JP2007225305A - Enzyme electrode - Google Patents

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Satoko Komatsu
さと子 小松
Hiroaki Fukuda
裕章 福田
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an enzyme electrode having both of a stable enzyme fixing capacity and high substrate reactivity though having a simple electrode structure. <P>SOLUTION: The enzyme electrode has a structure formed by keeping substrate dehydrogenating enzyme 10 for oxidizing a specific substrate Sub, a first electron mediator 20 comprising coenzyme of the substrate dehydrogenating enzyme 10, a coenzyme dehydrogenating enzyme 30 for oxidizing the first electron mediator 20 and a second electron mediator 40 for oxidizing the coenzyme dehydrogenating enzyme 30 to assist the transmission of electrons to an electrode 50 respectively overlying the electrode 50 to be fixed thereon in a laminar form. The first electron mediator 20, the coenzyme dehydrogenating enzyme 30 and the second electron mediator 40 are fixed to the lower layer on the surface side of the electrode 50 by a crosslinking agent having an epoxy group and the substrate dehydrogenating enzyme 10 is fixed to the upper layer on a substrate solution side by the crosslinking agent and a water-soluble carrier. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

この発明は、特定の基質を酸化する特性を有する酵素の酸化還元反応に伴う電子移動を利用した例えば電池、センサ、リアクター等に適用される酵素電極に関する。   The present invention relates to an enzyme electrode applied to, for example, a battery, a sensor, a reactor, or the like using electron transfer accompanying an oxidation-reduction reaction of an enzyme having a characteristic of oxidizing a specific substrate.

従来より、化石燃料の枯渇や様々な環境問題の観点から、より環境負荷の少ないエネルギー生産技術を確立すべく燃料電池の開発が盛んに行われている。そしてその中でも、安全性やコストに優れた微生物や酵素等の生体触媒を利用した酵素電極、およびこうした酵素電極を用いた酵素センサおよび酵素燃料電池に関する提案は多い。ちなみに、酵素燃料電池などは、触媒として白金を必要としないため安価な供給が可能であるとともに、セパレータも不要で、DMFC(ダイレクトメタノール型燃料電池)で問題となるメタノールのクロスオーバーなども生じない利点がある。   Conventionally, fuel cells have been actively developed in order to establish energy production technology with less environmental load from the viewpoint of depletion of fossil fuels and various environmental problems. Among them, there are many proposals relating to enzyme electrodes using biocatalysts such as microorganisms and enzymes that are excellent in safety and cost, and enzyme sensors and enzyme fuel cells using such enzyme electrodes. Incidentally, enzyme fuel cells and the like do not require platinum as a catalyst, so they can be supplied at a low cost, and they do not require a separator and do not cause methanol crossover, which is a problem in DMFC (direct methanol fuel cells). There are advantages.

一方、近年は、こうした酵素センサや酵素燃料電池の出力の向上や安定性の向上のため、それらの電極として用いられる酵素電極上に酵素を固定し、同電極近傍で起こる基質と酵素との反応を電気信号として効率よく抽出するための様々な方法も提案されている。例えば、特許文献1では、高分子電気伝導体等のペースト中に電子伝達体である電子メディエータを含有させたペースト状電極表面に酵素を固定し、その外面を基質透過膜(透析膜)で被覆することで酵素電極としての出力、並びに安定性を向上させる技術が提案されている。また、特許文献2では電極上にポリカチオン水溶液、ポリアニオン水溶液および酵素を展開してポリイオンコンプレックス膜を形成することで、酵素を固定化する電極製造方法が提案されている。このような電極製造方法の採用によって、基質溶液中への酵素の溶出が抑制できるようになり、酵素電極としての安定性が高められるようになる。さらに特許文献3では、架橋剤としてGA(グルタルアルデヒド)を用い、PLL(ポリ−L−リシン)と架橋させることで3次元的な構造を有するポリマーを形成し、このポリマーに酵素を電子メディエータと共々包括させることで、酵素電極としての出力向上を図る技術が提案されている。
特公平6−12353号公報 特許2669497号公報 特開2005−13210号公報
On the other hand, in recent years, in order to improve the output and stability of such enzyme sensors and enzyme fuel cells, the enzyme is immobilized on the enzyme electrode used as the electrode and the reaction between the substrate and the enzyme that occurs in the vicinity of the electrode. Various methods for efficiently extracting the signal as an electric signal have also been proposed. For example, in Patent Document 1, an enzyme is fixed on the surface of a paste-like electrode containing an electron mediator as an electron carrier in a paste such as a polymer electric conductor, and the outer surface thereof is covered with a substrate permeable membrane (dialysis membrane). Thus, a technique for improving the output and stability of the enzyme electrode has been proposed. Patent Document 2 proposes an electrode manufacturing method in which an enzyme is immobilized by developing a polycation aqueous solution, a polyanion aqueous solution and an enzyme on the electrode to form a polyion complex membrane. By adopting such an electrode manufacturing method, the elution of the enzyme into the substrate solution can be suppressed, and the stability as the enzyme electrode can be improved. Furthermore, in Patent Document 3, a polymer having a three-dimensional structure is formed by cross-linking with PLL (poly-L-lysine) using GA (glutaraldehyde) as a cross-linking agent, and an enzyme is combined with an electron mediator on the polymer. A technique for improving the output as an enzyme electrode by including them together has been proposed.
Japanese Examined Patent Publication No. 6-12353 Japanese Patent No. 26669497 JP 2005-13210 A

上述のように、電極上に酵素を固定する方法としてさまざまな方法が提案されている。ただし、例えば特許文献1に記載されている酵素電極は、電子メディエータを高分子電気伝導体のペースト中に含有させた後、その表面に酵素を固定し、さらにその溶出を防ぐために基質透過膜を利用しているため、その電極構造がかなり複雑となっている。また、特許文献2に記載されている酵素電極は、電極上に酵素を含有するポリイオンコンプレックス膜を形成するようにしているため、このポリイオンコンプレックス膜による酵素固定力が強く、酵素の働きが阻害されやすい。このことが原因によるものか、酵素電極としての出力が低下することが確認されている。一方、特許文献3に記載されている酵素電極は、架橋剤を用いた3次元的なポリマーを用いて電極上に酵素を固定しているため、採用する酵素によっては電極上への固定能力が増大する反面、やはり酵素の働きの阻害によるものか、この場合も酵素電極として出力が低下することがある。   As described above, various methods have been proposed as a method for immobilizing an enzyme on an electrode. However, for example, in the enzyme electrode described in Patent Document 1, an electron mediator is contained in a polymer electrical conductor paste, and then a substrate permeable membrane is used to fix the enzyme on the surface and prevent its elution. Since it is used, the electrode structure is considerably complicated. In addition, since the enzyme electrode described in Patent Document 2 forms a polyion complex membrane containing an enzyme on the electrode, the enzyme fixing force by this polyion complex membrane is strong, and the action of the enzyme is inhibited. Cheap. It has been confirmed that this is due to the cause or the output as the enzyme electrode is lowered. On the other hand, the enzyme electrode described in Patent Document 3 has an enzyme immobilized on the electrode using a three-dimensional polymer using a cross-linking agent. On the other hand, the output may decrease due to inhibition of the action of the enzyme, or in this case as an enzyme electrode.

この発明は、こうした実情に鑑みてなされたものであり、簡素な電極構造を有しながら、安定した酵素固定能力と高い基質反応性とを兼ね備える酵素電極を提供することを目的とする。   This invention is made | formed in view of such a situation, and it aims at providing the enzyme electrode which has a stable enzyme fixing ability and high substrate reactivity, having a simple electrode structure.

こうした目的を達成するため、請求項1に記載の発明では、酵素電極として、特定の基質を酸化する基質脱水素酵素および該基質脱水素酵素を酸化して電極への電子伝達を補助する電子メディエータが、前記電子メディエータを下層として前記電極上にそれぞれ層状に積層固定される構造とした。   In order to achieve these objects, in the invention described in claim 1, as an enzyme electrode, a substrate dehydrogenase that oxidizes a specific substrate and an electron mediator that oxidizes the substrate dehydrogenase and assists electron transfer to the electrode However, the electron mediator is used as a lower layer, and the electrodes are stacked and fixed in layers on the electrodes.

酵素電極としてのこのような構造によれば、上記基質脱水素酵素が基質側(基質溶液側)に、また上記電子メディエータが電極表面側にそれぞれ層状に積層固定されることで、上記基質脱水素酵素による高い基質反応性が確保されるようになる。また、上記電子メディエータを上記基質脱水素酵素よりも電極表面側に固定することにより、電子メディエータから電極への電子伝達が円滑に実現され、酵素電極としての出力向上が図られるようにもなる。   According to such a structure as an enzyme electrode, the substrate dehydrogenase is laminated and fixed in layers on the substrate side (substrate solution side) and the electron mediator on the electrode surface side. A high substrate reactivity by the enzyme is ensured. Further, by fixing the electron mediator on the electrode surface side with respect to the substrate dehydrogenase, electrons can be smoothly transferred from the electron mediator to the electrode, and the output as an enzyme electrode can be improved.

また、こうした構造において、請求項2に記載の発明によるように、前記電子メディエータとしてこれを、前記基質脱水素酵素の補酵素からなる第1の電子メディエータと、該第1の電子メディエータとなる補酵素を酸化する補酵素脱水素酵素と、該補酵素脱水素酵素を酸化して前記電極への電子伝達を補助する第2の電子メディエータとを備える構造とすることが特に有効である。酵素電極としてのこのような構造によれば、上記基質脱水素酵素の基質反応性が阻害されることなく、同基質脱水素酵素から伝達される電子が、上記第1の電子メディエータ、補酵素脱水素酵素、および第2の電子メディエータを介して電極へと伝達されることで、上記基質から電極への電子伝達がより円滑に実現されるようになる。   Moreover, in such a structure, as in the invention according to claim 2, the electron mediator includes a first electron mediator composed of a coenzyme of the substrate dehydrogenase and a complement that serves as the first electron mediator. It is particularly effective to have a structure comprising a coenzyme dehydrogenase that oxidizes an enzyme and a second electron mediator that oxidizes the coenzyme dehydrogenase and assists electron transfer to the electrode. According to such a structure as the enzyme electrode, the electrons transferred from the substrate dehydrogenase can be transferred to the first electron mediator, the coenzyme dehydration without inhibiting the substrate reactivity of the substrate dehydrogenase. By being transmitted to the electrode via the enzyme and the second electron mediator, the electron transfer from the substrate to the electrode is more smoothly realized.

またこの場合、請求項3に記載の発明によるように、前記第1の電子メディエータおよび前記補酵素脱水素酵素および前記第2の電子メディエータが、1つ以上のエポキシ基を有する架橋剤により固定されることとすれば、上記架橋剤の有するエポキシ基の開環付加反応によって上記第1の電子メディエータおよび補酵素脱水素酵素および第2の電子メディエータの有するアミノ基との間にアミド結合が生成され、それらをより容易かつ安定に上記電極上に固定することができるようになる。   In this case, as in the invention described in claim 3, the first electron mediator, the coenzyme dehydrogenase, and the second electron mediator are fixed by a crosslinking agent having one or more epoxy groups. In this case, an amide bond is formed between the first electron mediator, the coenzyme dehydrogenase and the amino group of the second electron mediator by the ring-opening addition reaction of the epoxy group of the crosslinking agent. They can be fixed on the electrode more easily and stably.

さらにこの場合、請求項4に記載の発明によるように、前記エポキシ基を有する架橋剤は、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテルからなることとすれば、上記第1の電子メディエータおよび補酵素脱水素酵素および第2の電子メディエータの各分子間で架橋構造を形成して3次元構造をとることも可能となる。これにより、これら第1の電子メディエータおよび補酵素脱水素酵素および第2の電子メディエータの電極上での固定がより安定に実現されるようになる。   In this case, as in the invention described in claim 4, if the cross-linking agent having an epoxy group is made of polyethylene glycol diglycidyl ether, the first electron mediator, the coenzyme dehydrogenase, It is also possible to form a three-dimensional structure by forming a crosslinked structure between the molecules of the two electron mediators. As a result, the first electron mediator, the coenzyme dehydrogenase, and the second electron mediator can be more stably fixed on the electrode.

また、上記構造では、請求項5に記載の発明によるように、前記ポリエチレングリコールジグリシジルエーテルからなる架橋剤は、前記第1の電子メディエータおよび前記補酵素脱水素酵素および前記第2の電子メディエータの総モル数に対して20〜50倍の量だけ含有することが特に有効である。ここで、上記架橋剤の量が上記総モル数に対して20倍未満である場合には、上記第1の電子メディエータと架橋される架橋剤としての量が不十分であるため、同第1の電子メディエータが基質溶液側の層を介して基質溶液中に溶出する懸念がある。そしてこの場合には、酵素電極としての出力低下も避けられない。一方、上記架橋剤の量が上記総モル数に対して50倍を超える場合には、上記第1の電子メディエータの全量が架橋剤により架橋されて電極表面側の層に固定されるようになる。このため、基質溶液側の層に固定される基質脱水素酵素から同第1の電子メディエータへの電子伝達が進行しにくくなり、ひいては上記基質脱水素酵素による酵素基質反応も進行しにくくなる。この点、上記構造のように、上記架橋剤の量を上記総モル数に対して20〜50倍の範囲とすることにより、上記第1の電子メディエータの大部分が上記架橋剤により電極表面側の層に安定に固定されるものの、その全量が架橋されることはない。このため、それら架橋されない第1の電子メディエータを介して基質脱水素酵素から上記電極表面側の層に固定されている第1の電子メディエータへの電子伝達が円滑に行われるとともに、同電極表面側の層に固定されている第1の電子メディエータから電極への電子伝達も円滑に行われるようになる。   In the above structure, as in the invention described in claim 5, the cross-linking agent comprising the polyethylene glycol diglycidyl ether comprises the first electron mediator, the coenzyme dehydrogenase, and the second electron mediator. It is particularly effective to contain 20 to 50 times the total number of moles. Here, when the amount of the crosslinking agent is less than 20 times the total number of moles, the amount of the crosslinking agent that is crosslinked with the first electron mediator is insufficient. There is a concern that the electron mediator may be eluted into the substrate solution through the layer on the substrate solution side. In this case, a decrease in output as an enzyme electrode is inevitable. On the other hand, when the amount of the cross-linking agent exceeds 50 times the total number of moles, the entire amount of the first electron mediator is cross-linked by the cross-linking agent and fixed to the layer on the electrode surface side. . For this reason, the electron transfer from the substrate dehydrogenase immobilized on the substrate solution side layer to the first electron mediator is less likely to proceed, and the enzyme substrate reaction by the substrate dehydrogenase is also less likely to proceed. In this respect, by setting the amount of the cross-linking agent in the range of 20 to 50 times the total number of moles as in the above structure, most of the first electron mediator is on the electrode surface side by the cross-linking agent. Although it is stably fixed to this layer, the whole amount is not crosslinked. Therefore, electron transfer from the substrate dehydrogenase to the first electron mediator fixed to the layer on the electrode surface side through the first electron mediator that is not cross-linked is smoothly performed, and the electrode surface side Electron transfer from the first electron mediator fixed to the layer to the electrode is also smoothly performed.

一方、これら請求項2〜5のいずれかに記載の酵素電極に関しては、請求項6に記載の発明によるように、前記補酵素脱水素酵素および前記第2の電子メディエータを、最下層として、前記第1の電子メディエータよりも前記電極の表面寄りの層に固定することが有効である。酵素電極としてのこのような構造によれば、上記基質脱水素酵素の基質反応性を阻害することなく、同基質脱水素酵素から第1の電子メディエータ、補酵素脱水素酵素、第2の電子メディエータへの電子伝達がより円滑に実現されるようになる。なおこの場合、当該酵素電極は、補酵素脱水素酵素および第2の電子メディエータが第1層に、第1の電子メディエータが第2層に、そして基質脱水素酵素が第3層にそれぞれ固定される3層構造をとることとなる。   On the other hand, regarding the enzyme electrode according to any one of claims 2 to 5, as in the invention according to claim 6, the coenzyme dehydrogenase and the second electron mediator are used as the lowermost layer, It is effective to fix to the layer closer to the surface of the electrode than the first electron mediator. According to such a structure as an enzyme electrode, the substrate dehydrogenase can inhibit the substrate reactivity of the substrate dehydrogenase, and the first electron mediator, coenzyme dehydrogenase, and second electron mediator can be obtained from the substrate dehydrogenase. The transfer of electrons to the can be realized more smoothly. In this case, in this enzyme electrode, the coenzyme dehydrogenase and the second electron mediator are fixed to the first layer, the first electron mediator is fixed to the second layer, and the substrate dehydrogenase is fixed to the third layer. The three-layer structure is taken.

また、これら請求項2〜6のいずれかに記載の構造に関しては、請求項7に記載の発明によるように、前記第1の電子メディエータとしては、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸のいずれかを採用することが特に望ましい。これにより、さまざまな酵素の補酵素として機能する電子伝達体として知られるこれらNAD+(酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)やNADP+(酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸)がこの第1の電子メディエータとして採用されることとなり、上記電極構造の実現がより容易に図られるようになる。   As for the structure according to any one of claims 2 to 6, as in the invention according to claim 7, the first electron mediator includes oxidized nicotinamide adenine dinucleotide and oxidized nicotinamide. It is particularly desirable to employ any of adenine dinucleotide phosphate. As a result, these NAD + (oxidized nicotinamide adenine dinucleotide) and NADP + (oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) known as electron carriers that function as coenzymes for various enzymes serve as the first electron mediator. As a result, the above electrode structure can be realized more easily.

また、請求項1〜7のいずれかに記載の酵素電極に関しては、請求項8に記載の発明によるように、前記基質脱水素酵素が、該基質脱水素酵素と架橋反応可能な官能基を有する架橋剤および水溶性担体の少なくとも一方により前記基質側の層に固定されることとすれば、上記基質脱水素酵素の電極上へのより安定な酵素固定が実現されるようになる。   In the enzyme electrode according to any one of claims 1 to 7, as in the invention according to claim 8, the substrate dehydrogenase has a functional group capable of undergoing a crosslinking reaction with the substrate dehydrogenase. If it is fixed to the layer on the substrate side by at least one of a crosslinking agent and a water-soluble carrier, more stable enzyme immobilization on the electrode of the substrate dehydrogenase can be realized.

なおこの場合、請求項9に記載の発明によるように、前記水溶性担体が、アニオン性およびカチオン性の少なくとも一方の電荷を有する水溶性ポリマーからなることとすれば、上記水溶性担体と上記基質脱水素酵素との間でイオン結合による架橋構造が生じることから、これら水溶性担体および基質脱水素酵素の間での3次元構造が形成されるようになる。すなわち、上記電極上に固定される基質脱水素酵素の酵素担持量の増大および酵素安定性の向上が図られるようになる。   In this case, as in the invention described in claim 9, if the water-soluble carrier is composed of a water-soluble polymer having an anionic or cationic charge, the water-soluble carrier and the substrate are used. Since a cross-linked structure is formed by ionic bond with dehydrogenase, a three-dimensional structure is formed between these water-soluble carrier and substrate dehydrogenase. That is, an increase in the amount of enzyme supported by the substrate dehydrogenase immobilized on the electrode and an improvement in enzyme stability can be achieved.

(第1の実施の形態)
以下、この発明にかかる酵素電極を具現化した第1の実施の形態について図1および図2を参照して説明する。
(First embodiment)
A first embodiment that embodies an enzyme electrode according to the present invention will be described below with reference to FIGS.

この実施の形態にかかる酵素電極は、特定の基質(標的物質)を酸化する基質脱水素酵素を触媒として、上記基質から電極に電子を伝達するものである。そして図1は、この酵素電極(アノード極)における電子伝達態様を模式的に示したものである。同図1に示されるように、この酵素電極は、特定の基質Subを酸化する基質脱水素酵素10と、同基質脱水素酵素10の補酵素からなる第1の電子メディエータ20と、同第1の電子メディエータ20を酸化する補酵素脱水素酵素30と、同補酵素脱水素酵素30を酸化する第2の電子メディエータ40とが、それぞれ電極50の表面に層状に固定される構造からなる。このうち基質脱水素酵素10が上記特定の基質Subを酸化(脱水素)すると、同基質Subから電子(e)が引き抜かれ、次いでこの基質脱水素酵素10が第1の電子メディエータ20により酸化されることで基質脱水素酵素10から第1の電子メディエータ20に電子が伝達される。同様に、この第1の電子メディエータ20が補酵素脱水素酵素30により酸化されることで第1の電子メディエータ20から補酵素脱水素酵素30に電子が引き抜かれ、さらにこの補酵素脱水素酵素30が第2の電子メディエータ40により酸化されることで補酵素脱水素酵素30から第2の電子メディエータ40に電子が伝達される。そして、この第2の電子メディエータ40が電極50表面で酸化されることで第2の電子メディエータ40から電極50に電子が伝達される。このように、上記特定の基質Subが検知されると、基質脱水素酵素10、第1の電子メディエータ20、補酵素脱水素酵素30、第2の電子メディエータ40を介して、電極50へと電子が伝達される。なお、同図1中では、これら基質Sub、基質脱水素酵素10、第1の電子メディエータ20、補酵素脱水素酵素30および第2の電子メディエータ40の酸化還元反応に伴って得られる各酸化還元体を、それぞれ酸化体(red)、還元体(ox)として示している。 The enzyme electrode according to this embodiment transmits electrons from the substrate to the electrode using a substrate dehydrogenase that oxidizes a specific substrate (target substance) as a catalyst. FIG. 1 schematically shows an electron transfer mode in the enzyme electrode (anode electrode). As shown in FIG. 1, the enzyme electrode includes a substrate dehydrogenase 10 that oxidizes a specific substrate Sub, a first electron mediator 20 that is a coenzyme of the substrate dehydrogenase 10, and the first electrode The coenzyme dehydrogenase 30 that oxidizes the electron mediator 20 and the second electron mediator 40 that oxidizes the coenzyme dehydrogenase 30 are each fixed to the surface of the electrode 50 in layers. Among these, when the substrate dehydrogenase 10 oxidizes (dehydrogenates) the specific substrate Sub, electrons (e ) are extracted from the substrate Sub, and then the substrate dehydrogenase 10 is oxidized by the first electron mediator 20. As a result, electrons are transferred from the substrate dehydrogenase 10 to the first electron mediator 20. Similarly, when the first electron mediator 20 is oxidized by the coenzyme dehydrogenase 30, electrons are extracted from the first electron mediator 20 to the coenzyme dehydrogenase 30, and the coenzyme dehydrogenase 30 is further extracted. Is oxidized by the second electron mediator 40, whereby electrons are transferred from the coenzyme dehydrogenase 30 to the second electron mediator 40. The second electron mediator 40 is oxidized on the surface of the electrode 50, whereby electrons are transferred from the second electron mediator 40 to the electrode 50. Thus, when the specific substrate Sub is detected, electrons are transferred to the electrode 50 via the substrate dehydrogenase 10, the first electron mediator 20, the coenzyme dehydrogenase 30, and the second electron mediator 40. Is transmitted. In FIG. 1, each redox obtained by the redox reaction of the substrate Sub, the substrate dehydrogenase 10, the first electron mediator 20, the coenzyme dehydrogenase 30, and the second electron mediator 40. The body is shown as an oxidant (red) and a reductant (ox), respectively.

上記酵素電極で検知される基質Subとしては、例えばグルコースや、メタノール、エタノール等のアルコールが用いられる。そして、これら各基質Subを特異的に酸化する基質脱水素酵素10としては、例えばグルコース脱水素酵素やアルコール脱水素酵素等が用いられる。また、上記基質脱水素酵素10を酸化する第1の電子メディエータ20としては、例えば上記各基質脱水素酵素10の補酵素であるNAD+(酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)やNADP+(酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸)等が用いられる。ちなみに、これらNAD+およびNADP+は、上記基質脱水素酵素10を酸化することで、それぞれNADH(還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)およびNADPH(還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸)となる。また、これら第1の電子メディエータ20を酸化する補酵素脱水素酵素30としては、例えばNAD(P)H脱水素酵素であるジアホラーゼ等が用いられる。ちなみに、上記第1の電子メディエータ20として上述した還元型のNAD(P)Hが用いられる場合には、補酵素脱水素酵素30であるジアホラーゼを還元することにより再び酸化型のNAD(P)+に戻る。なお、上記補酵素脱水素酵素30を酸化する第2の電子メディエータ40としては、例えばOs(オスミウム)錯体等が用いられる。   As the substrate Sub detected by the enzyme electrode, for example, glucose, alcohol such as methanol, ethanol or the like is used. As the substrate dehydrogenase 10 that specifically oxidizes each substrate Sub, for example, glucose dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, or the like is used. Examples of the first electron mediator 20 that oxidizes the substrate dehydrogenase 10 include NAD + (oxidized nicotinamide adenine dinucleotide) and NADP + (oxidized nicotinamide), which are coenzymes of the substrate dehydrogenase 10. Adenine dinucleotide phosphate) and the like are used. Incidentally, these NAD + and NADP + become NADH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide) and NADPH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) by oxidizing the substrate dehydrogenase 10, respectively. In addition, as the coenzyme dehydrogenase 30 that oxidizes the first electron mediator 20, for example, diaphorase which is NAD (P) H dehydrogenase is used. Incidentally, when the above-described reduced NAD (P) H is used as the first electron mediator 20, the reduced NAD (P) + is reduced again by reducing diaphorase which is the coenzyme dehydrogenase 30. Return to. In addition, as the 2nd electron mediator 40 which oxidizes the said coenzyme dehydrogenase 30, an Os (osmium) complex etc. are used, for example.

一方、上記電極50は導電性電極からなり、例えばカーボンペーパー等、基質脱水素酵素10等の担持に適した多孔質の炭素系材料や、同基質脱水素酵素10等の固定面積を増大させることのできるカーボンフェルトやカーボンブラック等の炭素系材料を用いることができる。また、その他の炭素系材料、導電性金属、半導体材料および金属酸化物なども導電性を有する物質であれば用いることができる。   On the other hand, the electrode 50 is composed of a conductive electrode, for example, a porous carbon-based material suitable for supporting the substrate dehydrogenase 10 or the like, such as carbon paper, or the fixed area of the substrate dehydrogenase 10 or the like. Carbon-based materials such as carbon felt and carbon black can be used. In addition, other carbon-based materials, conductive metals, semiconductor materials, metal oxides, and the like can be used as long as they have conductivity.

ここで、この実施の形態にかかる酵素電極においては、上述したように、電極50上に各酵素および各電子メディエータ等が積層固定されている。具体的には、電極50表面側の下層となる第1層には、第1の電子メディエータ20、補酵素脱水素酵素30および第2の電子メディエータ40が固定されており、基質側(基質溶液側)の第2層には、基質脱水素酵素10が固定されている。図2は、こうした各酵素および電子メディエータ等が電極上に固定される酵素電極の一例についてその積層構造を模式的に示したものであり、次に、同図2を参照してその電極構造を詳細に説明する。   Here, in the enzyme electrode according to this embodiment, as described above, each enzyme, each electron mediator, and the like are stacked and fixed on the electrode 50. Specifically, the first electron mediator 20, the coenzyme dehydrogenase 30 and the second electron mediator 40 are fixed to the first layer which is the lower layer on the surface side of the electrode 50, and the substrate side (substrate solution) The substrate dehydrogenase 10 is fixed to the second layer on the side). FIG. 2 schematically shows a laminated structure of an example of an enzyme electrode in which each of these enzymes, electron mediators, and the like are fixed on the electrode. Next, referring to FIG. This will be described in detail.

同図2に示されるように、この酵素電極は、電極50上に固定される各酵素および電子メディエータが2層に積層固定される構造からなる。ちなみにこの酵素電極では、例えばグルコースを基質Subとしている。また、上記基質脱水素酵素10としてはグルコース脱水素酵素11を、第1の電子メディエータ20としてはNAD+21を、上記補酵素脱水素酵素30としてはジアホラーゼ31を、上記第2の電子メディエータ40としてはOs錯体41をそれぞれ用いている。そして、これら各酵素および電子メディエータが、例えばカーボンペーパーからなる電極50上に2層に積層固定されている。具体的には、電極50表面上の第1層には、NAD+21、ジアホラーゼ31およびOs錯体41が固定されており、この第1層の上層で基質溶液側にあたる第2層には、グルコース脱水素酵素11が固定されている。   As shown in FIG. 2, the enzyme electrode has a structure in which each enzyme and electron mediator fixed on the electrode 50 are stacked and fixed in two layers. Incidentally, in this enzyme electrode, for example, glucose is used as a substrate Sub. The substrate dehydrogenase 10 is glucose dehydrogenase 11, the first electron mediator 20 is NAD + 21, the coenzyme dehydrogenase 30 is diaphorase 31, and the second electron mediator 40 is. Each of the Os complexes 41 is used. Each of these enzymes and electron mediators are laminated and fixed in two layers on an electrode 50 made of, for example, carbon paper. Specifically, NAD + 21, diaphorase 31 and Os complex 41 are fixed to the first layer on the surface of the electrode 50, and glucose dehydrogenation is formed on the second layer on the substrate solution side above this first layer. Enzyme 11 is immobilized.

このうち、第1層では、上記NAD+21、ジアホラーゼ31およびOs錯体41が、例えばPEGDGE(ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル)61等の架橋剤により上記電極50表面上に固定されている。このPEGDGE61はエポキシ基を有する架橋剤であり、その開環付加反応により、上記NAD+21、ジアホラーゼ31およびOs錯体41の有するアミノ基と結合することで架橋構造を形成する。   Among these, in the first layer, the NAD + 21, diaphorase 31 and Os complex 41 are fixed on the surface of the electrode 50 by a cross-linking agent such as PEGDGE (polyethylene glycol diglycidyl ether) 61. This PEGDGE 61 is a cross-linking agent having an epoxy group, and forms a cross-linked structure by binding to the amino group of the NAD + 21, diaphorase 31 and Os complex 41 by a ring-opening addition reaction.

一方、第2層では、上記グルコース脱水素酵素11が、GA(グルタルアルデヒド)71等の架橋剤およびPLL(ポリ−L−リシン)72等の水溶性担体により固定されている。このうちGA71は、2つのアルデヒド基を有する架橋剤であり、少なくとも1つのアミノ基を有する物質同士を架橋させることが可能である。これにより、グルコース脱水素酵素11の有するアミノ基とアミド結合することで架橋構造を形成する。また、PLL72はα−アミノ酸の一種であって、側鎖に1級アミノ酸を有する水溶性担体である。しかもこのPLL72は、陽電荷が豊富であるため、グルコース脱水素酵素11との間でイオン結合を生成して3次元構造のポリマー鎖を形成する。そして、第2層にこうしたPLL72による3次元構造が形成されることで、上記電極50上に固定されるグルコース脱水素酵素11の酵素担持量が増大して、その量的な保持能力の向上が図られるようになるとともに、GA71による架橋構造が形成されることで、上記グルコース脱水素酵素11が電極50上に安定に固定されるようになる。しかも、グルコース脱水素酵素11がこのように基質溶液側の第2層に固定されることで、同酵素11と基質との反応性も確保されるようになる。   On the other hand, in the second layer, the glucose dehydrogenase 11 is fixed by a crosslinking agent such as GA (glutaraldehyde) 71 and a water-soluble carrier such as PLL (poly-L-lysine) 72. Among these, GA71 is a crosslinking agent having two aldehyde groups, and can crosslink substances having at least one amino group. Thus, a cross-linked structure is formed by amide bond with the amino group of glucose dehydrogenase 11. PLL72 is a kind of α-amino acid and is a water-soluble carrier having a primary amino acid in the side chain. Moreover, since the PLL 72 is rich in positive charges, it generates an ionic bond with the glucose dehydrogenase 11 to form a three-dimensional polymer chain. Then, by forming such a three-dimensional structure by the PLL 72 in the second layer, the amount of the enzyme desorbing the glucose dehydrogenase 11 immobilized on the electrode 50 is increased, and the quantitative retention capacity is improved. As shown in the figure, the glucose dehydrogenase 11 is stably immobilized on the electrode 50 by forming a cross-linked structure by GA71. In addition, since the glucose dehydrogenase 11 is thus fixed to the second layer on the substrate solution side, the reactivity between the enzyme 11 and the substrate is also ensured.

ここで、上述のように第1層においては、NAD+21がPEGDGE61により電極上に固定されるが、その全量が架橋構造を形成して固定されないことが好ましい。具体的には、第1層に固定されるNAD+21、ジアホラーゼ31およびOs錯体41の総モル数に対して、PEGDGE61が20〜50倍の量だけ含有されていることが好ましい。これにより、上記NAD+21の大部分はPEGDGE61により架橋されて第1層に固定されることとなるが、同NAD+21の一部は架橋されず、第1層だけでなく第2層にも取り込まれるようになる。そして、このNAD+21が第2層、特に上述したPLL72からなるポリマー鎖内にとりこまれることで、基質溶液への溶出が防止されるとともに、同第2層に固定されているグルコース脱水素酵素11との電子伝達が円滑に図られるようになる。これにより、グルコース脱水素酵素11による高い酵素基質反応が確保されつつ、上記基質Subからグルコース脱水素酵素11、NAD+21、ジアホラーゼ31、Os錯体41を介して電極50への電子伝達が円滑に進行し、基質酸化電流の増加が図られるようになる。ちなみに、ここで用いられるPEGDGE61の量が上記総モル数に対して20倍未満である場合には、上記NAD+21と架橋される架橋剤としての量が不十分であるため、同NAD+21が基質溶液側の層を介して基質溶液中に溶出する懸念がある。そしてこの場合には、酵素電極としての出力低下も避けられない。一方、上記PEGDGE61の量が上記総モル数に対して50倍を超える場合には、上記NAD+21の全量がPEGDGE61により架橋されて電極50表面側の層に固定されるようになる。このため、基質溶液側の層に固定されるグルコース脱水素酵素11からNAD+21への電子伝達が進行しにくくなり、ひいてはグルコース脱水素酵素11による酵素基質反応も進行しにくくなる。   Here, as described above, in the first layer, NAD + 21 is fixed on the electrode by PEGDGE 61, but it is preferable that the entire amount forms a cross-linked structure and is not fixed. Specifically, it is preferable that PEGDGE61 is contained in an amount 20 to 50 times the total number of moles of NAD + 21, diaphorase 31 and Os complex 41 immobilized on the first layer. As a result, most of the NAD + 21 is cross-linked by the PEGDGE 61 and fixed to the first layer, but a part of the NAD + 21 is not cross-linked and is taken into the second layer as well as the first layer. become. The NAD + 21 is incorporated into the second layer, particularly the polymer chain composed of the above-described PLL 72, so that elution into the substrate solution is prevented and the glucose dehydrogenase 11 immobilized on the second layer Can be smoothly transmitted. Thereby, electron transfer from the substrate Sub to the electrode 50 through the glucose dehydrogenase 11, NAD + 21, diaphorase 31, and Os complex 41 proceeds smoothly while ensuring a high enzyme substrate reaction by the glucose dehydrogenase 11. As a result, the substrate oxidation current is increased. Incidentally, when the amount of PEGDGE61 used here is less than 20 times the total number of moles, the amount of NAD + 21 as a cross-linking agent that is cross-linked with NAD + 21 is insufficient. There is a concern that it elutes into the substrate solution through the layer. In this case, a decrease in output as an enzyme electrode is inevitable. On the other hand, when the amount of PEGDGE61 exceeds 50 times the total number of moles, the total amount of NAD + 21 is cross-linked by PEGDGE61 and fixed to the layer on the surface side of the electrode 50. For this reason, the electron transfer from the glucose dehydrogenase 11 fixed to the layer on the substrate solution side to the NAD + 21 does not proceed easily, and hence the enzyme substrate reaction by the glucose dehydrogenase 11 also does not proceed easily.

なお、上記第1層において、NAD+21、ジアホラーゼ31およびOs錯体41の固定に用いられる架橋剤としては、PEGDGE61の他にも1つ以上のエポキシ基を有するものであれば用いることができる。   In the first layer, as the cross-linking agent used for fixing NAD + 21, diaphorase 31, and Os complex 41, any one having one or more epoxy groups in addition to PEGDGE61 can be used.

また、上記第2層において、グルコース脱水素酵素11の固定に用いられる架橋剤としては、GA71の他にも、上記グルコース脱水素酵素11との架橋反応が可能である官能基を1つ以上有するものであれば同様に用いることができ、例えばEDC(1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩)等を用いることもできる。このEDCは、特にアミノ基とカルボキシル基を有する物質の架橋剤として利用することができる。   In the second layer, the cross-linking agent used for immobilizing glucose dehydrogenase 11 has one or more functional groups capable of a cross-linking reaction with glucose dehydrogenase 11 in addition to GA71. Any material can be used in the same manner. For example, EDC (1-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) can be used. This EDC can be used as a crosslinking agent for a substance having an amino group and a carboxyl group.

以上説明したように、この実施の形態にかかる酵素電極によれば、以下に列記するような効果が得られるようになる。
(1)カーボンペーパーからなる電極50上に、グルコースを酸化するグルコース脱水素酵素11と、同酵素11の補酵素であるNAD+21と、同NAD+21を酸化するジアホラーゼ31と、同ジアホラーゼ31を酸化するOs錯体41とを、2層に積層固定することとした。具体的には、電極50表面側となる第1層にNAD+21、ジアホラーゼ31およびOs錯体41を固定し、基質溶液側となる第2層にグルコース脱水素酵素11を固定することとした。これにより、上記グルコース脱水素酵素11の高い基質反応性を確保されるとともに、上記NAD+21、ジアホラーゼ31およびOs錯体41をグルコース脱水素酵素11よりも電極50表面側に固定したことで、これらから電極50への電子伝達が円滑に実現され、酵素電極としての出力向上が図られるようになる。
As described above, according to the enzyme electrode of this embodiment, the effects listed below can be obtained.
(1) On the electrode 50 made of carbon paper, glucose dehydrogenase 11 that oxidizes glucose, NAD + 21 that is a coenzyme of the enzyme 11, diaphorase 31 that oxidizes the NAD + 21, and Os that oxidizes the diaphorase 31 The complex 41 was fixed in two layers. Specifically, NAD + 21, diaphorase 31 and Os complex 41 were fixed to the first layer on the surface side of the electrode 50, and glucose dehydrogenase 11 was fixed to the second layer on the substrate solution side. As a result, high substrate reactivity of the glucose dehydrogenase 11 is ensured, and the NAD + 21, diaphorase 31 and Os complex 41 are fixed to the surface of the electrode 50 relative to the glucose dehydrogenase 11, so that Electron transfer to 50 is smoothly realized, and the output as an enzyme electrode is improved.

(2)NAD+21、ジアホラーゼ31およびOs錯体41は、エポキシ基を有する架橋剤であるPEGDGE61によって電極50の表面に固定されることとした。これにより、PEGDGE61の有する2個のエポキシ基の開環付加反応により、これらNAD+21、ジアホラーゼ31およびOs錯体41の有するアミノ基との間にアミド結合が生成されるとともに、これら各分子間で架橋構造を形成して3次元構造をとることも可能となり、それらの電極50上での固定がより安定に実現されるようになる。   (2) NAD + 21, diaphorase 31 and Os complex 41 are fixed to the surface of the electrode 50 by PEGDGE61 which is a crosslinking agent having an epoxy group. Thereby, an amide bond is formed between these NAD + 21, diaphorase 31 and the amino group of Os complex 41 by the ring-opening addition reaction of two epoxy groups of PEGDGE61, and a cross-linked structure between these molecules. It is also possible to form a three-dimensional structure, and the fixation on the electrodes 50 can be realized more stably.

(3)PEGDGE61は、NAD+21、ジアホラーゼ31およびOs錯体41の総モル数に対して20〜50倍の量だけ用いることとした。これにより、上記NAD+21の全量がPEGDGE61により架橋されて第2層に固定されることなく、架橋されないNAD+21が第2層にも存在可能となる。これにより、グルコース脱水素酵素11からNAD+21への電子伝達が円滑に実現されるようになる。   (3) PEGDGE 61 was used in an amount of 20 to 50 times the total number of moles of NAD + 21, diaphorase 31 and Os complex 41. As a result, the entire amount of NAD + 21 is cross-linked by PEGDGE 61 and is not fixed to the second layer, and non-cross-linked NAD + 21 can also be present in the second layer. Thereby, the electron transfer from glucose dehydrogenase 11 to NAD + 21 can be realized smoothly.

(4)グルコース脱水素酵素11は、架橋剤であるGA71および水溶性担体であるPLL72により電極50上に固定されることとした。これにより、グルコース脱水素酵素11とGA71との架橋構造が形成されることで、電極50に固定される酵素安定性の向上が図られるとともに、PLL72とのイオン結合による3次元構造が形成されることで、上記酵素11の担持量の増加が図られるようになる。   (4) The glucose dehydrogenase 11 is fixed on the electrode 50 by GA71 as a cross-linking agent and PLL72 as a water-soluble carrier. As a result, a cross-linked structure between glucose dehydrogenase 11 and GA 71 is formed, whereby the stability of the enzyme fixed to electrode 50 is improved, and a three-dimensional structure is formed by ionic bonding with PLL 72. As a result, the amount of the enzyme 11 supported can be increased.

(第2の実施の形態)
次に、この発明にかかる酵素電極の第2の実施の形態について、図3を参照して説明する。この実施の形態にかかる酵素電極も、酵素電極としての基本的な電子伝達態様は先の第1の実施の形態と同様であるが、電極に固定される各酵素および電子メディエータの層構造が異なる。
(Second Embodiment)
Next, a second embodiment of the enzyme electrode according to the present invention will be described with reference to FIG. The enzyme electrode according to this embodiment is the same as the first embodiment in the basic electron transfer mode as an enzyme electrode, but the layer structure of each enzyme and electron mediator fixed to the electrode is different. .

すなわち、第1の実施の形態では、電極に固定される各酵素および電子メディエータが2層に積層固定されることとしたが、この第2の実施の形態では、3層に積層固定されるようにしている。具体的には、電極50表面上の最下層である第1層には、ジアホラーゼ31およびOs錯体41が固定されており、同第1層の上層である第2層にはNAD+21が固定されており、同第2層の上層でありもっとも基質溶液側の第3層にはグルコース脱水素酵素11が固定されている。このうち第1層では、上記ジアホラーゼ31およびOs錯体41が、例えばPEGDGE61等の架橋剤により上記電極50表面上に固定されている。また第2層では、上記NAD+2がGA71等の架橋剤およびPLL72等の水溶性担体により固定されており、さらに第3層でも、上記グルコース脱水素酵素11が第2層と同様にGA71等の架橋剤およびPLL72等の水溶性担体により固定されている。   That is, in the first embodiment, each enzyme and electron mediator fixed to the electrode is stacked and fixed in two layers, but in this second embodiment, it is fixed and stacked in three layers. I have to. Specifically, diaphorase 31 and Os complex 41 are fixed to the first layer which is the lowest layer on the surface of the electrode 50, and NAD + 21 is fixed to the second layer which is the upper layer of the first layer. The glucose dehydrogenase 11 is immobilized on the upper layer of the second layer and the third layer closest to the substrate solution. Among them, in the first layer, the diaphorase 31 and the Os complex 41 are fixed on the surface of the electrode 50 by a crosslinking agent such as PEGDGE61. In the second layer, the NAD + 2 is fixed by a cross-linking agent such as GA71 and a water-soluble carrier such as PLL72. In the third layer, the glucose dehydrogenase 11 is cross-linked such as GA71 as in the second layer. And a water-soluble carrier such as PLL72.

そして、この実施の形態にかかる酵素電極でも、先の第1の実施の形態と同様、グルコース脱水素酵素11がもっとも基質溶液側にあたる第3層に固定されることで、同酵素11と基質との反応性が確保されている。さらにこの実施の形態にかかる酵素電極では、NAD+21よりもジアホラーゼ31およびOs錯体41が電極表面側の第1層に固定されることで、グルコース脱水素酵素11からNAD+21への電子伝達、並びにNAD+21からジアホラーゼ31およびOs錯体41への電子伝達が順次円滑に行われるようになる。   And also in the enzyme electrode concerning this embodiment, glucose dehydrogenase 11 is fixed to the 3rd layer which is the most substrate solution side similarly to previous 1st Embodiment, By this enzyme 11 and a substrate, The reactivity of is secured. Furthermore, in the enzyme electrode according to this embodiment, diaphorase 31 and Os complex 41 are fixed to the first layer on the electrode surface side relative to NAD + 21, so that electron transfer from glucose dehydrogenase 11 to NAD + 21 and NAD + 21 Electron transfer to the diaphorase 31 and the Os complex 41 is performed smoothly in sequence.

このように、酵素電極に使用される酵素や電子メディエータ等の数によっては、各酵素および電子メディエータが固定される層を2層から3層に増加させてもよく、酵素と基質との反応特性を考慮しつつ基質から電極への電子伝達を円滑に進行させることで、基質酸化電流の向上および電極安定性の向上を図ることができる。   Thus, depending on the number of enzymes and electron mediators used in the enzyme electrode, the number of layers to which each enzyme and electron mediator is fixed may be increased from two to three, and the reaction characteristics between the enzyme and the substrate. It is possible to improve the substrate oxidation current and the electrode stability by allowing the electron transfer from the substrate to the electrode to proceed smoothly while considering the above.

以上説明したように、この第2の実施の形態にかかる酵素電極によっても、先の第1の実施の形態による前記(1)〜(4)の効果と同等、もしくはそれに準じた効果が得られるようになる。   As described above, the enzyme electrode according to the second embodiment can obtain the same or similar effects as the effects (1) to (4) according to the first embodiment. It becomes like this.

以下に、実施例を挙げてこの発明を具体的に説明する。ただし、下記の実施例はこの発明を例示するだけであって、この発明の範囲を限定するものではない。
(酵素電極のグルコース酸化能の評価)
グルコース脱水素酵素、NAD+、ジアホラーゼおよびOs錯体を使用した酵素電極を3電極式の電気化学セルに用いることにより、上記酵素電極のグルコース酸化能の評価を行った。
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples. However, the following examples only illustrate the present invention and do not limit the scope of the present invention.
(Evaluation of glucose oxidation ability of enzyme electrode)
The enzyme electrode using glucose dehydrogenase, NAD +, diaphorase and Os complex was used in a three-electrode electrochemical cell to evaluate the glucose oxidizing ability of the enzyme electrode.

まず、直径5[mm]にくりぬいたカーボンペーパー、またはカーボンブラックを塗布したカーボンペーパー電極上に、Os錯体である15[mg/mL(ミリグラム/ミリリットル)]のPVI[Os(dpa)Cl]が1.5[μL(マイクロリットル)]、20[μM(マイクロモル/リットル)]のジアホラーゼが3[μL]、0.1[M]のNAD+が2.5[μL]、および100[mg/mL]のPEGDGEが5[μL]からなる混合液を塗布し、遮光状態にて30[℃]で6時間反応させることで電極表面上に第1層を形成した。次いで、この第1層の上面に1.9[mM]のグルコース脱水素酵素が5[μL]、1%のPLLが5[μL]、および0.125[%]のGAが5[μL]からなる混合液を塗布し、これを遮光状態にて室温で乾燥させることで基質溶液側の第2層を形成した。これにより、先の図2に示されるように、電極上に各酵素および電子メディエータ等が2層に積層固定された酵素電極E1を得た。次に、この酵素電極E1を3電極式の電気化学測定セルに用いた。具体的には、反応槽として5[mL(ミリリットル)]容量のパイレックスガラス(登録商標)製電解セルを用い、この反応槽にリン酸ナトリウムバッファおよび塩化カリウム溶液を注入した。そして、上記酵素電極E1を作用電極として上記反応槽に浸し、参照電極に銀/塩化銀電極、対極に白金電極を用いて、−0.2〜0.4[V(vs銀/塩化銀電極)]の間でサイクリックボルタンメトリ(CV、電位走査法)およびクロノアンペロメトリにて電位掃引した。なお、上記反応槽にはグルコースを添加し、その添加前後におけるCV測定を行った。 First, 15 [mg / mL (milligram / milliliter)] PVI [Os (dpa) 2 Cl] which is an Os complex is formed on a carbon paper electrode coated with carbon paper or carbon black having a diameter of 5 [mm]. 1.5 [μL (microliter)], 20 [μM (micromol / liter)] diaphorase 3 [μL], 0.1 [M] NAD + 2.5 [μL], and 100 [mg / ML] PEGDGE mixed solution consisting of 5 [μL] was applied and reacted at 30 [° C.] for 6 hours in a light-shielded state to form a first layer on the electrode surface. Next, 1.9 [mM] glucose dehydrogenase is 5 [μL], 1% PLL is 5 [μL], and 0.125 [%] GA is 5 [μL] on the upper surface of the first layer. The mixed solution consisting of was applied and dried at room temperature in a light-shielded state to form a second layer on the substrate solution side. As a result, as shown in FIG. 2, an enzyme electrode E1 was obtained in which each enzyme, electron mediator, and the like were laminated and fixed in two layers on the electrode. Next, this enzyme electrode E1 was used in a three-electrode electrochemical measurement cell. Specifically, a 5 [mL (milliliter)] capacity Pyrex glass (registered trademark) electrolytic cell was used as a reaction tank, and a sodium phosphate buffer and a potassium chloride solution were injected into the reaction tank. Then, the enzyme electrode E1 is immersed in the reaction vessel as a working electrode, and a silver / silver chloride electrode is used as a reference electrode and a platinum electrode is used as a counter electrode, and −0.2 to 0.4 [V (vs silver / silver chloride electrode). )], The potential was swept by cyclic voltammetry (CV, potential scanning method) and chronoamperometry. In addition, glucose was added to the said reaction tank, and CV measurement before and after the addition was performed.

図4は、このCV測定の結果を示したものであり、グルコース添加後のCV曲線を実線で、グルコース添加前のCV曲線を二点鎖線でそれぞれ示している。ここで、グルコース添加後のCV曲線(実線)は、作用電極の電位を順方向に掃引したときの酸化電流曲線L1および逆方向に掃引したときの還元電流曲線L2からなり、グルコース添加前のCV曲線(二点鎖線)は、同様に酸化電流曲線L3および還元電流曲線L4からなっている。同図4に示されるように、基質としてグルコースが添加されることで、酵素電極E1の酸化電流が大きく増加し、最大で約0.5345[mA/cm(ミリアンペア/平方センチメートル)]の酸化電流が確認されている。 FIG. 4 shows the results of this CV measurement, with the CV curve after addition of glucose indicated by a solid line and the CV curve before addition of glucose indicated by a two-dot chain line. Here, the CV curve after addition of glucose (solid line) includes an oxidation current curve L1 when the potential of the working electrode is swept in the forward direction and a reduction current curve L2 when the potential is swept in the reverse direction. The curve (two-dot chain line) is similarly composed of an oxidation current curve L3 and a reduction current curve L4. As shown in FIG. 4, the addition of glucose as a substrate greatly increases the oxidation current of the enzyme electrode E1, and the maximum oxidation current is about 0.5345 [mA / cm 2 (milliampere / square centimeter)]. Has been confirmed.

次に、同様にして、電極表面上にOs錯体、ジアホラーゼおよびPEGDGEを固定した第1層を形成し、その上層にPLL、GAおよびNAD+を固定した第2層を形成し、さらに、その上層にPLL、GAおよびグルコース脱水素酵素を固定した第3層を形成することで、先の図3に示されるように、電極上に各酵素および電子メディエータ等が3層に積層固定された酵素電極E2を得た。   Next, similarly, a first layer in which Os complex, diaphorase and PEGDGE are immobilized is formed on the electrode surface, a second layer in which PLL, GA and NAD + are immobilized is formed on the upper layer, and further on the upper layer. By forming a third layer in which PLL, GA, and glucose dehydrogenase are immobilized, as shown in FIG. 3, the enzyme electrode E2 in which each enzyme, electron mediator, and the like are laminated and immobilized in three layers on the electrode. Got.

また、この実施の形態にかかる酵素電極E1およびE2と、そのグルコース酸化能を比較するための比較例として、図5および図6に示すような電極構造を有する酵素電極E3およびE4を作製した。このうち、酵素電極E3は、図5に示されるように、電極50表面上に、グルコース脱水素酵素11、ジアホラーゼ31、およびOs錯体41をPEGDGE61により固定して第1層を形成し、その上層にNAD+21をGA71およびPLL72により固定して第2層を形成したものである。この酵素電極E3は、上記酵素電極E2と同様に、各酵素および電子メディエータ等が2層に積層固定されている酵素電極であるが、グルコース脱水素酵素11が電極表面側の第1層に固定され、NAD+21が同酵素11よりも基質溶液側の第2層に固定されている点が異なっている。一方、酵素電極E4は、図6に示されるように、電極50上に、グルコース脱水素酵素11、NAD+21、ジアホラーゼ31、およびOs錯体41を、PEGDGE61によって全て同一の層(第1層)に固定したものである。なお、これら酵素電極E1〜E4の電極構成の一覧を図7に示している。   In addition, enzyme electrodes E3 and E4 having electrode structures as shown in FIGS. 5 and 6 were produced as comparative examples for comparing the glucose oxidizing ability with the enzyme electrodes E1 and E2 according to this embodiment. Among them, as shown in FIG. 5, the enzyme electrode E3 forms a first layer on the surface of the electrode 50 by fixing glucose dehydrogenase 11, diaphorase 31, and Os complex 41 with PEGDGE61. NAD + 21 is fixed by GA71 and PLL72, and the second layer is formed. Like the enzyme electrode E2, the enzyme electrode E3 is an enzyme electrode in which each enzyme, electron mediator, and the like are laminated and fixed in two layers, but the glucose dehydrogenase 11 is fixed to the first layer on the electrode surface side. The difference is that NAD + 21 is fixed to the second layer on the substrate solution side of the enzyme 11. On the other hand, as shown in FIG. 6, the enzyme electrode E4 has glucose dehydrogenase 11, NAD + 21, diaphorase 31, and Os complex 41 fixed on the same layer (first layer) by PEGDGE 61 on the electrode 50. It is a thing. A list of electrode configurations of the enzyme electrodes E1 to E4 is shown in FIG.

図8は、これら酵素電極E1〜E4を用いて上述した条件と同一条件下でCV測定を行い、得られたグルコース酸化電流の最大値をそれぞれ示したものである。同図8に示されるように、グルコース脱水素酵素11を基質溶液側の層に固定し、かつ各酵素および電子メディエータ等が2層あるいは3層に積層固定されている酵素電極E1およびE2では、これらを1層に固定した酵素電極E4よりも大きな酸化電流が得られることがわかる。また、2層構造からなる酵素電極E1と酵素電極E3とを比較すると、グルコース脱水素酵素11とその補酵素であるNAD+21との固定位置の違いにより、酵素電極E1では酵素電極E3の約2倍近くの大きな酸化電流が得られている。このように、電極50上に固定されるグルコース脱水素酵素11を基質溶液側の層に固定することで同酵素11と基質との基質反応性が向上し、また、NAD+21、ジアホラーゼ31およびOs錯体41等を同酵素11よりも電極50表面側の層に固定することで、これら各酵素および電子メディエータから電極50への電子伝達がより円滑に進行することが確認された。   FIG. 8 shows the maximum value of the glucose oxidation current obtained by performing CV measurement under the same conditions as described above using these enzyme electrodes E1 to E4. As shown in FIG. 8, in the enzyme electrodes E1 and E2 in which glucose dehydrogenase 11 is fixed to the layer on the substrate solution side and each enzyme and electron mediator and the like are fixed in two or three layers, It can be seen that an oxidation current larger than that of the enzyme electrode E4 in which these are fixed in one layer can be obtained. Further, when the enzyme electrode E1 and the enzyme electrode E3 having a two-layer structure are compared, the enzyme electrode E1 is about twice as large as the enzyme electrode E3 due to the difference in the fixing position between the glucose dehydrogenase 11 and its coenzyme NAD + 21. A nearby large oxidation current is obtained. Thus, the substrate reactivity between the enzyme 11 and the substrate is improved by fixing the glucose dehydrogenase 11 immobilized on the electrode 50 to the layer on the substrate solution side, and NAD + 21, diaphorase 31 and the Os complex. It was confirmed that the transfer of electrons from these enzymes and electron mediators to the electrode 50 proceeded more smoothly by fixing 41 etc. to the layer on the surface side of the electrode 50 relative to the enzyme 11.

(その他の実施の形態)
なお、この発明にかかる酵素電極は、上記各実施の形態として示した構成に限らず、これらを適宜変更した、以下の態様にて実施することもできる。
(Other embodiments)
In addition, the enzyme electrode concerning this invention is not restricted to the structure shown as said each embodiment, It can also implement in the following aspects which changed these suitably.

・上記各実施の形態では、グルコース脱水素酵素11を架橋剤であるGA71との架橋構造および水溶性担体であるPLL72による3次元構造を通じて電極50上に固定することとしたが、一般に、基質脱水素酵素10の固定に用いられる架橋剤の有効性は、酵素電極に採用される同基質脱水素酵素10の種類によって有効か否かが異なる。例えば、基質脱水素酵素10としてアルコール脱水素酵素を用いる場合には、架橋剤としてGA71を用いると同脱水素酵素の失活が起こり、酵素電極としての出力が低下することが発明者らによって確認されている。このため、こうした基質脱水素酵素10と架橋剤および水溶性担体との反応性に応じて、上記基質脱水素酵素10の固定には架橋剤および水溶性担体のうちの一方を用いるようにしてもよいし、上記電極50上への十分な酵素固定が可能であればこれらの使用を割愛するようにしてもよい。   In each of the above embodiments, glucose dehydrogenase 11 is immobilized on electrode 50 through a cross-linking structure with GA 71 as a cross-linking agent and a three-dimensional structure with PLL 72 as a water-soluble carrier. The effectiveness of the crosslinking agent used for fixing the enzyme 10 depends on the type of the substrate dehydrogenase 10 employed in the enzyme electrode. For example, when alcohol dehydrogenase is used as the substrate dehydrogenase 10, the inventors have confirmed that when GA71 is used as a cross-linking agent, the dehydrogenase is deactivated and the output as an enzyme electrode is reduced. Has been. Therefore, depending on the reactivity of the substrate dehydrogenase 10 with the crosslinking agent and the water-soluble carrier, one of the crosslinking agent and the water-soluble carrier may be used for fixing the substrate dehydrogenase 10. Alternatively, if sufficient enzyme immobilization on the electrode 50 is possible, the use of these may be omitted.

・上記各実施の形態では、グルコースを基質Subとする酵素電極について例示し、基質脱水素酵素10としてグルコース脱水素酵素11を用いることとした。これに代えて、基質Subにメタノールやエタノールなどのアルコールを使用する場合には、基質脱水素酵素10としてもアルコール脱水素酵素に加えてアルデヒド脱水素酵素を利用することができる。そしてこの場合には、酵素電極を3層構造として、アルコール脱水素酵素を基質溶液側の第3層に、またアルデヒド脱水素酵素を第2層に、さらにNAD+を第1層に固定するようにしてもよい。このように、基質Subを酸化する基質脱水素酵素10を複数用いるようにしてもよく、また採用する基質脱水素酵素10と基質Subとの反応性を考慮して同酵素10を固定する層を適宜選択し、それらを電極50上の異なる層に固定するようにしてもよい。   In each of the above embodiments, the enzyme electrode using glucose as the substrate Sub is illustrated, and the glucose dehydrogenase 11 is used as the substrate dehydrogenase 10. Alternatively, when an alcohol such as methanol or ethanol is used for the substrate Sub, an aldehyde dehydrogenase can be used as the substrate dehydrogenase 10 in addition to the alcohol dehydrogenase. In this case, the enzyme electrode has a three-layer structure, alcohol dehydrogenase is fixed to the third layer on the substrate solution side, aldehyde dehydrogenase is fixed to the second layer, and NAD + is fixed to the first layer. May be. In this way, a plurality of substrate dehydrogenases 10 that oxidize the substrate Sub may be used, and a layer for immobilizing the enzyme 10 in consideration of the reactivity between the substrate dehydrogenase 10 and the substrate Sub to be employed is provided. They may be selected as appropriate and fixed to different layers on the electrode 50.

・上記各実施の形態では、電極50上に各酵素および電子メディエータを2層あるいは3層に積層固定する酵素電極について例示したが、これら電極50上に固定する酵素および電子メディエータやその種類によっては、4層以上の積層構造とすることも可能である。要は、酵素の基質反応性を確保しつつ、同酵素から電極への電子伝達反応を円滑に進行させることのできる構造であればよい。   In each of the above embodiments, the enzyme electrode in which each enzyme and electron mediator is laminated and fixed in two or three layers on the electrode 50 is exemplified. However, depending on the enzyme and electron mediator to be fixed on these electrodes 50 and the type thereof, It is also possible to have a stacked structure of four or more layers. In short, any structure may be used as long as the electron transfer reaction from the enzyme to the electrode can smoothly proceed while ensuring the substrate reactivity of the enzyme.

・上記各実施の形態では、基質Subから引き抜かれた電子が、基質脱水素酵素10、第1の電子メディエータ20、補酵素脱水素酵素30、および第2の電子メディエータ40を介して電極50に伝達されることとしたが、基質脱水素酵素10から電極への電子伝達態様は上記の例に限られない。すなわち、上記第1の電子メディエータ20、補酵素脱水素酵素30、および第2の電子メディエータ40に相当する機能を一つの電子メディエータにて担保することができ、上記基質脱水素酵素10からこの一つの電子メディエータを介して電極50に直接電子伝達が可能であれば、電極50上にこれらを積層固定する電極構造を採用することもできる。要は、特定の基質を酸化する基質脱水素酵素および該基質脱水素酵素を酸化して電極への電子伝達を補助する電子メディエータが、上記電子メディエータを下層として電極上にそれぞれ層状に積層固定される構造であればよい。このような構造であれ、上記基質脱水素酵素による高い基質反応性が確保されるとともに、上記電子メディエータを上記基質脱水素酵素よりも電極表面側に固定することにより、電子メディエータから電極への電子伝達が円滑に実現され、酵素電極としての出力向上が図られるようになる。   In each of the above embodiments, the electrons extracted from the substrate Sub are transferred to the electrode 50 via the substrate dehydrogenase 10, the first electron mediator 20, the coenzyme dehydrogenase 30, and the second electron mediator 40. However, the mode of electron transfer from the substrate dehydrogenase 10 to the electrode is not limited to the above example. That is, the functions corresponding to the first electron mediator 20, the coenzyme dehydrogenase 30, and the second electron mediator 40 can be secured by one electron mediator. If it is possible to transfer electrons directly to the electrode 50 via two electron mediators, an electrode structure in which these are stacked and fixed on the electrode 50 may be employed. In short, a substrate dehydrogenase that oxidizes a specific substrate and an electron mediator that oxidizes the substrate dehydrogenase and assists electron transfer to the electrode are laminated and fixed in layers on the electrode with the electron mediator as a lower layer. Any structure can be used. Even if it is such a structure, while high substrate reactivity by the said substrate dehydrogenase is ensured, the said electron mediator is fixed to the electrode surface side rather than the said substrate dehydrogenase, The electron from an electron mediator to an electrode Transmission is realized smoothly and the output as an enzyme electrode is improved.

この発明にかかる酵素電極の第1の実施の形態について、電子伝達態様を模式的に示す図。The figure which shows typically an electron transfer aspect about 1st Embodiment of the enzyme electrode concerning this invention. 同実施の形態にかかる酵素電極の積層構造を模式的に示す斜視図。The perspective view which shows typically the laminated structure of the enzyme electrode concerning the embodiment. この発明にかかる酵素電極の第2の実施の形態についてその積層構造を模式的に示す斜視図。The perspective view which shows typically the laminated structure about 2nd Embodiment of the enzyme electrode concerning this invention. この発明にかかる酵素電極の実施例についてグルコース添加前後におけるCV測定の結果を比較して示すグラフ。The graph which compares and shows the result of the CV measurement before and behind glucose addition about the Example of the enzyme electrode concerning this invention. この発明にかかる酵素電極の比較例としてその電極構造を模式的に示す斜視図。The perspective view which shows typically the electrode structure as a comparative example of the enzyme electrode concerning this invention. この発明にかかる酵素電極の比較例としてその電極構造を模式的に示す斜視図。The perspective view which shows typically the electrode structure as a comparative example of the enzyme electrode concerning this invention. この発明にかかる酵素電極の実施例および比較例の電極構成を一覧して示す図。The figure which lists and shows the electrode structure of the Example of an enzyme electrode concerning this invention, and a comparative example. この発明にかかる酵素電極の実施例および比較例についてグルコースを添加したときの最大酸化電流を一覧して示す図。The figure which lists and shows the maximum oxidation current when glucose is added about the Example and comparative example of the enzyme electrode concerning this invention.

符号の説明Explanation of symbols

10…基質脱水素酵素、11…グルコース脱水素酵素、20…第1の電子メディエータ、21…NAD+(酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)、30…補酵素脱水素酵素、31…ジアホラーゼ、40…第2の電子メディエータ、41…Os(オスミウム)錯体、50…電極、61…PEGDGE(ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル)、71…GA(グルタルアルデヒド)、72…PLL(ポリ−L−リシン)、Sub…基質。   DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 ... Substrate dehydrogenase, 11 ... Glucose dehydrogenase, 20 ... First electron mediator, 21 ... NAD + (oxidized nicotinamide adenine dinucleotide), 30 ... Coenzyme dehydrogenase, 31 ... Diaphorase, 40 ... First 2. Electron mediator of 2, 41 ... Os (osmium) complex, 50 ... electrode, 61 ... PEGDGE (polyethylene glycol diglycidyl ether), 71 ... GA (glutaraldehyde), 72 ... PLL (poly-L-lysine), Sub ... substrate .

Claims (9)

特定の基質を酸化する基質脱水素酵素および該基質脱水素酵素を酸化して電極への電子伝達を補助する電子メディエータが、前記電子メディエータを下層として電極上にそれぞれ層状に積層固定されてなる
ことを特徴とする酵素電極。
A substrate dehydrogenase that oxidizes a specific substrate and an electron mediator that oxidizes the substrate dehydrogenase and assists electron transfer to the electrode are laminated and fixed in layers on the electrode with the electron mediator as a lower layer. Enzyme electrode characterized by.
前記電子メディエータは、前記基質脱水素酵素の補酵素からなる第1の電子メディエータと、該第1の電子メディエータとなる補酵素を酸化する補酵素脱水素酵素と、該補酵素脱水素酵素を酸化して前記電極への電子伝達を補助する第2の電子メディエータとを備えてなる
請求項1に記載の酵素電極。
The electron mediator includes a first electron mediator comprising a coenzyme of the substrate dehydrogenase, a coenzyme dehydrogenase that oxidizes the coenzyme that is the first electron mediator, and an oxidizer that coenzyme dehydrogenase. The enzyme electrode according to claim 1, further comprising a second electron mediator that assists in electron transfer to the electrode.
前記第1の電子メディエータおよび前記補酵素脱水素酵素および前記第2の電子メディエータは、1つ以上のエポキシ基を有する架橋剤により固定されてなる
請求項2に記載の酵素電極。
The enzyme electrode according to claim 2, wherein the first electron mediator, the coenzyme dehydrogenase, and the second electron mediator are fixed by a crosslinking agent having one or more epoxy groups.
前記エポキシ基を有する架橋剤は、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテルからなる
請求項3に記載の酵素電極。
The enzyme electrode according to claim 3, wherein the crosslinking agent having an epoxy group is made of polyethylene glycol diglycidyl ether.
前記ポリエチレングリコールジグリシジルエーテルからなる架橋剤は、前記第1の電子メディエータおよび前記補酵素脱水素酵素および前記第2の電子メディエータの総モル数に対して20〜50倍の量だけ含有されてなる
請求項4に記載の酵素電極。
The crosslinking agent comprising polyethylene glycol diglycidyl ether is contained in an amount of 20 to 50 times the total number of moles of the first electron mediator, the coenzyme dehydrogenase, and the second electron mediator. The enzyme electrode according to claim 4.
前記補酵素脱水素酵素および前記第2の電子メディエータは、最下層として、前記第1の電子メディエータよりも前記電極の表面寄りの層に固定されてなる
請求項2〜5のいずれか一項に記載の酵素電極。
6. The coenzyme dehydrogenase and the second electron mediator are fixed to a layer closer to the surface of the electrode than the first electron mediator as a lowermost layer. 6. The enzyme electrode as described.
前記第1の電子メディエータは、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸のいずれかからなる
請求項2〜6のいずれか一項に記載の酵素電極。
The enzyme electrode according to any one of claims 2 to 6, wherein the first electron mediator is composed of any one of oxidized nicotinamide adenine dinucleotide and oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate.
前記基質脱水素酵素は、該基質脱水素酵素と架橋反応可能な官能基を有する架橋剤および水溶性担体の少なくとも一方により前記基質側の層に固定されてなる
請求項1〜7のいずれか一項に記載の酵素電極。
The substrate dehydrogenase is fixed to the substrate-side layer by at least one of a crosslinking agent having a functional group capable of undergoing a crosslinking reaction with the substrate dehydrogenase and a water-soluble carrier. The enzyme electrode according to Item.
前記水溶性担体は、アニオン性およびカチオン性の少なくとも一方の電荷を有する水溶性ポリマーからなる
請求項8に記載の酵素電極。
The enzyme electrode according to claim 8, wherein the water-soluble carrier comprises a water-soluble polymer having at least one of anionic and cationic charges.
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