JP2007289148A - Method for producing glucose dehydrogenase derived from aspergillus oryzae - Google Patents

Method for producing glucose dehydrogenase derived from aspergillus oryzae Download PDF

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Takahide Kishimoto
Masao Kitabayashi
Yoshiaki Nishiya
Yuji Tsuji
北林  雅夫
高英 岸本
西矢  芳昭
裕二 辻
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Toyobo Co Ltd
東洋紡績株式会社
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To produce glucose dehydrogenase derived from Aspergillus oryzae efficiently and also provide the more practical glucose dehydrogenase. <P>SOLUTION: It becomes possible to produce the glucose dehydrogenase efficiently and obtain the more practical glucose dehydrogenase by utilizing a glucose dehydrogenase gene isolated from the Aspergillus oryzae. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)由来のグルコースデヒドロゲナーゼを遺伝子組み換えにより製造する方法に関する。 The present invention is, Aspergillus oryzae and (Aspergillus oryzae) derived glucose dehydrogenase relates to a process for producing by genetic recombination.

血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。 SMBG is important for diabetics take to grasp treat normal his blood glucose level. 血糖自己測定に用いられるセンサにはグルコースを基質とする酵素が利用されている。 The sensor used for self-monitoring of blood glucose enzyme glucose as a substrate is utilized. そのような酵素の例としては例えばグルコースオキシダーゼ(EC 1.1.3.4)が挙げられる。 Examples of such enzymes include, for example, glucose oxidase (EC 1.1.3.4). グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有していることから血糖センサ用酵素として古くから利用されており、その最初の発表は実に40年ほど前に遡る。 Glucose oxidase is highly specific for glucose, the heat which has been used since ancient times as the enzyme for blood glucose sensors because it has the advantage of excellent stability, its initial announcement dates back ago indeed 40 years . グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサにおいては、グルコースを酸化してD−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることで測定がなされるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。 In the blood glucose sensor using glucose oxidase, the measurement by electrons generated in the process of converting the oxide to D- glucono -δ- lactone glucose is passed to the electrode via the mediator is made, the glucose oxidase reaction in easy passing resulting protons oxygen for dissolved oxygen there is a problem that affects the measured value.

このような問題を回避するために、例えばNAD(P)依存型グルコースデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.47)あるいはピロロピノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.5.2(旧 EC1.1.99.17))が血糖センサ用酵素として用いられている。 To avoid such a problem, for example, NAD (P) dependent glucose dehydrogenase (EC 1.1.1.47) or pyrrolo Pinot phosphorus quinone dependent glucose dehydrogenase (EC 1.1.5.2 (old EC1 .1.99.17)) is used as an enzyme for blood glucose sensors. これらは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、前者のNAD(P)依存型グルコースデヒドロゲナーゼは安定性の乏しさや補酵素の添加が必要という煩雑性がある。 These are a superior in that it does not influenced by dissolved oxygen, the former NAD (P) dependent glucose dehydrogenase is troublesomeness that requires the addition of the stability of poor or coenzyme. 一方後者のピロロピノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼは、基質特異性に乏しくマルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため、測定値の正確性を損ねる可能性があるという欠点がある。 Whereas the latter pyrrolo Pinot phosphorus quinone dependent glucose dehydrogenase to act in sugars other than glucose such as poor maltose and lactose in substrate specificity, it has the disadvantage that it may impair the accuracy of the measurements.

非特許文献1〜4にはアスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼについて報告されているが、グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子に関しては報告されていない。 Although Non-Patent Documents 1 to 4 have been reported for glucose dehydrogenase derived from Aspergillus oryzae, it has not been reported for glucose dehydrogenase gene. また、非特許文献1〜4には、遺伝子組み換えによりアスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼを製造することについての記載はない。 Further, Non-Patent Documents 1 to 4, there is no description about the production of glucose dehydrogenase derived from Aspergillus oryzae by genetic recombination.

また、特許文献1にはアスペルギルス属由来フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼが開示されている。 Further, derived from the genus Aspergillus flavin-binding glucose dehydrogenase is disclosed in Patent Document 1. 本酵素は基質特異性に優れかつ溶存酸素の影響を受けない点で優位である。 This enzyme is superior in that it does not influenced by the superior and dissolved oxygen to the substrate specificity. 熱安定性については50℃15分処理で89%程度の活性残存率であり安定性(以下、耐熱性とも表記)についても優れているとされている。 Thermal For stability a residual activity ratio of about 89% at 50 ° C. 15 minutes processing stability (hereinafter, also heat resistance notation) has been good also. 特許文献2には、その遺伝子配列、アミノ酸配列が報告されている。 Patent Document 2, the gene sequence, amino acid sequences have been reported.
WO 2004/058958 WO 2004/058958 WO 2006/101239 WO 2006/101239

最近になって、アスペルギルス・オリゼの全ゲノム配列が決定された。 More recently, the entire genome sequence of Aspergillus oryzae has been determined. しかしながら、当該配列のどの部分がグルコースデヒドロゲナーゼをコードしているかの情報はない。 However, there is no information on which part of the sequence encoding the glucose dehydrogenase.

本発明の目的は、より実用面において有利な血糖センサー用酵素を効率的に製造する方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a method of producing an enzyme for favorable blood glucose sensor efficiently in a more practical aspect. より具体的には、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を特定、取得、利用し、該グルコースデヒドロゲナーゼを大量に安定的に製造する方法を確立することにある。 More specifically, certain glucose dehydrogenase gene derived from Aspergillus oryzae, obtained by using, is to establish a method for producing a large amount stably the glucose dehydrogenase.

本発明者らは、上記目的を達成するために、National Center for Biotechnology Information(NCBI)のデータベースを利用し、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を推定、取得し、該遺伝子を用い、大腸菌よりアスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼを取得できることを見出し、本出願に到った。 The present inventors have found that in order to achieve the above object, using the database of National Center for Biotechnology Information (NCBI), the estimated glucose dehydrogenase gene derived from Aspergillus oryzae, acquires, using the gene, Aspergillus from E. coli · found to be able to obtain the glucose dehydrogenase derived from oryzae, were led to the present application.
本発明によれば、アスペルギルス・オリゼより単離したグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を利用することにより、グルコースデヒドロゲナーゼを効率的に生産しかつ、より実用的なグルコースデヒドロゲナーゼを取得することが可能になる。 According to the present invention, by utilizing glucose dehydrogenase gene isolated from Aspergillus oryzae, comprising the glucose dehydrogenase efficiently produced vital, it can be acquired more practical glucose dehydrogenase.

すなわち、本発明は以下のような構成からなる。 That is, the present invention consists of the following arrangement.
[項1] [Claim 1]
以下の(a)(b)(c)(d)のいずれかのDNAからなる遺伝子、もしくは、以下の(e)または(f)のタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターにより形質転換された形質転換体を栄養培地にて培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を製造する方法。 Gene consisting of the following (a) (b) (c) any of the DNA of (d), or transformed with a recombinant vector containing a gene encoding a protein of the following (e) or (f) how transformants were cultured in a nutrient medium to produce a protein having glucose dehydrogenase activity and recovering the protein having glucose dehydrogenase activity.
(a)配列番号5に記載の塩基配列からなるDNA (A) DNA consisting of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 5
(b)配列番号5に記載の塩基配列およびイントロンを含む、配列番号8に記載の塩基配列からなるDNA (B) including the nucleotide sequence and intron of SEQ ID NO: 5, consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8 DNA
(c)(a)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA (C) a DNA which hybridizes with the DNA under stringent conditions comprising a DNA complementary to the nucleotide sequence of (a), and encoding a protein having glucose dehydrogenase activity DNA
(d)(b)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする領域を含むDNA (D) a DNA which hybridizes with the DNA under stringent conditions comprising a DNA complementary to the nucleotide sequence of (b), and includes a region encoding a protein having a glucose dehydrogenase activity DNA
(e)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質(f)配列番号4に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加(挿入)されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質[項2] (E) 1 or several amino acids in the amino acid sequence set forth in Protein (f) SEQ ID NO: 4 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 is deleted, substituted or added (inserted) in the amino acid sequence, and protein having glucose dehydrogenase activity [claim 2]
宿主が大腸菌である項1に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を製造する方法。 How the host to produce a protein having a glucose dehydrogenase activity according to claim 1 which is E. coli.
[項3] [Item 3]
以下の(a)(b)(c)または(d)のDNAからなる遺伝子。 Gene comprising DNA of the following (a) (b) (c) or (d).
(a)配列番号5に記載の塩基配列からなるDNA (A) DNA consisting of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 5
(b)配列番号5に記載の塩基配列およびイントロンを含む、配列番号8に記載の塩基配列からなるDNA (B) including the nucleotide sequence and intron of SEQ ID NO: 5, consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8 DNA
(c)(a)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA (C) a DNA which hybridizes with the DNA under stringent conditions comprising a DNA complementary to the nucleotide sequence of (a), and encoding a protein having glucose dehydrogenase activity DNA
(d)(b)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする領域を含むDNA (D) a DNA which hybridizes with the DNA under stringent conditions comprising a DNA complementary to the nucleotide sequence of (b), and includes a region encoding a protein having a glucose dehydrogenase activity DNA
[項4] [4.]
以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子。 Gene encoding the following protein (a) or (b).
(a)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質(b)配列番号4に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加(挿入)されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質[項5] (A) 1 or several amino acids in the amino acid sequence set forth in (b) a protein SEQ ID NO: 4 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 is deleted, substituted or added (inserted) in the amino acid sequence, and protein having glucose dehydrogenase activity [claim 5]
項3または4のいずれかに記載の遺伝子を含む組換えベクター。 Recombinant vector comprising a gene according to any one of claim 3 or 4.
[項6] [Section 6]
項5に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。 Transformant transformed with the recombinant vector according to claim 5.
[項7] [Section 7]
宿主が大腸菌である項6に記載の形質転換体。 The transformant according to claim 6 host is E. coli.
[項8] [Section 8]
項6または7に記載の形質転換体を栄養培地にて培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生産する方法。 How the transformant according to claim 6 or 7 were cultured in a nutrient medium to produce a protein having a glucose dehydrogenase activity and recovering the protein having glucose dehydrogenase activity.

本発明により、グルコースデヒドロゲナーゼを効率的に生産することができるようになった。 The present invention makes it possible to produce a glucose dehydrogenase efficiently. また、より実用的なグルコースデヒドロゲナーゼを取得するために分子生物学的な改良を行うことが容易になった。 Also it makes it easier to carry out molecular biological improvements to obtain more practical glucose dehydrogenase.

本発明者らは、上記目的を達成するために、NCBIのデータベースを利用し、グルコースデヒドロゲナーゼ(GDHとも表記)と推測される遺伝子DNAを見出した。 The present inventors have found that in order to achieve the above object, using a database of NCBI, found gene DNA suspected of glucose dehydrogenase (GDH also notation).

配列番号1に記載の塩基配列からなるDNA(遺伝子)は、NCBIのデータベースから予測される、アスペルギルス・オリゼRIB40株由来のグルコースデヒドロゲナーゼをコードするDNA(遺伝子)を含む、イントロンを除去していないゲノム遺伝子配列である。 DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (gene) is predicted from the database of the NCBI, including DNA (gene) encoding the glucose dehydrogenase derived from Aspergillus oryzae RIB40 strain does not remove introns genomic it is a gene sequence.

配列番号2に記載の塩基配列からなるDNA(遺伝子)は、配列番号1からイントロンを除去したものである。 DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 (gene) is obtained by removing the intron from SEQ ID NO: 1.

配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、NCIBのデータベースから予測されるグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の全配列を示す。 Gene encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 shows the entire sequence of glucose dehydrogenase gene predicted from the database of the NCIB.

本発明者らは、非特許文献1〜4、NCBIのデータベースなどから、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA(遺伝子)の同定は容易になしうると予想していた。 The present inventors have found that non-patent Documents 1 to 4, and the like NCBI database, the identification of DNA encoding a protein having a glucose dehydrogenase activity derived from Aspergillus oryzae (gene) had expected to be capable no easily.
そしてさらに、当該遺伝子を含有する組換えベクターを作製し、形質転換した形質転換体を作り、形質転換体が発現する当該遺伝子がコードするタンパク質を精製することも容易になしうると考えていた。 And further, to prepare a recombinant vector containing the gene, to make a transformant transformed, thought that can be readily without purifying the protein encoded by the gene transformant is expressed.

具体的には、本発明者らは、NCBIのデータベースではアスペルギルス・オリゼ由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードするアミノ酸配列部分および塩基配列部分は特定されていないものの、非特許文献1〜4に記載された方法や公知技術を参考にしてアスペルギルス・オリゼを培養し、その培養上清から各種クロマトグラフィーを用いてGDHを精製して、その末端アミノ酸配列などを分析してプローブを作製し、グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を単離することを試みた。 In particular, the present inventors have found that although the database of NCBI amino acid sequence portion and a nucleotide sequence region encoding a flavin-binding glucose dehydrogenase derived from Aspergillus oryzae is not specified, described in Non-Patent Documents 1 to 4 the methods and known techniques with reference culturing Aspergillus oryzae which was purified GDH using the culture supernatant various chromatographies, to produce a probe to analyze and its terminal amino acid sequence, glucose dehydrogenase the gene encoding the attempt was made to isolate.

同様に、本発明者らは、アスペルギルス・テレウスに属する微生物を独自に入手してグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を単離することを試みた。 Similarly, the present inventors have attempted to isolate the gene encoding glucose dehydrogenase to obtain the microorganism belonging to Aspergillus terreus own.

本発明者らは種々検討したが、通常行う塩析、クロマトグラフィー等を用いた精製法では、アスペルギルス・オリゼTI株培養上清から、高純度で、SDS−PAGE上ではっきりと確認できるGDH標品を得るのは困難であることが分かった。 The present inventors have been studied, usually in the purification method using salting out, chromatography or the like for, on Aspergillus oryzae TI strain culture supernatant, in high purity, GDH index which clearly can be seen on SDS-PAGE it has been found that it is difficult to obtain the goods. 酵素タンパク質に結合しているであろう糖鎖が精製、確認を困難にしている原因の1つであると推察した。 Sugar purification that would have been bound to the enzyme protein was presumed to be one of the causes which make it difficult to check. したがって、遺伝子取得の常法の1つである部分アミノ酸配列を利用したクローニングを断念せざるを得ないと判断した。 Therefore, it is determined that abandon forced cloning utilizing the partial amino acid sequence is one of the conventional methods of gene acquisition.
このため、遺伝子取得には多くの試行錯誤をともない、非常な困難を極めたが、鋭意検討の結果、アスペルギルス・オリゼ由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を単離し、本願発明を完成するに至った。 Therefore, with a lot of trial and error in gene acquisition has extremely great difficulty, a result of intensive studies, the gene encoding the flavin-binding glucose dehydrogenase derived from Aspergillus oryzae is isolated, to complete the present invention It led to.
その詳細は実施例1〜3に後述する。 Its details will be described later in Examples 1-3.

本発明の一実施形態は、以下の(a)(b)(c)(d)のいずれかのDNAからなる遺伝子、もしくは、以下の(e)または(f)のタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターにより形質転換体を栄養培地にて培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を製造する方法である。 One embodiment of the present invention, the gene consisting of the following (a) (b) (c) any of the DNA of (d) or comprises a gene encoding a protein of the following (e) or (f) transformants were cultured in a nutrient medium with the recombinant vector, a method for producing a protein having glucose dehydrogenase activity and recovering the protein having glucose dehydrogenase activity.

(a)配列番号5に記載の塩基配列からなるDNA(遺伝子)は、本願発明者が同定した、後述のアスペルギルス・オリゼ TI株由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA(遺伝子)の全配列を示す。 (A) the base sequence described in SEQ ID NO: 5 DNA (gene), the present inventors have identified, all of the DNA encoding a protein having an Aspergillus oryzae TI strains derived glucose dehydrogenase activity described later (gene) the sequences. また、 Also,
(c)配列番号5に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA(遺伝子)も、本発明に適用できる。 (C) a DNA which hybridizes with the DNA under stringent conditions comprising a DNA complementary to the nucleotide sequence of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5, and even DNA (gene) encoding a protein having a glucose dehydrogenase activity, It can be applied to the present invention.

(b)配列番号8に記載の塩基配列からなるDNA(遺伝子)は、後述のアスペルギルス・オリゼ TI株由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA(遺伝子)を含む、イントロンを除去していないゲノム遺伝子配列である。 (B) the base sequence described in SEQ ID NO: 8 DNA (gene) comprises a DNA encoding a protein having a glucose dehydrogenase activity derived from Aspergillus oryzae TI strains described later (gene) does not remove introns it is a genomic gene sequence. また、 Also,
(d)配列番号8に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性をコードする領域を含むDNAも、本発明に適用できる。 (D) a DNA which hybridizes with the DNA under stringent conditions comprising a DNA complementary to the nucleotide sequence of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8, and comprises a region which encodes a glucose dehydrogenase activity DNA also the present invention It can be applied.

(e)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子とは、後述のアスペルギルス・オリゼ TI株由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA(遺伝子)の全配列を示す。 The gene encoding a protein comprising the amino acid sequence of (e) SEQ ID NO: 4 shows the entire sequence of DNA (gene) encoding a protein having a glucose dehydrogenase activity derived from Aspergillus oryzae TI strains described below. また、 Also,
(f)配列番号4に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加(挿入)されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA(遺伝子)も、本発明にに適用できる。 (F) SEQ ID NO: 4 1 or a few amino acids are deleted in the amino acid sequence set forth in, substituted or added (inserted) in the amino acid sequence, and DNA encoding a protein having a glucose dehydrogenase activity (gene) also , it can be applied to the present invention.

本発明のDNA(遺伝子)は本GDHの発現を向上させるように、コドンユーセージ(Codon usage)を変更したものを含みうる。 DNA of the present invention (gene) to enhance the expression of the GDH, may comprise a modification of the codon usage (Codon usage).

例えば、上記のアスペルギルス・オリゼ由来のGDH遺伝子を発現用ベクター(プラスミド等多くのものが当該技術分野において知られている)に挿入し、適当な宿主(大腸菌等多くのものが当該技術分野において知られている)を形質転換する。 For example, knowledge was inserted into the above-mentioned Aspergillus oryzae-derived expression vector GDH gene (those such as many plasmids are known in the art), a suitable host (as such many E. coli in the art its dependent) for the transformation. 得られた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてEDTAなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、GDHを含む水溶性画分を得ることができる。 The resulting culturing the transformant, after the cells were collected by centrifugal separation from the culture medium, the cells were disrupted by enzymatic methods such as mechanical methods or lysozyme, also, such as EDTA as necessary by adding a chelating agent or a surfactant such as solubilized, it is possible to obtain a water-soluble fraction containing the GDH. または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したGDHを直接培養液中に分泌させることが出来る。 Or by using a suitable host-vector system, it is possible to secrete the expressed GDH directly into the culture medium.

上記のようにして得られたGDH含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。 The GDH-containing solution obtained as described above concentration under reduced pressure, ammonium sulfate, salting out, or a hydrophilic organic solvent such as sodium sulfate, for example precipitation methanol, ethanol, by fractional precipitation method such as acetone it Seshimere. また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。 Further, heat treatment and isoelectric point treatment are also effective purification means. また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたGDHを得ることができる。 Furthermore, gel filtration, adsorption chromatography due adsorbent or gel filtration agent, ion-exchange chromatography, by performing affinity chromatography to obtain a purified GDH. 該精製酵素標品は、電気泳動(SDS−PAGE)的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。 The purified enzyme preparation is preferably are purified to electrophoresis (SDS-PAGE) enough to show a single band.

これらは、例えば、以下の文献に従って進めることができる。 These include, for example, can proceed according to the following literature.
(a)タンパク質実験プロトコール第1巻 機能解析編,第2巻 構造解析編 (秀潤社) 西村善文,大野茂男 監修(b)改訂 タンパク質実験ノート 上 抽出と分離精製 (洋土社) 岡田雅人,宮崎香 (A) Protein Experiment Protocol Volume 1 functional analysis, ed., Vol. 2 structure analysis Hen (Shujunsha) Yoshifumi Nishimura, Shigeo supervision (b) and the revised proteins experiment notebook extraction separation and purification (Yodosha) Masato Okada Ohno, Kaoru Miyazaki
編集(c)タンパク質実験の進めかた (洋土社) 岡田雅人,宮崎香 編集 あるいは以下に例示する方法によって進めることもできる。 Edit (c) promoting form of the protein experiment (Yodosha) Masato Okada, it can also be advanced by the methods illustrated in incense edit or less Miyazaki.

作製されたタンパク質の遺伝情報を有するDNAは、ベクターと連結された状態にて宿主微生物中に移入される。 DNA having genetic information of the produced protein is transferred into a host microorganism in a state of being ligated to a vector.

ベクターとしては、宿主微生物内で自立的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。 As the vector, those from a phage or plasmid capable of autonomously grow in a host microorganism is constructed for gene recombination is suitable. ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合にはLambda gt10、Lambda gt11などが例示される。 The phage, for example, Lambda gt10, Lambda gt11 is exemplified in the case of Escherichia coli as the host microorganism. また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、pBR322、pUC19、pKK223−3、pBluescriptなどが例示される。 As the plasmid, for example, when Escherichia coli as the host microorganism, pBR322, pUC19, pKK223-3, etc. pBluescript are exemplified. なかでも、pBluescriptなど、クローニングサイト上流にエシェリヒア・コリ内で認識されうるプロモーターを保持するものが好ましい。 Among them, pBluescript etc., it is preferable to retain the promoter which can be recognized by the Escherichia coli cloning site upstream.
また、適当な宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自立増殖可能で外来遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。 Further, suitable host microorganism, a recombinant vector is stable, and as long as it can phenotypic expression of autonomous growth possible foreign gene is not particularly limited. エシェリヒア・コリではエシェリヒア・コリW3110、エシェリヒア・コリC600、エシェリヒア・コリHB101、エシェリヒア・コリJM109、エシェリヒア・コリDH5αなどを用いることができる。 Escherichia coli W3110 in Escherichia coli, Escherichia coli C600, Escherichia coli HB101, Escherichia coli JM109, or the like can be used Escherichia coli DH5 [alpha.

宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えDNAの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。 As a method for transferring the recombinant vector into a host microorganism, for example, when the host microorganism is a microorganism belonging to the genus Escherichia may be employed as a method for performing transfer of the recombinant DNA in the presence of calcium ions, further electroporation method may be used. 更には、市販のコンピテントセル(例えば、コンピテントハイDH5α;東洋紡績製)を用いても良い。 Furthermore, commercially available competent cells (e.g., competent high DH5 [alpha; manufactured by Toyobo) may be used. 宿主として、酵母が用いられる場合にリチウム法、エレクトロポレーション法が、また、糸状菌が用いられ場合にはプロトプラスト法などが用いられる。 As host, lithium method when yeast is used, electroporation method, also, like protoplast method are used when filamentous fungus is used.

本発明において、GDHをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。 In the present invention, as a method of obtaining a gene coding for GDH, it includes the following method. アスペルギルス・オリゼのゲノム配列情報を用い、予測GDH遺伝子を見出すことができる。 Using genomic sequence information of Aspergillus oryzae, can be found prediction GDH gene. ついで、アスペルギルス・オリゼの菌体よりmRNAを調製し、cDNAを合成する。 Then, mRNA is prepared from cells of Aspergillus oryzae, to synthesize cDNA. こうして得られたcDNAをテンペレートとして、PCR法によりGLD遺伝子を増幅させ、本遺伝子をベクターと両DNAの平滑末端または付着末端においてDNAリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。 As thus resulting cDNA temperate, by the PCR method to amplify the GLD gene, the present gene in the vector and the blunt ends or cohesive ends of both DNA bound closed by a DNA ligase to construct a recombinant vector. 該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーを利用してGDHをコードする遺伝子を含有する組換え微生物を得る。 After transferring a recombinant vector into a replicable host microorganism to obtain a recombinant microorganism containing the gene coding for GDH using a marker in the vector.

上記のように得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のGDHを安定に生産し得る。 Microorganism is a transformant obtained as described above, by being cultivated in a nutrient medium, it can produce stably large quantities of GDH. 組換え体の選択は、ベクターのマーカーとGDH活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。 Selection of recombinants may be searching a microorganism that expresses the marker and GDH activity of the vector at the same time. 例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつGDHを生成する微生物を選択すればよい。 For example, it is grown in selective medium based on a drug resistance marker, and may be selected microorganisms to produce a GDH.

GDH遺伝子の塩基配列は、Science,第214巻,1205(1981)に記載されたジデオキシ法により解読した。 Nucleotide sequence of the GDH gene, Science, Volume 214, decrypted by the dideoxy method described in 1205 (1981). また、GDHのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。 The amino acid sequence of GDH was estimated from the nucleotide sequence determined as above.

上記のようにして、一度選択されたGDH遺伝子を保有する組換えベクターより、他の微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、GDH遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やPCR法によりGDH遺伝子であるDNAを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。 As described above, from a recombinant vector carrying GDH gene once selected, the transfer to a recombinant vector able to replicate in other microorganisms, by restriction enzyme, PCR from the recombinant vector carrying the GDH gene DNA was recovered a GDH gene can be easily carried out by coupling with other vector fragment. また、これらのベクターによる他の微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法、プロトプラスト法などを用いることができる。 Also, transformation of other microorganisms with these vectors can be used by calcium treatment competent cell method or electroporation method, protoplast method, or the like.

なお、本発明のGDH遺伝子は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、該遺伝子の翻訳後のアミノ酸配列の各アミノ酸残基の一部が欠失または置換されるようなDNA配列をもつものでもよく、また他のアミノ酸残基が付加または置換されるようなDNA配列をもつものでもよい。 Incidentally, GDH gene of the present invention, as long as it has a glucose dehydrogenase activity may be those having a DNA sequence as part of each amino acid residue of the amino acid sequence of post-translational gene is deleted or substituted, also other amino acid residues may be one having a DNA sequence as addition or substitution.

野生型GDHをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。 As a method of modifying a gene encoding the wild-type GDH is usually a technique for modifying the genetic information performed is used. すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するDNAの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するDNAが作成される。 That is, by converting a specific base of a DNA having genetic information of the protein, or by inserting or deleting a specific base, DNA having genetic information of the modified protein is created. DNA中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット(TransformerMutagenesis Kit;Clonetech製,EXOIII/Mung Bean Deletion Kit;Stratagene製,QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit;Stratagene製など)の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)の利用が挙げられる。 As a specific method for converting a base in DNA, for example a commercially available kit (TransformerMutagenesis Kit; Clonetech made, EXOIII / Mung Bean Deletion Kit; Stratagene Ltd., QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit; etc. manufactured by Stratagene) using the, or polymerase It includes the use of chain reaction (PCR).

形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよい。 Culturing the form of the host microorganism is a transformant may be selected culture conditions in view of the host Physiological properties. 多くの場合は液体培養で行い、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。 Often performed in liquid culture, the industrially advantageous to carry out aeration agitation culture. ただし、生産性を考えた場合に、宿主として糸状菌を使用し、固体培養で行った方が有利な場合もある。 However, when considering productivity, using the filamentous fungus as the host, it is sometimes advantageous to carried out in solid culture.

培地の栄養源としては,微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。 The nutrient medium, those usually used for culture of microorganisms may be widely used. 炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。 The carbon source may be any assimilable carbon compounds, for example, glucose, sucrose, lactose, maltose, lactose, molasses, such as pyruvate is used. また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。 As the nitrogen source may be any nitrogen compounds available, for example, peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, and soybean meal alkaline extract is used. その他、リン酸塩、 Other, phosphate,
炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。 Carbonates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, salts such as zinc, specific amino acids, are used as needed, such as certain vitamins.

培養温度は菌が成育し、GDHを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくは20〜37℃程度である。 Culture temperature is growth is bacteria, can be suitably changed within the range to produce GDH, it is preferably about 20 to 37 ° C.. 培養時間は条件によって多少異なるが、GDHが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は6〜48時間程度である。 Slightly different depending culture time conditions, it is sufficient GDH is complete culture period suitable to sure to allow time to reach the maximum yield, typically about 6 to 48 hours. 培地のpHは菌が発育し、GDHを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはpH6.0〜9.0程度の範囲である。 The pH of the medium was growth is bacteria, can be suitably changed within the range to produce GDH, it is preferably in the range of about pH 6.0 to 9.0.

培養物中のGDHを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、GDHが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、GDH含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。 A liquid culture containing cells that produce GDH in the culture as it is taken, can also be utilized, in general, according to a conventional method, if the GDH exists in the culture broth by filtration, centrifugation or the like, a GDH-containing solution and microorganism cells used after separation. GDHが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、EDTA等のキレート剤及び界面活性剤を添加してGDHを可溶化し、水溶液として分離採取する。 When the GDH is present in the microbial cells, the microbial cells were harvested by means such as filtration or centrifugation from the culture obtained, then destroy the bacteria by enzymatic methods such as mechanical methods or lysozyme and, if necessary, the GDH by adding a chelating agent and a surfactant such as EDTA solubilized and separated off as an aqueous solution.

上記のようにして得られたGDH含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。 The GDH-containing solution obtained as described above concentration under reduced pressure, ammonium sulfate, salting out, or a hydrophilic organic solvent such as sodium sulfate, for example precipitation methanol, ethanol, by fractional precipitation method such as acetone it Seshimere. また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。 Further, heat treatment and isoelectric point treatment are also effective purification means. その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたGDHを得ることができる。 Thereafter, gel filtration, adsorption chromatography due adsorbent or gel filtration agent, ion-exchange chromatography, by performing affinity chromatography to obtain a purified GDH.

例えば、セファデックス(Sephadex)ゲル(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)などによるゲルろ過、DEAEセファロースCL−6B (GEヘルスケア バイオサイエンス社製)、オクチルセファロースCL−6B (GEヘルスケア バイオサイエンス社製)等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。 For example, Sephadex (Sephadex) gel (GE Healthcare Bioscience) gel filtration due, DEAE Sepharose CL-6B (GE Healthcare Bioscience), Octyl Sepharose CL-6B (GE Healthcare Bioscience ) separated by column chromatography or the like, purified, to obtain a purified enzyme preparation. 該精製酵素標品は、電気泳動(SDS−PAGE)的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。 The purified enzyme preparation is preferably are purified to electrophoresis (SDS-PAGE) enough to show a single band.

本発明において、グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定は以下の条件で行う。 In the present invention, the measurement of glucose dehydrogenase activity is carried out under the following conditions.
<試薬> <Reagent>
50mM PIPES緩衝液pH6.5(0.1%TritonX−100を含む) 50 mM PIPES buffer pH 6.5 (containing 0.1% TritonX-100)
14mM 2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(DCPIP)溶液1M D−グルコース溶液上記PIPES緩衝液15.8ml、DCPIP溶液0.2ml、D―グルコース溶液4mlを混合して反応試薬とする。 14 mM 2,6-dichlorophenol indophenol (DCPIP) solution 1M D- glucose solution the PIPES buffer 15.8 ml, DCPIP solution 0.2 ml, and the reaction reagent by mixing D- glucose solution 4 ml.

<測定条件> <Measurement conditions>
反応試薬2.9mlを37℃で5分間予備加温する。 The reaction reagent 2.9ml preincubate 5 minutes at 37 ° C.. GDH溶液0.1mlを添加しゆるやかに混和後、水を対照に37℃に制御された分光光度計で、600nmの吸光度変化を5分記録し、直線部分から1分間あたりの吸光度変化(ΔOD TEST )を測定する。 GDH solution 0.1ml was added after gentle mixing, with water controls the spectrophotometer thermostated at 37 ° C., the change of absorbance 600nm recorded 5 minutes, the change in absorbance per minute from the linear portion (.DELTA.OD TEST ) is measured. 盲検はGDH溶液の代わりにGDHを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に1分間あたりの吸光度変化(ΔOD BLANK )を測定する。 Blinded measures the change in absorbance per minute in the same manner (.DELTA.OD BLANK) by adding a solvent to dissolve the GDH instead of GDH solution to the reagent mixture. これらの値から下記の式に従ってGDH活性を求める。 Request GDH activity from these values ​​according to the following formula. ここでGDH活性における1単位(U)とは、濃度200mMのD−グルコース存在下で1分間に1マイクロモルのDCPIPを還元する酵素量として定義している。 Here, the one unit (U) in the GDH activity is defined as the amount of enzyme that reduces 1 micromole of DCPIP per minute D- glucose presence of concentration 200 mM.

活性(U/ml)={−(ΔOD TEST −ΔOD BLANK )×3.0×希釈倍率}/(16.3×0.1×1.0) Activity (U / ml) = {- (ΔOD TEST -ΔOD BLANK) × 3.0 × dilution factor} / (16.3 × 0.1 × 1.0 )

なお、式中の3.0は反応試薬+酵素溶液の液量(ml)、16.3は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数(cm2/マイクロモル)、0.1は酵素溶液の液量(ml)、1.0はセルの光路長(cm)を示す。 The liquid volume of 3.0 in the formula the reaction reagent + enzyme solution (ml), millimolar molecular extinction coefficient (cm @ 2 / micromole) of the present activity measurement conditions 16.3, 0.1 liquid volume of enzyme solution (ml), 1.0 denotes optical path length of the cell (cm).

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Following illustratively describes the invention based on examples, the present invention is not limited to the following examples.

後述の実施例に記載される、アスペルギルス・オリゼGDH遺伝子の取得手順の概略は以下の通りである。 Are described in the Examples below, schematic acquisition procedure of Aspergillus oryzae GDH gene is as follows.

アスペルギルス・オリゼ由来GDH遺伝子を取得するために、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・テレウス培養上清から、塩析、クロマトグラフィー等を用いてGDHの精製を試みたが、高純度のGDHを得るのは困難であった。 To obtain the Aspergillus oryzae-derived GDH gene, Aspergillus oryzae, on Aspergillus terreus culture supernatant, salting out, we tried GDH purified using chromatography or the like, is difficult to obtain high purity GDH Met. (実施例1[1]) (Example 1 [1])
よって、遺伝子取得の常法の1つである部分アミノ酸配列を利用したクローニングは断念せざるを得なくなった。 Therefore, we cloned utilizing partial amino acid sequence, which is one of conventional methods for gene acquired was forced to give up.

そこで、我々はGDHを生産する微生物を上記以外に求め鋭意探索した結果、Penicillium lilacinoechinulatum NBRC6231株がGDHを生産することを見出し、本菌株の培養液から高純度の精製酵素を得ることに成功した。 Therefore, we result of intensive search seek microorganisms producing GDH in addition to the above, we found that Penicillium lilacinoechinulatum NBRC6231 strain produce GDH, and succeeded in the culture of the strain to obtain a highly purified enzyme. (実施例1[2]) (Example 1 [2])
次いで、該酵素を用いて部分アミノ酸配列を決定することに成功し、決定したアミノ酸配列を元に、PCR法により、P. Then, it succeeded in determining the partial amino acid sequence using the enzyme, based on the determined amino acid sequence by the PCR method, P. lilacinoechinulatum NBRC6231由来GDH遺伝子を一部取得し、塩基配列を決定した(1356bp)。 Purchased certain lilacinoechinulatum NBRC6231-derived GDH gene was sequenced (1356 bp). (実施例1[3][4]) (Example 1 [3] [4])
最終的に、この塩基配列を元に、公開されているアスペルギルス・オリゼのゲノムデータベースより、アスペルギルス・オリゼGDH遺伝子を推定(実施例1[5])、取得した。 Finally, based on this base sequence, from the genome databases of Aspergillus oryzae published, Aspergillus oryzae GDH gene estimate (Example 1 [5]) was obtained.

<実施例1>、 <Example 1>,
アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ(以下AOGDHとも記載)遺伝子の推定[1]アスペルギルス・オリゼ由来GDHの取得 アスペルギルス・オリゼは、土壌より入手し定法に従ってL乾燥菌株とし保管していたものを使用した。 Aspergillus oryzae derived glucose dehydrogenase (hereinafter AOGDH also described) Estimation of the gene [1] obtaining Aspergillus oryzae Aspergillus oryzae-derived GDH was used which had been stored as L dried strain according to a standard method was obtained from soil. 以下これをアスペルギルス・オリゼTI株と呼ぶ。 Hereinafter, this is referred to as Aspergillus oryzae TI strain.
アスペルギルス・オリゼTI株のL乾燥菌株をポテトデキストロース寒天培地(Difco製)に植菌し25℃でインキュベートすることにより復元した。 Restored by incubating L dry strain of Aspergillus oryzae TI strains inoculated 25 ° C. on a potato dextrose agar medium (manufactured by Difco). 復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収してフィルター滅菌水に懸濁した。 The hyphae on was restored plates and suspended in filter-sterilized water was collected by the agar. 2基の10L容ジャーファーメンター中に生産培地(1%麦芽エキス、1.5%大豆ペプチド、0.1%MgSO4・7水和物、2%グルコース、pH6.5)6Lを調製し、120℃15分オートクレーブ滅菌して放冷した後、上記の菌糸懸濁液を接種し、30℃、通気攪拌培養を行った。 Production medium in 10L jar fermenter in 2 groups (1% malt extract, 1.5% soybean peptides, 0.1% MgSO4 · 7 hydrate, 2% glucose, pH 6.5) and 6L was prepared, 120 ° C. after cooling to 15 minutes autoclave sterilization, inoculated with the above mycelium suspension was carried out 30 ° C., aeration spinner culture. 培養開始から64時間後に培養を停止し、菌糸体を濾過により除去してGDH活性を含む濾過液を回収した。 Stop the culture 64 hours after the start of culture were recovered filtrate containing GDH activity mycelium was removed by filtration. 回収した上清を限外ろ過膜(分子量10,000カット)により低分子物質を除去した。 The collected supernatant was removed low-molecular substances by ultrafiltration membrane (molecular weight cutoff of 10,000). 次いで、硫酸アンモニウムを60%飽和度となるように添加、溶解し、硫安分画を行い、遠心機によりGDHを含む上清画分を回収後、Octyl−Sepharoseカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度60%〜0%でグラジエント溶出してGDH活性のある画分を回収した。 Then, added to a 60% saturation of ammonium sulfate was dissolved, subjected to ammonium sulfate fractionation, after collecting the supernatant fraction containing GDH by centrifuge, adsorbed onto Octyl-Sepharose column, ammonium sulfate saturation 60% It was collected fractions having the GDH activity gradient elution with 0%. 得られたGDH溶液を、G−25−Sepharoseカラムを用いて脱塩を行った後、60%飽和度の硫酸アンモニウムを添加、溶解し、これをPhenyl−Sepharoseカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度60%〜0%でグラジエント溶出してGDH活性のある画分を回収した。 The resulting GDH solution was subjected to desalting using a G-25-Sepharose column, adding 60% saturation of ammonium sulfate was dissolved, which was adsorbed onto Phenyl-Sepharose column, ammonium sulfate saturation 60% It was collected fractions having the GDH activity gradient elution with 0%. 更にこれを50℃で45分加温した後、遠心分離を行って上清を得た。 After it was even this 45 minutes was heated at 50 ° C., to obtain a supernatant by centrifugation. 以上の工程を経て得られた溶液を精製GDH標品(AOGDH)とした。 The solution obtained through the above steps was purified GDH preparation (AOGDH). 尚、上記精製過程においては、緩衝液として20mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.5)を使用した。 In the above purification process, it was used 20mM potassium phosphate buffer (pH 6.5) as a buffer. さらに、AOGDHの部分アミノ酸配列を決定するため、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの各種手段により精製を試みたものの、部分アミノ酸配列決定に供することのできる精製標品を得ることはできなかった。 Furthermore, in order to determine the partial amino acid sequence of AOGDH, ion exchange chromatography, despite attempted purified by various means such as gel filtration chromatography, not possible to obtain a purified preparation which may be subjected to partial amino acid sequencing It was.
また、我々はアスペルギルス・テレウスに属する微生物を独自に探索入手し、上記と同様にその培養上清より、塩析、Octyl−sepharose等による精製を試みたが、アスペルギルス・オリゼ同様部分アミノ酸配列決定に供することのできる精製標品を得ることはできなかった。 We also own searches obtain the microorganism belonging to Aspergillus terreus, from the culture supernatant in the same manner as described above, salting out, was tried purification by Octyl-sepharose or the like, Aspergillus oryzae similar partial amino acid sequencing it was not possible to obtain a purified preparation that can be provided. 通常、一般的に行われる精製法を用いて、高純度で、SDS−PAGE上ではっきりと確認できるGDH標品を得ることができなかったのは、酵素タンパク質に結合しているであろう糖鎖が原因の一つとなってるのではないかと推察した。 Normally, using a purification method generally performed, in high purity, it was not able to obtain GDH preparations clearly be confirmed on SDS-PAGE will bound to the enzyme protein sugar the chain has been speculated that it would be has become one of the causes. したがって、遺伝子取得の常法の1つである該タンパク質の部分アミノ酸配列を利用したクローニングを断念せざるを得なくなった。 Thus, it was forced to abandon cloning using partial amino acid sequence of the protein which is one of the conventional methods of gene acquisition.
[2]ペニシリウム属糸状菌由来GDHの取得 ペニシリウム属糸状菌由来のGDH生産菌としてPenicillium lilacinoechinulatum NBRC6231を用い、上記アスペルギルス・オリゼTI株と同様の手順に従って、培養および精製を行い、SDS電気泳動でほぼ均一な精製標品を取得した。 [2] using the Penicillium lilacinoechinulatum NBRC6231 as GDH-producing bacterium from acquiring Penicillium fungi Penicillium fungi-derived GDH, according to the procedure similar to the Aspergillus oryzae TI strains were cultured and purified, substantially by SDS electrophoresis It was obtained a homogeneous purified preparation.

[3]cDNAの作製 Penicillium lilacinoechinulatum NBRC6231について上記方法に従い(ただしジャーファーメンターでの培養時間は24時間)培養を実施し、濾紙濾過により菌糸体を回収した。 [3] cDNA Preparation Penicillium lilacinoechinulatum NBRC6231 (incubation time at However jar fermenter 24 hours) according to the above method for implementing the culture were recovered mycelium by filter paper filtration. 得られた菌糸は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、クールミル(東洋紡社製)を用いて菌糸を粉砕した。 The resulting mycelia frozen immediately placed in liquid nitrogen and ground mycelia using Kurumiru (Toyobo Co., Ltd.). 粉砕菌体より直ちにセパゾールRNA I(ナカライテスク社製)を用いて本キットのプロトコールに従ってトータルRNAを抽出した。 Total RNA was extracted according to the protocol of the kit with immediately Sepazoru RNA I (manufactured by Nacalai Tesque) than grinding cells. 得られたトータルRNAからはOrigotex−dt30(第一化学薬品社製)をもちいてmRNAを精製し、これをテンプレートにReverTra−Plus−TM(東洋紡社製)を用いてRT−PCRを行った。 Resulting from total RNA mRNA was purified using a Origotex-dt30 (manufactured by Daiichi Pure Chemicals), RT-PCR was performed using a template ReverTra-Plus-TM (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) thereto. 得られた産物はアガロース電気泳動を行い、鎖長0.5〜4.0kbに相当する部分を切り出した。 The resulting product is subjected to agarose electrophoresis, excised a portion corresponding to the chain length 0.5~4.0Kb. 切り出したゲル断片からMagExtractor−PCR&Gel Clean Up−(東洋紡社製)を用いてcDNAを抽出・精製してcDNAサンプルとした。 Excised gel fragment from MagExtractor-PCR & Gel Clean Up- (Toyobo Co., Ltd.) was used to extract and purify the cDNA was cDNA sample.

[4]GDH遺伝子部分配列の決定 上記で精製したNBRC6231由来GDHを0.1%SDS、10%グリセロールを含有するTris−HClバッファー(pH6.8)に溶解し、ここにGlu特異的V8エンドプロテアーゼを終濃度10μg/mlとなるよう添加し37℃16時間インキュベートすることで部分分解を行った。 [4] The NBRC6231-derived GDH purified in determining the above GDH gene partial sequence was dissolved in Tris-HCl buffer containing 0.1% SDS, 10% glycerol (pH 6.8), wherein the Glu-specific V8 endoprotease was subjected to partial decomposition by adding incubated 37 ° C. 16 hours to a final concentration of 10 [mu] g / ml. このサンプルをアクリルアミド濃度16%のゲルを用いて電気泳動してペプチドを分離した。 The sample was separated peptides by electrophoresis using acrylamide concentration of 16% gel. このゲル中に存在するペプチド分子を、ブロット用バッファー(1.4%グリシン、0.3%トリス、20%エタノール)を用いてセミドライ法によりPVDF膜に転写した。 Peptide molecules present in the gel was transferred to PVDF membrane by semi-dry method using blotting buffer (1.4% glycine, 0.3% Tris, 20% ethanol) and. PVDF膜上に転写したペプチドはCBB染色キット(PIERCE社製GelCode Blue Stain Reagent)を用いて染色し、可視化されたペプチド断片のバンド部分2箇所を切り取ってペプチドシーケンサーにより内部アミノ酸配列の解析を行った。 Peptides transferred onto PVDF membrane were stained with CBB staining kit (PIERCE Co. GelCode Blue Stain Reagent), it was analyzed internal amino acid sequence by a peptide sequencer cut band portion 2 places visualized peptide fragments . 得られたアミノ酸配列はIGGVVDTSLKVYGTおよびWGGGTKQTVRAGKALGGTSTであった。 The resulting amino acid sequence was IGGVVDTSLKVYGT and WGGGTKQTVRAGKALGGTST. この配列を元にミックス塩基を含有するディジェネレートプライマーを作製し、NBRC6231由来cDNAをテンプレートにPCRを実施したところ増幅産物が得られ、アガロースゲル電気泳動により確認したところ1.4kb程度のシングルバンドであった。 To produce a degenerate primer containing a mix nucleotide of this sequence to the original, NBRC6231-derived cDNA template amplification product was subjected to a PCR obtained the, 1.4 kb about single band was confirmed by agarose gel electrophoresis Met. このバンドを切り出して東洋紡製MagExtractor−PCR&Gel Clean Up−を用いて抽出・精製した。 Cut out this band was extracted and purified using the Up- manufactured by Toyobo Co., Ltd. MagExtractor-PCR & Gel Clean. 精製DNA断片はTArget Clone −Plus−(東洋紡社製)によりTAクローニングし、得られたベクターで大腸菌JM109コンピテントセル(東洋紡社製)をヒートショックにより形質転換した。 Purified DNA fragment was TA cloned by TArget Clone -Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), the vector from E. coli JM109 competent cells (Toyobo) were transformed by heat shock. 形質転換クローンのうち青白判定でインサート挿入が確認されたコロニーについてMagExtractor−Plasmid−(東洋紡社製)を用いてプラスミドをミニプレップ抽出・精製し、プラスミド配列特異的プライマーを用いてインサートの塩基配列を決定した(1356bp)。 With MagExtractor-Plasmid- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) for colony the insert inserted was confirmed by the blue-white judgment of the transformed clones plasmids were miniprep extraction and purification, the nucleotide sequence of the insert with the plasmid sequence specific primers determined (1356bp).

[5]AOGDH遺伝子の推定 決定した塩基配列を元に「NCBI BLAST」のホームページ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)からホモロジー検索を実施し、 [5] The homology search was performed based on the nucleotide sequence deduced decision AOGDH gene from home "NCBI BLAST" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),
複数の候補配列より、公知のグルコース酸化酵素とのホモロジーも考慮して、AOGDH遺伝子を推定した。 A plurality of candidate sequences, taking into account also homology with known glucose oxidase, it was estimated AOGDH gene. 検索により推定したAOGDHとP. AOGDH and P. estimated by the search lilacinoechinulatum NBRC6231由来GDH部分配列とのアミノ酸レベルでの相同性は49%であった。 Homology at the amino acid level with lilacinoechinulatum NBRC6231-derived GDH partial sequence was 49%.

<実施例2> <Example 2>
AOGDH遺伝子の取得、大腸菌への導入 AOGDH遺伝子を取得するために、アスペルギルス・オリゼTI株の菌体よりmRNAを調製し、cDNAを合成した。 Get AOGDH gene, in order to obtain the introduction AOGDH genes into E. coli, mRNA is prepared from cells of Aspergillus oryzae TI strains to synthesize cDNA. 配列番号6、7に示す2種類のオリゴDNAを合成し、調製したcDNAをテンぺレートとしてKOD Plus DNAポリメラーゼ(東洋紡社製)を用いてAOGDH遺伝子増幅した。 By combining two kinds of oligo DNA shown in SEQ ID NO: 6,7, the prepared cDNA was AOGDH gene amplified using KOD Plus DNA polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) as a temperate. DNA断片を制限酵素NdeI、BamHIで処理し、pBluescript(LacZの翻訳開始コドンatgに合わせNdeI認識配列のatgを合わせる形でNdeIサイトを導入したもの)NdeI−BamHIサイトに挿入し、組換えプラスミドを構築した。 Limit the DNA fragment enzyme NdeI, treated with BamHI, (those that have been introduced an NdeI site in a manner to match the atg of NdeI recognition sequence match the LacZ translation initiation codon atg) pBluescript was inserted into NdeI-BamHI sites, a recombinant plasmid It was constructed. この組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリーDH5α(東洋紡社製)を形質転換した。 Using this recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli DH5 [alpha (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). 形質転換体より、常法に従いプラスミドを抽出し、AOGDH遺伝子の塩基配列の決定を行った(配列番号5)。 From the transformant according to a conventional method to extract the plasmid, it was performed to determine the nucleotide sequence of AOGDH gene (SEQ ID NO: 5). この結果、cDNA配列から推定されるアミノ酸残基は593アミノ酸(配列番号4)からなることが明らかとなった。 As a result, the amino acid residues deduced from the cDNA sequence revealed that consists 593 amino acids (SEQ ID NO: 4). データベースに登録されているRIB40株から予想されるGDHは588アミノ酸(配列番号3)でありTI株 GDHとアミノ酸残基数が異なることが示唆された。 GDH expected from RIB40 strain registered in the database TI strain GDH amino acid residues is 588 amino acids (SEQ ID NO: 3) is different suggested. なお、該遺伝子については、TI株ゲノムDNAを用いて配列を確認し、遺伝子隣接領域についてもRACE法を用いて確認を行った。 As for the gene, and sequence verified using the TI strain genomic DNA, it was confirmed by also using the RACE method for gene flanking regions. データベース株であるRIB40株とTI株で、GDH遺伝子の配列が異なることが示唆されたため、TI株GDH遺伝子を含む組換えプラスミドを鋳型として、データベースRIB40株の配列から予想されるGDH遺伝子配列を含む組換えプラスミドをQuickChange Site Directed Mutagenesis Kit(Stratagene製)を用いて作製し、形質転換体の取得を行った。 A database strains RIB40 strain and TI strains, since the sequence of GDH gene is different suggested, a recombinant plasmid containing the TI strain GDH gene as a template, comprising the GDH gene sequence predicted from the sequence database RIB40 strain recombinant plasmids were prepared using the QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit (manufactured by Stratagene), was performed to obtain the transformant. これら形質転換体を100μg/mlのアンピシリンを含む液体培地(Terrific broth)200ml中で、30℃、16時間振とう培養を行った。 These transformants in liquid media (Terrific broth) in 200ml containing 100 [mu] g / ml ampicillin, 30 ° C., was carried out for 16 hours by shaking culture. 菌体破砕液についてGDH活性を確認したところ、RIB40株由来GDHの配列を有する形質転換体ではGDH活性が確認できなかったが、TI株由来GDHの配列を有する形質転換体については菌体内に培養液1ml当たり8.0Uの高いGDH活性が得られた。 When checking GDH activity for cell lysate, it could not be confirmed GDH activity in transformants having the sequence of RIB40 strain-derived GDH, cultured microbial cells for transformants having the sequence of TI line-derived GDH high GDH activity of 8.0U per liquid 1ml was obtained. 尚、実施例1で実施したアスペルギルス・オリゼTI株の培養上清のGDH活性は、0.2U/mlであった。 Incidentally, GDH activity of the culture supernatant of Aspergillus oryzae TI strains was performed in Example 1 was 0.2 U / ml. この結果は、RIB40株データベース配列から予想したGDH遺伝子はGDHとして機能していないことが示唆するものであり、TI株とRIB40株の遺伝子配列を比較するかぎり、RIB40株ではGDH遺伝子の配列が一部欠失していることがその原因であると考えられた。 This result, GDH genes predicted from RIB40 strain database sequence is intended to suggest that it is not functioning as GDH, unless comparing gene sequence of TI strains and RIB40 strain, sequences of GDH gene is RIB40 strain one it was believed to be the cause of that deleted parts missing.

<実施例3> <Example 3>
実施例2で培養したTI株由来GDHの配列を有するエシェリヒア・コリーDH5α形質転換体を遠心分離により菌体を回収し、20mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.5)に懸濁後、フレンチプレス破粉機を用いてGDHを抽出液した。 Escherichia coli DH5α transformants having sequences TI line derived GDH cultured in Example 2 were harvested by centrifugation, were suspended in 20mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), French press implosion the GDH using a powder device was extract. これを実施例1で精製したAOGDHと同様の手順により、精製酵素標品(rAOGDH)を得て、AOGDH精製酵素標品との特性比較を実施した。 The same procedure as AOGDH purified in Example 1 this to obtain purified enzyme preparation of (rAOGDH), it was performed Comparison with AOGDH purified enzyme preparation.
[1]基質特異性 血糖センサを用いて血糖値を測定する場合、誤診を招かないために、グルコース特異的な酵素の使用が求められる。 [1] using a substrate specificity glucose sensor when measuring the blood glucose level, in order not to cause misdiagnosis, use of glucose specific enzyme is required. そこでrAOGDHについて各種糖類に対する反応性を調べた。 So it was examined for reactivity to various saccharides for RAOGDH. 結果を図1に示す。 The results are shown in Figure 1. rAOGDHはAOGDHと同等の基質特異性を示し、輸液使用患者がセンサを使用する際に特に問題になるマルトースには作用しないことが確認された。 rAOGDH shows a comparable substrate specificity and AOGDH, the maltose infusion using patient is particularly problematic when using sensors has been confirmed that no effect.
[2]マルトース分解性 血糖センサに使用するGDHそのものはマルトースに作用せずとも、酵素標品等にマルトースをグルコースに分解する成分が含まれる場合にも誤診につながる可能性がある。 [2] GDH itself to be used for maltose degradable glucose sensor without acting on maltose, it can lead to misdiagnosis even when maltose enzyme preparation Hinto contain decomposed components to glucose. つまり、GDH酵素標品にマルトースを分解する成分が含まれていないことが、きわめて重要になる。 In other words, it does not contain a degrading component maltose GDH enzyme preparation becomes very important. そこで、GDH精製表品中のマルトース分解成分のコンタミネーションについて調べた。 Therefore, we investigated contamination maltose decomposed components in the GDH purification table products. マルトース分解酵素のコンタミネーション試験は、以下の要領で行った。 Contamination test of maltose-degrading enzyme, was carried out in the following manner. 10U/mlに調製した各種精製酵素液50μlに、8mMマルトース50μlを添加して37℃にて反応した。 Various purified enzyme solution 50μl prepared in 10 U / ml, was reacted at the addition of 8mM maltose 50μl and 37 ° C.. 反応終了後、リキテックグルコース・HK・テスト(ロッシュ・ダイアグノスティックス社製)を用いて反応液に含まれるグルコース濃度を調べた。 After completion of the reaction, we examined the glucose concentration in the reaction solution by using a Riki Tech glucose · HK · test (Roche Diagnostics). なお、グルコース濃度を算出するための検量線は、該測定キットにて検量係数設定用グルコース(和光純薬工業社製)を測定して作成した。 Incidentally, a calibration curve for calculating the glucose concentration was prepared by measuring the calibration coefficient setting glucose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at the measurement kit. 結果を図2に示す。 The results are shown in Figure 2. AOGDH精製標品では、37℃,30秒処理で、既に90%のマルトースがグルコースに分解されており、10分反応処理後では、100%に近いマルトースが分解されていた。 In AOGDH purified product, 37 ° C., for 30 seconds processing has already 90% of maltose is decomposed into glucose, after the 10 minutes the reaction process, maltose had been degraded close to 100%. そこで、実施例1で部分アミノ酸配列解析を目的にAOGDHを高度に精製した標品を用いて同様に測定を行ったが、やはりマルトースから分解活性が確認された。 Therefore, although was measured similarly using the preparations were highly purified AOGDH the purpose of partial amino acid sequence analysis in Example 1, also the degradation activity of maltose was confirmed. 一方、rAOGDHでは、37℃,10分処理した後も、グルコースの蓄積は全く見られなかった。 On the other hand, in rAOGDH, 37 ℃, even after treatment 10 minutes, the accumulation of glucose was not observed at all. アスペルギルス・オリゼは古くから、醗酵産業に利用されており、アミラーゼやグルコアミラーゼなどの糖質関連酵素を著量生産することが知られており、そのような環境下で、GDHのみを高純度に精製するのは極めて困難と考えれる。 Aspergillus oryzae is a long time, has been used in the fermentation industry, it is known that the significant amount production carbohydrate-related enzymes such as amylase and glucoamylase, in such an environment, GDH only with high purity It is considered to be extremely difficult to purify.

これらの結果から、アスペルギルス・オリゼ由来GDHを血糖センサで用いる場合には遺伝子組換え体から調製したGDHを用いることが必須であると考える。 These results considered in the case of using the Aspergillus oryzae-derived GDH in blood glucose sensor is essential to use a GDH prepared from a genetic recombinant.

本発明は、組換え大腸菌を用いることにより、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼを、大量に生産することを可能にするものである。 The present invention, by using a recombinant E. coli is one that enables the glucose dehydrogenase derived from Aspergillus oryzae, produced in large quantities. また、本発明により広い意味でマルトースに作用しない、グルコースセンサ等に適したグルコースデヒドロゲナーゼを生産することを可能にする。 Also, do not act on maltose in a broad sense by the present invention makes it possible to produce a glucose dehydrogenase suitable for glucose sensor or the like.

本発明のGDH精製評品の基質特異性を示す。 It shows the substrate specificity of the GDH purified Review article of the present invention. 各基質濃度を4mMに設定し、グルコースに対する活性を100とした。 Each substrate concentration was set to 4 mM, and the activity for glucose as 100. 本発明のGDH精製評品のマルトース分解性を示す。 It shows the maltose degradable GDH purified Review article of the present invention.

Claims (8)

  1. 以下の(a)(b)(c)(d)のいずれかのDNAからなる遺伝子、もしくは、以下の(e)または(f)のタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターにより形質転換された形質転換体を栄養培地にて培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を製造する方法。 Gene consisting of the following (a) (b) (c) any of the DNA of (d), or transformed with a recombinant vector containing a gene encoding a protein of the following (e) or (f) how transformants were cultured in a nutrient medium to produce a protein having glucose dehydrogenase activity and recovering the protein having glucose dehydrogenase activity.
    (a)配列番号5に記載の塩基配列からなるDNA (A) DNA consisting of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 5
    (b)配列番号5に記載の塩基配列およびイントロンを含む、配列番号8に記載の塩基配列からなるDNA (B) including the nucleotide sequence and intron of SEQ ID NO: 5, consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8 DNA
    (c)(a)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA (C) a DNA which hybridizes with the DNA under stringent conditions comprising a DNA complementary to the nucleotide sequence of (a), and encoding a protein having glucose dehydrogenase activity DNA
    (d)(b)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする領域を含むDNA (D) a DNA which hybridizes with the DNA under stringent conditions comprising a DNA complementary to the nucleotide sequence of (b), and includes a region encoding a protein having a glucose dehydrogenase activity DNA
    (e)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質(f)配列番号4に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加(挿入)されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質 (E) 1 or several amino acids in the amino acid sequence set forth in Protein (f) SEQ ID NO: 4 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 is deleted, substituted or added (inserted) in the amino acid sequence, and protein having a glucose dehydrogenase activity
  2. 宿主が大腸菌である請求項1に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を製造する方法。 Method for producing a protein having glucose dehydrogenase activity of claim 1 host is E. coli.
  3. 以下の(a)(b)(c)または(d)のDNAからなる遺伝子。 Gene comprising DNA of the following (a) (b) (c) or (d).
    (a)配列番号5に記載の塩基配列からなるDNA (A) DNA consisting of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 5
    (b)配列番号5に記載の塩基配列およびイントロンを含む、配列番号8に記載の塩基配列からなるDNA (B) including the nucleotide sequence and intron of SEQ ID NO: 5, consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8 DNA
    (c)(a)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA (C) a DNA which hybridizes with the DNA under stringent conditions comprising a DNA complementary to the nucleotide sequence of (a), and encoding a protein having glucose dehydrogenase activity DNA
    (d)(b)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする領域を含むDNA (D) a DNA which hybridizes with the DNA under stringent conditions comprising a DNA complementary to the nucleotide sequence of (b), and includes a region encoding a protein having a glucose dehydrogenase activity DNA
  4. 以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子。 Gene encoding the following protein (a) or (b).
    (a)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質(b)配列番号4に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加(挿入)されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質 (A) 1 or several amino acids in the amino acid sequence set forth in (b) a protein SEQ ID NO: 4 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 is deleted, substituted or added (inserted) in the amino acid sequence, and protein having a glucose dehydrogenase activity
  5. 請求項3または4のいずれかに記載の遺伝子を含む組換えベクター。 Recombinant vector comprising a gene according to claim 3 or 4.
  6. 請求項5に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。 Transformant transformed with the recombinant vector of claim 5.
  7. 宿主が大腸菌である請求項6に記載の形質転換体。 The transformant according to claim 6 host is E. coli.
  8. 請求項6または7に記載の形質転換体を栄養培地にて培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生産する方法。 How the transformant according to claim 6 or 7 were cultured in a nutrient medium to produce a protein having a glucose dehydrogenase activity and recovering the protein having glucose dehydrogenase activity.
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