JP2007504807A - 培養培地にプロスタグランジン又はプロスタグランジン類似物を補足することによってインビトロ胚発生を高めるための方法及び組成 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、全体的に又は部分的にNational Institute of Child Health and Human Development(NICHD)、契約番号HD01277、から財政的支援を受けて行われるものである。したがって、米国政府が本発明について所定の権利を有する。
本発明は、一般に哺乳動物胚のインビトロ培養のため、及び適した宿主哺乳動物の子宮に培養された胚の着床後における妊娠の達成を高めるための組成及び方法に関する。
卵管内の環境は、精子の受精の可能性を高め、分裂する胚の発生を促進する。卵管上皮細胞と共培養された胚は、発生、孵化及び着床を向上させたことが示された[Xu、2001年;Xu、2000年]。プロスタサイクリン(PGI2)は、もともと血液及び血管(vascular)のホメオスタシスを維持する点に関与すると考えられている。しかしながら、遺伝子ノックアウトマウスにおける最近の観察結果から示唆されることは、プロスタサイクリンが他の生理的機能を有し得ることである。子宮内膜由来PGI2の重要性が、シクロオキシゲナーゼ(COX)−2ノックアウトマウスにおいて行われた観察によって強調される[Lim、1997年]。COX−2ノックアウトマウスの子宮内膜は、正常には脱落しなかった。結果として、移入された野生型胚(transferred wild type embryo)は、COX−2の欠損した雌マウスには着床できなかった。前述の異常性は、母方に外部からPGI2類似物の投与によってある程度矯正されることができた[Lim、1999年]。
最近、我々は、ヒト卵管がたくさんのプロスタサイクリン(PGI2)及びPGE2を合成すること発見した[Huang、2002年]。遺伝子ノックアウトの研究は、子宮内膜由来PGI2が子宮内膜の脱落に必須であることを示唆するが、着床前胚の発生におけるPGI2の効果は報告されていなかった。着床前胚の最適な発生にはPGI2を必要とするという仮説を用いて、マウス胚におけるPGI2の効果が、完全孵化率を基にして検査された。PGI2レセプタ(IP)の発現は、ウエスタンブロット解析及び免疫組織化学によって評価された。PGI2の胚への結合は、ラジオリガンド結合検定法によって確認された。我々の結果は、マウス胚の孵化はアイロプロスト(Iloprost)(ED506.7nM)、すなわち安定化したPGI2合成類似物の補足によって高められることを明らかにしている。8細胞から桑実胚に至る間、又は桑実胚から初期胚盤胞に至る間に、アイロプロストへの暴露が、孵化を促進させるのに重要であった。PGI2に対するこの時期特有の反応が、IPの発生時期特有の発現と同時に起こった。さらなる研究は、高められる胚の孵化を着床及び生児出生の増加と関連づけるために実施され、すなわちアイロプロストを補足された培地中で培養されたマウス胚が、妊娠キャリアに移入された。妊娠嚢及び生存する子の数がコントロール胚のその数と比較された。報告によれば、培養培地の添加物が胎児の体重を増加させるため[DeBaum、2002年;Thompson、1995年;Sinclair、1999年]、子及び胎盤の重量も比較された。我々の結果は、アイロプロストを補足された培養培地中で胚を培養することは、子及び胎盤の重量に影響を与えることなく、マウス胚の着床及び生児出生を高めることを示している。
本開示は、精子及び胚に対するPGI2並びにPGE2の効果の研究及びそれに続く研究の過程で明らかになった。我々の最近の結果は、ヒト[Huang、2002年]及びマウス[Huang、2004年]卵管上皮細胞が、PGI2の合成、すなわちCOX-1又はCOX-2及びPGI2合成酵素に必須の酵素を発現することを示している。たくさんのPGI2又はPGE2は、14C−アラキドン酸がヒト[Huang、2002年]又はマウス卵管[Huang、2004年]から調製されたミクロソームとインキュベーションされたときに産生された。本研究はまた、精子が卵と受精するために卵管末端に移動し、胚発生の最初の72時間は卵管で起こるという事実を考慮した。
試薬の出所及び制度上の承認。
別のものであると記載しない限り、試薬はシグマ社(Sigma Co.)(アメリカリ合衆国、ミズーリ、セント.ルイス)(St.Louis、MO、USA)から購入されたものである。ヒトのサンプルの使用は、ヒューマンサブジェクツの保護のための委員会(the Committee for the Protection of Human Subjects)(Institute Review Boardと同等)によって承認された。実験動物の取扱い及び研究プロトコルは動物福祉委員会によって認定された。
マウスは、水及び餌へのアクセスが自由で、制御された温度、湿度、及び光周期(12時間明暗周期)条件の下に保った。3週齢のC57B1/6雌マウスはハーラン(Harlan)(アメリカ合衆国、インジアナ、インジアナポリス)(Indianapolis、IN、USA)から購入された。8週齢のC3H雄マウスは最初にハーランから購入され、後にジャクソンラボラトリー(Jackson laboratory)(アメリカ合衆国、メイン、バーハーバー)(Bar Harbor ME、USA)から購入された。雌マウスの過剰排卵は、妊娠雌馬血清ゴナドトロピン(5単位)、及び続く46時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG、5単位)の腹腔内投与によって行われた。hCGを受けた後、それぞれの雌マウスが一匹の繁殖力のある雄マウスとつがいにされた。48時間後、2細胞胚は卵管から25mMへペス(HEPES)及び1%ウシ血清アルブミン(BSA)(アービン サイエンテイフィツク)(Irvine Scientific)を補足されたα-MEM培地に採取された。
推定されるマウスIPのアミノ酸配列(417a.a、Genebank_BAA05144)及びヒトIPのアミノ酸配列(386a.a、Genebank_BAA06110)は相同性が高い[Katsuyama、1994年]。予備的な検討では、アフィニテイー精製ポリクローナルペプチド抗体(テキサス大学健康科学センターのケーヘルアン博士(Dr.Ke−He Ruan、University of Texas Health Science Center)から提供)は、マウスIPと交差反応することを確認した。ウエスタンブロット解析は以前に説明したように行われた[Huang、2002年]。簡潔には、60個のマウス胚盤胞由来の全細胞溶解物が、10%アクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって分離され、ニトロセルロース膜(アメリカ合衆国、ニューハンプシャーのシュレイチャ− アンド シュエル、インク.)(Schleicher & Schuell、Inc.、NH、USA)に転写された。免疫反応タンパクが、抗体とのインキュベーション及び増強された化学発光(アメリカ合衆国、ニュージャージー、ピスカタウエイのアマ−シャム バイオサイエンス)(Amersham Bioscience、Piscataway、NJ、USA)による視覚化によって検出され、またSTORM860レーザースキャナ(アマ−シャム バイオサイエンス)(Amersham Bioscience)を使って検出された。ヒト血小板ミクロソームは、陽性のコントロールとして用いられた。抗体の特異性は、前吸収抗体を用いる平行実験で確かめられた。
マウス胚が4℃で30分間、4%パラホルムアルデヒド中に固定された。リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で3回洗浄後、胚は0.05%のTweenー20、5%の粉末ミルク及び0.1%のTriton X−100含有トリス緩衝化生理食塩水(pH7.4)において、室温で20分間ブロックされた。胚は、2時間ブロッキング緩衝液中でIP抗体(5ng/ml)とインキュベーションされ、それから37℃で30分間、アレクザ(Alexa)488(2.5μg/ml、アメリカ合衆国、アラバマのモレキュラー プローブ(Molecular Probes、AL、USA))と結合したヤギ抗-ラビットIgGとインキュベーションされた。細胞核は、室温で20分間、10μg/mlプロピデウム イオダイド(propdium iodiode)によって対比染色された。胚は、Fluoromount-G(登録商標)(アメリカ合衆国、アラバマ、バーミングハムのサザン バイオテクノロジー アソシエイツ インク.)(Southern Biotechnology Associates Inc.、Birmingham、AL、USA)に埋め込まれた。蛍光顕微鏡解析のために、胚盤胞は封入剤中に置かれてカバースリップが被せられた。共焦点顕微鏡解析のために、およそ50μmのスペーサが、スライドとカバースリップとの間に置かれて胚の3次元形態を保持した。陰性のコントロールには、胚が10ng/mlの非免疫ラビットIgGとインキュベーションされた(すなわち、一次抗体濃度の2倍の濃度)。
3H−アイロプロストの胚盤胞への結合の解析は、わずかに変更修正して以前に説明された [Arbab、2002年] ように行われた。232個が孵化されて孵化する胚盤胞は、結合緩衝液(10mMHEPES、pH7.4中に10mMMnCl2)中で3回洗浄されてから、非標識アイロプロスト(5μM)を有する又は有しない100μlの結合緩衝液に移された。反応は、3H−アイロプロスト(200nM、特異活性11.0Ci/mmol、アマ−シャム バイオサイエンス(Amersham Biosciences))を含む結合緩衝液を加えて、室温で60分間インキュベーションすることによって開始された。その反応は、氷冷洗浄緩衝液(10mMHEPES、pH7.4中に0.01%BSA)に胚盤胞を移すことによって終了された。緩衝液及び胚盤胞は、ガラスフアイバーフィルタ(Whatman GF/C2.4cm)を通してろ過され、フィルタは、2mlの洗浄緩衝液で3回洗浄された。フィルタがオーブン中で乾燥されてから、放射活性が5mlのシンチレーション液で計測されるシンチレーションによって測定された。
スチュ-デントのt検定又はダネット(Dunnet)検定に従った一元配置分散分析が適所に用いられた。p値<0.05は統計的に有意とみなされた。量反応曲線の作図及びED50値(1.0に設定されるヒル勾配を有して)の計算には、GraphPad Prism(登録商標)Software(アメリカ合衆国、カルフオル二ア、サンデイゴのグラフパッド プリズム ソフトウエア インク.)(GraphPad Prism Software Inc.、San Diego、CA、USA)を備えた。
マウス胚が採取されて上述のように培養され、その後に本発明者によって公表された[Huangら、2003年]。簡潔には、2細胞胚(C3B6F1)が、hCG投与後42時間、過剰排卵された3週齢のC57Bl/6雌マウスから採取された。胚(群当り14個)は、600μlのHTF培地(アメリカ合衆国、ニュージャージー、ベッドミンスターのセイジ バイオフアーマ)(SAGE Biophama、Bedminster、NJ、USA)を各々含む4ウエルデイッシュ(アメリカ合衆国、イリノイス、ネイパービルのナルジ ヌンク インターナショナル ネイパー)(Nalge Nunc International、Naperville、IL、USA)において、37℃で5%CO2の下に培養された。実験胚は、水中のアイロプロスト(1μM、アメリカ合衆国、ミシガン、アン アーバーのケイメン ケミカル(Caymen Chemical、Ann Arbor、MI、USA))を、またコントロール胚は等量の水を受けた。どちらの場合も水量は培養液の0.1%に満たなかった。
胚移入後72時間目に、着床は、多少変更修正して以前に説明された方法に基いて決定された[Pariaら、1993年]。簡潔には、安楽死前3分間、0.1mlのシカゴブルー(1%)が、妊娠マウスの尾静脈から投与された。そのマウスを殺した後、子宮角が取り出された。子宮角を取り囲む別々のブルーバンド(アスタリスクで示される)が計測された(図6A)。これらのバンドの存在は、着床部位への血管補給の増加を反映している。それから子宮角が開かれ、妊娠嚢が計測された(図6B)。着床率は、移入された胚当りの妊娠嚢の数として表現された。
予備的な検討は、一腹の大きさが小さいときには、妊娠キャリアが子を共食いするこを示した。子を正確に計測し、体重を量るために、我々は、胚移入後14日目に妊娠キャリアを殺した(妊娠期間の16.5日目、すなわち自然に誕生する2日前)。殺した後、生きている子の数を計測し、個々の子及び胎盤の重量が決定された。全ての子が全体の異常を調べられた。空の妊娠嚢の数がまた、着床率の決定のために計測された。生児出生率は、移入される胚当りの生存する子の数として表現され、着床率は、移入される胚当りの生存する子を有し又は有しない嚢の数として表現された。
フィッシャーの直接確率検定が、比率を比較するために用いられ、スチュ-ダントのt検定が体重の比較のために用いられた。p値<0.05は統計的に有意であると認められた。GraphPad Instat(登録商標)Software(アメリカ合衆国、カルフオル二ア、サンデイゴのグラフパッド プリズム ソフトウエア インク.)(GraphPad Software Inc.、San Diego、CA、USA)が、統計解析に用いられた。
PGI2はマウス胚の完全孵化を高めた。
マウス胚の完全孵化が、濃度に依存するかたちでアイロプロストによって高められた。その効果は0.1μM又はそれ以上の濃度(図1) で統計的に有意であった。完全な胚の孵化の最大増加は、1μMで起こっており、実験胚の81±7%(平均値±標準偏差、n=3)が完全に孵化した。対照的に、コントロール胚の49±14%(平均値±標準偏差、n=5)のみが完全に孵化した。量反応曲線からのED50値は6.7nM(図1)であった。飽和濃度依存反応及び6.7nMのED50値は、アイロプロストの効果がレセプタによって仲介されたことを示唆している。
胚が子宮に入る前にいくつかの発生時期を経るので、我々は、アイロプロストに対する発生時期特有の反応を研究した。我々の結果は、96時間培養の間のある期間が、その他の期間よりもより重要であったことを示している。最初の24時間の培養中(この期間の間に、たいていの2細胞の胚は8細胞の胚に発生した)にアイロプロストへの暴露は、孵化を高めなかった(図2)。一方、採取後0−72時間又は24−72時間の間にアイロプロストへの暴露は、0−96時間暴露を行ったものと同じ比率の完全孵化を生じた(図2)。
マウス胚の発生時期特有の発現を調査するために、我々は発生の異なる時期において胚盤胞のウエスタンブロット解析及び胚の免疫組織化学解析を行った。ウエスタンブロット解析は期待される分子量のタンパクが、IPに対するアフィニテイ精製抗体によって検出できることを示した(図3)。蛍光顕微鏡は、IP染色が桑実胚及び胚盤胞には存在する(図4A−E)が、未受精卵又は1細胞、2細胞及び8細胞胚(図示せず)には存在しないことを示した。桑実胚及び胚盤胞のIP染色は、同じ細かい網状模様を共有していた。共焦点顕微鏡画像は、IPが栄養外胚葉で好ましく発現されたことを示唆している。したがって、マウス胚によるIPの時期特有発現が、アイロプロストに対する反応と一致した。
アイロプロストによる胚の完全な孵化の濃度依存性の高まりは、その効果がレセプタ仲介であることを示唆した。我々は、ラジオリガンド結合測定を行って、アイロプロストによるマウス胚の結合をさらに確認した。我々は、0.1μMレベルのリガンドで結合するアイロプロストの量を計ることを選択し、ここで増大された孵化が最初に観察され、およそ3.04fmolの3H−アイロプロストが116胚盤胞に特異的に結合することを見出した(図5)。
我々のデータは、PGI2が胚の完全孵化を高めることを最初に示している。これは、ヒト卵管由来の上皮細胞とマウス胚の共培養が、胚細胞数を増加させ、アポトーシスを減少させて、胚の孵化を発生させるという以前の報告と一致している[Piekos、1995年;Xu、2000年;Xu、2001年]。それ故、卵管由来PGI2及び子宮内膜細胞由来PGI2は、同様のパラ分泌方法でこれらの効果を与えている。前者は胚の孵化を促進させ、後者は血小板凝集を妨げる。濃度依存性反応は、レセプタ仲介の事象と一致しており、ED50値6.7nMは報告されているKd、すなわちヒト血小板から可溶化されたIP(8nM)の値と同様であった[Tsai、1989年]。
Claims (16)
- 哺乳動物胚のインビトロ発生を高める方法であって、胚の完全孵化を促進するのに有効な量において、培養培地にプロスタグランジン又はその類似物を補足することを有する、方法。
- 前記プロスタグランジンはプロスタサイクリン(PGI2)又はプロスタグランジンE2(PGE2)である請求項1に記載の方法。
- 前記プロスタグランジン類似物はアイロプロスト又はプロスタグランジンE1(PGE1)である請求項1に記載の方法。
- 培養培地の前記補足は、ゲノムが活性化されて受精卵が桑実胚に発生する期間である胚の初期発生の間に行われる請求項1に記載の方法。
- 前記胚はヒトであり、前記初期発生は4乃至8細胞期で開始する請求項1に記載の方法。
- 培養培地の前記補足は、胚の桑実胚から初期胚盤胞への発生の間に行われる請求項1に記載の方法。
- 培養培地の前記補足は、胚の初期発生から桑実胚期への発生と、胚の桑実胚から初期胚盤胞への発生の間との両方の間において行われる請求項1に記載の方法。
- 前記胚はマウスであり、前記補足することは、培養中の胚を、その胚の2細胞発生期に胚の採取後24乃至42時間の間に、プロスタグランジン又は類似物に暴露することを含む請求項1に記載の方法。
- 前記胚はマウスであり、前記補足は、胚を、その胚の2細胞発生期に胚の採取後24乃至72時間の間に、前記プロスタグランジン又はその類似物に暴露することを有する請求項1に記載の方法。
- インビトロ受精胚のインビボ着床の可能性を増大させる方法であって、請求項1に記載の方法に従って胚のインビトロ発生を高めることにより、胚の孵化の可能性が高められてインビボ着床の可能性が増大させられることを有する、方法。
- 前記胚を完全に孵化させることを有しており、完全孵化は前記胚を透明帯から離すことを有する、請求項9に記載の方法。
- 前記胚を宿主哺乳動物の子宮へ着床すること及び前記完全孵化を、生存に適した妊娠の確立と相関させることを有する請求項10に記載の方法。
- インビトロで受精された哺乳動物胚の生児出生の可能性を増加させる方法であって、
請求項1に記載の方法に従って胚のインビトロ発生を高めることにより、高められる孵化、すなわち胚の高められる孵化の可能性が達せられること、
孵化の可能性が高められた胚を宿主哺乳動物の子宮に導入すること、及び
導入された胚を前記子宮内に着床できるようにすること、
とを有し、胚の宿主の子宮内に着床される能力は、このような高まりは有せず同様の宿主の子宮内へ導入される胚の能力と比較して高められる方法。 - インビトロで受精された哺乳動物胚の一群における生児出生率を増加させる方法であって、
請求項1に記載の方法に従って前記胚のインビトロ発生を高めることにより、高められる孵化、すなわち胚の高められる孵化の可能性が達せられること、
高められる孵化の可能性を有する胚を宿主哺乳動物に着床させること、及び
着床された胚をインビボで成長できるようにして、高められる孵化を有する胚、すなわち孵化の可能性が高められた胚からの生児出生率が、このような高まりを有せず着床された胚からの生児出生率よりも非常に高くなるようにすること、
とを有する方法。 - 哺乳動物胚のインビトロ初期発生のための改良された細胞培養培地であって、その改良点は、インビトロで前記胚の完全孵化を促進するのに有効な補足量のプロスタグランジン又はその類似物を有する、改良された細胞培養培地。
- プロスタグランジン又はその類似物の前記量は、インビトロ培養から取り出されて宿主哺乳動物の子宮に移入した後の、前記胚の完全孵化の可能性を高めるのに有効である、請求項15に記載の培地。
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