の治療において使用可能である。 The modified antibodies with serum half-life was reduced in the present invention may be used in the treatment of diseases or disorders destruction or removal is desired tissue or foreign microorganisms. 例えば、抗体は、癌、炎症性障害;感染症及び組織の除去が望まれるその他の身体条件を治療するために使用可能である。 For example, antibodies, cancer, inflammatory disorders; can be used to treat other body conditions the removal of infection and tissue is desired. 抗体は一般に、より迅速な生物学的クリアランス時間が結果として、投与されたあらゆる抗体の免疫原性の減少をもたらすことになるという点において有用である。 Antibodies In general, as more rapid biological clearance times result useful in that will result in reduced immunogenicity of any antibody administered. その他の利用分野としては、抗体ベースの画像形成法、抗体ベースの薬物除去又はより寿命の短かい免疫毒素の創造、が含まれることになる。 Other Field of the antibody-based imaging methods, the creation of short immunotoxin antibody-based drug removal, or than the lifetime, will be included.

増大した血清半減期をもつ修飾された抗体は、抗組織因子(TF)抗体、抗IgE抗体及び抗インテグリン抗体であり得る。 The modified antibodies with increased serum half-life may be an anti-tissue factor (TF) antibody, anti-IgE antibodies and anti-integrin antibodies. 所望の作用メカニズムは、リガンド-レセプタ結合対を遮断することにあり得る。 Desired mechanism of action, the ligand - can be in blocking the receptor binding pair. 増大した血清半減期をもつ修飾された抗体は、同様にアゴニスト抗体でもあり得る。 The modified antibodies with increased serum half-life, may likewise be an agonist antibody. 抗体は、同様に、ワクチンといったような治療薬としても使用できる。 Antibodies can likewise be used as therapeutic agents such as vaccines. かかるワクチンの投薬量及び免疫化頻度は、抗体の血清半減期が伸びたため減らされることになる。 Dosage and immunization frequency of such vaccines will be reduced due to serum half-life of the antibody is extended.
当該抗体を含む組成物は、非経口皮下投与、腹腔内投与、肺内投与、及び鼻腔内投与そして局所的免疫抑制治療用として所望の場合には、病変内投与を含むあらゆる適切な手段で投与される。 Composition comprising the antibody, parenteral subcutaneous, intraperitoneal, intrapulmonary, and if desired for the intranasal administration and topical immunosuppressive therapy, administered by any suitable means including intralesional administration It is. 非経口輸液には、筋内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が含まれる。 Parenteral infusions, intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal or subcutaneous administration. さらに、抗体は、特に下降する抗体用量でのパルス輸液によって適切に投与される。 Furthermore, the antibody is suitably administered by pulse infusion with an antibody dose of particularly lowered.

当該抗体又はそのカクテルを含有する組成物は、予防用及び/又は治療用処置のために投与できる。 The antibody or composition containing the cocktail, can be administered for prophylactic and / or therapeutic treatment. 治療向け利用分野においては、すでに特定の疾病にかかっている患者に対して、その身体条件及びその合併症を治ゆさせるか又は少なくとも部分的に阻むのに充分な量で組成物が投与される。 In the treatment for FIELD, to a patient already suffering from a particular disease, the composition is administered in an amount sufficient to thwart its physical condition and its complications or at least partially cure . これを達成するための適量は、「治療上の有効量」として定義づけされる。 An amount adequate to accomplish this is defined to be a "therapeutically effective amount". この使用にとって有効な量は、身体条件の重症度及び患者自身の免疫系の全体的状態によって左右されることになるが、一般的には、一用量あたり約0.01〜約100mgの修飾された抗体の範囲内にあり、患者一人あたり1〜10mgの投薬量がより一般的に使用されている。 It amounts effective for this use, but will be influenced by the overall condition of the immune system severity and patient's own physical condition, in general, the modified antibodies of about 0.01 to about 100mg per dose in the range of the dosage of the patient per person 1~10mg is more commonly used.

予防向け利用分野においては、修飾された抗体又はそのカクテルを含有する組成物は、すでに疾病状態にない患者に対して、その患者の抵抗力を増強させるために投与される。 In prophylactic friendly FIELD, modified antibody, or composition containing a cocktail thereof are administered previously to a patient without the disease state, to enhance the resistance of the patient. このような量は、「予防上の有効量」として定義づけされる。 Such an amount is defined as the "effective amount on prevention". この用途においては、精確な量はここでも患者の健康状態及び全体的免疫性レベルに左右されるが一般には一用量あたり0.1〜100mgの範囲内にあり、特に患者一人あたり1〜10mgの投薬量である。 In this application, in the range of 0.1~100mg per dose are generally will depend on the precise amounts health and overall immunity level of the patient Again, the dosage of particular 1~10mg person per patient it is.

組成物の単一又は多数回投与を実施できるが、用量レベル及びパターンは、治療を行なう医師によって選択される。 It can be carried out single or multiple administrations of the compositions, dosage levels and patterns being selected by the treating physician. いずれの場合でも、薬学的処方は、患者を有効に治療するのに充分な量の本発明の突然変異体抗体を提供しなければならない。 In any case, the pharmaceutical formulations should provide a mutant antibodies of the present invention in an amount sufficient to effectively treat the patient.
以下の例は、制限としてではなく例示を目的として提供されるものである。 The following example is provided for the purpose of illustration and not by way of limitation. 全ての引用の開示は、本明細書に明示的に参考として包含されている。 The disclosures of all citations is included as expressly herein by reference.

例1 Example 1.
この例は、本発明において使用される抗体発現ベクターについて記述している。 This example describes the antibody expression vectors used in the present invention.
pVg2.D.TtのM3変異体の1誘導体(Core et al., J. Immunol. 159:3613〜3621(1997))である重鎖発現プラスミドpVAg2M3-OST577の成分は、以下の通りである。 1 derivatives of the M3 variant of pVg2.D.Tt (Core et al, J. Immunol 159:.. 3613~3621 (1997)) component of a is heavy chain expression plasmid pVAg2M3-OST577 are as follows. 図5Aに示されているように、EcoRI部位から時計回り方向に進んで、重鎖単位は、EcoRI-XbaIフラグメントとしてのヒトサイトメガロウイルス(hCMV)主要前初期(IE)プロモータ及びエンハンサ(Boshart et al., Cell41;521-530(1985))で始まる。 As shown in Figure 5A, proceeding from the EcoRI site in the clockwise direction, the heavy chain unit, the human cytomegalovirus as EcoRI-XbaI fragment (hCMV) major immediate early (IE) promoter and enhancer (Boshart et al, Cell41;. begins with a 521-530 (1985)). hCMV領域の後には、シグナル配列、Jセグメント及びスプライス供与体配列を含むXbaIフラグメントとしてのOST577V H領域が続いている。 After hCMV region, signal sequence, OST577V H region as XbaI fragment containing the J segments and splice donor sequences are followed.

V H領域の後には、BamHI-EcoRIEGとしてのヒト補体遺伝子 C2(Ashfield et al.,EMBO J. 10:4197-4207(1991))の転写ターミネータが後続する、C H 3に後続するmRNAプロセッシングのためのポリアデニル化(poly A)シグナル、及びC H 1に先行するイントロンの一部、介在イントロンを伴うC H 1、ヒンジ(H)、C H 2及びC H 3エクソンを内含する、XbaI-BamHIフラグメントとしてのヒトガンマ-2M3重鎖定常領域(Cole et al., 前掲書中)を含有する装飾済みゲノミックDNAフラグメントが、続いている。 After a V H region, the human complement gene C2 as BamHI-EcoRIEG (Ashfield et al, EMBO J. 10:. 4197-4207 (1991)) transcription terminator is followed, mRNA processing following the C H 3 polyadenylation (poly a) signal, and part of the intron preceding the C H 1 for, to entailment the C H 1, hinge (H), C H 2 and C H 3 exons with the intervening introns, XbaI Human gamma -2M3 heavy chain constant region as -BamHI fragment (Cole et al., op. cit.) decoration already genomic DNA fragment containing has subsequently. 重鎖単位の後には、転写に必要なシミアンウイルス40(SV40)からの調節要素(エンハンサ、プロモータ、スプライスシグナル及びpoly Aシグナル)と共に、突然変異体形態のジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)をコードする遺伝子が続いている。 After the heavy chain unit encodes regulatory elements (enhancer, promoter, splice signals and poly A signal) with dihydrofolate reductase mutant forms of (dhfr) from Simian Virus 40 necessary for transcription (SV40) gene is continuing. プラスミドpVgIからのBamHI-EcoRIフラグメントとしてとられた(Co et al., 前掲書中)この領域は、BamHI部位をEcoRI部位に変換することによって装飾された。 Was taken as a BamHI-EcoRI fragment from plasmid pVgI (Co et al., Op. Cit.) This area is decorated by converting the BamHI site to an EcoRI site.

この単位の内部でもとのEcoRI部位から反時計まわりに移動すると、まず第1に、細菌宿主内のベクターのコピー数を増大させるべく、細菌複製起点がpUC18からの対応するセグメントで置換された(Yanisch-Perron et al., Gene 33:103-119(1985))ということを除いて、E. coli内の選択のための細菌複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドpBR322(Suteliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.43:77-90(1979))の一部分が存在する。 Moving inside of the unit from the original EcoRI site counterclockwise, first of all, in order to increase the copy number of the vector in a bacterial host, a bacterial replication origin was replaced with the corresponding segment from pUC18 ( . Yanisch-Perron et al, gene 33:. 103-119 (1985)) except that, E plasmid pBR322 containing the bacterial origin of replication and ampicillin resistance gene for selection in coli (Suteliffe, Cold Spring Harbor Symp . Quant Biol.43:. part of 77-90 (1979)) are present. 次に、強力な転写開始を確保するためにSV40エンハンサ及び早期プロモータを含有するSV40セグメント(Reddy et al., Science 200:494-502(1978))が存在する。 Next, SV40 segment containing the SV40 enhancer and early promoter to ensure strong transcription initiation (Reddy et al, Science 200:. 494-502 (1978)) are present. このセグメントの後には、E. coli dhfr遺伝子のコーディング配列(Simonsen and Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2495-2499(1983))が続いている。 After this segment, E coding sequence coli dhfr gene (Simonsen and Levinson, Proc Natl Acad Sci USA 80:.... 2495-2499 (1983)). Is followed. dhfr 遺伝子の後には、mRNAレベルを増大すると考えられている小さなt抗原イントロンを含有するSV40セグメントが続き、このとき、プラスミドは、mRNA写しを終結するためのpolyAシグナルを含むもう1つのSV40セグメントを含む。 After dhfr gene, SV40 segment containing the small t antigen intron, which is believed to increase mRNA levels is followed, this time, plasmid, another SV40 segment containing a polyA signal for ending the mRNA transcript including.

pVglの誘導体(Co et al., 前掲書中)である重鎖発現プラスミドpVAgl.N-OST577の成分は、以下の通りである。 Derivatives of pVgl (Co et al., Op. Cit.) The components of the heavy chain expression plasmid pVAgl.N-OST577 a is as follows. 図5Bに示されているように、EcoRI部位から時計まわり方向に進んで、重鎖単位は、XbaIフラグメントとしてのOST577V H領域が後続するpVAg2M3-OST577ベクター内で使用されたhCMV IEプロモータ及びエンハンサを含有する同じEcoRI-XbaIフラグメントで始まる。 As shown in Figure 5B, proceeding from the EcoRI site in the clockwise direction, the heavy chain unit, the hCMV IE promoter and enhancer that was used in the pVAg2M3-OST577 into vectors OST577V H region as XbaI fragment followed It begins with the same EcoRI-XbaI fragment containing. C H 3に後続するmRNAプロセッシングのためのpolyAシグナル、及びC H 1に先行するイントロンの一部、介在イントロンを伴うC H 1、ヒンジ(H)、C H 2及びC H 3エクソンを内含する。 PolyA signal for mRNA processing following the C H 3, and part of the intron preceding the C H 1, entailment the C H 1, hinge (H), C H 2 and C H 3 exons with the intervening introns to. V H領域の後には、XbaI-BamHIフラグメントとしてのヒトガンマ-1 重鎖定常領域(Ellison et al., Nucleic Acids Res.10:4071-4079(1982))を含有するゲノミックDNAフラグメントが、続いている。 After the V H region, human gamma-1 heavy chain constant region as XbaI-BamHI fragment (Ellison et al, Nucleic Acids Res.10 :. 4071-4079 (1982)) is genomic DNA fragment containing and subsequently . コーディング領域のその後の操作を容易にするためには、ヒンジとC H 2エクソンの間でイントロン内にNheI部位を作り出すべくオーバーラップ・エクステンションPCR 変異誘発(Higuchi, 前掲書中)が使用された。 To facilitate subsequent manipulations of the coding regions, overlap-extension PCR mutagenesis to create an NheI site in the intron between the hinge and the C H 2 exons (Higuchi, op. Cit.) Was used. 重鎖単位の後には、pVAg2M3-OST577ベクター内で使用された、プラスミドpBR322の一部分及び調節要素を伴ったdhfrをコードする同じBamHI-EcoRI制限フラグメントが続いている。 After the heavy chain unit is followed by the same BamHI-EcoRI restriction fragment encoding dhfr accompanied used within pVAg2M3-OST577 vector, a portion and regulatory elements of the plasmid pBR322.

pVKの誘導体(Co et al., 前掲書中)である軽鎖発現プラスミドpVAλ2-OST577の成分は、以下の通りである。 Derivatives of pVK (Co et al., Op. Cit.) Component of the light chain expression plasmid pVAλ2-OST577 a is as follows. 図6に示されているように、EcoRI部位から時計回り方向に進んで、シグナル配列、Jセグメント及びスプライス供与体配列を内含する、Xbal フラグメントとしてのOST577V L領域が後続する、重鎖ベクター内で使用されたhCMV IEプロモータ及びエンハンサを含有する同じEcoRI-XbaIフラグメントで始まる。 As shown in FIG. 6, proceeding from the EcoRI site in the clockwise direction, the signal sequence and entailment the J segments and splice donor sequences, OST577V L region is followed as Xbal fragment, the heavy chain vector in It begins with the same EcoRI-XbaI fragment containing the hCMV IE promoter and enhancer that was used in. V L領域には、ヒトラムダ-1 軽鎖からのmRNAプロセッシングのためのpolyAシグナルそして、ヒトラムダ2-軽鎖からの3′未翻訳領域の一部分及びヒトラムダ-2軽鎖定常領域エクソン(Cλ2)、ヒトラムダ-1軽鎖イントロンを内含する、ヒトラムダ-2軽鎖定常領域をコードするべくPCRにより装飾された(Hieter et al., Nature 294:536-540(1981))XbaI-Sau3Aフラグメントとしてのヒトラムダ-1軽鎖定常領域(Hieter et al., 同書中)を含有するゲノミックDNAフラグメントが続いている。 The V L region, polyA signal and for mRNA processing from the human lambda -1 light chain, a portion of the 3 'untranslated region from the human lambda 2 light chain and human lambda -2 light chain constant region exon (Cλ2), human lambda (. Hieter et al, Nature 294: 536-540 (1981)) -1 for entailment light chain intron, decorated by PCR to encode the human lambda -2 light chain constant region XbaI-Sau3A human lambda as fragments - 1 light chain constant region (Hieter et al., ibid.) is followed by a genomic DNA fragment containing.

軽鎖遺伝子には、転写に必要なSV40からの調節要素と合せて、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子(gpt)が続いている。 The light chain gene, together with regulatory elements from SV40 needed for transcription, the gene encoding xanthine guanine phosphoribosyl transferase (gpt) is followed. プラスミドpSV2-gpt(Mulligan and Berg.前掲書中)からBamHI-EcoRIフラグメントとしてとられたこの領域の機能は、哺乳動物細胞内へのプラスミドのトランスフェクションの後に、選択可能な薬物耐性マーカーを提供することにある。 Plasmid pSV2-gpt (Mulligan and Berg. Op.cit) function of this region taken from a BamHI-EcoRI fragment, after transfection of the plasmid into mammalian cells, to provide a selectable drug-resistance marker It lies in the fact. EcoRI部位からこの単位内を反時計回り方向に移動すると、まず第1に、細菌宿主内のベクターのコピー数を増大させるべく、細菌複製起点がpUC18からの対応するセグメントで置換された(Yanisch-Perron et al.,前掲書)ということを除いて、E. coli内の選択のための細菌複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドpBR322(Sutcliffe, 前掲書)の一部分が存在する。 Moving this unit in the EcoRI site in the counterclockwise direction, first of all, in order to increase the copy number of the vector in a bacterial host, a bacterial replication origin was replaced with the corresponding segment from pUC18 (Yanisch- Perron et al., except that supra), E. bacterial replication for selection in coli origin and plasmid pBR322 (Sutcliffe containing ampicillin resistance gene, a portion of supra) exist.

次に、強力な転写開始を確保するためにSV40エンハンサ及び早期プロモータを含有するSV40セグメント(Reddy et al., 前掲書中)が存在する。 Next, SV40 segment containing the SV40 enhancer and early promoter to ensure strong transcription initiation (Reddy et al., Op. Cit.) Are present. このセグメントの後には、E. coli gpt 遺伝子のコーディング配列(Richardson et al., Nucleic Acids Res. 11:8809-8816(1983))が続いている。 After this segment, E coli gpt gene coding sequence. (Richardson et al, Nucleic Acids Res 11:.. 8809-8816 (1983)) is followed. gpt 遺伝子の後には、mRNAレベルを増大すると考えられている小さなt抗原イントロンを含有するSV40セグメントが続き、このとき、プラスミドは、mRNA写しを終結するためのpolyAシグナルを含むもう1つのSV40セグメントを含む。 After gpt gene, SV40 segment containing the small t antigen intron, which is believed to increase mRNA levels is followed, this time, plasmid, another SV40 segment containing a polyA signal for ending the mRNA transcript including.

重鎖発現プラスミドpVAg2M3-HuID10(図7A参照)の成分は、OST577V H領域がプラスミドpHuID10.IgG1.rgpt.dE(Kostelny et al.,(2001)前掲書中)からのHuID10V H領域と置き換わっているという点を除いて、それが由来したpVAg2M3-OST577のものと同一である。 The components of the heavy chain expression plasmid pVAg2M3-HuID10 (see FIG. 7A) is, OST577V H region plasmid pHuID10.IgG1.rgpt.dE (Kostelny et al., ( 2001) op.cit) are replaced with HuID10V H region from except that, it is identical to that of pVAg2M3-OST577 was derived. 重鎖発現プラスミドpVAg1.N-HulD10(図7B参照)の成分は、OST577V H領域がプラスミドpHuID10.IgG1.rgpt.dE(Kostelny et al.,(2001)同書中)からのHulD10V H領域と置き換わっているという点を除いて、それが由来したpVAg1.N-OST577のものと同一である。 The components of the heavy chain expression plasmid pVAg1.N-HulD10 (see FIG. 7B), OST577V H region plasmid pHuID10.IgG1.rgpt.dE (Kostelny et al., ( 2001) ibid.) Replaced by a HulD10V H region from except that there are the same as those of pVAg1.N-OST577 it was derived.

重鎖発現プラスミドpHuHCg3.Tt.D-Hu1D10の成分(図7Cを参照のこと)は、pVg2.D.Tt(Cole et al., 前掲書中)の成分と同一であり、但しヒトγ−2M3重鎖定常領域で含むXbaI−BamHIフラグメントが、XbaIフラグメントとして、プラスミドpHu1D10.IgG1.rgpt.dE(Kostelngなど. (2001), 前掲書中)からのHu1D10V H領域により置換され、続いてC H 1、4種のヒンジ(H)、C H 2及びC H 3、介在性イントロンを含むエキソン、C H 1の前のイントロンの一部、及びC H 3に続くmRNAプロセッシングのためのポリアデニル化(ポリA)シグナルを含む、Xba−BamHIフラグメントとしてのヒトγ−3重鎖定常領域(Huck et al., Nucleic Acids Res. 14: 1779-1789 (1986))を含むゲノムDNAフラグメントが存在する。 The components of the heavy chain expression plasmid pHuHCg3.Tt.D-Hu1D10 (see Figure 7C) is, pVg2.D.Tt (Cole et al., Op. Cit.) Are the same as components of the, except human gamma-2M3 XbaI-BamHI fragment containing the heavy chain constant region, as XbaI fragment, plasmid PHu1D10.IgG1.Rgpt.DE (such Kostelng. (2001), op. cit) is replaced by Hu1D10V H region from, followed by C H 1 , four hinge (H), C H 2 and C H 3, polyadenylation (poly for mRNA processing following the exon, part of the previous intron C H 1, and C H 3 including intervening intron including a) signal, Xba-BamHI human gamma-3 heavy chain constant region as a fragment (Huck et al, Nucleic Acids Res 14:.. 1779-1789 (1986)) there is genomic DNA fragments containing.

重鎖発現プラスミドpHuHCg4.Tt.D-Hu1D10の成分は、pHuHCg3.Tt.D-Hu1D10の成分と同一であり(図7Dを参照のこと)、但し、ヒトγ−3重鎖定常領域が、C H 1、ヒンジ(H)、C H 2及びC H 3、介在性イントロンを含むエキソン、C H 1の前のイントロンの一部、及びC H 3に続くmRNAプロセッシングのためのポリアデニル化(ポリA)シグナルを含む、Xba−BamHIフラグメントとしてのヒトγ−4重鎖定常領域(Ellison et al., 前掲書中)を含むゲノムDNAフラグメントにより置換された。 The components of the heavy chain expression plasmid pHuHCg4.Tt.D-Hu1D10 is identical to the components of pHuHCg3.Tt.D-Hu1D10 (see Figure 7D), however, human gamma-3 heavy chain constant region, C H 1, hinge (H), C H 2 and C H 3, exons containing intervening introns, C part of the previous intron H 1, and polyadenylation for mRNA processing following C H 3 (poly a ) including the signal, Xba-BamHI human gamma-4 heavy chain constant region as a fragment (Ellison et al., which is substituted by genomic DNA fragments containing op.cit).
pVkの誘導体である(Co et al., 前掲書中)軽鎖発現プラスミドpVk-HulD10の成分は、以下の通りである。 A derivative of pVk components (Co et al., Supra in) the light chain expression plasmid pVk-Hu1D10 is as follows. 図8に示されているように、EcoRI部位から時計回り方向に進んで、シグナル配列、Jセグメント及びスプライス供与体配列を内含する、Xbal フラグメントとしてのHulD10V L領域(Kostelny et al.(2001))が後続する、重鎖ベクター内で使用されたhCMV IEプロモータ及びエンハンサを含有する同じEcoRI-XbaIフラグメントで始まる。 As shown in Figure 8, proceeding from the EcoRI site in the clockwise direction and entailment signal sequences, J segments and splice donor sequences, HulD10V L region as Xbal fragment (Kostelny et al. (2001) ) is followed, starting with the same EcoRI-XbaI fragment containing the hCMV IE promoter and enhancer that was used in the heavy chain vector. V L領域の後には、ヒトカッパ軽鎖定常領域エクソン(Cκ)、Cκに先行するイントロンの一部及びCκに後続するmRNAプロセッシング用のpolyAシグナルを内含する、XbaI-BamHIフラグメントとしてのヒトカッパ軽鎖定常領域(Hieter et al., Cell 22:197-207(1980))を含有するゲノミックDNAフラグメントが続いている。 After a V L region, a human kappa light chain constant region exon (C kappa), to entailment a polyA signal for mRNA processing following the part of the intron preceding the C kappa and C kappa, kappa Keikusarijo as XbaI-BamHI fragment constant region (Hieter et al, Cell 22:. 197-207 (1980)) is genomic DNA fragment containing continues. 軽鎖単位の後には、pVKベクターの中で使用された、転写に必要な調節要素及びプラスミドpBR322の一部分を伴った、gptをコードする同じBamH-EcoRIフラグメントが続いている。 After the light chain unit is used within pVK vector, accompanied by a portion of the regulatory elements and plasmid pBR322 necessary for transcription, and subsequently the same BamH-EcoRI fragment encoding gpt.

例2 Example 2.
この例は、本発明において使用されるプラスミドについて記述している。 This example describes the plasmids used in the present invention.
OST577 重鎖及び軽鎖cDNAは、ヒトモノクローナル抗HBV抗体を発現するトリオーマ細胞系統からPCRによりその全体がクローニングされた(Ehrich et al.前掲書)。 OST577 heavy and light chain cDNA their entirety were cloned by PCR from a trioma cell line expressing human monoclonal anti-HBV antibody (Ehrich et al. Supra). 重鎖及び軽鎖可変領域は、Co et al. 前出に概略説明されているように、シグナル配列、V、(D)、及びJセグメント、スプライスドナー配列及び対応するイントロンの一部分を含む、両方の端部でXbaIによりフランキングされたミニエクソンへとPCRにより変換された。 Heavy and light chain variable regions, Co et al., As is schematically described supra, including the signal sequence, V, a portion of (D), and J segments, splice donor sequences and the corresponding introns, both It converted by PCR into flanked mini exons with XbaI at the ends. pVg2.D.TtのM3変異体の誘導体である(Cole et al., 前掲書)発現ベクターpVAg2M3-OST577(図5A参照)は、OST577-V Hミニエクソンで、OKT3-V Hミニエクソンを含有するXbaIフラグメントを置換することによって構築された。 a derivative of M3 variant of pVg2.D.Tt (Cole et al., supra) expression vector pVAg2M3-OST577 (see Figure 5A) is a OST577-V H miniexon, containing OKT3-V H miniexon It was constructed by replacing the XbaI fragment.

次に、細菌複製起点を含有するPciI-FspIフラグメントをpUC18からの対応するPciI-FspIフラグメント(Yanisch-Perron et al., 前掲書)で置換して、細菌宿主内のベクターのコピー数を増大させた。 The corresponding Pcil-FspI fragment of the Pcil-FspI fragment containing the bacterial replication origin from pUC18 (Yanisch-Perron et al., Supra) was substituted with, increasing the copy number of the vector in a bacterial host It was. pVglの誘導体(Co et al.前掲書)である発現ベクターpVAgl.N-OST577(図5B参照)は、pVglのユニークXabI部位の中にOST577-V Hミニエクソンを含有するXbaIフラグメントを挿入し、オーバーラップ・エクステンションPCRによりヒンジ-CH 2イントロンを装飾しT(Higuchi, 前掲書)ユニークNheI部位を作り上げ、細菌複製起点を含有するHindIII-XhoIフラグメントをpVAg2M3-OST577からの対応するHindIII-XhoIフラグメントで置換して細菌宿主内のベクターのコピー数を増大させることによって構築された。 derivatives of pVgl (Co et al. supra) (see FIG. 5B) expression vector pVAgl.N-OST577 is inserts an XbaI fragment containing the OST577-V H miniexon into the unique XabI site of pVgl, overlap-extension PCR by decorating the hinge -CH 2 intron T (Higuchi, op. cit) created a unique NheI site, the HindIII-XhoI fragment containing the bacterial replication origin with the corresponding HindIII-XhoI fragment from pVAg2M3-OST577 substituted to built by increasing the copy number of the vector in bacterial hosts.

pVKの誘導体(Co et al.前掲書)である発現ベクターpVλ-OST577は、まず最初にゲノミックヒトカッパ定常領域を含むpVkのXbaI-Bam HIフラグメントを、ゲノミックヒトラムダ-1定常領域を含むXbaI-Bgl II PCR産物で置換することによって構築された。 Derivatives of pVK (Co et al. Supra) expression vector pVλ-OST577 is, first the XbaI-Bam HI fragment of pVk containing the genomic human kappa constant region first, including genomic human lambda-1 constant region XbaI- It was constructed by replacing Bgl II PCR products. コーディング領域及び3′の未翻訳領域の一部分をPCRによりOST577軽鎖cDNAからの対応するフラグメントと置換させて、基本的にゲノミックヒトラムダ-2定常領域エクソンを生成させた。 A portion of the untranslated region of the coding region and 3 'by substitution with the corresponding fragment from OST577 light chain cDNA by PCR, was basically to produce a genomic human lambda -2 constant region exon. 最終的に、ベクターのXabI部位内にOST577-V Lミニエクソンを挿入した。 Finally, the insertion of the OST577-V L miniexon into XabI site of the vector. pVλ-OST577の誘導体である発現ベクターpVAλ2-OST577(図6参照)は、細菌複製起点を含むSapI-FspIフラグメントをpVAg2M3-OST577からの対応するSapI-FspIフラグメントで置換して細菌宿主内のベクターのコピー数を増大させることによって構築された。 pVλ-OST577 expression vector is a derivative of pVAλ2-OST577 (see Figure 6) is the SapI-FspI fragment containing the bacterial replication origin was replaced with the corresponding SapI-FspI fragment from pVAg2M3-OST577 vector in a bacterial host It was constructed by increasing the copy number.

発現ベクターpVAg2M3-HulD10(図7A参照)は、hCMVプロモータ及びエンハンサ-(Boshart et al.前掲書)及びOST577V H領域を含むプラスミドpVAg2M3-OST577からのXhoI-XbaIフラグメントを、hCMVプロモータ及びエンハンサ及びHulD10V H領域を含むプラスミドpHulD10.IgG1.rgpt.dEからの対応するXhoI-XbaIフラグメント(Kostelny et al.(2001)前掲書)で置換することによって構築された。 Expression vectors pVAg2M3-Hu1D10 (see Figure 7A) is, hCMV promoter and enhancer - the XhoI-XbaI fragment from (. Boshart et al supra) plasmid pVAg2M3-OST577 containing and OST577V H region, hCMV promoter and enhancer and HulD10V H It was constructed by replacing with the corresponding XhoI-XbaI fragment from plasmid pHulD10.IgG1.rgpt.dE containing region (Kostelny et al. (2001) ibid). 発現ベクターpVAg1.N-Hul D10(図7B参照)は、hCMVプロモータ及びエンハンサ(Boshart et al.,前掲書)及びOST577V H領域を含むプラスミドpVAgl.N-OST577からのXhoI-XbaIフラグメントをhCMVプロモータ及びエンハンサ及びHulD10V H領域を含むプラスミドpHulD10.IgG1.rgpt.dE(Kostelny et al.(2001)前掲書)からの対応するXhoI-XbaIフラグメントで置換することによって構築された。 Expression vectors pVAg1.N-Hul D10 (see FIG. 7B), hCMV promoter and enhancer (Boshart et al., Supra) and OST577V H regions and hCMV promoter a XhoI-XbaI fragment from plasmid pVAgl.N-OST577 including enhancer and plasmids containing HulD10V H region pHulD10.IgG1.rgpt.dE was constructed by replacing the corresponding XhoI-XbaI fragment from (Kostelny et al. (2001) ibid).

発現ベクターpHuHCg3.Tt.D-Hu1D10(図7Cを参照のこと)は、hCMVプロモーター及びエンハンサー、及びヒトγ−2M3重鎖定常鎖領域を含む、pVg2.D.Tt (Cole et al. 前掲)のM3変異体からのXhoI−BamHIフラグメントを、hCMVプロモーター及びエンハンサー、及びHu1D10 V H領域を含む、プラスミドpHu1D10.IgG1.rgpt.dE (Kostelny et al. (2001), 前掲)からのXhoI-XbaIフラグメント、及びヒトγ−3重鎖定常領域(Huck et al., 前掲)を含むXbaI−BamHIフラグメントによりそれぞれ置換することにより構成された。 Expression vectors pHuHCg3.Tt.D-Hu1D10 (see Figure 7C) is, hCMV promoter and enhancer, and a human gamma-2M3 heavy chain constant chain region, PVg2.D.Tt of (Cole et al. Supra) the XhoI-BamHI fragment from M3 mutants, hCMV promoter and enhancer, and a Hu1D10 V H region, plasmid pHu1D10.IgG1.rgpt.dE (Kostelny et al. (2001 ), supra) XhoI-XbaI fragment from, and human gamma-3 heavy chain constant region (Huck et al., supra) was constructed by replacing each with XbaI-BamHI fragment containing the.

発現ベクターpHuHCg4.Tt.D-Hu1D10(図7Dを参照のこと)は、hCMVプロモーター及びエンハンサー、及びヒトγ−2M3重鎖定常鎖領域を含む、pVg2.D.Tt (Cole et al. 前掲)のM3変異体からのXhoI−BamHIフラグメントを、hCMVプロモーター及びエンハンサー、及びHu1D10 V H領域を含む、プラスミドpHu1D10.IgG1.rgpt.dE (Kostelny et al. (2001), 前掲)からのXhoI-XbaIフラグメント、及びヒトγ−4重鎖定常領域(Huck et al., 前掲)を含むXbaI−BamHIフラグメントによりそれぞれ置換することにより構成された。 Expression vectors pHuHCg4.Tt.D-Hu1D10 (see Figure 7D) is, hCMV promoter and enhancer, and a human gamma-2M3 heavy chain constant chain region, PVg2.D.Tt of (Cole et al. Supra) the XhoI-BamHI fragment from M3 mutants, hCMV promoter and enhancer, and a Hu1D10 V H region, plasmid pHu1D10.IgG1.rgpt.dE (Kostelny et al. (2001 ), supra) XhoI-XbaI fragment from, and human gamma-4 heavy chain constant region (Huck et al., supra) was constructed by replacing each with XbaI-BamHI fragment containing the.

発現ベクターpVK HulD10(図8参照)は、hCMVプロモータ及びエンハンサ(Boshart et al.前掲書)を含むプラスミドpVkからのXhoI-XbaIフラグメント(Co et al.,前掲書)をhCMVプロモータ及びエンハンサ及びHulD10V L領域を含むプラスミドpHulD10.IgG2.rgpt.dEからのXhoI-XbaIフラグメント(Kostelny et al.(2001)前掲書)で置換することによって構築された。 Expression vectors pVK Hu1D10 (see Figure 8) is, hCMV promoter and enhancer (Boshart et al. Supra) XhoI-XbaI fragment from plasmid pVk containing (Co et al., Supra) hCMV promoter to and enhancer and HulD10V L XhoI-XbaI fragment from plasmid pHulD10.IgG2.rgpt.dE containing region was constructed by replacing (Kostelny et al. (2001) ibid).

pVk.rgの誘導体(Cole et al., 前掲書)である基本EX VpDL172は、ゲノミックヒトカッパ定常領域を含むXbaI-SphIフラグメントを、M195重鎖シグナル配列のN末端部分を含むXbaI-NheIフラグメント(Co et al., 前掲書)、0.7kbのNheI-AgeIフラグメント、ヒト崩壊加速因子からのGPIリンケージシグナル(Caras et al., Nature 325;545-549(1987))が後続するマウスモノクローナル抗体のE10によって認識される(Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5;3610-3616(1985))リンカーペプチドによりフランキングされたヒトc-mycデカペプチドをコードする合成AgeI-EagIフラグメント、及びヒト免疫グロブリンガンマ-1 遺伝子のpolyAシグナルを含有するEagI-SphIフラグメント(Ellison et al., 前掲書)から成るXbaI-SphIフラグメントで置換することによって構築された。 Derivative of pVk.rg (Cole et al., Supra) Basic EX VpDL172 is, the XbaI-SphI fragment containing the genomic human kappa constant region, XbaI-NheI fragment containing the N-terminal portion of the M195 heavy chain signal sequence ( . Co et al, supra), NheI-AgeI fragment of 0.7 kb, GPI linkage signal from human decay accelerating factor (Caras et al, Nature 325;. 545-549 (1987)) is subsequent mouse monoclonal antibody E10 recognized by (Evan et al, Mol Cell Biol 5;.... 3610-3616 (1985)) synthesized AgeI-EagI fragment encoding flanking human c-myc decapeptide by a linker peptide, and human immunodeficiency globulin gamma -1 EagI-SphI fragment containing the polyA signal of the gene (Ellison et al., supra) was constructed by replacing XbaI-SphI fragment comprised of.

ヒトベータ-2-ミクログロブリン(β2m)及びヒト新生児Fcレセプタ(FcRn)アルファ鎖の細胞外ドメインを、ヒト末梢血単核細胞から調製したcDNAライブラリからPCRによりクローニングさせた。 The human beta-2-microglobulin (.beta.2m) and human neonatal Fc receptor (FcRn) the extracellular domain of alpha chain were cloned by PCR from a cDNA library prepared from human peripheral blood mononuclear cells. ヒトFcRnアルファ鎖遺伝子をPCRによって装飾させ、5′末端ではフランキングNheI部位及びM195重鎖シグナル配列(Co et al., 前掲書)をそして3′末端ではフランキングAgeI部位を加え、これを用いてpDL172のNheI-AgeIフラグメントを置換して、結果として発現ベクターpDL172+HuFcRnを得た。 The human FcRn alpha chain gene was decorated by PCR, 5 'flanking NheI site and the M195 heavy chain signal sequence at the end (Co et al., Supra) and the 3' addition of flanking AgeI site at the terminal end, using the same and to replace the NheI-AgeI fragment of pDL172 Te, in expression vector pDL172 + HuFcRn consequently.

ヒトβ2m遺伝子をPCRで修飾させて、5′及び3′末端でそれぞれフランキングXbaI及びSalI部位を付加し、内部EcoRI部位を除去した。 Human β2m gene was modified by PCR, respectively at the 5 'and 3' ends to add flanking XbaI and SalI sites, and to remove an internal EcoRI site. 結果として得たXbaI-SalIフラグメントを、ヒト補体遺伝子C2(Ashfield et al., 前掲書)の転写ターミネータを含有するBam HI-EcoRIフラグメントが後続する、マウス免疫グロブリンガンマ-2a遺伝子のポリアデニル化シグナルを含有するSalI-Bam HIフラグメント(Kostelny et al.(1992)前掲書)によりその3′末端上でそしてhCMVIEプロモータ及びエンハンサを含有するEcoRI-XbaIフラグメント(Boshart et al. 前掲書)によりその5′末端でフランキングされた中間ベクターへと、サブクローニングさせた。 The resulting XbaI-SalI fragment, human complement gene C2 (Ashfield et al., Supra) Bam HI-EcoRI fragment containing the transcriptional terminator is followed, the mouse immunoglobulin gamma -2a gene polyadenylation signal the SalI-Bam HI fragment containing the 3 by (Kostelny et al. (1992) ibid) 'a the end and EcoRI-XbaI fragment containing the hCMVIE promoter and enhancer (Boshart et al. supra) by its 5' into flanked intermediate vector at the end, it was subcloned. 結果として得た、官能性ヒトβ2m転写単位を含むEcoRI-EcoRIフラグメントを、pDL172+HuFcRnのユニークEcoRI部位へとクローニングさせて、結果として以下pDL208(図9A参照)と呼ぶ発現ベクターpDL172+HuFcRn+Huβ2mを得た。 Resulting, the EcoRI-EcoRI fragment containing a functional human β2m transcriptional unit, pDL172 + HuFcRn by cloned into the unique EcoRI site of the expression vector, hereinafter referred to as as a result pDL208 (see Figure 9A) pDL172 + HuFcRn + Huβ2m It was obtained.

アカゲザルβ2m及びアカゲザルFnRnアルファ鎖の細胞外ドメインを、アカゲザル末梢血単核細胞から調製されたcDNAライブラリからPCRによってクローニングさせた。 The extracellular domain of rhesus β2m and rhesus FnRn alpha chain were cloned by PCR from a cDNA library prepared from rhesus peripheral blood mononuclear cells. アカゲザルβ2m遺伝子をPCRで装飾させて、5′及び3′末端でそれぞれフランキングXbaI及びSalI部位を付加し、内部EcoRI部位を除去した。 The rhesus β2m gene was decorated with PCR, respectively at the 5 'and 3' ends to add flanking XbaI and SalI sites, and to remove an internal EcoRI site. 結果として得たXbaI-SalIフラグメントを、ヒト補体遺伝子C2(Ashfield et al., 前掲書)の転写ターミネータを含有するBam HI-EcoRIフラグメントが後続する、マウス免疫グロブリンガンマ-2a遺伝子のポリアデニル化シグナルを含有するSalI-Bam HIフラグメント(Kostelny et al.(1992)前掲書)によりその3′末端上でそしてhCMVIEプロモータ及びエンハンサを含有するEcoRI-XbaIフラグメント(Boshart et al. 前掲書)によりその5′末端でフランキングされた中間ベクターへと、サブクローニングさせた。 The resulting XbaI-SalI fragment, human complement gene C2 (Ashfield et al., Supra) Bam HI-EcoRI fragment containing the transcriptional terminator is followed, the mouse immunoglobulin gamma -2a gene polyadenylation signal the SalI-Bam HI fragment containing the 3 by (Kostelny et al. (1992) ibid) 'a the end and EcoRI-XbaI fragment containing the hCMVIE promoter and enhancer (Boshart et al. supra) by its 5' into flanked intermediate vector at the end, it was subcloned.

結果として得た、官能性アカゲザルβ2m転写単位を含むEcoRI-EcoRIフラグメントを用いて、pDL172+HuFcRn+Huβ2mの(ヒトβ2m転写単位を含有する)EcoRI-EcoRIフラグメントを置換して、結果としてpDL172+HuFcRn+Rhβ2mを得た。 Resulting, with EcoRI-EcoRI fragment containing a functional rhesus β2m transcriptional unit (containing the human β2m transcriptional unit) of pDL172 + HuFcRn + Huβ2m to replace the EcoRI-EcoRI fragment, resulting in pDL172 + HuFcRn + was obtained Rhβ2m. アカゲザルFcRnアルファ鎖遺伝子をPCRにより修飾して、5′末端ではフランキングNheI部位とM195重鎖シグナル配列のC末端部分(Co et al., 前掲書)を、そして3′末端ではフランキングAgeI部位を付加し、これを用いてpDL172+HuFcRn+Rhβ2mの(ヒトFcRnアルファ鎖遺伝子を含む)NheI-AgeIフラグメントを置換し、結果として以下pDL410(図9B参照)と呼ぶ発現ベクターpDL172+RhFcRn+Rhβ2mを得た。 The rhesus FcRn alpha chain gene was modified by PCR, 'C-terminal portion of the flanking NheI site and the M195 heavy chain signal sequence at the end (Co et al., Supra) and the 3' 5 flanking AgeI site at the end It was added and the pDL172 + HuFcRn + (including human FcRn alpha chain gene) of Rhβ2m NheI-AgeI fragment was replaced with an expression vector, hereinafter referred to as as a result PDL410 (see FIG. 9B) pDL172 + RhFcRn + Rhβ2m with this Obtained.

例3 Example 3.
この例は、ヒトγ2M3重鎖遺伝子のFc領域の変異誘発について記述している。 This example describes mutagenesis of the Fc region of the human γ2M3 heavy chain gene.
分子モデリング Molecular Modeling:
ラットFc/FcRn複合体の低解像度結晶構造に基づいて、ヒトFc/FcRn複合体の初期モデルが生成された(Burmeister et al., Nature 372:379-383(1994);RCSBタンパク質データバンクコードIFRT)。 Based on the low-resolution crystal structure of the rat Fc / FcRn complex, an initial model of the human Fc / FcRn complex was generated (Burmeister et al, Nature 372:. 379-383 (1994); RCSB Protein Data Bank code IFRT ). まず第1に複合体のラットβ2mは、その配位と同じ配位をヒト組織適合抗原HLA-A2の高解像度結晶構造から取られたヒトβ2mに重ね合わせることによって置換された(Saper et al. J. Mol. Biol. 219:277-319(1991));RCSPコード3HLA)。 First rat β2m of the first to complex the same coordination as the coordination substituted by superimposing the human β2m taken from a high-resolution crystal structure of the human histocompatibility antigen HLA-A2 (Saper et al. .. J. Mol Biol 219: 277-319 (1991)); RCSP code 3HLA). その後、ラットFcRnのアルファ鎖は、複合体内のラットアルファ鎖と同じ配位でヒトFcRnの高解像度結晶構造から取られたヒトアルファ鎖を重ね合わせることで置換された(West and Bjorkman, Biochemistry 29:9698-9708(2000);RCSBコード(1EXU)。 Then, the alpha chain of the rat FcRn was replaced by superimposing the human alpha chain taken at the same coordination as the composite body of the rat alpha chain from a high-resolution crystal structure of human FcRn (West and Bjorkman, Biochemistry 29: 9698-9708 (2000); RCSB code (1EXU).

次に、複合体Fc内のラット残基はヒトIgG1Fc(Kabat et al.前掲書)からの対応する残基で置換され、ヒトIgG1Fc/FcRn複合体のモデルを生成するべく、SEGMOD及びENCADプログラム(Levitt, J.Mol. Biol. 226:507-533(1992);Levitt, J. Mol. Biol. 168:595-620(1983))を用いてエネルギー最小化計算が行なわれた。 Next, the rat residues in the complex in the Fc is replaced with the corresponding residues from the human IgGlFc (Kabat et al. Supra), to generate a model of human IgGlFc / FcRn complex, SEGMOD and ENCAD programs ( Levitt, J.Mol Biol 226:.... 507-533 (1992); Levitt, J. Mol Biol 168: 595-620 (1983)) is energy minimization calculations using was performed. 最後に、モデルのヒトIgG1 Fc残基はヒトIgG2M3Fcからの対応する残基(Cole et al., 前掲書)で置換され、エネルギー最小化計算が反復されて、以下モデル1と呼ぶヒトIgG2M3 Fc/FcRnの複合体のモデルが生成された。 Finally, the human IgG1 Fc residues of the model corresponding residues from the human IgG2M3Fc (Cole et al., Supra) are substituted with, by energy minimization calculations are repeated, following the model 1 and the called person IgG2M3 Fc / complex model of the FcRn has been generated.

以下モデル2と呼ぶ第2のヒトIgG2M3 Fc/FcRn複合体モデルが、ラットFc/FcRn複合体のモデル(Weng et al., J. Mol. Biol. 282:217-225(1998);RCSBコード2FRTに基づいて、上述のとおりに生成された。 The following second human IgG2M3 Fc / FcRn complex model called the model 2, model of the rat Fc / FcRn complex (Weng et al, J. Mol Biol 282:... 217-225 (1998); RCSB code 2FRT based on, it was generated as described above.
以下モデル3と呼ぶ第3のモデルが、ヘテロ2量体ラットFc/FcRn複合体の高解像度結晶構造(Martin et al., Mol. Cell 7:867-877(2001);RCSBコード1/1A)に基づいて、上述の通りに生成された。 The following third model called the model 3, the high-resolution crystal structure of the heterodimer rat Fc / FcRn complex (Martin et al, Mol Cell 7:.. 867-877 (2001); RCSB code 1 / 1A) based on, it was generated as described above.

変異誘発 Mutagenesis;
(Kabat et al.,前掲書のEU指標に従って番号づけされた)OST577-IgG2M3 重鎖の位置250、314及び428で無作為アミノ酸置換を生成するために、オーバーラップ・エクステンションポリメラーゼ連鎖反応(PCR)方法(Higuchi, 前掲書)を使用した。 (Kabat et al., Are numbered according to the EU index of supra) with OST577-IgG2M3 heavy position of chains 250, 314 and 428 to generate a random amino acid substitutions, overlap-extension polymerase chain reaction (PCR) method (Higuchi, op. cit.) was used. 位置250で無作為突然変異体を生成するためには、M=A又はC、及びN=A、C、G又はTであるものとして変異誘発プライマJY24(5′-GAC CTC AGG GGT CCG GGA GAT CAT GAG MNN GTC CTT GG-3′)(配列番号77)及びJY25(5′-CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC-3′)(配列番号78)が使用された。 To generate random mutants at position 250, M = A or C, and N = A, C, the mutagenesis primers JY24 (5'-GAC CTC AGG GGT CCG GGA GAT as a G or T CAT GAG MNN GTC CTT GG-3 ') (SEQ ID NO: 77) and JY25 (5'-CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC-3') (SEQ ID NO: 78) was used. オーバーラップ・エクステンションPCRの第1ラウンドでは、左側フラグメントのために外部プライマmsc g2-1(5′-CCA GCT CTG TCC CAC ACC G-3′)(配列番号79)及びJY24が用いられ、右側フラグメントのためには外部プライマkco8′(5′-GCC AGG ATC CGA CCC ACT-3′)(配列番号80)及びJY25が用いられた。 In the first round of overlap-extension PCR, outside primer msc g2-1 for left-hand fragment (5'-CCA GCT CTG TCC CAC ACC G-3 ') (SEQ ID NO: 79) and JY24 are used, the right fragment outside primer kco8 '(5'-GCC AGG ATC CGA CCC ACT-3') (SEQ ID NO: 80) and JY25 were used for.
PCR反応は、GeneAmp(商標)PCR System9600(Applied Biosystems(商標)、Foster City, CA)中でまず5分間94℃で、次に5秒間94℃、5秒間55℃及び60秒間72℃のサイクル25回でインキュベートしその後7分間72℃でインキュベートすることによって、メーカーの推奨事項に従ってExpand TM高忠実度PCRシステム(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)を用いて行なわれた。 PCR reactions, GeneAmp (TM) PCR System9600 (Applied Biosystems (TM), Foster City, CA) in first 5 minutes 94 ° C. in, then 5 seconds 94 ° C., 5 seconds 55 ° C. and 60 seconds 72 ° C. Cycle 25 by incubating at incubated 72 ° C. Thereafter 7 min at times, was performed using Expand TM high fidelity PCR system (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, iN ) and following the manufacturer's recommendations. PCR産物を、低融点アガロースゲル上で走らせ、ゲルから切除し、70℃で融解させた。 The PCR products were run on a low-melting point agarose gel, excised from the gel, and melted at 70 ° C..

左側及び右側のフラグメントを組合せるためのPCRの第2ラウンドは、35サイクル、外部プライマmscg2-1及びkco8を用いて上述の通り行なわれた。 The second round of PCR to combine the left-hand and right-hand fragments was done as described above for 35 cycles, using the outside primers mscg2-1 and kco8. 最終的PCR産物を低融点アガロースゲル上で走らせ、予想されたサイズのDNAフラグメントを切除し、QIAEX TM IIゲル抽出キット(QIAGEN(商標)、Valencia,CA)を用いて精製した。 The final PCR products were run on a low-melting point agarose gel, excised DNA fragment of the expected size, QIAEX TM II Gel Extraction Kit (QIAGEN (TM), Valencia, CA) and purified using. 精製したフラグメントをPinAI及びBamHIで消化させ、上述の通りにゲル精製し、pVAg2M3-OST577内の対応する部位の間でクローニングした。 The purified fragments were digested with PinAI and BamHI, gel-purified as described above, and cloned between the corresponding sites in pVAg2M3-OST577.

T250I及びT250Lの突然変異体を生成するためには、K=G又はTとして、変異誘発プライマKH4(5′-GAC CTC AGG GGT CCG GGA GAT CAT GAG AAK GTC CTT GG-3′)(配列番号81)及びKH3(5′-CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC-3′)(配列番号82)が使用された。 To generate the mutants T250I and T250L as K = G or T, the mutagenesis primers KH4 (5'-GAC CTC AGG GGT CCG GGA GAT CAT GAG AAK GTC CTT GG-3 ') (SEQ ID NO: 81 ) and KH3 (5'-CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC-3 ') (SEQ ID NO: 82) was used. T250C及びT250Gの突然変異体を生成するためには、M=A又はCであるものとして、変異誘発プライマKH5(5′-GAC CTC AGG GGT CCG GGA GAT CAT GAG GCM GTC CTT GG-3′)(配列番号83)及びKH3が使用された。 To generate mutants of the T250C and T250G is, M = as being A or C, the mutagenesis primers KH5 (5'-GAC CTC AGG GGT CCG GGA GAT CAT GAG GCM GTC CTT GG-3 ') ( SEQ ID NO: 83) and KH3 were used. T250N及びT250Qの突然変異体を生成するためには、K=G又はT、そしてN=A、C、G又はTであるものとして変異誘発プライマKH6(5′-GAC CTC AGG GGT CCG GGA GAT CAT GAG NTK GTC CTT GG-3′)(配列番号84)及びKH3が使用された。 T250N and to generate mutants T250Q is, K = G or T and N = A, C, the mutagenesis primers KH6 as a G or T (5'-GAC CTC AGG GGT CCG GGA GAT CAT, GAG NTK GTC CTT GG-3 ') (SEQ ID NO: 84) and KH3 were used.

PCRの第1ラウンドでは、左側フラグメントのために外部プライマmsc g2-1及びKH4、KH5又はKH6が用いられ、右側フラグメントのためには外部プライマMGD-1(5′-GCC AGG ATC CGA CCC ACT-3′)(配列番号85)及びKH3が用いられた。 In the first round of PCR used outside primer msc g2-1 and KH4, KH5 or KH6 is used for the left-hand fragment, and outside primer MGD-1 for the right-hand fragment (5'-GCC AGG ATC CGA CCC ACT- 3 ') (SEQ ID NO: 85) and KH3 were used. PCR反応は、まず5分間94℃で、次に5秒間94℃、5秒間60℃及び60秒間72℃のサイクル25回でインキュベートしその後7分間72℃でインキュベートすることによって、Expand TM高忠実度PCRシステム(Roche Diagnostics Corporation)を用いて行なわれた。 PCR reaction is first 5 min 94 ° C., then 5 seconds 94 ° C., by incubating incubated thereafter for 7 minutes 72 ° C. for 5 seconds 60 ° C. and 60 seconds 72 ° C. for 25 cycles, Expand TM High Fidelity PCR using the system (Roche Diagnostics Corporation) was conducted. PCR産物を、低融点アガロース上で走らせ、ゲルから切除し、70℃で融解させた。 The PCR products were run on a low melting point agarose, excised from the gel, and melted at 70 ° C..

左側及び右側のフラグメントを組合せるためのPCRの第2ラウンドは、外部プライマmscg2-1及びMGD-1を用いて、まず5分間94℃で、次に5秒間94℃、5秒間60℃及び105秒間72℃のサイクル35回でインキュベートし、その後7分間72℃でインキュベートすることによって、上述の通りに行なわれた。 The second round of PCR to combine the left-hand and right-hand fragments, using outside primers mscg2-1 and MGD-1, first in 5 minutes 94 ° C., then 5 seconds 94 ° C., 5 sec 60 ° C. and 105 and incubated at sec 72 ° C. for 35 cycles, by then incubated at 7 minutes 72 ° C., it was done as described above. 最終的PCR産物を低融点アガロースゲル上で走らせ、予想されたサイズのDNAフラグメントを切除し、QIAquick TMゲル抽出キット(QIAGEN(商標))を用いて精製した。 The final PCR products were run on a low-melting point agarose gel, excised DNA fragment of the expected size was purified using the QIAquick TM Gel Extraction Kit (QIAGEN (TM)). 精製したフラグメントをPinAI及びBamHIで消化させ、上述の通りにゲル精製し、pVAg2M3-OST577内の対応する部位の間でクローニングした。 The purified fragments were digested with PinAI and BamHI, gel-purified as described above, and cloned between the corresponding sites in pVAg2M3-OST577.

無作為突然変異体を位置314で生成するためにはK=G又はT、及びN=A、C、G又はTであるものとして、変異誘発プライマkco78(5′-ACC GTT GTG CAC CAG GAC TGG NNK AAC GGC AAG GAG-3′)(配列番号86)及びkco79(5′-CCA GTC CTG GTG CAC AAC GG-3′)(配列番号87)が使用された。 To generate random mutants at position 314 K = G or T, and N = A, C, as a G or T, the mutagenesis primers kco78 (5'-ACC GTT GTG CAC CAG GAC TGG NNK AAC GGC AAG GAG-3 ') (SEQ ID NO: 86) and kco79 (5'-CCA GTC CTG GTG CAC AAC GG-3') (SEQ ID NO: 87) was used. PCRの第1ラウンドでは、左側フラグメントのために外部プライマks g2-5(5′-CTC CCG GAC CCC TGA GGT C-3′)(配列番号88)及びkco79が、そして左側フラグメントのために外部プライマkco8及びkco78が用いられた。 In the first round of PCR, the external primer for outside primer ks g2-5 (5'-CTC CCG GAC CCC TGA GGT C-3 ') (SEQ ID NO: 88) and kco79 is then left fragment, for the left-hand fragment kco8 and kco78 was used. 全ての後続ステップは、PCRの第2ラウンドが外部プライマksg2-5及びkco8を使用し、最終PCR フラグメントがPm1I及びBam HIで消化されpVAg2M3-OST577内の対応する部位へとクローニングされたという点を除いて、位置250の無作為変異誘発について上述した通りに行なわれた。 All subsequent steps, a second round of PCR is used an external primer ksg2-5 and kco8, final PCR fragments of that was cloned into the corresponding sites of Pm1I and digested with Bam HI in pVAg2M3-OST577 except for, it was performed as described above for the random mutagenesis of positions 250.

L314I突然変異体を生成するためには、変異誘発プライマMGD-10(5′-ACC GTT GTG CAC CAG GAC TGG ATC AAC GGC AAG GA-3′)(配列番号89)及びkco79が使用された。 To generate the L314I mutant, the mutagenesis primers MGD-10 (5'-ACC GTT GTG CAC CAG GAC TGG ATC AAC GGC AAG GA-3 ') (SEQ ID NO: 89) and kco79 were used. L314Y突然変異体を生成するためには、変異誘発プライマMGD-11(5′-ACC GTT GTG CAC CAG GAC TGG TAT AAC GGC AAG GA-3′)(配列番号90)及びkco79が使用された。 To generate the L314Y mutant, the mutagenesis primers MGD-11 (5'-ACC GTT GTG CAC CAG GAC TGG TAT AAC GGC AAG GA-3 ') (SEQ ID NO: 90) and kco79 were used. L314H 突然変異体を生成するためには、変異誘発プライマMGD-12(5′-ACC GTT GTG CAC CAG GAC TGG CAC AAC GGC AAG GA-3′)(配列番号91)及びkco79が使用された。 To generate the L314H mutant, the mutagenesis primers MGD-12 (5'-ACC GTT GTG CAC CAG GAC TGG CAC AAC GGC AAG GA-3 ') (SEQ ID NO: 91) and kco79 were used. L314M突然変異体を生成するためには、変異誘発プライマMGD-13(5′-ACC GTT GTG CAC CAG GAC TGG ATG AAC GGC AAG GA-3′)(配列番号92)及びkco79が使用された。 To generate the L314M mutant, the mutagenesis primers MGD-13 (5'-ACC GTT GTG CAC CAG GAC TGG ATG AAC GGC AAG GA-3 ') (SEQ ID NO: 92) and kco79 were used. L314N 突然変異体を生成するためには、変異誘発プライマMGD-14(5′-ACC GTT GTG CAC CAG GAC TGG AAT AAC GGC AAG GA-3′)(配列番号93)及びkco79が使用された。 To generate the L314N mutant, the mutagenesis primers MGD-14 (5'-ACC GTT GTG CAC CAG GAC TGG AAT AAC GGC AAG GA-3 ') (SEQ ID NO: 93) and kco79 were used.

PCRの第1ラウンドでは、左側フラグメントのために外部プライマjt240(5′-GGA CAC CTT CTC TCC TCC C-3′)(配列番号94)及びkco79が用いられ、右側フラグメントのためには、外部プライマkco41(5′-ATT CTA GTT GTG GTT TGT CC-3′)(配列番号95)及び、MGD-10、MGD-11、MGD-12、MGD-13又はMGD-14が使用された。 In the first round of PCR used outside primer jt240 (5'-GGA CAC CTT CTC TCC TCC C-3 ') (SEQ ID NO: 94) and kco79 are used for the left-hand fragment, for the right-hand fragment, and outside primer kco41 (5'-ATT CTA GTT GTG GTT TGT CC-3 ') (SEQ ID NO: 95) and, MGD-10, MGD-11, MGD-12, MGD-13 or MGD-14 was used. PCR反応は、まず、5分間94℃で、次に5秒間94℃、5秒間60℃及び60秒間72℃のサイクル25回でインキュベートし、その後7分間72℃でインキュベートすることによって、Expand TM高忠実度PCRシステム(Roche Diagnostics Corporation)を用いて行なわれた。 PCR reactions, first, at 5 minutes 94 ° C., then 5 seconds 94 ° C., by incubation for 5 seconds 60 ° C. and 60 seconds 72 ° C. for 25 cycles, and then incubated at 7 minutes 72 ° C., Expand TM High It was carried out using the fidelity PCR system (Roche Diagnostics Corporation).

PCR産物を、低融点アガロースゲル上で走らせ、ゲルから切除し、70℃で融解させた。 The PCR products were run on a low-melting point agarose gel, excised from the gel, and melted at 70 ° C.. 左側及び右側のフラグメントを組合せるためのPCRの第2ラウンドは、外部プライマjt240及びkco41を用いて、まず5分間94℃で、次に5秒間94℃、5秒間60℃及び90秒間72℃のサイクル35回でインキュベートし、その後7分間72℃でインキュベートすることによって、上述の通りに行なわれた。 The second round of PCR to combine the left-hand and right-hand fragments, using outside primers jt240 and kco41, first with 5 min 94 ° C., then 5 seconds 94 ° C., 5 seconds 60 ° C. and 90 seconds 72 ° C. and incubated at 35 cycles, by then incubated at 7 minutes 72 ° C., it was done as described above. 最終的PCR産物を低融点アガロースゲル上で走らせ、予想されたサイズのDNAフラグメントを切除し、QIAquick TMゲル抽出キット(QIAGEN(商標))を用いて精製した。 The final PCR products were run on a low-melting point agarose gel, excised DNA fragment of the expected size was purified using the QIAquick TM Gel Extraction Kit (QIAGEN (TM)). 精製したフラグメントをpCR(商標)4Blunt-TOPO(商標)(Invitrogen TM , Carlsbad, CA)中でサブクローニングさせ、次にPmII及びBam HIで消化させ、上述の通りにゲル精製し、pVAg2M3-OST577内の対応する部位の間でクローニングした。 The purified fragment pCR (TM) 4Blunt-TOPO (TM) (Invitrogen TM, Carlsbad, CA ) was subcloned in, then digested with PmII and Bam HI, gel-purified as described above, in the pVAg2M3-OST577 and cloned between the corresponding sites.

位置428で無作為突然変異体を生成するためには、最初、K=G又はTそしてN=A、C、G又はTであるものとして、変異誘発プライマJY22(5′-GAA CGT CTT CTC ATG CTC CGT GNN KCA TGA GGC TCT G-3′)(配列番号96)及びJY23(5′-CAC GGA GCA TGA GAA GAC GTT C-3′)(配列番号97)が用いられた。 To generate random mutants at position 428, first, K = G or T and N = A, C, as a G or T, the mutagenesis primers JY22 (5'-GAA CGT CTT CTC ATG CTC CGT GNN KCA TGA GGC TCT G-3 ') (SEQ ID NO: 96) and JY23 (5'-CAC GGA GCA TGA GAA GAC GTT C-3') (SEQ ID NO: 97) was used. PCRの第1ラウンドでは、左側フラグメントのために外部プライマks g2-5及びJY23が、そして右側フラグメントのために外部プライマkco8及びJY22が用いられた。 In the first round of PCR, outside primer ks G2-5 and JY23 for the left-hand fragment, and outside primer kco8 and JY22 were used for right-hand fragment. 全ての後続ステップは、位置314無作為変異誘発について上述した通り行なわれた。 All subsequent steps were done as described above for position 314 random mutagenesis.

さらなる無作為突然変異体を位置428で生成するために、ひき続き、M=A又はC そしてN=A、C、G又はTであるものとして、変異誘発プライマMGD-2(5′-GTG TAG TGG TTG TGC AGA GCC TCA TGM NNC ACG GAG CAT GAG AAG-3′)(配列番号98)及びKH1(5′-CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC AC-3′)(配列番号99)が使用された。 To generate additional random mutants at position 428, continuing, M = A or C and N = A, C, as a G or T, the mutagenesis primers MGD-2 (5'-GTG TAG TGG TTG TGC AGA GCC TCA TGM NNC ACG GAG CAT GAG AAG-3 ') (SEQ ID NO: 98) and KH1 (5'-CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC AC-3') (SEQ ID NO: 99) was used . PCRの第1ラウンドでは、左側フラグメントのために外部プライマmsc g2-1及びMGD-2が、又右側フラグメントのためには外部プライマMGD-1及びKH1が使用された。 In the first round of PCR, outside primer msc g2-1 and MGD-2 for the left-hand fragment, and outside primer MGD-1 and KH1 is for the right-hand fragments was used. PCR反応は、まず、5分間94℃で、次に5秒間94℃、5秒間60℃及び90秒間72℃のサイクル25回でインキュベートしその後7分間72℃でインキュベートすることによって、Expand TM高忠実度PCRシステム(Roche Diagnostics Corporation)を用いて行なわれた。 PCR reactions, first, at 5 minutes 94 ° C., then 5 seconds 94 ° C., by incubating incubated thereafter for 7 minutes 72 ° C. for 5 seconds 60 ° C. and 90 seconds 72 ° C. for 25 cycles, Expand TM High fidelity It was carried out using the degree PCR system (Roche Diagnostics Corporation).

PCR産物を、低融点アガロースゲル上で走らせ、ゲルから切除し、70℃で融解させた。 The PCR products were run on a low-melting point agarose gel, excised from the gel, and melted at 70 ° C.. 左側及び右側のフラグメントを組合せるためのPCRの第2ラウンドは、外部プライマg2-1及びMGD-1を用いて、まず5分間94℃で、次に5秒間94℃、5秒間60℃及び75秒間72℃のサイクル35回でインキュベートし、その後7分間72℃でインキュベートすることによって、上述の通りに行なわれた。 The second round of PCR to combine the left-hand and right-hand fragments, using outside primers g2-1 and MGD-1, at first 5 min 94 ° C., then 5 seconds 94 ° C., 5 sec 60 ° C. and 75 and incubated at sec 72 ° C. for 35 cycles, by then incubated at 7 minutes 72 ° C., it was done as described above. 最終的PCR産物を低融点アガロースゲル上で走らせ、予想されたサイズのDNAフラグメントを切除し、QIA quick TMゲル抽出キット(QIAGEN(商標))を用いて精製した。 The final PCR products were run on a low-melting point agarose gel, excised DNA fragment of the expected size was purified using the QIA quick TM Gel Extraction Kit (QIAGEN (TM)). 精製したフラグメントをPinAI及びBam HIで消化させ、上述の通りにゲル精製し、pVAg2M3-OST577内の対応する部位の間でクローニングした。 The purified fragments were digested with PinAI and Bam HI, gel-purified as described above, and cloned between the corresponding sites in pVAg2M3-OST577.

M428E突然変異体を生成するためには、MGD-8(5′-GTG TAG TGG TTG TGC AGA GCC TCA TGT TCC ACG GAG CAT GAG AAG-3′)(配列番号100)及びKH1が使用された。 To generate the M428E mutant, MGD-8 (5'-GTG TAG TGG TTG TGC AGA GCC TCA TGT TCC ACG GAG CAT GAG AAG-3 ') (SEQ ID NO: 100) and KH1 were used. PCRの第1ラウンドでは、左側フラグメントのために外部プライマmsc g2-1及びMGD-8が、又右側プライマのために外部プライマMGD-1及びKH1が用いられた。 In the first round of PCR, outside primer msc g2-1 and MGD-8 for the left-hand fragment, and outside primer MGD-1 and KH1 were used for right primer. 全ての後続ステップは、位置428無作為変異誘発について上述した通り行なわれた。 All subsequent steps were done as described above for position 428 random mutagenesis.

T250E/M428F二重突然変異体は、T250E突然変異を含むpVAg2M3-OST577プラスミド内のPmlI-Bam HIフラグメントを、M428F突然変異を含むpVAg2M3-OST577プラスミドからの対応するPmlI-Bam HIフラグメントで置換することによって生成された。 T250E / M428F double mutant, the PmlI-Bam HI fragment in the pVAg2M3-OST577 plasmid containing the T250E mutation, be replaced by the corresponding PmlI-Bam HI fragment from pVAg2M3-OST577 plasmid containing the M428F mutation It has been generated by. T250Q/M428F及びT250Q/M428L 二重突然変異体は、T250Q 突然変異を含むpVAg2M3-OST577プラスミド内のPmlI-Bam HIフラグメントを、それぞれM428F及びM428Lの突然変異を含むpVAg2M3-OST577プラスミドからの対応するPmlI-Bam HIフラグメントで置換することによって生成された。 T250Q / M428F and T250Q / M428L double mutant, corresponding to PmlI-Bam HI fragment in the pVAg2M3-OST577 plasmid containing the T250Q mutation, from pVAg2M3-OST577 plasmids each containing mutations M428F and M428L PmlI produced by replacing -Bam HI fragment.

同様にHulD10-IgG2M3重鎖の位置250及び428で複数のアミノ酸置換が作り上げられた。 Multiple amino acid substitutions were created at positions 250 and 428 of the Hu1D10-IgG2M3 heavy chain. M428L突然変異体を生成するためには、hCMVプロモータ及びエンハンサ(Boshart et al. 前掲書)及びOST577V H領域を含むプラスミドpVAg2M3-OST577(M428L)からのXhoI-XbaIフラグメントが、hCMVプロモータ及びエンハンサ及びHul D10V H領域を含むプラスミドpHulD10IgG1.rgpt.dE(Kostelny et al.(2001)前掲書)からの対応するXhoI-XbaIフラグメントで置換された。 To generate the M428L mutant, XhoI-XbaI fragment from hCMV promoter and enhancer (Boshart et al. Supra) plasmid pVAg2M3-OST577 including and OST577V H region (M428L) is, hCMV promoter and enhancer and Hul D10V plasmid pHulD10IgG1.rgpt.dE containing H region was replaced with the corresponding XhoI-XbaI fragment from (Kostelny et al. (2001) ibid). T250Q/M428L 突然変異体を生成するためには、hCMVプロモータ及びエンハンサ(Boshart et al. 前掲書)及びOST577V H領域を含むプラスミドpVAg2M3-OST577(T250Q/428L)からのXhoI-XbaIフラグメントがhCMVプロモータ及びエンハンサ及びHulD10V H領域を含むプラスミドpHulD18.IgG1.rgpt.dE(Kostelny et al, (2001)、前掲書)からの対応するXhoI-XbaIフラグメントで置換された。 T250Q / M428L to produce a mutant, hCMV promoter and enhancer (Boshart et al. Supra) and XhoI-XbaI fragment from plasmid pVAg2M3-OST577 (T250Q / 428L) containing OST577V H region hCMV promoter and enhancers and HulD10V plasmid pHulD18.IgG1.rgpt.dE containing H region (Kostelny et al, (2001) , op. cit) have been replaced with the corresponding XhoI-XbaI fragment from.

QIAprep TM Spin Miniprepキット(QIAGEN(商標))を用いてプラスミドDNAが調製され、配列決定によって、ヌクレオチド置換が同定された。 Plasmid DNA was prepared using the QIAprep TM Spin Miniprep Kit (QIAGEN (TM)), by sequencing, nucleotide substitutions were identified. Endo Free(商標) Plasmid Maxiキット(QIAGEN(商標))を用いて、大規模プラスミドDNA調製物が作られた。 With Endo the Free (TM) Plasmid Maxi Kit (QIAGEN (TM)), a large-scale plasmid DNA preparations were made. OST577-IgG2M3発現プラスミドのコーディング領域を、ヌクレオチド配列により確認した。 The coding region of OST577-IgG2M3 expression plasmids were verified by nucleotide sequencing.

結果 Result:
改変された血清半減期をもつものと予想されることになる新生児Fcレセプタ(FcRn)に対するより高い又はより低い親和力をもつヒトIgG 突然変異体を単離するために、(Kabat et al.前掲書のEU指標に従って番号付けされる)ヒトγ2M3重鎖の位置250、314及び428において、無作為アミノ酸置換が生成された。 The human IgG mutants with higher or lower affinity to altered serum half-lives would be expected to have the neonatal Fc receptor (FcRn) in order to isolate, (Kabat et al. Supra in the numbered according to the EU index) position 250, 314 and 428 of the human γ2M3 heavy chain, random amino acid substitutions were generated. これら3つの位置は、ラットFc/FcRn複合体のX線結晶構造(Burmeister et al. 前掲書から演繹された、ヒトIgG2M3Fc及びヒトFcRnの複合体のコンピュータモデリング(例の冒頭で記述したモデル1、2及び3を参照)に基づいて選択された。位置250、314及び428にある野生型アミノ酸はFc/FcRn界面近くにあるが、これらの残基は、FcとFcRnの間のpH依存性相互作用に直接寄与すると思われない。 These three positions, X-rays crystal structure of the rat Fc / FcRn complex (Burmeister et al. Was deduced from Ibid, model 1 described at the beginning of computer modeling (eg of a complex of human IgG2M3Fc and human FcRn, is selected based on the reference 2 and 3). Although the wild-type amino acids at positions 250, 314 and 428 is near Fc / FcRn interface, these residues, pH dependent cross between Fc and FcRn It does not appear to contribute directly to the action.

従って、これらの位置におけるアミノ酸置換は、pH依存性結合を維持する一方で、FcRnに対するFcの親和力を増大(又は減少)させ得る。 Therefore, amino acid substitutions at these positions, while maintaining pH-dependent binding may the affinity of Fc increased (or decreased) for the FcRn. PCRベースの変異誘発により生成された単一の突然変異体としては、位置250の野生型TをA、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W、又はYに変換した19の突然変異体;位置314の野生型LをA、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はYに変換した19の突然変異体;そして位置428の野生型MをA、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はYに変換した19の突然変異体があった(表1参照)。 The single mutants generated by PCR-based mutagenesis, the wild-type T position 250 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P , Q, R, S, V, W, or mutants of 19 was converted to Y; wild-type L to a at position 314, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N , P, Q, R, S, T, V, W, or mutants of 19 was converted to Y; and wild type M position 428 a, C, D, E, F, G, H, I, K, was L, N, P, Q, R, S, T, V, W, or mutants of 19 converted to Y (see Table 1). FCRnに対する増大した結合をもつ単一突然変異体の一部は、T250E/M428F、T250Q/M428F及びT250Q/M428Lを含めて複数の二重突然変異体を生成するように組合せられた。 Some of the single mutants with increased binding to FCRn is, T250E / M428F, were combined to generate a plurality of double mutants, including the T250Q / M428F and T250Q / M428L.

例4 Example 4.
この例は、ヒトγ1重鎖遺伝子のFc領域の変異誘発について記述する。 This example describes mutagenesis of the Fc region of the human γ1 heavy chain gene.
変異誘発 Mutagenesis:
(Kabat et al, 前掲書のEU指標に従って番号づけされた)OST577-IgG1重鎖の位置250及び428でアミノ酸置換を生成するために、オーバーラップ・エクステンションPCR方法(Higuchi, 前掲書中)を使用した。 To generate amino acid substitutions at (Kabat et al, op. Cit of the numbered according to the EU index) OST577-IgG1 heavy position of chains 250 and 428, using the overlap-extension PCR method (Higuchi, op. Cit.) did. T250E突然変異体を生成するためには、変異誘発プライマJX076(5′-AAC CCA AGG ACG AAC TCA TGA TCT CCC G-3′)(配列番号101)及びJX077(5′-GGA GAT CAT GAG TTC GTC CTT GGG TTT TG-3′)(配列番号102)が使用された。 To generate the T250E mutant, the mutagenesis primers JX076 (5'-AAC CCA AGG ACG AAC TCA TGA TCT CCC G-3 ') (SEQ ID NO: 101) and JX077 (5'-GGA GAT CAT GAG TTC GTC CTT GGG TTT TG-3 ') (SEQ ID NO: 102) was used. オーバーラップ・エクステンションPCRの第1ラウンドでは、左側フラグメントのために外部プライマJX080(5′-CCT CAG CTC GGA CAC CTT CTC-3′)(配列番号103)及びJX077が使用され、右側フラグメントのためには外部プライマNT244(5′-GCC TCC CTC ATG CCA CTC A-3′(配列番号104)及びJX076が使用された。 In the first round of overlap-extension PCR, outside primer JX080 for the left-hand fragment (5'-CCT CAG CTC GGA CAC CTT CTC-3 ') (SEQ ID NO: 103) and JX077 were used, for the right-hand fragment and outside primer NT244 (5'-GCC TCC CTC ATG CCA CTC A-3 '(SEQ ID NO: 104) and JX076 were used.

PCR反応はGeneAmp(商標)PCR System9600(Applied Biosystems(商標))中で、まず5分間94℃で、次に20秒間94℃、20秒間55℃及び90秒間72℃のサイクル35回でインキュベートし、その後7分間72℃でインキュべートすることによって、メーカーの推奨事項に従ってExpand TM高忠実度PCRシステム(Roche Diagnostics Corporation)を用いて行なわれた。 PCR reactions in GeneAmp (TM) PCR System9600 (Applied Biosystems (TM)), first for 5 minutes 94 ° C., then 20 seconds 94 ° C., and incubated at 20 sec 55 ° C. and 90 seconds 72 ° C. for 35 cycles, by incubate for a subsequent 7 min 72 ° C., were performed using the Expand TM high fidelity PCR system (Roche Diagnostics Corporation) according to the manufacturer's recommendations. PCR産物を、低融点アガロースゲル上で走らせ、ゲルから切除し、70℃で融解させた。 The PCR products were run on a low-melting point agarose gel, excised from the gel, and melted at 70 ° C.. 左側及び右側のフラグメントを組合せるためのPCRの第2ラウンドは、35サイクル、外部プライマJXO80及びNT244を用いて上述の通りに行なわれた。 The second round of PCR to combine the left-hand and right-hand fragments was done as described above using 35 cycles, the external primer JXO80 and NT244. 最終的PCR産物を低融点アガロースゲル上で走らせ、予想されたサイズのDNAフラグメントを切除し、QIAquick TM IIゲル抽出キット(QIAGEN(商標))を用いて精製した。 The final PCR products were run on a low-melting point agarose gel, excised DNA fragment of the expected size was purified using the QIAquick TM II Gel Extraction Kit (QIAGEN (TM)). 精製したフラグメントをNheI及びEagIで消化させ、上述の通りにゲル精製し、pVAg.N-OST577内の対応する部位の間でクローニングした。 The purified fragments were digested with NheI and EagI, gel-purified as described above, and cloned between the corresponding sites in pVAg.N-OST577.

T250D 突然変異体を生成するためには、変異誘発プライマJX087(5′-AAC CCA AGG ACG ACC TCA TGA TCT CCC G-3′)(配列番号105)及びJX088(5′-GGA GAT CAT GAG GTC GTC CTT GGG TTT TG-3′)(配列番号106)を使用された。 To generate the T250D mutant, the mutagenesis primers JX087 (5'-AAC CCA AGG ACG ACC TCA TGA TCT CCC G-3 ') (SEQ ID NO: 105) and JX088 (5'-GGA GAT CAT GAG GTC GTC CTT GGG TTT TG-3 ') were used (SEQ ID NO: 106). PCRの第1ラウンドでは、左側フラグメントのために外部プライマJX080及びJX088が使用され、右側フラグメントのために外部プライマNT244及びJX087が使用された。 In the first round of PCR used outside primer JX080 and JX088 were used for left-hand fragment, and outside primer NT244 and JX087 were used for right-hand fragment. 全ての後続ステップは、上述の通りに行なわれた。 All subsequent steps were done as described above.

M428F突然変異体を生成するためには、変異誘発プライマJX078(5′-CTC ATG CTC CGT GTT CCA TGA GGC TCT GC-3′)(配列番号107)及びJX079(5′-AGA GCC TCA TGG AAC ACG GAG CAT GAG-3′)(配列番号108)が使用された。 To generate the M428F mutant, the mutagenesis primers JX078 (5'-CTC ATG CTC CGT GTT CCA TGA GGC TCT GC-3 ') (SEQ ID NO: 107) and JX079 (5'-AGA GCC TCA TGG AAC ACG GAG CAT GAG-3 ') (SEQ ID NO: 108) was used. PCRの第1ラウンドでは、左側フラグメントのために外部プライマJX080及びJX079が使用され、右側フラグメントのために外部プライマNT244及びJX078が使用された。 In the first round of PCR used outside primer JX080 and JX079 were used for left-hand fragment, and outside primer NT244 and JX078 were used for right-hand fragment. 全ての後続ステップは、上述の通りに行なわれた。 All subsequent steps were done as described above.

M428L突然変異体を生成するためには、変異誘発プライマJXM428L1(5′-CTC ATG CTC CGT GTT GCA TGA GGC TCT GC-3′)(配列番号109)及びJXM428L2(5′-AGA GCC TCA TGC AAC ACG GAG CAT GAG-3′)(配列番号110)が使用された。 To generate the M428L mutant, the mutagenesis primers JXM428L1 (5'-CTC ATG CTC CGT GTT GCA TGA GGC TCT GC-3 ') (SEQ ID NO: 109) and JXM428L2 (5'-AGA GCC TCA TGC AAC ACG GAG CAT GAG-3 ') (SEQ ID NO: 110) was used. PCRの第1ラウンドでは、左側フラグメントのために外部プライマJX080及びJXM428L2が使用され、右側フラグメントのために外部プライマNT244及びJXM428L1が使用された。 In the first round of PCR used outside primer JX080 and JXM428L2 is used for left-hand fragment, and outside primer NT244 and JXM428L1 were used to right-hand fragment. 全ての後続ステップは、上述の通りに行なわれた。 All subsequent steps were done as described above.

T250Q 突然変異体を生成するためには、変異誘発プライマJXT250Q1(5′-AAC CCA AGG ACC AAC TCA TGA TCT CCC G-3′)(配列番号111)及びJXT250Q2(5′-GGA GAT CAT GAG TTG GTC CTT GGG TTT TG-3′)(配列番号112)が使用された。 To generate the T250Q mutant, the mutagenesis primers JXT250Q1 (5'-AAC CCA AGG ACC AAC TCA TGA TCT CCC G-3 ') (SEQ ID NO: 111) and JXT250Q2 (5'-GGA GAT CAT GAG TTG GTC CTT GGG TTT TG-3 ') (SEQ ID NO: 112) was used. PCRの第1ラウンドでは、左側フラグメントのために外部プライマJX080及びJXT250Q2が使用され、右側フラグメントのために外部プライマNT244及びJXT250Q1が使用された。 In the first round of PCR used outside primer JX080 and JXT250Q2 is used for left-hand fragment, and outside primer NT244 and JXT250Q1 were used for right-hand fragment. 全ての後続ステップは、上述の通りに行なわれた。 All subsequent steps were done as described above.

T250E/M428F二重突然変異体を生成するためには、M428突然変異を含む鋳型内でT250E 突然変異を作り出すために、変異誘発プライマJX076及びJX077が使用された。 To generate the T250E / M428F double mutant, in order to produce T250E mutation in a template containing the M428 mutation, mutagenesis primers JX076 and JX077 were used. PCRの第1ラウンドでは、左側フラグメントのために外部プライマJX080及びJX077が使用され、右側フラグメントのために外部プライマNT244及びJX076が使用された。 In the first round of PCR used outside primer JX080 and JX077 were used for left-hand fragment, and outside primer NT244 and JX076 were used for right-hand fragment. 全ての後続ステップは、上述の通りに行なわれた。 All subsequent steps were done as described above.

T250Q/M428L二重突然変異体を生成するためには、T250Q 突然変異を作り出すべく変異誘発プライマJXT250Q1及びJXT250Q2が使用され、M428L 突然変異を作り出すべく変異誘発プライマJXM428L1及びJXM428L2が使用された。 To generate the T250Q / M428L double mutant, the mutagenesis primers JXT250Q1 and JXT250Q2 to create the T250Q mutation is used, the mutagenesis primers JXM428L1 and JXM428L2 to create the M428L mutation were used. PCRの第1ラウンドでは、左側フラグメントを作り出すために外部プライマJX080及びJXT250Q2が、中央フラグメントを作り出すためにJXT250Q1及びJXM428L2が、又右側フラグメントを作り出すために外部プライマNT244及びJXM428L1が使用された。 In the first round of PCR, outside primer JX080 and JXT250Q2 to create the left fragment, it is JXT250Q1 and JXM428L2 to create the middle fragment, and outside primer NT244 and JXM428L1 were used to create the right fragment. 全ての後続ステップは、上述の通りに行なわれた。 All subsequent steps were done as described above.

同様にHulD10-IgG1 重鎖の位置250及び428で複数のアミノ酸置換が作り出された。 Multiple amino acid substitutions were generated at positions 250 and 428 of the Hu1D10-IgG1 heavy chain. 428L突然変異体を生成するためには、hCMVプロモータ及びエンハンサ(Boshart et al. 前掲書)及びOST577V H領域を含むプラスミドpVAg1.N-OST577(M428L)からのXhoI-XbaIフラグメントが、hCMVプロモータ及びエンハンサ及びHul D10V H領域を含むプラスミドpHulD10IgG1.rgpt.dE(Kostelny et al.(2001)前掲書)からの対応するXhoI-XbaIフラグメントで置換された。 To generate the 428L mutant has a XhoI-XbaI fragment from hCMV promoter and enhancer (Boshart et al. Supra) plasmid pVAg1.N-OST577 including and OST577V H region (M428L), hCMV promoter and enhancer and Hul D10V H region plasmid pHulD10IgG1.rgpt.dE containing substituted with the corresponding XhoI-XbaI fragment from (Kostelny et al. (2001) ibid). T250Q/M428L突然変異体を生成するためには、hCMVプロモータ及びエンハンサ(Boshart et al. 前掲書)及びOST577V H領域を含むプラスミドpVAg1.N-OST577(T250Q/428L)からのXhoI-XbaIフラグメントがhCMVプロモータ及びエンハンサ及びHulD10V H領域を含むプラスミドpHulD18.IgG1.rgpt.dE(Kostelny et al, (2001)、前掲書)からの対応するXhoI-XbaIフラグメントで置換された。 T250Q / M428L to produce a mutant, XhoI-XbaI fragment from hCMV promoter and enhancer (Boshart et al. Supra) plasmid pVAg1.N-OST577 containing and OST577V H region (T250Q / 428L) is hCMV promoter and enhancer and plasmids pHulD18.IgG1.rgpt.dE containing HulD10V H region (Kostelny et al, (2001) , op. cit) have been replaced with the corresponding XhoI-XbaI fragment from.

QIAprep TM Spin Miniprepキット(QIAGEN(商標))を用いてプラスミドDNAが調製され、配列決定によって、ヌクレオチド置換が確認された。 Plasmid DNA was prepared using the QIAprep TM Spin Miniprep Kit (QIAGEN (TM)), by sequencing, nucleotide substitutions were confirmed. Endo Free(商標) Plasmid Maxiキット(QIAGEN(商標))を用いて、大規模プラスミドDNA調製物が作られた。 With Endo the Free (TM) Plasmid Maxi Kit (QIAGEN (TM)), a large-scale plasmid DNA preparations were made. OST577-IgG1発現プラスミドのコーディング領域を、ヌクレオチド配列により確認した。 The coding region of OST577-IgG1 expression plasmids were verified by nucleotide sequencing.

結果 Result:
改変された血清半減期をもつものと予想されることになる新生児Fcレセプタ(FcRn)に対する改変された親和力をもつヒトIgG 突然変異体を同定するために、(Kabat et al.前掲書のEU指標に従って番号付けされる)ヒトγ1重鎖の位置250及び428において、複数のアミノ酸置換が生成された。 In order to identify human IgG mutants with affinity modified for altered neonatal Fc receptor it would be expected to have a serum half-life (FcRn), (EU index of Kabat et al. Supra in numbering to) position 250 and 428 of the human γ1 heavy chain according to a plurality of amino acid substitutions were generated. これら2つの位置は、FcRnに対する増大した又は減少した結合を結果としてもらしたヒトγ2M3重鎖内のこれらの位置における突然変異の同定に基づいて選択された。 These two positions were chosen based on the identification of mutations at these positions in the increased or decreased leaked human γ2M3 heavy within the chain a bond as a result of FcRn. 位置250及び428にある野生型アミノ酸はFc/FcRn界面近くにあるが、これらの残基は、FcとFcRnの間のpH依存性相互作用に直接寄与すると思われない。 Although the wild-type amino acids at positions 250 and 428 is near Fc / FcRn interface, these residues do not appear to directly contribute to the pH-dependent interaction between Fc and FcRn. 従って、これらの位置におけるアミノ酸置換は、pH依存性結合を維持する一方で、FcRnに対するFcの親和力を増大(又は減少)させ得る。 Therefore, amino acid substitutions at these positions, while maintaining pH-dependent binding may the affinity of Fc increased (or decreased) for the FcRn. ヒトγ2M3 重鎖との関連において増大した結合を示した単一及び二重の両方の突然変異体が、単一突然変異体T250E、T250Q、M428F及びM428Lそして二重突然変異体T250E/M428F及びT250Q/M428Lを含めたヒトγ1重鎖の中で評価された。 Single and double both mutants showed binding were increased in the context of the human γ2M3 heavy chain, the single mutants T250E, T250Q, M428F and M428L and double mutant T250E / M428F and T250Q / M428L were evaluated in the human γ1 heavy chain, including. ヒトγ2M3重鎖(T250D)との関連において減少した結合を示した単一突然変異体が同様にヒトγ1重鎖の中で評価された。 Single mutants exhibited decreased binding in the context of the human γ2M3 heavy chain (T250D) was evaluated similarly in the human γ1 heavy chain.

例5 Example 5.
この例は、突然変異体IgG2M3及びIgG1抗体の特徴づけについて記述している。 This example describes the characterization of mutant IgG2M3 and IgG1 antibodies.
細胞培養 Cell culture:
ヒト腎細胞系統293-H(Life Technologies(商標), Rockville, MD)を、7.5%CO 2のインキュベータ内で37℃で、以下293培地と呼ぶ10%のウシ胎児血清(FBS)(HyClone(商標), Logan, UT)、0.1mMのMEM可欠アミノ酸(Invitrogen TM )及び2mMのL-グルタミン(Invitrogen TM )を含有するDMEM(Bio Whittaker TM ,Walkersville, MD)内に維持した。 Human kidney cell line 293-H (Life Technologies (TM), Rockville, MD) and, at 37 ° C. in a 7.5% CO 2 incubator, 10% fetal calf serum referred to as 293 medium (FBS) (HyClone (TM ), Logan, UT), were maintained MEM non-essential amino acids 0.1 mM (Invitrogen TM) and DMEM containing 2mM L- glutamine (Invitrogen TM) (Bio Whittaker TM , Walkersville, MD) in the. 一過性トランスフェクションの後のモノクローナル抗体の発現及び精製について、293-H細胞を、以下低-IgG293培地と呼ぶ10%の低-IgG FBS(HyClone(商標))、0.1mMのMEM可欠アミノ酸及び2mMのL-グルタミンの中でインキュベートさせた。 For expression of monoclonal antibodies and purification after transient transfection, 293-H cells, following the low -IgG293 medium as referred 10% low -IgG FBS (HyClone (TM)), MEM non-essential amino acids 0.1mM and it was incubated in 2mM L- glutamine. マウス骨髄腫細胞系統Sp2/0(米国標準培養収集機関、Manassus, VA)を、10%のFBS及び2mMのL-グルタミンを含有するDMEM中に維持した。 Mouse myeloma cell line Sp2 / 0 (American Type Culture collection agencies, Manassus, VA) and were maintained in DMEM containing 10% FBS and 2mM L- glutamine. 安定したトランスフェクション後のモノクローナル抗体の精製のために、Sp2/0 細胞をハイブリドーマ-SFM(HSFM)(Life Technologies(商標))での成長に適合させた。 For purification of stable monoclonal antibodies after transfection, and the Sp2 / 0 cells were adapted to growth in Hybridoma -SFM (HSFM) (Life Technologies (TM)).

一過性トランスフェクション Transient Transfection:
293-H細胞を、適切な軽鎖プラスミド及び適切な野生型の重鎖プラスミド、又は位置250、314又は428に単一又は二重アミノ酸置換を含むさまざまな突然変異を受けた重鎖プラスミドのうちの1つで一過性に同時トランスフェクションさせた。 293-H cells, appropriate light chain plasmid and the appropriate wild-type heavy chain plasmid, or position 250, 314 or 428 of the heavy chain plasmid has undergone various mutations including single or double amino acid substitutions It was cotransfected into one in transient. 小規模一過性トランスフェクションのためには、1回のトランスフェクションにつき約1×10 6個の細胞を6ウェル平板内で3mlの293培地の中で平板固定し、一晩集密状態になるまで成長させた。 For small-scale transient transfections were plated fixed in 293 medium 3ml within one about 1 × 10 6 cells 6-well plates per transfection, the overnight confluence until it is grown. 翌日、2μgの軽鎖プラスミドと2μgの野生型又は突然変異を受けた重鎖プラスミドを0.25mlのHSFMと組合わせた。 The next day, the heavy chain plasmid, which has received a wild-type or mutant of light chain plasmid and 2μg of 2μg combination with HSFM of 0.25ml.

別々の試験管内に、10μlのLipofectamine TM 2000試薬(Invitroge TM )及び0.25mlのHSFMを組合せ、室温で5分間インキュベートした。 In separate tubes, combining HSFM of 10μl of Lipofectamine TM 2000 reagent (Invitrogen TM) and 0.25 ml, and incubated at room temperature for 5 minutes. 0.25mlのLipofectamine TM 2000-HSEM混合物を穏やかに0.25mlのDNA HSFM混合物と混合し、20分間室温でインキュベートした。 Gently the Lipofectamine TM 2000-HSFM mixture of 0.25ml were mixed with DNA HSFM mixture 0.25ml, and incubated at room temperature for 20 minutes. 293-Hの細胞を覆う培地を吸引し、低-IgG293培地と交換し、次にリポフェクタミン-DNA複合体を滴下にて細胞に加え、渦巻きにより穏やかに混合し、細胞を7.5%のCO 2のインキュベータ内で37℃で5〜7日間インキュベートしてから上清を収獲した。 The medium was aspirated covering the cell 293-H, and replaced with low -IgG293 medium, then added to the cells Lipofectamine -DNA complex dropwise, mixed gently by swirling, and the cells of 7.5% of CO 2 the supernatant was incubated for 5-7 days at 37 ° C. in an incubator and harvested.

大規模一過性トランスフェクションのためには、1回のトランスフェクションにつき、約7×10 6個の細胞をT-75フラスコ内で25mlの293培地の中で平板固定し、一晩集密状態になるまで成長させた。 For large-scale transient transfections, per transfections were plated fixed in 293 medium 25ml about 7 × 10 6 cells in T-75 flasks overnight confluence It was grown to. 翌日、12μgの軽鎖プラスミドと12μgの野生型又は突然変異を受けた重鎖プラスミドを1.5mlのHSFMと組合わせた。 The next day, 12μg of light chain plasmid and 12μg heavy chain plasmid, which has received a wild-type or mutant of the combination with HSFM of 1.5ml. 別々の試験管内に、60μlのLipofectamine TM 2000試薬及び1.5mlのHSFMを組合せ、室温で5分間インキュベートした。 In separate tubes, combining HSFM of Lipofectamine TM 2000 reagent and 1.5ml of 60 [mu] l, and incubated at room temperature for 5 minutes. 1.5mlのLipofectamine TM 2000-HSEM混合物を穏やかに1.5mlのDNAHSFM混合物と混合し、20分間室温でインキュベートした。 The Lipofectamine TM 2000-HSFM mixture of 1.5ml mixed with DNAHSFM mixture gently 1.5ml, and incubated at room temperature for 20 minutes. 293-Hの細胞を覆う培地を吸引し、低-IgG273培地と交換し、次にリポフェクタミン-DNA複合体を滴下にて細胞に加え、渦巻きにより穏やかに混合し、細胞を7.5%のCO 2のインキュベータ内で37℃で5〜7日間インキュベートしてから上清を収獲した。 The medium was aspirated covering the cell 293-H, and replaced with low -IgG273 medium, then added to the cells Lipofectamine -DNA complex dropwise, mixed gently by swirling, and the cells of 7.5% of CO 2 the supernatant was incubated for 5-7 days at 37 ° C. in an incubator and harvested.

抗体濃度 Antibody concentration
小規模一過性トランスフェクションからの上清を最高1200rpmで5分間遠心分離することで収獲し、0.22μmのMillex(商標)-GVマイクロフィルタ(Millipore(商標) Corporation, Bedford, MA)を用いて無菌ろ過した。 It was harvested by 5 min centrifugation at maximum 1200rpm Supernatants from small-scale transient transfections, 0.22 [mu] m of Millex (TM) -GV microfilters (Millipore (TM) Corporation, Bedford, MA) using a sterile filtered. 標本を、3000rpmでの遠心分離により、6mlのVivaspin(商標)濃縮器(50,000MWCO)(Vivascience(商標)AG,Hannover, Germany)を用いて約6倍、0.5mlまで濃縮した。 The specimens by centrifugation at 3000 rpm, 6 ml of Vivaspin (TM) concentrators (50,000MWCO) (Vivascience (TM) AG, Hannover, Germany) about 6-fold using, concentrated to 0.5 ml. 濃縮したタンパク質を5mlのPBS、pH6.0中に再懸濁させ、上述のとおり0.5mlの体積まで濃縮した。 PBS of the concentrated protein 5 ml, resuspended in pH 6.0, and concentrated to a volume of 0.5ml as described above. 以下に記述したELISA方法を用いて、各標本中の抗体濃度を測定した。 Using the ELISA method described below was measure antibody concentration in each sample.

安定したトランスフェクション Stable transfection:
Sp2/0 細胞を適切な軽鎖プラスミド及び適切な野生型の、重鎖プラスミド又は位置250又は428に単一又は二重アミノ酸置換を含むさまざまな突然変異を受けた重鎖プラスミドのうちの1つで、安定した形でトランスフェクションさせた。 Sp2 / 0 cells of the appropriate light chain plasmid and the appropriate wild-type, one of the heavy chain plasmid has undergone various mutations including single or double amino acid substitutions in the heavy chain plasmid or position 250 or 428 in, it was transfected in a stable manner. 約1×10 7個の細胞を10mlのPBSで洗浄し、1mlのPBS中で再懸濁させた。 About 1 × 10 7 cells were washed with 10ml of PBS, and resuspended in PBS in 1 ml. 約25〜30μgの軽鎖プラスミド及び50〜60μgの重鎖プラスミドをFspIで線形化し、細胞に付加した。 About 25~30μg light chain plasmid and 50~60μg heavy chain plasmid were linearized with FspI, and added to the cells. 細胞とDNAを穏やかに混合し、氷上でGene Pulser Cuvelte(Bio-Rad(商標) Laboratories, Hercules, CA)に移した。 The cells and DNA were mixed gently, and transferred on ice Gene Pulser Cuvelte (Bio-Rad (TM) Laboratories, Hercules, CA) on. 0.360kV、25μFに設定したGene Pulser II(Bio Rad(商標) Laboratories)を用いて、細胞を電気穿孔させ、10〜20分間氷に戻した。 0.360KV, using Gene Pulser II set to 25μF (Bio Rad (TM) Laboratories), the cells were electroporated, were returned to 10-20 minutes the ice. 細胞を40mlのDMEM、10%のFBS、2mMのL-グルタミンの中で希釈させ、100μl/ウェルで4枚の96ウェル平板内に同定した。 Cells 40ml of DMEM, 10% of FBS, were diluted in 2mM L- glutamine, and identified 96 in well plates in 4 sheets of 100 [mu] l / well.

48時間後に、100μl/ウェルの2×マイコフェノール酸(MPA)選択培地(DMEM、10%のFBS、1×HT Media Supplement Hybri-Max(商標)(Sigma(商標), St. Louis, MO)、300μg/mlのキサンチン(Sigma(商標))、2μg/mlマイコフェノール酸(Life Technologies(商標))及び2mM L-グルタミン)を添加した。 After 48 hours, 2 × mycophenolic acid 100 [mu] l / well (MPA) selection medium (DMEM, 10% of FBS, 1 × HT Media Supplement Hybri-Max (TM) (Sigma (TM), St. Louis, MO), 300 [mu] g / ml xanthine (Sigma (TM)), it was added 2 [mu] g / ml mycophenolic acid (Life Technologies (TM)) and 2 mM L-glutamine). 見かけ上単一のコロニーを含んでいるウェルからの上清を、10〜14日後にELISAによりスクリーニングした。 Supernatants from wells apparently containing single colonies were screened by ELISA after 10-14 days. HSFM(Life Technologies(商標))に対する膨張及び適合のため、最高の抗体産生クローンを選択した。 For expansion and adaptation to HSFM (Life Technologies (TM)), and selects the highest antibody-producing clones. 適合したクローンを、450mlのHSFM中でローラーボトルに対し膨張させ、空気中の5%のCO 2でガス供給し、2月後に50mlのProtein Free Feed Medium-2(PFFM-2)(Sauer et al., Biotechnol. Bioeng.67:585-597(2000))をこれに補足し、消耗するまで成長させた。 The matched clones were expanded to roller bottles in HSFM of 450 ml, and the gas supply with 5% CO 2 in air, Protein of 50ml after February Free Feed Medium-2 (PFFM- 2) (Sauer et al ., Biotechnol Bioeng.67:. 585-597 of the (2000)) supplemented to this, and grown to exhaustion.

最高の抗体産生クローンの一部分を同様にProtein Free Basal Medium-1(PFBM-1)(Protein Design Labs TM , Inc.)に対し適合させ、10L入りスピナーフラスコに対して膨張させ、1/10体積のPFFM-2を2日後に補足し、消耗するまで成長させた。 Best Similarly a portion of the antibody-producing clones Protein Free Basal Medium-1 (PFBM -1) (Protein Design Labs TM, Inc.) is adapted to, inflated against 10L entering the spinner flask, 1/10 volume of supplemented with PFFM-2 after two days, and grown to exhaustion.

ELISA ELISA:
培養上清中に存在するOST577又はHulD10抗体の量を定量するために、ELISAを実施した。 To quantify the amount of OST577 or HulD10 antibody present in culture supernatants was performed ELISA. Immulon TM 4平板(DYNEX(商標) Technologies, Inc., Chantilly, VA)を4℃で一晩、pH9.4の100μl/ウェルの0.2Mの炭酸塩/重炭酸塩緩衝液中の1.0μg/mlのヤギF(ab′) 2抗ヒトIgGガンマ鎖抗体(BioSource International, Camarillo, CA)又はAffiniPure TMヤギ抗ヒトIgG Fcy フラグメント特異的抗体(Jackson Immuno Research Laboratories, Inc. West Grove, PA)でコーティングした。 Immulon TM 4 flat (DYNEX (TM) Technologies, Inc., Chantilly, VA ) overnight at 4 ° C., and in carbonate / bicarbonate buffer, 0.2M in 100 [mu] l / well of pH 9.4 1.0 [mu] g / ml goat F (ab ') 2 anti-human IgG gamma chain antibody (BioSource International, Camarillo, CA) were coated with or AffiniPure TM goat anti-human IgG Fcy fragment specific antibody (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc. West Grove, PA) . 翌日、平板をELISA Wash Buffer(EWB)(PBS、0.1% Tween20)で洗浄し、室温で20〜30分間、300μl/ウェルのTBS中のSuper Block(商標) Blocking Bufferで遮断させた。 The next day, plates were washed with ELISA Wash Buffer (EWB) (PBS, 0.1% Tween20), were blocked with Super Block (TM) Blocking Buffer for 20 to 30 minutes, in TBS in 300 [mu] l / well at room temperature. 平板をEWBで洗浄し、適切に希釈させた試験標本を各ウェルに添加した。 The plates were washed with EWB, was added test specimens were appropriately diluted to each well. 精製したOST577又はHulD10抗体を適宜、0.2μg/mlから始めて100μl/ウェルのELISA Buffer(EB)(PBS、1%のウシ血清アルブミン、0.1%のTween20)中で2倍に段階希釈した。 Appropriate OST577 or HulD10 antibodies were purified, 0.2 [mu] g / ml starting from the 100 [mu] l / well ELISA Buffer (EB) (PBS, 1% bovine serum albumin, Tween20 0.1%) were serially diluted two-fold in.

最初に培養上清を100μl/ウェルのEB中で1:10に希釈し、その後、100μl/ウェルのEB中で2倍に希釈した。 The first supernatant was diluted 1:10 in EB of 100 [mu] l / well, then diluted to 2-fold in EB of 100 [mu] l / well. 平板を1〜2時間室温でインキュベートし、その後EWBで洗浄し、100μl/ウェルのヤギ抗ヒトラムダ軽鎖HRP接合型抗体(BioSource International, 又はSouthern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL)又はヤギ抗ヒトカッパ軽鎖HRP接合型抗体(Southern Biotechnology Associates, Inc.)を適宜、EB中の1.0μg/mlで添加した。 Incubating a plate for 1-2 hours at room temperature, then washed with EWB, 100 [mu] l / well of goat anti-human lambda light chain HRP-conjugated antibody (BioSource International, or Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) or goat anti-human kappa light chain HRP-conjugated antibody (Southern Biotechnology Associates, Inc.) as appropriate, was added at 1.0 [mu] g / ml in EB. 室温で1時間インキュベートした後、平板をEWSで洗浄し、その後100μl/ウェルのABTS Peroxidase Substrate/Peroxidase Solution B(Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)を添加した。 After incubation for 1 hour at room temperature, plates were washed with EWS, was subsequently added 100 [mu] l / well of ABTS Peroxidase Substrate / Peroxidase Solution B (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) and. 反応を100μl/ウェルの2%のシュウ酸で停止し、415nmでの吸収度をVER SAmax TMマイクロタイター平板読取り装置(Molecular Devices Corporation(商標), Sunnyvale, CA)を用いて測定した。 The reaction was stopped with 2% oxalic acid 100 [mu] l / well, the absorbance at 415 nm VER SAmax TM microtiter plate reader (Molecular Devices Corporation (TM), Sunnyvale, CA) was used for the measurement.

抗体精製 Antibody Purification:
一過性トランスフェクションからの培養上清を遠心分離によって収獲し、無菌ろ過した。 Culture supernatants from transient transfections were harvested by centrifugation, and sterile filtered. ろ過した上清のpHを、pH7.0の1Mのクエン酸ナトリウム1/50体積を添加することで調整した。 The pH of the filtered supernatants was adjusted by addition of sodium citrate 1/50 volume of 1M of pH 7.0. 上清を、pH7.0で、150mMのNaCl、20mMのクエン酸ナトリウムで予め平衡化された1mlのHiTrap(商標) Protein A HPカラム(Amersham Biosciences TM Corporation, Piscataway, NJ)上に走らせた。 The supernatant at pH 7.0, was run 150mM of NaCl, HiTrap that was pre-equilibrated 1ml with 20mM sodium citrate (TM) Protein A HP column (Amersham Biosciences TM Corporation, Piscataway, NJ) on. カラムを同じ緩衝液で洗浄し、結合した抗体を、pH3.5の20mMのクエン酸ナトリウムで溶出させた。 The column was washed with the same buffer, and bound antibody was eluted with 20mM sodium citrate pH 3.5. 1/50体積のpH6.5の1.5Mのクエン酸ナトリウムを添加して中和させた後、プールした抗体画分を、pH6.0の120mM NaCl、20mMクエン酸ナトリウムで予め平衡化された5mlのHiTrap(商標) Desaltingカラム(Amersham Biosciences TM Corporation)上に走らせた。 After neutralization by addition of sodium citrate 1.5M 1/50 volume of pH 6.5, the antibody fractions were pooled, 120 mM NaCl of pH 6.0, pre-equilibrated with 20mM sodium citrate 5ml It was run on a HiTrap (TM) Desalting column (Amersham Biosciences TM Corporation). 流入物を収集し、OD 280 >0.1の画分をプールし、2mlのVivaspin(商標) 濃縮器(50,000ダルトンMWCO)(Vivascience(商標) AG)を用いて最高0.5〜1.0mg/mlまで濃縮した。 The inflow was collected, pooled fractions OD 280> 0.1, and concentrated to a maximum of 0.5 to 1.0 mg / ml with 2ml of Vivaspin (TM) concentrators (50,000 dalton MWCO) (Vivascience (TM) AG) . その後、0.2μmのMillex(商標)-GVマイクロフィルター(Millipore(商標) Corporation)を用いて、標本をろ過滅菌した。 Then, using a 0.2μm of Millex (TM) -GV microfilters (Millipore (TM) Corporation), was filter sterilized specimens. 精製された抗体の濃度は、280nmでの吸収度(1mg/ml=1.4A 280 )を測定することによって、UV分光法によって決定された。 Concentration of purified antibody by measuring the absorbance at 280nm (1mg / ml = 1.4A 280 ), were determined by UV spectroscopy.

安定したトランスフェクションからの抗体の小規模精製のためには、培養上清を遠心分離により収獲し、無菌ろ過した。 For small-scale purification of antibody from stable transfections, culture supernatants were harvested by centrifugation, and sterile filtered. pH7.4のPBSで予め平衡化された5mlのPOROS(商標)50A ProteinAカラム(Applied Biosystems(商標))上に上清を走らせた。 I ran the supernatant onto a pre-equilibrated 5ml in pH7.4 in PBS POROS (TM) 50A ProteinA column (Applied Biosystems (TM)). カラムを同じ緩衝液で洗浄し、結合した抗体を、pH3.0の0.1MのNaCl、0.1Mのグリシンで溶出させた。 The column was washed with the same buffer, and bound antibody was eluted with 0.1M NaCl in pH 3.0, 0.1M glycine. 1/20体積の1MのTris基剤を添加して中和させた後、プールした画分を、PD-10脱塩カラム(Amersham Biosciences TM Corporatio)を用いてか又は透析により、PBSpH7.4内へ緩衝液交換させた。 After neutralized by addition of Tris base, 1/20 volume of 1M, the fractions pooled, according to whether or dialysis using a PD-10 desalting column (Amersham Biosciences TM Corporatio), the PBSpH7.4 to were allowed to buffer exchange. 次に標本を、0.2μmのMillex(商標)-GVマイクロフィルター(Millipore(商標) Corporation)を用いてろ過滅菌した。 The next sample, and filter sterilized using a 0.2μm of Millex (TM) -GV microfilters (Millipore (TM) Corporation). 精製した抗体の濃度を、280nmでの吸収度(1mg/ml=1.4A 280 )を測定することによってUV分光法により決定した。 The concentration of the purified antibody was determined by UV spectroscopy by measuring the absorbance at 280nm and (1mg / ml = 1.4A 280) .

安定したトランスフェクタントからの抗体の大規模精製のためには、細胞培養収獲物をSartorius(商標)ろ過カプセル(Sartorius(商標) AG、Goettingen, Germany)を用いたデッドエンドろ過により清澄させた。 For large-scale purification of stable antibody from transfectants were then clarified cell culture harvest was Sartorius (TM) filtration capsule (Sartorius (TM) AG, Goettingen, Germany) by dead-end filtration using . 清澄させた収獲物をPellicon(商標) 2カセット(30,000ダルトンMWCO)(Millipore(商標) Corporation)を用いて約10Lから750mlまで濃縮させ、次に上述のクエン酸緩衝液システムを用いてrProteinA Sepharose FFカラム(Amersham Biosciences TM Corporation)上のプロテインAアフィニティクロマトグラフィにより精製した。 Was concentrated harvest product was clarified from about 10L using Pellicon (R) 2 cassette (30,000 dalton MWCO) (Millipore (TM) Corporation) to 750 ml, then rProteinA Sepharose FF using the above citrate buffer system It was purified by protein a affinity chromatography on a column (Amersham Biosciences TM Corporation). プロテインA溶出液を、YM30膜(Millipore(商標) Corporation)を用いてAmicon(商標)撹拌式セル器具内で濃縮させ、その後、Superdex TM 200カラム(Amersham Biosciences TM Corporation)を用いて、pH6.0の120mMのNaCl、20mMのクエン酸ナトリウム内に標本を緩衝液交換した。 Protein A eluate was concentrated in Amicon (TM) stirred cell in the instrument using a YM30 membrane (Millipore (TM) Corporation), then, using a Superdex TM 200 column (Amersham Biosciences TM Corporation), pH6.0 120mM of NaCl, and buffer exchanged samples in sodium citrate of 20 mM. pH及び浸透圧を測定し、精製された抗体の濃度を、280nmでの吸収度(1mg/ml=1.4A 280 )を測定することによりUV分光法で決定した。 The pH and osmolality were measured, the concentrations of the purified antibodies were determined by UV spectroscopy by measuring the absorbance at 280nm and (1mg / ml = 1.4A 280) .

SDS-PAGE SDS-PAGE
NuPAGE(商標)Novex4-12% Bis-Tris gels (Invitrogen TM )上に還元又は非還元条件で5μgの精製済み抗体標本を走らせ、メーカーの推奨事項に従ってSimply Blue TM SafeStain Kit(Invitrogen TM )を用いて染色した。 NuPAGE (TM) Novex4-12% Bis-Tris gels ( Invitrogen TM) under reducing or non-reducing conditions on run a purified antibody samples 5 [mu] g, using Simply Blue TM SafeStain Kit (Invitrogen TM ) according to the manufacturer's recommendations stained.

結果 Result:
IgG2M3Fc及びIgG1Fc突然変異体は、それぞれ、OST577の軽鎖及び重鎖可変領域(Ehrlich et al.,前掲書中)、ヒトラムダ-2の軽鎖定常領域(Hieter et al.(1981)、前掲書中)及びヒトガンマ-2 突然変異体3(IgG2M3)(Cole et al., 前掲書中)及びIgG(Ellison et al.,前掲書中)の重鎖定常領域を含む抗-HBV抗体として発現された。 IgG2M3Fc and IgG1Fc mutants, respectively, the light and heavy chain variable regions of OST577 (Ehrlich et al., Op. Cit.), The light chain constant region (Hieter et al of human lambda-2. (1981), ibid in ) and human gamma -2 mutants 3 (IgG2M3) (Cole et al., ibid in) and IgG (Ellison et al., was expressed as an anti -HBV antibody comprising a heavy chain constant region of op.cit). IgG2M3変異体は、C H 2領域(V234A及びG237A)内に2つのアミノ酸置換を含み、ヒトFcyレセプタに対する極めて低い残留結合を示す(Cole et al.,前掲書中)。 IgG2M3 variant contains two amino acid substitutions in the C H 2 region (V234A and G237A), it shows extremely low residual binding to human Fcy receptors (Cole et al., Op. Cit.). IgG2M3Fc及びIgG1Fc突然変異体は、同様に、それぞれ、HulD10の軽鎖及び重鎖可変領域(Kostelny et al.(2001)前掲書中)、ヒトカッパの軽鎖定常領域(Hieter et al.(1980)前掲書中)及びヒトIgG2M3(Cole et al., 前掲書中)及びIgG1(Ellison et al., 前掲書中)の重鎖定常領域を含む抗-HLA-DRβ鎖対立遺伝子抗体としても発現された。 IgG2M3Fc and IgG1Fc mutants likewise, respectively, the light and heavy chain variable region (Kostelny et al. (2001) op.cit) of Hu1D10, the light chain constant region of human kappa (Hieter et al. (1980) supra Shochu) and human IgG2M3 (Cole et al., ibid in) and IgG1 (Ellison et al., it was also expressed as anti-HLA-DR beta chain allele antibody comprising a heavy chain constant region of op.cit).

上述のように、適切な野生型又は突然変異体重鎖発現ベクターを、OST577又はHulD10モノクローナル抗体の発現のため293-H細胞内に適切な軽鎖発現ベクターと共に一過性に同時トランスフェクションさせた。 As mentioned above, the appropriate wild-type or mutant heavy chain expression vector were co-transfected transiently with the appropriate light chain expression vector to 293-H in cells for expression of OST577 or HulD10 monoclonal antibodies. 一過性トランスフェクションの後に収獲された培養上清のELISA分析は、抗体発現レベルが25mlの上清中で標準的に5〜50μg/mlであることを示した。 ELISA analysis of culture supernatants were harvested after transient transfection showed that antibody expression levels are standardly 5-50 [mu] g / ml in supernatants of 25 ml. OST577又はHulD10抗体をプロテインAアフィニティクロマトグラフィで精製し、約100〜1000μgの最終収量を得た。 The OST577 or HulD10 antibodies were purified by protein A affinity chromatography, to give a final yield of approximately 100-1000. Sp2/0 細胞内のOST577又はHulD10抗体の安定した発現は、標準的に結果として、ELISAにより決定される通り5〜50μg/mlの発現レベルをもたらした。 Sp2 / 0 stable expression of OST577 or HulD10 antibody in cells, as a standard Consequently, resulted in expression levels of as 5-50 [mu] g / ml as determined by ELISA. 培養上清中に存在する抗体の約50〜80%の収量が、小規模プロテインAアフィニティクロマトグラフィによって得られた。 About 50-80% yield of antibody present in culture supernatants were obtained by small-scale protein A affinity chromatography.

精製済み抗体を、非還元条件及び還元条件下で、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS-PAGE)により特徴づけした。 Purified antibody under non-reducing and reducing conditions, were characterized by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). 非還元条件下でのSDS-PAGE分析は、精製済み抗体が約150〜160kDの分子量を有することを示し(データ示さず)還元条件下での分析は、精製済み抗体が約50kDの分子量をもつ重鎖そして約25kDの分子量をもつ軽鎖(図10A及び10Bを参照)で構成されていることを示した。 SDS-PAGE analysis under non-reducing conditions showed that the purified antibody has a molecular weight of about 150~160KD (data not shown) analysis under reducing conditions, purified antibody has a molecular weight of about 50kD It showed that it is composed of the heavy chain and the light chain having a molecular weight of about 25 kD (see Figure 10A and 10B). 安定したSp2/0 トランスフェクタントから精製された抗体のSDS-PAGE分析は、一過性293-Hトランスフェクションからの精製された抗体で観察されたものに類似の結果を提供した。 SDS-PAGE analysis of purified from stable Sp2 / 0 transfectants antibody, provided similar results to those observed with purified antibody from transient 293-H transfections.

例6 Example 6.
この例は、突然変異体IgG2M3及びIgG1抗体の競合結合分析について記述している。 This example describes the competitive binding analysis of mutant IgG2M3 and IgG1 antibodies.
細胞培養 Cell culture:
マウス骨髄腫細胞系統NS0(European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, UK)を10%のFBSを含むDMEM中に維持した。 It was maintained murine myeloma cell line NS0 (European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, UK) and in DMEM containing 10% FBS. 表面上で組換え型でGPIリンクしたヒト又はアカゲザルFcRnを発現するNS0トランスフェクタントを、マイコフェノール酸(MPA)選択培地(DMEM、10% FBS、1xHT Media Supplement Hybri-Max(商標) (Sigma(商標))、250μg/mlのキサンチン(Sigma(商標))、1μg/mlのマイコフェノール酸(Life Technologies(商標))及び2mML-グルタミン)又は2×MPA選択培地の中で維持した。 The NS0 transfectants expressing human or rhesus FcRn was GPI linked with recombinant on the surface, mycophenolic acid (MPA) selection medium (DMEM, 10% FBS, 1xHT Media Supplement Hybri-Max (TM) (Sigma (TM)), 250 [mu] g / ml xanthine (Sigma (TM)), were maintained in mycophenolic acid (Life Technologies (TM)) and 2mML- glutamine) or 2 × MPA selection medium 1 [mu] g / ml.

ヒトFcRn細胞系統 Human FcRn cell line
NS0細胞をpDL208で安定した形でトランスフェクションした。 It was transfected in a stable manner with NS0 cells in pDL208. 約1×10 7個の細胞を1回洗浄し、1mlの単純DMEM中に再懸濁させ、Gene Pulser TM Cuvette(Bio-Rad(商標) Laboratories)に移し、氷上で10分間インキュベートした。 About 1 × 10 7 cells were washed once, resuspended in simple DMEM in 1 ml, transferred to a Gene Pulser TM Cuvette (Bio-Rad ( TM) Laboratories), and incubated on ice for 10 minutes. 40μgのプラスミドpDL208をFspIで線形化し、氷上で細胞と穏やかに混合し、次に1.5kV、3μFに設定したGene Pulser TM II(Bio-Rad(商標) Laboratories)を用いて2回パルス処理することにより細胞を電気穿孔し、10分間氷上に戻した。 The 40μg of plasmid pDL208 was linearized with FspI, gently mixed with the cells on ice, then 1.5 kV, twice pulsed with Gene Pulser set to 3μF TM II (Bio-Rad (TM) Laboratories) that the cells were electroporated by, and returned to ice for 10 min. 細胞を20mlのDMEM、10%のFBS中で希釈させ、100μl/ウェルで2枚の96ウェル平板内に固定した。 Cells were diluted in FBS DMEM, 10% of 20 ml, was fixed to 96 in well plates two at 100 [mu] l / well. 培地を48時間後にMPA選択培地と交換した。 It was replaced with MPA selection medium medium after 48 hours. 見かけ上単一のコロニーを含んでいるウェルからのマイコフェノール酸耐性NS0トランスフェクタントを、MPA選択培地内で膨張させ、約3週間後にFACS TMによりスクリーニングした。 Mycophenolic acid-resistant NS0 transfectants from wells apparently containing single colonies were expanded in MPA selection medium and screened by FACS TM after about 3 weeks.

試験1回につき約1.5×10 5個の細胞を、氷上で1時間、10μg/mlのビオチニル化されたマウス抗ヒトB2-ミクログロブリン抗体(Chromaprobe, Inc., Aptos, CA)を含む100μlのFACS Staining Buffer(FSB)(PBS、1%FBS、0.1%NaN 3 )中でインキュベートした。 Test once per about 1.5 × 10 5 cells on ice for 1 hour, 10 [mu] g / ml of biotinylated mouse anti-human B2- microglobulin antibody (Chromaprobe, Inc., Aptos, CA ) of 100μl containing FACS Staining Buffer (FSB) was incubated with (PBS, 1% FBS, 0.1 % NaN 3) in. 細胞を4mlのFSBで1回洗浄し、次に20μg/mlのストレプトアビジン-FITC接合体を含有する25μlのFSB(Southern Biotechnology Assosciates, Inc.)中でインキュベートした。 Cells were washed once with FSB of 4 ml, then the 25μl containing streptavidin -FITC conjugate 20μg / ml FSB (Southern Biotechnology Assosciates, Inc.) were incubated in. 細胞を4mlのFSBで一回洗浄し、1%のホルムアルデヒド中に再懸濁させた。 Cells were washed once with FSB of 4 ml, were resuspended in 1% formaldehyde. 標本を1、FACS canフローサイトメトリ(BD(商標) Biosciences, San Josc, CA)を用いてヒトβ2mに対する抗体の結合について分析した。 1 specimens, FACS CAN flow cytometry (BD (TM) Biosciences, San Josc, CA) were analyzed for antibody binding to human β2m using. 最高の見かけの染色を有する複数のクローンを、FACStar細胞ソーター(BD(商標)Biosciences)を用いてサブクローニングし、DMEM、10%のFBS、2mMのL-グルタミンの中で膨張させ、上述の通りにFACS TMによって再試験した。 A plurality of clones with staining highest apparent, and subcloned using a FACStar cell sorter (BD (TM) Biosciences), DMEM, 10% of FBS, is expanded in 2mM L- glutamine, as described above It was re-tested by FACS TM. NS0 HuFcRn(memb)、クローン7〜3と呼称される1つのサブクローンを、後続する結合検定中で使用した。 NS0 HuFcRn (memb), one sub-clones, designated clone 7 to 3 was used in subsequent binding assays.

アカゲザルFcRn細胞系統 Rhesus FcRn cell lines:
NS0細胞を、pDL410で安定した形でトランスフェクションさせた。 The NS0 cells were transfected in a stable manner with PDL410. 約6×10 5個の細胞を上述の通り電気穿孔によりトランスフェクションさせた。 About 6 × 10 5 cells were transfected by electroporation as described above. アカゲザルFcFnアルファ鎖を交差反応する、試験1回につき100ngのマウス抗ヒトFcRnアルファ鎖抗体(Protein Design Labs TM , Inc.)で染色し、ヤギ抗マウスカッパFITC接合型抗体(Southern Biotechnology Associates, Inc.)で検出することによって、上述の通りにFACS TMによりトランスフェクタントを同定した。 Cross-reacts with rhesus FcFn alpha chain, test once per 100ng of mouse anti-human FcRn alpha chain antibody (Protein Design Labs TM, Inc.) in dyed, goat anti-mouse kappa FITC-conjugated antibody (Southern Biotechnology Associates, Inc. by detecting at), it was identified transfectants by FACS TM as described above. 後続する結合検定では、NS0RhFcRn、クローン-3と呼称される細胞系統が使用された。 The subsequent binding assays, NS0RhFcRn, cell line, designated clone -3 was used.

単一点競合結合検定 Single-point competitive binding assay:
細胞系統NS0 HuFcRn(memb)、クローン7-3上のヒトFcRnに対する結合についての単一点競合結合検定において、濃縮したOST577-IgG2M3上清を試験した。 Cell line NS0 HuFcRn (memb), the single point competitive binding assay for binding to human FcRn on clone 7-3 were tested OST577-IgG2M3 supernatants concentrated. 試験一回につき約2×10 5個の細胞を、pH8.0のFACS Binding Buffer(FBB)(0.5%のBSA、0.1%のNaN 3を含有するPBS)中で1回、pH6.0のFBB中で1回洗浄し、pH6.0のFBB中の予め混合されたビオチニル化したOST577-IgG2M3抗体(8.3μg/ml)及び(8.3μg/mlの競合抗体を含む)濃縮上清120μlの中に再懸濁させた。 About 2 × 10 5 cells per test once, FACS Binding Buffer (FBB) in pH 8.0 1 times in (0.5% BSA, PBS containing 0.1% NaN 3), FBB of pH6.0 washed once with medium, in a premixed biotinylated OST577-IgG2M3 antibody (8.3μg / ml) and (including 8.3μg / ml of competing antibody) concentrate supernatant 120μl in FBB, pH6.0 resuspended.

細胞を、氷上で1時間インキュベートし、pH6.0のFBB中で2回洗浄し、pH6.0のFBB中で2.5μg/mlまで希釈させた25μlのストレプトアビジン-RPE接合体(Bio Source International)内に再懸濁させた。 Cells were incubated on ice for 1 hour, washed twice in FBB, pH 6.0, 25 [mu] l streptavidin -RPE conjugate which was diluted to 2.5 [mu] g / ml in FBB, pH6.0 (Bio Source International) resuspended within. 暗所で氷上にて30分間インキュベートした後、細胞をpH6.0のFBB中で2回洗浄し、1%のホルムアルデヒド中で再懸濁させた。 After incubation for 30 minutes on ice in the dark, the cells were washed twice in FBB, pH 6.0, and resuspended in 1% formaldehyde. 標本を、FACS Caliburフローサイトメータ(BD(商標) Biosciences)を用いてFACS TMによりFcRnに対する抗体結合について分析した。 Samples were analyzed for antibody binding to FcRn by FACS TM using FACS Calibur flow cytometer (BD (TM) Biosciences). 各突然変異体の平均チャネル螢光(MCF)を、野生型抗体のものと比較し、Excel(Microsoft(商標) Corporation, Redmond, WA)を用いてプロットした。 The mean channel fluorescence for each mutant (MCF), as compared with that of the wild-type antibody and plotted using Excel (Microsoft (TM) Corporation, Redmond, WA).

競合結合検定 Competitive binding assays:
各々の精製済みOST577-IgG2M3抗体の希釈系列を、細胞系統NS0 HuFuRn(memb)、クローン7-3上のヒトFcRnに対する結合について、ビオチニル化されたHuEP5C7-IgG2M3抗体(He et al., J.Immunol. 160;1029-1035(1998))に対して競合させた。 A dilution series of each purified OST577-IgG2M3 antibody of cell line NS0 HuFuRn (memb), for binding to human FcRn on the clone 7-3, biotinylated HuEP5C7-IgG2M3 antibody (He et al., J.Immunol . was competed against 1029-1035 (1998)); 160. 初期スクリーニング実験については、試験1回あたり約2×10 5個の細胞を、pH6.0のFSB中で1回洗浄し、pH6.0のFSB中の予め混合されたビオチニル化HuEP5C7-IgG2M3抗体(10μg/ml)及びOST577-IgG2M3競合抗体(208μg/mlから0.102μg/mlまでの2倍の系列希釈)100μl中に再懸濁させた。 Initial For screening experiments, approximately 2 × 10 5 cells per test were washed once in FSB of pH 6.0, premixed biotinylated HuEP5C7-IgG2M3 antibody in FSB of pH 6.0 ( 10 [mu] g / ml) and OST577-IgG2M3 2-fold serial dilutions from competing antibody (208μg / ml to 0.102μg / ml) were resuspended in 100 [mu] l.

細胞を氷上で1時間抗体混合物と共にインキュベートし、pH6.0のFSB中で2回洗浄し、pH6.0のFSB中で2.5μg/mlまで希釈させた25μlのストレプトアビジン-RPE接合体(Bio Source International)中に再懸濁させた。 Cells were incubated with antibody for 1 hour on ice the mixture was washed twice in FSB, pH 6.0, streptavidin -RPE conjugate 25μl which was diluted to 2.5 [mu] g / ml in FSB of pH 6.0 (Bio Source It was re-suspended in the International). 暗所で氷上にて30分間インキュベートした後、細胞をpH6.0のFSB中で2回洗浄し、1%のホルムアルデヒド中で再懸濁させた。 After incubation for 30 minutes on ice in the dark, the cells were washed twice in FSB, pH 6.0, and resuspended in 1% formaldehyde. 標本を、FACScanフローサイトメータ(BD(商標) Biosciences)を用いてFACS TMによりFcRnに対する抗体結合について分析した。 Samples were analyzed for antibody binding to FcRn by FACS TM using a FACScan flow cytometer (BD (TM) Biosciences). 平均チャンネル螢光(MCF)を、競合物質濃度に対してプロットし、IC50値をGraph Pad Prism(商標)(Graph Pad TM Software, Inc., San Diego, CA)を用いて計算した。 Mean channel fluorescence of (MCF), competitive plotted against substance concentration, the IC50 values Graph Pad Prism (TM) (Graph Pad TM Software, Inc. , San Diego, CA) were calculated using. 一貫性に関しては、表中に示されたIC50値は、最終的競合濃度に基づいている。 Regarding consistency, IC50 values ​​shown in the table are based on the final competitor concentrations.

後続する競合結合実験は、細胞をpH8.0のFBB中で一回、pH6.0のFBB中で一回洗浄し、次にpH6.0のFBB中の予め混合されたビオチニル化HuEP5C7-IgG2M3抗体(10μg/ml)及びOST577-IgG2M3競合抗体(208μg/mlから0.102μg/mlまでの2倍の系列希釈)100μlの中で再懸濁させたという点を除いて、上述の通りに行なった。 Subsequent competitive binding experiments, cells once in FBB, pH 8.0, and washed once in FBB, pH6.0, then pH6.0 premixed biotinylated HuEP5C7-IgG2M3 antibody in FBB, (10 [mu] g / ml) and OST577-IgG2M3 competitor antibody (2-fold serial dilutions from 208μg / ml to 0.102μg / ml) except that resuspended in 100 [mu] l, were carried out as described above. 後続する全てのインキュベーション及び洗浄は、上述の通り、pH6.0でFBBを用いて行なった。 All incubations and washes followed, as described above, was performed using FBB at pH 6.0. 上述の通り、pH6.0のFBB中の予め混合されたビオチニル化OST577-IgG2M3抗体(8.3μg/ml)及びOST577-IgG2M3競合抗体(208μg/mlから0.102μg/mlまでの2倍系列希釈)120μlの中で、1群の実験を行なった。 As described above, (2-fold serial dilutions from 208μg / ml to 0.102μg / ml) pre-mixed biotinylated OST577-IgG2M3 antibody (8.3μg / ml) and OST577-IgG2M3 competitor antibodies in FBB, pH 6.0 120 [mu] l in, it was carried out of the group of experiments. もう1群の実験を、上述の通り、pH6.0のFBB中の予め混合されたビオチニル化OST577-IgG1抗体(5.0μg/ml)及びOST577-IgG1競合抗体(125μg/mlからの2倍系列希釈、又は250μg/mlからの3倍系列希釈)200μlの中で行なった。 The other group of experiments, as described above, two-fold serial dilutions from premixed biotinylated OST577-IgG1 antibody (5.0 [mu] g / ml) and OST577-IgG1 competitor antibody (125 [mu] g / ml in FBB, pH6.0 or 3-fold serial dilutions from 250 [mu] g / ml) was performed in 200 [mu] l.

さらにもう1群の実験を、上述の通り、pH6.0のFBB中の予め混合されたビオチニル化HuEP577-IgG1抗体(5.0μg/ml)及びOST577-IgG1競合抗体(750μg/mlから出発した3倍系列希釈)200μl中で行なった。 Further another group of experiments, as described above, three times starting from premixed biotinylated HuEP577-IgG1 antibody (5.0 [mu] g / ml) and OST577-IgG1 competitor antibody (750 [mu] g / ml in FBB, pH6.0 series dilution) were carried out in 200μl. 各々の精製済みOST577-IgG2M3抗体の希釈系列を、細胞系統NS0 RhFc、クローンR-3上のアカゲザルFcRnに対する結合について、ビオチニル化されたOST577-IgG2M3抗体に対して競合させた。 A dilution series of each purified OST577-IgG2M3 antibody of cell line NS0 RhFc, for binding to rhesus FcRn on the clone R-3, was competed against biotinylated OST577-IgG2M3 antibody. 一群の実験においては、試験1回あたり約2×10 5個の細胞を、pH8.0のFSB中で1回そしてpH6.0のFBB中で1回洗浄し、次にpH6.0のFSB中の予め混合されたビオチニル化OST577-IgG2M3抗体(8.3μg/ml)及びOST577-IgG2M3競合抗体(208μg/mlから0.102μg/mlまでの2倍の系列希釈)120μl中に再懸濁させた。 In one group of experiments, approximately 2 × 10 5 cells per test, and washed once with one and FBB, pH6.0 in FSB of pH 8.0, then in the FSB pH6.0 of pre-mixed biotinylated OST577-IgG2M3 antibody (8.3μg / ml) and OST577-IgG2M3 (2-fold serial dilutions from 208μg / ml to 0.102μg / ml) competitor antibody were resuspended in 120 [mu] l.

細胞を氷上で1時間抗体混合物と共にインキュベートし、pH6.0のFBB中で2回洗浄し、pH6.0のFBB中で2.5μg/mlまで希釈させた25μlのストレプトアビジン-RPE接合体(Bio Source International)中に再懸濁させた。 Cells were incubated with antibody for 1 hour on ice the mixture was washed twice in FBB, pH 6.0, streptavidin -RPE conjugate 25μl which was diluted to 2.5 [mu] g / ml in FBB, pH 6.0 (Bio Source It was re-suspended in the International). 暗所で氷上にて30分間インキュベートした後、細胞をpH6.0のFBB中で2回洗浄し、1%のホルムアルデヒド中で再懸濁させた。 After incubation for 30 minutes on ice in the dark, the cells were washed twice in FBB, pH 6.0, and resuspended in 1% formaldehyde. 標本を、FACSCaliburフローサイトメータ(BD(商標) Biosciences)を用いてFACS TMによりFcRnに対する抗体結合について分析した。 Samples were analyzed for antibody binding to FcRn by FACS TM using a FACSCalibur flow cytometer (BD (TM) Biosciences). もう1群の実験を、上述の通り、pH6.0のFBB中の予め混合されたビオチニル化OST577-IgG1抗体(5.0μg/ml)及びOST577-IgG1競合抗体(500μg/mlから出発した3倍の系列希釈)200μlの中で行なった。 The other group of experiments, as described above, premixed biotinylated OST577-IgG1 antibody in FBB, pH6.0 (5.0μg / ml) and OST577-IgG1 competitor antibody (500 [mu] g / ml 3 times starting from It was carried out in a series dilution) 200μl.

結果 Result:
その表面上でヒトFcRnを安定した形で発現するトランスフェクションを受けたNS0細胞系統を用いて、野生型OST577-IgG2M3又はOST577-IgG1抗体及びそのさまざまな突然変異体のFcRnに対する相対的結合を決定した。 With NS0 cell line that have undergone transfection expressing human FcRn on its surface in a stable manner, determine the relative binding to FcRn wild-type OST577-IgG2M3 or OST577-IgG1 antibodies and their various mutants did. 上述の通り、濃縮した上清を、単一点競合検定に従ってヒトFcRnに対する結合についてテストし、精製された抗体を、競合結合検定におけるFcRn結合についてテストした。 As described above, the concentrated supernatants were tested for binding to human FcRn according to the single point competitive assay, the purified antibodies were tested for FcRn binding in competitive binding assays. 増大する濃度の標識されていない競合抗体を、pH6.0のFSB又はFBBの中で飽和濃度の標識されたIgG2M3又はIgG1抗体の存在下で、細胞と共にインキュベートさせた。 Competing unlabeled antibody concentrations of increasing, in the presence of IgG2M3 or IgG1 antibody labeled saturating concentration in FSB or FBB, pH 6.0, it was incubated with the cells.

濃縮したOST577-IgG2M3上清での標準的実験の結果は、図11A、11B及び11Cに示されている。 Results of standard experiments with concentrated OST577-IgG2M3 supernatants are shown in FIG. 11A, 11B and 11C. 図11Aに示されているように、位置250にある突然変異体の一部分(例えばT250E、T250Q)は、野生型よりも強い競合物質であり、これらの突然変異体が野生型抗体に比べて増大したヒトFcRnに対する結合を有するということを示唆していた。 As shown in FIG. 11A, a portion (e.g. T250E, T250Q) of the mutants at position 250, were stronger competitors than the wild-type, these mutants increases as compared to the wild-type antibody suggesting that has a binding to human FcRn. この位置にあるその他の突然変異体(例えばT250D、T250F、T250K、T250N、T250P、T250R、T250W、T250Y)は、野生型よりも弱い競合物質であり、これらの突然変異体が野生型抗体に比べてヒトFcRnに対する低減した結合を有することを示唆していた。 Other mutants at this position (e.g. T250D, T250F, T250K, T250N, T250P, T250R, T250W, T250Y) are weaker competitors than the wild-type, these mutants compared to the wild-type antibody suggesting that it has a coupling with reduced to human FcRn Te. 図11Bに示されているように、位置314における突然変異体のいずれも、野生型よりも強い競合物質ではなく、これらの突然変異体のいずれも野生型抗体に比べて増大したヒトFcRnに対する結合を有していないということを示唆していた。 As shown in FIG. 11B, none of the mutants at position 314, rather than the stronger competitors than the wild-type, binding to human FcRn, were all increased as compared to the wild-type antibody in these mutants that is it does not have a have suggested.

この位置における突然変異体の大部分(例えば、L314A、L314C、L314D、L314E、L314F、L314G、L314H、L314K、L314M、L314N、L314P、L314Q、L314R、L314S、L314T、L314V、L314W、L314Y)は、野生型よりも弱い競合物質であり、これらの突然変異体が野生型抗体に比べて減少したヒトFcRnに対する結合を有することを示唆していた。 Most of the mutants at this position (e.g., L314A, L314C, L314D, L314E, L314F, L314G, L314H, L314K, L314M, L314N, L314P, L314Q, L314R, L314S, L314T, L314V, L314W, L314Y) is a weak competitors than the wild-type, these mutants had suggested to have binding to human FcRn was reduced as compared to the wild-type antibody. 図11Cに示されているように、位置428にある突然変異体の一部分(例えばM428F、428L)は、野生型よりも強い競合物質であり、これらの突然変異体が野生型抗体と比べて増大したヒトFcRnに対する結合を有するということを示唆していた。 As shown in FIG. 11C, a portion (e.g. M428F, 428L) of the mutants at position 428, were stronger competitors than the wild-type, these mutants increased compared to the wild-type antibody suggesting that has a binding to human FcRn. この位置にあるその他の突然変異体(例えばM428A、M428C、M428D、M428E、M428G、M428H、M428K、M428N、M428P、M428Q、M428R、M428S、M428T、M428V、M428Y)は、野生型に比べて弱い競合物質であり、これらの突然変異体が野生型抗体に比べて減少したヒトFcRnを有することを示唆していた。 Other mutants at this position (e.g. M428A, M428C, M428D, M428E, M428G, M428H, M428K, M428N, M428P, M428Q, M428R, M428S, M428T, M428V, M428Y) is weaker competitors than the wild-type a substance, these mutants had suggested that having human FcRn was reduced as compared to the wild-type antibody.

表2は、ヒトFcRnに対する競合について、精製した野生型OST577-IgG2M3抗体及びその突然変異体のIC50値(FcRnに対する標識された抗体の結合を50%阻害するのに必要な競合抗体の量)をまとめている。 Table 2, for competition for human FcRn, IC50 value of the purified the wild-type OST577-IgG2M3 antibody and its mutants (amount of competing antibody required for 50% binding of labeled antibody inhibition to FcRn) collectively have. 相対的結合値は、野生型OST577-IgG2M3抗体のIC50値と各々の突然変異体のIC50値の比率として計算された。 Relative binding values ​​were calculated as the ratio of IC50 values ​​of IC50 values ​​of the wild-type OST577-IgG2M3 antibody and respective mutants. アミノ酸位置314では、精製済み抗体のいずれも、野生型抗体との関係においてヒトFcRnに対する結合の増大を示さなかった。 In amino acid position 314, none of the purified antibody, showed no increase in binding to human FcRn relative to the wild-type antibody. 実際、位置314における精製済み突然変異体のうちの4つの全てが野生型抗体との関係において減少した結合を示した。 In fact, it showed binding to all four of the purified mutants at position 314 is reduced relative to the wild-type antibody. しかしながら、アミノ酸位置250においては、突然変異体の1つ(T250E)が、野生型抗体に比べて約6倍優れたヒトFcRnに対する結合を示した。 However, at amino acid position 250, one of the mutants (T250E) showed binding to about 6 times superior human FcRn as compared to the wild-type antibody. 位置250における複数の突然変異体が、野生型抗体との関係においてわずかに減少した結合を示し、1つの突然変異体(T250D)は、野生型抗体との関係において実質的に減少したヒトFcRnに対する結合を示した。 Multiple mutants at position 250 showed slightly reduced binding relative to the wild-type antibody, one mutant (T250D) is for substantially reduced human FcRn relative to the wild-type antibody It showed binding. アミノ酸位置428では、突然変異体の1つ(M428)は同じく、野生型抗体よりも約3倍優れたヒトFcRnに対する結合を示し、一方もう1つの突然変異体(M428G)は、野生型抗体との関係において実質的に低減されたヒトFcRnに対する結合を示した。 In amino acid position 428, one of the mutants (M428) is also showed binding to approximately 3-fold better human FcRn than the wild-type antibody, while another mutant (M428G) is the wild-type antibody It showed binding to substantially reduced human FcRn in relationship.

2つの異なる位置における2つのアミノ酸置換、すなわち、各々ヒトFcRnに対する結合の増大を示すT250E、T250Q、M428F及びM428Lが同定されたことから、二重突然変異体 T250E/M428F、T250Q/M428F及びT250Q/M428Lが構築され、293-H細胞内に一過性にトランスフェクションされ、精製され、ヒトFcRnへの結合についてテストされた。 Two amino acid substitutions at two different positions, i.e., each T250E showing increased binding to human FcRn, T250Q, since the M428F and M428L were identified, the double mutant T250E / M428F, T250Q / M428F and T250Q / M428L was constructed, transiently transfected into 293-H within the cell, purified and tested for binding to human FcRn. 上述の通り、標識されていない増大する濃度の抗体が、pH6.0中の未飽和濃度の標識されたHuEP5C7-IgG2M3又はOST577-IgG2M3抗体の存在下で、ヒトFcRnを発現する細胞と共にインキュベートされた。 As described above, the antibodies of increasing concentrations of the unlabeled in the presence of HuEP5C7-IgG2M3 or OST577-IgG2M3 antibody labeled unsaturation concentrations in pH 6.0, was incubated with cells expressing human FcRn .

図12Aに示されている通り、二重突然変異体(T250E/M428F)は、単一突然変異体(T250E/M428F)のいずれよりもヒトFcRnに対するより優れた結合を示し、野生型抗体に比べ約15倍優れたヒトFcRnに対する結合を示した。 As shown in Figure 12A, the double mutant (T250E / M428F) showed better binding than to human FcRn than either of the single mutants (T250E / M428F), compared to the wild-type antibody It showed binding to about 15 fold better human FcRn. 図12Bに示されているように、二重突然変異体(T250Q/M428L)は、単一突然変異体(T250Q又はM428L)又は二重突然変異体(T250Q/M428F)のいずれよりも優れたヒトFcRnに対する結合を示し、野生型抗体よりも約28倍優れたヒトFcRnに対する結合を示した。 As shown in FIG. 12B, the double mutant (T250Q / M428L) is single mutants (T250Q or M428L) or the double mutant (T250Q / M428F) better human than any of showed binding to FcRn, it showed binding to about 28 fold better human FcRn than the wild-type antibody.

表3にまとめられているように、1つの実験グループにおいては、野生型OST577-IgG2M3抗体についてのIC50は、最高9μg/mlであり、一方、単一突然変異体(T250E及びM428F)の各々についてのIC50は最高3μg/mlであり、二重突然変異体(T250E/M428F)についてのIC50は1μg/ml未満である。 As summarized in Table 3, in one group of experiments, the IC50 for the wild-type OST577-IgG2M3 antibody is the highest 9 [mu] g / ml, whereas, for each of the single mutants (T250E and M428F) the IC50 of the highest 3 [mu] g / ml, IC50 for the double mutant (T250E / M428F) is less than 1 [mu] g / ml. 表4にまとめられているように、もう1つの実験グループにおいては、野生型OST577-IgG2M3抗体についてのIC50は最高12μg/mlであり、一方単一突然変異体(T250Q及びM428L)の各々及び二重突然変異体(T250Q/M428F)の各々についてのIC50は、最高2〜4μg/mlであり、二重突然変異体(T250Q/M428L)についてのIC50は、1μg/1ml未満である。 As summarized in Table 4, in another group of experiments, the IC50 for the wild-type OST577-IgG2M3 antibody is the highest 12 [mu] g / ml, whereas each and two single mutants (T250Q and M428L) IC50 for each of the heavy mutant (T250Q / M428F) is the highest 2~4μg / ml, IC50 for the double mutant (T250Q / M428L) is less than 1 [mu] g / 1 ml.

野生型OST577-IgG1、単一突然変異体 T250E、T250Q、M428F、M428L及び二重突然変異体T250E/M428F及びT250Q/M428Lも同様に作り出された。 Wild-type OST577-IgG1, the single mutants T250E, T250Q, M428F, M428L, and the double mutant T250E / M428F and T250Q / M428L were also created in the same manner. 表5にまとめられているように、1つの実験グループにおいては、野生型OST577-IgG1抗体についてのIC50は最高14μg/mlであり、一方単一突然変異体(T250E及びM428F)の各々についてのIC50は最高3〜5μg/mlであり、二重突然変異体(T250E/428F)についてのIC50は1μg/ml未満である。 As summarized in Table 5, in one group of experiments, the IC50 for the wild-type OST577-IgG1 antibody is the highest 14 [mu] g / ml, whereas the IC50 for each of the single mutants (T250E and M428F) is the highest 3~5μg / ml, IC50 for the double mutant (T250E / M428F) is less than 1 [mu] g / ml. 表6にまとめられているように、もう1つの実験グループにおいては、野生型OST577-IgG1抗体についてのIC50は最高10μg/mlであり、一方単一突然変異体(T250Q)についてのIC50は最高3μg/mlであり、単一突然変異体(M428L)及び二重突然変異体(T250Q/428L)についてのIC50は1μg/ml未満である。 As summarized in Table 6, in another group of experiments, the IC50 for the wild-type OST577-IgG1 antibody is the highest 10 [mu] g / ml, whereas the IC50 for the single mutant (T250Q) is best 3μg / a ml, IC50 for the single mutant (M428L) and the double mutant (T250Q / 428L) is less than 1 [mu] g / ml.

アカゲザルFcRnに対するOST577-IgG2M3及びその突然変異体の一部分の結合は、競合結合実験においてテストされた。 Coupling a portion of OST577-IgG2M3 and some of its mutants to rhesus FcRn were tested in competitive binding experiments. 表7にまとめられているように、野生型OST577/IgG2M3抗体についてのIC50は最高15μg/mlであり、一方、単一突然変異体(T250Q及びM428L)及び二重突然変異体(T250Q/428F)の各々についてのIC50は最高2〜4μg/mlであり、二重突然変異体(T250Q/428L)についてのIC50は、1μg/ml未満である。 As summarized in Table 7, the IC50 for the wild-type OST577 / IgG2M3 antibody is the highest 15 [mu] g / ml, whereas the single mutants (T250Q and M428L) and the double mutant (T250Q / M428F) the IC50 for each of the highest 2~4μg / ml, IC50 for the double mutant (T250Q / 428L) is less than 1 [mu] g / ml. アカゲザルFcRnに対するOST577-IgG1及びその突然変異体の一部分の結合も同様に競合結合実験においてテストされた。 Coupling a portion of the OST577-IgG1 and some of its mutants to rhesus FcRn were also tested in a similar competitive binding experiments. 表8にまとめられているように、野生型OST577-IgG1抗体のためのIC50は最高9μg/mlであり、一方、単一突然変異体(T250Q)についてのIC50は、最高3μg/mlであり、単一突然変異体についてのIC50(M428L)及び二重突然変異体(T250Q/M428L)についてIC50は1μg/1ml未満である。 As summarized in Table 8, IC50 for the wild-type OST577-IgG1 antibody is the highest 9 [mu] g / ml, whereas, IC50 for the single mutant (T250Q) is the highest 3 [mu] g / ml, IC50 is below 1 [mu] g / 1 ml for IC50 (M428L) and the double mutant for the single mutant (T250Q / M428L).

例7 Example 7.
この例は、FcRn結合におけるIgG2M3及びIgG1突然変異体の特性の確認について記述している。 This example describes confirmation of the properties of the IgG2M3 and IgG1 mutants in FcRn binding.
直接的結合検定 Direct binding assay:
pH6.0のFBB中でトランスフェクションを受けていないNS0細胞に対する、又は細胞系統NS0HuFcRn(memb)、クローン7-3上のヒトFcRnに対する結合について、精製済みOST577-IgG2M3抗体をテストした。 For pH 6.0 NS0 cells that have not been transfected in FBB, or cell lines NS0HuFcRn (memb), for binding to human FcRn on clone 7-3 were tested Purified OST577-IgG2M3 antibody. pH8.0のFBB中で、試験1回につき約2×10 5個の細胞を一回洗浄し、pH6.0のFBB中で一回洗浄し、次にpH6.0のFBB中で11μg/mlの濃度で100μlの抗体中に再懸濁させた。 pH8.0 in FBB, about 2 × 10 5 cells per one test were washed once, and washed once in FBB, pH6.0, then 11μg / ml in FBB, pH6.0 resuspended in 100μl of antibody concentration.

細胞を氷上で1時間、抗体と共にインキュベートし、pH6.0のFBB中で2回洗浄し、pH6.0のFBB中で5μg/mlまで希釈された25μlのヤギ抗ヒトIgG RPE接合抗体(Southern, Biotechnology Associates, Inc)中に再懸濁させた。 1 hour cells on ice, and incubated with antibodies, washed twice in FBB, pH6.0, goat 25μl diluted to 5 [mu] g / ml in FBB, pH6.0 anti-human IgG RPE-conjugated antibody (Southern, Biotechnology Associates, was re-suspended in Inc). 暗所で氷上で30分間インキュベートした後、細胞をpH6.0のFBB中で2回洗浄し、1%のホルムアルデヒド中で再懸濁させた。 After incubation on ice for 30 minutes in the dark, the cells were washed twice in FBB, pH 6.0, and resuspended in 1% formaldehyde. FAC Scanフローサイトメータ(BD(商標) Biosciences)を用いてFACS TMによりFcRnに対する抗体結合について標本を分析した。 FAC Scan using a flow cytometer (BD (TM) Biosciences) Samples were analyzed for antibody binding to FcRn by FACS TM. 各々の突然変異体の平均チャネル螢光(MCF)を、Excel(Microsofto(商標) Coaporation)を用いてプロットした。 Mean channel fluorescence for each mutant (MCF), it was plotted using Excel (Microsofto (TM) Coaporation).

競合的結合検定 Competitive binding assays:
37℃で細胞系統NS0 HuFcRn(memb)、クローン7-3上でヒトFcRnに対する結合について、ビオチニル化されたOST577-IgG2M3抗体に対し、各々の精製済みOST577-IgG2M3抗体の希釈系列を競合させた。 Cell line NS0 HuFcRn (memb) at 37 ° C., for binding to human FcRn on clone 7-3, with respect OST577-IgG2M3 antibody biotinylated was competed a dilution series of each purified OST577-IgG2M3 antibody for. 試験1回あたり約2×10 5個の細胞を、pH8.0のFBB中で一回、pH6.0のFBBの中で1回洗浄し、次に、pH6.0のFBB中の予め混合されたビオチニル化OST577-IgG2M3抗体(10μg/ml)及びOST577-IgG2M3競合抗体(208μg/mlから0.102μg/mlまでの2倍系列希釈)100μl中に再懸濁させた。 About 2 × 10 5 cells per test, once in FBB, pH 8.0, were washed once in FBB, pH6.0, then premixed in FBB, pH6.0 and (2 fold serial dilutions from 208μg / ml to 0.102μg / ml) biotinylated OST577-IgG2M3 antibody (10 [mu] g / ml) and OST577-IgG2M3 competitor antibody were resuspended in 100 [mu] l.

細胞を、37℃で1時間抗体混合物と共にインキュベートし、pH6.0のFSB中で2回洗浄し、pH6.0のFBB中で2.5μg/mlまで希釈させた25μlのストレプトアビジン-RPE接合体(Bio Source International)内に再懸濁させた。 Cells were incubated with the antibody mixture for 1 hour at 37 ° C., washed twice in FSB of pH 6.0, in FBB, pH 6.0 2.5 [mu] g / ml streptavidin -RPE conjugate 25μl which was diluted to ( Bio Source International) were resuspended in. 暗所で30分間インキュベートした後、細胞をpH6.0のFBB中で2回洗浄し、1%のホルムアルデヒド中で再懸濁液させた。 After incubation in the dark for 30 minutes, cells were washed twice in FBB, pH 6.0, and re-suspension in 1% formaldehyde. 標本を、FACScanフローサイトメータ(BD(商標) Biosciences)を用いてFACS TMによりFcRnに対する抗体結合について分析した。 Samples were analyzed for antibody binding to FcRn by FACS TM using a FACScan flow cytometer (BD (TM) Biosciences). 平均チャンネル螢光(MCF)を、競合濃度に対してプロットし、IC50値をGraphPad Prism(商標)(GraphPad TM Software)を用いて計算した。 Mean channel fluorescence of (MCF), plotted against competitor concentration, IC50 values were calculated using GraphPad Prism (TM) (GraphPad TM Software).

pH依存性結合及び放出検定 pH-dependent binding and release assays
精製済みOST577-IgG2M3及びOST577-IgG1突然変異体抗体をヒトFcRnに対する結合についてそれぞれの野生型抗体に対し比較し、次にNS0 HuFcRn(memb)、クローン7-3を用いた1点結合及び放出検定においてさまざまなpH値で放出させた。 Purified OST577-IgG2M3 and OST577-IgG1 mutant antibodies were compared to the respective wild-type antibodies for binding to human FcRn, then NS0 HuFcRn (memb), 1 point binding and release assays using Clone 7-3 in was released at various pH values. 試験1回あたり約2×10 5個の細胞を、pH8.0のFBB中で1回、pH6.0のFBB中で1回洗浄し、次にpH6.0のFBB中の精製済み抗体(10μg/ml)100μlの中に再懸濁させた。 About 2 × 10 5 cells per test, once in FBB, pH 8.0, and washed once in FBB, pH6.0, then pH6.0 purified antibody in FBB, (10 [mu] g / ml) were resuspended in 100 [mu] l. 細胞を1時間氷上でインキュベートさせ、pH6.0、6.5、7.0、7.5又は8.0のFBB中で2回洗浄し、適切なpHのFBB中で1.25μg/mlまで希釈させたヤギF(ab') 2抗ヒトIgG FITC接合型抗体(Southern Biotechnology Associates, Inc)25μlの中に再懸濁させた。 The cells were incubated for 1 hour on ice, washed twice in FBB, pH6.0,6.5,7.0,7.5 or 8.0, a suitable pH goat was diluted to 1.25 [mu] g / ml in FBB, F (ab ') 2 anti-human IgG FITC-junction antibodies (Southern Biotechnology Associates, Inc) were resuspended in 25 [mu] l. 暗所で氷上にて30分間インキュベートした後、細胞を適切なpHのFBB中で2回洗浄し、1%のホルムアルデヒド中に再懸濁させた。 After incubation for 30 minutes on ice in the dark, the cells were washed twice in FBB, appropriate pH, and resuspended in 1% formaldehyde. FACS Caliburフローサイトメーター(BD(商標) Bioscience)を用いてFACS TMによりFcRnに対する抗体結合について標本を分析した。 Samples were analyzed for antibody binding to FcRn by FACS TM using FACS Calibur flow cytometer (BD (TM) Bioscience). 各突然変異体の平均チャンネル螢光(MCF)を、Excel (Microsoft(商標) Corporation)を用いてプロットした。 Mean channel fluorescence (MCF) of each mutant was plotted using Excel (Microsoft (TM) Corporation).

精製済みOST577-IgG2M3及びOST577-IgG1突然変異体抗体をアカゲザルFcRnに対する結合についてそれぞれの野生型抗体に対し比較し、次に上述の通りNS0 RhFcRnクローンR-3を用いた1点結合及び放出検定においてさまざまなpH値で放出させた。 Purified OST577-IgG2M3 and OST577-IgG1 mutant antibodies were compared to the respective wild-type antibodies for binding to rhesus FcRn, then in the above as NS0 RhFcRn clone R-3 1-point binding and release assays using It was released at various pH values.

結果 Result:
ヒトFcRnに対する野生型OST577-IgG2M3又はOST577-IgG1抗体の結合特性は、その表面上でヒトFcRnを安定した形で発現するトランスフェクションを受けたNS0細胞系統を用いて確認された。 Binding properties of the wild-type OST577-IgG2M3 or OST577-IgG1 antibodies to human FcRn were confirmed using NS0 cell line that have undergone transfection expressing human FcRn on its surface in a stable manner. 突然変異体抗体の結合が、一部のその他のレセプタを介して又は未知のメカニズムにより発生するのではなくトランスフェクションを受けたNS0細胞系統上のヒトFcRnに特異的なものであったことを確認するため、ヒトFcRnを安定した形で発現するトランスフェクションを受けたNS0細胞系統に対比して、トランスフェクションを受けていないNS0細胞に対する結合について、抗体をテストした。 Binding of mutant antibodies, ensure that was specific to a portion of the other through a receptor or unknown mechanism NS0 cell line on human FcRn with the transfected rather than generated by to, in contrast to NS0 cell line that have undergone transfection expressing in a stable manner the human FcRn, for binding to NS0 cells that have not been transfected, were tested antibody. 上述の通り、細胞をpH6.0のFBB中の未飽和濃度の抗体と共にインキュベートさせ、FACS TMにより結合を分析した。 As described above, cells were incubated with non-saturating concentration of antibody in FBB, pH 6.0, binding was analyzed by FACS TM. 図13に示されているように、結果は、親NS0細胞系統に対する見かけ上の結合が全く存在せず、抗体がヒトFcRnを介して、トランスフェクションを受けていない細胞に対し特異的に結合することを示唆していた、ということを表わしていた。 As shown in Figure 13, the result does not bind at all exist apparent to the parent NS0 cell line, the antibody via a human FcRn, which specifically binds to cells that have not been transfected it had been suggested, had expressed that.

本発明において生成された突然変異体の各々が生理学的に適切な形で挙動したことを確認するため、ヒトFcRnに対する結合に対する温度及びpHの効果がさらに厳密に検討された。 Each of the mutants generated in the present invention is to confirm that behaved in a physiologically suitable form, the effect of temperature and pH are more closely examined for binding to human FcRn. 初期競合結合検定は4℃で実施されたため、生理学的により適切な37℃で実験を反復し、この温度において突然変異体がなお活性であることを示した。 Since the initial competitive binding assays were performed at 4 ° C., the experiments were repeated at the right 37 ° C. Physiological showed that at this temperature a mutant is still active. 上述のとおり、増大する濃度の標識されていない競合抗体を、pH6.0のFBB中で37℃で、亜飽和濃度の標識されたOST577-IgG2M3抗体の存在下でヒトFcRnを発現する細胞と共にインキュベートさせた。 Incubated as described above, the competitor antibody unlabeled increasing concentrations, at 37 ° C. in FBB pH 6.0, with cells expressing human FcRn in the presence of labeled OST577-IgG2M3 antibody in subsaturating concentrations It was. 図14に示されているように、結果は、抗体が37℃でヒトFcRnに対する結合のその相対的パターンを維持していることを示していた。 As shown in FIG. 14, the results, antibody showed that maintains its relative pattern of binding to human FcRn at 37 ° C..

FcRnに対するIgGの結合は、pH依存性のものであることがわかっている。 Binding of IgG to FcRn is known to be of pH-dependent. すなわちIgGは、pH6.0でFcRnに対し強く結合するかpH8.0では弱くしか結合しない。 That IgG is only weakly bound In or pH8.0 binds strongly to FcRn at pH 6.0. より長い血清半減期をもつ突然変異体抗体を工学処理するためには、pH8.0でのFcRnからのpH依存性放出を保持する一方でpH6.0でのFcRnに対する結合を増大させることが望ましい。 To engineered mutants antibodies with longer serum half-life, it is desirable to increase binding to FcRn at pH6.0 while retaining pH-dependent release from FcRn at pH8.0 . 結合がpH依存性であったことを確認するため、ヒトFcRnを安定した形で発現するトランスフェクションを受けたNS0細胞系統に対する結合について抗体をテストし、次に、pH6.0〜pH8.0までの範囲のpH値でこれを放出した。 To confirm that binding was pH-dependent, to test the antibodies for binding to NS0 cell line that have undergone transfection expressing in a stable manner the human FcRn, then, to pH6.0~pH8.0 and released it in the pH value range. 上述の通り、pH6.0のFBB中の未飽和濃度の抗体と共に細胞をインキュベートさせ、pH6.0、6.5、7.0、7.5又は8.0のFBB中で洗浄し、FACS TMにより結合を分析した。 As described above, cells were incubated with non-saturating concentration of antibody in FBB, pH 6.0, washed with FBB, pH6.0,6.5,7.0,7.5 or 8.0, was analyzed bound by FACS TM. 図15Aに示されているように、結果は、T250E、T250Q、M428F、M428L、T250E/M428F、T250Q/M428F又はT250Q/M428L突然変異を有する修飾されたのOST577-IgG2M3抗体が、全て、pH値がpH8.0まで増大するにつれて結合を減少させながら、pH6.0でヒトFcRnに対する強い結合を示す、ということを表わしていた。 As shown in Figure 15A, results, T250E, T250Q, M428F, M428L, T250E / M428F, T250Q / M428F, or T250Q / M428L OST577-IgG2M3 antibodies of modified with a mutation, all, pH value There with diminishing binding as increased to pH 8.0, showed strong binding to human FcRn at pH 6.0, it had a indicates that.

図15Bに示されているように、結果は、T250E、M428F又はT250E/M428F 突然変異を有する修飾されたのOST577-IgG1抗体が、全て、pH値がpH8.0まで増大するにつれて結合を減少させながら、pH6.0でヒトFcRnに対する強い結合を示す、ということを表わしていた。 As shown in Figure 15B, results, T250E, OST577-IgG1 antibodies of modified with a M428F or T250E / M428F mutations all, diminishing binding as the pH values ​​increased to pH8.0 while, represented the showed strong binding to human FcRn at pH 6.0. T250D突然変異を有するOST577-IgG1抗体は、pH8.0までpH値が増大するにつれて結合を減少させながら、pH6.0でヒトFcRnに対するより弱い結合(野生型に比べて)を示した。 OST577-IgG1 antibodies having T250D mutation, with diminishing binding as the pH value to pH8.0 increases, showed weaker binding (compared to wild-type) to human FcRn at pH 6.0. 図15Cに示されているように、結果は、T250Q、M428L又はT250Q/428L 突然変異を有する修飾されたのOST577-IgG1抗体が全て、pH値がpH8.0まで増大するにつれて結合を減少させながら、pH6.0でヒトFcRnに対する強い結合を示す、ということを表わしていた。 As shown in Figure 15C, results, T250Q, all M428L or T250Q / 428L OST577-IgG1 antibodies of modified with a mutation, with diminishing binding as the pH values ​​increased to pH8.0 , represented the showed strong binding to human FcRn at pH 6.0. これらの結果は、ヒトFcRnに対する抗体の結合が実際pH依存性のものであることを表わしていた。 These results indicated that the binding of the antibody to human FcRn is really that of pH-dependent.

類似の要領で、アカゲザルFcRnを安定した形で発現するトランスフェクションを受けたNS0細胞系統に対する結合について抗体をテストし、次にこれをpH6.0〜pH8.0の範囲内のpH値で放出させた。 In a similar manner, was released at pH values ​​in the range of test antibodies for binding to NS0 cell line that have undergone transfection expressing in a stable manner the rhesus FcRn, which is then pH6.0~pH8.0 It was. 図15Dに示されているように、結果はT250E、T250Q、M428F、M428L、T250E/M428F、T250Q/M428F又はT250Q/M428L突然変異を有する修飾されたのOST577-IgG2M3抗体が、全て、pH値がpH8.0まで増大するにつれて結合を減少させながら、pH6.0でアカゲザルFcRnに対する強い結合を示す、ということを表わしていた。 As shown in Figure 15D, the results T250E, T250Q, M428F, M428L, T250E / M428F, T250Q / M428F, or T250Q / M428L OST577-IgG2M3 antibodies of modified with a mutation, all the pH values with diminishing binding as increased to pH 8.0, showed strong binding to rhesus FcRn at pH 6.0, it had a indicates that. 図15Eに示されているように、結果は、T250Q、M428L又はT250Q/M428L、突然変異を有する修飾されたのOST577-IgG1抗体が、全て、pH値がpH8.0まで増大するにつれて結合を減少させながら、pH6.0でアカゲザルFcRnに対する強い結合を示す、ということを表わしていた。 As shown in Figure 15E, the results, reduced T250Q, M428L, or T250Q / M428L, OST577-IgG1 antibodies of modified with a mutation, all the binding as the pH values ​​increased to pH8.0 while, it represented the showed strong binding to rhesus FcRn at pH 6.0. これらの結果は、アカゲザルFcRnに対する抗体の結合が同様にpH依存性であることを表わしていた。 These results indicated that the binding of the antibodies to rhesus FcRn is similarly pH-dependent.

例8 Example 8.
この例は、IgG2M3及びIgG1突然変異体の付加的な特性の確認について記述している。 This example describes confirmation of additional properties of the IgG2M3 and IgG1 mutants.
細胞培養 Cell culture:
ヒトバーキットリンパ腫細胞系統Raji(米国標準培養収集機関)を、10%のFBS(HyClone(商標))及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Life Technologies(商標))を含有するL-グルタミンを伴うRPMI1640(Bio Whittaker TM )の中に維持した。 Human Burkitt's lymphoma cell line Raji (the US standard culture collection agencies), 10% FBS (HyClone (R)) and 1% penicillin - streptomycin (Life Technologies (TM)) RPMI1640 with L- glutamine containing (Bio It was maintained in the Whittaker TM).

抗原結合検定 Antigen binding assays:
OST577野生型及び突然変異体抗体の抗原結合活性を、競合結合ELISAにおいて確認した。 OST577 antigen binding activity of wild-type and mutant antibodies was confirmed in a competitive binding ELISA. Immulon TM 2平板(DYNEX(商標) Technologies)を、組換え型B型肝炎表面抗原(HBsAg)1.0μg/ml(Advanced Immuno Chemical, Inc., Long Beach, CA)で4℃で一晩コーティングした。 Immulon TM 2 Plates (DYNEX (TM) Technologies), recombinant hepatitis B surface antigen (HBsAg) 1.0μg / ml (Advanced Immuno Chemical, Inc., Long Beach, CA) were coated overnight at 4 ° C. at. 翌日、平板をEWBで洗浄し、室温で30分間、TBS中のSuperBlock(商標) Blocking Buffer(Pierce Chemical Company)300μl/ウェルで遮断した。 The next day, plates were washed with EWB, and 30 minutes at room temperature, and blocked with SuperBlock in TBS (TM) Blocking Buffer (Pierce Chemical Company) 300μl / well. 平板をEWBで洗浄し、各ウェルに対し100μlのEB中の予め混合されたビオチニル化577-IgG2M3抗体(0.25μg/ml)及び競合物質OST577-IgG2M3抗体(33μg/mlから0.033μg/mlまでの2倍系列希釈)、又は予め混合されたビオチニル化OST577-IgG1抗体(0.25μg/ml)及び競合物質OST577-IgG1抗体(67μg/mlから0.067μg/mlまでの系列希釈)を各ウェルに添加した。 The plates were washed with EWB, from premixed biotinylated 577-IgG2M3 antibody (0.25 [mu] g / ml) and competitor OST577-IgG2M3 antibody (33 .mu.g / ml in EB of 100μl to each well to 0.033 / ml 2-fold serial dilution), or premixed biotinylated OST577-IgG1 antibody (0.25 [mu] g / ml) and competitor OST577-IgG1 antibody (serial dilutions from 67μg / ml to 0.067μg / ml) was added to each well .

平板を室温で1時間インキュベートし、次にEWBで洗浄し、100μl/ウェルのストレプトアビジン-HRP接合体(Pierce Chemical Company)をEB中に1μg/mlで添加した。 Plates were incubated for 1 hour at room temperature, then washed with EWB, it was added at 1 [mu] g / ml streptavidin -HRP conjugate 100 [mu] l / well (Pierce Chemical Company) in EB. 室温で30分間インキュベートした後、平板をEWBで洗浄し、その後100μl/ウェルのABTSペルオキシダーゼ基質/ペルオキシダーゼ溶液B(Kirkegaard & Perry Laboratories)を添加した。 After incubation at room temperature for 30 minutes, plates were washed with EWB, and then added 100 [mu] l / well of ABTS Peroxidase Substrate / Peroxidase Solution B (Kirkegaard & Perry Laboratories). 反応を100μl/ウェルのシュウ酸で停止し、415nmでの吸収度を、VER SAmax TMマイクロタイタープレート読取り装置(Molecular Devices Corporation(商標))を用いて測定した。 The reaction was quenched with oxalic acid 100 [mu] l / well, the absorbance at 415 nm, was measured with VER SAmax TM microtiter plate reader to (Molecular Devices Corporation (TM)).

HulD10-IgG2M3野生型及び突然変異体抗体の抗原結合活性を、HulD10により認識されるHLA-DRβ鎖の対立遺伝子を発現する、Raji細胞を用いてFACS TM結合検定の中で確認した(Kostelny et al.,(2001)前掲書中)。 Hu1D10-IgG2M3 antigen binding activity of wild-type and mutant antibodies express an allele of HLA-DR beta chain that is recognized by Hu1D10, was confirmed in a FACS TM binding assay using Raji cells (Kostelny et al ., (2001) op. cit.). 試験1回あたり2.5×10 5個の細胞をpH7.4のFBB中で1回洗浄し、pH7.4のFBB中のHulD10-IgG2M3抗体(60μg/mlから0.027μg/mlまでの3倍系列希釈)140μl中で再懸濁させた。 Test once per 2.5 × 10 5 cells were washed once in FBB, pH7.4, 3-fold serial dilutions from Hu1D10-IgG2M3 antibody (60 [mu] g / ml in FBB, pH7.4 to 0.027μg / ml ) were re-suspended in 140μl. 細胞を氷上で1時間抗体と共にインキュベートし、pH7.4のFBB中で2回洗浄し、pH7.4のFBB中で10μg/mlまで希釈された25μlのヤギF(ab′) 2抗ヒトカッパRPE接合型抗体(Southern Biotechnology Associates, Inc.)中で再懸濁させた。 Cells were incubated with antibody for 1 hour on ice, washed twice in FBB, pH 7.4, goat F of 25μl diluted to 10 [mu] g / ml in FBB, pH 7.4 (ab ') 2 anti-human kappa RPE junction type antibody (Southern Biotechnology Associates, Inc.) and resuspended in. 暗所で氷上にて30分間インキュベートした後、細胞をpH7.4のFBB中で2回洗浄し、1%のホルムアルデヒド中で再懸濁させた。 After incubation for 30 minutes on ice in the dark, the cells were washed twice in FBB, pH 7.4, and resuspended in 1% formaldehyde. FACS Caliburフローサイトメータ(BD(商標) Biosciences)を用いてFACS TMによりHLA-DR β鎖対立遺伝子に対する抗体結合について標本を分析した。 Samples were analyzed for antibody binding to the HLA-DR beta chain allele by FACS TM using FACS Calibur flow cytometer (BD (TM) Biosciences).

類似の要領で、HulD10-IgG1野生型及び突然変異体抗体の抗原結合活性を、Raji 細胞を用いて、FACS TM結合検定中で確認した。 In a similar manner, the antigen-binding activity of Hu1D10-IgG1 wild-type and mutant antibodies using Raji cells, was confirmed in FACS TM binding assay. 試験1回あたり約2.0×10 5個の細胞をpH7.4のFBB中で1回洗浄し、pH7.4のFBB中のHulD10-IgG1-抗体(25μg/mlから12.5μg/mlまでの2倍系列希釈、12.5μg/mlから0.0020μg/mlまでの3倍系列希釈)100μl中で再懸濁させた。 About 2.0 × 10 5 cells of per test were washed once in FBB, pH7.4, 2-fold from the Hu1D10-IgG1-antibodies (25 [mu] g / ml in FBB, pH7.4 to 12.5 [mu] g / ml Serial dilutions were resuspended in 3 fold serial dilutions) in 100μl from 12.5 [mu] g / ml to 0.0020μg / ml. HuFd79-IgG1抗体の希釈系列(Co et al., Proc. Natl. Acad. Sci.88:2869-2873(1991))を上述の通りに調製し、陰性の対照として使用した。 HuFd79-IgG1 antibody dilution series of (Co et al, Proc Natl Acad Sci.88:.... 2869-2873 (1991)) were prepared as described above was used as a negative control. 細胞を氷上で1時間抗体と共にインキュベートし、pH7.4のFBB中で2回洗浄し、pH7.4のFBB中で20μg/mlまで希釈された25μlのヤギF(ab') 2抗ヒトIgG FITC接合型抗体(Southern, Biotechnology Associates, Inc)中で再懸濁させた。 Cells were incubated with antibody for 1 hour on ice, washed twice in FBB, pH 7.4, goat F of 25μl diluted to 20 [mu] g / ml in FBB, pH 7.4 (ab ') 2 anti-human IgG FITC junction antibody (Southern, Biotechnology Associates, Inc) were resuspended in. 暗所で氷上にて30分間インキュベートした後、細胞をpH7.4のFBB中で2回洗浄し、1%のホルムアルデヒド中で再懸濁させた。 After incubation for 30 minutes on ice in the dark, the cells were washed twice in FBB, pH 7.4, and resuspended in 1% formaldehyde. FAC S.Caliburフローサイトメータ(BD(商標) Biosciences)を用いてFACS TMによりHLA-DRβ鎖対立遺伝子に対する抗体結合について標本を分析した。 Samples were analyzed for antibody binding to the HLA-DR beta chain allele by FACS TM using FAC S.Calibur flow cytometer (BD (TM) Biosciences).

ADCC検定 ADCC test
公表された方法(Shields et al. 前掲書中)に従ってエフェクタとしてヒト末梢血単核細胞(PBMC)そして標的としてRaji細胞を用いて乳酸脱水素酵素(LDH)放出を測定することにより、HulD10野生型及び突然変異体抗体の抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC)活性を確認した。 By measuring the lactate dehydrogenase (LDH) release using Raji cells as human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and target as effectors according to published methods (Shields et al. Op. Cit.), Hu1D10 wild-type and it confirmed the antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC) activity of mutant antibodies. Ficoll-Paque(商標) Plus勾配(Amersham Biosciences TM Corporation)を用いて新鮮全血からPBMCを調製し、検定培地中8×10 6個/mlの細胞密度で再懸濁させた(RPMI1640、1%BSA)。 Ficoll-Paque with (R) Plus gradient (Amersham Biosciences TM Corporation) PBMC were prepared from fresh whole blood were resuspended at a cell density of 8 × 10 6 cells / ml in assay medium (RPMI1640,1% BSA). Raji 細胞を検定培地中で3回洗浄し、検定培地中0.4×10 6個/mlの細胞密度で再懸濁させた。 It washed 3 times Raji cells in assay medium, resuspended at a cell density of 0.4 × 10 6 cells / ml in assay medium. HulD10野生型及び突然変異体抗体を、検定培地中で4μg/ml、0.25μg/ml、及び0.016μg/mlまで希釈した。 HulD10 wild-type and mutant antibodies, 4 [mu] g / ml in assay medium, were diluted to 0.25 [mu] g / ml, and 0.016μg / ml.

Raji 細胞(50μl/ウェル)及びHulD10抗体(50μl/ウェルすなわち試験1回あたり200ng、12.5ng又は0.8ng)をFalcon96ウェルU底検定平板(BD(商標) Biosciences)のウェル内で組合わせ、室温で30分間インキュベートさせた。 Raji cells (50 [mu] l / well) and HulD10 antibody (50 [mu] l / well ie test per 200 ng, 12.5 ng or 0.8 ng) were combined in the wells of a Falcon96 well U-bottom assay plate-(BD (TM) Biosciences), at room temperature and allowed to incubate for 30 minutes. オプソニンを作用させた細胞に対しPBMC(100μl/ウェルすなわち40:1のエフェクタ/標的比)を添加し、CO 2インキュベータ内で37℃で4時間インキュベートさせた。 PBMC against cells that have opsonize (100 [mu] l / well namely 40: 1 effector / target ratio) were added and allowed to incubate for 4 hours at 37 ° C. in a CO 2 incubator. 抗体の不在下でエフェクタ及び標的細胞をインキュベートすることにより、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(AICC)を測定した。 By incubating effector and target cells in the absence of antibody was measured antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (AICC). 抗体の不在下で標的細胞(SRtarget)又はエフェクタ細胞(SR effector)をインキュベートすることによって自発的放出を測定した。 It was measured spontaneous release by incubating target cells (SRtarget) or effector cells (SR Effector) in the absence of antibody. 標的細胞に対して2%のトリトンX-100を添加することによって、最大放出(MR)を測定した。 By adding 2% Triton X-100 to target cells was measured Maximum release (MR).

平板を穏やかに遠心分離に付し、上清(100μl/ウェル)をFalcon96-ウェル-平底平板に移した。 Flat gently centrifuged, and the supernatants (100 [mu] l / well) Falcon96- well - were transferred to flat bottom plates. 室温で30分間細胞障害検出キット(Roche Diagnostics Corporation)からの100μl/ウェルのLDH反応混合物と共に上清をインキュベートすることにより、LDH活性を測定した。 By incubating the supernatants with LDH reaction mixture 100 [mu] l / well from the room temperature for 30 minutes cytotoxicity detection kit (Roche Diagnostics Corporation), LDH activity was measured. 50μl/ウェルの1NのHClで反応を停止させ、490nmでの吸収度をVERSAmax TMマイクロタイタープレート読取り装置(Molecular Devices Corporation(商標))を用いて測定した。 The reaction with 1N HCl in 50 [mu] l / well was stopped, was measured using the absorbance at 490 nm VERSAmax TM microtiter plate reader with (Molecular Devices Corporation (TM)). 細胞障害パーセントは(LDH放出sample -SR effector -SR target )/MR target -SR target )×100として計算した。 Cytotoxicity percentage was calculated as (LDH release sample -SR effector -SR target) / MR target -SR target) × 100.

結果 Result:
野生型及び突然変異体OST577及びHulD10抗体のそれぞれの抗原に対する抗原結合特性は、適切な結合検定を用いて確認された。 Antigen binding properties for their respective antigens of wild-type and mutant OST577 and HulD10 antibodies were confirmed using appropriate binding assays. 上述の通り、HBsAgに対するOST577抗体の結合は、競合ELISAにおいて決定された。 As described above, the binding of OST577 antibodies to HBsAg was determined in a competition ELISA. 図16Aに示されているように、HBsAgに対する野生型及び突然変異体 OST577-IgG2M3抗体の結合は、基本的に同一であった。 As shown in Figure 16A, the binding of the wild-type and mutant OST577-IgG2M3 antibodies to HBsAg was essentially identical. 同様に図16Bに示されているように、HBsAgに対する野生型及び突然変異体 OST577-IgG1抗体の結合は、基本的に同一であった。 As also shown in FIG. 16B, the binding of the wild-type and mutant OST577-IgG1 antibodies to HBsAg was essentially identical.

上述の通り、HLA-DRβ鎖の対立遺伝子に対するHulD10抗体の結合は、FACS結合検定において決定された。 As described above, the binding of HulD10 antibodies to an allele of the HLA-DR beta chain was determined in a FACS binding assay. 図17Aに示されているように、HLA-DRβ鎖対立遺伝子に対する野生型及び突然変異体 HulD10-IgG2M3抗体の結合は、基本的に同一であった。 As shown in Figure 17A, the binding of the wild-type and mutant Hu1D10-IgG2M3 antibodies to HLA-DR beta chain allele was essentially identical. 同様に、図17Bに示されているように、HLA-DRβに対する野生型及び突然変異体 HulD10-IgG1抗体の結合は、基本的に同一であった。 Similarly, as shown in FIG. 17B, the binding of the wild-type and mutant Hu1D10-IgG1 antibodies to HLA-DR beta was essentially identical. これらの結果は、予測通り位置250及び428での記述された突然変異が抗体結合に影響を及ぼすことはない、ということを表わしている。 These results indicate that the described mutations at predictably position 250 and 428 not affect antibody binding, represents that.

HulD10野生型及び突然変異体抗体のADCC活性は、エフェクタとしてヒトPBMCを、又標的としてRaji 細胞を用いたLDH放出検定において確認された。 Hu1D10 ADCC activity of the wild-type and mutant antibodies, human PBMC as effectors, also was confirmed in LDH release assay using Raji cells as targets. 図18Aに示されている通り、同型接合158V/VF RIII対立遺伝子を担持する供与体を用いると、二重突然変異体(T250Q/M428L)HulD10-IgG1抗体のADCC活性は、野生型抗体のものときわめて類似していたが、一方、単一突然変異体(M428L)HulD10-IgG1抗体のADCC活性は野生型抗体と比べてわずかに減少していた。 As shown in Figure 18A, the use of donor carrying homozygous 158V / VF C gamma RIII alleles, the double mutant (T250Q / M428L) HulD10-IgG1 antibody in ADCC activity of the wild-type antibody things that are very similar, whereas the single mutant (M428L) HulD10-IgG1 antibody in ADCC activity was reduced slightly compared to the wild-type antibody. 予想した通り、野生型及び突然変異体 HulD10-IgG2M3抗体には、ADCC活性が欠如していた。 As expected, the wild-type and mutant Hu1D10-IgG2M3 antibodies lacked ADCC activity.

類似の要領で、図18Bに示されているように、同型接合158F/F FcγRIII対立遺伝子を担持する供与体を使用すると、二重突然変異体(T250Q/M428L)HulD10-IgG1抗体のADCC活性は野生型抗体にきわめて類似していたが、一方、単一突然変異体(M428L)HulD10-IgG1抗体のADCC活性は野生型抗体に比べて幾分か減少していた。 In a similar manner, as shown in FIG. 18B, by using the donor carrying homozygous 158F / F Fc [gamma] RIII alleles, the double mutant (T250Q / M428L) HulD10-IgG1 antibody in ADCC activity It was very similar to the wild-type antibody, while the single mutant (M428L) HulD10-IgG1 antibody in ADCC activity was reduced somewhat compared to the wild-type antibody. 野生型及び突然変異体 HulD10-IgG2M3抗体には、ADCC活性が欠如していた。 The wild-type and mutant Hu1D10-IgG2M3 antibodies lacked ADCC activity. これらの結果は、本発明で記述されているT250Q/M428L 突然変異は、抗体のIgG1形態のADCC活性に影響を及ぼさないが、一方M428L MUTは、IgG1形態のADCC活性をわずかに低減させるということを表わしている。 These results, T250Q / M428L mutations are described in the present invention does not affect the IgG1 form of ADCC activity of an antibody, whereas M428L MUT is that is slightly reduced ADCC activity of IgG1 form a represents. 位置250及び428における記述された突然変異体は、抗体のIgG2M3形態のADCC活性に影響を及ぼさない。 Mutants described at positions 250 and 428 do not affect the ADCC activity of the IgG2M3 form of the antibody.

例9 Example 9.
この例は、in vitro及びin vivoの血清半減期検定について記述している。 This example describes the serum half-life test of the in vitro and in vivo.
In vivoでのFcRnに対するより高い(又はより低い)親和力をもつヒトIgG抗体が、それぞれin vivoでより長い(又はより短かい)血清半減期を有するものと予想されている。 Human IgG antibodies with higher (or lower) affinity than to FcRn at In vivo, are expected to have longer (or more shorter) serum half-life, respectively in vivo. FcRnに対するヒトIgG 突然変異体の親和力は、適切なバイオセンサーチップに接合された可溶性FcRnを用いた表面プラズモン共鳴(SPR)といったようなさまざまな方法によってか、又はトランスフェクションを受けた細胞の表面上で発現されたFcRnを用いた競合結合実験を実施することによって、in vivoで測定可能である。 Affinity of human IgG mutants to FcRn, either by a variety of methods such as surface plasmon resonance (SPR) using soluble FcRn joined to a suitable biosensor chip, or on the surface of cells transfected by competition binding experiments are performed with using the expressed FcRn in, it can be measured by in vivo. in vitro親和力実験において使用されるFcRnは、マウス、アカゲザル又はヒト由来であり得る。 FcRn used in the in vitro affinity experiments mice may be derived from rhesus or human. 所望の特性をもつヒトIgG 突然変異体の血清半減期は、体重1kgあたり0.1〜10mgの抗体といった範囲の抗体用量を適切な実験動物(例えばマウス又はサル)又はヒトに注射し、次に抗体の予想血清半減期にまたがるさまざまな時間的間隔で血清標本を抜き取り、ELISAといったような適切な技術によって無傷のIgGの存在について標本を検定することで、in vivoで測定可能である。 Serum half-life of human IgG mutants with the desired properties can be obtained by injecting the antibody dose range such antibodies of 0.1~10mg per body weight 1kg to the appropriate laboratory animals (e.g., mice or monkeys) or humans, then the antibody withdrawing serum samples at various time intervals spanning the expected serum half-life, by a suitable technique such as ELISA by assaying the sample for the presence of intact IgG, it can be measured by in vivo.

アカゲザル薬物動態研究 Rhesus monkey pharmacokinetic studies:
カリフォルニア大学デービス校のカリフォルニア国立霊長類研究センター(CNPRC)において、「OST577の3つの変異体の薬学動態比較」という題の非GLP薬物動態研究が実施された。 In the University of California, Davis of the California National Primate Research Center (CNPRC), a non-GLP pharmacokinetics study entitled "Pharmacokinetic Comparison of the three variants of OST577" was conducted. 12匹の雄のマカクアカゲザルを体重で任意抽出し、3つの研究グループのうちの1つに割当てた。 Twelve male macaques rhesus arbitrarily extracted with weight were assigned to one of three study groups. 各研究グループを構成する4匹の動物は各々、15分間にわたり1mg/kgの割合でOST577の野生型又は2つの変異体のうちの1つの単一回静脈内用量投与を受けた。 4 animals constituting each study group each received intravenous dose one single one of the wild-type or two variants of OST577 at a rate of 1 mg / kg for 15 minutes. OST抗体は、野生型OST577-IgG2M3、単一突然変異 M428Lを含むOST577-IgG2M3の1変異体及び、二重突然変異 T250Q/M428Lを含むOST577-IgG2M3の1変異体であった。 OST antibody, wild-type OST577-IgG2M3, 1 variant of OST577-IgG2M3 containing the single mutation M428L, and was 1 variant of OST577-IgG2M3 containing the double mutation T250Q / M428L. 3つの抗体全てを、Sp2/0 細胞のトランスフェクションにより発現させ、例5に記述されている通りに精製した。 All three antibodies were expressed by transfection of Sp2 / 0 cells and purified as described in Example 5.

血液標本を0日目の投薬の前、投薬後1時間及び4時間目及び1日目、7日目、14日目、21日目、28日目、42日目及び56日目に採取した。 Before the blood sample dosing day 0, 1 hour and 4 hours and 1 day after dosing, 7 days, 14 days, 21 days, 28 days, were harvested on day 42 and day 56 . 各時点で、伏在静脈から4mlの血液を採取し、血清を調製し、2つのアリコートを凍結させ、使用まで-20℃で維持した。 At each time point, the 4ml of blood from the saphenous vein is collected, the serum was prepared, frozen two aliquots and kept at -20 ° C. until use. 血清化学及び血液学決定のため、血液標本を研究より16日前、0日目の投薬前及び56日目の研究終了時点で採取した。 For serum chemistry and hematology determined, before 16 days from the study blood samples were taken at study end of pre-dose and 56 day 0 day.

ELISA ELISA:
アカゲザル血清標本中のOST577-IgG2M3の濃度を、条件付き検定を用いてELISAにより決定した。 The concentration of the OST577-IgG2M3 of rhesus serum specimens were determined by ELISA using a conditional test. プールされた正常なアカゲザル血清(PNRS)をCNPRCから得た。 The pooled normal rhesus serum (PNRS) was obtained from CNPRC. 較正物質、陽性血清対照を調製するため及びアカゲザル血清標本の予備希釈のために同じPNRSロットを使用した。 Calibrators, using the same PNRS lot for predilution of and rhesus serum samples for preparing the positive serum controls. 3000、1500、750、375、187.5、93.75、46.88、23.44及び0ng/mlでPNRS中でOST577-IgG2M3の標準希釈により較正物質を調製し、2時間室温で平衡化し、-20℃でアリコートの形で凍結させた。 3000,1500,750,375,187.5,93.75,46.88,23.44 and 0 ng / ml in in PNRS prepared calibrators by standard dilution of OST577-IgG2M3, equilibrated for 2 hours at room temperature, an aliquot form at -20 ° C. in frozen. 低い陽性血清対照については0.2μg/mlで、中位の陽性血清対照については0.4μg/ml、高い陽性血清対照については0.8μg/mlでOST577-IgG2M3でPNRSをスパイクすることによって、陽性血清対照を調製し、室温で2時間平衡化し、-20℃でアリコートの形で凍結させた。 In 0.2 [mu] g / ml for low positive serum control, 0.4 [mu] g / ml for the positive serum controls medium, by spiking PNRS with OST577-IgG2M3 at 0.8 [mu] g / ml for high positive serum control, positive serum control It was prepared and equilibrated for 2 hours at room temperature, and frozen in aliquots of the form at -20 ° C.. 各々の動物からの投薬前血清標本を、陰性血清対照として使用した。 The predose serum specimens from each animal were used as negative serum controls.

Immulon TM 2平板(DYNEX(商標) Technologies, Inc.)を一晩2〜8℃で、PBS中1.0μg/mlの100μl/ウェルのマウス抗-OST577-IgG1イディオタイプモノクローナル抗体(OST577-γ 1抗-id, Protein Design Labs TM , Inc)でコーティングした。 Immulon TM 2 flat (DYNEX (TM) Technologies, Inc.) overnight at 2 to 8 ° C. The, PBS in 1.0 [mu] g / ml of 100 [mu] l / well of mouse anti -OST577-IgG1 idiotype monoclonal antibody (OST577-gamma 1 anti -id, it was coated with Protein Design Labs TM, Inc). 翌日、平板を300μl/ウェルのPBS/Tween(リン酸緩衝生理食塩水、0.1% Tween20)で3回洗浄し、ペーパータオル上で叩いて乾燥させ、室温で60±5分間、PBS中の300μl/ウェルのSuper Block(商標) Blocking Bufferで遮断した。 The next day, a plate of 300 [mu] l / well PBS / Tween (phosphate-buffered saline, 0.1% Tween20) was washed 3 times with, tapped dry on a paper towel, 60 ± 5 minutes at room temperature, 300 [mu] l / well in PBS was cut off in the Super Block (trademark) blocking Buffer. 較正物質、陽性及び陰性血清対照及び血清標本を解凍し、使用前に室温にした。 Calibrators, were thawed positive and negative serum controls, and serum samples were brought to room temperature before use. 較正物質、及び正及び陰性血清対照を、PBS中のSuper Block(商標) Blocking Buffer中で1:10の割合で希釈した。 Calibrators, and positive and negative serum controls were diluted 1:10 in Super Block (TM) Blocking Buffer in in PBS.

血清標本をPNRS中で適切に予備希釈させ(1:10〜1:80)、次にPBS中のSuper Block Buffer内で1:10で希釈した。 Serum specimens properly is pre-diluted in PNRS a (1: 10-1: 80), then diluted 1:10 in Super Block Buffer in PBS. 平板を300μl/ウェルのPBS/Tweenで3回洗浄し、ペーパータオル上で叩いて乾燥させた。 The plates were washed 3 times with 300 [mu] l / well of PBS / Tween, and tapped dry on a paper towel. 希釈した較正物質、正及び陰性血清対照及び血清標本を次に、デュプリケートウェル内に100μl/ウェルで添加し、室温で60±5分間インキュベートした。 Diluted calibrators, then the positive and negative serum controls, and serum samples were added at 100 [mu] l / well in duplicate wells and incubated for 60 ± 5 minutes at room temperature. 平板を3回300μl/ウェルのPBS/Tweenで洗浄し、ペーパータオル上で叩いて乾燥させた。 The plates were washed three times 300 [mu] l / well PBS / Tween and tapped dry on a paper towel. PBS/BSA/Tween(リン酸緩衝生理食塩水、0.5%のウシ血清アルブミン、0.1%のTween20)中の1:1000希釈によりヤギ抗ヒトラムダ軽鎖HRP接合抗体(Southern Biotechnology Associates, Inc.)を調製し、100μl/ウェルで添加し、室温で60±5分間インキュベートさせた。 PBS / BSA / Tween (phosphate buffered saline, 0.5% bovine serum albumin, 0.1% Tween20) 1 in: 1000 Goat by diluting anti-human lambda light chain HRP-conjugated antibody (Southern Biotechnology Associates, Inc.) to prepare was added at 100 [mu] l / well and allowed to incubate for 60 ± 5 minutes at room temperature.

平板を、PBS/Tween300μl/ウェルで3回洗浄し、ペーパータオル上で叩いて乾燥させた。 The plates were washed 3 times with PBS / Tween300μl / well and tapped dry on a paper towel. 100μl/ウェルの割合でABTSペルオキシダーゼ基板/ペルオキシダーゼ溶液B(Kirkegaard & Perry Laboratories)を添加し、7±1分間インキュベートした。 It was added ABTS Peroxidase Substrate / Peroxidase Solution B (Kirkegaard & Perry Laboratories) at a rate of 100 [mu] l / well and incubated 7 ± 1 minutes. 100μl/ウェルの割合でSubstrate Stop Solution(2%のシュウ酸)を添加することにより進行を止めた。 It was stopped proceeds by the addition of Substrate Stop Solution (2% oxalic acid) at a rate of 100 [mu] l / well. 415nmでの吸収度の値を、VERSA max TMマイクロタイタープレート読取り装置(Molecular Devices Corporation(商標))を用いて、Substrate Stop Solutionを添加してから30分以内に測定した。 The value of absorbance at 415 nm, VERSA max TM microtiter plate reader using (Molecular Devices Corporation (TM)), was measured within 30 minutes after the addition of Substrate Stop Solution.

較正曲線は、較正物質から得た平均吸収度値を用い、SOFTmax(商標)PRO、バージョン4.0(Molecular Devices Corporation(商標))で41パラメータロジスティック回帰曲線にデータを当てはめることによって作成された。 Calibration curve, using the average absorbance values ​​obtained from the calibration substance, created by fitting the data to the 41-parameter logistic regression curve SOFTmax (TM) PRO, version 4.0 (Molecular Devices Corporation (TM)). 陰性血清対照についての平均吸収度値(すなわち各々の動物についての投薬前標本平均)を、較正物質について得られた各々の吸収度値から差し引いた。 Mean absorbance values ​​for the negative serum control (i.e., predose sample mean for each animal) was subtracted from each absorbance value obtained for the calibrators. 陽性血清対照について得た各々の吸収度値から陰性血清対照について得た平均吸収度値を差し引いた後、陽性血清対照濃度を決定した。 After subtracting the mean absorbance value obtained for the negative serum control from each absorbance value obtained for the positive serum controls were determined positive serum control concentrations. 結果として得た平均吸収度値に対応する濃度を、較正曲線からの内挿により導出した。 The concentration corresponding to the mean absorbance value obtained as a result was derived by interpolation from the calibration curve. 血清標本の濃度は、各標本の吸収度値から陰性血清対照の平均吸収度値を差し引き、結果として得られた吸収度値を平均し、較正曲線からの内挿により平均吸収度に対応する濃度を導出し、該当する場合予備希釈係数を結果として得られた濃度に乗じて各標本についての最終的濃度に到達することによって決定された。 The concentration of serum specimens subtracts the mean absorbance value of the negative serum control from the absorbance value of each sample, averaging the absorbance values ​​obtained as a result, corresponding to the mean absorbance by interpolation from the calibration curve the concentration derives, is determined by multiplying the concentration obtained as a result of a preliminary dilution factor where applicable arrive at a final concentration for each sample.

検定の推定された定量範囲は、0.10〜0.90μg/mlであった。 Estimated quantitative range of the assay was 0.10~0.90μg / ml. 検定は、(1)定量的範囲内の3つの較正物質全ての平均逆算濃度は、その公称値の20%の範囲であったこと及び(2)6つの陽性血清対照のうちの4つの平均計算結果がその公称値の30%以内にあり、各濃度レベルからの少なくとも1つの平均結果がその公称値の30%以内にあったことという2つの条件が満たされた時点で適切とみなされた。 Assays, (1) the three calibrator all mean back-calculated concentration in the quantitative range, four average calculation of its possible was 20% of the nominal value and (2) six positive serum control result is in within 30% of its nominal value, were considered appropriate at the time the at least one average result its two conditions that were within 30% of the nominal value is met from each concentration level. 以上の基準を満たさなかった平板からのデータは拒絶された。 It was rejected data from not a flat plate that meet the above criteria. 個々の血清標本からのデータは、(1)デュプリケートウェル内の吸収度値が互いに40%を上回る差異を呈していたこと、(2)平均計算濃度が検定の定量化下限(LLQQ)(0.10μg/ml)より低いものであったこと;(3)平均計算濃度が検定の定量化上限(ULOQ)(0.90μg/ml)より高いものであったこと、という3つの条件のうちのいずれかが満たされた場合に拒絶された。 Data from individual serum samples, (1) the absorbance values ​​in duplicate in the wells were exhibited differences of more than 40% to each other, (2) quantification limit of the average calculation concentration assay (LLOQ) (0.10 .mu.g / ml) that were those lower; (3) the average calculation concentration was higher than the quantification limit of the assay (ULOQ) (0.90μg / ml), one of the three conditions that the It was rejected when it is filled.

結果 Result:
血清抗体濃度データはWinNonlin(商標) Enterprise Edition, バージョン3.2(Pharsight(商標) Corporation, Mountain View, CA)を用いて、2区画モデルと適合させられた。 Serum antibody concentration data WinNonlin (TM) Enterprise Edition, version 3.2 (Pharsight (TM) Corporation, Mountain View, CA) was used to be adapted and two-compartment model. このモデルは、第1次分配及び第1次除去速度を仮定し、データをうまく適合させる。 This model, the first-order distribution and first order elimination rate assumed, to successfully fit the data. モデリングされたデータ(一次薬物動態パラメータの各グループの幾何平均に基づいてシミュレートされたもの)ならびに観察された平均血清抗体濃度(μg/ml)及び4匹の動物の各グループについての標準偏差を、GraphPad Prism(商標), バージョン3.02(GraphPad TM Software, Inc.)を用いて時間(輸液後の日数)の関数としてプロットした。 The standard deviation for the modeled data (those simulated based on the geometric mean of each group of primary pharmacokinetic parameters) as well as the observed mean serum antibody concentration ([mu] g / ml) and each group of four animals , GraphPad Prism (TM), were plotted as a function of version 3.02 (GraphPad TM Software, Inc.) time using (days after infusion). 図19に示されているように、データは、OST577-IgG2M3のM428L及びT250Q/M428L変異体の平均血清抗体濃度が全ての時点で野生型OST577-IgG2M3より高いレベルで維持されたことを表わしている。 As shown in Figure 19, the data indicates that the mean serum antibody concentrations of M428L and T250Q / M428L variants of OST577-IgG2M3 were maintained at higher levels than wild-type OST577-IgG2M3 at all time points there.

WinNonlin(商標) Enterprise Edition, バージョン3.2(Pharsight(商標) Corporation)を用いたデータから、さまざまな薬物動態パラメータが計算された。 WinNonlin (TM) Enterprise Edition, the data using version 3.2 (Pharsight (TM) Corporation), various pharmacokinetic parameters were calculated. (GraphPad Prism(商標) バージョン3.02(GraphPad TM Software, Inc.)を用いて、薬物動態パラメータの統計的分析を計算した。表9に示されているように、平均最大血清抗体濃度(Cmax)は、3つのテストグループの間で非常に類似しており、投与された抗体が類似の要領で循環に分配されたことを表わしていた。かくして、分配段階の後の突然変異体 IgG2M3抗体のより高い抗体濃度は、血清中のその存続度の増大に原因がある。平均クリアランス(CL)の分析は、これがあてはまっていることを示した。 (GraphPad Prism (TM) version 3.02 (GraphPad TM Software, Inc.) was used to calculate a statistical analysis of the pharmacokinetic parameters. As shown in Table 9, the mean maximum serum antibody concentration (Cmax) is is very similar to among the three test groups were indicating that the antibody administered were distributed to the circulation in a similar manner. Thus, the higher the mutant IgG2M3 antibodies following the distribution phase antibody concentration may cause the increase in the survival of the serum. analysis of the mean clearance (CL) indicated that this is held true.

単位時間あたりにクリアランスされた血清抗体の量である平均CLは、野生型OST577-IgG2M3(0.144±0.047ml/時/kg)に比べて、M428L変異体については約1.8倍低く(0.0811±0.0384ml/hr/kg;p=0.057)、T250Q/M428L変異体については約2.8倍低い(0.0514±0.0075ml/時/kg;p=0.029)ものであり、野生型に比べ、アカゲザルの循環からのOST577-IgG2M3 M428L及びT250Q/M428L変異体のクリアランスが著しく低下していることを表わしていた(表9)。 Mean CL is the amount of clearance serum antibody per unit time, as compared to wild-type OST577-IgG2M3 (0.144 ± 0.047ml / hr / kg), the M428L variant was about 1.8 times lower (0.0811 ± 0.0384ml for /hr/kg;p=0.057),T250Q/M428L variants are those about 2.8-fold lower (0.0514 ± 0.0075ml / hr /kg;p=0.029), relative to wild type, OST577 from circulation rhesus -IgG2M3 M428L and T250Q / M428L variants of clearance was expressed that it is significantly reduced (Table 9).

OST577-IgG2M3変異体のPKプロフィールは、その他のパラメータで計算することによりさらに分析された(表9)。 PK profiles of OST577-IgG2M3 variants were further analyzed by calculating other parameters (Table 9). AUC(曲線下面積)はCLに反比例することから、時間ゼロから無限まで外挿された濃度-時間曲線の下の面積である平均AUCは、野生型OST577-IgG2M3(7,710±3,110時*μg/ml)に比べて、M428L変異体については約2倍高く(15,200±8,700時*μg/ml:p=0.057)、T250Q/M428L変異体については約2.6倍高い(19,800±2,900時*μg/ml:p=0.029)ものであり、野生型に比較してOST577-IgG2M3 M428L及びT250Q/M428L変異体の完全露呈が著しく増大していることを表わすことになる(表9)。 Since AUC (area under the curve) is inversely proportional to CL, was extrapolated from time zero to infinity concentration - Mean AUC is the area under the time curve for wild-type OST577-IgG2M3 (7,710 ± 3,110 times * [mu] g / compared to ml), about 2 times higher for M428L variant (15,200 ± 8,700 times * μg / ml: p = 0.057), T250Q / M428L variants from about 2.6-fold higher for (19,800 ± 2,900 times * [mu] g / ml : p = 0.029) are those, thus indicating that compared to full exposure of OST577-IgG2M3 M428L and T250Q / M428L mutant is significantly increased in wild-type (Table 9).

最後に、平均除去(β-相)半減期は、野生型OST577-IgG2M3(351±121時間)に比べて、M428L変異体については約1.8倍長く(642±205時間)、T250Q/M428L変異体については約1.9倍長い(652±28時間;p=0.029)ものであった(表9)。 Finally, the mean elimination (beta-phase) half-life, as compared to wild-type OST577-IgG2M3 (351 ± 121 hr), about 1.8 times longer for M428L variant (642 ± 205 hr), T250Q / M428L variant about 1.9 fold for a long (652 ± 28 hr; p = 0.029) were those (Table 9). この研究における野生型OST577-IgG2M3についての除去半減期は、アカゲザルにおける以前のPK研究においてOST577-IgG1(324±85時間)のものに類似している(Ehrlich et al., 前掲書中)。 Elimination half-life for the wild-type OST577-IgG2M3 in this study is similar in a previous PK study in rhesus monkeys to those of OST577-IgG1 (324 ± 85 hr) (Ehrlich et al., Op. Cit.).

例10 Example 10.
この例は、IgG1抗体の変異体に対する例9に記載されるインビトロ血清半減期アッセイの適用を記載する。 This example describes the application of in vitro serum half-life assays described in Example 9 for the variants of the IgG1 antibody.
アカゲザル薬物動力学研究: Rhesus monkey pharmacokinetic study:
“OST577の2種の変異体の薬物動力学比較”と称する非GLP薬物動力学研究を、University of California, DavisでのCalifornia National Primate Research Center (CNPRC)で行った。 Is referred to as non-GLP pharmacokinetics study "OST577 2 or pharmacokinetic comparison of variants", was carried out at University of California, California National Primate Research Center at Davis (CNPRC). 8匹の雄のアカゲザルを、体重別にランダム化し、そして2種の研究の1つに割り当てた。 Eight male rhesus monkeys were randomized by weight and assigned to one of two studies. 個々の研究グループを包含する4匹の動物は、15分間にわたって投与される1mg/kgでの野生型又は変異体OST577の単一静脈内用量を、それぞれ受けた。 4 animals including individual research group, the wild-type or single intravenous dose of mutant OST577 at 1 mg / kg administered over 15 minutes, receiving respectively. OST577抗体は、野生型0ST577−IgG1、及び二重突然変異T250Q/M428Lを含むOST577−IgG1の変異体であった。 OST577 antibodies were variants of OST577-IgG1 containing wild-type 0ST577-IgG1, and the double mutation T250Q / M428L. 両抗体を、Sp2/0のトランスフェクションにより発現し、そして例5に記載のようにして精製した。 Both antibodies were expressed by transfection of Sp2 / 0, and purified as described in Example 5.

血液サンプルを、0日目、投与の前、投与の後、1及び4時間で、及び1、7、14、21、28、 42及び56日で採取した。 Blood samples, on day 0, before administration after administration, at 1 and 4 hours, and 1,7,14,21,28, were taken at 42 and 56 days. 個々の時点で、4mlの血液を、伏在静脈から採取し、血清を調製し、そして2つのアリコートを凍結し、そして使用まで、−20℃で維持した。 In each time point, the 4ml of blood was taken from the saphenous vein, serum was prepared and frozen two aliquots, and to use, and maintained at -20 ° C.. 血清化学及び血液学的決定のために、血液サンプルを、0日目、投与の前、及び56日目の研究の終結で採取した。 For serum chemistry and hematology determinations, blood samples, on day 0, were collected at the end of the previous, and day 56 of the study of the administration.

ELISA: ELISA:
アカゲザル血清サンプルにおけるOST577−IgG1抗体の濃度を、確証されたアッセイを用いて、ELISAにより決定した。 The concentration of the OST577-IgG1 antibodies in rhesus serum samples, using a validated assay was determined by ELISA. プールされた正常なアカゲザル血清(PNRS)を、CNPRCから入手した。 The pooled normal rhesus serum (PNRS), was obtained from CNPRC. PNRSのサンプルロットを、キャリブレーター、正及び負の対照を調製するために、及びアカゲザル血清サンプルの予備−希釈のために使用した。 Samples lot of PNRS, calibrator, to prepare the positive and negative controls, and rhesus serum samples pre - was used for dilution. キャリブレーターを、3200、1600、800、400、200、100、50、25及び0ng/mlでのPNRSへのOST577−IgG1の標準希釈により調製し、室温で2時間、平衡化し、そして−80℃でアリコートにおいて凍結した。 The calibrators were prepared by standard dilution of OST577-IgG1 to PNRS at 3200,1600,800,400,200,100,50,25 and 0 ng / ml, 2 h at room temperature, equilibrated, and at -80 ° C. and frozen in aliquots. 正の血清対照を、低い正の血清対照について0.2μg/mlで、中位の正の血清対照について0.4μg/mlで、及び高い正の血清対照について0.8μg/mlでのOST577−IgG1によりPNRSをスパイキングすることにより調製し、室温で2時間、平衡化し、そして−80℃でアリコートにおいて凍結した。 The positive serum control, at 0.2 [mu] g / ml for low positive serum control, at 0.4 [mu] g / ml for positive serum control medium, and high positive serum control for the OST577-IgG1 in 0.8 [mu] g / ml PNRS It was prepared by spiking, 2 hours at room temperature, equilibrated, and frozen in aliquots at -80 ° C.. PNRSを、負の血清対照として使用した。 The PNRS, was used as a negative serum control.

Immulon TM 2プレート(DYNEX(商標)Technologies, Inc.)を、PBS中、1.0μg/mlで、100μl/ウェルのマウス抗−OST577−IgG1インディオタイプモノクローナル抗体(OST577−γ1抗−id, Protein Design Labs TM , Inc.)により2−8℃で一晩、被覆した。 Immulon TM 2 plates (DYNEX (TM) Technologies, Inc.) and, in PBS, with 1.0 [mu] g / ml, 100 [mu] l / well of mouse anti -OST577-IgG1 Indians type monoclonal antibody (OST577-.gamma.1 anti -id, Protein Design Labs TM, Inc.) by overnight at 2-8 ° C., was coated. 次の日、プレートを、300μl/ウェルのPBS/Tween(リン酸緩衝溶液、0.1%Tween20)により3度、洗浄し、ペーパータオル上で軽くたたいて乾燥し、そして室温で60±5分間、PBS中、300μl/ウェルのSuperBlock(商標)Blocking Buffer (Pierce Chemical Company)により阻止した。 The next day, the plates, 300 [mu] l / well of PBS / Tween (phosphate buffered saline, 0.1% Tween20) 3 times with, washing, and tapped dry on a paper towel, and for 60 ± 5 minutes at room temperature, PBS among was prevented by SuperBlock of 300 [mu] l / well (TM) blocking Buffer (Pierce Chemical Company). キャリブレーター、正及び負の血清対照、及び血清サンプルを、融解し、そして使用の前、室温に戻した。 Calibrators, positive and negative serum controls, and serum samples, melted, and prior to use, was returned to room temperature.

キャリブレーター、及び正及び負の血清対照を、PBS中、SupeBlock(商標)Blocking Bufferにより1:10に希釈した。 Calibrators, and positive and negative serum controls were diluted in PBS, 1: 10 by SupeBlock (TM) Blocking Buffer. 血清サンプルを、PNRSによりおおまかに予備希釈し(1:5〜1:80)、次にPBS中、SuperBlock(商標)Blocking Bufferにより1:10に希釈した。 Serum samples roughly prediluted by PNRS (1: 5~1: 80), then PBS, and diluted 1:10 with SuperBlock (TM) Blocking Buffer. プレートを、300μl/ウェルのPBS/Tweenにより3度、洗浄し、そしてペーパータオル上で軽くたたいて乾燥した。 The plates 3 times with PBS / Tween of 300 [mu] l / well, washed and tapped dry on a paper towel. 次に、希釈されたキャリブレーター、正及び負の血清対照、及び血清サンプルを、2つのウェルに100μl/ウェルで添加し、そして室温で60±5分間インキュベートした。 Next, calibrators diluted, positive and negative serum controls, and serum samples were added at 100 [mu] l / well in duplicate wells and incubated for 60 ± 5 minutes at room temperature. プレートを、300μl/ウェルのPBS/Tweenにより3度、洗浄し、そしてペーパータオル上で軽くたたいて乾燥した。 The plates 3 times with PBS / Tween of 300 [mu] l / well, washed and tapped dry on a paper towel. ヤギ抗−ヒトλ軽鎖HRP−接合抗体(Southern Biotechnology Associates, Inc.)を、PBS/BSA/Tween(リン酸緩衝溶液、0.5%ウシ血清アルブミン、0.1%Tween20)により1:1000に希釈することにより調製し、100μl/ウェルで添加し、そして室温で60±5分間インキュベートした。 Goat anti - human λ light chain HRP- conjugated antibody (Southern Biotechnology Associates, Inc.) to, PBS / BSA / Tween (phosphate buffered saline, 0.5% bovine serum albumin, 0.1% Tween20) by 1: 1000 dilution in prepared by, it was added at 100 [mu] l / well and incubated for 60 ± 5 minutes at room temperature.

プレートを、300μl/ウェルのPBS/Tweenにより3度、洗浄し、そしてペーパータオル上で軽くたたいて乾燥した。 The plates 3 times with PBS / Tween of 300 [mu] l / well, washed and tapped dry on a paper towel. ABTSペルオキシダーゼ基質/ペルオキシダーゼ溶液B(Kirkegaard & Perry Laboratories)を、100μl/ウェルで添加し、そして7±1分間インキュベートした。 ABTS Peroxidase Substrate / Peroxidase Solution B a (Kirkegaard & Perry Laboratories), was added at 100 [mu] l / well and incubated 7 ± 1 minutes. 進行を、100μl/ウェルでの基質停止溶液(2%シュウ酸)の添加により停止した。 Proceed was stopped by the addition of substrate stop solution (2% oxalic acid) at 100 [mu] l / well. 415nmでの吸光度値を、基質停止溶液の添加の後30分以内に、VERSAmax TMマイクロタイタープレートリーダー(Molecular Devices Corporation(商標))を用いて測定した。 The absorbance values at 415 nm, within 30 minutes after the addition of substrate stop solution, was measured using a VERSAmax TM microtiter plate reader (Molecular Devices Corporation (TM)).

検量線を、キャリブレーターから得られる平均吸光度値を用い、そしてSOFTmax(商標)PRO, バージョン4.0(Molecular Devices Corporation(商標))を用いての4種のパラメーターのロジスティック回帰曲線にデータを適合することにより調製した。 A calibration curve, using the average absorbance values ​​obtained from the calibrators and SOFTmax (TM) PRO, the logistic regression curve of the four parameters using version 4.0 (Molecular Devices Corporation (TM)) by fitting the data It was prepared. 0.0ng/mlのカリブレーターについての平均吸光度値を、残存するカリブレーターについて得られた個々の吸光度値から控除した。 The mean absorbance value for the calibrator of 0.0 ng / ml, was deducted from each absorbance value obtained for the calibrators remaining. 正の血清対照濃度を、正の血清対照について得られ個々の吸光度値から、負の血清対照について得られた平均吸光度値を控除した後に決定した。 The positive serum control concentrations, from the resulting individual absorbance values ​​for positive serum control, were determined after deducting a mean absorbance value obtained for the negative serum control. 得られる平均吸光度値に対応する濃度は、検量線からの内挿により得られる。 Concentration corresponding to the mean absorbance values ​​obtained are obtained by interpolation from the calibration curve. 血清サンプルの濃度を、個々の研究サンプルの吸光度値から適切な予備用量サンプルの平均吸光度値を控除し、その得られる吸光度値を平均し、検量線からの内挿により平均吸光度値に対応する濃度を誘導し、そして個々のサンプルについて最終濃度に達するよう、予備希釈因子によりその得られる濃度を掛け算することにより決定した。 The concentration of the serum samples, less the mean absorbance value of the appropriate pre-dose sample from the absorbance values ​​of the individual study samples, averaging the absorbance values ​​thereof obtained, corresponding to the mean absorbance value by interpolation from the calibration curve the concentration induced, and to reach a final concentration for each sample was determined by multiplying the concentration of the obtained by the preliminary dilution factor.

アッセイの推定される定量範囲は、0.10−0.90μg/mlであった。 Estimated quantitative range of the assay was 0.10-0.90μg / ml. アッセイは、次の2種の条件が適合する場合、適切であると思われた:(1)定量範囲におけるすべての4種のキャリブレーターの平均逆算出された濃度がそれらの呼称値の20%以内であり;そして(2)6種の正の血清対照のうち4種の計算された平均結果がそれらの呼称値の30%以内であり、そして個々の濃度レベルからの少なくとも1つの平均結果が呼称値の30%以内である。 Assay, if the following two conditions are met, appeared to be appropriate: (1) Average reverse calculated concentration of all four calibrators in quantitative range within 20% of their nominal value in it; and (2) six positive four calculated average results of the serum controls are within 30% of their nominal value, and at least one mean result designation from individual concentration levels it is within 30% of the value.

上記の基準を満たさなかったプレートからのデータは、拒絶された。 Data from plates that did not meet the above criteria were rejected. 個々の血清サンプルからのデータは、次の条件のいずれかが適合する場合、拒絶された:(1)計算された平均濃度が、アッセイの定量下限(LLOQ)(0.10μg/ml)以下であるか;又は(2)計算された平均濃度がアッセイの定量上限(ULOQ)(0.90μg/ml)以上である。 Data from individual serum samples, if any of the following conditions are met, is rejected: (1) the calculated average density is equal to or less than lower limit of quantification of the assay (LLOQ) (0.10 .mu.g / ml) or; or (2) the calculated average density is greater than or equal to upper limit of quantification of the assay (ULOQ) (0.90μg / ml). 二重サンプルの計算された結果がお互い40%以上異なった場合、サンプルは、第2の独立したアッセイにおいて再試験された。 When a double sample calculated result is different from each other more than 40%, the sample was retested in a second independent assay. その第2アッセイの計算された平均結果が問題のサンプルについての第1のアッセイの計算された平均結果の15%以内である場合、第1のアッセイの計算された平均結果が使用された。 If the calculated average results of the second assay is within 15% of the calculated average results of the first assay for the sample in question, the calculated average results of the first assay were used. 他方では、サンプルは、第3の独立したアッセイにより再試験され、そして1つの値がアウトライアー試験により除かれない場合、すべての3種のアッセイの結果が平均された。 On the other hand, the sample is retested by the third independent assays, and one value may not removed by the outlier test, the results of all three assays are averaged. この場合、2種の残る値の平均が報告された。 In this case, the average of two remaining values ​​are reported.

結果: result:
血清抗体濃度データを、WinNonlin Enterprise Edition, バージョン3.2(Pharsight(商標)Corporation, Mountain View, CA)を用いて、2区画モデルに適合せしめた。 The serum antibody concentration data, WinNonlin Enterprise Edition, Version 3.2 (Pharsight (TM) Corporation, Mountain View, CA) was used to allowed conform to the two-compartment model. 前記モデアルは、一次分配及び一次除去速度を仮定し、そして前記データをうまく適合させる。 The Modearu assumes the primary distributor and primary removal rate, and is well adapted to the data. モデリングされたデータ(個々のグループの一次薬物動力学パラメーターのメジアン値に基づいてシミュレートされた)、並びに観察された平均血清抗体濃度(μg/ml)及び4匹の動物の個々のグループについての標準偏差を、GraphPad Prism(商標)バージョン3.02 (GraphPad Software, Inc. )を用いて、時間(輸液後の日数)の関数としてプロットした。 Modeled data (simulated based on the median value of the primary pharmacokinetic parameters of each group), as well as the observed mean serum antibody concentration ([mu] g / ml) and for the four animals in each group the standard deviation, GraphPad Prism (TM) version 3.02 (GraphPad Software, Inc.) was used and plotted as a function of time (days after infusion). 図20に示されるように、データは、OST577−IgG1のT250Q/M428L変異体の平均血清抗体濃度がすべての時点で野生型OST577−IgG1より高いレベルで維持されたことを示している。 As shown in FIG. 20, the data indicate that the mean serum antibody concentrations of T250Q / M428L variants of OST577-IgG1 were maintained at higher levels than wild-type OST577-IgG1 at all time points.

種々の薬物動力学パラメーターを、WinNonlin(商標)Enterprise Edition, バージョン 3.2(Pharsighte(商標)Corporation)を用いたデータから計算した。 Various pharmacokinetic parameters were calculated from the data using WinNonlin (TM) Enterprise Edition, version 3.2 (Pharsighte (TM) Corporation). 薬物動力学パラメーターの統計的分析を、GraphPad Prism(商標), バージョン 3.02 (GraphPad TM Software, Inc. )を用いて計算した。 Statistical analysis of pharmacokinetic parameters, GraphPad Prism (TM), were calculated using version 3.02 (GraphPad TM Software, Inc.) . 表10に示されるように、C maxは両試験グループ間で非常に類似し、このことは、投与された抗体が類似する態様で循環に分配されたことを示す。 As shown in Table 10, C max is very similar between the two study groups, indicating that the antibody administered were distributed to the circulation in a manner similar. 従って、分配段階に続く変異体IgG1抗体のより高い抗体濃度は、血清中のその高められた存続度に原因がある。 Thus, the higher antibody concentrations of the mutant IgG1 antibody following the distribution phase are attributed to the enhanced survival of the serum. 平均CLの分析は、これがあてはまっていることを示した。 Analysis of the mean CL indicated that this is held true. 平均CLは、野生型OST577−IgG1(0.190±0.022ml/時/kg)に比較して、T250Q/M428L変異体(0.0811±0.0191ml/時/kg;p=0.029)について約2.3倍低く(表10)、このことは、野生型に比較して、アカゲザルの循環からのOST577−IgG1 T250Q/M428L変異体のクリアランスの著しい低下を示す。 Mean CL is compared to the wild-type OST577-IgG1 (0.190 ± 0.022ml / hr / kg), T250Q / M428L variant (0.0811 ± 0.0191ml / h /Kg;p=0.029) about 2.3-fold lower (Table 10), which, compared to the wild-type, indicating a significant reduction in clearance OST577-IgG1 T250Q / M428L variants from the circulation of rhesus monkeys.

OST577−IgG1変異体のPKプロフィールを、他のパラメーターを計算することにより、さらに分析した(表10)。 The PK profile of OST577-IgG1 mutant, by calculating other parameters were further analyzed (Table 10). 平均AUCは、野生型OST577−IgG1(5,320±590時* μ/ml)に比較して、T250Q/M428L変異体(12,900±3,000時* μg/ml; p=0.029)について約2.4倍高く(表10)、このことは、野生型に比較して、OST577−TgG1 T250Q/M428L変異体の完全露呈の著しい増大を示す。 Mean AUC, compared to wild-type OST577-IgG1 (5,320 ± 590 pm * μ / ml), T250Q / M428L variant (12,900 ± 3,000 times * μg / ml; p = 0.029 ) about 2.4 times higher (Table 10), which, compared to the wild-type, indicating a significant increase in complete exposure of the OST577-TgG1 T250Q / M428L variants.

最終的に、平均除去(β−相)半減期は、野生型OST577−IgG1(336±34時間)に比較して、T250Q/M428L変異体(838±187時間;p=0.029)について約2.5倍長かった(表10)。 Finally, the mean elimination (beta-phase) half-life, as compared to wild-type OST577-IgG1 (336 ± 34 hr), T250Q / M428L variant (838 ± 187 hr; p = 0.029) about 2.5 fold for It was longer (Table 10). この研究における野生型OST577−IgG1についての除去半減期は、アカゲザルにおける以前のPK研究におけるOST577−IgG1(324±85時間)についての半減期に類似する(Ehrlich et al., 前掲書中)。 Elimination half-life for the wild-type OST577-IgG1 in this study is similar to the half-life for OST577-IgG1 in a previous PK study in rhesus monkeys (324 ± 85 hr) (Ehrlich et al., Op. Cit.).

例11 Example 11.
この例は、IgG3及びIgG4抗体の変異体に対する例6及び7に記載される種々の結合分析の適用について記載する。 This example describes the application of the various binding analyzes described in Examples 6 and 7 with respect to variants of IgG3 and IgG4 antibodies.
突然変異誘発: Mutagenesis:
オーバーラップ−延長PCR方法(Higuchi, 前掲)を用いて、Hu1D10−IgG3重鎖の位置428、又はHu1D10−IgG4重鎖の位置250及び428での特定の部位のアミノ酸置換を生成した(Kabat et al., 前掲のEU指標に従って番号付けされた)。 Overlap - extension PCR method (Higuchi, supra) using, Hu1D10-IgG3 heavy position of chain 428, or to generate amino acid substitutions at a specified site at position 250 and 428 of the Hu1D10-IgG4 heavy chain (Kabat et al ., it was numbered according to the EU index of supra). M428L変異体を、Hu1D10−IgG3重鎖において生成した。 The M428L mutant, produced in Hu1D10-IgG3 heavy chain. M428L及びT250QM428L変体の両者を、Hu1D10−IgG4重鎖において生成した。 Both M428L and T250QM428L variants were produced in Hu1D10-IgG4 heavy chain.

トランスフェクション: Transfection:
例1及び2に詳細に記載される、野生型又は変異体Hu1D10−IgG3又はHu1D10−IgG4重鎖発現ベクターを、pVk−Hu1D10軽鎖発現ベクターと共に、ヒト腎臓細胞系293−H(Life Technologies(商標))中に一時的に同時トランスフェクトした。 Examples 1 and 2 are described in detail, a wild-type or mutant Hu1D10-IgG3 or Hu1D10-IgG4 heavy chain expression vector, pVk-Hu1D10 with light chain expression vectors, human kidney cell line 293-H (Life Technologies (TM )) were transiently co-transfected into. Hu1D10−IgG3又はHu1D10−IgG4発現ベクターもまた、例5に記載のようにして、pVk−Hu1D10発現ベクターと共にSp2/0細胞中に安定して同時トランスフェクトした。 Hu1D10-IgG3 or Hu1D10-IgG4 expression vector also as described in Example 5, stable cotransfected into Sp2 / 0 cells with pVk-Hu1D10 expression vector. Sp2/0における安定したトランスフェクションに関しては、IgG3発現ベクターを、FspIにより線状化し;しかしながら、IgG4発現ベクターは、pHuHC.g4.It.D-Hu1D10に2個のFspI部位が存在するので、Bstz171により線状化した。 For the stable transfection of Sp2 / 0, the IgG3 expression vector was linearized by FspI; however, IgG4 expression vectors, since two FspI site is present pHuHC.g4.It.D-Hu1D10, Bstz171 It was linearized by.

抗体精製: Antibody Purification:
ヒトIgG4抗体を含む培養上清液を、例5に記載のようにして、ELISAにより定量化し、遠心分離により収穫し、無菌濾過し、そしてプロテインA親和性クロマトグラフィーにより精製した。 The culture supernatant containing the human IgG4 antibody, as described in Example 5, quantified by ELISA, harvested by centrifugation, sterile filtered, and purified by protein A affinity chromatography.

ヒトIgG3抗体を含む培養上清液を、例5に記載のようにして、ELISAにより定量化し、遠心分離により収穫し、そして無菌濾過した。 The culture supernatant containing human IgG3 antibody, as described in Example 5, quantified by ELISA, harvested by centrifugation, and sterile filtered. 濾過された上清液のpHを、1/75体積の1Mのトリス−HCl(pH8.0)の添加により調節した。 The pH of the filtered supernatants was adjusted by addition of 1/75 volume of 1M Tris-HCl (pH 8.0). 上清液を、20mMのリン酸ナトリウム(pH7.0)により予備−平衡化された、1mlのHiTrapW(商標)Protein G HP カラム (Amersham Biosciences Corporation)上で試験した。 The supernatant, preliminary with sodium phosphate 20 mM (pH 7.0) - was equilibrated and tested on 1ml of HiTrapW (TM) Protein G HP column (Amersham Biosciences Corporation). カラムを、同じ緩衝液により洗浄し、そして結合された抗体を、100mMのグリシン−HCl(pH2.7)により溶出した。 The column was washed with the same buffer, and bound antibody was eluted with 100mM glycine-HCl (pH 2.7). 約1/50体積の1Mのトリス−HCl(pH8.0)の添加による中和の後、プールされたタンパク質画分を、20mMのクエン酸ナトリウム、120mMのNaCl(pH6.0)において一晩、透析するか、又は20mMのクエン酸ナトリウム120mMのNaCl(pH6.0)により予備−平衡化された、5mlのHiTrap(商標)Desalting カラム (Amersham Biosciences Corporation)上で試験した。 After neutralization by addition of 1/50 volume of 1M Tris-HCl (pH 8.0), the protein fractions pooled, 20 mM sodium citrate, overnight in NaCl (pH 6.0) of 120 mM, or dialysis, or pre-by NaCl (pH 6.0) of 20mM sodium citrate 120 mM - equilibrated and tested over 5ml of HiTrap (TM) Desalting column (Amersham Biosciences Corporation).

脱塩カラムを通しての流れを集め、そしてOD280>1の画分をプールし、そして2mlのVivaspin(商標)濃縮機(50,000ドルトンMWCO)(Vivascience(商標)AG)を用いて、約0.5−1.0mg/mlに濃縮した。 Collect the flow through a desalting column, and OD280> 1 fractions were pooled, and using 2ml of Vivaspin (TM) concentrators (50,000 daltons MWCO) (Vivascience (TM) AG), about 0.5-1.0mg / it was concentrated in ml. 透析された材料を、同じ態様で濃縮した。 The dialyzed material was concentrated in the same manner. 次に、サンプルを、0.2μmのMillex(商標)-GV microfilters(Milliporee Corporation)を用いて濾過殺菌した。 Next, samples were filter sterilized using a 0.2μm of Millex (TM) -GV microfilters (Milliporee Corporation). 精製された抗体の濃度を、280nmでの吸光度(1mgl/ml=1.4A 280 )を測定することにより、UV分光法により決定した。 The concentration of the purified antibody by measuring absorbance at 280nm and (1mgl / ml = 1.4A 280) , were determined by UV spectroscopy.

SDS−PAGE: SDS-PAGE:
精製された抗体のサンプル5μgを、例5に記載のようにして、還元又は非−還元条件下で試験した。 Samples 5μg of purified antibodies, as described in Example 5, a reducing or non - tested under reducing conditions.

競争結合アッセイ: Competition binding assays:
例6に記載のようにして、表面上で組換えGPI−結合のヒト又はアカゲザルFcRnを発現するNSO形質転換体を、ミコフェノール酸(MPA)選択培地(DMEM, 10% FBS, lx HT 培地 補充 Hybri-Maxo(商標)(Sigma(商標)), 250 μg/ml キサンチン (Sigma(商標))、 1μg/mlの ミコフェノール酸(Life Technologies(商標)), 及び 2 mM のL-グルタミン)、又は2×MPA選択培地において維持した。 Example 6 as described in the NSO transformants expressing human or rhesus FcRn recombinant GPI- binding on the surface, mycophenolic acid (MPA) selection medium (DMEM, 10% FBS, lx HT media supplement Hybri-MAXO (TM) (Sigma (TM)), 250 [mu] g / ml xanthine (Sigma (TM)), 1 [mu] g / ml of mycophenolic acid (Life Technologies (TM)), and 2 mM L- glutamine), or It was maintained in 2 × MPA selection medium.

個々の精製されたHU1D10−1gG3抗体の一連の希釈溶液を、ビオチンにより(Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL)によりラベルされたヒトIgG(Sigma-Aldrich、St. Louis, MO)に対して競争せしめた。 Competition A series of dilutions of each purified HU1D10-1gG3 antibodies with biotin (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) by labeled human IgG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) with respect to It was allowed. 抗体を、細胞系NS0 HuFcRn(memb)、すなわちクローン7−3上のヒトFcRn、及び細胞系NS0 RhFcRn、すなわちクローンR-3上のアカゲザルFcRnに対する結合について試験した。 Antibodies cell line NS0 HuFcRn (memb), i.e. clones 7-3 on the human FcRn, and cell lines NS0 RhFcRn, i.e. were tested for binding to rhesus FcRn on the clone R-3. 試験当たり約2×10 5個の細胞を、FBB(pH8.0)により1度、及びFBB(pH6.0)により1度、洗浄し、次にFBB(pH6.0)中、120μlの予備−混合された、ビオチニル化されたヒトIgG抗体(8.3μg/ml)及びHu1D10−IgG3競争抗体(625μg/mlから0.305μg/mlまでの2倍の一連の希釈)に再懸濁した。 About 2 × 10 5 cells per test, once with FBB (pH 8.0), and once with FBB (pH 6.0), washed and then in FBB (pH 6.0), 120 [mu] l Extra - mixed, and resuspended in biotinylated human IgG antibody (8.3μg / ml) and (serial dilution twice from 625μg / ml to 0.305μg / ml) Hu1D10-IgG3 compete antibody.

細胞を、氷上で1時間、抗体混合物と共にインキュベートし、FBB(pH6.0)により2度、洗浄し、そしてFBB(pH6.0)において2.5μg/mlに希釈されたストレプタビジン−RPE接合体(BioSource International)25μlに再懸濁した。 Cells on ice for 1 hour, then incubated with the antibody mixture twice with FBB (pH 6.0), washed and FBB (pH 6.0) diluted to 2.5 [mu] g / ml in a streptavidin -RPE conjugate (BioSource International) and resuspended in 25μl. 暗室において氷上で30分間インキュベートした後、細胞を、FBB(pH6.0)により2度、洗浄し、そして1%ホルムアルデヒドに再懸濁した。 After incubation on ice for 30 min in the dark, the cells twice with FBB (pH 6.0), washed, and resuspended in 1% formaldehyde. サンプルを、FACSCalibur流動細胞計測法(BD(商標)Biosciences)を用いてのFACS TMにより、FcRnに結合する抗体について分析した。 Samples by FACS TM for using FACSCalibur flow cytometry and (BD (TM) Biosciences), were analyzed for antibody binding to FcRn.

個々の精製されたHu1D10−IgG4抗体の一連の希釈溶液を、ビオチン(Pierce Biotechnology, Inc.)によりラベルされたヒトIgG(Sigma−Aldrich)に対して競争せしめた。 A series of dilutions of each purified Hu1D10-IgG4 antibody, was allowed to compete against biotin (Pierce Biotechnology, Inc.) by labeled human IgG (Sigma-Aldrich). IgG4抗体を、細胞系NS0 HuFcRn (memb)、すなわちクローン7−3上のFcRn、及び細胞系NS0 RhFcRn, すなわちクローンR-3上のアカゲザルFcRnへの結合について、IgG3抗体について上記のようにして試験した。 The IgG4 antibodies, cell lines NS0 HuFcRn (memb), i.e. clones 7-3 on FcRn, and cell lines NS0 RhFcRn, i.e. for binding to rhesus FcRn on the clone R-3, as described above for the IgG3 antibody tests did.

Ph−依存性結合及び放出アッセイ: Ph- dependent binding and release assays:
精製されたHu1D10−IgG3及びHu1D10−IgG4変異体抗体を、ヒト又はアカゲザルFcRnへの結合について、それぞれの野生型抗体に比較し、そして次に、例7に記載のようにして、細胞系NS0 HuFcRn (memb)、すなわちクローン7−3、及びNS0 RhFcRn、すなわちクローンR−3を用いての単一点結合及び放出アッセイにおいて種々のpH値で放出した。 The purified Hu1D10-IgG3 and Hu1D10-IgG4 mutant antibodies, for binding to human or rhesus FcRn, compared to the respective wild-type antibodies, and then, as described in Example 7, a cell line NS0 HuFcRn (memb), i.e. clone 7-3, and NS0 RhFcRn, i.e. released at various pH values ​​in single-point binding and release assays using cloned R-3. 両サブタイプのIgG3及びIgG4が同等にラベルされたことを確めるために、適切なpHのFBBにおいて1.25μg/mlに希釈された、25μlのヤギF(ab') 2抗−ヒトκFTTC−接合抗体(Southern Biotechnology Associates, Inc.)を、検出試薬として使用した。 That IgG3 and IgG4 of both subtypes were equally labeled for sure Mel, diluted to 1.25 [mu] g / ml in FBB of the appropriate pH, goat 25μl F (ab ') 2 anti - human κFTTC- the conjugated antibody (Southern Biotechnology Associates, Inc.), was used as a detection reagent.

結果: result:
アミノ酸置換を、ヒトγ3重鎖の位置428で、及びヒトγ4重鎖の位置250及び428で生ぜしめた(Kabat, et al., 前掲のEU指標に従って番号付けられた)。 An amino acid substitution at position 428 of the human γ3 heavy chain, and was caused by the positions 250 and 428 of the human γ4 heavy chains (Kabat, et al., They were numbered according to the EU index of supra). それらの2つの位置は、FcRnへの高められた結合をもたらしたヒトγ2M3重鎖におけるそれらの位置での突然変異の同定に基づいて選択された。 Two positions thereof, which is selected based on the identification of mutations at these positions in the human γ2M3 heavy chain that resulted in binding elevated to FcRn. M428L変異体は、ヒトγ3重鎖において評価された。 M428L mutant was evaluated in the human γ3 heavy chain. M428L変異体及びT250Q/M428L変異体の両者を、ヒトγ4重鎖において評価した。 Both the M428L mutant and T250Q / M428L variants were evaluated in the human γ4 heavy chains.

IgG3及びIgG4Fc変異体は、それぞれ、Hu1D10(Kostelny et al. (2001)、前掲)の軽鎖及び重鎖可変領域、ヒトκ(Hieter et al. (1980)、前掲)の軽鎖定常領域、及びヒトIgG3(Huck et al., 前掲)及びIgG4(Ellison et al., 前掲)の重鎖定常領域を含んで成る抗−HLA−DRβ鎖対立遺伝子抗体として発現された。 IgG3 and IgG4Fc variants respectively, Hu1D10 (Kostelny et al. (2001), supra) light and heavy chain variable regions of the human κ (Hieter et al. (1980), supra) of the light chain constant region and, human IgG3 (Huck et al., supra) and IgG4 (Ellison et al., supra) was expressed as anti-HLA-DR beta chain allele antibodies, comprising a heavy chain constant region of. 上記のように、適切な野生型又は変異体重鎖発現ベクターを、Hu1D10モノクローナル抗体の発現のために、適切な軽鎖発現ベクターと共に293−H細胞中に一時的に同時−トランスフェクトした。 As described above, the appropriate wild-type or mutant heavy chain expression vector, for the expression of Hu1D10 monoclonal antibodies transiently co to 293-H cells with the appropriate light chain expression vector - transfected.

一時的にトランスフェクションの後5〜7日で収穫された培養上清液のELISA分析は、抗体発現レベルが典型的には、25mlの上清液中、5−25μg/mlであったことを示した。 ELISA analysis of temporary 5-7 culture was harvested in day supernatants after transfection, the antibody expression levels are typically in the supernatant liquid of 25 ml, it was 5-25μg / ml Indicated. Hu1D10−IgG3及びHu1D10−IgG4抗体を、約100−500μgの最終収量のために、それぞれプロテインG及びAを用いて親和性クロマトグラフィーにより精製した。 The Hu1D10-IgG3 and Hu1D10-IgG4 antibody, for final yield of about 100-500, was purified by affinity chromatography respectively using Protein G and A. Sp2/0細胞におけるHu1D10抗体の安定した発現は典型的には、ELISAにより決定される場合、30−100μg/mlの発現レベルをもたらした。 Stable expression of Hu1D10 antibodies in Sp2 / 0 cells typically as determined by ELISA, resulting in the expression level of 30-100μg / ml. 培養上清液に存在する約50−80%の抗体の収率が、小規模プロテインG又はA親和性クロマトグラフィーにより得られた。 The yield of about 50-80% of the antibody present in culture supernatants were obtained by small-scale protein G or A affinity chromatography.

精製された抗体を、非還元及び還元条件下でSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)により特徴づけた。 Purified antibodies were characterized by SDS polyacrylamide gel electrophoresis under non-reducing and reducing conditions (SDS-PAGE). 非還元条件下でのSDS−PAGE分析は、精製された抗体が約150−170kDa分子量を有したことを示し(データは示されていない);還元条件下での分析は、精製された抗体が約50−60kDの分子量を有する重鎖及び約25kDの分子量を有する軽鎖から構成されることを示した(データは示されていない)。 SDS-PAGE analysis in non reducing conditions indicates that the purified antibodies had about 150-170kDa molecular weight (data not shown); analysis under reducing conditions, antibodies purified It has been shown to be composed of a light chain with a molecular weight of the heavy chain and about 25kD with a molecular weight of about 50-60KD (data not shown). 安定したSp2/0トランスフェクタントから精製された抗体のSDS−PAGE分析は、一時的な293−Hトランスフェクションから精製された抗体により観察される結果に類似する結果を与えた。 SDS-PAGE analysis of purified from stable Sp2 / 0 transfectants antibodies gave similar results to the results observed by antibodies purified from transient 293-H transfections.

FcRnに対する野生型Hu1D10−IgG3及びHu1D10−IgG4抗体、及びそれらの種類の変異体の相対的結合を、その表面上でヒトFcRnを安定して発現する、トランスフェクトされたNSO細胞系を用いて決定した。 Wild-type Hu1D10-IgG3 and Hu1D10-IgG4 antibodies to FcRn, and the relative binding of these types of mutants, stably expressing human FcRn on its surface, determined using NSO cell line transfected did. 上記のようにして、精製された抗体を、競争結合アッセイにおいて、FcRnの結合について試験した。 As described above, the purified antibody, in a competitive binding assay, were tested for binding FcRn. 上昇する濃度のラベルされていない競争抗体を、FBB(pH6.0)中、亜飽和濃度のビオチニル化されたヒトIgG抗体(Sigma−Aldrich)の存在下で細胞と共にインキュベートした。 Competition antibody unlabeled increasing concentrations, in FBB (pH 6.0), were incubated with cells in the presence of a subsaturating concentration of biotinylated human IgG antibody (Sigma-Aldrich).

ヒトFcRnへのHu1D10−IgG3野生型及びM428L変異体の結合を、競争結合実験において試験した。 The binding of Hu1D10-IgG3 wild-type and M428L mutant to human FcRn, were tested in competitive binding experiments. 表11に要約されるように、野生型Hu1D10−IgG3抗体についてのIC50は約15μg/mlであり、そしてM428L単一変異体についてIC50 は約2μg/mlである。 As summarized in Table 11, the IC50 for the wild-type Hu1D10-IgG3 antibody is about 15 [mu] g / ml, and IC50 for M428L single mutant is about 2 [mu] g / ml. ヒトFcRnへのHu1D10−IgG4及びその変異体の結合をまた、競争結合実験において試験した。 The binding of Hu1D10-IgG4 and its mutants to human FcRn were also tested in competitive binding experiments. 表12に要約されるように、野生型Hu1D10−IgG抗体についてのIC50は約76μg/mlであり、そしてM428M単一変異体についてのIC50は約5μg/mlであり、そしてT250Q/M428L二重変異体についてのIC50は約1μg/mlである。 As summarized in Table 12, the IC50 for the wild-type Hu1D10-IgG antibody was approximately 76μg / ml, and the IC50 for M428M single mutant is about 5 [mu] g / ml, and T250Q / M428L double mutant IC50 for the body is about 1 [mu] g / ml.

アカゲザルFcRnへのHu1D10−IgG3野生型及びM428L変異体の結合を、競争結合実験において試験した。 The binding of Hu1D10-IgG3 wild-type and M428L mutant to rhesus FcRn, were tested in competitive binding experiments. 表13に要約されるように、野生型Hu1D10−IgG3抗体についてのIC50は約14μg/mlであり、そしてM428L単一変異体についてIC50 は約3μg/mlである。 As summarized in Table 13, the IC50 for the wild-type Hu1D10-IgG3 antibody is about 14 [mu] g / ml, and IC50 for M428L single mutant is about 3 [mu] g / ml. アカゲザルFcRnへのHu1D10−IgG4及びその変異体の結合をまた、競争結合実験において試験した。 The binding of Hu1D10-IgG4 and its mutants to rhesus FcRn were also tested in competitive binding experiments. 表14に要約されるように、野生型Hu1D10−IgG抗体についてのIC50は約98μg/mlであり、そしてM428M単一変異体についてのIC50は約7μg/mlであり、そしてT250Q/M428L二重変異体についてのIC50は約1μg/mlである。 As summarized in Table 14, the IC50 for the wild-type Hu1D10-IgG antibody was approximately 98μg / ml, and the IC50 for M428M single mutant is about 7 [mu] g / ml, and T250Q / M428L double mutant IC50 for the body is about 1 [mu] g / ml.

FcRnへのIgGの結合はpH−依存性であることが知られており;IgGはpH6.0でFcRnに強く結合するが、しかしpH8.0では弱く結合する。 Binding of IgG to FcRn is known to be dependent pH-; IgG binds strongly to FcRn at pH6.0, but the pH8.0 weakly bound. より長い血清半減期を有する変異体抗体を構築するためには、pH8.0でFcRnからのpH−依存性放出を保持しながら、pH6.0でFcRnへの結合を高めることが所望される。 To construct a mutant antibodies with longer serum half-life, while retaining the pH- dependent release from FcRn at pH 8.0, it is desirable to increase binding to FcRn at pH 6.0. 結合がpH−依存性であることを確めるために、抗体を、ヒトFcRnを安定して発現する、トランスフェクトされたNSO細胞系への結合について試験し、そして6.0〜8.0の範囲のpH値で放出した。 That the binding is pH- dependent for sure Mel, antibody, expressing human FcRn stable, and tested for binding to NSO cell line transfected with, and pH in the range of 6.0 to 8.0 It was released in value. 上記のように、細胞を、FBB(pH6.0)中、亜飽和濃度の抗体と共にインキュベートし、pH6.0, 6.5, 7.0, 7.5又は8.0でのFBBにより洗浄し、そして結合をFACS TMにより分析した。 As described above, the cells in FBB (pH 6.0), incubated with subsaturating concentrations of the antibody, pH 6.0, 6.5, 7.0, washed with FBB, at 7.5 or 8.0, and analyzed by FACS TM binding did.

図21Aに示されるように、その結果は、M428L突然変異を有する、修飾されたHu1D10−IgG3抗体が、pH6.0でヒトFcRnへの強い結合を示し、そしてpH値がpH8.0に高められるにつれて、結合が低下することを示した。 As shown in FIG. 21A, the result has M428L mutations, Hu1D10-IgG3 antibody modifications, showed strong binding to human FcRn at pH 6.0, and pH value is increased to pH8.0 As the binding showed a decrease. 図21Bに示されるように、その結果は、M428L又はT250Q/M428L突然変異を有する、修飾されたHu1D10−IgG4抗体がpH6.0でヒトFcRnへの強い結合を示し、そしてpH値がpH8.0に上昇するにつれて、結合が低下することを示した。 As shown in FIG. 21B, the result has M428L or T250Q / M428L mutations, Hu1D10-IgG4 antibody modified showed strong binding to human FcRn at pH 6.0, and pH value of pH8.0 as it rises, binding was shown to decrease. それらの結果は、ヒトFcRnへのIgG3及びIgG4抗体の結合がpH−依存性であったことを示した。 The results showed that binding of IgG3 and IgG4 antibodies to human FcRn was pH- dependent.

同様に、抗体を、アカゲザルFcRnを安定して発現する、トランスフェクトされたNSO細胞系への結合について試験し、そして次に、6.0〜8.0の範囲のpH値で放出した。 Similarly, the antibody, expressing rhesus FcRn stable, and tested for binding to NSO cell line transfected with, and was then released at pH values ​​ranging from 6.0 to 8.0. 図21Cに示されるように、その結果は、M428Lを有する、修飾されたHu1D10−IgG3抗体がpH6.0でアカゲザルFcRnへの強い結合を示し、そしてpH値がpH8.0に高まるにつれて、結合が低下することを示した。 As shown in FIG. 21C, the result is, as has the M428L, Hu1D10-IgG3 antibody modified showed strong binding to rhesus FcRn at pH 6.0, and pH value increases to pH 8.0, binding It showed a decrease. 図21Dに示されるように、その結果は、H428L又はT250Q/M428L突然変異を有する、修飾されたHu1D10−IgG4抗体がpH6.0でアカゲザルFcRnに対して強い結合を示し、そしてpH値がpH8.0に上昇するにつれて、結合が低下したことを示した。 As shown in FIG. 21D, the result has H428L or T250Q / M428L mutations, Hu1D10-IgG4 antibody modified showed strong binding to rhesus FcRn at pH 6.0, and pH value of pH 8. as it rises to 0, binding were reduced. それらの結果は、アカゲザルにFcRnへの抗体の結合がまた、pH−依存性であったことを示した。 These results, also the binding of the antibody to FcRn in rhesus monkeys showed that was pH- dependent.

例12 Example 12.
この例は、IgG3及びIgG4抗体の変異体への例9及び10に記載されるインビトロ及びインビボ血清半減期の適用を記載する。 This example describes the application of in vitro and in vivo serum half-life as described in Example 9 and 10 to mutants of IgG3 and IgG4 antibodies.
例9及び10に記載されるような“アカゲザル薬物動力学的研究”のプロトコールを、IgG3及びIgG4の変異体に対して行い、インビボ血清半減期及び種々の薬物動力学的パラメーターに対する突然変異の効果を確認した。 The protocol for "Rhesus Pharmacokinetics Study" as described in Examples 9 and 10, performed on the mutants of IgG3 and IgG4, the mutations to in vivo serum half-life and the various pharmacokinetic parameters effective It was confirmed.

例13 . Example 13.
この例は、改良された患者処理規則を可能にするために、良く知られている治療抗体のFcRn結合変異体を企画し、そして生成し、それにより、個々の血清半減期を延長すること(又は縮小すること)を記載する。 This example is to allow for improved patient processing rules, planning FcRn binding variants of the well-known therapeutic antibodies and to generate, thereby extending the individual serum half-life ( or reducing) describes.

ダクリズマブ: Daclizumab:
ダクリズマブは、多くの自己免疫及び炎症疾患症状、例えば喘息、糖尿病、ブドウ膜炎、多発性硬化症、リウマチ様関節炎及び潰瘍性大腸炎のために臨床学的に開発されている、ヒト適合された抗−CD25モノクローナル抗体である。 Daclizumab, many autoimmune and inflammatory disease conditions such as asthma, diabetes, uveitis, multiple sclerosis, has been clinically developed for rheumatoid arthritis and ulcerative colitis, are humanized it is an anti--CD25 monoclonal antibody. ダクリズマブは、移植適応症のみのために、商標Zenapax(商標)として現在市販されている。 Daclizumab for transplantation indications only, and is currently marketed under the trademark Zenapax (R).

ダクリズマブについての軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列は、引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第5,530,101号に開示されている。 Amino acid sequences of the light and heavy chain variable regions of daclizumab are disclosed in US Patent No. 5,530,101, incorporated herein by reference.
その現在の臨床学的態様におけるダクリズマブは、IgG1イソタイプ抗体であるが、しかしながら、類似する治療特徴を示す、ダクリズマブのIgG2M3イソタイプバージョンが、生成され得る。 Daclizumab in its current clinical embodiment is an IgG1 isotype antibody, however, show a therapeutic characteristics similar, IgG2M3 isotype version of daclizumab may be generated.

ダクリズマブの血清半減期を高めるために、その定常領域アミノ酸配列を、上記FcRn結合突然変異のいずれかにより修飾した。 To increase the serum half-life of daclizumab, its constant region amino acid sequences were modified by any of the FcRn binding mutations. 例えば、T250Q/M428L突然変異を、上記例1−4に記載されるベクター企画及び突然変異誘発についての方法を用いて、ダクリズマブにおいて生成することができる。 For example, it is possible to the T250Q / M428L mutation, using the method of vector planning and mutagenesis described in the above Examples 1-4, to generate the daclizumab. T250Q/M428Lダクリズマブの配列は、図22(配列番号122)に示される。 Sequence of T250Q / M428L daclizumab is shown in FIG. 22 (SEQ ID NO: 122).

T250Q/M428Lダクリズマブの高められた血清半減期を、例5−7に記載されるインビトロ結合アッセイ方法を用いて、又は例9−10に記載されるインビボアッセイ方法を用いて決定することができる。 The serum half-life that is elevated T250Q / M428L daclizumab, can be used in vitro binding assay method described in Example 5-7, or determined using the in vivo assay methods described in Example 9-10.
T250Q/M428Lダクリズマブは、投与の高められた頻度及び量の利点を、変更されていないダクリズマブの治療効果に提供することであろうことが予測される。 T250Q / M428L daclizumab, the benefits of enhanced frequency and amount of dosage, it is expected that it will be provided to the therapeutic effect of daclizumab which have not been changed.

図22(配列番号119−123)に示されるように、ダクリズマブ(IgG1イソタイプ)定常領域配列における他のFcRn結合突然変異をまた、上記例1−3の方法に従って生成することができる。 As shown in FIG. 22 (SEQ ID NO: 119-123), also the other FcRn binding mutations in daclizumab (IgG1 isotype) constant region sequences can be generated according to the method of the Example 1-3. それらの変異体はまた、上記OST577及びHu1D10抗体例の効果に基づいて、所望されるようなダクリズマブの血清半減期に影響を及ぼすであろうことが予測される。 Variants thereof also are based on the effect of the OST577 and Hu1D10 antibodies example, it will affect the serum half-life of daclizumab as desired can be expected.
同様に、図22(配列番号124−128)に示されるような、ダクリズマブ定常領域配列のIgG2M3バージョンにおけるFcRn結合突然変異をまた、上記例1−4の方法に従って生成することができる。 Similarly, as shown in FIG. 22 (SEQ ID NO: 124-128), also FcRn binding mutations in IgG2M3 version of daclizumab constant region sequences can be generated according to the method of the example 1-4.

フォントリズマブ: Fontolizumab:
フォントリズマブはHuZAF TMとしても知られている、IgG1イソタイプのヒト適合された抗−インターフェロン−γ(IFN−γ)モノクローナル抗体である。 Fontolizumab is also known as HuZAF TM, anti is human adaptation of IgG1 isotype - interferon -γ (IFN-γ) monoclonal antibody. フォントリズマブは、現在、クローン病のための治療処理剤として臨床学的に開発されている。 Fontolizumab is currently being clinically developed as therapeutic treatment for Crohn's disease. フォントリズマブの可変領域は、引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第6,329,511号に開示される。 The variable region of fontolizumab is disclosed in US Patent No. 6,329,511 which is incorporated herein by reference. ダクリズマブについて上記に記載されるように、フォントリズマブの血清半減期はまた、上記例1−4に記載される方法を用いて、図23(配列番号130−134)に示されるようなその定常領域配列を突然変異誘発することにより変更され得る。 As described above for daclizumab, serum half-life of fontolizumab also using the methods described in the above example 1-4, the steady-state as shown in FIG. 23 (SEQ ID NO: 130-134) It may be modified by mutagenesis region sequences.

ビシリズマブ: Visilizumab:
ビシリズマブは、Nuvion(商標)としても知られている、IgG2イソタイプのヒト適合された抗−CD3モノクローナル抗体である。 Visilizumab is also known as Nuvion (R), an anti -CD3 monoclonal antibody human adaptation of IgG2 isotype. ビシリズマブは、すべての成熟T細胞上で抗原−受容体複合体を形成するCD3分子を標的化する。 Visilizumab, all mature T cells on antigen - targeting CD3 molecules forming a receptor complex. ビシリズマブは現在、ステロイド抗療性潰瘍性大腸炎の処理剤として臨床学的に開発されている。 Visilizumab is currently being clinically developed as processing agent for steroid-refractory ulcerative colitis. ダクリズマブ及びフォントリズマブについて上記に記載されるように、ビシリズマブの血清半減期はまた、上記例1−4に記載される方法を用いて、図24(配列番号136−140)に示されるようなその定常領域配列を突然変異誘発することにより変更され得る。 For daclizumab and fontolizumab as described above, the serum half-life of visilizumab also using the methods described in the above example 1-4, as shown in FIG. 24 (SEQ ID NO: 136-140) It may be modified by inducing a mutation that constant region sequences.

M200: M200:
M200は、種々の増殖性障害に向けられる脈管形成インヒビター治療剤として現在、開発されているα5β1インテグリンに対して向けられたキメラIgG4抗体である。 M200 is a chimeric IgG4 antibody directed against α5β1 integrin currently being developed as angiogenesis inhibitors therapeutic agents directed to various proliferative disorders. ダクリズマブ、フォントリズマブ及びビシリズマブについて上記に記載されるように、M200の血清半減期はまた、上記例1−3に記載される方法を用いて、図25(配列番号142−146)に示されるようなその定常領域配列を突然変異誘発することにより変更され得る。 Daclizumab, about fontolizumab and visilizumab as described above, the serum half-life of M200 also using the methods described in the above example 1-3 is shown in FIG. 25 (SEQ ID NO: 142-146) the constant region sequences as may be modified by mutagenesis.

本発明は、現在好まれる実施形態を基準にして記載されてきたが、本発明の範囲内で種々の修飾を行うことができることを理解すべきである。 The present invention has been described with reference to the embodiment presently preferred, it should be understood that it is possible to make various modifications within the scope of the present invention.
全ての刊行物、特許、特許出願及びウェブサイトは、あたかも各々の個々の刊行物、特許、特許出願及びウェブサイトが特異的及び個別にその全体が参考として内含されているのと同じレベルで、その全体が参考として本明細書に内含されるものである。 All publications, patents, patent applications, and websites, as if each individual publication, patent, at the same level of the entire patent application and website specifically and individually are incorporated by reference , in which in its entirety is entailment herein by reference.

図1は、IgG分子の構造を例示する。 Figure 1 illustrates the structure of an IgG molecule. 図2は、IgG分子のサルベージ経路を示す。 Figure 2 shows the salvage pathway of IgG molecules. 図3Aは、重鎖の位置250、314及び428が強調されている状態での、OST577-IgG2M3及びOST577-IgG1のアミノ酸配列を示す。 3A is in a state where the position 250, 314 and 428 of the heavy chain is highlighted, shows the amino acid sequence of OST577-IgG2M3 and OST577-IgG1. 「OST577-VH」(配列番号1)は、OST577-IgG2M3又はOST577-IgG1の重鎖可変領域のアミノ酸配列を表わしている。 "OST577-VH" (SEQ ID NO: 1) represents the amino acid sequence of the heavy chain variable region of OST577-IgG2M3 or OST577-IgG1. 「IgG2M3-CH」(配列番号:2)は、OST577-IgG2M3の重鎖定常領域のアミノ酸配列を表わす。 "IgG2M3-CH" (SEQ ID NO: 2) depicts the amino acid sequence of the heavy chain constant region of OST577-IgG2M3. 「IgG1-CH」(配列番号3)は、OST577-IgG1の重鎖定常領域のアミノ酸配列を表わしている。 "IgG1-CH" (SEQ ID NO: 3) depicts the amino acid sequence of the heavy chain constant region of OST577-IgG1. 「OST577-VL」(配列番号4)は、OST577-IgG2M3又はOST577-IgG1の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表わしている。 "OST577-VL" (SEQ ID NO: 4) depicts the amino acid sequence of the light chain variable region of OST577-IgG2M3 or OST577-IgG1. 「LAMBDA2-CL」(配列番号5)は、OST577-LgG2M3又はOST577-IgG1の軽鎖定常領域のアミノ酸配列を表わす。 "Lambda 2-CL" (SEQ ID NO: 5) represents the amino acid sequence of the light chain constant region of OST577-LgG2M3 or OST577-IgG1. 図3B-1は、未修飾OST577-IgG2M3と比較した修飾されたOST577-IgG2M3の定常領域のアミノ酸配列(各々の開示されたアミノ酸配列の配列番号については表1を参照のこと)を示す。 Figure 3B-1 shows the amino acid sequence of the constant region of OST577-IgG2M3, which modified as compared to the unmodified OST577-IgG2M3 (See Table 1 for SEQ ID NO of each disclosed amino acid sequence). 図3B-2は、未修飾OST577-IgG2M3と比較した修飾されたOST577-IgG2M3の定常領域のアミノ酸配列(各々の開示されたアミノ酸配列の配列番号については表1を参照のこと)を示す。 Figure 3B-2 shows the amino acid sequence of the constant region of OST577-IgG2M3, which modified as compared to the unmodified OST577-IgG2M3 (See Table 1 for SEQ ID NO of each disclosed amino acid sequence). 図3B-3は、未修飾OST577-IgG2M3と比較した修飾されたOST577-IgG2M3の定常領域のアミノ酸配列(各々の開示されたアミノ酸配列の配列番号については表1を参照のこと)を示す。 Figure 3B-3 shows the amino acid sequence of the constant region of OST577-IgG2M3, which modified as compared to the unmodified OST577-IgG2M3 (See Table 1 for SEQ ID NO of each disclosed amino acid sequence). 図3B-4は、未修飾OST577-IgG2M3と比較した修飾されたOST577-IgG2M3の定常領域のアミノ酸配列(各々の開示されたアミノ酸配列の配列番号については表1を参照のこと)を示す。 Figure 3B-4 shows the amino acid sequence of the constant region of OST577-IgG2M3, which modified as compared to the unmodified OST577-IgG2M3 (See Table 1 for SEQ ID NO of each disclosed amino acid sequence). 図3B-5は、未修飾OST577-IgG2M3と比較した修飾されたOST577-IgG2M3の定常領域のアミノ酸配列(各々の開示されたアミノ酸配列の配列番号については表1を参照のこと)を示す。 Figure 3B-5 shows the amino acid sequence of the constant region of OST577-IgG2M3, which modified as compared to the unmodified OST577-IgG2M3 (See Table 1 for SEQ ID NO of each disclosed amino acid sequence). 図3B-6は、未修飾OST577-IgG2M3と比較した修飾されたOST577-IgG2M3の定常領域のアミノ酸配列(各々の開示されたアミノ酸配列の配列番号については表1を参照のこと)を示す。 Figure 3B-6 shows the amino acid sequence of the constant region of OST577-IgG2M3, which modified as compared to the unmodified OST577-IgG2M3 (See Table 1 for SEQ ID NO of each disclosed amino acid sequence). 図3Cは、未修飾OST577-IgG1と比較した修飾されたOST577-IgG1の定常領域のアミノ酸配列を示す。 Figure 3C shows the amino acid sequence of the constant region of OST577-IgG1 to modified compared to the unmodified OST577-IgG1. 図3Dは、重鎖の位置250、314及び428が強調された状態での、HulD10-IgG2M3及びHulD10-IgG1のアミノ酸配列を示す。 Figure 3D is in a state where the position 250, 314 and 428 of the heavy chain is emphasized, shows the amino acid sequence of Hu1D10-IgG2M3 and Hu1D10-IgG1. 「Hul10-VH」(配列番号6)は、HulD10-IgG2M3又はHulD10-IgG1の重鎖可変領域のアミノ酸配列を表わす。 "Hul10-VH" (SEQ ID NO: 6) represents the amino acid sequence of the heavy chain variable region of Hu1D10-IgG2M3 or Hu1D10-IgG1. 「IgG2M3-CH」(配列番号2)は、HulD10IgG2M3の重鎖定常領域のアミノ酸配列を表わす。 "IgG2M3-CH" (SEQ ID NO: 2) depicts the amino acid sequence of the heavy chain constant region of HulD10IgG2M3. 「IgGl-CH」(配列番号7)は、HulD10-IgG1の重鎖定常領域のアミノ酸配列を表わす。 "IgGl-CH" (SEQ ID NO: 7) depicts the amino acid sequence of the heavy chain constant region of Hu1D10-IgG1. 「HulD10-VL」(配列番号8)は、HulD10-IgG2M3又はHulD10-IgG1の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表わす。 "Hu1D10-VL" (SEQ ID NO: 8) represents the amino acid sequence of the light chain variable region of Hu1D10-IgG2M3 or Hu1D10-IgG1. 「KAPPA-CL」(配列番号9)は、HulD10-IgG2M3又はHulD10-IgG1の軽鎖定常領域のアミノ酸配列を表わしている。 "KAPPA-CL" (SEQ ID NO: 9) depicts the amino acid sequence of the light chain constant region of Hu1D10-IgG2M3 or Hu1D10-IgG1. 図3Eは、未修飾HulD10-IgG2M3と比較した修飾されたHulD10-IgG2M3の定常領域のアミノ酸配列を示す。 Figure 3E shows the amino acid sequence of the constant region of Hu1D10-IgG2M3, which modified as compared to the unmodified Hu1D10-IgG2M3. 図3Fは、未修飾HulD10-IgG1と比較した修飾されたHulD10-IgG1の定常領域のアミノ酸配列を示す。 Figure 3F shows the amino acid sequence of the constant region of Hu1D10-IgG1 which modified as compared to the unmodified Hu1D10-IgG1. 図3Gは、重鎖の位置250及び428が強調された状態での、Hu1D10−IgG3及びHu1D10−IgG4のアミノ酸配列を示す。 Figure 3G is, in a state where the position 250 and 428 of the heavy chain is emphasized, it shows the amino acid sequence of Hu1D10-IgG3 and Hu1D10-IgG4. “Hu1D10-VH”(配列番号6)は、HuID10−IgG3又はHu1D10−IgG4の重鎖可変領域のアミノ酸配列を表わす。 "Hu1D10-VH" (SEQ ID NO: 6) represents the amino acid sequence of the heavy chain variable region of HuID10-IgG3 or Hu1D10-IgG4. “IgG-CH”(配列番号113)は、Hu1D10−IgG3の重鎖定常領域のアミノ酸配列を表わす。 "IgG-CH" (SEQ ID NO: 113) represents the amino acid sequence of the heavy chain constant region of Hu1D10-IgG3. “IgG4-CH”(配列番号114)は、Hu1D10−IgG4の重鎖定常領域のアミノ酸配列を表わす。 "IgG4-CH" (SEQ ID NO: 114) represents the amino acid sequence of the heavy chain constant region of Hu1D10-IgG4. “Hu1D10-VL”(配列番号8)はHu1D10-IgG3又はHu1D10−IgG4の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表わす。 "Hu1D10-VL" (SEQ ID NO: 8) represents the amino acid sequence of the light chain variable region of Hu1D10-IgG3 or Hu1D10-IgG4. “KAPPA-CL”(配列番号9)は、Hu1D10-IgGM3又はHu1D10-IgG4の軽鎖定常領域のアミノ酸配列を表わしている。 "KAPPA-CL" (SEQ ID NO: 9) depicts the amino acid sequence of the light chain constant region of Hu1D10-IgGM3 or Hu1D10-IgG4. 図3Hは、未修飾HulD10-IgG3と比較したM428LHulD10-IgG3変異体(配列番号115)の定常領域のアミノ酸配列を示す。 Figure 3H shows the amino acid sequence of the constant region of M428LHulD10-IgG3 mutants compared to unmodified Hu1D10-IgG3 (SEQ ID NO: 115). 図3Iは、未修飾HulD10-IgG4と比較したM428LHulD10-IgG4変異体(配列番号116)及びT250Q/M428LHulD10-IgG4(配列番号117)の定常領域のアミノ酸配列を示す。 Figure 3I shows the amino acid sequence of the constant region of M428LHulD10-IgG4 mutants compared to unmodified Hu1D10-IgG4 (SEQ ID NO: 116) and T250Q / M428LHulD10-IgG4 (SEQ ID NO: 117). 図4は、オーバーラップ・エクステンションPCR方法を例示する。 Figure 4 illustrates the overlap-extension PCR method. 図5Aは、重鎖ベクターpVAg 2M3-OST577の制限地図を示す。 Figure 5A shows a restriction map of the heavy chain vector pVAg 2M3-OST577. 図5Bは、重鎖ベクターpVAgl.N-OST577の制限地図を示す。 Figure 5B shows the restriction map of the heavy chain vector pVAgl.N-OST577. 図6は、軽鎖ベクターpVAλ2-OST577の制限地図を示す。 Figure 6 shows a restriction map of light chain vector pVAλ2-OST577. 図7Aは、重鎖ベクターpVAg2M3-HulD10の制限地図を示す。 Figure 7A shows a restriction map of the heavy chain vector pVAg2M3-Hu1D10. 図7Bは、重鎖ベクターpVAgl.N-HulD10の制限地図を示す。 Figure 7B shows a restriction map of the heavy chain vector pVAgl.N-HulD10. 図7Cは、重鎖ベクターpHuHCg3.Tt.D-Hu1D10の制限地図を示す。 Figure 7C shows a restriction map of the heavy chain vector pHuHCg3.Tt.D-Hu1D10. 図7Dは、重鎖ベクターpHuHCg4.Tt.D-Hu1D10の制限地図を示す。 Figure 7D shows a restriction map of the heavy chain vector pHuHCg4.Tt.D-Hu1D10. 図8は、軽鎖ベクターpVk-HulD10の制限地図を示す。 Figure 8 shows a restriction map of light chain vector pVk-Hu1D10. 図9Aは、ヒトFcRnベクターpDL208の制限地図を示す。 Figure 9A shows the restriction map of human FcRn Vector pDL208. 図9Bは、アカゲザルFcRnベクターpDL410の制限地図を示す。 Figure 9B shows a restriction map of rhesus FcRn Vector PDL410. 図10Aは、OST577-IgG2M3野生型及び突然変異体抗体のSDS-PAGE分析を示す。 Figure 10A shows SDS-PAGE analysis of OST577-IgG2M3 wild-type and mutant antibodies. 精製済みOST577-IgG2M3野生型及び突然変異体抗体は、例5で記述されているように、還元条件下でSDS-PAGEにより分析された。 Purified OST577-IgG2M3 wild-type and mutant antibodies, as described in Example 5, were analyzed by SDS-PAGE under reducing conditions. 図10Bは、OST577-IgG1野生型及び突然変異体抗体のSDS-PAGE分析を示す。 Figure 10B shows the SDS-PAGE analysis of the OST577-IgG1 wild-type and mutant antibodies. 精製済みOST577-IgG1野生型及び突然変異体抗体は、例5で記述されているように、還元条件下でSDS-PAGEにより分析された。 Purified OST577-IgG1 wild-type and mutant antibodies, as described in Example 5, were analyzed by SDS-PAGE under reducing conditions. 図11Aは、ヒトFcRnに対するOST577-IgG2M3の位置250のさまざまな突然変異体の単一点比較結合検定を示す。 11A shows a single-point comparison binding assays of various mutants position 250 of OST577-IgG2M3 to human FcRn. pH6.0でのFBB中の野生型又は位置250突然変異体 OST577-IgG2M3競争的抗体の存在下でのトランスフェクションを受けたNS0細胞上のヒトFcRnに対するビオチニル化されたOST577-IgG2M3抗体の結合は、例6で記述されているように、ストレプトアビジン接合されたRPEで検出され、フローサイトメトリにより分析された。 Binding of OST577-IgG2M3 antibody biotinylated to human FcRn on NS0 cells transfected in the presence of wild-type or position 250 mutant OST577-IgG2M3 competitive antibody in FBB, at pH6.0 is , as described in example 6, was detected with streptavidin-conjugated RPE, were analyzed by flow cytometry. 図11Bは、ヒトFcRnに対するOST577-IgG2M3の位置314のさまざまな突然変異体の単一点比較結合検定を示す。 Figure 11B shows a single-point comparison binding assays of various mutants position 314 of OST577-IgG2M3 to human FcRn. pH6.0でのFBB中の野生型又は位置314突然変異体OST577-IgG2M3競争的抗体の存在下でのトランスフェクションを受けたNS0細胞上のヒトFcRnに対するビオチニル化されたOST577-IgG2M3抗体の結合は、例6で記述されているように、ストレプトアビジン接合されたRPEで検出され、フローサイトメトリにより分析された。 Binding of OST577-IgG2M3 antibody biotinylated to human FcRn on NS0 cells transfected in the presence of wild-type or position 314 mutant OST577-IgG2M3 competitive antibody in FBB, at pH6.0 is , as described in example 6, was detected with streptavidin-conjugated RPE, were analyzed by flow cytometry. 図11Cは、ヒトFcRnに対するOST577-IgG2M3の位置428のさまざまな突然変異体の単一点比較結合検定を示す。 Figure 11C illustrates a single-point comparison binding assays of various mutants position 428 of OST577-IgG2M3 to human FcRn. pH6.0でのFBB中の野生型又は位置428突然変異体OST577-IgG2M3競争的抗体の存在下でのトランスフェクションを受けたNS0細胞上のヒトFcRnに対するビオチニル化されたOST577-IgG2M3抗体の結合は、例6で記述されているように、ストレプトアビジン接合されたRPEで検出され、フローサイトメトリにより分析された。 Binding of OST577-IgG2M3 antibody biotinylated to human FcRn on NS0 cells transfected in the presence of wild-type or position 428 mutant OST577-IgG2M3 competitive antibody in FBB, at pH6.0 is , as described in example 6, was detected with streptavidin-conjugated RPE, were analyzed by flow cytometry. 図12Aは、ヒトFcRnに対するOST577-IgG2M3野生型及び突然変異体抗体の競合的結合検定を示す。 Figure 12A shows a competitive binding assay OST577-IgG2M3 wild-type and mutant antibodies to human FcRn. pH6.0でのFBB中の増大する濃度の野生型又は突然変異体OST577-IgG2M3競争的抗体の存在下でのトランスフェクションを受けたNS0細胞上のヒトFcRnに対するビオチニル化されたHuEP5C7-IgG2M3抗体の結合は、例6で記述されているように、ストレプトアビジン接合されたRPEで検出され、フローサイトメトリにより分析された。 Of HuEP5C7-IgG2M3 antibody biotinylated for increasing human FcRn on NS0 cells transfected in the presence of wild-type or mutant OST577-IgG2M3 competitive antibody concentrations in FBB, at pH6.0 binding, as described in example 6, it was detected with streptavidin-conjugated RPE, were analyzed by flow cytometry. 図12Bは、ヒトFcRnに対するOST577-IgG2M3野生型及び突然変異体抗体の競合的結合検定を示す。 12B shows the competitive binding assay of OST577-IgG2M3 wild-type and mutant antibodies to human FcRn. pH6.0でのFBB中の増大する濃度の野生型又は突然変異体OST577-IgG2M3競争的抗体の存在下でのトランスフェクションを受けたNS0細胞上のヒトFcRnに対するビオチニル化されたOST577-IgG2M3抗体の結合は、例6で記述されているように、ストレプトアビジン接合されたRPEで検出され、フローサイトメトリにより分析された。 Of OST577-IgG2M3 antibody biotinylated for increasing human FcRn on NS0 cells transfected in the presence of wild-type or mutant OST577-IgG2M3 competitive antibody concentrations in FBB, at pH6.0 binding, as described in example 6, it was detected with streptavidin-conjugated RPE, were analyzed by flow cytometry. 図13は、ヒトFcRnでのトランスフェクションを受けた細胞対トランスフェクションを受けていない細胞に対する抗体結合を示す。 Figure 13 shows the antibody binding to cells that have not been received cell to transfect transfection with human FcRn. pH6.0でのトランスフェクションを受けたNS0細胞上のヒトFcRn又はトランスフェクションを受けていないNS0細胞に対する野生型又は突然変異体OST577-IgG2M3の結合は、例7で記述されているように、フローサイトメトリにより分析された。 Binding of wild-type or mutant OST577-IgG2M3 to human FcRn or NS0 cells that have not been transfected on NS0 cells transfected with pH6.0, as described in Example 7, the flow It was analyzed by cytometry. 図14は、37℃でのヒトFcRnに対するOST577-IgG2M3野生型及び突然変異体抗体の競合的結合検定を示す。 Figure 14 shows a competitive binding assay OST577-IgG2M3 wild-type and mutant antibodies to human FcRn at 37 ° C.. pH6.0でのFBB中の増大する濃度の野生型又は突然変異体OST577-IgG2M3競争的抗体の存在下でのトランスフェクションを受けたNS0細胞上のヒトFcRnに対するビオチニル化されたHuEP5C7-IgG2M3抗体の結合は、例7で記述されているように、ストレプトアビジン接合されたRPEで検出され、フローサイトメトリにより分析された。 Of HuEP5C7-IgG2M3 antibody biotinylated for increasing human FcRn on NS0 cells transfected in the presence of wild-type or mutant OST577-IgG2M3 competitive antibody concentrations in FBB, at pH6.0 binding, as described in example 7, it was detected with streptavidin-conjugated RPE, were analyzed by flow cytometry. 全てのインキュベーションは37℃で行われた。 All incubations were performed at 37 ° C.. 図15Aは、ヒトFcRnに対するOST577-IgG2M3野生型及び突然変異体抗体のpH依存性結合及び放出を示す。 Figure 15A shows the pH-dependent binding and release of OST577-IgG2M3 wild-type and mutant antibodies to human FcRn. pH6.0、6.5、7.0、7.5又は8.0でのFBB中のトランスフェクションを受けたNS0細胞上のヒトFcRnに対する野生型又は突然変異体OST577-IgG2M3抗体の結合及び放出が例7で記述された通りのフローサイトメトリにより分析された。 As binding and release of the wild-type or mutant OST577-IgG2M3 antibody is described in Example 7 to human FcRn on NS0 cells transfected in FBB, at pH6.0,6.5,7.0,7.5 or 8.0 It was analyzed by flow cytometry. 図15Bは、ヒトFcRnに対するOST577-IgG1野生型及び突然変異体抗体のpH依存性結合及び放出を示す。 Figure 15B shows the pH-dependent binding and release of OST577-IgG1 wild-type and mutant antibodies to human FcRn. pH6.0、6.5、7.0、7.5又は8.0でのFBB中のトランスフェクションを受けたNS0細胞上のヒトFcRnに対する野生型又は突然変異体OST577-IgG1抗体の結合及び放出が例7で記述された通りのフローサイトメトリにより分析された。 As binding and release of the wild-type or mutant OST577-IgG1 antibodies is described in Example 7 to human FcRn on NS0 cells transfected in FBB, at pH6.0,6.5,7.0,7.5 or 8.0 It was analyzed by flow cytometry. 図15Cは、ヒトFcRnに対するOST577-IgG1野生型及び突然変異体抗体のpH依存性結合及び放出を示す。 Figure 15C shows the pH-dependent binding and release of OST577-IgG1 wild-type and mutant antibodies to human FcRn. pH6.0、6.5、7.0、7.5又は8.0でのFBB中のトランスフェクションを受けたNS0細胞上のヒトFcRnに対する野生型又は突然変異体OST577-IgG1抗体の結合及び放出が例7で記述された通りのフローサイトメトリにより分析された。 As binding and release of the wild-type or mutant OST577-IgG1 antibodies is described in Example 7 to human FcRn on NS0 cells transfected in FBB, at pH6.0,6.5,7.0,7.5 or 8.0 It was analyzed by flow cytometry. 図15Dは、アカゲザルFcRnに対するOST577-IgG2M3野生型及び突然変異体抗体のpH依存性結合及び放出を示す。 Figure 15D shows the pH-dependent binding and release of OST577-IgG2M3 wild-type and mutant antibodies to rhesus FcRn. pH6.0、6.5、7.0、7.5又は8.0でのFBB中のトランスフェクションを受けたNS0細胞上のアカゲザルFcRnに対する野生型又は突然変異体OST577-IgG2M3抗体の結合及び放出が例7で記述された通りのフローサイトメトリにより分析された。 As binding and release of the wild-type or mutant OST577-IgG2M3 antibody is described in Example 7 to rhesus FcRn on NS0 cells transfected in FBB, at pH6.0,6.5,7.0,7.5 or 8.0 It was analyzed by flow cytometry. 図15Eは、アカゲザルFcRnに対するOST577-IgG1野生型及び突然変異体抗体のpH依存性結合及び放出を示す。 Figure 15E shows the pH-dependent binding and release of OST577-IgG1 wild-type and mutant antibodies to rhesus FcRn. pH6.0、6.5、7.0、7.5又は8.0でのFBB中のトランスフェクションを受けたNS0細胞上のアカゲザルFcRnに対する野生型又は突然変異体OST577-IgG1抗体の結合及び放出が例7で記述された通りのフローサイトメトリにより分析された。 As binding and release of the wild-type or mutant OST577-IgG1 antibodies is described in Example 7 to rhesus FcRn on NS0 cells transfected in FBB, at pH6.0,6.5,7.0,7.5 or 8.0 It was analyzed by flow cytometry. 図16Aは、HBsAgに対するOST577-IgG2M3野生型及び突然変異体抗体の競合的結合検定を示す。 Figure 16A shows a competitive binding assay OST577-IgG2M3 wild-type and mutant antibodies against HBsAg. HBsAgに対する野生型又は突然変異体 OST577-IgG2M3抗体の結合は、例8に記述されている通り、ELISA競合において分析された。 Binding of wild-type or mutant OST577-IgG2M3 antibodies to HBsAg, as described in Example 8, it was analyzed in an ELISA competition. 図16Bは、HBsAgに対するOST577-IgG1野生型及び突然変異体抗体の競合的結合検定を示す。 Figure 16B shows the competitive binding assay of OST577-IgG1 wild-type and mutant antibodies against HBsAg. HBsAgに対する野生型又は突然変異体OST577-IgG1抗体の結合は、例8に記述されている通り、ELISA競合において分析された。 Binding of wild-type or mutant OST577-IgG1 antibodies to HBsAg, as described in Example 8, it was analyzed in an ELISA competition. 図17Aは、HLA-DR β鎖対立遺伝子に対するHulD10-IgG2M3野生型及び突然変異体抗体の結合検定を示す。 Figure 17A shows binding assay of Hu1D10-IgG2M3 wild-type and mutant antibodies against HLA-DR beta chain alleles. ラージ細胞に対する野生型又は突然変異体HulD10-IgG2M3抗体の結合は、例8に記述されている通り、FACS結合検定において分析された。 Binding of wild-type or mutant Hu1D10-IgG2M3 antibodies to Raji cells, as described in Example 8, it was analyzed in a FACS binding assay. 図17Bは、HLA-DR β鎖対立遺伝子に対するHulD10-IgG1野生型及び突然変異体抗体の結合検定を示す。 Figure 17B shows the HLA-DR beta chain alleles Hu1D10-IgG1 binding assay of wild-type and mutant antibodies against. ラージ細胞に対する野生型又は突然変異体HulD10-IgG1抗体の結合は、例8に記述されている通り、FACS結合検定において分析された。 Binding of wild-type or mutant Hu1D10-IgG1 antibodies to Raji cells, as described in Example 8, it was analyzed in a FACS binding assay. 図18Aは、158V/V供与体からのPBMCを用いたHulD10-IgG1及びHulD10-IgG2M3野生型及び突然変異体抗体のADCC検定を示す。 Figure 18A shows the Hu1D10-IgG1 and Hu1D10-IgG2M3 ADCC assay of the wild-type and mutant antibodies using PBMC from 158V / V donor. ラージ細胞上の野生型又は突然変異体 HulD10-IgG1及びHulD10-IgG2M3のADCC活性は、例8に記述されている通りに、同型接合158V/V FcγRIII対立遺伝子を担持する供与体から単離されたPBMCを用いて決定された。 Wild-type or ADCC activity of the mutant Hu1D10-IgG1 and Hu1D10-IgG2M3 on Raji cells is as described in Example 8 was isolated from donor carrying homozygous 158V / V Fc [gamma] RIII alleles It was determined using PBMC. 図18Bは、158F/F供与体からのPBMCを用いたHulD10-IgG1及びHulD10-IgG2M3野生型及び突然変異体抗体のADCC検定を示す。 Figure 18B shows the Hu1D10-IgG1 and Hu1D10-IgG2M3 ADCC assay of the wild-type and mutant antibodies using PBMC from 158F / F donor. ラージ細胞上の野生型又は突然変異体 HulD10-IgG1及びHulD10-IgG2M3のADCC活性は、例8に記述されている通りに、同型接合158F/F FcγRIII対立遺伝子を担持する供与体から単離されたPBMCを用いて決定された。 Wild-type or ADCC activity of the mutant Hu1D10-IgG1 and Hu1D10-IgG2M3 on Raji cells is as described in Example 8 was isolated from donor carrying homozygous 158F / F Fc [gamma] RIII alleles It was determined using PBMC. 図19は、アカゲマカクザルにおけるOST577-IgG2M3野生型及び変異体抗体の薬物動態学を示す。 Figure 19 shows the OST577-IgG2M3 pharmacokinetics of wild-type and variant antibodies in Akagemakakuzaru. 4匹のアカゲマカクザルのグループに対して1mg/kgの用量で輸液により投与されたOST577-IgG2M3野生型及び変異体抗体の観察されモデリングされた平均血清濃度(μg/ml)及び標準偏差は、例9に記述されている通りに、時間(輸液後の日数)を関数としてプロットされた。 Four mean serum concentration (μg / ml) and standard deviation observed modeling OST577-IgG2M3 wild-type and mutant antibodies administered by infusion at a dose of 1 mg / kg to a group of Akagemakakuzaru of example as described in 9, it plotted time (days after infusion) as a function. 図20は、アカゲマカクザルにおけるOST577−IgG1の野生型及び変異体抗体の薬物動力学を示す。 Figure 20 shows wild-type and pharmacokinetics of variant antibody of OST577-IgG1 in Akagemakakuzaru. 4匹のアカゲマカクザルのグループに対して1mg/kgの用量で輪液により投与されたOST577-IgG1野生型及び変異体抗体の観察されるモデリングされた平均血清濃度(μg/ml)及び標準偏差は、例10に記述されている通りに、時間(輪液後の日数)を関するとしてプロットされた。 Four of the average serum concentration (μg / ml) and standard deviation modeled is observed administered OST577-IgG1 wild-type and mutant antibodies by wheel hydraulic at a dose of 1 mg / kg to a group of Akagemakakuzaru is , as described in example 10, plotted as concerns the time (number of days after wheel hydraulic). 図21Aは、ヒトFcRnに対するHu1D10-IgG3野生型及び変異体抗体のpH−依存性結合及び放出を示す。 Figure 21A shows a pH- dependent binding and release of Hu1D10-IgG3 wild-type and mutant antibodies to human FcRn. pH6.0, 6.5, 7.0, 7.5又は8.0で、FBBにおけるトランスフェクトされたNSO細胞上でのヒトFcRnに対するHu1D10-IgG3野生型及び変異体抗体のpH−依存性結合及び放出が、例11に記載のようにして流動細胞計測法により分析された。 pH6.0, 6.5, 7.0, 7.5 or 8.0, pH-dependent binding and release of Hu1D10-IgG3 wild-type and mutant antibodies to human FcRn on NSO cells transfected in FBB, described in Example 11 as it analyzed by flow cytometry. 図21Bは、ヒトFcRnに対するHu1D10-IgG4野生型及び変異体抗体のpH−依存性結合及び放出を示す。 Figure 21B shows a pH- dependent binding and release of Hu1D10-IgG4 Wild-type and variant antibodies to human FcRn. pH6.0, 6.5, 7.0, 7.5又は8.0で、FBBにおけるトランスフェクトされたNSO細胞上でのヒトFcRnに対するHu1D10-IgG4野生型及び変異体抗体のpH−依存性結合及び放出が、例11に記載のようにして流動細胞計測法により分析された。 pH6.0, 6.5, 7.0, 7.5 or 8.0, pH-dependent binding and release of Hu1D10-IgG4 Wild-type and variant antibodies to human FcRn on NSO cells transfected in FBB, described in Example 11 as it analyzed by flow cytometry. 図21Cは、アカゲザルFcRnに対するHu1D10-IgG3野生型及び変異体抗体のpH−依存性結合及び放出を示す。 Figure 21C shows a pH- dependent binding and release of Hu1D10-IgG3 wild-type and mutant antibodies to rhesus FcRn. pH6.0, 6.5, 7.0, 7.5又は8.0で、FBBにおけるトランスフェクトされたNSO細胞上でのアカゲザルFcRnに対するHu1D10-IgG3野生型及び変異体抗体のpH−依存性結合及び放出が、例11に記載のようにして流動細胞計測法により分析された。 pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 or 8.0, is pH- dependent binding and release of Hu1D10-IgG3 wild-type and mutant antibodies to rhesus FcRn on NSO cells transfected in FBB, described in Example 11 as it analyzed by flow cytometry. 図21Dは、アカゲザルFcRnに対するHu1D10-IgG4野生型及び変異体抗体のpH−依存性結合及び放出を示す。 Figure 21D shows a pH- dependent binding and release of Hu1D10-IgG4 Wild-type and variant antibodies to rhesus FcRn. pH6.0, 6.5, 7.0, 7.5又は8.0で、FBBにおけるトランスフェクトされたNSO細胞上でのアカゲザルFcRnに対するHu1D10-IgG4野生型及び変異体抗体のpH−依存性結合及び放出が、例11に記載のようにして流動細胞計測法により分析された。 pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 or 8.0, is pH- dependent binding and release of Hu1D10-IgG4 Wild-type and variant antibodies to rhesus FcRn on NSO cells transfected in FBB, described in Example 11 as it analyzed by flow cytometry. 図22-1は、種々のFcRn結合突然変異を有するダクリズマブのアミノ酸配列を示す。 Figure 22-1 shows the amino acid sequence of daclizumab with various FcRn binding mutations. 図22-2は、種々のFcRn結合突然変異を有するダクリズマブのアミノ酸配列を示す。 Figure 22-2 shows the amino acid sequence of daclizumab with various FcRn binding mutations. 図23は、種々のFcRn結合突然変異を有するフォントリズマブのアミノ酸配列を示す。 Figure 23 shows the amino acid sequence of fontolizumab having various FcRn binding mutations. 図24は、種々のFcRn結合突然変異を有するビシリズマブのアミノ酸配列を示す。 Figure 24 shows the amino acid sequence of visilizumab with various FcRn binding mutations. 図25は、種々のFcRn結合突然変異を有するM200のアミノ酸配列を示す。 Figure 25 shows the M200 amino acid sequence of which has a different FcRn binding mutations.

Claims (27)

  1. アミノ酸残基250、314及び428から成るグループの中から選択された重鎖定常領域由来の少なくとも1つのアミノ酸残基が未修飾IgGクラス抗体の中に存在するものと異なっており、未修飾抗体のものとの関係において改変されたFcRn結合親和力及び/又は血清半減期を有する、IgGクラスの修飾された抗体。 At least one amino acid residue from the heavy chain constant region selected from the group consisting of amino acid residues 250, 314 and 428 are different from that present in the unmodified class IgG antibody, the unmodified antibody FcRn binding affinity is altered in relation to the objects and / or has a serum half-life, the modified antibodies of the IgG class.
  2. 前記未修飾IgGクラス抗体が、ダクリズマブ(daclizumab)、フォントリズマブ(fontolizumab)、ビシリズマブ(visilizumab)及びM200から成る群から選択される、請求項1に記載の修飾された抗体。 The unmodified IgG class antibody, daclizumab (daclizumab), fontolizumab (fontolizumab), is selected from the group consisting of visilizumab (visilizumab) and M200, modified antibody of claim 1.
  3. アミノ酸残基250、314及び428から成る群から選択された重鎖定常領域からの少なくとも1つのアミノ酸残基が、天然に存在するIgGクラス抗体に存在するものと異なっている、天然に存在するIgGクラス抗体のものと実質的に同一の定常領域を有する抗体であって、前記抗体のFcRn結合親和性力及び/又は血清半減期が前記天然に存在する抗体との関係において変更されている抗体。 IgG in which at least one amino acid residue is present are different from those present in the IgG class naturally occurring antibodies, naturally from the heavy chain constant region selected from the group consisting of amino acid residues 250, 314 and 428 class antibody ones and a substantially antibody having the same constant region, antibodies that FcRn binding affinity forces, and / or serum half-life of the antibody is modified in relation to the antibodies present in the nature.
  4. 前記天然に存在するIgGクラス抗体が、ダクリズマブ、フォントリズマブ、ビシリズマブ及びM200から成る群から選択される、請求項3に記載の修飾された抗体。 IgG class antibodies present in the naturally occurring, daclizumab, fontolizumab, is selected from the group consisting of visilizumab and M200, modified antibody of claim 3.
  5. (a) 重鎖定常領域由来の前記アミノ酸残基250がグルタミン酸又はグルタミンである; 又は(b) 重鎖定常領域由来の前記アミノ酸残基428がフェニルアラニン又はロイシンである; (A) said amino acid residue 250 from the heavy chain constant region is glutamic acid or glutamine; or (b) said amino acid residue 428 from the heavy chain constant region is phenylalanine or leucine;
    請求項3に記載の抗体。 The antibody of claim 3.
  6. 重鎖定常領域由来のアミノ酸残基250がグルタミンである、請求項3に記載の抗体。 Amino acid residue 250 from the heavy chain constant region is glutamine, antibody of claim 3.
  7. 重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428がロイシンである、請求項3に記載の抗体。 Amino acid residue 428 from the heavy chain constant region is leucine antibody of claim 3.
  8. (a) 重鎖定常領域由来の前記アミノ酸残基250がグルタミン酸であり、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428がフェニルアラニンである; (A) said amino acid residue 250 from the heavy chain constant region is glutamic acid and amino acid residue 428 from the heavy chain constant region is phenylalanine;
    (b) 重鎖定常領域由来の前記アミノ酸残基250がグルタミンであり、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428がフェニルアラニンである;又は (c) 重鎖定常領域由来の前記アミノ酸残基250がグルタミンであり、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428がロイシンである、 (B) said amino acid residue 250 from the heavy chain constant region is glutamine and amino acid residue 428 from the heavy chain constant region is phenylalanine; or (c) said amino acid residue 250 from the heavy chain constant region glutamine and amino acid residue 428 from the heavy chain constant region is leucine,
    請求項3に記載の抗体。 The antibody of claim 3.
  9. 対応する未修飾IgGクラス抗体のものよりも少なくとも約1.3倍長いin vivo除去半減期をもつIgGクラスの修飾された治療用抗体。 The corresponding unmodified class IgG antibody at least about 1.3 times longer in vivo modified therapeutic antibody of class IgG with an elimination half-life than that of.
  10. 残基250、314及び428から成るグループの中から選択された重鎖定常領域由来の少なくとも1つのアミノ酸残基が、未修飾抗体の中に存在するものと異なっている、請求項9に記載のIgGクラスの修飾された治療用抗体。 At least one amino acid residue from the heavy chain constant region selected from the group consisting of residues 250, 314 and 428 is different from that present in the unmodified antibody, as claimed in claim 9 modified therapeutic antibody of the IgG class.
  11. 前記抗体が、ダクリズマブ、フォントリズマブ、ビシリズマブ及びM200から成る群から選択される、請求項9記載のIgGクラスの修飾された治療用抗体。 Wherein said antibody, daclizumab, fontolizumab, is selected from the group consisting of visilizumab and M200, claim 9, wherein the IgG class modified therapeutic antibody of.
  12. (a) 重鎖定常領域由来の前記アミノ酸残基250がグルタミン酸であり、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428がフェニルアラニンである; (A) said amino acid residue 250 from the heavy chain constant region is glutamic acid and amino acid residue 428 from the heavy chain constant region is phenylalanine;
    (b) 重鎖定常領域由来の前記アミノ酸残基250がグルタミンであり、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428がフェニルアラニンである;又は (c) 重鎖定常領域由来の前記アミノ酸残基250がグルタミンであり、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基428がロイシンである、 (B) said amino acid residue 250 from the heavy chain constant region is glutamine and amino acid residue 428 from the heavy chain constant region is phenylalanine; or (c) said amino acid residue 250 from the heavy chain constant region glutamine and amino acid residue 428 from the heavy chain constant region is leucine,
    請求項9に記載のIgGクラスの修飾された治療用抗体。 Modified therapeutic antibody of class IgG of Claim 9.
  13. 対応する未修飾IgGクラス抗体のものよりも少なくとも約1.3倍低いin vivoクリアランス期をもつIgGクラスの修飾された治療用抗体。 The corresponding unmodified class IgG at least about 1.3-fold lower in vivo clearance phase modified therapeutic antibody of class IgG with an than antibodies.
  14. 残基250、314及び428から成るグループの中から選択された重鎖定常領域由来のアミノ酸残基の少なくとも1つが、未修飾IgGクラス抗体の中に存在するものと異なっている、請求項13に記載のIgGクラスの修飾された治療用抗体。 At least one of amino acid residues from the selected heavy chain constant region from the group consisting of residues 250, 314 and 428, are different from those present in the unmodified class IgG antibody, to claim 13 modified therapeutic antibody of the IgG class according.
  15. 前記抗体が、ダクリズマブ、フォントリズマブ、ビシリズマブ及びM200から成る群から選択される、請求項13記載のIgGクラスの修飾された治療用抗体。 Wherein said antibody, daclizumab, fontolizumab, is selected from the group consisting of visilizumab and M200, modified therapeutic antibody of class IgG of Claim 13, wherein.
  16. 配列番号118の軽鎖アミノ酸配列、及び配列番号119−128から選択された重鎖アミノ酸配列を含んで成る修飾された治療用抗体。 Light chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 118, and modified therapeutic antibody comprising a heavy chain amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 119-128.
  17. 請求項16記載の軽鎖又は重鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含んで成るベクター。 Vector comprising a polynucleotide encoding the light chain or the heavy chain amino acid sequence of claim 16, wherein.
  18. 請求項16記載のベクターを含んで成る宿主細胞。 Host cell comprising the vector of claim 16, wherein.
  19. 配列番号129の軽鎖アミノ酸配列、及び配列番号130−134から選択された重鎖アミノ酸配列を含んで成る修飾された治療用抗体。 Light chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 129, and modified therapeutic antibody comprising a heavy chain amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 130-134.
  20. 請求項19記載の軽鎖又は重鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含んで成るベクター。 Vector comprising a polynucleotide encoding the light chain or the heavy chain amino acid sequence of claim 19, wherein.
  21. 請求項19記載のベクターを含んで成る宿主細胞。 Host cell comprising the vector of claim 19, wherein.
  22. 配列番号135の軽鎖アミノ酸配列、及び配列番号136−140から選択された重鎖アミノ酸配列を含んで成る修飾された治療用抗体。 Light chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 135, and modified therapeutic antibody comprising a heavy chain amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 136-140.
  23. 請求項22記載の軽鎖又は重鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含んで成るベクター。 Vector comprising a polynucleotide encoding the light chain or the heavy chain amino acid sequence of claim 22, wherein.
  24. 請求項22記載のベクターを含んで成る宿主細胞。 Host cell comprising the vector of claim 22, wherein.
  25. 配列番号141の軽鎖アミノ酸配列、及び配列番号142−146から選択された重鎖アミノ酸配列を含んで成る修飾された治療用抗体。 Light chain amino acid sequences, and modified therapeutic antibody comprising a heavy chain amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 142-146 in SEQ ID NO: 141.
  26. 請求項25記載の軽鎖又は重鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含んで成るベクター。 Vector comprising a polynucleotide encoding the claims 25 light chain or the heavy chain amino acid sequence as set forth.
  27. 請求項25記載のベクターを含んで成る宿主細胞。 Host cell comprising the vector of claim 25, wherein.
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010123012A1 (en) * 2009-04-20 2010-10-28 協和発酵キリン株式会社 Antibody containing igg2 having amino acid mutation introduced therein
JP2011173918A (en) * 2009-03-19 2011-09-08 Chugai Pharmaceut Co Ltd Pharmaceutical formulation containing improved antibody molecule
JP2013520166A (en) * 2010-02-18 2013-06-06 トランステック ファーマ,インコーポレイティド Rage fusion proteins and methods of use thereof
US8562991B2 (en) 2008-09-26 2013-10-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody molecules that bind to IL-6 receptor
JP2015520615A (en) * 2012-05-23 2015-07-23 ジェネンテック, インコーポレイテッド Selection method of the therapeutic agent

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
JPH11506310A (en) * 1995-03-01 1999-06-08 アイオワ イミュノセラピー インベスティゲイターズ Effective bispecific antibodies in the treatment of B cell lymphoma and cell lines
JP2000507816A (en) * 1996-03-18 2000-06-27 ボード オブ リージェンツ,ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム Immunoglobulin-like domain having an increased half-life
US6329511B1 (en) * 1998-12-01 2001-12-11 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies to γ-interferon
WO2002060919A2 (en) * 2000-12-12 2002-08-08 Medimmune, Inc. Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
JP2002530108A (en) * 1998-11-24 2002-09-17 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション Humanized monoclonal antibody
JP2003512019A (en) * 1999-01-15 2003-04-02 ジェネンテック・インコーポレーテッド Polypeptide variants with altered effector function

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5834597A (en) 1996-05-20 1998-11-10 Protein Design Labs, Inc. Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
JPH11506310A (en) * 1995-03-01 1999-06-08 アイオワ イミュノセラピー インベスティゲイターズ Effective bispecific antibodies in the treatment of B cell lymphoma and cell lines
JP2000507816A (en) * 1996-03-18 2000-06-27 ボード オブ リージェンツ,ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム Immunoglobulin-like domain having an increased half-life
JP2002530108A (en) * 1998-11-24 2002-09-17 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション Humanized monoclonal antibody
US6329511B1 (en) * 1998-12-01 2001-12-11 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies to γ-interferon
JP2003512019A (en) * 1999-01-15 2003-04-02 ジェネンテック・インコーポレーテッド Polypeptide variants with altered effector function
WO2002060919A2 (en) * 2000-12-12 2002-08-08 Medimmune, Inc. Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8562991B2 (en) 2008-09-26 2013-10-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody molecules that bind to IL-6 receptor
JP2011173918A (en) * 2009-03-19 2011-09-08 Chugai Pharmaceut Co Ltd Pharmaceutical formulation containing improved antibody molecule
JP2012504106A (en) * 2009-03-19 2012-02-16 中外製薬株式会社 Formulations containing an improved antibody molecules
WO2010123012A1 (en) * 2009-04-20 2010-10-28 協和発酵キリン株式会社 Antibody containing igg2 having amino acid mutation introduced therein
US9587031B2 (en) 2009-04-20 2017-03-07 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd DNA encoding an anti-CD40 IgG2 antibody having amino acid mutations
JP5694921B2 (en) * 2009-04-20 2015-04-01 協和発酵キリン株式会社 Antibodies having a IgG2 that amino acid mutation has been introduced
JP2015146805A (en) * 2009-04-20 2015-08-20 協和発酵キリン株式会社 ANTIBODY CONTAINING IgG2 HAVING AMINO ACID MUTATION INTRODUCED THEREIN
US9234044B2 (en) 2009-04-20 2016-01-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Agonistic anti-CD40 IGG2 antibodies having amino acid mutations introduced therein
JP2013520166A (en) * 2010-02-18 2013-06-06 トランステック ファーマ,インコーポレイティド Rage fusion proteins and methods of use thereof
JP2015520615A (en) * 2012-05-23 2015-07-23 ジェネンテック, インコーポレイテッド Selection method of the therapeutic agent

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