JP2007314526A - Membrane protein solubilizing agent and membrane protein solubilizing method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、膜タンパク質可溶化剤および膜タンパク質可溶化方法に係り、特に、生体膜中に含まれる膜タンパク質を可溶化するための膜タンパク質可溶化剤および膜タンパク質可溶化方法に関する。 The present invention relates to a membrane protein solubilizer and a membrane protein solubilization method, and more particularly to a membrane protein solubilizer and a membrane protein solubilization method for solubilizing a membrane protein contained in a biological membrane.
生体膜は細胞を構成する膜状の構造物であり、細胞と外部、あるいはミトコンドリア等の細胞内小器官と原形質を区別する役割を果たしている。
生体膜は、一対のリン脂質が疎水性相互作用により結合した脂質二重膜構造をしており、疎水性領域を内側に、親水性領域を外側に向けた構造をしている。そして、この脂質二重膜の内部には膜タンパク質が埋め込まれている。細胞や細胞内小器官の活動に必要な物質の輸送や情報伝達は、主としてこの膜タンパク質を介して行われる。
A biological membrane is a membranous structure that constitutes a cell, and plays a role of distinguishing a cell from the outside, or an intracellular organelle such as a mitochondria and a protoplasm.
The biological membrane has a lipid bilayer structure in which a pair of phospholipids are bonded by a hydrophobic interaction, and has a structure in which a hydrophobic region is directed inward and a hydrophilic region is directed outward. A membrane protein is embedded in the lipid bilayer. Transport of substances necessary for the activity of cells and organelles and transmission of information are mainly performed through this membrane protein.
膜タンパク質は、脂質二重膜を介して細胞内と細胞外、あるいは原形質と細胞内小器官との間の物質の選別や輸送を行うなどの様々な機能を有する。細胞内外の物質に関与する膜タンパク質としては、細胞増殖因子受容体、ホルモン受容体、サイトカイン受容体などがあり、これらの受容体は物質の受容、伝達、変換などを行う。また、細胞内小器官の膜タンパク質としては、小胞体におけるタンパク質合成や、ミトコンドリアや葉緑体でのエネルギー変換に関与する膜タンパク質などがある。 Membrane proteins have various functions such as sorting and transporting substances between cells and extracellular regions, or between protoplasms and intracellular organelles via lipid bilayer membranes. Membrane proteins involved in substances inside and outside the cell include cell growth factor receptors, hormone receptors, cytokine receptors, and the like, and these receptors accept, transmit and convert substances. In addition, as membrane proteins of intracellular organelles, there are membrane proteins involved in protein synthesis in the endoplasmic reticulum and energy conversion in mitochondria and chloroplasts.
このように、膜タンパク質は生命活動にとって重要な機能を果たしているため、医薬、農業、食品、工業などのあらゆる分野で研究対象とされている。特に、医薬の分野では、膜タンパク質の構造・機能を解析することにより、様々な疾病に対する有効な治療薬の開発が行われている。更に、このような治療薬として、近年では精製した膜タンパク質を医薬品の有効成分として直接利用する膜タンパク質製剤の開発が行われている。 Thus, since membrane proteins play important functions for life activities, they have been studied in all fields such as medicine, agriculture, food, and industry. In particular, in the field of medicine, effective therapeutic agents for various diseases have been developed by analyzing the structure and function of membrane proteins. Further, as such therapeutic agents, in recent years, development of membrane protein preparations that directly use purified membrane proteins as active ingredients of pharmaceuticals has been carried out.
一般に、膜タンパク質は疎水性領域が表面に局在した構造をしており、脂質二重膜の内部に埋め込まれた状態で生体膜に保持されている。膜タンパク質は、その表面の疎水性領域と脂質二重膜内部の疎水性領域が疎水性相互作用により結合しているため、生体膜から膜タンパク質を可溶化する際には、可溶化剤を用いて脂質二重膜を溶解し、膜タンパク質を脂質二重膜構造から抽出して水溶液中に溶解させる必要がある。 In general, a membrane protein has a structure in which a hydrophobic region is localized on the surface, and is retained on a biological membrane in a state of being embedded in a lipid bilayer membrane. Membrane proteins have solubilizing agents used to solubilize membrane proteins from biological membranes because the hydrophobic region on the surface and the hydrophobic region inside the lipid bilayer membrane are bound by hydrophobic interaction. Thus, it is necessary to dissolve the lipid bilayer membrane and extract the membrane protein from the lipid bilayer structure and dissolve it in the aqueous solution.
従来、膜タンパク質の可溶化に使用される可溶化剤としては、分子内に疎水性部分と親水性部分の両方を有する両親媒性の界面活性剤が使用されてきた。界面活性剤の具体例としては、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート等の非イオン性界面活性剤や、３−［（３−コール酸アミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コール酸アミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）等の両イオン性界面活性剤や、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、コール酸ナトリウム等の陰イオン性界面活性剤が広く用いられてきた。
そして、生体膜を含む試料をこれらの界面活性剤を含む可溶化剤と混合して、超音波やホモジネート処理等を行うことで生体膜から膜タンパク質を水層（水溶媒）に移行させて可溶化させる。
Conventionally, as a solubilizer used for solubilization of a membrane protein, an amphiphilic surfactant having both a hydrophobic portion and a hydrophilic portion in the molecule has been used. Specific examples of the surfactant include polyoxyethylene (23) lauryl ether, polyoxyethylene (9) octylphenyl ether, n-octyl-β-D-glucopyranoside, polyoxyethylene (10) octylphenyl ether, polyoxy Nonionic surfactants such as ethylene (20) sorbitan monolaurate and polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate, and 3-[(3-cholidoamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonic acid Amphoteric surfactants such as (CHAPS), 3-[(3-cholidoamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxypropanesulfonic acid (CHAPSO), sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium cholate, etc. Of anionic surfactants are widely used It was.
A sample containing a biological membrane is mixed with a solubilizing agent containing these surfactants, and ultrasonic membranes or homogenate treatment is performed to transfer the membrane protein from the biological membrane to an aqueous layer (aqueous solvent). Solubilize.
膜タンパク質の可溶化において重要なことは、膜タンパク質の可溶化時や可溶化後に変性や失活をさせないことである。しかしながら、従来の界面活性剤は、脂質二重層を溶解させるのみならず、膜タンパク質の立体構造をも崩壊させて、膜タンパク質を変性させた状態で水溶媒中に溶解させる。このため、可溶化後の膜タンパク質のうち活性を保持したままの状態にあるものの収量が減少するという不都合があった。 What is important in solubilization of membrane proteins is to prevent denaturation or inactivation during or after solubilization of membrane proteins. However, the conventional surfactant not only dissolves the lipid bilayer but also disrupts the three-dimensional structure of the membrane protein and dissolves the membrane protein in an aqueous solvent in a denatured state. For this reason, there existed a problem that the yield of what was maintaining the activity among the membrane proteins after solubilization decreased.
このように、可溶化後の膜タンパク質は、一部が界面活性剤により変性した状態で水溶媒中に溶解しているため、使用時には溶媒を適当な条件にして、変性した膜タンパク質を再折りたたみ（リフォールディング）させる必要がある。しかしながら、このリフォールディング工程では、膜タンパク質の疎水性相互作用などによる不可逆的な凝集（アグリゲーション）や、誤った折りたたみ（ミスフォールディング）などが起こりやすく、所定の活性や機能を有さなくなる場合がある。 In this way, the membrane protein after solubilization is partly denatured with a surfactant and dissolved in an aqueous solvent. Therefore, when using the membrane protein, the denatured membrane protein is refolded under suitable conditions. (Refolding) is required. However, in this refolding step, irreversible aggregation (aggregation) due to hydrophobic interactions of membrane proteins, misfolding (misfolding), etc. are likely to occur, and the predetermined activity and function may not be achieved. .
また、膜タンパク質の可溶化時に使用した界面活性剤が溶液中に残存した状態で保存すると、活性を保持している膜タンパク質も残存界面活性剤により変性や失活が生じるという不都合があった。
このような変性や失活を防止するため、一般に膜タンパク質の可溶化後は、可溶化時に使用した残存界面活性剤を透析等によって除去してポリエチレングリコール等の安定化剤に置換する操作が必要になる。しかしながら、このような透析操作を行うことで、膜タンパク質の可溶化工数の増加に伴う精製コストの上昇、透析操作による膜タンパク質の変性や凝集による活性の低下、透析チューブなどの器具への試料の付着による収率の減少といった不都合が生じる。
従って、かねてから、膜タンパク質を安定的に可溶化できる膜タンパク質可溶化剤が求められていた。
Further, when the surfactant used for solubilizing the membrane protein is stored in a state where it remains in the solution, there is a disadvantage that the membrane protein retaining the activity is also denatured or deactivated by the remaining surfactant.
In order to prevent such denaturation and deactivation, it is generally necessary to remove the remaining surfactant used during solubilization by dialysis and replace with a stabilizer such as polyethylene glycol after solubilization of the membrane protein. become. However, by performing such dialysis, the purification cost increases due to an increase in the man-hours for solubilizing the membrane protein, the activity decreases due to denaturation and aggregation of the membrane protein due to dialysis, and the sample is put into a device such as a dialysis tube. Inconveniences such as a decrease in yield due to adhesion occur.
Therefore, a membrane protein solubilizer that can stably solubilize membrane proteins has been demanded for some time.
ところで、従来、ホスホリルコリン基を有する重合体とタンパク質を共存させるタンパク質の安定化方法およびこの方法を利用した組成物が知られている（例えば、特許文献１）。この安定化方法や組成物を用いることで、アルブミン製剤等の血漿製剤タンパク質を安定化することが可能となる。 By the way, conventionally, a protein stabilization method in which a polymer having a phosphorylcholine group and a protein coexist and a composition using this method are known (for example, Patent Document 1). By using this stabilization method and composition, it is possible to stabilize plasma preparation proteins such as albumin preparations.
しかしながら、ホスホリルコリン基を有する重合体であって、膜タンパク質の可溶化に使用されるものについては、未だに開発されていなかった。 However, a polymer having a phosphorylcholine group and used for solubilization of a membrane protein has not been developed yet.
本発明の目的は、生体膜から膜タンパク質を安定的に可溶化できる膜タンパク質可溶化剤およびこれを使用した膜タンパク質可溶化方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a membrane protein solubilizing agent capable of stably solubilizing a membrane protein from a biological membrane and a membrane protein solubilization method using the same.
本発明者らは、ホスホリルコリン類似基とアルキル基含有側鎖を分子内に含む共重合体を用いることで、膜タンパク質を安定的に可溶化できるという新たな知見を得るに至った。
すなわち、上記課題を解決するために、本発明の膜タンパク質可溶化剤は、生体膜中に含まれる膜タンパク質を可溶化するための膜タンパク質可溶化剤であって、下記一般式（１）
That is, in order to solve the above problems, the membrane protein solubilizer of the present invention is a membrane protein solubilizer for solubilizing a membrane protein contained in a biological membrane, and has the following general formula (1):
また、前記膜タンパク質は、エリスロポエチン受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、マクロファージコロニー刺激因子受容体、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体、ヒト成長ホルモン受容体、アディポネクチン受容体、ＴＮＦ−α受容体、インターロイキン−１受容体、インターロイキン−２受容体、インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６受容体）からなる群から選択される１又は２種類以上であることが好ましい。 In addition, the membrane protein includes erythropoietin receptor, granulocyte colony stimulating factor receptor, macrophage colony stimulating factor receptor, insulin receptor, insulin-like growth factor receptor, human growth hormone receptor, adiponectin receptor, TNF-α It is preferable that it is 1 or 2 or more types selected from the group which consists of a receptor, an interleukin-1 receptor, an interleukin-2 receptor, and an interleukin-6 receptor (IL-6 receptor).
また、上記課題を解決するために、本発明の膜タンパク質可溶化方法は、生体膜中に含まれる膜タンパク質を可溶化するための膜タンパク質可溶化方法であって、前記生体膜を含有する試料と、下記一般式（１）
この場合、前記可溶化された前記膜タンパク質を、前記膜タンパク質可溶化剤が残存した溶液中で保存することが好ましい。 In this case, the solubilized membrane protein is preferably stored in a solution in which the membrane protein solubilizer remains.
また、前記膜タンパク質は、エリスロポエチン受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、マクロファージコロニー刺激因子受容体、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体、ヒト成長ホルモン受容体、アディポネクチン受容体、ＴＮＦ−α受容体、インターロイキン−１受容体、インターロイキン−２受容体、インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６受容体）からなる群から選択される１又は２種類以上であることが好ましい。 In addition, the membrane protein includes erythropoietin receptor, granulocyte colony stimulating factor receptor, macrophage colony stimulating factor receptor, insulin receptor, insulin-like growth factor receptor, human growth hormone receptor, adiponectin receptor, TNF-α It is preferable that it is 1 or 2 or more types selected from the group which consists of a receptor, an interleukin-1 receptor, an interleukin-2 receptor, and an interleukin-6 receptor (IL-6 receptor).
本発明の膜タンパク質可溶化剤によれば、ホスホリルコリン類似基含有側鎖とアルキル基含有側鎖の両側鎖を分子内に含む共重合体を含んでおり、この共重合体は生体膜を溶解して膜タンパク質を可溶化する可溶化能に優れている。従って、生体膜中から膜タンパク質を高い効率で安定的に可溶化できる。 According to the membrane protein solubilizing agent of the present invention, it contains a copolymer containing both side chains of a phosphorylcholine-like group-containing side chain and an alkyl group-containing side chain in the molecule, and this copolymer dissolves biological membranes. Excellent solubilization ability to solubilize membrane proteins. Therefore, the membrane protein can be stably solubilized from the biological membrane with high efficiency.
以下に、本発明の膜タンパク質可溶化剤について説明する。なお、以下に説明する材料、器具、条件などは本発明を限定するものではなく、本発明の趣旨に沿って各種改変することができることは勿論である。 The membrane protein solubilizer of the present invention will be described below. It should be noted that the materials, instruments, conditions, and the like described below do not limit the present invention, and various modifications can be made within the spirit of the present invention.
本発明の膜タンパク質可溶化剤は、ホスホリルコリン類似基含有側鎖とアルキル基含有側鎖を分子内に含む共重合体（以下、ＰＣポリマーという）を膜タンパク質可溶化の有効成分として含んでいる。
このＰＣポリマーは、具体的には、下記一般式（１）
Specifically, this PC polymer has the following general formula (1)
このＰＣポリマーは、下記一般式（２）で示されるホスホリルコリン類似基を分子内に有している。
このホスホリルコリン類似基は、生体膜の構成成分の１つであるリン脂質極性基（ホスホリルコリン基）と同一又は類似した構造をしている。このため、ホスホリルコリン類似基を分子内に含むＰＣポリマーは、水溶媒内で自己組織化して生体膜とよく似た性質の擬似生体膜を構築する。この擬似生体膜中に膜タンパク質が保持されることで、生体膜内に存在する場合と同様に安定した状態となり、可溶化後の膜タンパク質を安定的に保存できると推定される。 This phosphorylcholine-like group has the same or similar structure as a phospholipid polar group (phosphorylcholine group) which is one of the components of the biological membrane. For this reason, a PC polymer containing a phosphorylcholine-like group in the molecule is self-assembled in an aqueous solvent to construct a pseudo-biological membrane having properties similar to those of a biological membrane. By holding the membrane protein in the pseudo-biological membrane, it is presumed that the membrane protein after being solubilized can be stably stored, as in the case where it exists in the biological membrane.
更に、ホスホリルコリン類似基は、リン酸基とコリン類似基の二つの荷電性基を有している。このリン酸基のマイナス電荷とコリン類似基のプラス電荷は分子内で打ち消しあうため、ホスホリルコリン類似基は電気的に中性な官能基として挙動する。従って、膜タンパク質の電荷型アミノ酸側鎖と静電的相互作用を起こしにくく、これらの側鎖と相互作用することによる膜タンパク質の構造変化を防止することができると考えられる。 Furthermore, the phosphorylcholine-like group has two charged groups, a phosphate group and a choline-like group. Since the negative charge of the phosphate group and the positive charge of the choline-like group cancel each other in the molecule, the phosphorylcholine-like group behaves as an electrically neutral functional group. Therefore, it is considered that the electrostatic interaction with the charged amino acid side chains of the membrane protein hardly occurs, and the structural change of the membrane protein due to the interaction with these side chains can be prevented.
更にまた、このＰＣポリマーは生体に対する毒性が低い。これは、ＰＣポリマーの有するホスホリルコリン類似基が生体膜の成分であるリン脂質極性基と類似した構造をしており、生体が異物として認識しにくいためであると推定される。このため、ＰＣポリマーを製剤に含有して生体に投与しても、拒絶反応、生体組織の破壊、溶血、死亡といった悪影響を及ぼすことが無い。 Furthermore, this PC polymer has low toxicity to living bodies. This is presumably because the phosphorylcholine-like group of the PC polymer has a structure similar to the phospholipid polar group that is a component of the biological membrane, and the living body is difficult to recognize as a foreign substance. For this reason, even if PC polymer is contained in a preparation and administered to a living body, adverse effects such as rejection, destruction of living tissue, hemolysis, and death are not caused.
また、このＰＣポリマーは、一般式：−Ｒ７（式中、Ｒ７は炭素数１〜６の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ８は水素又はメチル基である。）で示されるアルキル基を分子内に有している。 Further, this PC polymer has the general formula: -R 7 (wherein R 7 represents a linear or branched divalent hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, and R 8 represents hydrogen or a methyl group. )) In the molecule.
このアルキル基は疎水性であるため、脂質二重膜を構成するリン脂質の疎水基と疎水性相互作用を起こし、二重層構造を崩壊させる性質を有すると考えられる。従って、膜タンパク質を保持する脂質二重膜を溶解させて膜タンパク質を可溶化する機能に中心的な役割をはたしていると推定される。
更に、このアルキル基は、膜タンパク質表面に局在する疎水性領域と疎水性相互作用をすると考えられる。この疎水性相互作用により、膜タンパク質は水溶媒中でも凝集を起こしにくく、活性を保持した状態で安定的に水溶媒中に分散していると推定される。このように、アルキル基は、可溶化後の膜タンパク質の安定性にも寄与すると考えられる。
Since this alkyl group is hydrophobic, it is considered that it has a property of causing a hydrophobic interaction with the hydrophobic group of the phospholipid constituting the lipid bilayer membrane and disrupting the bilayer structure. Therefore, it is presumed that it plays a central role in the function of solubilizing the membrane protein by dissolving the lipid bilayer membrane holding the membrane protein.
Furthermore, this alkyl group is thought to have a hydrophobic interaction with a hydrophobic region localized on the surface of the membrane protein. Due to this hydrophobic interaction, it is presumed that the membrane protein hardly aggregates even in an aqueous solvent and is stably dispersed in the aqueous solvent while maintaining the activity. Thus, the alkyl group is considered to contribute to the stability of the membrane protein after solubilization.
このように、本発明のＰＣポリマーは、上述したような脂質二重膜を溶解しやすい性質を備えているため、特に生体膜に埋もれた膜タンパク質を可溶化する際に好適に使用される。 Thus, since the PC polymer of the present invention has the property of easily dissolving the lipid bilayer as described above, it is suitably used particularly when solubilizing a membrane protein buried in a biological membrane.
次に、ＰＣポリマーの製造方法について説明する。
上記ＰＣポリマーは、分子内にホスホリルコリン類似基を有するホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）と、分子内にアルキル基を有するアルキル基含有単量体（ａ２）の２種類の単量体を共重合することで合成することが可能である。
Next, a method for producing a PC polymer will be described.
The PC polymer comprises two types of monomers: a phosphorylcholine-like group-containing monomer (a1) having a phosphorylcholine-like group in the molecule and an alkyl group-containing monomer (a2) having an alkyl group in the molecule. It can be synthesized by polymerization.
ホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）としては、細胞膜の構成成分であるリン脂質が有するホスホリルコリン基と類似した性質を有するホスホリルコリン類似基を側鎖として備え、且つ、重合性の（メタ）アクリロイル基を分子内に有する単量体が挙げられる。 The phosphorylcholine-like group-containing monomer (a1) includes a phosphorylcholine-like group having a property similar to that of a phosphorylcholine group possessed by a phospholipid that is a component of a cell membrane as a side chain, and a polymerizable (meth) acryloyl group The monomer which has in a molecule | numerator is mentioned.
具体的には、下記一般式（３）で示される化合物が好適に使用される。
このような化合物としては、例えば、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、４−（メタ）アクリロイルオキシブチル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、５−（メタ）アクリロイルオキシペンチル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、７−（メタ）アクリロイルオキシヘプチル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、８−（メタ）アクリロイルオキシオクチル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、９−（メタ）アクリロイルオキシノニル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、１０−（メタ）アクリロイルオキシデシル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２−（トリプロピルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２−（トリブチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシブチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシペンチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシヘキシル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート等が挙げられる。
ここで、「（メタ）アクリロイル」とは、メタクリルおよび／またはアクリルを意味しており、本明細書中の他の記載においても同じ意味で使用する。
なお、上記化合物は、使用に際して単独または混合物として用いることができる。
このうち、入手が特に容易などの理由から、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート｛別名、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリンともいう（以下、ＭＰＣ）｝が好適である。
Examples of such compounds include 2- (meth) acryloyloxyethyl-2- (trimethylammonio) ethyl phosphate, 3- (meth) acryloyloxypropyl-2- (triethylammonio) ethyl phosphate, 4- ( (Meth) acryloyloxybutyl-2- (triethylammonio) ethyl phosphate, 5- (meth) acryloyloxypentyl-2- (triethylammonio) ethyl phosphate, 6- (meth) acryloyloxyhexyl-2- (triethylammonio) ) Ethyl phosphate, 7- (meth) acryloyloxyheptyl-2- (triethylammonio) ethyl phosphate, 8- (meth) acryloyloxyoctyl-2- (triethylammonio) ethyl phosphate, 9- (meth) acrylo Ruoxynonyl-2- (triethylammonio) ethyl phosphate, 10- (meth) acryloyloxydecyl-2- (triethylammonio) ethyl phosphate, 2- (meth) acryloyloxyethyl-2- (triethylammonio) ethyl phosphate, 2- (meth) acryloyloxyethyl-2- (tripropylammonio) ethyl phosphate, 2- (meth) acryloyloxyethyl-2- (tributylammonio) ethyl phosphate, 2- (meth) acryloyloxypropyl-2- (Trimethylammonio) ethyl phosphate, 2- (meth) acryloyloxybutyl-2- (trimethylammonio) ethyl phosphate, 2- (meth) acryloyloxypentyl-2- (trimethylammonio) ethylphos Eto, 2- (meth) acryloyloxy-hexyl-2- (trimethylammonio) ethyl phosphate.
Here, “(meth) acryloyl” means methacryl and / or acryl and is used in the same meaning in other descriptions in this specification.
In addition, the said compound can be used individually or as a mixture in use.
Among these, 2- (meth) acryloyloxyethyl-2- (trimethylammonio) ethyl phosphate {also called 2- (meth) acryloyloxyethyl phosphorylcholine (hereinafter referred to as MPC)} because it is particularly easy to obtain. Is preferred.
また、ＰＣポリマーは、アルキル基含有単量体（ａ２）を構成単位として備えている。アルキル基含有単量体（ａ２）としては、側鎖にアルキル基を有し、且つ、分子内に重合性の（メタ）アクリロイル基を有する単量体が挙げられる。 Moreover, PC polymer is equipped with the alkyl group containing monomer (a2) as a structural unit. Examples of the alkyl group-containing monomer (a2) include monomers having an alkyl group in the side chain and a polymerizable (meth) acryloyl group in the molecule.
具体的には、下記一般式（４）で示される化合物が好適に使用される。
このような化合物としては、例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸イソプロピル、（メタ）アクリル酸ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸ｓｅｃ−ブチル、（メタ）アクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル、（メタ）アクリル酸ペンチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル等が挙げられる。
なお、上記化合物は、使用に際して単独または混合物として用いることができる。
上記複数の化合物のうち、入手が容易である点や、ホスホリルコリン類似基単量体（ａ１）との重合性に優れている点から、（メタ）アクリル酸ｎ−ブチル（以下、ＢＭＡ）が好ましい。
Examples of such compounds include methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, propyl (meth) acrylate, isopropyl (meth) acrylate, n-butyl (meth) acrylate, and (meth) acrylic. Examples include acid sec-butyl, tert-butyl (meth) acrylate, pentyl (meth) acrylate, hexyl (meth) acrylate, and the like.
In addition, the said compound can be used individually or as a mixture in use.
Of the plurality of compounds, n-butyl (meth) acrylate (hereinafter referred to as BMA) is preferable from the viewpoint of easy availability and excellent polymerizability with the phosphorylcholine-like group monomer (a1). .
ホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）とアルキル基含有単量体（ａ２）との共重合体であるＰＣポリマーにおいて、両単量体の組成比は可溶化する膜タンパク質や生体膜の性質、可溶化後の保存安定性などを考慮して任意の組成比とすることができる。
具体的には、ＰＣポリマー中でのホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）の含有割合は、モル分率（すなわち、ｍ／ｍ＋ｎ）で０．０５〜０．９５の範囲であればよい。
特に、膜タンパク質の可溶化の点から、ホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）の含有割合は、０．３０〜０．５０の範囲が好ましい。モル分率が０．３０よりも小さいと、ホスホリルコリン類似基の割合が少なくなるため膜タンパク質の安定性が低下して好ましくない。一方、モル分率が０．５０よりも大きいと、アルキル基の割合が多くなり過ぎるためＰＣポリマーの溶媒への溶解度が低下して好ましくない。
In the PC polymer that is a copolymer of the phosphorylcholine-like group-containing monomer (a1) and the alkyl group-containing monomer (a2), the composition ratio of both monomers is the property of the solubilized membrane protein or biological membrane, Considering the storage stability after solubilization and the like, the composition ratio can be arbitrarily determined.
Specifically, the content ratio of the phosphorylcholine-like group-containing monomer (a1) in the PC polymer may be in the range of 0.05 to 0.95 in terms of molar fraction (that is, m / m + n).
In particular, from the viewpoint of solubilization of the membrane protein, the content ratio of the phosphorylcholine-like group-containing monomer (a1) is preferably in the range of 0.30 to 0.50. If the molar fraction is less than 0.30, the proportion of phosphorylcholine-like groups decreases, which is not preferable because the stability of the membrane protein is lowered. On the other hand, when the molar fraction is larger than 0.50, the proportion of the alkyl group is excessively increased, so that the solubility of the PC polymer in the solvent is lowered, which is not preferable.
ＰＣポリマー中の各単量体の構成割合は、重合反応開始前の各単量体の混合比にほぼ等しくなるため、混合比を調整することで所望の組成比とすることが可能である。例えば、ホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）のＰＣポリマー中でのモル分率（すなわち、ｍ／ｍ＋ｎ）が０．４のＰＣポリマーを製造する場合、重合開始前の溶液中のホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）とアルキル基含有単量体（ａ２）の混合比をモル比で０．４：０．６にすればよい。 Since the composition ratio of each monomer in the PC polymer is substantially equal to the mixing ratio of each monomer before the start of the polymerization reaction, it is possible to obtain a desired composition ratio by adjusting the mixing ratio. For example, in the case of producing a PC polymer having a phosphorylcholine analog-containing monomer (a1) having a molar fraction (ie, m / m + n) in the PC polymer of 0.4, the phosphorylcholine analog group in the solution before the start of polymerization The mixing ratio of the containing monomer (a1) and the alkyl group-containing monomer (a2) may be 0.4: 0.6 in terms of molar ratio.
また、ＰＣポリマーの重量平均分子量は、特には限定されないが、１，０００〜５，０００，０００の範囲内であればよい。
特に、膜タンパク質の可溶化の観点からは、１０，０００〜１，０００，０００の範囲が好適である。重量平均分子量が１０，０００より小さいと、膜タンパク質の安定性への重合体の寄与度が低下するため好ましくない。逆に、重量平均分子量が１，０００，０００よりも大きいと、溶液の粘度が高くなりすぎて取り扱いが不便となるため好ましくない。
特に、可溶化した膜タンパク質を用いて膜タンパク質製剤を製造する場合、ＰＣポリマーが膜タンパク質製剤に残存する場合があるが、ＰＣポリマーの重量平均分子量が大きすぎると腎臓などで代謝されにくい。このため、ＰＣポリマーの重量平均分子量としては、５０，０００〜１５０，０００程度が好ましい。
The weight average molecular weight of the PC polymer is not particularly limited, but may be in the range of 1,000 to 5,000,000.
In particular, the range of 10,000 to 1,000,000 is suitable from the viewpoint of solubilization of membrane proteins. A weight average molecular weight of less than 10,000 is not preferred because the contribution of the polymer to the stability of the membrane protein decreases. On the other hand, if the weight average molecular weight is larger than 1,000,000, the viscosity of the solution becomes too high and the handling becomes inconvenient, which is not preferable.
In particular, when a membrane protein preparation is produced using a solubilized membrane protein, the PC polymer may remain in the membrane protein preparation, but if the weight average molecular weight of the PC polymer is too large, it is difficult to be metabolized in the kidney or the like. For this reason, the weight average molecular weight of the PC polymer is preferably about 50,000 to 150,000.
なお、この場合の重量平均分子量とは、ゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）により標準ポリエチレングリコールを用いて換算した重量平均分子量を意味する。本明細書中の他の記載においても同様の意味である。
具体的には、以下の条件でＧＰＣを行って算出した重量平均分子量を意味する。
カラム：Ｇ３０００ＰＷＸＬを２本（東ソー社製）
溶出溶媒：２０ｍＭリン酸バッファ
標準物質：ポリエチレングリコール（ポリマー・ラボラトリー社製）
流速：０．５ｍｌ／分
試料溶液使用量：１００μｌ
カラム温度：４０℃
視差屈折計・計算プログラム：東ソー社製インテグレータ内臓分子量計算プログラム（ＳＣ−８０２０用ＧＰＣプログラム）
In addition, the weight average molecular weight in this case means the weight average molecular weight converted using standard polyethylene glycol by gel permeation chromatography (GPC). The same meaning applies to other descriptions in the present specification.
Specifically, it means the weight average molecular weight calculated by GPC under the following conditions.
Column: Two G3000PWXL (manufactured by Tosoh Corporation)
Elution solvent: 20 mM phosphate buffer Standard substance: Polyethylene glycol (manufactured by Polymer Laboratory)
Flow rate: 0.5 ml / min Sample solution usage: 100 μl
Column temperature: 40 ° C
Parallax refractometer / calculation program: Tosoh integrator built-in molecular weight calculation program (GPC program for SC-8020)
ＰＣポリマーの重量平均分子量は、重合反応の時間、重合開始剤の濃度、重合温度などの重合条件によって調整することができる。例えば、重合反応の時間を２４時間と長くすれば、得られるＰＣポリマーの重量平均分子量は５００，０００程度と大きくなる。一方、重合反応時間を１．５時間と短時間にすれば、得られるＰＣポリマーの重量平均分子量は３０，０００程度と小さくなる。 The weight average molecular weight of the PC polymer can be adjusted by the polymerization conditions such as the polymerization reaction time, the concentration of the polymerization initiator, and the polymerization temperature. For example, if the polymerization reaction time is increased to 24 hours, the weight average molecular weight of the obtained PC polymer increases to about 500,000. On the other hand, if the polymerization reaction time is as short as 1.5 hours, the weight average molecular weight of the PC polymer obtained is as small as about 30,000.
また、ＰＣポリマーの種類としては、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、グラフト共重合体などの、公知の重合様式による重合体のいずれであってもよい。各単量体の重合は、溶液重合、塊状重合、乳化重合、懸濁重合などの公知の方法を用いて行われる。この際必要に応じて、重合系を窒素、二酸化炭素、ヘリウム等の不活性ガスで置換して、または置換せずにこの不活性ガスを重合系に連続的に導入した状態で、重合温度０〜１００℃、重合時間１０分〜４８時間の重合条件下でラジカル重合させる方法等により調製する事ができる。 Moreover, as a kind of PC polymer, any of the polymers by a well-known polymerization mode, such as an alternating copolymer, a random copolymer, a block copolymer, and a graft copolymer, may be sufficient. The polymerization of each monomer is performed using a known method such as solution polymerization, bulk polymerization, emulsion polymerization, suspension polymerization or the like. At this time, if necessary, the polymerization system is replaced with an inert gas such as nitrogen, carbon dioxide, helium or the like, or the inert gas is continuously introduced into the polymerization system without replacement. It can be prepared by a method of radical polymerization under polymerization conditions of -100 ° C. and a polymerization time of 10 minutes to 48 hours.
重合に際しては、アクリル系高分子化合物の重合反応において通常使用されるラジカル重合開始剤を用いることができる。ラジカル重合開始剤としては、例えば、２，２−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩、４，４−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、２，２−アゾビス（２−（５−メチル−２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）二塩酸塩、２，２−アゾビスイソブチルアミド二水和物、２，２−アゾビスイソブチロニトリル、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過酸化ベンゾイル、ジイソプロピルペルオキシジカーボネート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート、ｔ−ブチルペルオキシジイソブチレート、過酸化ラウロイル、アゾビスイソブチロニトリル、２，２ −アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート等が挙げられる。
特に、４，４−アゾビス（４−シアノ吉草酸）または２，２−アゾビスイソブチロニトリルが好適である。
In the polymerization, a radical polymerization initiator usually used in a polymerization reaction of an acrylic polymer compound can be used. Examples of the radical polymerization initiator include 2,2-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride, 4,4-azobis (4-cyanovaleric acid), 2,2-azobis (2- (5-methyl- 2-Imidazolin-2-yl) propane) dihydrochloride, 2,2-azobisisobutyramide dihydrate, 2,2-azobisisobutyronitrile, ammonium persulfate, potassium persulfate, benzoyl peroxide, diisopropyl Peroxydicarbonate, t-butylperoxy-2-ethylhexanoate, t-butylperoxypivalate, t-butylperoxydiisobutyrate, lauroyl peroxide, azobisisobutyronitrile, 2,2-azobis (2, 4-dimethylvaleronitrile), t-butylperoxyneodecanoate and the like.
In particular, 4,4-azobis (4-cyanovaleric acid) or 2,2-azobisisobutyronitrile is preferable.
これらのラジカル重合開始剤は単独で用いても混合物で用いてもよい。また、ラジカル重合開始剤の他に各種レドックス系の促進剤を用いても良い。ラジカル重合開始剤の使用量は、単量体組成物１００重量部に対して０．０１〜５．０重量部が好ましい。反応温度は４０〜８０℃、好ましくは５０〜７０℃である。
ラジカル重合開始剤の種類、濃度、反応時間、反応温度などを適宜選択することにより、所望の重量平均分子量や分子量分布を有するＰＣポリマーを得ることが可能となる。
重合反応後のＰＣポリマーの精製は、再沈殿法、透析法、精密濾過法、限外濾過法など一般的な精製方法により行うことができる。
These radical polymerization initiators may be used alone or in a mixture. In addition to the radical polymerization initiator, various redox accelerators may be used. The amount of radical polymerization initiator used is preferably 0.01 to 5.0 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the monomer composition. The reaction temperature is 40 to 80 ° C, preferably 50 to 70 ° C.
By appropriately selecting the type, concentration, reaction time, reaction temperature, and the like of the radical polymerization initiator, a PC polymer having a desired weight average molecular weight and molecular weight distribution can be obtained.
Purification of the PC polymer after the polymerization reaction can be performed by a general purification method such as a reprecipitation method, a dialysis method, a microfiltration method, or an ultrafiltration method.
精製したＰＣポリマーは、乾燥して粉末状で保存するか、または水、各種緩衝液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ニトロメタンなどの溶媒中で保存することができる。溶媒としては、水溶液や有機溶媒、または有機溶媒と水溶媒を混合した混合溶媒などの各種溶媒を使用することが可能である。有機溶媒としては、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルスルオキシド、アセトニトリル、ジオキサン、アセトン、塩化メチレン、クロロホルム、メチルエチルケトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、トルエン、シクロヘキサン、ジエチルエーテル、ｎ−ヘキサン、イソプロピルエーテル、四塩化炭素、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドンなどが挙げられる。 The purified PC polymer can be dried and stored in powder form, or stored in a solvent such as water, various buffers, methanol, ethanol, isopropanol, nitromethane. As the solvent, various solvents such as an aqueous solution, an organic solvent, or a mixed solvent obtained by mixing an organic solvent and an aqueous solvent can be used. Examples of the organic solvent include dimethylformamide, dimethylsulfoxide, acetonitrile, dioxane, acetone, methylene chloride, chloroform, methyl ethyl ketone, ethyl acetate, tetrahydrofuran, toluene, cyclohexane, diethyl ether, n-hexane, isopropyl ether, carbon tetrachloride, dimethyl. Examples include acetamide and N-methyl-2-pyrrolidone.
精製したＰＣポリマーを膜タンパク質可溶化剤として使用する場合は、試料中に直接粉末を混合するか、または生理的食塩水や各種緩衝液などの溶媒に上記保存状態のＰＣポリマーを混合して溶液状の可溶化剤を調整した後で、この可溶化剤を試料中に混合する。
ＰＣポリマーの濃度は、可溶化する膜タンパク質の種類や特性にもよるが、０．１〜１．０ｍＭ程度が好ましい。
緩衝液として、例えばリン酸バッファ、酢酸バッファ、クエン酸バッファ、Ｔｒｉｓ−塩酸バッファ、Ｔｒｉｓ−酢酸バッファ、Ｔｒｉｓ−塩酸バッファ、Ｈｅｐｅｓバッファ、ＭＯＰＳバッファなどが挙げられる。
When using the purified PC polymer as a membrane protein solubilizer, mix the powder directly into the sample, or mix the above-preserved PC polymer in a solvent such as physiological saline or various buffer solutions. After preparing the solubilizing agent in the form, the solubilizing agent is mixed into the sample.
The concentration of the PC polymer is preferably about 0.1 to 1.0 mM, although it depends on the type and characteristics of the solubilized membrane protein.
Examples of the buffer include phosphate buffer, acetate buffer, citrate buffer, Tris-hydrochloric acid buffer, Tris-acetic acid buffer, Tris-hydrochloric acid buffer, Hepes buffer, and MOPS buffer.
この溶媒には、ＰＣポリマーの可溶化作用や膜タンパク質に対する保存安定作用を阻害しない範囲で各種成分を配合することができる。
このような成分としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム、硫酸アンモニウムなどの塩や、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡなどのキレート剤、ＳＤＳなどの界面活性剤、ＤＴＴ、２−メルカプトエタノール、グルタチオン、アスコルビン酸などの還元剤、エチレングリコール、グリセロールなどの凍結保護剤、アジ化ナトリウム、チメロサールなどの防腐剤、アプロチニン、ペプスタチン、ロイペプチンなどのプロテアーゼ阻害剤などを挙げることができる。
Various components can be blended in this solvent as long as the solubilizing action of the PC polymer and the storage stability action against the membrane protein are not inhibited.
Examples of such components include salts such as sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, sodium acetate, potassium acetate, calcium chloride, ammonium sulfate, chelating agents such as EDTA and EGTA, surfactants such as SDS, DTT, 2- Examples include reducing agents such as mercaptoethanol, glutathione and ascorbic acid, cryoprotectants such as ethylene glycol and glycerol, preservatives such as sodium azide and thimerosal, and protease inhibitors such as aprotinin, pepstatin and leupeptin.
本発明の膜タンパク質可溶化剤は、特に生体膜に結合した膜タンパク質の可溶化に最適である。生体膜の種類としては、細胞と外界との境界を形成する細胞膜、ミトコンドリアや葉緑体、リソソームなどの細胞内オルガネラを囲む膜など、ホスホリルコリン基を含む生体膜のすべてを含んでいる。
このような膜タンパク質には様々な種類があるが、例えば、細胞増殖因子受容体、ホルモン受容体、サイトカイン受容体などが挙げられる。
細胞増殖因子受容体の例としては、赤血球産生調節因子であるエリスロポエチン受容体（ＥＰＯ受容体）、好中球前駆細胞の分化促進作用を有する顆粒球コロニー刺激因子受容体（Ｇ−ＣＳＦ受容体）、単球の分化促進作用を有するマクロファージコロニー刺激因子受容体（Ｍ−ＣＳＦ受容体）などが挙げられる。
ホルモン受容体の例としては、血中糖分濃度の調節機能を有するインスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−１受容体）、ヒト成長ホルモン受容体などが挙げられる。
サイトカイン受容体の例としては、脂肪細胞から分泌されインスリンの作用に関与するアディポネクチン受容体、慢性炎症などに関与するＴＮＦ−α受容体（ＴＮＦ−α受容体）、免疫応答に関与するインターロイキン−１受容体（ＩＬ−１受容体）、Ｔ細胞の増殖促進機能を有するインターロイキン−２受容体（ＩＬ−２受容体）、抗体産生促進機能を有するインターロイキン−６受容体（ＩＬ−６受容体）などが挙げられる。
なお、膜タンパク質としては、野生型のみならず、これらの膜タンパク質の変異型も含む。このような変異型の膜タンパク質は、膜タンパク質をコードする遺伝子に先天的な変異を有するものであっても、遺伝子組換え等により人工的に変異を導入したものであってもよい。
The membrane protein solubilizer of the present invention is particularly suitable for solubilizing membrane proteins bound to biological membranes. Types of biological membranes include all biological membranes containing phosphorylcholine groups, such as cell membranes that form boundaries between cells and the outside world, membranes that surround intracellular organelles such as mitochondria, chloroplasts, and lysosomes.
There are various types of such membrane proteins, and examples thereof include a cell growth factor receptor, a hormone receptor, and a cytokine receptor.
Examples of cell growth factor receptors include erythropoietin receptor (EPO receptor), which is an erythropoiesis regulator, and granulocyte colony-stimulating factor receptor (G-CSF receptor), which has an action of promoting differentiation of neutrophil progenitor cells. And macrophage colony-stimulating factor receptor (M-CSF receptor) having a monocyte differentiation-promoting action.
Examples of hormone receptors include insulin receptors having a function of regulating blood sugar concentration, insulin-like growth factor receptors (IGF-1 receptors), human growth hormone receptors, and the like.
Examples of cytokine receptors include adiponectin receptors that are secreted from adipocytes and are involved in the action of insulin, TNF-α receptors (TNF-α receptor) that are involved in chronic inflammation, and interleukins that are involved in immune responses. 1 receptor (IL-1 receptor), interleukin-2 receptor (IL-2 receptor) having a T cell proliferation promoting function, interleukin-6 receptor (IL-6 receptor) having an antibody production promoting function Body).
The membrane protein includes not only wild type but also mutant types of these membrane proteins. Such a mutant membrane protein may have a congenital mutation in a gene encoding the membrane protein, or may have a mutation artificially introduced by genetic recombination or the like.
膜タンパク質を可溶化するには、まず膜タンパク質を含む生体組織や生体細胞などの試料を調整する。例えば、ＥＰＯ受容体は骨髄組織中に多く含まれるため、試料として骨髄組織を使用する。
なお、目的とする膜タンパク質をコードする遺伝子をトランスジェニック生物や大腸菌などの微生物に組み込ませて膜タンパク質を発現させ、この生物から膜タンパク質を含む組織や細胞を調整することも可能である。この場合、ＧＳＴ融合タンパク質やＨｉｓ−タグ結合タンパク質といった、生化学・生理学の分野で広く用いられている発現系を利用することも可能である。
In order to solubilize membrane proteins, samples such as biological tissues and biological cells containing membrane proteins are first prepared. For example, since many EPO receptors are contained in bone marrow tissue, bone marrow tissue is used as a sample.
It is also possible to incorporate a gene encoding a target membrane protein into a microorganism such as a transgenic organism or Escherichia coli to express the membrane protein, and to adjust tissues or cells containing the membrane protein from this organism. In this case, expression systems widely used in the fields of biochemistry and physiology, such as GST fusion protein and His-tag binding protein, can also be used.
生体組織から膜タンパク質を可溶化する方法としては、目的とする膜タンパク質を含む生体組織や細胞の調製液に、ＰＣポリマーを含む膜タンパク質可溶化剤を混合することで行われる。単に混合するだけでも、生体膜から膜タンパク質を可溶化することが可能であるが、混合後の試料溶液に対して超音波処理やホモジナイズなどの処理を施すことで、脂質二重層に埋もれた膜タンパク質をより効率的に水層に溶解させることができる。
膜タンパク質可溶化後の溶液中に含まれる不溶成分は、遠心分離などにより沈殿させて除去する。
As a method for solubilizing membrane protein from a biological tissue, a membrane protein solubilizing agent containing a PC polymer is mixed with a biological tissue or cell preparation solution containing the target membrane protein. Membrane proteins can be solubilized from biological membranes by simply mixing them, but membranes buried in lipid bilayers by subjecting the mixed sample solution to treatments such as ultrasonic treatment and homogenization Protein can be more efficiently dissolved in the aqueous layer.
Insoluble components contained in the solution after membrane protein solubilization are removed by precipitation by centrifugation or the like.
可溶化後の膜タンパク質を含む溶液は、目的とする膜タンパク質以外の成分を多く含んだ状態にあるので、実験などに使用する際には、公知の方法で目的とする膜タンパク質を精製してもよい。
可溶化した膜タンパク質の精製方法としては、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーといった公知のタンパク質精製技術を用いて行うことができる。更に、各クロマトグラフィーの溶出溶液としてＰＣポリマーを含む溶液を使用すると、精製過程での膜タンパク質の変性や失活を防止することが可能となるため好ましい。精製後の膜タンパク質は、必要に応じてペプチド限定分解や糖鎖付加を行ってもよい。
Since the solution containing membrane protein after solubilization contains a lot of components other than the target membrane protein, the target membrane protein is purified by a known method when used for experiments. Also good.
The solubilized membrane protein can be purified using a known protein purification technique such as gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, or affinity chromatography. Furthermore, it is preferable to use a solution containing a PC polymer as an elution solution for each chromatography because it is possible to prevent denaturation and inactivation of membrane proteins during the purification process. The membrane protein after purification may be subjected to peptide limited degradation or sugar chain addition as necessary.
精製後の膜タンパク質は、試験、研究などに用いられるほか、医薬品として生体に直接投与することも可能である。精製後の膜タンパク質から膜タンパク質製剤を製造するには、膜タンパク質溶液に製剤用基材を混合して、所定の剤形に成形する。この際、上述したようにＰＣポリマーは生体毒性が低いため、可溶化時に用いられたＰＣポリマーが多少残存していても、生体に対して悪影響を及ぼすことがほとんどない。 The purified membrane protein can be used for testing, research, etc., and can be directly administered to a living body as a pharmaceutical product. In order to produce a membrane protein preparation from the purified membrane protein, a base material for preparation is mixed with the membrane protein solution and molded into a predetermined dosage form. At this time, since the PC polymer has low biotoxicity as described above, even if some PC polymer used at the time of solubilization remains, there is almost no adverse effect on the living body.
逆に、ＰＣポリマーは生体膜の構成成分と類似した構造のホスホリルコリン類似基を有しているため、膜タンパク質の保存安定性を向上させる。このため、膜タンパク質の可溶化に用いたＰＣポリマーが溶液中に残存した状態でそのまま保存することが好ましい。
このように、抽出後の膜タンパク質を可溶化剤が含まれた状態でそのまま保存することができるため、抽出後の溶液から透析などにより可溶化剤を除去したり、溶液を安定化剤などに置換したりする必要が無く、可溶化・保存工程の簡略化や膜タンパク質の収率向上などを図ることができる。
On the contrary, the PC polymer has a phosphorylcholine-like group having a structure similar to that of a constituent component of a biological membrane, thereby improving the storage stability of the membrane protein. For this reason, it is preferable to preserve | save as it is in the state in which the PC polymer used for solubilization of membrane protein remained in the solution.
In this way, the extracted membrane protein can be stored as it is in a state in which the solubilizing agent is contained, so that the solubilizing agent can be removed from the extracted solution by dialysis or the like, There is no need for substitution, so that the solubilization / preservation process can be simplified and the yield of membrane protein can be improved.
膜タンパク質製剤の剤形としては、その使用形態に応じて適宜設定することができる。剤形の種類としては、例えば散剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤、トローチ剤、貼付剤、軟膏剤、坐剤、噴霧剤、吸引剤などが挙げられる。そして、これらの剤形に応じて上記製剤用基剤から所望の製剤用基剤を選択したり、他の製剤用基剤を適宜配合したりすることができる。 The dosage form of the membrane protein preparation can be appropriately set according to the usage form. Examples of the dosage form include powders, fine granules, granules, pills, capsules, solutions, syrups, troches, patches, ointments, suppositories, sprays, and suction agents. And according to these dosage forms, a desired formulation base can be selected from the above formulation bases, or other formulation bases can be appropriately blended.
膜タンパク質製剤の投与方法としては、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、髄腔内投与、皮下投与、舌下投与、経直腸投与、点眼投与、経鼻投与、経皮投与など、公知の投与方法を用いることができる。なお、経口投与の場合は、散剤、細粒剤、カプセル剤などの薬剤の表面を、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートやヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの腸溶性コーティング剤や胃溶性コーティング剤で被覆することで、有効成分が所望の組織や器官に到達しやすいようにすることも可能である。 As the administration method of the membrane protein preparation, known as oral administration, intravenous administration, intramuscular administration, intrathecal administration, subcutaneous administration, sublingual administration, rectal administration, ophthalmic administration, nasal administration, transdermal administration, etc. An administration method can be used. For oral administration, it is effective to coat the surface of drugs such as powders, fine granules, and capsules with enteric coating agents such as hydroxypropylmethylcellulose acetate and hydroxypropylmethylcellulose phthalate and gastric coating agents. It is also possible to make it easier for the ingredients to reach the desired tissue or organ.
このような膜タンパク質を有効成分とする膜タンパク質製剤は、細胞増殖因子やホルモンなどと特異的に結合するため、これらの成分が過剰に産生されることが原因の疾患、例えば糖尿病、高血圧、心不全、腎不全、膠原病、リウマチ、関節炎などの治療薬として有効である。 Membrane protein preparations containing such membrane proteins as active ingredients specifically bind to cell growth factors, hormones, etc., so diseases caused by excessive production of these components such as diabetes, hypertension, heart failure It is effective as a therapeutic agent for renal failure, collagen disease, rheumatism, arthritis and the like.
（実施例１、２）
以下に、本発明の膜タンパク質可溶化剤について実施例を挙げて説明をする。本実施例では、膜タンパク質として、Ｇタンパク質共役型受容体（以下、ＧＰＣＲ）の一種であるマウス肝臓由来のアディポネクチンＲ２受容体（以下、ＡｄｉｐｏＲ２受容体）を使用した。また、本発明の共重合体であるＰＣポリマーは、ホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）としてＭＰＣ、アルキル基含有単量体（ａ２）としてＢＭＡを用い、ＭＰＣとＢＭＡのモル比が５：５の共重合体（以下、ＰＭＢ５０）、モル比が３：７の共重合体（ＰＭＢ３０）の２種類の共重合体を使用した。
(Examples 1 and 2)
Hereinafter, the membrane protein solubilizer of the present invention will be described with reference to examples. In this example, mouse membrane-derived adiponectin R2 receptor (hereinafter referred to as AdipoR2 receptor), which is a kind of G protein-coupled receptor (hereinafter referred to as GPCR), was used as a membrane protein. The PC polymer which is a copolymer of the present invention uses MPC as the phosphorylcholine-like group-containing monomer (a1) and BMA as the alkyl group-containing monomer (a2), and the molar ratio of MPC to BMA is 5: Two types of copolymers, a copolymer of 5 (hereinafter referred to as PMB50) and a copolymer having a molar ratio of 3: 7 (PMB30), were used.
＜ＰＭＢ５０およびＰＭＢ３０の調整＞
ＭＰＣ（日本油脂製）とＢＭＡ（ナカライ製）を用いてＰＭＢ５０およびＰＭＢ３０を合成した。本発明で用いるＰＭＢ５０およびＰＭＢ３０は、
石原ら、「りん脂質ポリマの調製及びそれらのポリマのヒドロゲル膜としての性質」、ポリマージャーナル（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ）、１９９０年５月、Ｖｏｌ．２２、Ｎｏ．５、ｐ．３５５−３６０、
に記載された方法に従って製造した。
ＰＭＢ５０の合成方法について簡単に説明すると、ＭＰＣとＢＭＡを５０ｍｏｌ：５０ｍｏｌのモル比となるようにテトラヒドロフランとエタノールの混合溶媒中に溶解し、重合開始剤としてα、α´−アゾビスイソブチロニトリルを添加して６０℃、２．５時間反応させることにより合成した。
ＰＭＢ３０についても同様に、ＭＰＣとＢＭＡを３０ｍｏｌ：７０ｍｏｌのモル比となるようにテトラヒドロフランとエタノールの混合溶媒中に溶解し、重合開始剤としてα、α´−アゾビスイソブチロニトリルを添加して６０℃、２．５時間反応させることにより合成した。
<Adjustment of PMB50 and PMB30>
PMB50 and PMB30 were synthesized using MPC (manufactured by NOF Corporation) and BMA (manufactured by Nacalai). PMB50 and PMB30 used in the present invention are:
Ishihara et al., “Preparation of Phospholipid Polymers and Their Properties as Hydrogel Films”, Polymer Journal, May 1990, Vol. 22, no. 5, p. 355-360,
Was prepared according to the method described in 1.
Briefly explaining the synthesis method of PMB50, MPC and BMA are dissolved in a mixed solvent of tetrahydrofuran and ethanol so as to have a molar ratio of 50 mol: 50 mol, and α, α′-azobisisobutyronitrile is used as a polymerization initiator. Was added and reacted at 60 ° C. for 2.5 hours.
Similarly, for PMB30, MPC and BMA are dissolved in a mixed solvent of tetrahydrofuran and ethanol so that the molar ratio is 30 mol: 70 mol, and α, α′-azobisisobutyronitrile is added as a polymerization initiator. It was synthesized by reacting at 60 ° C. for 2.5 hours.
＜ＡｄｉｐｏＲ２受容体の可溶化＞
２０週齢マウスの肝臓を摘出し、肝臓組織１ｇにつき、０．１Ｍ、ｐＨ７．５のＴＢＳ（Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ：トリス緩衝生理食塩水）、１％のプロテアーゼインヒビターの混合溶液を添加し、ホモジナイザ（池本理化社製テフロン（登録商標）ホモジナイザ）にて４℃、１分間ホモジナイズして肝臓組織を破砕した。
ホモジナイズ処理で得られた懸濁液を１．５ｍｌの遠心分離用マイクロチューブに１００μｌずつ分注し、４℃、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、ＡｄｉｐｏＲ２受容体を含む難溶性タンパク質と水溶性タンパク質を分離した。遠心分離後の上清を除去して沈殿のみを回収した。再度、０．１Ｍ、ｐＨ７．５のＴＢＳ（Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ：トリス緩衝生理食塩水）、１％のプロテアーゼインヒビター混合溶液を添加して洗浄し、上記条件にて遠心分離を行った。この工程を計３回繰り返した。
最終的に得られた沈殿に３種類の膜タンパク質可溶化剤を１ｍｌ添加して混合し、肝細胞懸濁液を得た。膜タンパク質可溶化剤の条件は以下の通りである。
実施例１：５重量％濃度ＰＭＢ５０
実施例２：５重量％濃度ＰＭＢ３０
比較例： ５重量％濃度 Ｍｅｍ−ＰＥＲ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）
<Solubilization of AdipoR2 receptor>
The liver of a 20-week-old mouse was removed, and a mixed solution of 0.1 M, pH 7.5 TBS (Tris Buffered Saline), 1% protease inhibitor was added to 1 g of liver tissue, and a homogenizer ( The liver tissue was crushed by homogenization at 4 ° C. for 1 minute using a Teflon (registered trademark) homogenizer manufactured by Ikemoto Rika Co., Ltd.
Dispense 100 μl each of the suspension obtained by the homogenization treatment into a 1.5 ml centrifuge microtube, and centrifuge at 4 ° C. and 1000 rpm for 5 minutes to produce a sparingly soluble protein containing AdipoR2 receptor and a water-soluble protein. Separated. The supernatant after centrifugation was removed and only the precipitate was collected. Again, 0.1 M, pH 7.5 TBS (Tris Buffered Saline: Tris buffered saline), 1% protease inhibitor mixed solution was added and washed, and centrifugation was performed under the above conditions. This process was repeated a total of 3 times.
1 ml of three kinds of membrane protein solubilizers were added to and mixed with the finally obtained precipitate to obtain a hepatocyte suspension. The conditions for the membrane protein solubilizer are as follows.
Example 1: 5 wt% PMB50
Example 2: 5 wt% PMB30
Comparative Example: 5 wt% Concentration Mem-PER Eukaryotic Membrane Protein Extraction Reagent Kit (manufactured by PIERCE)
続いて、実施例１，２および比較例の肝細胞懸濁液に対して、アウトプットコントロールレベル１で１０分間超音波処理して、ＡｄｉｐｏＲ２受容体の細胞膜からの可溶化を行った。超音波処理後の溶液を３７℃、１時間インキュベートし、その後、４℃、１０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した後に、上清のみを取得した。 Subsequently, the hepatocyte suspensions of Examples 1 and 2 and Comparative Example were sonicated for 10 minutes at output control level 1 to solubilize the AdipoR2 receptor from the cell membrane. The solution after sonication was incubated at 37 ° C. for 1 hour, and then centrifuged at 4 ° C., 1000 rpm for 20 minutes, and then only the supernatant was obtained.
＜ＡｄｉｐｏＲ２受容体の確認＞
上記実施例１，２および比較例の上清中にＡｄｉｐｏＲ２受容体が含まれているか否かを、ウェスタンブロッティングにより確認した。
まず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）用の４ウェルの電気泳動用ゲルを作成した。作成したゲルを泳動槽にセットして、２５ｍＭＴｒｉｓ緩衝液を泳動槽に注入してゲルを浸漬させた。次に、遠心分離で分離した実施例１，２、比較例の各上清に、９％ＳＤＳ、１５％２−メルカプトエタノール、４０ｍｌＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファ、３０％グリセリンとなるよう調整した試料処理液を、上清：試料処理液＝１：２となるように混合して、全量を６０μｌとした。ＳＤＳ処理した試料をそれぞれゲル上のウェルに注入して、電気泳動装置（アドバンテック社製ＦＰ−０８０）で２０ｍＡ、１８０分間通電して電気泳動を行った。
<Confirmation of AdipoR2 receptor>
Whether or not the AdipoR2 receptor was contained in the supernatants of Examples 1 and 2 and the comparative example was confirmed by Western blotting.
First, a 4-well electrophoresis gel for SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) was prepared. The prepared gel was set in the electrophoresis tank, and 25 mM Tris buffer was injected into the electrophoresis tank to immerse the gel. Next, the sample treatment solutions prepared to be 9% SDS, 15% 2-mercaptoethanol, 40 ml Tris-HCl buffer, and 30% glycerin are added to the supernatants of Examples 1 and 2 and Comparative Example separated by centrifugation. The mixture was mixed so that the supernatant: the sample treatment solution was 1: 2, so that the total amount was 60 μl. Each SDS-treated sample was injected into a well on the gel, and electrophoresis was carried out by applying current at 20 mA for 180 minutes with an electrophoresis apparatus (FP-080 manufactured by Advantech).
続いて、電気泳動後のゲルを用いてウェスタンブロッティングを行った。ブロッティング装置としてバイオラッド社製ＴｒａｎｓＢｌｏｔ（登録商標） Ｃｅｌｌ、転写膜としてＭＳＩ社製ＰＶＤＦメンブレムを使用した。ブロッティングバッファとして１９２ｍＭグリシン、２５ｍＭＴｒｉｓバッファ、２０％メタノールを使用し、ブロッキング剤として５％スキムミルクを添加したＴＴＢＳ溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）を使用した。また、一次抗体として、マウス抗ＡｄｉｐｏＲ２受容体抗体（ＡＬＰＨＡ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ社製）を希釈率１０００倍にして使用した。二次抗体として、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＣＥＬＬ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＰＲＯＤＵＣＴ社製）を希釈率１０００倍にして使用した。
電気泳動後のゲルを２５℃、３時間、８０Ｖにて転写膜に転写し、転写後の転写膜にブロッキング剤を添加して２５℃、１時間振とうして転写膜をブロッキングして、ブロッキング反応後にブロッティングバッファで３回洗浄した。ブロッキング後の転写膜に一次抗体を添加して、４℃、１６時間振とうして転写膜と反応させ、反応後の転写膜を上記ブロッティングバッファで３回洗浄した。
一次抗体反応後の転写膜に二次抗体を添加して、２５℃、１時間振とうして一次抗体と反応させ、反応後の転写膜をＴＴＢＳ溶液で３回洗浄した。
反応後の転写膜をラップ上に載置した後、転写膜を発色剤（ＥＣＬ ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と反応させて、転写膜に転写されたＡｄｉｐｏＲ２受容体を検出した。
Subsequently, Western blotting was performed using the gel after electrophoresis. TransBlot (registered trademark) Cell manufactured by Bio-Rad was used as a blotting device, and PVDF membrane manufactured by MSI was used as a transfer film. A TTBS solution (10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.4) using 192 mM glycine, 25 mM Tris buffer, 20% methanol as a blotting buffer and added with 5% skim milk as a blocking agent. used. Further, a mouse anti-AdipoR2 receptor antibody (manufactured by ALPHA DIAGNOSTIC INTERNATIONAL) was used as a primary antibody at a dilution ratio of 1000 times. As a secondary antibody, an HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody (manufactured by CELL SIGNALING PRODUCT) was used at a dilution rate of 1000 times.
The gel after electrophoresis is transferred to a transfer film at 25 ° C. for 3 hours at 80 V, a blocking agent is added to the transferred transfer film, and the transfer film is shaken at 25 ° C. for 1 hour to block the transfer film. After the reaction, it was washed 3 times with a blotting buffer. The primary antibody was added to the transfer film after blocking and shaken at 4 ° C. for 16 hours to react with the transfer film, and the transferred transfer film was washed three times with the blotting buffer.
The secondary antibody was added to the transfer membrane after the primary antibody reaction, and the mixture was reacted with the primary antibody by shaking at 25 ° C. for 1 hour, and the transfer membrane after the reaction was washed 3 times with a TTBS solution.
After the transfer film after the reaction was placed on a wrap, the transfer film was reacted with a color former (ECL plus Western Blotting Detection: manufactured by Amersham Bioscience) to detect the AdipoR2 receptor transferred to the transfer film.
図１はウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。左から順に、（１）比較例、（２）実施例２（ＰＭＢ３０）、（３）実施例１（ＰＭＢ５０）の結果を示している。
この図からわかるように、（１）の比較例の場合と実施例１、２のいずれの場合においても、ＡｄｉｐｏＲ２受容体の存在を示す約５０ｋＤａのバンドが検出されていることから、ＡｄｉｐｏＲ２受容体が上清中に溶解（すなわち、可溶化）していることがわかる。しかも、両者のバンドの検出強度がほぼ等しいことから、ＰＭＢ５０、ＰＭＢ３０ともに、従来の界面活性剤と同様に高い膜タンパク質可溶化能力を備えていることがわかる。
FIG. 1 is a photograph showing the results of Western blotting. The results of (1) Comparative Example, (2) Example 2 (PMB30), and (3) Example 1 (PMB50) are shown in order from the left.
As can be seen from this figure, a band of about 50 kDa indicating the presence of the AdipoR2 receptor was detected in both cases of the comparative example (1) and Examples 1 and 2, so that the AdipoR2 receptor Is dissolved (ie, solubilized) in the supernatant. Moreover, since the detected intensities of both bands are almost equal, it can be seen that both PMB50 and PMB30 have a high membrane protein solubilizing ability as with conventional surfactants.
（実施例３〜８）
次に、膜タンパク質可溶化剤による抽出後の膜タンパク質の活性残存試験を行った。
本実施例では、膜タンパク質としてインスリン受容体（Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＩＲ）を用いた。
図２に、インスリン受容体の模式図を示す。この図に示すように、インスリン受容体は、αサブユニットとβサブユニットがＳ−Ｓ結合により２個ずつ会合した４量体タンパク質である。αサブユニットにはインスリン結合ドメインがあり、完全に膜外に存在する。βサブユニットには、膜外に存在する領域、膜貫通領域、細胞内に存在する領域があり、このうち細胞内領域にインスリンによって活性化されるチロシンキナーゼドメインが存在する。
(Examples 3 to 8)
Next, the activity remaining test of the membrane protein after extraction with a membrane protein solubilizer was performed.
In this example, an insulin receptor (IR) was used as a membrane protein.
FIG. 2 shows a schematic diagram of the insulin receptor. As shown in this figure, the insulin receptor is a tetrameric protein in which two α subunits and two β subunits are associated with each other by S—S bonds. The α subunit has an insulin binding domain and is completely extramembranous. The β subunit has a region existing outside the membrane, a transmembrane region, and a region present in the cell. Among them, a tyrosine kinase domain activated by insulin exists in the intracellular region.
インスリンがαサブユニットのインスリン結合ドメインに結合すると、βサブユニットのチロシンキナーゼドメインが刺激され、まず受容体の自己リン酸化により細胞質タンパク質であるインスリン受容体基質（Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ；ＩＲＳ）に対するチロシンキナーゼ活性が増加する。
チロシンキナーゼドメインにあるチロシン残基１１６２、１１６３がリン酸化されることはチロシンキナーゼ活性に必須であると考えられている。
When insulin binds to the insulin-binding domain of the α subunit, the tyrosine kinase domain of the β subunit is stimulated, and firstly, tyrosine kinase for insulin receptor substrate (IRS), which is a cytoplasmic protein, by autophosphorylation of the receptor. Increases activity.
It is believed that phosphorylation of tyrosine residues 1162, 1163 in the tyrosine kinase domain is essential for tyrosine kinase activity.
そこで、本実施例では、本発明の膜タンパク質可溶化剤（ＰＭＢ３０、ＰＭＢ５０）を実施例（実施例３〜８）とし、実施例１、２と同様にＰＩＥＲＣＥ社製の膜タンパク質可溶化剤を比較例（比較例３〜８）として活性残存試験を行った。具体的には、これら膜タンパク質可溶化剤を用いて生体組織からインスリン受容体を可溶化して抽出し、抽出後のサンプルをＥＬＩＳＡで分析してインスリン受容体の中に活性があるインスリン受容体の割合と、得られたインスリン受容体とそのリガンド（インスリン）との結合力を調べることで、活性残存の評価を行った。 Therefore, in this example, the membrane protein solubilizers (PMB30, PMB50) of the present invention were used as examples (Examples 3 to 8), and the membrane protein solubilizer manufactured by PIERCE was used in the same manner as in Examples 1 and 2. The activity residual test was done as a comparative example (comparative examples 3-8). Specifically, the insulin receptor is solubilized and extracted from biological tissue using these membrane protein solubilizers, and the extracted sample is analyzed by ELISA, and the insulin receptor is active in the insulin receptor. The residual activity was evaluated by examining the binding ratio between the obtained insulin receptor and its ligand (insulin).
（ステップ１）
４匹の１０週齢オス Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ａ〜Ｄ）（日本チャールス・リバー社製）を用意し、１６時間絶食させた。ＰＢＳ（−）でグルコースを溶かし、２匹（Ａ、Ｂ）にグルコース２ｇ／ｋｇを腹腔内注射し、マウスＡを注射後１５分後、マウスＢを２５分後に解剖して肝臓、骨格筋、内臓脂肪組織を取り出した。
残りの２匹（Ｃ、Ｄ）にＰＢＳ（−）を腹腔内注射し、いずれも１５分後に解剖して肝臓、骨格筋、内臓脂肪組織を取り出した。
マウスＡ〜Ｄから取り出したこれらの組織を速やかに液体窒素に入れ、冷蔵庫にて−８０℃で保存した。
これらのマウスのうちマウスＡ〜Ｃから取り出した組織を用い、以下の膜タンパク質抽出実験を行った。マウスＤの組織についてはそのまま保存しておいた。
(Step 1)
Four 10-week-old male C57BL / 6J mice (A to D) (manufactured by Charles River Japan) were prepared and fasted for 16 hours. Glucose was dissolved in PBS (−), and 2 animals (A, B) were intraperitoneally injected with 2 g / kg of glucose. Mouse A was injected 15 minutes after injection, and mouse B was dissected 25 minutes later to analyze liver, skeletal muscle, Visceral adipose tissue was removed.
The remaining two animals (C, D) were injected intraperitoneally with PBS (-), and after 15 minutes, each was dissected and liver, skeletal muscle, and visceral adipose tissue were removed.
These tissues taken out from the mice A to D were immediately put into liquid nitrogen and stored at −80 ° C. in a refrigerator.
The following membrane protein extraction experiments were performed using tissues extracted from mice A to C among these mice. The tissue of mouse D was stored as it was.
（ステップ２）
実施例３〜８と比較例の膜タンパク質可溶化剤によりマウスから取り出した組織からインスリン受容体を抽出する実験を行い、得られたインスリン受容体の濃度を定量した。
膜タンパク質可溶化剤（ＰＭＢ３０、ＰＭＢ５０、ＰＩＥＲＣＥの３種類）と１×ＴＢＳに、１×Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＰＩＥＲＣＥ社製）、１ｍＭ ＮａＦ（Ｓｉｇｍａ社製）、２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４（Ｓｉｇｍａ社製）を混合した。
(Step 2)
Experiments were conducted to extract insulin receptors from tissues taken from mice using the membrane protein solubilizers of Examples 3 to 8 and Comparative Examples, and the concentrations of the obtained insulin receptors were quantified.
Membrane protein solubilizers (3 types of PMB30, PMB50, PIERCE) and 1 × TBS, 1 × Protease Inhibitor (manufactured by PIERCE), 1 mM NaF (manufactured by Sigma), 2 mM Na 3 VO 4 (manufactured by Sigma) Mixed.
次に、１２０ｍｇの肝臓（又は骨格筋）と１ｍｌのＴＢＳを遠心管の中に入れ、ポリトロンホモジナイザでホモジナイズして均質液を得た。脂肪組織１２０ｍｇとＴＢＳ１ｍｌをダウンス型ホモジナイザ（ｓｏｆｔ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｉｎｄｅｒ）に入れ、手作業でホモジナイズして均質液を得た。これは、脂肪組織の膜タンパク質は、通常の方法でホモジナイズすると壊れやすいと言われているためである。 Next, 120 mg of liver (or skeletal muscle) and 1 ml of TBS were placed in a centrifuge tube and homogenized with a polytron homogenizer to obtain a homogeneous solution. Adipose tissue (120 mg) and TBS (1 ml) were placed in a Dose type homogenizer and homogenized manually to obtain a homogeneous solution. This is because adipose tissue membrane proteins are said to be fragile when homogenized by conventional methods.
上の工程で得られた均質液を３本の１．５ｍｌチューブに同量となるように分け、１０００ｇ、５分間、４℃で遠心分離した。脂肪組織の均質液については、この条件で遠心分離しても沈殿物が見られなかったため、さらに１００００ｇ、１５分間、４℃で遠心分離した。その結果、少量の沈殿物を確認することができた。
遠心分離後に上清を捨て、沈殿物をＰＩＥＲＣＥ社製のＲｅａｇｅｎｔ Ａ ３００μｌ（比較例３〜８）、ＰＭＢ３０ １ｍｌ（実施例３−１〜８−１）、ＰＭＢ５０ １ｍｌ（実施例３−２〜８−２）のいずれかを用いて溶かし、更に１ｍｌ注射器（２５Ｇ針）で沈殿物を含む溶液の吸引・吐出を１０回程度繰り返し、沈殿物を細かくした。
The homogeneous solution obtained in the above step was divided into three 1.5 ml tubes so as to have the same amount, and centrifuged at 1000 g for 5 minutes at 4 ° C. The homogenous adipose tissue solution was centrifuged at 10000 g for 15 minutes at 4 ° C. because no precipitate was observed after centrifugation under these conditions. As a result, a small amount of precipitate could be confirmed.
After centrifuging, the supernatant was discarded, and the precipitates were 300 μl of Reagent A manufactured by PIERCE (Comparative Examples 3 to 8), 1 ml of PMB30 (Examples 3-1 to 8-1), and 1 ml of PMB50 (Examples 3 to 8). -2), the solution containing the precipitate was further aspirated and discharged about 10 times with a 1 ml syringe (25G needle) to make the precipitate fine.
得られたサンプルに対して氷上で超音波処理（ｏｕｔｐｕｔ ｃｏｎｔｒｏｌ １、ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ １０％）を１０分間行い、３７℃、１時間インキュベーションした。その後、１００００ｇ、６分間、４℃で遠心分離を行い、上清を−８０℃で保存した。
なお、この際バッファ交換などは行っていない。すなわち、保存液中には、実施例や比較例の膜タンパク質可溶化剤が含まれた状態となっている。
The obtained sample was sonicated on ice (output control 1, duty cycle 10%) for 10 minutes and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, centrifugation was performed at 10000 g for 6 minutes at 4 ° C., and the supernatant was stored at −80 ° C.
At this time, buffer exchange or the like is not performed. That is, the preservation solution contains the membrane protein solubilizers of Examples and Comparative Examples.
抽出後２ヶ月目に、得られたサンプルに含まれるインスリン受容体の濃度を測定した。その結果を表１に示す。なお、肝臓、骨格筋からはインスリン受容体が抽出できるが（表１の「タンパク量（ｍｇ／ｍｌ）」の欄参照）、内臓脂肪組織についてはタンパク質濃度が０ｍｇ／ｍｌとなり、抽出できなかった。 Two months after extraction, the concentration of insulin receptor contained in the obtained sample was measured. The results are shown in Table 1. Insulin receptor can be extracted from liver and skeletal muscle (see the column of “protein amount (mg / ml)” in Table 1), but for visceral adipose tissue, the protein concentration was 0 mg / ml and could not be extracted. .
表１の「タンパク量」の欄に示す結果からわかるように、肝臓、骨格筋については、すべての実験において実施例の方が比較例よりも得られたインスリン受容体の濃度が明らかに高いことがわかる。加えて、実施例の方が比較例よりも得られるインスリン受容体のボリュームも多かった（比較例では２００μｌ弱に対し、実施例では１ｍｌ弱）。
このことから、実施例の膜タンパク質可溶化剤のほうが比較例の膜タンパク質可溶化剤よりも膜タンパク質の抽出能力に優れていることがわかる。
As can be seen from the result shown in the column of “protein amount” in Table 1, the concentration of the insulin receptor obtained in the example was clearly higher than that of the comparative example in all experiments for the liver and skeletal muscle. I understand. In addition, the volume of insulin receptor obtained in the Example was higher than that in the Comparative Example (Comparative Example was less than 200 μl, whereas the Example was less than 1 ml).
From this, it can be seen that the membrane protein solubilizers of the examples are superior to the membrane protein solubilizers of the comparative examples in the ability to extract membrane proteins.
（ステップ３）
次に、得られたサンプル中に含まれるインスリン受容体のうちリン酸化されたインスリン受容体の割合を検討した。
冷凍保存したサンプルを抽出後２ヶ月目に解凍し、リン酸化インスリン受容体とインスリン受容体の定量を行った。リン酸化インスリン受容体の定量は、ＥＬＩＳＡキット１（ＰｈｏｓｐｈｏＤｅｔｅｃｔＴＭ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｐＴｙｒ１１６２／１１６３））を用いて行った。また、インスリン受容体の定量は、ＥＬＩＳＡキット２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＢＡ０３８）を用いて行った。なお、ＥＬＩＳＡキット１は、チロシン残基１１６２、１１６３がリン酸化されたインスリン受容体のみと反応し、ＥＬＩＳＡキット２は、これらのチロシン残基がリン酸化されたかどうかにかかわらず反応する。
(Step 3)
Next, the ratio of the phosphorylated insulin receptor among the insulin receptors contained in the obtained sample was examined.
Samples stored frozen were thawed 2 months after extraction, and phosphorylated insulin receptor and insulin receptor were quantified. Phosphorylated insulin receptor was quantified using ELISA kit 1 (PhosphoDetect ™ Insulin Receptor (pTyr 1162/1163 )). Insulin receptor was quantified using ELISA kit 2 (Calbiochem Cat. No. CBA038). ELISA kit 1 reacts only with insulin receptors phosphorylated on tyrosine residues 1162 and 1163, and ELISA kit 2 reacts regardless of whether these tyrosine residues are phosphorylated.
まず、得られたサンプルのそれぞれについて上記２種類のＥＬＩＳＡキットを用いてＥＬＩＳＡを行い、実施例、比較例の膜タンパク質可溶化剤によって得られた全インスリン受容体に対するリン酸化されたインスリン受容体の割合を算出した。 First, ELISA was performed for each of the obtained samples using the above-mentioned two types of ELISA kits, and the phosphorylated insulin receptors for all insulin receptors obtained by the membrane protein solubilizers of Examples and Comparative Examples were compared. The percentage was calculated.
その結果、得られたインスリン受容体の中で活性があるインスリン受容体の割合を、表１の「Ｐ−ＩＲ／ＩＲ（Ｕｎｉｔ／ｎｇ）」の値で示す。
比較例よりも実施例の方が得られたサンプルのＰ−ＩＲ／ＩＲ値が全体的に高かったことから、比較例の膜タンパク質可溶化剤よりも実施例の膜タンパク質可溶化剤を用いてインスリン受容体の抽出を行ったほうが、活性を高く保持できることがわかる。
As a result, the ratio of the active insulin receptors in the obtained insulin receptors is shown by the value of “P-IR / IR (Unit / ng)” in Table 1.
Since the P-IR / IR value of the sample obtained in the example was higher than that in the comparative example, the membrane protein solubilizer of the example was used rather than the membrane protein solubilizer of the comparative example. It can be seen that the activity can be maintained higher when the insulin receptor is extracted.
なお、実験前には、マウスＡ、ＢのサンプルのＰ−ＩＲ／ＩＲ値は、マウスＣより倍以上高いと予想したが、実際は大きな差が見られなかった。すなわち、肝臓サンプルでは差がほとんど無く、骨格筋サンプルではマウスＢ／マウスＣ＝１．６８（ＰＭＢ３０）、マウスＢ／マウスＣ＝１．５３（ＰＭＢ５０）と、１．５倍程度と低いものになった。これは、グルコース注射後１０分、２５分後では、各組織内のインスリン受容体の活性がまだピークに達していないと考えられる。このため、マウスＡ〜Ｃの結果は、いずれもインスリン受容体のベースレベル（すなわち、空腹状態でどの程度インスリン受容体が活性化しているか）を示す可能性が高いと考えられる。 Before the experiment, the P-IR / IR values of the samples of mice A and B were expected to be more than double that of mouse C, but in reality, no significant difference was observed. That is, there is almost no difference in the liver sample, and in the skeletal muscle sample, mouse B / mouse C = 1.68 (PMB30) and mouse B / mouse C = 1.53 (PMB50), which are as low as about 1.5 times. became. This is considered that the activity of the insulin receptor in each tissue has not yet reached its peak at 10 minutes and 25 minutes after the glucose injection. For this reason, it is considered that the results of mice A to C are likely to indicate the base level of the insulin receptor (that is, how much the insulin receptor is activated in the fasted state).
（ステップ４）
次に、別の評価方法でインスリン受容体の活性残存性を調べた。
まず、ステップ２で得られたインスリン受容体を含んだ膜タンパク質溶液に９６ウェルプレートを一晩浸してコーティングした。Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ （Ｓ−Ｔｙｐｅ）を用意し、キットのインスリン抗体固相化９６ウェルプレートに替えて、上で一晩コーティングしたプレートを使用した。
インスリン受容体と試薬との反応、吸光度の測定は、シバヤギ社のプロトコールに従った。概要としては、まずプレートにインスリンを加え、次に酵素標識インスリン二次抗体、酵素基質（発色試薬）を順次反応させた。そして、反応後の溶液の４５０ｎｍの吸光度を測定することで、インスリン受容体とインスリンとの結合力を評価した。
(Step 4)
Next, the remaining activity of the insulin receptor was examined by another evaluation method.
First, the 96-well plate was soaked overnight in the membrane protein solution containing the insulin receptor obtained in Step 2 and coated. A Mouse Insulin ELISA Kit (S-Type) was prepared, and instead of the insulin antibody-immobilized 96-well plate in the kit, a plate coated overnight was used.
The reaction between the insulin receptor and the reagent and the measurement of the absorbance were in accordance with Shibayagi protocol. As a summary, first, insulin was added to the plate, and then an enzyme-labeled insulin secondary antibody and an enzyme substrate (coloring reagent) were reacted sequentially. And the binding force of an insulin receptor and insulin was evaluated by measuring the light absorbency of 450 nm of the solution after reaction.
この測定結果を表１に示す（「吸光度（インスリン結合力）」の欄参照）。
この表からわかるように、実施例と比較例のいずれも骨格筋よりも肝臓の方が吸光度が高く、骨格筋ではほぼブランクウェルの吸光度と同じであった。
この結果から、実施例、比較例ともに、インスリンとの結合力が温存されていることがわかった。
The measurement results are shown in Table 1 (see the column of “absorbance (insulin binding force)”).
As can be seen from this table, the absorbance of the liver was higher in the liver than in the skeletal muscle in both the Examples and Comparative Examples, and the absorbance in the skeletal muscle was almost the same as that in the blank well.
From these results, it was found that the binding force with insulin was preserved in both the examples and comparative examples.
以上の結果から、本発明の膜タンパク質可溶化剤（実施例）の方が従来の膜タンパク質可溶化剤（比較例）よりも膜タンパク質の可溶化能が優れるとともに、可溶化後の膜タンパク質の活性を高い状態で維持していることがわかった。
これは、本発明の膜タンパク質可溶化剤が、生体膜と類似した構造を備えたホスホリルコリン類似基を含んでいるため、膜タンパク質の可溶化の際に膜タンパク質可溶化剤が膜タンパク質の安定化に貢献し、膜タンパク質の構造変化をほとんど引き起こすことなく可溶化できたためと考えられる。
This is because the membrane protein solubilizer of the present invention contains a phosphorylcholine-like group having a structure similar to that of a biological membrane, so that the membrane protein solubilizer stabilizes the membrane protein when solubilizing the membrane protein. This is thought to be because it was solubilized with almost no structural change in the membrane protein.
また、得られたサンプルのうちマウスＡの肝臓（実施例３、比較例３）とマウスＢの骨格筋（実施例７、比較例７）については、抽出直後の活性（Ｐ−ＩＲ／ＩＲ）を測定し、抽出直後の活性と２ヶ月保存後の活性を比較することで、実施例と比較例とで保存安定性の違いを調べた。 Among the obtained samples, the activity immediately after extraction (P-IR / IR) of the liver of mouse A (Example 3, Comparative Example 3) and the skeletal muscle of mouse B (Example 7, Comparative Example 7) Was measured, and the activity immediately after extraction and the activity after storage for 2 months were compared to examine the difference in storage stability between the Examples and Comparative Examples.
この結果を表２に示す。この表に示すように、比較例３と比較例７のいずれも抽出直後から２ヶ月後では活性が低下していたが（比較例３では抽出直後の値１．２３９→２ヵ月後０．４４１、比較例７では抽出直後１．５０４→２ヵ月後０．４８２）、実施例３、７では一部（実施例３−１）に活性の低下が見られたものの、他のサンプルについては活性がほとんど低下していない。 The results are shown in Table 2. As shown in this table, the activity of both Comparative Example 3 and Comparative Example 7 decreased after 2 months from immediately after extraction (in Comparative Example 3, the value 1.239 immediately after extraction → 0.441 after 2 months). In Comparative Example 7, 1.504 immediately after extraction → 0.482 after 2 months), and in Examples 3 and 7, a decrease in activity was observed in part (Example 3-1), but other samples were active. Has hardly decreased.
特に、実施例７−１では抽出直後４．５６２→２ヶ月後４．６６７、実施例７−２では抽出直後２．５６０→２ヶ月後２．４２９と、いずれの実施例でも活性はほとんど変化していない。このことから、特に実施例７の膜タンパク質可溶化剤は、保存において膜タンパク質を安定化させていることがわかる。
以上の結果から、本発明の膜タンパク質可溶化剤は、膜タンパク質の抽出のみならず、その後の保存安定性にも貢献することがわかった。
From the above results, it was found that the membrane protein solubilizer of the present invention contributes not only to extraction of membrane proteins but also to subsequent storage stability.
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