JP2007236347A - Central breathing disorder model/non-human animal - Google Patents
Central breathing disorder model/non-human animal Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007236347A JP2007236347A JP2006066489A JP2006066489A JP2007236347A JP 2007236347 A JP2007236347 A JP 2007236347A JP 2006066489 A JP2006066489 A JP 2006066489A JP 2006066489 A JP2006066489 A JP 2006066489A JP 2007236347 A JP2007236347 A JP 2007236347A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dscam
- gene
- human animal
- respiratory
- disorder
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 67
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 title abstract description 12
- 101150042154 Dscam gene Proteins 0.000 claims abstract description 140
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 56
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 48
- 102100037713 Down syndrome cell adhesion molecule Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 101710199377 Down syndrome cell adhesion molecule Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 37
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 claims description 33
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 23
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 22
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 18
- 210000001034 respiratory center Anatomy 0.000 claims description 14
- 210000003594 spinal ganglia Anatomy 0.000 claims description 14
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 13
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 claims description 13
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 8
- 206010066131 Congenital central hypoventilation syndrome Diseases 0.000 claims description 7
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 7
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 230000014511 neuron projection development Effects 0.000 claims description 6
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 claims description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 abstract description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 14
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 12
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 230000003434 inspiratory effect Effects 0.000 description 10
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 9
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 9
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 9
- 206010010539 Congenital megacolon Diseases 0.000 description 8
- 208000004592 Hirschsprung disease Diseases 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 210000001767 medulla oblongata Anatomy 0.000 description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 6
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 6
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 5
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 210000005262 rostral ventrolateral medulla Anatomy 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- -1 5HT Proteins 0.000 description 4
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 4
- 210000004720 cerebrum Anatomy 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 3
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 3
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 108010072151 Agouti Signaling Protein Proteins 0.000 description 2
- 102000006822 Agouti Signaling Protein Human genes 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000484025 Cuniculus Species 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 238000010826 Nissl staining Methods 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010019653 Pwo polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 208000008784 apnea Diseases 0.000 description 2
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 2
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 208000036970 congenital 1 with or without Hirschsprung disease central hypoventilation syndrome Diseases 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 2
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 2
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000003522 neurite outgrowth assay Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000269350 Anura Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000016843 Calbindin 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010028326 Calbindin 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010058699 Choline O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 208000027205 Congenital disease Diseases 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102100033902 Endothelin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101800004490 Endothelin-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 108010000722 Excitatory Amino Acid Transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031563 Excitatory amino acid transporter 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102100021260 Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 101000894906 Homo sapiens Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001092197 Homo sapiens RNA binding protein fox-1 homolog 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000600903 Homo sapiens Substance-P receptor Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 101150097991 L1CAM gene Proteins 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 101100224654 Mus musculus Dscam gene Proteins 0.000 description 1
- 101100518992 Mus musculus Pax2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000614094 Mus musculus Proton-activated chloride channel Proteins 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700006416 NBPhox Proteins 0.000 description 1
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 1
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 1
- 102000019009 Neural Cell Adhesion Molecule L1 Human genes 0.000 description 1
- 108010012255 Neural Cell Adhesion Molecule L1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000007354 PAX6 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 101150081664 PAX6 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000004590 Peripherins Human genes 0.000 description 1
- 108010003081 Peripherins Proteins 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 101150008375 Pou4f1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 102100035530 RNA binding protein fox-1 homolog 3 Human genes 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108700005079 Recessive Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000052708 Recessive Genes Human genes 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 102100037346 Substance-P receptor Human genes 0.000 description 1
- 208000034972 Sudden Infant Death Diseases 0.000 description 1
- 206010042440 Sudden infant death syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010044688 Trisomy 21 Diseases 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000000020 growth cone Anatomy 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003249 myenteric plexus Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000008035 nerve activity Effects 0.000 description 1
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000933 neural crest Anatomy 0.000 description 1
- 210000001982 neural crest cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000000956 olfactory bulb Anatomy 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 210000005047 peripherin Anatomy 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 210000002975 pon Anatomy 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 201000002859 sleep apnea Diseases 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 230000007847 structural defect Effects 0.000 description 1
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 1
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000003519 ventilatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
中枢性呼吸障害とは、脳幹及び/又は延髄にある呼吸運動をつかさどる中枢神経系が正常に作動せず、呼吸運動が異常となる状態と定義される。より具体的に中枢性呼吸障害としては、先天性中枢性低換気症候群(Ondine curse病)や、難病である原発性肺胞低換気症候群(primary alveolar hypoventilaon syndrome;PAHS)等を挙げることができる。また、乳幼児突然死症候群や睡眠時無呼吸症候群なども原因の一つとして中枢性呼吸障害が疑われている。 Central respiratory disorder is defined as a condition in which the central nervous system that controls respiratory movements in the brainstem and / or medulla does not operate normally and respiratory movements are abnormal. More specifically, examples of central respiratory disorder include congenital central hypoventilation syndrome (Ondine curse disease) and primary alveolar hypoventilaon syndrome (PAHS), which is an intractable disease. Central respiratory disorder is also suspected as a cause of sudden infant death syndrome and sleep apnea syndrome.
しかしながら、中枢性呼吸障害の原因遺伝子が未だ特定されておらず、中枢性呼吸障害の発症メカニズムを解明するには至っていない。中枢性呼吸障害の発症メカニズムが明らかになれば、上述した各種の症候群の有効な治療や薬剤の創出を期待することができる。 However, the causative gene of central respiratory disorder has not yet been identified, and the onset mechanism of central respiratory disorder has not been elucidated. If the onset mechanism of central respiratory disorder is clarified, it is possible to expect effective treatment of the above-mentioned various syndromes and creation of drugs.
ところで、神経系免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞接着分子(CAM)は、神経系の発生および機能(移動、神経突起の認識、軸索伸長および軸索反発を含む)に重要な種々の細胞間相互作用を仲介するものとして知られている。なかでも、ダウン症細胞接着分子(DSCAM)は、ヒト第21q22染色体から単離される神経系Igスーパーファミリーの最大のメンバーである(非特許文献1)。非特許文献1及び非特許文献2では、マウスDscamを同定し、これが胎児期から成人期にかけて神経系で広範に発現していることが示されている。
By the way, cell adhesion molecules (CAMs) of the nervous system immunoglobulin superfamily are involved in various cell-cell interactions that are important for the development and function of the nervous system (including migration, neurite recognition, axon elongation, and axon repulsion). It is known to mediate. Among them, Down's syndrome cell adhesion molecule (DSCAM) is the largest member of the nervous system Ig superfamily isolated from human chromosome 21q22 (Non-patent Document 1).
しかしながら、DSCAMと中枢性呼吸障害との関連性を示す知見はなく、またDSCAM遺伝子は中枢性呼吸障害の原因遺伝子の候補としてさえ挙がっていないのが現状である。 However, there is no knowledge showing the relationship between DSCAM and central respiratory disorder, and the DSCAM gene is not even listed as a candidate gene for central respiratory disorder.
そこで、本発明は、上述したような実情に鑑み、DSCAM遺伝子の欠損と中枢性呼吸障害の発症との関連性を新規に証明することで、中枢性呼吸障害の発症メカニズムや中枢性呼吸障害に関する創薬を可能とする有用な非ヒト動物、非ヒト動物の作製方法、呼吸中枢障害に起因する疾患の治療薬のスクリーニング方法、呼吸中枢障害に起因する疾患の検査方法及び呼吸中枢障害に起因する疾患の検査キットを提供することを目的とする。 Therefore, in view of the above situation, the present invention relates to the mechanism of central respiratory disorder and central respiratory disorder by newly demonstrating the relationship between DSCAM gene deficiency and the development of central respiratory disorder. Useful non-human animals that enable drug discovery, methods for producing non-human animals, screening methods for therapeutic agents for diseases caused by respiratory central disorders, methods for examining diseases caused by respiratory central disorders, and respiratory central disorders An object is to provide a test kit for a disease.
上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。
(1)ダウン症細胞接着分子(Down syndrome cell adhesion molecule: DSCAM)遺伝子が欠損した遺伝子型を有し、中枢性呼吸障害を示す非ヒト動物。
(2)上記DSCAM遺伝子がホモ欠損である(1)記載の非ヒト動物。
(3)上記DSCAM遺伝子がヘテロ欠損である(1)記載の非ヒト動物。
(4)ダウン症細胞接着分子(Down syndrome cell adhesion molecule: DSCAM)遺伝子が欠損した遺伝子型を有し、中枢性呼吸障害を示す非ヒト動物の作製方法であって、非ヒト動物胚幹細胞おける前記遺伝子が欠失されているか又は非機能性とされた胚幹細胞を選別し、当該胚幹細胞からキメラ胚を作製し、当該キメラ胚を仮親非ヒト動物の子宮に移植し、出産により非ヒト仔動物を得て、前記遺伝子が破壊されたキメラ非ヒト動物を選別し、前記キメラ非ヒト動物の雌と雄の交配によって、DSCAM遺伝子が欠損した遺伝子型を有する非ヒト動物を得る工程を含む方法。
(5)上記交配によって上記DSCAM遺伝子がホモ欠損である非ヒト動物を得ることを特徴とする(4)記載の方法。
(6)上記交配によって上記DSCAM遺伝子がヘテロ欠損である非ヒト動物を得ることを特徴とする(4)記載の方法。
(7)(1)乃至(3)いずれか一項記載の非ヒト動物に対して、候補物質を投与する工程と、上記(1)〜(4)の少なくとも1つのデータを測定する工程と、
(1)非ヒト動物の呼吸リズムを示すデータ
(2)C4前根活性を示すデータ
(3)前呼吸性ニューロン活性を示すデータ
(4)後根神経節ニューロン培養物の神経突起伸長を示すデータ
下記(1)〜(4)いずれか1以上のデータが、候補物質未投与の上記非ヒト動物を用いて測定したデータと比較して有意に改善している場合に当該候補物質を呼吸中枢障害に起因する疾患の治療薬として同定する工程とを含む呼吸中枢障害に起因する疾患の治療薬のスクリーニング方法。
(8)上記疾患が先天性中枢性低換気症候群であることを特徴とする(7)記載のスクリーニング方法。
(9)上記疾患がヒルシュスプリング病を併発することを特徴とする(7)記載のスクリーニング方法。
(10) 被検者から生体サンプルを採取する工程、採取した生体サンプルにおける、ダウン症細胞接着分子(Down syndrome cell adhesion molecule: DSCAM)遺伝子の変異を検出する工程を含む、呼吸中枢障害に起因する疾患の検査方法。
(11) 被検者から採取した生体サンプルにおける、ダウン症細胞接着分子(Down syndrome cell adhesion molecule: DSCAM)遺伝子の変異を検出する試薬を含む、呼吸中枢障害に起因する疾患診断キット。
The present invention that has achieved the above-described object includes the following.
(1) A non-human animal having a genotype deficient in a Down syndrome cell adhesion molecule (DSCAM) gene and exhibiting central respiratory disorder.
(2) The non-human animal according to (1), wherein the DSCAM gene is homo-deficient.
(3) The non-human animal according to (1), wherein the DSCAM gene is heterozygous.
(4) A method for producing a non-human animal having a genotype deficient in a Down syndrome cell adhesion molecule (DSCAM) gene and exhibiting central respiratory disorder, wherein the gene is used in a non-human animal embryonic stem cell Is selected or embryonic stem cells that have been rendered non-functional, a chimeric embryo is produced from the embryonic stem cells, the chimeric embryo is transplanted into the uterus of a temporary parent non-human animal, and a non-human pup is obtained by birth And obtaining a non-human animal having a genotype deficient in the DSCAM gene by selecting a chimeric non-human animal in which the gene is disrupted and mating the female and male of the chimeric non-human animal.
(5) The method according to (4), wherein a non-human animal in which the DSCAM gene is homo-deficient is obtained by the mating.
(6) The method according to (4), wherein a non-human animal in which the DSCAM gene is hetero-deficient is obtained by the mating.
(7) A step of administering a candidate substance to the non-human animal according to any one of (1) to (3), a step of measuring at least one data of (1) to (4) above,
(1) Data showing respiratory rhythm of non-human animals (2) Data showing C4 anterior root activity (3) Data showing anterior respiratory neuron activity (4) Data showing neurite outgrowth of dorsal root ganglion neuron culture When any one or more of the following (1) to (4) is significantly improved as compared with the data measured using the non-human animal not administered with the candidate substance, the candidate substance is treated as respiratory center disorder And a method for screening a therapeutic agent for a disease caused by respiratory center disorder, comprising the step of identifying the therapeutic agent for a disease caused by the disease.
(8) The screening method according to (7), wherein the disease is congenital central hypoventilation syndrome.
(9) The screening method according to (7), wherein the disease is accompanied by Hirschspring disease.
(10) A disease caused by respiratory central disorder, including a step of collecting a biological sample from a subject, and a step of detecting a mutation of Down syndrome cell adhesion molecule (DSCAM) gene in the collected biological sample. Inspection method.
(11) A diagnostic kit for a disease caused by respiratory center disorder, comprising a reagent for detecting a mutation in a Down syndrome cell adhesion molecule (DSCAM) gene in a biological sample collected from a subject.
以下、図面を参照して本発明をより詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the drawings.
1.DSCAM遺伝子
本発明においてダウン症細胞接着分子(Down syndrome cell adhesion molecule: DSCAM)遺伝子とは、神経系の発生・分化に深く関与する神経系免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの一つであり、中脳・神経管・後根神経節など早い時期に発生する神経組織で発現している。DSCAM遺伝子は、ヒト、マウス、ラット、等の哺乳動物、ショウジョウバエ、コクヌストモドキ、カイコ等の昆虫、ゼブラフィッシュ等の魚類等において同定されている。DSCAM遺伝子は、上述のように種々の生物において発現していることが確認されており、未確認の生物においても定法に従って単離同定することは容易に可能である。ただし、DSCAM遺伝子は、種々のスプライシングバリアントが知られており、コードしているタンパク質は一種類ではない。
1. DSCAM gene In the present invention, the Down syndrome cell adhesion molecule (DSCAM) gene is a member of the nervous system immunoglobulin superfamily that is deeply involved in the development and differentiation of the nervous system.・ It is expressed in neural tissues that occur early, such as dorsal root ganglia. The DSCAM gene has been identified in mammals such as humans, mice, and rats, insects such as Drosophila, moss, silkworms, fish such as zebrafish, and the like. The DSCAM gene has been confirmed to be expressed in various organisms as described above, and can be easily isolated and identified in an unidentified organism according to a conventional method. However, various splicing variants are known for the DSCAM gene, and the encoded protein is not one kind.
例えば、ヒト由来のDSCAM遺伝子としては、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDSCAM遺伝子を挙げることができる。また、マウス由来のDSCAM遺伝子としては、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。 For example, as a human-derived DSCAM gene, a DSCAM gene encoding a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be mentioned. An example of a mouse-derived DSCAM gene is a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
2.DSCAM遺伝子ノックアウト・非ヒト動物
本発明においては、上記「1」で説明したDSCAM遺伝子を欠損させることで、中枢性呼吸障害を示す非ヒト動物を作製することができる。ここで、非ヒト動物とは、ヒトを除く動物を意味し、例えばヒトを除く哺乳動物(マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ等)、鳥類(例えば、ニワトリ等)、両生類(例えば、カエル等)、爬虫類又は昆虫が挙げられる。
2. DSCAM gene knockout / non-human animal In the present invention, a non-human animal exhibiting central respiratory disorder can be produced by deleting the DSCAM gene described in the above "1". Here, the non-human animal means an animal excluding humans, for example, mammals excluding humans (mouse, rat, rabbit, dog, cat, monkey, sheep, pig, cow, horse, etc.), birds (for example, Chicken, etc.), amphibians (eg, frogs), reptiles or insects.
非ヒト動物を作製する手法は、特に限定されず、従来公知の手法を適宜使用することができる。従来公知の手法としては、例えば「ジーンターゲティングの最新技術」(八木健編集 羊土社)、「ジーンターゲティング」(野田哲生監訳 メディカル・サイエンス・インターナショナル社)又はScience 244:1288-1292, 1989等に開示されている。 A technique for producing a non-human animal is not particularly limited, and a conventionally known technique can be appropriately used. Conventionally known methods include, for example, “the latest technology of gene targeting” (Yoji Ken Yodosha), “gene targeting” (translated by Tetsuo Noda, Medical Science International), Science 244: 1288-1292, 1989, etc. It is disclosed.
例えば、相同組換えによって少なくとも一方の対立遺伝子であるDSCAM遺伝子を破壊した胚幹細胞(以下、ES細胞とも表記する)を、受精卵の胚盤胞に注入してキメラ非ヒト動物を得る。得られたキメラ動物を、相当する野生型非ヒト動物と交配させて、対立遺伝子の一方のみが破壊されたヘテロ接合体非ヒト動物(以下、DSCAM+/-とも表記する)を作出することができる。さらにこれら得られたヘテロ接合体非ヒト動物を交配させて、両方の対立遺伝子が破壊されたホモ接合体非ヒト動物(以下、DSCAM-/-とも表記する)を作出することができる。野生型はDSCAM+/+で表現される。 For example, a chimeric non-human animal is obtained by injecting embryonic stem cells (hereinafter also referred to as ES cells) in which at least one allele DSCAM gene is disrupted by homologous recombination into a blastocyst of a fertilized egg. The resulting chimeric animal can be crossed with the corresponding wild-type non-human animal to produce a heterozygous non-human animal (hereinafter also referred to as DSCAM +/- ) in which only one of the alleles is destroyed. it can. Furthermore, these obtained heterozygous non-human animals can be mated to produce homozygous non-human animals (hereinafter also referred to as DSCAM − / − ) in which both alleles are disrupted. Wild type is expressed in DSCAM + / + .
ES細胞としては、マウスの場合には、E14、CCE、J1又はT2等を用いることができる。ES細胞の相同組換えは、例えばDSCAM遺伝子の発現を妨害し得る任意のDNA配列を挿入した組換えDNAを、ES細胞に導入することにより行うことができる。DSCAM遺伝子の発現を妨害し得る任意のDNA配列は、組換えDNAのES細胞への導入を確認できるような薬剤耐性遺伝子(例えば、ネオマイシン耐性遺伝子(neo))等を用いるのが好ましく、またレポーター遺伝子(β−ガラクトシダーゼ(lacZ))等を用いるのが好ましいが、特に限定されない。 As an ES cell, E14, CCE, J1, or T2 can be used in the case of a mouse. Homologous recombination of ES cells can be performed, for example, by introducing recombinant DNA into which any DNA sequence capable of interfering with the expression of the DSCAM gene is introduced into ES cells. As an arbitrary DNA sequence capable of interfering with the expression of the DSCAM gene, a drug resistance gene (for example, neomycin resistance gene (neo)) that can confirm introduction of recombinant DNA into ES cells is preferably used. A gene (β-galactosidase (lacZ)) or the like is preferably used, but is not particularly limited.
上述のDNA導入法としては、例えば電気穿孔法又はマイクロインジェクション法が挙げられる。ES細胞におけるDSCAM遺伝子の破壊は、常法に従って、例えばPCRとサザンブロットハイブリダイゼーションで確認することができる。 Examples of the DNA introduction method include an electroporation method and a microinjection method. The disruption of the DSCAM gene in ES cells can be confirmed by, for example, PCR and Southern blot hybridization according to a conventional method.
相同組換えによりDSCAM遺伝子を破壊したES細胞を有するキメラ非ヒト動物の作出方法は、例えば胚盤胞マイクロインジェクション法等が挙げられる。胚盤胞インジェクション法は、非ヒト動物の胚盤胞にDSCAM遺伝子を破壊したES細胞をマイクロインジェクションし、処理した胚盤胞を擬妊娠非ヒト動物に移植することにより所望のキメラ非ヒト動物を作出することができる。 Examples of a method for producing a chimeric non-human animal having ES cells in which the DSCAM gene is disrupted by homologous recombination include a blastocyst microinjection method. The blastocyst injection method involves microinjecting a DSCAM gene-disrupted ES cell into a non-human animal blastocyst and transplanting the treated blastocyst into a pseudopregnant non-human animal to obtain a desired chimeric non-human animal. Can be created.
上述のように得られたキメラ非ヒト動物を、相当する野生型非ヒト動物に交配させることで得られるヘテロ接合体非ヒト動物、あるいは該へテロ接合体非ヒト動物を更に交配させることで得られるホモ接合体非ヒト動物は、例えば、尾部から採取したDNAを用いたサザンブロット法によりその遺伝子型を確認することができる。またRNAブロット分析によりDSCAM遺伝子の発現の有無を確認することができる。 A heterozygous non-human animal obtained by mating the chimeric non-human animal obtained as described above with a corresponding wild-type non-human animal, or obtained by further mating the heterozygous non-human animal. The homozygous non-human animal obtained can be confirmed for its genotype by, for example, Southern blotting using DNA collected from the tail. In addition, the presence or absence of expression of the DSCAM gene can be confirmed by RNA blot analysis.
作製されたノックアウト・非ヒト動物は、驚くべくことに中枢性呼吸障害を発症していることが判明し、中枢性呼吸障害モデル動物としての利用が可能となる。特にDSCAM-/-には、正常に出生するが24時間以内にほぼ全個体が呼吸障害によって死亡するといった特徴を有している。また、特にDSCAM+/-には、正常に出生してDSCAM+/+と同様に生育するが僅かに呼吸障害を発症しているといった特徴を有している。上記「1」で説明したように、DSCAM遺伝子が種々の神経組織で発現していることが知られているが、上述したノックアウト・非ヒト動物(DSCAM-/-及びDSCAM+/-)の特徴は全く予測できるものではない。 The produced knockout non-human animal is surprisingly found to develop central respiratory disorder, and can be used as a central respiratory disorder model animal. In particular, DSCAM -/- has the characteristics that it is born normally, but almost all individuals die from respiratory disorder within 24 hours. In particular, DSCAM +/− has the characteristics that it is born normally and grows similarly to DSCAM + / + , but slightly develops respiratory disorder. As described in “1” above, it is known that the DSCAM gene is expressed in various neural tissues, but the characteristics of the above-described knockout non-human animals (DSCAM − / − and DSCAM +/− ). Is not predictable at all.
また、DSCAM-/-においては、延髄及び脊髄のサイズが野生型DSCAM+/+と比較して有意に肥大しているといった特徴を有している。また、先天性中枢性低換気症候群(CCHS)に罹っている患者の50%はヒルシュスプルング病(HSCR)を併発している。HSCRは可変長の腸に沿った腸神経節の欠失によって特徴付けられる先天性の疾患である(Croakerら(1998)“Congenital central hypoventilation syndrome and Hirschsprung’s disease”Arch. Dis. Child 78, 316-322.)。HSCRの病理は、神経堤細胞が移動し損なうことに起因していると考えられる。DSCAM遺伝子は神経堤から誘導される腸の腸筋神経叢で発現されることが知られている(Yamakawaら(1998)“DSCAM: a novel member of the immunoglobulin superfamily maps in a Down syndrome region and is involved in the development of the nervous system”Hum. Mol. Genet. 7, 227-237.)。さらに、HSCRの変更因子領域の一つが第21q22染色体上で報告されている(Puffenbergerら(1994)“Identity-by-descent and association mapping of a recessive gene for Hirschsprung disease on human chromosome 13q22”Hum. Mol. Genet. 3, 1217-1225)。そして、このDSCAM遺伝子は当該論文に報告された領域内に位置する。したがって、DSCAM遺伝子は、HSCRの発症にも関与していることが示唆される。 In addition, DSCAM − / − has a feature that the size of medulla and spinal cord is significantly enlarged compared to wild type DSCAM + / + . Also, 50% of patients with congenital central hypoventilation syndrome (CCHS) have Hirschsprung disease (HSCR). HSCR is a congenital disease characterized by a loss of enteric ganglion along the variable-length intestine (Croaker et al. (1998) “Congenital central hypoventilation syndrome and Hirschsprung's disease” Arch. Dis. Child 78, 316-322. .). The pathology of HSCR is thought to be due to the failure of neural crest cells to migrate. The DSCAM gene is known to be expressed in the intestinal myenteric plexus derived from the neural crest (Yamakawa et al. (1998) “DSCAM: a novel member of the immunoglobulin superfamily maps in a Down syndrome region and is involved in the development of the nervous system ”Hum. Mol. Genet. 7, 227-237.). In addition, one of the change factor regions of HSCR has been reported on chromosome 21q22 (Puffenberger et al. (1994) “Identity-by-descent and association mapping of a recessive gene for Hirschsprung disease on human chromosome 13q22” Hum. Mol. Genet. 3, 1217-1225). This DSCAM gene is located within the region reported in the paper. Therefore, it is suggested that the DSCAM gene is also involved in the development of HSCR.
3.DSCAM遺伝子ノックアウト・非ヒト動物の利用
上記「2」で説明したDSCAM遺伝子ノックアウト・非ヒト動物は、中枢性呼吸障害を発症するといった特徴を利用することで、中枢性呼吸障害モデル動物として利用することができる。具体的には、呼吸中枢障害に起因する疾患に対する治療薬を同定するスクリーニン方法にDSCAM遺伝子ノックアウト・非ヒト動物を利用することができる。
3. Use of DSCAM gene knockout / non-human animal The DSCAM gene knockout / non-human animal described in “2” above should be used as a model animal for central respiratory disorder by utilizing the characteristics of developing central respiratory disorder. Can do. Specifically, a DSCAM gene knockout / non-human animal can be used in a screening method for identifying a therapeutic agent for a disease caused by respiratory central disorder.
具体的には、先ず、DSCAM遺伝子ノックアウト・非ヒト動物に対して候補物質を投与する。ここで候補物質とは、中枢性呼吸障害に対する治療薬の候補となりうる物質を意味する。候補物質は既知物質でも未知物質でもよい。また候補物質としては、タンパク質、ペプチド、核酸分子、疑似核酸分子、低分子化合物、高分子化合物、有機化合物及び無機化合物といった如何なる物質であってもよい。特に、DSCAM-/-においては、出生後24時間で死亡するため、死亡前に投与することとなる。これに対して、DSCAM+/-においては、野生型と同様に生育するため、様々な生育段階で投与することができる。 Specifically, first, a candidate substance is administered to a DSCAM gene knockout / non-human animal. Here, the candidate substance means a substance that can be a candidate for a therapeutic drug for central respiratory disorder. The candidate substance may be a known substance or an unknown substance. The candidate substance may be any substance such as a protein, peptide, nucleic acid molecule, pseudo-nucleic acid molecule, low molecular compound, high molecular compound, organic compound, and inorganic compound. In particular, DSCAM -/- died 24 hours after birth, so it should be administered before death. In contrast, since DSCAM +/- grows in the same manner as the wild type, it can be administered at various stages of growth.
次に、本スクリーニング方法では、候補物質の投与によるDSCAM遺伝子ノックアウト・非ヒト動物における中枢性呼吸障害の改善効果を確認する。例えば、投与後のDSCAM遺伝子ノックアウト・非ヒト動物における呼吸リズムをモニターするか、呼吸中枢の機能をモニターする。より具体的には、下記(1)〜(4)の少なくとも1つのデータを測定する。 Next, in this screening method, the effect of improving a central respiratory disorder in a non-human animal by DSCAM gene knockout by administration of a candidate substance is confirmed. For example, DSCAM gene knockout after administration, respiratory rhythm in non-human animals, or respiratory center function is monitored. More specifically, at least one data of the following (1) to (4) is measured.
(1)DSCAM遺伝子ノックアウト・非ヒト動物の呼吸リズムを示すデータ
(2)C4前根活性を示すデータ
(3)前呼吸性(Pre-I)ニューロン活性を示すデータ
(4)後根神経節ニューロン培養物の神経突起伸長を示すデータ
(1) DSCAM gene knockout / data showing respiratory rhythm of non-human animals (2) data showing C4 anterior root activity (3) data showing prerespiratory (Pre-I) neuron activity (4) dorsal root ganglion neurons Data showing neurite outgrowth in culture
上記(1)に示す呼吸リズムを測定する方法は、特に限定されないが、例えば全身プレチスモグラフィーを用いる方法を挙げることができる(Kuwakiら(1996)“Impaired ventilatory responses to hypoxia and hypercapnea in mutant mice deficient in endothelin-1”Am. J. Physiol. 270, 1279-1286参照)。また、上記(2)に示すC4前根活性を測定する方法は、特に限定されないが、in vitro調製物用の延髄及び脊髄を用い、吸息リズムに対応する呼吸様活性をガラスキャピラリー吸引電極及び時定数0.3秒の高域フィルターを介して測定する方法を挙げることができる(Shirasawaら(2000)“Rnx deficiency results in congenital central hypoventilation”Nat. Genet. 24, 287-290、Suzueら(1984)“Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat”J. Physiol. 354, 173-183及びOnimaruら(1988)“Primary respiratory rhythm generator in the medulla of brainstem-spinal cord preparation from newborn rat”Brain Res. 445, 314-324参照)。上記(3)に示すPre-Iニューロン活性を測定する方法としては、特に限定されないが、電圧感受性色素で染色した脳幹-脊髄調製物を用いた光記録システムを適用して平均膜電位軌道を測定する方法を挙げることができる(Onimaruら(2003)“A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla”J. Neurosci. 23, 1478-1486参照)。また、Pre-Iニューロン活性は、例えば腹側外側延髄の吸息性ニューロンの膜電位を全細胞パッチクランプ法(Onimaruら(1992)“Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats”Pflugers. Arch. 420, 399-406及びArataら(1990)“Respiration-related neurons in the ventral medulla of newborn rats in vitro”Brain Res. Bull. 24, 599-604参照)を用いて測定することができる。上記(4)に示す後根神経節ニューロン培養物の神経突起伸長を測定する方法としては、特に限定されないが、Dscam-Fc又はL1cam-Fcをコートしたシャーレに後根神経節(DRG)をプレーティングし、培養物を撮像することで測定することができる(Kamiguchiら(2001)“The role of endocytic l1 trafficking in polarized adhesion and migration of nerve growth cones”J. Neurosci. 21, 9194-9203)。 The method for measuring the respiratory rhythm shown in the above (1) is not particularly limited, and examples thereof include a method using whole body plethysmography (Kuwaki et al. (1996) “Impaired ventilatory responses to hypoxia and hypercapnea in mutant mice deficient). in endothelin-1 ”Am. J. Physiol. 270, 1279-1286). In addition, the method for measuring the C4 anterior root activity shown in (2) above is not particularly limited, but using a medulla and spinal cord for in vitro preparation, respiratory-like activity corresponding to the inspiration rhythm is exhibited by a glass capillary suction electrode and The measurement can be performed through a high-pass filter with a time constant of 0.3 seconds (Shirasawa et al. (2000) “Rnx deficiency results in congenital central hypoventilation” Nat. Genet. 24, 287-290, Suzue et al. (1984) “ Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat ”J. Physiol.354, 173-183 and Onimaru et al. (1988)“ Primary respiratory rhythm generator in the medulla of brainstem-spinal cord preparation from newborn rat "See Brain Res. 445, 314-324). The method for measuring Pre-I neuron activity shown in (3) above is not particularly limited, but the average membrane potential trajectory is measured by applying an optical recording system using a brainstem-spinal cord preparation stained with a voltage-sensitive dye. (See Onimaru et al. (2003) “A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla” J. Neurosci. 23, 1478-1486). In addition, Pre-I neuron activity can be measured by, for example, measuring the membrane potential of inspiratory neurons in the ventral lateral medulla using the whole cell patch clamp method (Onimaru et al. (1992) “Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations”. Using isolated from newborn rats ”Pflugers. Arch. 420, 399-406 and Arata et al. (1990)“ Respiration-related neurons in the ventral medulla of newborn rats in vitro ”Brain Res. Bull. 24, 599-604). Can be measured. The method for measuring neurite outgrowth of the dorsal root ganglion neuron culture shown in (4) above is not particularly limited, but the dorsal root ganglion (DRG) is played on a petri dish coated with Dscam-Fc or L1cam-Fc. And imaging the culture (Kamiguchi et al. (2001) “The role of endocytic l1 trafficking in polarized adhesion and migration of nerve growth cones” J. Neurosci. 21, 9194-9203).
次に、本スクリーニング方法では、上記(1)〜(4)いずれか1以上のデータが、候補物質未投与の上記非ヒト動物を用いて測定したデータと比較する。比較の結果、候補物質を投与した場合に、いずれかのデータが有意に改善している場合に当該候補物質を呼吸中枢障害に起因する疾患の治療薬として同定する。 Next, in the present screening method, any one or more of the data (1) to (4) is compared with data measured using the non-human animal not administered with the candidate substance. As a result of comparison, when a candidate substance is administered, if any of the data is significantly improved, the candidate substance is identified as a therapeutic agent for a disease caused by respiratory center disorder.
4.DSCAM遺伝子の利用
以上で説明してきたように、DSCAM遺伝子の欠損によって中枢性呼吸障害を発症することが実証された。この知見に基づけば、DSCAM遺伝子が中枢性呼吸障害の発症メカニズムに深く関与していることとなる。したがって、中枢性呼吸障害が疑われる患者におけるDSCAM遺伝子を検査することによって、中枢性呼吸障害の診断を支援することができる。すなわち、上述してきた知見に基づいて、被検者から採取した生体サンプルにおける、DSCAM遺伝子の変異を検出する工程を含む呼吸中枢障害の検査方法及びDSCAM遺伝子の変異を検出する試薬を含む呼吸中枢障害診断キットを提供することができる。
4). Utilization of the DSCAM gene As described above, it has been demonstrated that a deficiency in the DSCAM gene causes central respiratory disorder. Based on this finding, the DSCAM gene is deeply involved in the mechanism of central respiratory disorder. Therefore, the diagnosis of central respiratory disorder can be supported by examining the DSCAM gene in patients suspected of having central respiratory disorder. That is, based on the knowledge described above, in a biological sample collected from a subject, a respiratory center disorder including a method for detecting a respiratory center disorder including a step of detecting a DSCAM gene mutation and a reagent for detecting a DSCAM gene mutation A diagnostic kit can be provided.
ここで、DSCAM遺伝子の変異とは、DSCAM遺伝子の欠失及びミスセンス変異といった変異のみならず、DSCAM遺伝子の発現量の変化も意味する。すなわち、DSCAM遺伝子の発現を制御するプロモーター領域や、DSCAM遺伝子の転写制御因子における変異も、DSCAM遺伝子の変異として定義する。このような意味でDSCAM遺伝子の変異を検出することによって、被験者における中枢性呼吸障害を診断することが可能となる。 Here, the DSCAM gene mutation means not only a mutation such as a DSCAM gene deletion and a missense mutation, but also a change in the expression level of the DSCAM gene. That is, a mutation in the promoter region that controls the expression of the DSCAM gene and a transcriptional control factor of the DSCAM gene is also defined as a mutation in the DSCAM gene. By detecting a mutation in the DSCAM gene in this sense, it becomes possible to diagnose central respiratory disorder in a subject.
また、DSCAM遺伝子の変異を検出する試薬としては、配列番号1に示すヒト由来のDSCAM遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブや、DSCAM遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットを挙げることができる。DSCAM遺伝子がコードするDSCAMタンパク質に対する抗体をDSCAM遺伝子の変異を検出する試薬として使用することもできる。これらのプローブ、プライマーセット及び抗体は、DSCAM遺伝子の欠失や、その発現量の変化を検出する際に使用することができる。 Examples of the reagent for detecting a mutation in the DSCAM gene include a probe that specifically hybridizes to the human-derived DSCAM gene shown in SEQ ID NO: 1 and a primer set that specifically amplifies the DSCAM gene. An antibody against the DSCAM protein encoded by the DSCAM gene can also be used as a reagent for detecting a mutation in the DSCAM gene. These probes, primer sets and antibodies can be used for detecting deletion of the DSCAM gene and changes in its expression level.
一方、DSCAM遺伝子におけるミスセンス変異は、当該変異を有する変異DSCAM遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブや、当該変異DSCAM遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット、変異DSCAM遺伝子がコードする変異DSCAMタンパク質に対する特異的抗体を使用して検出することができる。 On the other hand, a missense mutation in the DSCAM gene is specific to a probe that specifically hybridizes to the mutant DSCAM gene having the mutation, a primer set that specifically amplifies the mutant DSCAM gene, and a mutant DSCAM protein encoded by the mutant DSCAM gene. Can be detected using specific antibodies.
さらに一例として、DSCAM遺伝子の変異は、DHPLC(denaturing HPLC)法と組み合わせたヘテロデュプレックス法を行うための装置(WAVETM DNA Fragment Analysis System (Transgenomic, Inc., San Jose, CA)利用することができる。当該装置には、オートサンプラー、高分離能のマイクロペリキュラーマトリックスを充填したキャピラリーカラム、分離条件の予測・入力および分離結果の出力のためのソフトウェア、ならびにディスプレイが含まれる。 Furthermore, as an example, mutation of the DSCAM gene can be used for a heteroduplex method combined with a DHPLC (denaturing HPLC) method (WAVE ™ DNA Fragment Analysis System (Transgenomic, Inc., San Jose, CA)). The instrument includes an autosampler, a capillary column packed with a high-resolution micro-pericular matrix, software for predicting and inputting separation conditions and outputting separation results, and a display.
本手法では、DSCAM遺伝子における33個のエキソンのうち少なくとも1以上のエキソンについて、当該エキソンを特異的に増幅する一対のプライマーを設計する。このとき、一対のプライマーとしては、33個のエキソンすべてについて設計してもよいし、一部のエキソンについてのみ設計してもよい。特に、中枢性呼吸障害を発症する患者において、DSCAM遺伝子の特定の領域に変異を有することが明らかになっていれば、当該変異を含むエキソンについてプライマーを設計すればよい。 In this method, for at least one exon out of 33 exons in the DSCAM gene, a pair of primers that specifically amplify the exon is designed. At this time, as a pair of primers, all 33 exons may be designed, or only a part of exons may be designed. In particular, in a patient who develops a central respiratory disorder, if it is clear that a specific region of the DSCAM gene has a mutation, a primer may be designed for an exon containing the mutation.
本手法では、このように設計した一対のプライマーを使用してDSCAM遺伝子におけるエキソンを増幅し、増幅したDNA断片を含む溶液を熱処理することによってヘテロ二本鎖を形成する。その後、ヘテロ二本鎖を含む溶液をクロマトグラディーの原理で溶出することによって、変異を含まない野生型ホモ二本鎖の溶出ピークと比較して、異なる位置に出現する溶出ピークをヘテロ二本鎖として同定する。本手法によれば、患者由来のゲノムDNAを用いてDSCAM遺伝子の特定のエキソンにおける変異の有無を検出することができる。そして、当該変異の有無を検出することによって、患者に対する中枢性呼吸障害の診断を支援するための有用な情報を取得することができる。 In this method, a pair of primers designed in this manner is used to amplify an exon in the DSCAM gene, and a solution containing the amplified DNA fragment is heat-treated to form a heteroduplex. Then, by eluting the solution containing the heteroduplex on the principle of chromatogradation, the elution peak appearing at a different position is compared with the elution peak of the wild-type homoduplex containing no mutation. Identify as According to this method, it is possible to detect the presence or absence of a mutation in a specific exon of the DSCAM gene using patient-derived genomic DNA. Then, by detecting the presence or absence of the mutation, useful information for supporting diagnosis of central respiratory disorder for the patient can be acquired.
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定して解釈されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, the technical scope of this invention is limited to these Examples and is not interpreted.
〔実施例1〕Dscam遺伝子ノックアウトマウスの作製
本実施例では、図1aに示すように、Dscam遺伝子の第1エキソン(図1aにおける黒塗り四角で示す。)を欠失させたDscam遺伝子ノックアウトマウスを作製した。第1エキソンを変換するゲノムクローンを得るべく、プローブでマウスPACライブラリー(RPCI-21:マウス129s6/SvEvTAC;Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA, USA)をスクリーニングしており、2種類の独立のクローン(639K11及び671I13)を同定した。第1エキソンを含む30kb付近の領域のゲノム構造は、この2種類のクローンにおいて数種の制限酵素とプローブとを用いたサザンブロット分析によって確認した。
[Example 1] Preparation of Dscam gene knockout mouse In this example, as shown in Fig. 1a, a Dscam gene knockout mouse from which the first exon of the Dscam gene (indicated by a black square in Fig. 1a) is deleted. Produced. The mouse PAC library (RPCI-21: mouse 129s6 / SvEvTAC; Children's Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA, USA) is screened with probes to obtain genomic clones that transform the first exon, and two independent types Clones (639K11 and 671I13) were identified. The genomic structure of the region around 30 kb containing the first exon was confirmed by Southern blot analysis using several restriction enzymes and probes in these two clones.
Cre-loxP系を用いたターゲティング構築物は以下のように調製した。先ず、639K11クローンの2.8kb EcoRI-SpeI断片をプラスミドベクターpBluescript II SK(-)(Stratagene Inc., La Jolla, CA, USA)のEcoRI-SpeI部位にサブクローニングした。続いて、EcoRI及びSpeI消化によって切除された平滑末端化2.8kb EcoRI-SpeI断片をターゲティング構築物の平滑末端化SalI部位にクローニングし、構築物の3’アームを作製した。5’アームは639K11クローンの8.8kb平滑末端化BamHI-EcoRI断片を平滑末端化HbaI部位に挿入し、その後loxP断片をMluI部位に挿入することによって作製し、こうしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neo)を有するターゲティング構築物を作製した。 A targeting construct using the Cre-loxP system was prepared as follows. First, the 2.8 kb EcoRI-SpeI fragment of the 639K11 clone was subcloned into the EcoRI-SpeI site of the plasmid vector pBluescript II SK (-) (Stratagene Inc., La Jolla, CA, USA). Subsequently, the blunt-ended 2.8 kb EcoRI-SpeI fragment excised by EcoRI and SpeI digestion was cloned into the blunt-ended SalI site of the targeting construct to create the 3 'arm of the construct. The 5 'arm was created by inserting the 8.8 kb blunt-ended BamHI-EcoRI fragment of the 639K11 clone into the blunt-ended HbaI site followed by the loxP fragment into the MluI site, thus targeting with neomycin phosphotransferase (neo) A construct was made.
なお、図1aにおいて、AcはAccIであり、BはBamHIであり、EIはEcoRIであり、EVはEcoRVであり、HcはHincIIであり、HdはHindIIIであり、MはMluIであり、SpはSpeIである。 In FIG. 1a, Ac is AccI, B is BamHI, EI is EcoRI, EV is EcoRV, Hc is HincII, Hd is HindIII, M is MluI, and Sp is SpeI.
次に、NotIでターゲティング構築物を線状化し、Gene-Pulser(BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA)を用いて、3μF及び800Vで約7x107個のE14ES細胞にエレクトロポレートした。トランスフェクト細胞を、10cmシャーレ中で、ネオマイシン耐性、マイトマイシン処理済マウス胚繊維芽細胞(MEF)にプレーティングした。プレーティングから1日後に、ゲネチシンの存在下で(G418;125μg/ml)ポジティブ選択を行った。耐性クローンを9日目に選択し、その後予めMEFが蒔かれた24ウェル平板で増殖させた。個々のクローンに由来するEcoRV消化ゲノムDNAを、ターゲティング構築物のすぐ上流のゲノム配列に由来する356bpプローブ(図1aにおいてP2として示す)を用いたサザンブロットによって分析した(図1b)。プローブはPCRによって作製した。ポジティブクローンをさらに、SpeI消化ゲノムDNAを5末端プローブ(図1aにおいてP1として示す。385bpPCR増幅断片)にハイブリダイズさせることによって確認した。 The targeting construct was then linearized with NotI and electroporated into approximately 7 × 10 7 E14ES cells at 3 μF and 800 V using Gene-Pulser (BioRad Laboratories, Hercules, Calif., USA). Transfected cells were plated into neomycin-resistant, mitomycin-treated mouse embryonic fibroblasts (MEF) in a 10 cm dish. One day after plating, positive selection was performed in the presence of geneticin (G418; 125 μg / ml). Resistant clones were selected on day 9 and then grown in 24-well plates pre-plated with MEF. EcoRV digested genomic DNA from individual clones was analyzed by Southern blot using a 356 bp probe (shown as P2 in FIG. 1a) derived from the genomic sequence immediately upstream of the targeting construct (FIG. 1b). The probe was prepared by PCR. Positive clones were further confirmed by hybridizing SpeI digested genomic DNA to a 5-terminal probe (shown as P1 in FIG. 1a. 385 bp PCR amplified fragment).
2種類の各標的クローン(A38及びA151)に由来する約15個のES細胞をC57BL/6胚盤胞に注射した。注射した平均15個の胚盤胞を偽妊娠メス受容ICRマウスに転移した。いずれのESクローンも50%以上がアグーチの毛色のマウスをわずかに生じた。二種類(各クローンにつき1個体)のオスキメラをC57BL/6メスと交配させて、アグーチの毛色マーカーによる生殖細胞伝達の検出を可能にした。サザンブロット分析により測定したところ、アグーチの子孫の52%(17/33)は挿入について陽性であった。ヘテロ接合型flox-neoメスマウスをCAG-creオスと交配させてヘテロ接合型ノックアウトマウスを作製した。 Approximately 15 ES cells from each of the two target clones (A38 and A151) were injected into C57BL / 6 blastocysts. An average of 15 injected blastocysts were transferred to pseudopregnant female recipient ICR mice. All ES clones produced a slight agouti-colored mouse in more than 50%. Two types (one for each clone) of male chimeras were mated with C57BL / 6 females to enable detection of germline transmission using Agouti's coat color marker. As measured by Southern blot analysis, 52% (17/33) of agouti offspring were positive for insertion. Heterozygous flox-neo female mice were crossed with CAG-cre males to produce heterozygous knockout mice.
実験手順及び動物の飼育条件は、RIKEN Institute’s Animal Experiments Committeeに認可され、かつ全ての動物は動物実験用の制度指針に従って世話がなされ人道的に扱われた。 Experimental procedures and animal rearing conditions were approved by the RIKEN Institute's Animal Experiments Committee, and all animals were cared for and treated humanely according to institutional guidelines for animal experiments.
得られたヘテロ接合型ノックアウトマウス(Dscam+/−マウス)は稔性であり、ほぼ正常に発育した。また、ヘテロ接合体間の交配によりホモ接合体を産出したところ、出生直後の全ての出生仔の遺伝子型はメンデルの分離比に合致し(野生型、220/835、26.3%;Dscam+/−、420/835、50.3%;Dscam−/−、195/835、23.4%)、これはDscam−/−マウスが胚性致死でないことを示した。しかし、ほとんどのDscam−/−マウスは出生後24時間以内に死亡し、48時間以上生存したマウスは稀であった。 The resulting heterozygous knockout mice (Dscam +/− mice) were fertile and developed almost normally. In addition, when homozygotes were produced by crossing between heterozygotes, the genotypes of all offspring immediately after birth matched the Mendelian segregation ratio (wild type, 220/835, 26.3%; Dscam +/− 420/835, 50.3%; Dscam − / − , 195/835, 23.4%), indicating that the Dscam − / − mice were not embryonic lethal. However, most Dscam − / − mice died within 24 hours after birth and rarely survived for more than 48 hours.
〔実施例2〕Dscam遺伝子ノックアウトマウスの分析
ノーザンブロット分析
得られたノックアウトマウスにおけるDSCAM遺伝子の発現を確認するためにノーザンブロット分析を行った。脳組織はP0マウスから切り取った。トータルRNAをTrizol試薬(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA)を用いて抽出し、mRNAをμMACS mRNA Isolation Kit(Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany)により単離した。3μgのポリ(A)RNAを1%アガロースホルムアルデヒドゲルの各レーンに充填し、サイズにより分離したRNAをナイロンメンブレン(Biodyne;Pall Bio Support, East Hills, NY, USA)に転写した。ハイブリダイゼーションのために、DNAプローブを[α-32P]dCTPで標識し、ExpressHybハイブリダイゼーション溶液(Clontech, Palo Alto、CA, USA)中で製品に推奨されるように一晩ハイブリダイズさせた。最後にブロットを0.1xSSC/0.1% SDS中、55℃で洗浄し、-80℃でX線フィルムに曝露した。
[Example 2] Analysis of Dscam gene knockout mice
Northern blot analysis Northern blot analysis was performed to confirm the expression of the DSCAM gene in the resulting knockout mice. Brain tissue was cut from P0 mice. Total RNA was extracted using Trizol reagent (Invitrogen Corp., Carlsbad, Calif., USA), and mRNA was isolated using μMACS mRNA Isolation Kit (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany). 3 μg of poly (A) RNA was filled in each lane of a 1% agarose formaldehyde gel, and RNA separated according to size was transferred to a nylon membrane (Biodyne; Pall Bio Support, East Hills, NY, USA). For hybridization, DNA probes were labeled with [α- 32 P] dCTP and hybridized overnight in ExpressHyb hybridization solution (Clontech, Palo Alto, CA, USA) as recommended for the product. Finally, the blot was washed in 0.1 × SSC / 0.1% SDS at 55 ° C. and exposed to X-ray film at −80 ° C.
結果を図1cに示す。なお、図1cにおいて、Ex.1はエキソン1部分(1-496bp)を意味し、ECは細胞外部分(2299-2626bp)を意味し、TMは膜内外部分(5210-5410bp)を意味し、CPは細胞部分(5385-5637bp)を意味する。また、本例では、野生型(図1cにおいて+/+と表記)、Dscam+/-(図1cにおいて+/-と表記)及びDscam-/-マウス(図1cにおいて-/-と表記)について分析を行った。
The results are shown in FIG. In FIG. 1c, Ex.1 means
図1cに示したように、ノーザンブロット分析により、Dscam−/−出生仔の脳ではDscam転写産物が全く確認されず、Dscam+/−出生仔の脳ではDscam遺伝子の発現量が減少していることが確認された。 As shown in FIG. 1c, Northern blot analysis revealed no Dscam transcripts in Dscam − / − offspring brains and decreased Dscam gene expression in Dscam +/− offspring brains. It was confirmed.
RNA in situハイブリダイゼーション
参考のため、野生型マウス(Dscam+/+マウス)の出生直後(すなわちDscam−/−マウスの急死時)におけるDscam mRNAの発現をRNA in situハイブリダイゼーションによって確認した。RNA in situハイブリダイゼーションは、ジゴキシゲニンで標識したcRNAプローブを用い、低温切片で実施した。先ず、切片を0.1M PB(リン酸緩衝液)で洗浄し、4% PFAを用いて30分間で固定した。次に切片を0.1M PBで洗浄し、その後、0.1M PB中で5分間0.3% Triton X-100で透過処理した。これらを0.1M PBで5分間洗浄し、その後、1xSSC中0.1N HClで10分間洗浄した。次いで、それらを0.1M トリエタノールアミン中で10分間、0.25%無水酢酸でアセチル化し、0.1M PBで洗浄した。次いで、切片をハイブリダイゼーションバッファー中、55℃、cRNAプローブ不在下で16時間プレハイブリダイゼーションし、10μg/mlのcRNAプローブを含むハイブリダイゼーションバッファー(50%ホルムアミド、5xSSC、0.1% N-ラウロイルザルコシン、0.02%遮断剤)を用いて、55℃で一晩ハイブリダイズさせた。切片を50%ホルムアミドを含む2xSSC中55℃で3回、それぞれにつき1時間洗浄した。ハイブリダイゼーションをアルカリホスファターゼと結合した抗DIG Fab(Roche Diagnostics)を用いて、NBT/BCIP(Roche Diagnostics)を用いて検出した。
For reference to RNA in situ hybridization, expression of Dscam mRNA was confirmed by RNA in situ hybridization immediately after birth of a wild type mouse (Dscam + / + mouse) (ie, when Dscam − / − mouse suddenly died). RNA in situ hybridization was performed on cryosections using a cRNA probe labeled with digoxigenin. First, the sections were washed with 0.1 M PB (phosphate buffer) and fixed with 4% PFA for 30 minutes. The sections were then washed with 0.1M PB and then permeabilized with 0.3% Triton X-100 in 0.1M PB for 5 minutes. These were washed with 0.1M PB for 5 minutes, followed by 10 minutes with 0.1N HCl in 1 × SSC. They were then acetylated with 0.25% acetic anhydride in 0.1M triethanolamine for 10 minutes and washed with 0.1M PB. The sections were then prehybridized in hybridization buffer at 55 ° C. in the absence of cRNA probe for 16 hours and hybridized with 10 μg / ml cRNA probe (50% formamide, 5 × SSC, 0.1% N-lauroylsarcosine, 0.02% blocking agent) and hybridized overnight at 55 ° C. Sections were washed 3 times at 55 ° C. in 2 × SSC containing 50% formamide for 1 hour each. Hybridization was detected using NBT / BCIP (Roche Diagnostics) using anti-DIG Fab (Roche Diagnostics) conjugated with alkaline phosphatase.
結果を図2a〜dに示した。図2aはDscam抗センスプローブとハイブリダイズしたP0マウス脳の矢状断切片の写真である。図2bは図2aにおいて実線で囲った領域(延髄に相当)を拡大して示す写真である。図2cは、図2b中、実線の位置を切断レベルとする冠状切片の写真である。図2dは延髄における呼吸ニューロン分布の模式図である。図2c及び図2dにおいて実線で囲った領域は呼吸中枢の位置を示している。図2dにおいて白丸又は黒丸は、それぞれ前吸息性(Pre-I)又は吸息性(I)ニューロンの記録部位を示している。 The results are shown in FIGS. FIG. 2a is a photograph of a sagittal section of a P0 mouse brain hybridized with a Dscam antisense probe. FIG. 2b is an enlarged photograph of the region (corresponding to the medulla oblongata) surrounded by the solid line in FIG. 2a. FIG. 2c is a photograph of a coronal section having a solid line position in FIG. 2b as a cutting level. FIG. 2d is a schematic diagram of respiratory neuron distribution in the medulla oblongata. In FIG. 2c and FIG. 2d, the area surrounded by a solid line indicates the position of the respiratory center. In FIG. 2d, white circles or black circles indicate the recording sites of pre-inspiratory (Pre-I) or inspiratory (I) neurons, respectively.
図2aに示すように、Dscam mRNAは、大脳皮質、海馬、視床、脳橋、嗅球で広範に発現し、そして延髄の呼吸中枢で優性的に発現していた。図2b中の矢印で示すように、Dscamは腹側延髄の呼吸リズム形成ニューロンで発現していた。図2c及びdに示すようにDscam mRNAはPre-I及びIニューロンが活性化する部位で発現していた。 As shown in FIG. 2a, Dscam mRNA was widely expressed in the cerebral cortex, hippocampus, thalamus, pons, olfactory bulb, and was predominantly expressed in the respiratory center of the medulla oblongata. As indicated by the arrow in FIG. 2b, Dscam was expressed in respiratory rhythm-forming neurons in the ventral medulla. As shown in FIGS. 2c and 2d, Dscam mRNA was expressed at sites where Pre-I and I neurons were activated.
脳の形態学的分析及び免疫組織化学
得られたノックアウトマウスにおける組織学的異常を評価すべく、P0 Dscam−/−マウス及びその野生型同腹仔から単離した脳の形態を調査した。麻酔したDscam−/−マウス又は野生型マウスに0.1M PB中4%パラホルムアルデヒドを経心臓的に灌流させた。20μmの低温切片を0.9%トルイジンブルーで染色(ニッスル染色)した。また、34種類のマーカー(SMI311、SMI52、SMI35、NF150、NFL、NF-MH、2H3、3A10、CD57、5HT、ネスチン、RAT401、OLIG2、NeuN、v-glut2、NK1R、GLAST、Brn3a、ペリフェリン、CR50、GAD65、グルタメート、GABA、カルレチニン、AChE、ChAT、Pax2、Pax6、GluR2、Phox2b、TH、μ-オピオイドR1、ソマトスタチン及びspot)を用いて実施した。免疫組織化学分析においては、抗体をPBS/0.01% Triton X-100及び5%ウシ血清アルブミンで希釈した。
Brain Morphological Analysis and Immunohistochemistry To evaluate histological abnormalities in the resulting knockout mice, brain morphology isolated from P0 Dscam − / − mice and their wild-type littermates was investigated. Anesthetized Dscam − / − mice or wild type mice were transcardially perfused with 4% paraformaldehyde in 0.1M PB. 20 μm cryosections were stained with 0.9% toluidine blue (Nissl staining). In addition, 34 types of markers (SMI311, SMI52, SMI35, NF150, NFL, NF-MH, 2H3, 3A10, CD57, 5HT, Nestin, RAT401, OLIG2, NeuN, v-glut2, NK1R, GLAST, Brn3a, Peripherin, CR50 , GAD65, glutamate, GABA, calretinin, AChE, ChAT, Pax2, Pax6, GluR2, Phox2b, TH, μ-opioid R1, somatostatin and spot). For immunohistochemical analysis, antibodies were diluted with PBS / 0.01% Triton X-100 and 5% bovine serum albumin.
図3aには、出生後0日目のDscam-/-及び野生型マウスの脳の腹側図を示す。Dscam-/-マウスの延髄及び脊髄は野生型マウスのものよりも大きいことが分かる。図3bには大脳(図3aにおいて*を付した実線)を及び延髄(図3aにおいて**を付した実線)の幅を測定した結果を示す。測定の結果はt検定で比較した。図3bにおいてエラーバーはSEMを示す。図3bに示すように、大脳及び延髄の幅は、野生型(n=7)でそれぞれ6.05±0.07mm及び3.11±0.04であった。これに対して、Dscam−/−マウス(n=7)でそれぞれ6.20±0.07及び3.35±0.03mmであった。大脳についてはp=0.188、延髄についてはp=0.0004であった。Dscam−/−マウスの延髄及び脊髄は野生型同腹仔のものよりも7.8%大きかった。
FIG. 3a shows a ventral view of the brains of Dscam − / − and wild type mice on
図3c〜jは、延髄(図3c、d、g及びh)及び脊髄(図3e、f、i及びj)の冠状切片をニッスル染色した結果を示している。Dscam−/−マウスの延髄(図3d及びh)は、野生型マウスのもの(図3c及びg)より、背腹軸(図3c及びd)及び内外軸(図3g及びh)のいずれにおいてもサイズが大きいことがわかる。また、Dscam−/−マウスの脊髄(図3f及びj)は、野生型マウスのもの(図3e及びi)より、背腹軸(図3e及びf)及び内外軸(図3i及び,j)のいずれにおいてもサイズが大きいことがわかる。これらの結果は、Dscam−/−マウスのこれらの組織で明らかな構造的欠損は見られず、延髄及び脊髄の細胞の大きさはDscam−/−と野生型とで類似しているが、細胞数がDscam−/−で増加したことを示唆している。 Figures 3c-j show the results of Nissl staining of coronal sections of medulla oblongata (Figures 3c, d, g and h) and spinal cord (Figures 3e, f, i and j). The medulla of Dscam − / − mice (FIGS. 3d and h) are both on the dorsoventral axis (FIGS. 3c and d) and the inner and outer axes (FIGS. 3g and h) than those of wild-type mice (FIGS. 3c and g) You can see that the size is large. In addition, the spinal cords of the Dscam − / − mice (FIGS. 3f and j) are those of the dorsal abdominal axis (FIGS. 3e and f) and the internal and external axes (FIGS. 3i and j) of the wild type mouse (FIGs. 3e and i). It can be seen that the size is large in both cases. These results show that there are no obvious structural defects in these tissues of Dscam − / − mice, and medullary and spinal cord cell sizes are similar between Dscam − / − and wild type cells, This suggests that the number increased with Dscam − / − .
呼吸分析
実施例1で作製したDscam-/-マウスの外見は、出生直後は正常に見え、その体重は統計的に野生型及びDscam+/-同腹仔の体重と異ならなかった(データは示されない)。しかし、Dscam-/-出生仔が発作又は呼吸様動作の困難さを示すのを観察した。また、胃にミルクを有するDscam-/-出生仔はほとんどおらず、これはほとんどのDscam-/-出生仔が授乳していないことを示している。Dscam-/-出生仔におけるこれらの表現型及び延髄呼吸中枢においてDscam mRNAが優性的に発現していることから、全身プレチスモグラフィーを用いてDscam−/−及びDscam+/−出生仔並びに野生型同腹仔における自発呼吸活性を調査した。
Respiratory analysis The appearance of Dscam − / − mice produced in Example 1 appeared normal immediately after birth and their body weight was not statistically different from that of wild type and Dscam +/− littermates (data not shown) ). However, we observed that Dscam − / − offspring showed difficulty in seizures or breath-like movements. Also, there are few Dscam − / − offsprings with milk in the stomach, indicating that most Dscam − / − offspring are not breastfeeding. These phenotypes in Dscam − / − offspring and Dscam mRNA are predominantly expressed in the medullary respiratory center, so Dscam − / − and Dscam +/− offspring and wild type using whole body plethysmography Spontaneous respiratory activity in litters was investigated.
詳細には、全身プレチスモグラフィーを一日齢未満のP0マウスで実施した(上掲Kuwakiら(1996)参照)。呼吸頻度、一回呼吸量、及び分時拍出量を、安静呼吸の間に50〜70回の呼吸サイクルから算出した。結果を図4aに示した。図4aに示すように、Dscam−/−出生仔の呼吸リズムは不規則かつ頻繁な無呼吸を示し、他方、野生型同腹仔の呼吸リズムは規則正しく一定であり、Dscam+/−もわずかな異常を示すことが明かとなった。 Specifically, whole body plethysmography was performed on P0 mice under the age of one day (see Kuwaki et al. (1996) above). Respiration frequency, tidal volume, and minute volume were calculated from 50 to 70 breath cycles during rest breathing. The result is shown in FIG. 4a. As shown in FIG. 4a, Dscam − / − birth pups have irregular and frequent apnea, whereas wild littermates have regular and constant respiratory rhythms, and Dscam +/− is also slightly abnormal. It became clear to show.
また、in vitro調製物用の延髄および脊髄を、既に記載されるように十分にエーテル麻酔が施されたP0マウスから単離した(上掲Shirasawaら(2000)、Suzueら(1984)及びOnimaruら(1988)参照)。吸息リズムに対応する呼吸様活性を、ガラスキャピラリー吸引電極及び時定数0.3秒の高域フィルターを介してC4/C5前根でモニターした。値は平均±SDとして示される。3種全ての遺伝子型について、統計的有意性を分散分析(分散分析)によって決定した。グループ間での有意な差異は事後的ボンフェローニ検定を用いて同定した。腹側外側延髄の吸息性ニューロンの膜電位(上掲Arataら(1990))を従来の全細胞パッチクランプ法(上掲Onimaruら(1992))を用いて記録した。膜電位を、連続抵抗(25〜50mol/LΩ)及び静電容量の補償後に、単電極膜電位固定用増幅器(CEZ-3100, Nihon Kohden, Tokyo, Japan)で記録した。結果を図4bに示した。図4bに示すように、Dscam-/-マウスにおいては、無呼吸を示す低振幅のC4活性が観察された(図4bにおける矢印)。図4bに示す結果から、Dscam-/-マウスの呼吸パターンの異常(図4a)が腹側延髄に位置する呼吸リズム形成中枢に起因していることが示された。 The medulla and spinal cord for in vitro preparations were also isolated from P0 mice that had been fully ether anesthetized as previously described (Shirasawa et al. (2000), Suzue et al. (1984) and Onimaru et al., Supra). (See 1988). Respiratory-like activity corresponding to the inspiration rhythm was monitored at the C4 / C5 anterior root via a glass capillary suction electrode and a high-pass filter with a time constant of 0.3 seconds. Values are shown as mean ± SD. Statistical significance was determined by analysis of variance (ANOVA) for all three genotypes. Significant differences between groups were identified using a post hoc Bonferroni test. Membrane potentials of inspiratory neurons in the ventral lateral medulla (above Arata et al. (1990)) were recorded using a conventional whole cell patch clamp method (above Onimaru et al. (1992)). The membrane potential was recorded with a single electrode membrane potential fixing amplifier (CEZ-3100, Nihon Kohden, Tokyo, Japan) after compensation of continuous resistance (25-50 mol / LΩ) and capacitance. The result is shown in FIG. 4b. As shown in FIG. 4b, low amplitude C4 activity indicating apnea was observed in Dscam − / − mice (arrow in FIG. 4b). From the results shown in FIG. 4b, it was shown that the abnormal breathing pattern of Dscam − / − mice (FIG. 4a) was caused by the respiratory rhythm formation center located in the ventral medulla.
光記録法
腹側延髄の呼吸性ニューロン活性の空間-時間パターンを可視化するために、電圧感受性色素で染色した脳幹-脊髄調製物を用いた光記録システムを適用した(上掲Onimaruら(2003))。先ず、延髄-脊髄調製物を、電圧感受性蛍光色素、Di-2-ANEPEQ(33μg/ml, Molecular Probe, Eugene, OR)を含む改変したクレブス溶液中、95%O2及び5%CO2の割合で、室温で30分間インキュベートした。染色後、この調製物を、蛍光顕微鏡(THT-75顕微鏡セットアップ, Scimedia Ltd., Tokyo, Japan)が取り付けられた2-mL灌流チェンバー中で腹側表面にして置いた。ニューロン活性を、電圧感受性色素を用いて光学式記録装置(MiCAM02;Brain Vision Inc., Saitama, Japan)により、510-550nm励起フィルター、ダイクロイックミラー、及び光源とするタングステン-ハロゲンランプ(150W)を備えた590nm吸収フィルターを介して検出した。CCDベースカメラは192x128ピクセル(33.3x37.5μm/ピクセル)から構成される。光学像は20ミリ秒毎に得た。吸息活性の取得時間はC4吸息群発の開始前3.84秒及び開始後1.28秒からなる5.12秒であった。取得した像は50回の呼吸サイクルの平均であった。各タイプのニューロンの光学活性を、78ピクセルを含む平均ΔF/F値として測定した。蛍光の変化は比率(%、部分的変化)(すなわち参照像の蛍光強度に対する蛍光強度)として表現した。2x2ピクセルのソフトウェア-空間フィルターで処理された差異的な像は、赤が蛍光の減少(これは膜脱分極を示している)に対応する擬色ディスプレイによって表した。BV_分析(BrainVision Inc., Saitama, Japan)をデータの取得及び分析に用いた。
Optical recording method To visualize the spatio-temporal pattern of respiratory neuronal activity in ventral medulla, we applied an optical recording system using a brainstem-spinal cord preparation stained with a voltage-sensitive dye (Onimaru et al. (2003), supra). ). First, the medulla-spinal cord preparation is prepared in a modified Krebs solution containing a voltage-sensitive fluorescent dye, Di-2-ANEPEQ (33 μg / ml, Molecular Probe, Eugene, OR) at a ratio of 95% O 2 and 5% CO 2 . And incubated at room temperature for 30 minutes. After staining, the preparation was placed on the ventral surface in a 2-mL perfusion chamber fitted with a fluorescence microscope (THT-75 microscope setup, Scimedia Ltd., Tokyo, Japan). Neuron activity is recorded with a 510-550nm excitation filter, dichroic mirror, and a tungsten-halogen lamp (150W) using an optical recording device (MiCAM02; Brain Vision Inc., Saitama, Japan) using a voltage-sensitive dye. Detection was through a 590 nm absorption filter. The CCD base camera consists of 192x128 pixels (33.3x37.5μm / pixel). Optical images were obtained every 20 milliseconds. The acquisition time of inspiratory activity was 5.12 seconds, consisting of 3.84 seconds before the start of C4 inhalation group and 1.28 seconds after the start. The acquired image was an average of 50 respiratory cycles. The optical activity of each type of neuron was measured as the mean ΔF / F value including 78 pixels. The change in fluorescence was expressed as a ratio (%, partial change) (ie, fluorescence intensity relative to the fluorescence intensity of the reference image). The differential image processed with the 2x2 pixel software-spatial filter was represented by a pseudo-color display where red corresponds to a decrease in fluorescence (which indicates membrane depolarization). BV_analysis (BrainVision Inc., Saitama, Japan) was used for data acquisition and analysis.
結果を図5a〜fに示す。-1500ms(図5a及びb)または0ms(図5c及びd)におけるC4吸息群発からのΔF/F擬色像を延髄の腹側表面に重ねた。光学像の結果は、C4吸息活性によって誘発された50回の呼吸サイクルの平均である。図5中、赤丸はPre-I(前吸息性)ニューロン活性の最も顕著な領域を示し、青丸はI(吸息性)ニューロン活性の最も顕著な領域を示している。図5e及びfには、赤丸及び青丸(78ピクセル)内の光学的反応を定量し、それぞれ赤色(図5e及びfにおいて上段のプロファイル)及び青色トレース(図5e及びfにおいて中段のプロファイル)として示した。図5e及びfにおいて下段のトレース(黒)はC4前根吸息活性を示す。この像の各時点は、グラフ中の垂直の点線で示される。 The results are shown in FIGS. A ΔF / F pseudocolor image from the C4 inspiration cluster at -1500 ms (FIGS. 5a and b) or 0 ms (FIGS. 5c and d) was superimposed on the ventral surface of the medulla oblongata. The optical image result is the average of 50 respiratory cycles induced by C4 inspiratory activity. In FIG. 5, the red circle indicates the most prominent region of Pre-I (pre-inspiratory) neuron activity, and the blue circle indicates the most prominent region of I (inspiratory) neuron activity. FIGS. 5e and f quantify the optical response within the red and blue circles (78 pixels) as red (upper profile in FIGS. 5e and f) and blue traces (middle profile in FIGS. 5e and f), respectively. Indicated. In FIGS. 5e and f, the lower trace (black) indicates C4 anterior root inhalation activity. Each point in the image is indicated by a vertical dotted line in the graph.
図5a及びeに示すように、野生型マウスでは、前吸息性(Pre-I)ニューロン活性の平均膜電位軌道は、吻側延髄腹外側部(RVLM)の限定された領域で、吸息性(Pre-I)神経活性の開始前には顔面神経核レベルで数百ミリ秒を現した。続いて、図5c及びeに示すように、呼吸性ニューロン活性は腹側延髄で中央及び尾部に伝播するように観察された。対照的に図5b及びfに示すように、Dscam-/-マウスでは、前吸息段階の間RVLMにおけるPre-Iニューロン活性の平均膜電位軌道は消失していることがわかった。これらの結果から、Dscam-/-マウスにおける呼吸機能不全はPre-Iニューロンの異常から生じていることが判明した。 As shown in FIGS. 5a and e, in wild-type mice, the mean membrane potential trajectory of pre-inspiratory (Pre-I) neuron activity is inhaled in a limited region of the rostral ventrolateral part (RVLM). Hundreds of milliseconds appeared at the facial nucleus level before the onset of sexual (Pre-I) nerve activity. Subsequently, as shown in FIGS. 5c and e, respiratory neuronal activity was observed to propagate to the center and tail in the ventral medulla oblongata. In contrast, as shown in FIGS. 5b and f, it was found that in Dscam − / − mice, the mean membrane potential trajectory of Pre-I neuronal activity in RVLM disappeared during the pre-inspiration phase. These results indicate that respiratory dysfunction in Dscam − / − mice results from abnormalities in Pre-I neurons.
さらにまた、Pre-Iニューロンの長期継続活性の基本性質を調査するために(図5eにおける上段プロファイル)、従来の全細胞パッチクランプ法を用いて、野生型マウス由来のRVLMの対応領域における数個のニューロンの膜電位を記録した。その結果、図6に示すように、Pre-Iニューロン活性の膜電位の複数のサブタイプがI-ニューロン活性の開始前に連続して出現するのを観察した。これらの結果は、Pre-Iニューロンが複数のサブタイプからなり、これらが順次活性化することを示唆している。これらは互いに結合して、その活性を中継し、その後活性をI-ニューロンへ転移する。 Furthermore, in order to investigate the basic properties of long-lasting activity of Pre-I neurons (upper profile in Fig. 5e), several of them in the corresponding region of RVLM from wild-type mice using the conventional whole-cell patch clamp method The membrane potential of neurons was recorded. As a result, as shown in FIG. 6, it was observed that a plurality of subtypes of membrane potential of Pre-I neuron activity appeared continuously before the start of I-neuron activity. These results suggest that Pre-I neurons consist of multiple subtypes, which are activated sequentially. They bind to each other, relay their activity, and then transfer activity to I-neurons.
神経突起伸長アッセイ
神経突起の伸長におけるDscamの同種親和性結合依存性促進活性も調査した。
P0マウスから切り取った後根神経節(DRG)を、37℃で30分間トリプシン-EGTA(Life Technologies)で処理し、p20マイクロピペットマンを用いて粉砕することによって解離させた。解離した細胞を、10%ウシ胎児血清(Life Technologies)、1%PSF(Life Technologies)及び20ng/ml NGF(Promega)を添加したRPMI1640培地(Life Technologies)で再懸濁し、Dscam-Fc又はL1cam(細胞接着分子L1)-Fcをコートしたガラス製シャーレ上にプレーティングした。CAM-Fcをコートしたシャーレを、0.1mg/ml ポリ-D-リシン(70-150kD;Sigma Aldrich)、40μg/ml 抗Fc抗体(Sigma Aldrich)及びDscam-Fc又はL1cam-Fcを順にコートすることによって準備した。Dscam-Fc又はL1cam-Fcの製造は、既に記載されるように行った(上掲Kamiguchi及びYoshihara(2001))。4%ホルムアルデヒドで固定する前に、細胞を加湿したインキュベーター中、5%CO2、37℃で7時間培養した。
Neurite outgrowth assay The homophilic binding-dependent promoting activity of Dscam in neurite outgrowth was also investigated.
The dorsal root ganglia (DRG) excised from P0 mice were treated with trypsin-EGTA (Life Technologies) at 37 ° C. for 30 minutes and dissociated by grinding with a p20 micropipette man. Dissociated cells were resuspended in RPMI1640 medium (Life Technologies) supplemented with 10% fetal calf serum (Life Technologies), 1% PSF (Life Technologies) and 20 ng / ml NGF (Promega), and Dscam-Fc or L1cam ( The cells were plated on a glass petri dish coated with the cell adhesion molecule L1) -Fc. Coat a petri dish coated with CAM-Fc in order with 0.1 mg / ml poly-D-lysine (70-150 kD; Sigma Aldrich), 40 μg / ml anti-Fc antibody (Sigma Aldrich) and Dscam-Fc or L1cam-Fc. Prepared by. The production of Dscam-Fc or L1cam-Fc was performed as described previously (Kamiguchi and Yoshihara (2001) above). Prior to fixation with 4% formaldehyde, cells were cultured in a humidified incubator for 7 hours at 37 ° C., 5% CO 2 .
冷却デジタルCCDカメラ(CoolSNAP HQ;Photometrics)で撮影したDRGニューロンの像をMetaMorphバージョン4.6(Universal Imaging)を用いて分析した。神経突起の長さは、最長の神経突起の先端と神経突起が現れる細胞体の外面との距離として測定した。 Images of DRG neurons taken with a cooled digital CCD camera (CoolSNAP HQ; Photometrics) were analyzed using MetaMorph version 4.6 (Universal Imaging). The length of the neurite was measured as the distance between the tip of the longest neurite and the outer surface of the cell body where the neurite appeared.
結果を図7a及びbに示す。なお、図7aにおいて、Dscam-Fcのサンプル数はn=465又はn=348であり、L1cam-Fcのサンプル数はn=327又はn=335である。また、ネガティブコントロールは、タンパク質でコートしていないシャーレを用いた場合の結果を示している(n=151又はn=142)。また、図7aにおいて『****』はp<0.0001を意味しており、同一の培養条件下で野生型ニューロンとt検定で比較した結果である。図7bにおいて各サンプル数はn=600である。図7a及びbにおいてエラーバーはSEMを表す。 The results are shown in FIGS. 7a and b. In FIG. 7a, the number of samples of Dscam-Fc is n = 465 or n = 348, and the number of samples of L1cam-Fc is n = 327 or n = 335. Moreover, the negative control has shown the result at the time of using the petri dish which is not coat | covered with protein (n = 151 or n = 142). In FIG. 7a, “****” means p <0.0001, which is a result of comparison with a wild-type neuron by t-test under the same culture conditions. In FIG. 7b, the number of each sample is n = 600. In FIGS. 7a and b, error bars represent SEM.
図7a及びbに示すように、Dscam-Fcでコートしたシャーレ上のDscam-/-由来DRGニューロンの神経突起長は、野生型由来DRGニューロンのものと比較してかなり短いが(図7a)、神経突起を保有するDRGニューロンの比率がDscam-/-対野生型DRGニューロン間で異ならなかったことを観察した(図7b)。これらの結果は、Dscamの同種親和性結合が神経突起の伸長を刺激し、Dscamの欠損が異常な神経ネットワークの形成を導き得ることを示している。 As shown in FIGS. 7a and b, the neurite length of Dscam − / − derived DRG neurons on a Dscam-Fc coated petri dish is considerably shorter than that of wild type derived DRG neurons (FIG. 7a). We observed that the ratio of DRG neurons bearing neurites did not differ between Dscam − / − versus wild type DRG neurons (FIG. 7b). These results indicate that Dscam homophilic binding stimulates neurite outgrowth and Dscam deficiency can lead to the formation of abnormal neural networks.
これらは、RVLMにおけるDscamの発現が、その内部ネットワークの形成に重要な役割(例えば、軸索誘導受容体等)を果たし得ること、並びに、Dscam-/-マウスにおけるその欠損がPre-Iニューロンサブタイプの異常な内部結合を導き、その結果、全体としてPre-Iニューロン活性の欠損を生じ得ることを示している。 These indicate that the expression of Dscam in RVLM can play an important role in the formation of its internal network (eg, axonal guidance receptors), and that its deficiency in Dscam − / − mice It has been shown that it leads to a type of abnormal internal connection, which can result in a loss of pre-I neuronal activity as a whole.
〔実施例3〕DSCAM遺伝子の解析
実施例1及び2からDSCAM遺伝子が中枢性呼吸障害に関与していることが明かとなったが、DSCAM遺伝子の変異を検出することで中枢性呼吸障害の診断を支援することができる。本実施例ではDSCAM遺伝子の変異を検出する一手法として、DHPLC法と組み合わせたヘテロデュプレックス法を説明する。
[Example 3] Analysis of the DSCAM gene From Examples 1 and 2, it was revealed that the DSCAM gene is involved in central respiratory disorder. Diagnosis of central respiratory disorder by detecting mutations in the DSCAM gene Can help. In this example, a heteroduplex method combined with a DHPLC method will be described as one method for detecting a mutation in the DSCAM gene.
本手法では、先ず、DSCAM遺伝子のエキソンをPCRによって増幅した。PCRは、QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden社製)を用いてヘパリン処理血からゲノムDNAを抽出した。PCRは、抽出したゲノムDNAを鋳型として、DSCAM遺伝子の33個のエキソンを増幅すべく設計した33対のプライマーセット及びPyrobestTMDNA polymerase (Takara 社製)又はPwo DNA polymerase (Roche社製)を使用した。本実施例で使用した33対のプライマーセットの塩基配列を表1及び表2に示す。なお、DSCAM遺伝子における33個のエキソンについては『Yamakawaら“DSCAM: a novel member of the immunoglobulin superfamily maps in a Down syndrome region and is involved in the development of the nervous system.”Hum. Mol. Genet. 7, 227-237 (1998)』を参照する。 In this method, first, an exon of the DSCAM gene was amplified by PCR. For PCR, genomic DNA was extracted from heparinized blood using QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, manufactured by Hilden). PCR uses 33 pairs of primer sets designed to amplify 33 exons of the DSCAM gene and Pyrobest TM DNA polymerase (Takara) or Pwo DNA polymerase (Roche) using the extracted genomic DNA as a template did. Tables 1 and 2 show the base sequences of the 33 pairs of primer sets used in this example. For 33 exons in the DSCAM gene, see “Yamakawa et al.“ DSCAM: a novel member of the immunoglobulin superfamily maps in a Down syndrome region and is involved in the development of the nervous system. ”Hum. Mol. Genet. 7, 227-237 (1998).
エキソン2〜33を増幅するPCRに際しては、鋳型となるゲノムDNAを50〜100ng使用し、各プライマーを0.5μMと1xPyrobestTMbufferとdNTP混合液を0.2 mMとPyrobestTM DNA polymeraseを2.5 U含む全量25μlの反応液で行った。エキソン1を増幅するPCRに際しては、Epicentre MasterAmp KN bufferとPwo DNA polymeraseを2.5 U使用した。エキソン2〜33を増幅する際のPCR条件としては、95℃で3分間の初期変成の後、94℃で20秒間及び68℃で1分間を1サイクルとして3サイクル(ただし1サイクル毎に後半ステップの温度を1℃ずつ低下するように設定する)行い、その後、94℃で20秒間、64.5℃で20秒間及び72℃で40秒間を1サイクルとして13サイクル(ただし1サイクル毎に“64.5℃で20秒間”ステップの温度を0.8℃ずつ低下するように設定する)行い、その後、94℃で20秒間、55℃で20秒間及び72℃で40秒間を1サイクルとして19サイクル行い、その後、72℃で5分間の最終伸長を行う条件とした。エキソン1を増幅する際のPCR条件としては、94℃で2分間の初期変成の後、94℃で15秒間、62℃で30秒間及び72℃で1分間を1サイクルとして10サイクル(ただし1サイクル毎に“62℃で30秒間”ステップの温度を1℃ずつ低下するように設定する)行い、その後、94℃で15秒間、52℃で30秒間及び72℃で1分間を1サイクルとして23サイクル行い、その後、72℃で5分間の最終伸長を行う条件とした。PCRによって増幅産物を2%アガロースゲルで確認したところ、エキソン1〜33全てについて予期していたサイズで増幅できていたことが示された(データは示さない)。なお、得られたPCR産物は、ArrayItTMPCR purification kit(TeleChem International社製)を使用して精製し、配列決定に供した。そして、BigDyeTMterminator cycle sequencing kit及びABI PRISMTM 3700 DNA sequencing system (PE Applied Biosystems社製)を使用して配列決定を行った。
For PCR to amplify
次に、本手法では、上述したPCRによる産物を95℃で5分間処理して熱変成させ、その後、80〜55℃で50分間処理して段階的な再アニーリングさせた。これにより、エキソン1〜33について、ヘテロ二本鎖を形成することができる。 Next, in this method, the above-mentioned PCR product was thermally denatured by treating at 95 ° C. for 5 minutes, and then treated at 80 to 55 ° C. for 50 minutes to perform stepwise reannealing. Thereby, about exons 1-33, a heteroduplex can be formed.
次に、反応液を用いてDHPLC法によってヘテロ二本鎖を検出した。DHPLC法は、WAVE DNA-fragment analysis system(Transgenomic社製)を用いて行った。このときカラム温度は、WAVEMAKER software (Transgenomic社製)に基づいて決定した。また、DHPLC法に供する反応液には、多型が存在せず、ホモ二本鎖を形成して単一ピークを示すコントロールを等量添加した。また、コントロールを加えた反応液は、直線的なアセトニトリル濃度勾配で速度0.9ml/minの条件で溶出した。 Next, heteroduplex was detected by DHPLC method using the reaction solution. The DHPLC method was performed using a WAVE DNA-fragment analysis system (manufactured by Transgenomic). At this time, the column temperature was determined based on WAVEMAKER software (Transgenomic). Further, the reaction solution subjected to the DHPLC method did not have a polymorphism, and an equal amount of a control that formed a homoduplex and showed a single peak was added. Further, the reaction solution to which the control was added was eluted with a linear acetonitrile concentration gradient at a rate of 0.9 ml / min.
具体的な温度条件としては、エキソン2、21及び22については59℃及び60℃とし、エキソン3、6、8、15、16、19及び27については60℃及び61℃とし、エキソン4、7、10、11、12、14、17、18、24、25及び29については58℃及び59℃とし、エキソン5、20及び26については62℃及び63℃とし、エキソン9、30及び32については61℃及び62℃とし、エキソン13については56℃及び57℃とし、エキソン23及び28については54℃及び55℃とし、エキソン31については63℃及び64℃とし、エキソン33については55℃及び56とした。
Specific temperature conditions are 59 ° C. and 60 ° C. for
また、DHPLC法におけるデータ分析は、得られたクロマトグラムに対する目視検査によって行った。また、各サンプルにおいてはコントロールとの比較も行った。ヘテロ接合体及びホモ接合体の変異プロファイルは、野生型ホモ接合体のピークから区別可能なピークとして検出した。 Data analysis in the DHPLC method was performed by visual inspection on the obtained chromatogram. Each sample was also compared with the control. Heterozygous and homozygous mutation profiles were detected as peaks distinguishable from wild type homozygous peaks.
Claims (11)
非ヒト動物胚幹細胞おける前記遺伝子が欠失されているか又は非機能性とされた胚幹細胞を選別し、
当該胚幹細胞からキメラ胚を作製し、
当該キメラ胚を仮親非ヒト動物の子宮に移植し、出産により非ヒト仔動物を得て、前記遺伝子が破壊されたキメラ非ヒト動物を選別し、
前記キメラ非ヒト動物の雌と雄の交配によって、DSCAM遺伝子が欠損した遺伝子型を有する非ヒト動物を得る、
工程を含む方法。 A method for producing a non-human animal having a genotype deficient in a Down syndrome cell adhesion molecule (DSCAM) gene and exhibiting central respiratory disorder,
Selecting an embryonic stem cell in which the gene in the non-human animal embryonic stem cell is deleted or rendered non-functional;
A chimeric embryo is produced from the embryonic stem cell,
Transplanting the chimeric embryo into the uterus of a temporary parent non-human animal, obtaining a non-human pup by birth, selecting the chimeric non-human animal in which the gene is disrupted,
By mating female and male of the chimeric non-human animal, a non-human animal having a genotype deficient in the DSCAM gene is obtained.
A method comprising steps.
上記(1)〜(4)の少なくとも1つのデータを測定する工程と、
(1)非ヒト動物の呼吸リズムを示すデータ
(2)C4前根活性を示すデータ
(3)前呼吸性ニューロン活性を示すデータ
(4)後根神経節ニューロン培養物の神経突起伸長を示すデータ
下記(1)〜(4)いずれか1以上のデータが、候補物質未投与の上記非ヒト動物を用いて測定したデータと比較して有意に改善している場合に当該候補物質を呼吸中枢障害に起因する疾患の治療薬として同定する工程と
を含む呼吸中枢障害に起因する疾患の治療薬のスクリーニング方法。 Administering a candidate substance to the non-human animal according to any one of claims 1 to 3,
Measuring at least one data of (1) to (4) above;
(1) Data indicating respiratory rhythm of non-human animals (2) Data indicating C4 anterior root activity (3) Data indicating anterior respiratory neuron activity (4) Data indicating neurite outgrowth of dorsal root ganglion neuron culture If any one or more of the following (1) to (4) is significantly improved as compared to the data measured using the non-human animal not administered with the candidate substance, the candidate substance is treated as a respiratory center disorder. And a method for screening a therapeutic agent for a disease caused by respiratory center disorder, comprising the step of identifying the therapeutic agent for a disease caused by the disease.
採取した生体サンプルにおける、ダウン症細胞接着分子(Down syndrome cell adhesion molecule: DSCAM)遺伝子の変異を検出する工程を含む、呼吸中枢障害に起因する疾患の検査方法。 Collecting a biological sample from the subject,
A method for examining a disease caused by a respiratory center disorder, comprising a step of detecting a mutation in a Down syndrome cell adhesion molecule (DSCAM) gene in a collected biological sample.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006066489A JP2007236347A (en) | 2006-03-10 | 2006-03-10 | Central breathing disorder model/non-human animal |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006066489A JP2007236347A (en) | 2006-03-10 | 2006-03-10 | Central breathing disorder model/non-human animal |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007236347A true JP2007236347A (en) | 2007-09-20 |
Family
ID=38582513
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006066489A Pending JP2007236347A (en) | 2006-03-10 | 2006-03-10 | Central breathing disorder model/non-human animal |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2007236347A (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010075096A (en) * | 2008-09-25 | 2010-04-08 | Genome Soyaku Kenkyusho:Kk | Hepatopathy model animal and method for screening drug or food material to ameliorate or prevent hepatopathy by using the animal |
-
2006
- 2006-03-10 JP JP2006066489A patent/JP2007236347A/en active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010075096A (en) * | 2008-09-25 | 2010-04-08 | Genome Soyaku Kenkyusho:Kk | Hepatopathy model animal and method for screening drug or food material to ameliorate or prevent hepatopathy by using the animal |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wang et al. | Progressive Cerebellar, Auditory, and Esophageal Dysfunction Caused by Targeted Disruption of thefrizzled-4 Gene | |
Heuckeroth et al. | Gene targeting reveals a critical role for neurturin in the development and maintenance of enteric, sensory, and parasympathetic neurons | |
Klein et al. | Targeted disruption of the trkB neurotrophin receptor gene results in nervous system lesions and neonatal death | |
Wang et al. | A mouse model for Glut-1 haploinsufficiency | |
Crowley et al. | Mice lacking nerve growth factor display perinatal loss of sensory and sympathetic neurons yet develop basal forebrain cholinergic neurons | |
Cemal et al. | YAC transgenic mice carrying pathological alleles of the MJD1 locus exhibit a mild and slowly progressive cerebellar deficit | |
Michaud et al. | Neuromuscular defects and breathing disorders in a new mouse model of spinal muscular atrophy | |
JP3679403B2 (en) | Transgenic animals | |
Rhee et al. | Pbx3 deficiency results in central hypoventilation | |
McNeill et al. | Nav2 is necessary for cranial nerve development and blood pressure regulation | |
Parrish et al. | Loss of the Sall3 gene leads to palate deficiency, abnormalities in cranial nerves, and perinatal lethality | |
Di Donato et al. | Spinocerebellar ataxia type 1 | |
JP2009519028A (en) | Novel neurotrophic factor protein and uses thereof | |
Dragatsis et al. | Huntingtin-associated protein 1 (Hap1) mutant mice bypassing the early postnatal lethality are neuroanatomically normal and fertile but display growth retardation | |
Amano et al. | DSCAM deficiency causes loss of pre-inspiratory neuron synchroneity and perinatal death | |
KR20190043845A (en) | Marker TMEM43 for diagnosing sensorineural hearing loss and uses thereof | |
JP2007236347A (en) | Central breathing disorder model/non-human animal | |
Xu et al. | PHR1, a PH domain-containing protein expressed in primary sensory neurons | |
US5625121A (en) | Mice deficient in nerve growth factor receptors encoded by trkB | |
CN116463353B (en) | Construction method and application of Csf1r gene mutation mouse model | |
JP4494340B2 (en) | Glutamate transporter GLAST function-deficient mice | |
US20090119786A1 (en) | Model animal of schizophrenia | |
Sewell | Determining the Role of Beta-Tubulin 4b in Cilia and Development | |
Mitchell | Longitudinal studies and the development of gene therapy for ovine neuronal ceroid lipofuscinoses | |
Vaidyanathan | Oxytocin Receptor in Sensori-motor Circuits and Its Association with Hypothalamus Activity |