JP2007289148A - Method for producing glucose dehydrogenase derived from aspergillus oryzae - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のグルコースデヒドロゲナーゼを遺伝子組み換えにより製造する方法に関する。 The present invention relates to a method for producing glucose dehydrogenase derived from Aspergillus oryzae by genetic recombination.
血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサにはグルコースを基質とする酵素が利用されている。そのような酵素の例としては例えばグルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有していることから血糖センサ用酵素として古くから利用されており、その最初の発表は実に４０年ほど前に遡る。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサにおいては、グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることで測定がなされるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。 Blood glucose self-measurement is important for diabetics to grasp their normal blood glucose level and use it for treatment. An enzyme using glucose as a substrate is used for a sensor used for blood glucose self-measurement. An example of such an enzyme is glucose oxidase (EC 1.1.3.4). Glucose oxidase has been used as an enzyme for blood glucose sensors for a long time because it has the advantage of high specificity for glucose and excellent thermal stability, and its first announcement dates back to about 40 years ago. . In a blood glucose sensor using glucose oxidase, measurement is performed by passing electrons generated in the process of oxidizing glucose and converting it to D-glucono-δ-lactone to the electrode through a mediator. There is a problem that dissolved oxygen affects the measured value because the protons generated in the above are easily passed to oxygen.
このような問題を回避するために、例えばＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４７）あるいはピロロピノリンキノン依存型グルコースデヒド
ロゲナーゼ（ＥＣ １．１．５．２（旧 ＥＣ１．１．９９．１７））が血糖センサ用酵素として用いられている。これらは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、前者のＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼは安定性の乏しさや補酵素の添加が必要という煩雑性がある。一方後者のピロロピノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼは、基質特異性に乏しくマルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため、測定値の正確性を損ねる可能性があるという欠点がある。
In order to avoid such problems, for example, NAD (P) -dependent glucose dehydrogenase (EC 1.1.1.47) or pyrrolopinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase (EC 1.1.5.2 (formerly EC1 .1.99.17)) is used as an enzyme for blood glucose sensors. These are superior in that they are not affected by dissolved oxygen, but the former NAD (P) -dependent glucose dehydrogenase has poor stability and the complexity of requiring the addition of a coenzyme. On the other hand, the latter pyrrolopinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase has poor substrate specificity and acts on saccharides other than glucose, such as maltose and lactose, and thus has the disadvantage of impairing the accuracy of the measured value.
非特許文献１〜４にはアスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼについて報告されているが、グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子に関しては報告されていない。また、非特許文献１〜４には、遺伝子組み換えによりアスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼを製造することについての記載はない。
また、特許文献１にはアスペルギルス属由来フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼが開示されている。本酵素は基質特異性に優れかつ溶存酸素の影響を受けない点で優位である。熱安定性については５０℃１５分処理で８９％程度の活性残存率であり安定性（以下、耐熱性とも表記）についても優れているとされている。特許文献２には、その遺伝子配列、アミノ酸配列が報告されている。
最近になって、アスペルギルス・オリゼの全ゲノム配列が決定された。しかしながら、当該配列のどの部分がグルコースデヒドロゲナーゼをコードしているかの情報はない。 Recently, the complete genome sequence of Aspergillus oryzae has been determined. However, there is no information as to which part of the sequence encodes glucose dehydrogenase.
本発明の目的は、より実用面において有利な血糖センサー用酵素を効率的に製造する方法を提供することである。より具体的には、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を特定、取得、利用し、該グルコースデヒドロゲナーゼを大量に安定的に製造する方法を確立することにある。 An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing an enzyme for a blood glucose sensor that is more practically advantageous. More specifically, it is to establish a method for stably producing a large amount of glucose dehydrogenase by specifying, obtaining and using a glucose dehydrogenase gene derived from Aspergillus oryzae.
本発明者らは、上記目的を達成するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデータベースを利用し、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を推定、取得し、該遺伝子を用い、大腸菌よりアスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼを取得できることを見出し、本出願に到った。
本発明によれば、アスペルギルス・オリゼより単離したグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を利用することにより、グルコースデヒドロゲナーゼを効率的に生産しかつ、より実用的なグルコースデヒドロゲナーゼを取得することが可能になる。
In order to achieve the above-mentioned object, the present inventors estimated and obtained a glucose dehydrogenase gene derived from Aspergillus oryzae using the database of National Center for Biotechnology Information (NCBI), and used the gene to aspergillus from Escherichia coli.・ The inventors have found that glucose dehydrogenase derived from oryzae can be obtained, and have arrived at the present application.
According to the present invention, it is possible to efficiently produce glucose dehydrogenase and obtain a more practical glucose dehydrogenase by using a glucose dehydrogenase gene isolated from Aspergillus oryzae.
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
［項１］
以下の（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子、もしくは、以下の（ｅ）または（ｆ）のタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターにより形質転換された形質転換体を栄養培地にて培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を製造する方法。
（ａ）配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号５に記載の塩基配列およびイントロンを含む、配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）（ｂ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ
（ｅ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｆ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
［項２］
宿主が大腸菌である項１に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を製造する方法。
［項３］
以下の（ａ）（ｂ）（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号５に記載の塩基配列およびイントロンを含む、配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）（ｂ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ
［項４］
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
［項５］
項３または４のいずれかに記載の遺伝子を含む組換えベクター。
［項６］
項５に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
［項７］
宿主が大腸菌である項６に記載の形質転換体。
［項８］
項６または７に記載の形質転換体を栄養培地にて培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生産する方法。
That is, the present invention has the following configuration.
[Claim 1]
It was transformed with a gene consisting of any of the following DNAs (a), (b), (c) and (d), or a recombinant vector containing a gene encoding the following protein (e) or (f): A method for producing a protein having glucose dehydrogenase activity, comprising culturing a transformant in a nutrient medium and collecting a protein having glucose dehydrogenase activity.
(A) DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5
(B) a DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and an intron
(C) DNA that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA of (a) under a stringent condition and encodes a protein having glucose dehydrogenase activity
(D) DNA comprising a region encoding a protein that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA of (b) and has glucose dehydrogenase activity
(E) a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 (f) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added (inserted) in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and Protein having glucose dehydrogenase activity [Item 2]
Item 2. A method for producing a protein having glucose dehydrogenase activity according to Item 1, wherein the host is Escherichia coli.
[Section 3]
A gene comprising the following DNA (a) (b) (c) or (d):
(A) DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5
(B) a DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and an intron
(C) DNA that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA of (a) under a stringent condition and encodes a protein having glucose dehydrogenase activity
(D) DNA comprising a region encoding a protein that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA of (b) and has glucose dehydrogenase activity
[Claim 4]
A gene encoding the following protein (a) or (b).
(A) a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 (b) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added (inserted) in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and Protein having glucose dehydrogenase activity [Item 5]
Item 5. A recombinant vector comprising the gene according to any one of Items 3 and 4.
[Claim 6]
Item 6. A transformant transformed with the recombinant vector according to Item 5.
[Claim 7]
Item 7. The transformant according to item 6, wherein the host is E. coli.
[Section 8]
Item 8. A method for producing a protein having glucose dehydrogenase activity, comprising culturing the transformant according to Item 6 or 7 in a nutrient medium and collecting a protein having glucose dehydrogenase activity.
本発明により、グルコースデヒドロゲナーゼを効率的に生産することができるようになった。また、より実用的なグルコースデヒドロゲナーゼを取得するために分子生物学的な改良を行うことが容易になった。 According to the present invention, glucose dehydrogenase can be produced efficiently. It has also become easier to make molecular biological improvements in order to obtain more practical glucose dehydrogenase.
本発明者らは、上記目的を達成するために、ＮＣＢＩのデータベースを利用し、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨとも表記）と推測される遺伝子ＤＮＡを見出した。 In order to achieve the above object, the present inventors have found a gene DNA presumed to be glucose dehydrogenase (also referred to as GDH) using the NCBI database.
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（遺伝子）は、ＮＣＢＩのデータベースから予測される、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株由来のグルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ（遺伝子）を含む、イントロンを除去していないゲノム遺伝子配列である。 The DNA (gene) having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 includes a DNA (gene) encoding glucose dehydrogenase derived from the Aspergillus oryzae RIB40 strain predicted from the NCBI database, and having no intron removed. Gene sequence.
配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（遺伝子）は、配列番号１からイントロンを除去したものである。 DNA (gene) having the base sequence described in SEQ ID NO: 2 is obtained by removing introns from SEQ ID NO: 1.
配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、ＮＣＩＢのデータベースから予測されるグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の全配列を示す。 The gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 represents the entire sequence of the glucose dehydrogenase gene predicted from the NCIB database.
本発明者らは、非特許文献１〜４、ＮＣＢＩのデータベースなどから、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）の同定は容易になしうると予想していた。
そしてさらに、当該遺伝子を含有する組換えベクターを作製し、形質転換した形質転換体を作り、形質転換体が発現する当該遺伝子がコードするタンパク質を精製することも容易になしうると考えていた。
The present inventors predicted that DNA (gene) encoding a protein having glucose dehydrogenase activity derived from Aspergillus oryzae can be easily identified from Non-Patent Documents 1 to 4 and NCBI database.
Furthermore, it was thought that a recombinant vector containing the gene can be produced, a transformed transformant can be produced, and a protein encoded by the gene expressed by the transformant can be easily purified.
具体的には、本発明者らは、ＮＣＢＩのデータベースではアスペルギルス・オリゼ由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードするアミノ酸配列部分および塩基配列部分は特定されていないものの、非特許文献１〜４に記載された方法や公知技術を参考にしてアスペルギルス・オリゼを培養し、その培養上清から各種クロマトグラフィーを用いてＧＤＨを精製して、その末端アミノ酸配列などを分析してプローブを作製し、グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を単離することを試みた。 Specifically, although the amino acid sequence part and base sequence part which code for the flavin-binding glucose dehydrogenase derived from Aspergillus oryzae are not specified in the NCBI database, the present inventors described in Non-Patent Documents 1 to 4. Culturing Aspergillus oryzae with reference to the prepared methods and known techniques, purifying GDH from the culture supernatant using various chromatography, analyzing its terminal amino acid sequence, etc. to produce a probe, and glucose dehydrogenase Attempts were made to isolate the gene encoding.
同様に、本発明者らは、アスペルギルス・テレウスに属する微生物を独自に入手してグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を単離することを試みた。 Similarly, the present inventors independently obtained a microorganism belonging to Aspergillus terreus and attempted to isolate a gene encoding glucose dehydrogenase.
本発明者らは種々検討したが、通常行う塩析、クロマトグラフィー等を用いた精製法では、アスペルギルス・オリゼＴＩ株培養上清から、高純度で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ではっきりと確認できるＧＤＨ標品を得るのは困難であることが分かった。酵素タンパク質に結合しているであろう糖鎖が精製、確認を困難にしている原因の１つであると推察した。したがって、遺伝子取得の常法の１つである部分アミノ酸配列を利用したクローニングを断念せざるを得ないと判断した。
このため、遺伝子取得には多くの試行錯誤をともない、非常な困難を極めたが、鋭意検討の結果、アスペルギルス・オリゼ由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を単離し、本願発明を完成するに至った。
その詳細は実施例１〜３に後述する。
The inventors of the present invention have made various studies. In the usual purification method using salting out, chromatography, etc., the GDH standard that can be clearly confirmed on SDS-PAGE with high purity from the culture supernatant of Aspergillus oryzae strain TI. It turned out that it was difficult to obtain goods. It was inferred that the sugar chain that would be bound to the enzyme protein was one of the causes that made purification and confirmation difficult. Therefore, it was determined that cloning using a partial amino acid sequence, which is one of the common methods for gene acquisition, must be abandoned.
For this reason, gene acquisition was extremely difficult with many trials and errors, but as a result of intensive studies, a gene encoding a flavin-binding glucose dehydrogenase derived from Aspergillus oryzae was isolated and the present invention was completed. It came to.
Details thereof will be described later in Examples 1 to 3.
本発明の一実施形態は、以下の（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子、もしくは、以下の（ｅ）または（ｆ）のタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターにより形質転換体を栄養培地にて培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を製造する方法である。 One embodiment of the present invention includes a gene consisting of the DNA of any one of the following (a), (b), (c) and (d), or a gene encoding the following protein (e) or (f): It is a method for producing a protein having glucose dehydrogenase activity, which comprises culturing a transformant in a nutrient medium using a recombinant vector and collecting a protein having glucose dehydrogenase activity.
（ａ）配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（遺伝子）は、本願発明者が同定した、後述のアスペルギルス・オリゼ ＴＩ株由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）の全配列を示す。また、
（ｃ）配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）も、本発明に適用できる。
(A) The DNA (gene) having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 is the entire DNA (gene) encoding a protein having glucose dehydrogenase activity derived from the Aspergillus oryzae TI strain described later, as identified by the present inventors. Indicates the sequence. Also,
(C) DNA (gene) that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and that encodes a protein having glucose dehydrogenase activity, Applicable to the present invention.
（ｂ）配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（遺伝子）は、後述のアスペルギルス・オリゼ ＴＩ株由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）を含む、イントロンを除去していないゲノム遺伝子配列である。また、
（ｄ）配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性をコードする領域を含むＤＮＡも、本発明に適用できる。
(B) The DNA (gene) having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8 contains DNA (gene) encoding a protein having glucose dehydrogenase activity derived from the Aspergillus oryzae TI strain described later, and does not remove introns. Genomic gene sequence. Also,
(D) DNA comprising a region that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 and which encodes a glucose dehydrogenase activity is also included in the present invention. Applicable.
（ｅ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子とは、後述のアスペルギルス・オリゼ TI株由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）の全配列を示す。また、
（ｆ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）も、本発明にに適用できる。
(E) The gene encoding a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 represents the entire sequence of DNA (gene) encoding a protein having glucose dehydrogenase activity derived from the Aspergillus oryzae TI strain described later. Also,
(F) A DNA (gene) encoding a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added (inserted) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and having glucose dehydrogenase activity It can be applied to the present invention.
本発明のＤＮＡ（遺伝子）は本ＧＤＨの発現を向上させるように、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を変更したものを含みうる。 The DNA (gene) of the present invention may include a modified codon usage to improve the expression of the present GDH.
例えば、上記のアスペルギルス・オリゼ由来のＧＤＨ遺伝子を発現用ベクター（プラスミド等多くのものが当該技術分野において知られている）に挿入し、適当な宿主（大腸菌等多くのものが当該技術分野において知られている）を形質転換する。得られた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、ＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。 For example, the GDH gene derived from Aspergillus oryzae described above is inserted into an expression vector (many things such as plasmids are known in the art), and an appropriate host (many things such as E. coli are known in the art). Is transformed). After culturing the obtained transformant and collecting the bacterial cells from the culture solution by centrifugation or the like, the bacterial cells are destroyed by a mechanical method or an enzymatic method such as lysozyme, and if necessary, such as EDTA A water-soluble fraction containing GDH can be obtained by adding a chelating agent or a surfactant and solubilizing. Alternatively, the expressed GDH can be secreted directly into the culture medium by using an appropriate host vector system.
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。 The GDH-containing solution obtained as described above is precipitated by, for example, vacuum concentration, membrane concentration, salting-out treatment with ammonium sulfate, sodium sulfate or the like, or fractional precipitation with a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, etc. You just have to let them know. Heat treatment and isoelectric point treatment are also effective purification means. Further, purified GDH can be obtained by performing gel filtration using an adsorbent or a gel filter, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography. The purified enzyme preparation is preferably purified to the extent that it shows a single band on electrophoresis (SDS-PAGE).
これらは、例えば、以下の文献に従って進めることができる。
（ａ）タンパク質実験プロトコール第１巻 機能解析編，第２巻 構造解析編 （秀潤社） 西村善文，大野茂男 監修
（ｂ）改訂 タンパク質実験ノート 上 抽出と分離精製 （洋土社） 岡田雅人，宮崎香
編集
（ｃ）タンパク質実験の進めかた （洋土社） 岡田雅人，宮崎香 編集
あるいは以下に例示する方法によって進めることもできる。
These can proceed according to the following literature, for example.
(A) Protein Experiment Protocol Volume 1 Functional Analysis, Volume 2 Structural Analysis (Syujunsha) Supervised by Yoshifumi Nishimura and Shigeo Ohno (b) Revised Protein Experiment Notes Extraction and separation and purification (Yodosha) Masato Okada, Kaori Miyazaki
Editing (c) How to proceed with protein experiments (Yodosha) Edited by Masato Okada and Kaori Miyazaki or by the method exemplified below.
作製されたタンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、ベクターと連結された状態にて宿主微生物中に移入される。 The prepared DNA having the genetic information of the protein is transferred into the host microorganism in a state of being linked to the vector.
ベクターとしては、宿主微生物内で自立的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄａ ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１などが例示される。また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどが例示される。なかでも、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど、クローニングサイト上流にエシェリヒア・コリ内で認識されうるプロモーターを保持するものが好ましい。
また、適当な宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自立増殖可能で外来遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。エシェリヒア・コリではエシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＤＨ５αなどを用いることができる。
Suitable vectors are those constructed for gene recombination from phages or plasmids that can grow independently in a host microorganism. Examples of the phage include Lambda gt10 and Lambda gt11 when Escherichia coli is used as a host microorganism. Examples of plasmids include pBR322, pUC19, pKK223-3, and pBluescript when Escherichia coli is used as a host microorganism. Of these, pBluescript or the like that retains a promoter that can be recognized in Escherichia coli upstream of the cloning site is preferable.
In addition, a suitable host microorganism is not particularly limited as long as the recombinant vector is stable, can self-propagate and can express a foreign gene. In Escherichia coli, Escherichia coli W3110, Escherichia coli C600, Escherichia coli HB101, Escherichia coli JM109, Escherichia coli DH5α, and the like can be used.
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＤＨ５α；東洋紡績製）を用いても良い。宿主として、酵母が用いられる場合にリチウム法、エレクトロポレーション法が、また、糸状菌が用いられ場合にはプロトプラスト法などが用いられる。 As a method for transferring the recombinant vector into the host microorganism, for example, when the host microorganism is a microorganism belonging to the genus Escherichia, a method for transferring the recombinant DNA in the presence of calcium ions can be employed. An electroporation method may be used. Furthermore, a commercially available competent cell (for example, competent high DH5α; manufactured by Toyobo) may be used. When yeast is used as the host, the lithium method or electroporation method is used. When filamentous fungi are used, the protoplast method or the like is used.
本発明において、ＧＤＨをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。アスペルギルス・オリゼのゲノム配列情報を用い、予測ＧＤＨ遺伝子を見出すことができる。ついで、アスペルギルス・オリゼの菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成する。こうして得られたｃＤＮＡをテンペレートとして、ＰＣＲ法によりＧＬＤ遺
伝子を増幅させ、本遺伝子をベクターと両ＤＮＡの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーを利用してＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組換え微生物を得る。
In the present invention, methods for obtaining a gene encoding GDH include the following methods. Using Aspergillus oryzae genome sequence information, a predicted GDH gene can be found. Next, mRNA is prepared from Aspergillus oryzae cells and cDNA is synthesized. Using the cDNA thus obtained as a template, the GLD gene is amplified by the PCR method, and this gene is bound to the vector at the blunt end or sticky end of both DNAs with DNA ligase or the like to construct a recombinant vector. After transferring the recombinant vector to a replicable host microorganism, a recombinant microorganism containing a gene encoding GDH is obtained using the marker of the vector.
上記のように得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＧＤＨを安定に生産し得る。組換え体の選択は、ベクターのマーカーとＧＤＨ活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧＤＨを生成する微生物を選択すればよい。 The microorganism which is a transformant obtained as described above can stably produce a large amount of GDH by being cultured in a nutrient medium. The selection of the recombinant may be carried out by searching for a microorganism that simultaneously expresses the marker of the vector and the GDH activity. For example, a microorganism that grows in a selective medium based on a drug resistance marker and generates GDH may be selected.
ＧＤＨ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読した。また、ＧＤＨのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。 The base sequence of the GDH gene was decoded by the dideoxy method described in Science, Vol. 214, 1205 (1981). The amino acid sequence of GDH was estimated from the base sequence determined as described above.
上記のようにして、一度選択されたＧＤＨ遺伝子を保有する組換えベクターより、他の微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ＧＤＨ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによる他の微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法、プロトプラスト法などを用いることができる。 As described above, transfer from a recombinant vector carrying a GDH gene once selected to a recombinant vector that can be replicated in another microorganism can be carried out by using a restriction enzyme or PCR method from the recombinant vector carrying the GDH gene. It can be easily carried out by collecting the DNA that is the GDH gene and binding it to other vector fragments. Further, for transformation of other microorganisms with these vectors, a competent cell method using calcium treatment, an electroporation method, a protoplast method, or the like can be used.
なお、本発明のＧＤＨ遺伝子は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、該遺伝子の翻訳後のアミノ酸配列の各アミノ酸残基の一部が欠失または置換されるようなＤＮＡ配列をもつものでもよく、また他のアミノ酸残基が付加または置換されるようなＤＮＡ配列をもつものでもよい。 The GDH gene of the present invention may have a DNA sequence in which a part of each amino acid residue of the translated amino acid sequence of the gene is deleted or substituted as long as it has glucose dehydrogenase activity. It may have a DNA sequence in which other amino acid residues are added or substituted.
野生型ＧＤＨをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。 As a method for modifying the gene encoding wild-type GDH, a commonly performed technique for modifying genetic information is used. That is, a DNA having genetic information of a modified protein is created by converting a specific base of DNA having genetic information of the protein, or by inserting or deleting a specific base. As a specific method for converting bases in DNA, for example, a commercially available kit (Transformer Mutagenesis Kit; manufactured by Clonetech, EXOIII / Mung Bean Selection Kit; manufactured by Stratagene, QuickChange SiteDirected MutagenStained MutaseNeste, etc.) Use of the chain reaction method (PCR) is mentioned.
形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよい。多くの場合は液体培養で行い、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。ただし、生産性を考えた場合に、宿主として糸状菌を使用し、固体培養で行った方が有利な場合もある。 The culture form of the host microorganism as a transformant may be selected in consideration of the nutritional physiological properties of the host. In many cases, it is advantageous to use liquid culture and industrially perform aeration and agitation culture. However, in consideration of productivity, it may be advantageous to use a filamentous fungus as a host and perform the solid culture.
培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、
炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
As a nutrient source of the medium, those commonly used for culturing microorganisms can be widely used. Any carbon compound that can be assimilated may be used as the carbon source. For example, glucose, sucrose, lactose, maltose, lactose, molasses, pyruvic acid and the like are used. The nitrogen source may be any available nitrogen compound. For example, peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, soybean cake alkaline extract, and the like are used. Others, phosphate,
Carbonate, sulfate, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, zinc and other salts, specific amino acids, specific vitamins and the like are used as necessary.
培養温度は菌が成育し、ＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくは２０〜３７℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、ＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは菌が発育し、ＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。 The culture temperature can be appropriately changed within the range in which the bacteria grow and produce GDH, but is preferably about 20 to 37 ° C. Although the culture time varies slightly depending on the conditions, the culture may be completed at an appropriate time in consideration of the time when GDH reaches the maximum yield, and is usually about 6 to 48 hours. The pH of the medium can be appropriately changed within the range in which the bacteria grow and produce GDH, but is preferably in the range of about pH 6.0 to 9.0.
培養物中のＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、ＧＤＨが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、ＧＤＨ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。ＧＤＨが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。 Although the culture solution containing the cells producing GDH in the culture can be collected and used as it is, generally, when GDH is present in the culture solution according to a conventional method, filtration, centrifugation, etc. It is used after separating the GDH-containing solution and the microbial cells. When GDH is present in the microbial cells, the microbial cells are collected from the obtained culture by means of filtration or centrifugation, and then the microbial cells are destroyed by a mechanical method or an enzymatic method such as lysozyme. Further, if necessary, a chelating agent such as EDTA and a surfactant are added to solubilize GDH and separated and collected as an aqueous solution.
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。 The GDH-containing solution obtained as described above is precipitated by, for example, vacuum concentration, membrane concentration, salting-out treatment with ammonium sulfate, sodium sulfate or the like, or fractional precipitation with a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, etc. You just have to let them know. Heat treatment and isoelectric point treatment are also effective purification means. Thereafter, purified GDH can be obtained by performing gel filtration using an adsorbent or a gel filter, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ （ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ （ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。 For example, gel filtration using Sephadex gel (manufactured by GE Healthcare Bioscience), DEAE Sepharose CL-6B (manufactured by GE Healthcare Bioscience), octyl Sepharose CL-6B (manufactured by GE Healthcare Bioscience) And purified by column chromatography such as) to obtain a purified enzyme preparation. The purified enzyme preparation is preferably purified to the extent that it shows a single band on electrophoresis (SDS-PAGE).
本発明において、グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定は以下の条件で行う。
＜試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
１４ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液１５．８ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液０．２ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４ｍｌを混合して反応試薬とする。
In the present invention, glucose dehydrogenase activity is measured under the following conditions.
<Reagent>
50 mM PIPES buffer pH 6.5 (including 0.1% Triton X-100)
14 mM 2,6-dichlorophenolindophenol (DCPIP) solution 1M D-glucose solution 15.8 ml of the above PIPES buffer, 0.2 ml of DCPIP solution, and 4 ml of D-glucose solution are mixed to obtain a reaction reagent.
＜測定条件＞
反応試薬２．９ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から下記の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。
<Measurement conditions>
Prewarm 2.9 ml of reaction reagent at 37 ° C. for 5 minutes. After adding 0.1 ml of GDH solution and mixing gently, the absorbance change at 600 nm was recorded for 5 minutes using a spectrophotometer controlled at 37 ° C. with water as a control, and the absorbance change per minute (ΔOD TEST) ). In the blind test, a change in absorbance per minute (ΔOD BLANK ) is similarly measured by adding a solvent that dissolves GDH to the reagent mixture instead of the GDH solution. From these values, the GDH activity is determined according to the following formula. Here, 1 unit (U) in GDH activity is defined as the amount of enzyme that reduces 1 micromole of DCPIP per minute in the presence of 200 mM D-glucose.
活性（Ｕ／ｍｌ）＝{−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝／（１６．３×０．１×１．０） Activity (U / ml) = {− (ΔOD TEST −ΔOD BLANK ) × 3.0 × dilution factor} / (16.3 × 0.1 × 1.0)
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。 In the formula, 3.0 is the reaction reagent + enzyme solution volume (ml), 16.3 is the millimolar molecular extinction coefficient (cm 2 / micromole) under the present activity measurement conditions, and 0.1 is the enzyme solution volume. (Ml), 1.0 indicates the optical path length (cm) of the cell.
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited to a following example.
後述の実施例に記載される、アスペルギルス・オリゼＧＤＨ遺伝子の取得手順の概略は以下の通りである。 The outline of the procedure for obtaining the Aspergillus oryzae GDH gene described in Examples described later is as follows.
アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨ遺伝子を取得するために、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・テレウス培養上清から、塩析、クロマトグラフィー等を用いてＧＤＨの精製を試みたが、高純度のＧＤＨを得るのは困難であった。（実施例１［１］）
よって、遺伝子取得の常法の１つである部分アミノ酸配列を利用したクローニングは断念せざるを得なくなった。
In order to obtain the GDH gene derived from Aspergillus oryzae, purification of GDH was attempted from the supernatant of Aspergillus oryzae and Aspergillus terreus using salting out, chromatography, etc., but it was difficult to obtain high purity GDH. Met. (Example 1 [1])
Therefore, cloning using a partial amino acid sequence, which is one of the conventional methods for gene acquisition, has to be abandoned.
そこで、我々はＧＤＨを生産する微生物を上記以外に求め鋭意探索した結果、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１株がＧＤＨを生産することを見出し、本菌株の培養液から高純度の精製酵素を得ることに成功した。（実施例１［２］）
次いで、該酵素を用いて部分アミノ酸配列を決定することに成功し、決定したアミノ酸配列を元に、ＰＣＲ法により、Ｐ．ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨ遺伝子を一部取得し、塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。（実施例１［３］［４］）
最終的に、この塩基配列を元に、公開されているアスペルギルス・オリゼのゲノムデータベースより、アスペルギルス・オリゼＧＤＨ遺伝子を推定（実施例１[５]）、取得した。
Thus, as a result of earnest search for microorganisms that produce GDH other than the above, we found that Penicillium lilacinoechinatum NBRC6231 produces GDH, and succeeded in obtaining a purified enzyme of high purity from the culture solution of this strain. (Example 1 [2])
Subsequently, the partial amino acid sequence was successfully determined using the enzyme, and P.P. A part of lilacinoechinatum NBRC6231-derived GDH gene was obtained and the nucleotide sequence was determined (1356 bp). (Example 1 [3] [4])
Finally, based on this base sequence, the Aspergillus oryzae GDH gene was estimated and obtained from the published genome database of Aspergillus oryzae (Example 1 [5]).
＜実施例１＞、
アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＡＯＧＤＨとも記載）遺伝子の推定
［１］アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨの取得
アスペルギルス・オリゼは、土壌より入手し定法に従ってＬ乾燥菌株とし保管していたものを使用した。以下これをアスペルギルス・オリゼＴＩ株と呼ぶ。
アスペルギルス・オリゼＴＩ株のＬ乾燥菌株をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元した。復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収してフィルター滅菌水に懸濁した。２基の１０Ｌ容ジャーファーメンター中に生産培地（１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、０．１％ＭｇＳＯ４・７水和物、２％グルコース、ｐＨ６．５）６Ｌを調製し、１２０℃１５分オートクレーブ滅菌して放冷した後、上記の菌糸懸濁液を接種し、３０℃、通気攪拌培養を行った。培養開始から６４時間後に培養を停止し、菌糸体を濾過により除去してＧＤＨ活性を含む濾過液を回収した。回収した上清を限外ろ過膜（分子量１０，０００カット）により低分子物質を除去した。次いで、硫酸アンモニウムを６０％飽和度となるように添加、溶解し、硫安分画を行い、遠心機によりＧＤＨを含む上清画分を回収後、Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。得られたＧＤＨ溶液を、Ｇ−２５−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いて脱塩を行った後、６０％飽和度の硫酸アンモニウムを添加、溶解し、これをＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。更にこれを５０℃で４５分加温した後、遠心分離を行って上清を得た。以上の工程を経て得られた溶液を精製ＧＤＨ標品（ＡＯＧＤＨ）とした。尚、上記精製過程においては、緩衝液として２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を使用した。さらに、ＡＯＧＤＨの部分アミノ酸配列を決定するため、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの各種手段により精製を試みたものの、部分アミノ酸配列決定に供することのできる精製標品を得ることはできなかった。
また、我々はアスペルギルス・テレウスに属する微生物を独自に探索入手し、上記と同様にその培養上清より、塩析、Ｏｃｔｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ等による精製を試みたが、アスペルギルス・オリゼ同様部分アミノ酸配列決定に供することのできる精製標品を得ることはできなかった。通常、一般的に行われる精製法を用いて、高純度で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ではっきりと確認できるＧＤＨ標品を得ることができなかったのは、酵素タンパク質に結合しているであろう糖鎖が原因の一つとなってるのではないかと推察した。したがって、遺伝子取得の常法の１つである該タンパク質の部分アミノ酸配列を利用したクローニングを断念せざるを得なくなった。
［２］ペニシリウム属糸状菌由来ＧＤＨの取得
ペニシリウム属糸状菌由来のＧＤＨ生産菌としてＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１を用い、上記アスペルギルス・オリゼＴＩ株と同様の手順に従って、培養および精製を行い、ＳＤＳ電気泳動でほぼ均一な精製標品を取得した。
<Example 1>,
Aspergillus oryzae-derived glucose dehydrogenase (hereinafter also referred to as AOGDH) gene estimation [1] Acquisition of Aspergillus oryzae-derived GDH Aspergillus oryzae was obtained from soil and stored as an L dry strain according to a standard method. This is hereinafter referred to as Aspergillus oryzae TI strain.
The L dry strain of Aspergillus oryzae strain TI was inoculated into potato dextrose agar medium (manufactured by Difco) and reconstituted by incubation at 25 ° C. The restored mycelium on the plate was collected together with the agar and suspended in filter sterilized water. 6 L of production medium (1% malt extract, 1.5% soybean peptide, 0.1% MgSO4 · 7 hydrate, 2% glucose, pH 6.5) was prepared in two 10 L jar fermenters, After autoclaving at 15 ° C. for 15 minutes and allowing to cool, the above mycelial suspension was inoculated and cultured at 30 ° C. with aeration and stirring. After 64 hours from the start of the culture, the culture was stopped, the mycelium was removed by filtration, and the filtrate containing GDH activity was collected. Low molecular weight substances were removed from the collected supernatant by ultrafiltration membrane (molecular weight 10,000 cut). Next, ammonium sulfate was added and dissolved to 60% saturation, ammonium sulfate fractionation was performed, and the supernatant fraction containing GDH was collected by a centrifuge, and then adsorbed on an Octyl-Sepharose column, and ammonium sulfate saturation 60%. Fractions with GDH activity were collected by gradient elution at ˜0%. The obtained GDH solution was desalted using a G-25-Sepharose column, and then 60% saturated ammonium sulfate was added and dissolved, adsorbed on the Phenyl-Sepharose column, and ammonium sulfate saturated 60%. Fractions with GDH activity were collected by gradient elution at ˜0%. Further, this was heated at 50 ° C. for 45 minutes, and then centrifuged to obtain a supernatant. The solution obtained through the above steps was used as a purified GDH preparation (AOGDH). In the purification process, 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5) was used as the buffer. Furthermore, in order to determine the partial amino acid sequence of AOGDH, purification was attempted by various means such as ion exchange chromatography and gel filtration chromatography, but it was not possible to obtain a purified preparation that could be used for partial amino acid sequencing. It was.
In addition, we independently searched for and obtained microorganisms belonging to Aspergillus terreus and tried to purify the culture supernatant by salting out, Octyl-sepharose, etc. in the same manner as described above. It was not possible to obtain a purified sample that could be provided. Usually, it was not possible to obtain a GDH preparation with high purity and clearly identifiable on SDS-PAGE by using a commonly used purification method. I guessed that the chain might be one of the causes. Accordingly, it has been unavoidable to abandon cloning using a partial amino acid sequence of the protein, which is one of the common methods for gene acquisition.
[2] Acquisition of GDH derived from Penicillium filamentous fungus Using Penicillium lilacinoechinatum NBRC6231 as a GDH producing bacterium derived from Penicillium filamentous fungus, culturing and purifying according to the same procedure as the above Aspergillus oryzae strain TI, almost by SDS electrophoresis A uniform purified sample was obtained.
［３］ｃＤＮＡの作製
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１について上記方法に従い（ただしジャーファーメンターでの培養時間は２４時間）培養を実施し、濾紙濾過により菌糸体を回収した。得られた菌糸は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、クールミル（東洋紡社製）を用いて菌糸を粉砕した。粉砕菌体より直ちにセパゾールＲＮＡ Ｉ（ナカライテスク社製）を用いて本キットのプロトコールに従ってトータルＲＮＡを抽出した。得られたトータルＲＮＡからはＯｒｉｇｏｔｅｘ−ｄｔ３０（第一化学薬品社製）をもちいてｍＲＮＡを精製し、これをテンプレートにＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−ＴＭ（東洋紡社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた産物はアガロース電気泳動を行い、鎖長０．５〜４．０ｋｂに相当する部分を切り出した。切り出したゲル断片からＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ−（東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡを抽出・精製してｃＤＮＡサンプルとした。
[3] Preparation of cDNA The Penicillium lilacinoechinalum NBRC6231 was cultured according to the above method (however, the culture time in the jar fermenter was 24 hours), and the mycelium was collected by filter paper filtration. The obtained mycelia were immediately frozen in liquid nitrogen, and the mycelium was pulverized using a cool mill (Toyobo Co., Ltd.). Total RNA was extracted from the pulverized cells using Sepakol RNA I (Nacalai Tesque) according to the protocol of this kit. From the total RNA obtained, mRNA was purified using Origotex-dt30 (Daiichi Chemicals Co., Ltd.), and RT-PCR was performed using RiverTra-Plus-TM (Toyobo Co., Ltd.) using this as a template. The obtained product was subjected to agarose electrophoresis, and a portion corresponding to a chain length of 0.5 to 4.0 kb was cut out. CDNA was extracted and purified from the excised gel fragment using MagExtractor-PCR & Gel Clean Up- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) to obtain a cDNA sample.
［４］ＧＤＨ遺伝子部分配列の決定
上記で精製したＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨを０．１％ＳＤＳ、１０％グリセロールを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８）に溶解し、ここにＧｌｕ特異的Ｖ８エンドプロテアーゼを終濃度１０μｇ／ｍｌとなるよう添加し３７℃１６時間インキュベートすることで部分分解を行った。このサンプルをアクリルアミド濃度１６％のゲルを用いて電気泳動してペプチドを分離した。このゲル中に存在するペプチド分子を、ブロット用バッファー（1.4％グリシン、0.3％トリス、20％エタノール）を用いてセミドライ法によりＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜上に転写したペプチドはＣＢＢ染色キット（ＰＩＥＲＣＥ社製ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）を用いて染色し、可視化されたペプチド断片のバンド部分２箇所を切り取ってペプチドシーケンサーにより内部アミノ酸配列の解析を行った。得られたアミノ酸配列はＩＧＧＶＶＤＴＳＬＫＶＹＧＴおよびＷＧＧＧＴＫＱＴＶＲＡＧＫＡＬＧＧＴＳＴであった。この配列を元にミックス塩基を含有するディジェネレートプライマーを作製し、ＮＢＲＣ６２３１由来ｃＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを実施したところ増幅産物が得られ、アガロースゲル電気泳動により確認したところ１．４ｋｂ程度のシングルバンドであった。このバンドを切り出して東洋紡製ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ−を用いて抽出・精製した。精製ＤＮＡ断片はＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）によりＴＡクローニングし、得られたベクターで大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（東洋紡社製）をヒートショックにより形質転換した。形質転換クローンのうち青白判定でインサート挿入が確認されたコロニーについてＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｐｌａｓｍｉｄ−（東洋紡社製）を用いてプラスミドをミニプレップ抽出・精製し、プラスミド配列特異的プライマーを用いてインサートの塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。
[4] Determination of GDH gene partial sequence The above-purified NBRC6231-derived GDH was dissolved in Tris-HCl buffer (pH 6.8) containing 0.1% SDS and 10% glycerol, and the Glu-specific V8 endoprotease was added thereto. Was added to a final concentration of 10 μg / ml and incubated at 37 ° C. for 16 hours for partial degradation. This sample was electrophoresed on a gel with an acrylamide concentration of 16% to separate the peptides. Peptide molecules present in the gel were transferred to a PVDF membrane by a semi-dry method using a blotting buffer (1.4% glycine, 0.3% Tris, 20% ethanol). The peptide transcribed onto the PVDF membrane was stained using a CBB staining kit (GelCode Blue Stain Reagent manufactured by PIERCE), and two bands of the visualized peptide fragment were cut out and the internal amino acid sequence was analyzed by a peptide sequencer. . The resulting amino acid sequences were IGGVVDTSLKVYGT and WGGGTKQTVRAKGALGGGTST. Based on this sequence, a degenerate primer containing a mixed base was prepared, and PCR was performed using NBRC6231-derived cDNA as a template. An amplification product was obtained, which was confirmed by agarose gel electrophoresis. A single band of about 1.4 kb was obtained. Met. This band was cut out and extracted and purified using Toyobo's MagExtractor-PCR & Gel Clean Up-. The purified DNA fragment was TA-cloned using TARGET Clone-Plus- (Toyobo), and Escherichia coli JM109 competent cell (Toyobo) was transformed with the resulting vector by heat shock. From the transformed clones, colonies in which insert insertion was confirmed by blue-white determination were subjected to miniprep extraction and purification of the plasmid using MagExtractor-Plasmid- (manufactured by Toyobo), and the nucleotide sequence of the insert was determined using plasmid sequence-specific primers. Determined (1356 bp).
［５］ＡＯＧＤＨ遺伝子の推定
決定した塩基配列を元に「ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ」のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）からホモロジー検索を実施し、
複数の候補配列より、公知のグルコース酸化酵素とのホモロジーも考慮して、ＡＯＧＤＨ遺伝子を推定した。検索により推定したＡＯＧＤＨとＰ．ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨ部分配列とのアミノ酸レベルでの相同性は４９％であった。
[5] Estimation of AOGDH gene A homology search is performed from the homepage of “NCBI BLAST” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) based on the determined base sequence,
The AOGDH gene was estimated from a plurality of candidate sequences in consideration of homology with known glucose oxidase. AOGDH and P.E. The homology at the amino acid level with the GDH partial sequence derived from lilacinoechinatum NBRC6231 was 49%.
＜実施例２＞
ＡＯＧＤＨ遺伝子の取得、大腸菌への導入
ＡＯＧＤＨ遺伝子を取得するために、アスペルギルス・オリゼＴＩ株の菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。配列番号６、７に示す２種類のオリゴＤＮＡを合成し、調製したｃＤＮＡをテンぺレートとしてＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いてＡＯＧＤＨ遺伝子増幅した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンａｔｇに合わせＮｄｅＩ認識配列のａｔｇを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、組換えプラスミドを構築した。この組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリーＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換体より、常法に従いプラスミドを抽出し、ＡＯＧＤＨ遺伝子の塩基配列の決定を行った（配列番号５）。この結果、ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸残基は５９３アミノ酸（配列番号４）からなることが明らかとなった。データベースに登録されているＲＩＢ４０株から予想されるＧＤＨは５８８アミノ酸（配列番号３）でありＴＩ株 ＧＤＨとアミノ酸残基数が異なることが示唆された。なお、該遺伝子については、ＴＩ株ゲノムＤＮＡを用いて配列を確認し、遺伝子隣接領域についてもＲＡＣＥ法を用いて確認を行った。データベース株であるＲＩＢ４０株とＴＩ株で、ＧＤＨ遺伝子の配列が異なることが示唆されたため、ＴＩ株ＧＤＨ遺伝子を含む組換えプラスミドを鋳型として、データベースＲＩＢ４０株の配列から予想されるＧＤＨ遺伝子配列を含む組換えプラスミドをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を用いて作製し、形質転換体の取得を行った。これら形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体培地（Terrific broth）２００ｍｌ中で、３０℃、１６時間振とう培養を行った。菌体破砕液についてＧＤＨ活性を確認したところ、ＲＩＢ４０株由来ＧＤＨの配列を有する形質転換体ではＧＤＨ活性が確認できなかったが、ＴＩ株由来ＧＤＨの配列を有する形質転換体については菌体内に培養液１ｍｌ当たり８．０Ｕの高いＧＤＨ活性が得られた。尚、実施例１で実施したアスペルギルス・オリゼＴＩ株の培養上清のＧＤＨ活性は、０．２Ｕ／ｍｌであった。この結果は、ＲＩＢ４０株データベース配列から予想したＧＤＨ遺伝子はＧＤＨとして機能していないことが示唆するものであり、ＴＩ株とＲＩＢ４０株の遺伝子配列を比較するかぎり、ＲＩＢ４０株ではＧＤＨ遺伝子の配列が一部欠失していることがその原因であると考えられた。
<Example 2>
Acquisition of AOGDH gene and introduction into E. coli In order to acquire the AOGDH gene, mRNA was prepared from cells of Aspergillus oryzae TI strain, and cDNA was synthesized. Two types of oligo DNAs shown in SEQ ID NOs: 6 and 7 were synthesized, and the AOGDH gene was amplified using KOD Plus DNA polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) using the prepared cDNA as a template. The DNA fragment was treated with restriction enzymes NdeI and BamHI, pBluescript (in which the NdeI site was introduced in the form of matching the atg of the NdeI recognition sequence in accordance with the translation initiation codon atg of LacZ), the recombinant plasmid was inserted into the NdeI-BamHI site. It was constructed. Escherichia coli DH5α (Toyobo Co., Ltd.) was transformed with this recombinant plasmid. A plasmid was extracted from the transformant according to a conventional method, and the base sequence of the AOGDH gene was determined (SEQ ID NO: 5). As a result, it was revealed that the amino acid residue deduced from the cDNA sequence consists of 593 amino acids (SEQ ID NO: 4). The predicted GDH from the RIB40 strain registered in the database is 588 amino acids (SEQ ID NO: 3), suggesting that the number of amino acid residues is different from that of the TI strain GDH. In addition, about this gene, the arrangement | sequence was confirmed using TI strain | stump | stock genomic DNA, and the gene adjacent region was also confirmed using the RACE method. Since the database strain RIB40 and TI strains were suggested to have different GDH gene sequences, a recombinant plasmid containing the TI strain GDH gene was used as a template to include the GDH gene sequence predicted from the database RIB40 strain sequence. A recombinant plasmid was prepared using QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit (manufactured by Stratagene), and a transformant was obtained. These transformants were cultured in 200 ml of a liquid medium (Terrific broth) containing 100 μg / ml ampicillin with shaking at 30 ° C. for 16 hours. When the GDH activity was confirmed with respect to the cell disruption solution, the GDH activity could not be confirmed with the transformant having the GDH sequence derived from the RIB40 strain, but the transformant having the GDH sequence derived from the TI strain was cultured in the cells. A high GDH activity of 8.0 U per ml of liquid was obtained. The GDH activity of the culture supernatant of Aspergillus oryzae TI strain carried out in Example 1 was 0.2 U / ml. This result suggests that the GDH gene predicted from the RIB40 strain database sequence does not function as GDH. As long as the gene sequences of the TI strain and the RIB40 strain are compared, the RDH40 strain has the same GDH gene sequence. It was thought that the cause was partial deletion.
＜実施例３＞
実施例２で培養したＴＩ株由来ＧＤＨの配列を有するエシェリヒア・コリーＤＨ５α形質転換体を遠心分離により菌体を回収し、２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁後、フレンチプレス破粉機を用いてＧＤＨを抽出液した。これを実施例１で精製したＡＯＧＤＨと同様の手順により、精製酵素標品（ｒＡＯＧＤＨ）を得て、ＡＯＧＤＨ精製酵素標品との特性比較を実施した。
［１］基質特異性
血糖センサを用いて血糖値を測定する場合、誤診を招かないために、グルコース特異的な酵素の使用が求められる。そこでｒＡＯＧＤＨについて各種糖類に対する反応性を調べた。結果を図１に示す。ｒＡＯＧＤＨはＡＯＧＤＨと同等の基質特異性を示し、輸液使用患者がセンサを使用する際に特に問題になるマルトースには作用しないことが確認された。
［２］マルトース分解性
血糖センサに使用するＧＤＨそのものはマルトースに作用せずとも、酵素標品等にマルトースをグルコースに分解する成分が含まれる場合にも誤診につながる可能性がある。つまり、ＧＤＨ酵素標品にマルトースを分解する成分が含まれていないことが、きわめて重要になる。そこで、ＧＤＨ精製表品中のマルトース分解成分のコンタミネーションについて調べた。マルトース分解酵素のコンタミネーション試験は、以下の要領で行った。１０Ｕ／ｍｌに調製した各種精製酵素液５０μｌに、８ｍＭマルトース５０μｌを添加して３７℃にて反応した。反応終了後、リキテックグルコース・ＨＫ・テスト（ロッシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて反応液に含まれるグルコース濃度を調べた。なお、グルコース濃度を算出するための検量線は、該測定キットにて検量係数設定用グルコース（和光純薬工業社製）を測定して作成した。結果を図２に示す。ＡＯＧＤＨ精製標品では、３７℃，３０秒処理で、既に９０％のマルトースがグルコースに分解されており、１０分反応処理後では、１００％に近いマルトースが分解されていた。そこで、実施例１で部分アミノ酸配列解析を目的にＡＯＧＤＨを高度に精製した標品を用いて同様に測定を行ったが、やはりマルトースから分解活性が確認された。一方、ｒＡＯＧＤＨでは、３７℃，１０分処理した後も、グルコースの蓄積は全く見られなかった。アスペルギルス・オリゼは古くから、醗酵産業に利用されており、アミラーゼやグルコアミラーゼなどの糖質関連酵素を著量生産することが知られており、そのような環境下で、ＧＤＨのみを高純度に精製するのは極めて困難と考えれる。
<Example 3>
The Escherichia coli DH5α transformant having the GDH sequence derived from the TI strain cultured in Example 2 was collected by centrifugation, suspended in 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), and then broken into French presses. GDH was extracted using a powder machine. The purified enzyme preparation (rAOGDH) was obtained by the same procedure as that of AOGDH purified in Example 1, and the characteristics were compared with the AOGDH purified enzyme preparation.
[1] Substrate specificity When a blood glucose level is measured using a blood glucose sensor, the use of a glucose-specific enzyme is required in order to prevent misdiagnosis. Therefore, the reactivity of rAOGDH to various saccharides was examined. The results are shown in FIG. rAOGDH has the same substrate specificity as AOGDH, and it has been confirmed that it does not act on maltose, which is a particular problem when infusion patients use the sensor.
[2] Maltose degradability GDH itself used in a blood glucose sensor does not act on maltose, but may also lead to misdiagnosis when an enzyme preparation or the like contains a component that decomposes maltose into glucose. That is, it is extremely important that the GDH enzyme preparation does not contain a component that decomposes maltose. Therefore, the contamination of maltose-decomposing components in the GDH purification table was examined. The contamination test for maltose-degrading enzyme was performed as follows. 50 μl of 8 mM maltose was added to 50 μl of various purified enzyme solutions prepared to 10 U / ml and reacted at 37 ° C. After completion of the reaction, the concentration of glucose contained in the reaction solution was examined using Liquitech Glucose HK Test (Roche Diagnostics). The calibration curve for calculating the glucose concentration was prepared by measuring the calibration coefficient setting glucose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with the measurement kit. The results are shown in FIG. In the AOGDH purified sample, 90% of maltose was already decomposed into glucose after treatment at 37 ° C. for 30 seconds, and nearly 10% of maltose was decomposed after 10 minutes of reaction treatment. Therefore, the measurement was performed in the same manner using a sample obtained by highly purifying AOGDH for the purpose of partial amino acid sequence analysis in Example 1, but the degradation activity was also confirmed from maltose. On the other hand, rAOGDH showed no glucose accumulation even after 10 minutes of treatment at 37 ° C. Aspergillus oryzae has long been used in the fermentation industry and is known to produce significant amounts of carbohydrate-related enzymes such as amylase and glucoamylase. In such an environment, only GDH is highly purified. It seems extremely difficult to purify.
これらの結果から、アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨを血糖センサで用いる場合には遺伝子組換え体から調製したＧＤＨを用いることが必須であると考える。 From these results, when using Aspergillus oryzae-derived GDH in a blood glucose sensor, it is considered essential to use GDH prepared from a gene recombinant.
本発明は、組換え大腸菌を用いることにより、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼを、大量に生産することを可能にするものである。また、本発明により広い意味でマルトースに作用しない、グルコースセンサ等に適したグルコースデヒドロゲナーゼを生産することを可能にする。 The present invention makes it possible to produce glucose dehydrogenase derived from Aspergillus oryzae in large quantities by using recombinant Escherichia coli. In addition, the present invention makes it possible to produce glucose dehydrogenase suitable for glucose sensors and the like that does not act on maltose in a broad sense.
Claims (8)
（ａ）配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号５に記載の塩基配列およびイントロンを含む、配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）（ｂ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ
（ｅ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｆ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質 It was transformed with a gene consisting of any of the following DNAs (a), (b), (c) and (d), or a recombinant vector containing a gene encoding the following protein (e) or (f): A method for producing a protein having glucose dehydrogenase activity, comprising culturing a transformant in a nutrient medium and collecting a protein having glucose dehydrogenase activity.
(A) DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5
(B) a DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and an intron
(C) DNA that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA of (a) under a stringent condition and encodes a protein having glucose dehydrogenase activity
(D) DNA comprising a region encoding a protein that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA of (b) and has glucose dehydrogenase activity
(E) a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 (f) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added (inserted) in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and Protein having glucose dehydrogenase activity
（ａ）配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号５に記載の塩基配列およびイントロンを含む、配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）（ｂ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ A gene comprising the following DNA (a) (b) (c) or (d):
(A) DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5
(B) a DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and an intron
(C) DNA that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA of (a) under a stringent condition and encodes a protein having glucose dehydrogenase activity
(D) DNA comprising a region encoding a protein that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA of (b) and has glucose dehydrogenase activity
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質 A gene encoding the following protein (a) or (b).
(A) a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 (b) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added (inserted) in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and Protein having glucose dehydrogenase activity
A method for producing a protein having glucose dehydrogenase activity, comprising culturing the transformant according to claim 6 or 7 in a nutrient medium and collecting a protein having glucose dehydrogenase activity.
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Cited By (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2007139013A1 (en) * | 2006-05-29 | 2009-10-08 | 天野エンザイム株式会社 | Flavin adenine dinucleotide-linked glucose dehydrogenase |
| JPWO2008001903A1 (en) * | 2006-06-29 | 2009-12-03 | 池田食研株式会社 | FAD-linked glucose dehydrogenase gene |
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| WO2012001976A1 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-05 | 有限会社アルティザイム・インターナショナル | Glucose dehydrogenase |
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| WO2013099294A1 (en) | 2011-12-28 | 2013-07-04 | 有限会社アルティザイム・インターナショナル | Glucose dehydrogenase |
| JP5398004B2 (en) * | 2007-12-28 | 2014-01-29 | 池田食研株式会社 | Modified glucose dehydrogenase gene |
| US8945359B2 (en) | 2011-08-26 | 2015-02-03 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Flavin-binding glucose dehydrogenase |
| US9074239B2 (en) | 2011-06-07 | 2015-07-07 | Kikkoman Corporation | Flavin-binding glucose dehydrogenase, method for producing flavin-binding glucose dehydrogenase, and glucose measurement method |
| US9238802B2 (en) | 2010-12-01 | 2016-01-19 | Kikkoman Corporation | E. coli transformant, method for producing flavin-bound glucose dehydrogenase using the same, and mutant flavin-bound glucose dehydrogenases |
| US9260699B2 (en) | 2011-10-31 | 2016-02-16 | Toyobo Co., Ltd. | Glucose dehydrogenase |
| US9404144B2 (en) | 2012-02-09 | 2016-08-02 | Toyobo Co., Ltd. | Glucose dehydrogenase |
| US9469844B2 (en) | 2010-12-02 | 2016-10-18 | Kikkoman Corporation | Flavin-bound glucose dehydrogenases, a method for producing a flavin-bound glucose dehydrogenase, and yeast transformant used for the same |
| US9487758B2 (en) | 2011-08-11 | 2016-11-08 | Toyobo Co., Ltd. | Glucose dehydrogenase |
| US9493814B2 (en) | 2011-11-02 | 2016-11-15 | Kikkoman Corporation | Flavin-binding glucose dehydrogenase having improved substrate specificity |
| US9506042B2 (en) | 2012-06-29 | 2016-11-29 | Toyobo Co., Ltd. | Glucose dehydrogenase |
| US9796963B2 (en) | 2012-09-10 | 2017-10-24 | Toyobo Co., Ltd. | Glucose dehydrogenase |
| JPWO2016163448A1 (en) * | 2015-04-09 | 2018-02-08 | 東洋紡株式会社 | Enzyme preparation for glucose measurement |
| US9957543B2 (en) | 2005-03-25 | 2018-05-01 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same |
| JPWO2018062542A1 (en) * | 2016-09-30 | 2019-08-29 | 有限会社アルティザイム・インターナショナル | Electron mediator modified enzyme and enzyme electrode, spectroscopic analysis kit and enzyme test paper using the same |
| US10961514B2 (en) | 2016-01-14 | 2021-03-30 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Flavin-conjugated glucose dehydrogenase |
| US10988738B2 (en) | 2002-12-24 | 2021-04-27 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-binding glucose dehydrogenase |
| US11066690B2 (en) | 2016-05-09 | 2021-07-20 | Kikkoman Corporation | Flavin-binding glucose dehydrogenase variant |
| US11072809B2 (en) | 2015-01-16 | 2021-07-27 | Toyobo Co., Ltd. | FAD-dependent glucose dehydrogenase |
-
2006
- 2006-12-28 JP JP2006354168A patent/JP2007289148A/en not_active Withdrawn
Cited By (50)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11345897B2 (en) | 2002-12-24 | 2022-05-31 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-binding glucose dehydrogenase |
| US10988738B2 (en) | 2002-12-24 | 2021-04-27 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-binding glucose dehydrogenase |
| US11155789B2 (en) | 2002-12-24 | 2021-10-26 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-binding glucose dehydrogenase |
| US11225645B2 (en) | 2002-12-24 | 2022-01-18 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-binding glucose dehydrogenase |
| US10851398B2 (en) | 2005-03-25 | 2020-12-01 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same |
| US10808274B2 (en) | 2005-03-25 | 2020-10-20 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same |
| US10669565B2 (en) | 2005-03-25 | 2020-06-02 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same |
| US10648011B2 (en) | 2005-03-25 | 2020-05-12 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same |
| US9957543B2 (en) | 2005-03-25 | 2018-05-01 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same |
| US10815515B2 (en) | 2005-03-25 | 2020-10-27 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same |
| US10738341B2 (en) | 2005-03-25 | 2020-08-11 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same |
| US10883133B2 (en) | 2005-03-25 | 2021-01-05 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same |
| US10626433B2 (en) | 2005-03-25 | 2020-04-21 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same |
| US10626434B2 (en) | 2005-03-25 | 2020-04-21 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same |
| JPWO2007139013A1 (en) * | 2006-05-29 | 2009-10-08 | 天野エンザイム株式会社 | Flavin adenine dinucleotide-linked glucose dehydrogenase |
| JPWO2008001903A1 (en) * | 2006-06-29 | 2009-12-03 | 池田食研株式会社 | FAD-linked glucose dehydrogenase gene |
| JP2011217755A (en) * | 2006-06-29 | 2011-11-04 | Ikeda Shokken Kk | Biosensor for use in determination of glucose |
| JP4665235B2 (en) * | 2006-06-29 | 2011-04-06 | 池田食研株式会社 | FAD-linked glucose dehydrogenase gene |
| JP2019165742A (en) * | 2006-06-29 | 2019-10-03 | Ｐｈｃ株式会社 | Biosensor for glucose measurement |
| JP2016019529A (en) * | 2006-06-29 | 2016-02-04 | 池田食研株式会社 | Biosensor for use in measurement of glucose |
| JP2018093872A (en) * | 2006-06-29 | 2018-06-21 | 池田食研株式会社 | Biosensor for glucose measurement |
| JP7162646B2 (en) | 2006-06-29 | 2022-10-28 | Ｐｈｃ株式会社 | Biosensor for glucose measurement |
| JP2020202859A (en) * | 2006-06-29 | 2020-12-24 | Ｐｈｃ株式会社 | Biosensor for measuring glucose |
| JP2017148058A (en) * | 2006-06-29 | 2017-08-31 | 池田食研株式会社 | Biosensor for glucose measurement |
| JP2013138677A (en) * | 2006-06-29 | 2013-07-18 | Ikeda Shokken Kk | Biosensor for use in determination of glucose |
| JP7430762B2 (en) | 2006-06-29 | 2024-02-13 | Ｐｈｃ株式会社 | Biosensor for glucose measurement |
| JP5398004B2 (en) * | 2007-12-28 | 2014-01-29 | 池田食研株式会社 | Modified glucose dehydrogenase gene |
| WO2010140431A1 (en) | 2009-06-04 | 2010-12-09 | キッコーマン株式会社 | Flavin-bound glucose dehydrogenase |
| US8445246B2 (en) | 2009-06-04 | 2013-05-21 | Kikkoman Corporation | Flavin-binding glucose dehydrogenases |
| US8247189B2 (en) | 2009-09-16 | 2012-08-21 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Modified flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase |
| WO2012001976A1 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-05 | 有限会社アルティザイム・インターナショナル | Glucose dehydrogenase |
| US8999691B2 (en) | 2010-06-29 | 2015-04-07 | Ultizyme International Ltd. | Glucose dehydrogenase |
| US9238802B2 (en) | 2010-12-01 | 2016-01-19 | Kikkoman Corporation | E. coli transformant, method for producing flavin-bound glucose dehydrogenase using the same, and mutant flavin-bound glucose dehydrogenases |
| US9469844B2 (en) | 2010-12-02 | 2016-10-18 | Kikkoman Corporation | Flavin-bound glucose dehydrogenases, a method for producing a flavin-bound glucose dehydrogenase, and yeast transformant used for the same |
| US9074239B2 (en) | 2011-06-07 | 2015-07-07 | Kikkoman Corporation | Flavin-binding glucose dehydrogenase, method for producing flavin-binding glucose dehydrogenase, and glucose measurement method |
| US9487758B2 (en) | 2011-08-11 | 2016-11-08 | Toyobo Co., Ltd. | Glucose dehydrogenase |
| US8945359B2 (en) | 2011-08-26 | 2015-02-03 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Flavin-binding glucose dehydrogenase |
| US9260699B2 (en) | 2011-10-31 | 2016-02-16 | Toyobo Co., Ltd. | Glucose dehydrogenase |
| US9493814B2 (en) | 2011-11-02 | 2016-11-15 | Kikkoman Corporation | Flavin-binding glucose dehydrogenase having improved substrate specificity |
| WO2013099294A1 (en) | 2011-12-28 | 2013-07-04 | 有限会社アルティザイム・インターナショナル | Glucose dehydrogenase |
| US9512459B2 (en) | 2011-12-28 | 2016-12-06 | Ultizyme International Ltd. | Glucose dehydrogenase |
| US9404144B2 (en) | 2012-02-09 | 2016-08-02 | Toyobo Co., Ltd. | Glucose dehydrogenase |
| US9506042B2 (en) | 2012-06-29 | 2016-11-29 | Toyobo Co., Ltd. | Glucose dehydrogenase |
| US9796963B2 (en) | 2012-09-10 | 2017-10-24 | Toyobo Co., Ltd. | Glucose dehydrogenase |
| US11072809B2 (en) | 2015-01-16 | 2021-07-27 | Toyobo Co., Ltd. | FAD-dependent glucose dehydrogenase |
| US10913971B2 (en) | 2015-04-09 | 2021-02-09 | Toyobo Co., Ltd. | Enzyme preparation for use in measurement of glucose |
| JPWO2016163448A1 (en) * | 2015-04-09 | 2018-02-08 | 東洋紡株式会社 | Enzyme preparation for glucose measurement |
| US10961514B2 (en) | 2016-01-14 | 2021-03-30 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Flavin-conjugated glucose dehydrogenase |
| US11066690B2 (en) | 2016-05-09 | 2021-07-20 | Kikkoman Corporation | Flavin-binding glucose dehydrogenase variant |
| JPWO2018062542A1 (en) * | 2016-09-30 | 2019-08-29 | 有限会社アルティザイム・インターナショナル | Electron mediator modified enzyme and enzyme electrode, spectroscopic analysis kit and enzyme test paper using the same |
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