JP2007217330A - New peptide - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新規なペプチドおよびその用途に関する。さらに詳しくは、本発明は、アミロイドβの沈着によって引き起こされる疾患の治療または予防に有効な化合物(薬物)を同定するために使用される新規なペプチド、および当該ペプチドを利用したアミロイドβ凝集（オリゴマー化）阻害剤のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a novel peptide and its use. More specifically, the present invention relates to a novel peptide used for identifying a compound (drug) effective for treating or preventing a disease caused by amyloid β deposition, and amyloid β aggregation (oligomer) using the peptide. The present invention relates to a screening method for inhibitors.
アミロイドβは、アルツハイマー病などのある種の神経疾患患者脳の神経細胞あるいは血管に沈着し、認知症などの症状を引き起こす原因物質とされている。アミロイドβは、正常脳でも恒常的に産生されている生理的なペプチドであるが、凝集・沈着を生じやすく、アルツハイマー病、ダウン症、高齢者の脳にみられる老人斑の主成分である。
アルツハイマー病は、例えば神経原繊維化、神経炎性プラーク、ニューロン萎縮、樹状突起剪定およびニューロン死を含めた種々の病状を特徴とする進行性神経変性疾患である。アミロイドβの線維化および沈着はアルツハイマー病に特異的であり、アルツハイマー病の他の症状に先行する。従ってアミロイドβの線維化抑制を指標としたアルツハイマー病治療剤の開発が進められているが、現在に至っても本疾患の根治療法を担う医薬品は得られていない。
Amyloid β is considered to be a causative substance that deposits on nerve cells or blood vessels in the brain of certain neurological patients such as Alzheimer's disease and causes symptoms such as dementia. Amyloid β is a physiological peptide that is constantly produced in the normal brain, but is prone to aggregation and deposition, and is the main component of senile plaques found in Alzheimer's disease, Down's syndrome, and the elderly's brain.
Alzheimer's disease is a progressive neurodegenerative disease characterized by various pathologies including, for example, neurofibrillization, neuritic plaques, neuronal atrophy, dendritic pruning and neuronal death. Fibrosis and deposition of amyloid β is specific for Alzheimer's disease and precedes other symptoms of Alzheimer's disease. Accordingly, development of a therapeutic agent for Alzheimer's disease using amyloid β fibrosis inhibition as an index has been underway, but no pharmaceuticals that can be used as a root treatment for this disease have been obtained.
アミロイドβの線維化には、その凝集の度合いによっていくつかの段階（種類）が存在する。すなわち、可溶性のものではモノマー、ダイマー、オリゴマー、そして不溶性のものでは沈着を伴うアミロイド繊維である。
近年、アミロイドβの毒性は、不溶性の繊維そのものよりも、むしろ可溶性のオリゴマーにあるという研究報告が集積されている。すなわちアミロイドβが毒性を発現するには凝集初期に形成される可溶性オリゴマーが重要であることが報告されている（非特許文献１および２を参照）。
Fibrosis of amyloid β has several stages (types) depending on the degree of aggregation. That is, monomers that are soluble are dimers, dimers, and oligomers, and those that are insoluble are amyloid fibers with deposition.
In recent years, research reports have accumulated that the toxicity of amyloid β is in soluble oligomers rather than insoluble fibers themselves. That is, it has been reported that soluble oligomers formed in the early stage of aggregation are important for amyloid β to exhibit toxicity (see Non-Patent Documents 1 and 2).
従ってアルツハイマー病のごく初期段階においてアミロイドβの凝集を阻害する物質（化合物）は、アルツハイマー病の根本治療剤として有効性が期待される。当該治療剤を同定するためには、凝集の最初のステップであるダイマー化、オリゴマー化を効率よく検出するスクリーニング系を構築する必要がある。
しかしながら、アルツハイマー病の初期段階である可溶性ダイマー、オリゴマーは従来より行われている不溶性の凝集物を特異的に認識する色素を用いる方法では検出が困難であった。たとえば、アミロイドの凝集度を測定するための一般的な方法においてチオフラビンＴアッセイが汎用されている。しかしながら、チオフラビンＴ法では可溶性のダイマー、オリゴマーの検出はできない。
Therefore, a substance (compound) that inhibits amyloid β aggregation in the very early stage of Alzheimer's disease is expected to be effective as a radical therapeutic agent for Alzheimer's disease. In order to identify the therapeutic agent, it is necessary to construct a screening system that efficiently detects the first step of aggregation, dimerization and oligomerization.
However, it has been difficult to detect soluble dimers and oligomers, which are the early stages of Alzheimer's disease, by conventional methods using a dye that specifically recognizes insoluble aggregates. For example, the thioflavin T assay is widely used in a general method for measuring the degree of aggregation of amyloid. However, soluble dimers and oligomers cannot be detected by the thioflavin T method.
近年、アミロイドβの第16位〜20位の配列であるKLVFF(配列番号：４）が結合部分となりアミロイドβの繊維が形成されることが明らかとなった(非特許文献３を参照）。その後、当該KLVFF（配列番号：４）は、アミロイドβ中のホモロガスな配列に結合すること、すなわちKLVFF（配列番号：４）はアミロイドβの自己会合配列であることが示された（非特許文献４を参照）。このような背景に基づき、近年、当該自己会合配列に結合する化合物をスクリーニングする方法が幾つか検討されている。例えば非特許文献５においては、Ac-KLVFFが固定化されたピンと、蛍光ラベルされたAβ(10-35)を使用したAβ凝集抑制アッセイ法が記載されているが、当該アッセイではアミロイドβの毒性の原因と考えられている可溶性アミロイドβの凝集阻害剤を効率よくスクリーニングすることはできない。一方、ＡＦＭ（原子間力顕微鏡）を使えばダイマー、オリゴマーを検出できるが、この技術は測定技術の熟練を要し、評価のスループットは低い。よって臨床診断や薬物スクリーニングの多くの検体を処理するプロトコルに不向きである。 In recent years, it has been clarified that KLVFF (SEQ ID NO: 4), which is a sequence of positions 16 to 20 of amyloid β, becomes a binding portion and amyloid β fibers are formed (see Non-Patent Document 3). Thereafter, it was shown that the KLVFF (SEQ ID NO: 4) binds to a homologous sequence in amyloid β, that is, KLVFF (SEQ ID NO: 4) is a self-association sequence of amyloid β (non-patent document). 4). Based on such a background, in recent years, several methods for screening for compounds that bind to the self-association sequence have been studied. For example, Non-Patent Document 5 describes an Aβ aggregation inhibition assay method using a pin on which Ac-KLVFF is immobilized and fluorescently labeled Aβ (10-35). In this assay, toxicity of amyloid β is described. It is not possible to screen efficiently for an aggregation inhibitor of soluble amyloid β, which is considered to be the cause of the above. On the other hand, if an AFM (atomic force microscope) is used, dimers and oligomers can be detected. However, this technique requires skill in measurement techniques, and the evaluation throughput is low. Therefore, it is not suitable for a protocol for processing many specimens for clinical diagnosis and drug screening.
また非特許文献６においては、2種類のＫＬＶＦＦ配列（配列番号：４）含有ペプチドをＹＮＧＫ配列（配列番号：９）リンカーペプチドで結合させたペプチドをＣＤスペクトル解析および電子顕微鏡を用いた観察手法を用いて繊維化の状態を評価している。しかしながらこの方法では評価のスループットが低い。さらにＣＤスペクトル解析法は測定感度が低く、10μＭ以上の高濃度のペプチドが必要であり、ＨＴＳ(ハイスループットスクリーニング）には不向きである。一方、電子顕微鏡による観察は定量的な測定方法ではないので、これもＨＴＳに適していない。 In Non-Patent Document 6, a method in which a peptide obtained by binding two types of KLVFF sequence (SEQ ID NO: 4) -containing peptide with a YNGK sequence (SEQ ID NO: 9) linker peptide is analyzed using CD spectrum analysis and an electron microscope. It is used to evaluate the state of fiberization. However, this method has a low evaluation throughput. Furthermore, the CD spectrum analysis method has low measurement sensitivity, requires a peptide with a high concentration of 10 μM or more, and is not suitable for HTS (High Throughput Screening). On the other hand, since observation with an electron microscope is not a quantitative measurement method, it is also not suitable for HTS.
さらに非特許文献７においては、ＫＬＶＦＦ配列（配列番号：４）とリンカーペプチドＹＮＧＫ（配列番号：９）および蛍光エネルギー共鳴転移受容体として5-((((2-iodoacetyl)amino)ethyl)amino)naphthalene-1-sulfonic acidを組み合わせることによりＦＲＥＴ（Fluorescent Resonance Energy Transfer；蛍光共鳴エネルギー転移）反応を実現している。しかしながらそもそも本公知のペプチドはオリゴマー阻害剤をスクリーニングする目的で調製されたものではないので、ＨＴＳに使用するには多くの課題がある。すなわちこの公知のペプチド配列はアミロイドβ自己会合配列部位ＫＬＶＦＦ（配列番号：４）以外の配列も含有された長鎖ペプチドを用いているため、ＫＬＶＦＦ（配列番号：４）以外の配列にスクリーニング化合物が結合してＦＲＥＴ反応を阻害する可能性が高いので、擬陽性化合物が多くスクリーニングされる可能性がある。もしくはＫＬＶＦＦ（配列番号：４）両端のアミノ酸配列が長くなれば、βヘアピン構造における相互作用が強くなるので多くのＫＬＶＦＦ配列（配列番号：４）に特異的に結合する化合物は擬陰性となり、除外される可能性がきわめて高く、効率よくオリゴマー阻害剤をスクリーニングする目的には不向きである。さらにエネルギー受容体と自己会合配列の結合にCysを用いているので、化合物との反応中にCysのチオール基が容易に酸化されやすく化学的に不安定であるためＦＲＥＴ反応に影響を及ぼす可能性があり、やはりスクリーニングには不向きである。 Further, in Non-Patent Document 7, KLVFF sequence (SEQ ID NO: 4), linker peptide YNGK (SEQ ID NO: 9) and 5-((((2-iodoacetyl) amino) ethyl) amino) as a fluorescence energy resonance transfer receptor FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer) reaction is realized by combining naphthalene-1-sulfonic acid. However, since the known peptides are not originally prepared for screening oligomeric inhibitors, there are many problems in using them for HTS. That is, since this known peptide sequence uses a long-chain peptide containing a sequence other than the amyloid β self-association sequence site KLVFF (SEQ ID NO: 4), the screening compound is present in a sequence other than KLVFF (SEQ ID NO: 4). Since there is a high possibility of binding and inhibiting the FRET reaction, many false positive compounds may be screened. Alternatively, if the amino acid sequence at both ends of KLVFF (SEQ ID NO: 4) becomes longer, the interaction in the β hairpin structure becomes stronger, so a compound that specifically binds to many KLVFF sequences (SEQ ID NO: 4) becomes false negative and is excluded. Therefore, it is highly unsuitable for screening oligomer inhibitors efficiently. Furthermore, since Cys is used to bind the energy acceptor and the self-association sequence, the thiol group of Cys is easily oxidized during the reaction with the compound and is chemically unstable, which may affect the FRET reaction. After all, it is not suitable for screening.
以上のように現時点では、可溶性アミロイドβに対して凝集阻害活性を効率よく定量的にスクリーニングする方法は存在していない。 As described above, at present, there is no method for efficiently and quantitatively screening for the aggregation inhibitory activity against soluble amyloid β.
本発明の目的は、アミロイドβ凝集の最初のステップであるダイマー化、オリゴマー化を阻害する化合物を効率よく簡便にスクリーニングするための新規なペプチド、およびこれを用いたアミロイドβオリゴマー化阻害剤のスクリーニング方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a novel peptide for efficiently and easily screening for a compound that inhibits dimerization and oligomerization, which is the first step of amyloid β aggregation, and screening of an amyloid β oligomerization inhibitor using the same It is to provide a method.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、アミロイドβのオリゴマー化阻害剤の新規なスクリーニング方法を見出すに到った。その手法とは、アミロイドβ自己会合配列として公知であるアミロイドβ内配列KLVFF（The Journal of biological chemistry, Vol. 271, No. 15, 85458548, 1996）（配列番号：４）とFRET反応の検出系を組み合わせた１分子内FRET反応を用いたものである。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found a novel screening method for an oligomerization inhibitor of amyloid β. The method includes an amyloid β internal sequence KLVFF (The Journal of biological chemistry, Vol. 271, No. 15, 85458548, 1996) (SEQ ID NO: 4), which is known as an amyloid β self-association sequence, and a FRET reaction detection system. This is a method using a single intramolecular FRET reaction.
具体的には本発明者らは、公知のアミロイドβ１６〜２０番目の自己会合配列（KLVFF関連）を公知のリンカー配列 YNGK（配列番号：９）を介して結合させたペプチドを種々設計した。すなわちKLVFF関連配列の自己会合による１分子内結合が、スクリーニング化合物により阻害された場合の構造変化を測定する系を考案した。ここでKLVFF関連配列とはKLVFF（配列番号：４）同様に自己会合を生ずる公知のアミノ酸配列を指し、たとえばKLVFFA（配列番号：24）であってもよい。 Specifically, the present inventors designed various peptides in which a known amyloid β16-20th self-association sequence (KLVFF related) was bound via a known linker sequence YNGK (SEQ ID NO: 9). That is, a system was devised to measure the structural change when the intramolecular binding due to self-association of KLVFF-related sequences was inhibited by the screening compound. Here, the KLVFF-related sequence refers to a known amino acid sequence that causes self-association as in KLVFF (SEQ ID NO: 4), and may be, for example, KLVFFA (SEQ ID NO: 24).
その際、ペプチドのC末端に蛍光エネルギー共鳴転移供与体としてトリプトファン残基を、そしてペプチドのN末端に受容体としてのDNS（5-（ジメチルアミノ）-1-ナフタレンスルホン酸：dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl）基を導入し、FRET活性の測定を試みた。 At that time, tryptophan residue as a fluorescence energy resonance transfer donor at the C-terminus of the peptide and DNS (5- (dimethylamino) -1-naphthalenesulfonic acid: dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl as the acceptor at the N-terminus of the peptide ) Group was introduced and measurement of FRET activity was attempted.
FRETは異なる周波数(波長)で蛍光を発する２つの蛍光物質が一方の標識から他方へエネルギーを転移することができるのに十分に互いに隣接している場合に検出可能である。FRETは、当該分野で広く知られている（概説については、Matyus，１９９２，Ｊ．Photochem．Photobiol．B：Biol．，12：323-337（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照のこと）。FRETは、エネルギーが励起した供与体分子から受容体分子への移動である無放射プロセスである。この移動の効率は、エネルギー供与体と受容体分子との間の距離に依存する。エネルギー移動速度は、供与体と受容体との間の距離の関数で表され、エネルギー移動効率は、距離の変化に非常に感度が高く、エネルギー移動は、１-１０ｎｍの距離範囲で検出可能な効率が得られるといわれているが、典型的には、供与体と受容体との好ましい対には４-６ｎｍの距離が適当である。このような供与体と受容体に適切な距離を与えるペプチドを選別することは容易ではない。 FRET is detectable when two fluorescent materials that fluoresce at different frequencies (wavelengths) are sufficiently adjacent to each other to be able to transfer energy from one label to the other. FRET is widely known in the art (for review, see Matyus, 1992, J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 12: 323-337, which is hereby incorporated by reference. See)). FRET is a non-radiative process in which energy is transferred from an excited donor molecule to an acceptor molecule. The efficiency of this transfer depends on the distance between the energy donor and the acceptor molecule. The energy transfer rate is expressed as a function of the distance between the donor and acceptor, the energy transfer efficiency is very sensitive to changes in distance and the energy transfer can be detected in the 1-10 nm distance range. Although it is said that efficiency is obtained, typically a distance of 4-6 nm is suitable for a preferred donor-acceptor pair. It is not easy to select a peptide that gives an appropriate distance between the donor and the acceptor.
すなわち、C末端にエネルギー供与体分子を含み、N末端にエネルギー受容体分子を含み、かつKLVFF関連配列、YNGK配列の前後に適当なアミノ酸を付加することによって、供与体分子と受容体分子との適切な1分子内対（距離関係）を形成させることは容易ではないが、本発明者らは、化合物がペプチドに結合した場合、供与体分子と受容体分子との間にエネルギー移動が起こるように試行錯誤により検討した結果、ペプチドNo.1（配列番号：20）、ペプチドNo.2 (配列番号：21）およびペプチドNo.4（配列番号：22）がFRET反応の良好な配列であることを見出した。中でもペプチドNo.1は極めて強い蛍光強度を示し、効率よくFRET反応を生じる優れたペプチドであることを見出した。さらに、公知のアミロイドβオリゴマー化阻害剤であるクルクミンを本発明のペプチド(ペプチドNo.1）に接触させた結果、FRET活性の大幅な減少が確認された。以上により、本発明のペプチドはアミロイドβオリゴマー化阻害剤を効率よくかつ簡便にスクリーニングするためのスクリーニングツールとして有用であることが明らかとなった。 That is, by including an energy donor molecule at the C-terminus, an energy acceptor molecule at the N-terminus, and adding an appropriate amino acid before and after the KLVFF-related sequence and the YNGK sequence, Although it is not easy to form a suitable intramolecular pair (distance relationship), we believe that when a compound is bound to a peptide, energy transfer occurs between the donor molecule and the acceptor molecule. As a result of trial and error, peptide No. 1 (SEQ ID NO: 20), peptide No. 2 (SEQ ID NO: 21) and peptide No. 4 (SEQ ID NO: 22) are good sequences for the FRET reaction. I found. Among these, peptide No. 1 was found to be an excellent peptide that exhibits extremely strong fluorescence intensity and efficiently generates a FRET reaction. Furthermore, as a result of contacting curcumin, a known amyloid β oligomerization inhibitor, with the peptide of the present invention (peptide No. 1), a significant decrease in FRET activity was confirmed. From the above, it has been clarified that the peptide of the present invention is useful as a screening tool for efficiently and simply screening an amyloid β oligomerization inhibitor.
本発明のペプチドは、例えばHTSのように多数の化合物を一度にスクリーニングする際にも有効に用いることができる。本発明のペプチドを用いたアミロイドβオリゴマー化阻害剤のスクリーニングにより、アルツハイマー病の治療または予防薬の候補物質を効率良く同定することができる。
本発明はこのような知見に基づき完成するに至ったものである。
The peptide of the present invention can be effectively used for screening a large number of compounds at once, such as HTS. By screening for an amyloid β oligomerization inhibitor using the peptide of the present invention, a candidate substance for a therapeutic or prophylactic agent for Alzheimer's disease can be efficiently identified.
The present invention has been completed based on such findings.
すなわち本発明は、
項１. アミノ酸配列ａ−ｂ−ｃ：
〔ここでａおよびｃは、
（１）Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）、Ｘ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ(配列番号：２）、Ｘ−Ｘ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：３）、およびこれらの配列においてＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：４）部分がＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：５）となったもの、から選択されるいずれかの組み合わせ、
（２）Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：４）、Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ（配列番号：６）およびこれらの配列においてＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：７）部分がＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ（配列番号：８）となったもの、から選択されるいずれかの組み合わせ、または
（３）前記（１）または（２）のアミノ酸配列中、ａにおけるＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：７）またはＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ（配列番号：８）のいずれか１アミノ酸、および／またはｃにおけるＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：７）またはＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ（配列番号：８）のいずれか１アミノ酸がＡ（アラニン残基）に置換されたものの組み合わせからなり、
(ここでＸは如何なるアミノ酸であっても良い)、
ｂはＹ−Ｎ−Ｇ−Ｋ（配列番号：９）またはそれに類似するペプチドミミックな化合物である。〕
を含有し、かつ片端にエネルギー供与体構造、もう片端にエネルギー受容体構造が結合している、FRET活性を有するペプチド、
That is, the present invention
Item 1. Amino acid sequence abc:
[Where a and c are
(1) KLVFFFX (SEQ ID NO: 1), XXLVVFFX (SEQ ID NO: 2), XXKL -VFFF (SEQ ID NO: 3), and in these sequences, the KLVFFF (SEQ ID NO: 4) portion is FFVFLK (SEQ ID NO: 5). Any combination selected from,
(2) KLVFFF (SEQ ID NO: 4), LVFFF (SEQ ID NO: 6) and LVVF in these sequences (SEQ ID NO: 7) any combination selected from those in which the portion is FFVL (SEQ ID NO: 8), or (3) in the amino acid sequence of (1) or (2) above, LVFFF (SEQ ID NO: 7) in either one amino acid of LVFFF (SEQ ID NO: 7) or FFVL (SEQ ID NO: 8) and / or c ) Or F-F-V-L (SEQ ID NO: 8) consisting of a combination of amino acids substituted with A (alanine residue),
(Where X can be any amino acid),
b is YNGK (SEQ ID NO: 9) or a peptide mimic compound similar thereto. ]
A peptide having FRET activity, containing an energy donor structure at one end and an energy acceptor structure at the other end,
項２. エネルギー供与体構造がＣ末端に結合しており、エネルギー受容体構造がＮ末端に結合している、項１記載のペプチド、
項３． エネルギー供与体構造がＷ（トリプトファン残基）である、項１または２記載のペプチド、
項４． エネルギー受容体構造がＤＮＳ基である、項１〜３いずれか記載のペプチド、
項５． 前記ａのＮ末端に修飾されていても良いグリシン残基が付加された、項１〜４いずれか記載のペプチド、
項６． 前記ｃのＣ末端にグリシン残基が付加された、項１〜５いずれか記載のペプチド、
Item 3. Item 3. The peptide according to
Item 5. Item 5. The peptide according to any one of Items 1 to 4, wherein a glycine residue which may be modified is added to the N-terminus of a.
Item 6. Item 6. The peptide according to any one of Items 1 to 5, wherein a glycine residue is added to the C terminus of c.
項７． 以下の（４）〜（１９）：
（４）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）であり、前記ｃがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）、
（５）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）であり、前記ｃがＸ−Ｘ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：３）、
（６）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）であり、前記ｃがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）、
（７）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）であり、前記ｃがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ−Ｘ−Ｘ（配列番号：11）、
（８）前記ａがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）であり、前記ｃがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）、
（９）前記ａがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）であり、前記ｃがＸ−Ｘ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：３）、
（１０）前記ａがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）であり、前記ｃがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）、
（１１）前記ａがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）であり、前記ｃがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ−Ｘ−Ｘ（配列番号：11）、
（１２）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）であり、前記ｃがＸ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ(配列番号：２）、
（１３）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）であり、前記ｃがＸ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ−Ｘ（配列番号：12）、
（１４）前記ａがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）であり、前記ｃがＸ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ(配列番号：２）、
（１５）前記ａがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）であり、前記ｃがＸ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ−Ｘ（配列番号：12）、
（１６）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：４）であり、前記ｃがＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ（配列番号：６）、
（１７）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：４）であり、前記ｃがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｘ（配列番号：13）、
（１８）前記ａがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｘ（配列番号：13）であり、前記ｃがＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ（配列番号：６）、
（１９）前記ａがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｘ（配列番号：13）であり、前記ｃがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｘ（配列番号：13）、
のいずれかである、項１〜６いずれか記載のペプチド、
Item 7. The following (4) to (19):
(4) a is KLVFFFX (SEQ ID NO: 1), and c is KLVFFX (SEQ ID NO: 1). ,
(5) The a is KLVFFFX (SEQ ID NO: 1), and the c is XXLKLFVF (SEQ ID NO: 3). ,
(6) The a is KLVFFFX (SEQ ID NO: 1), and the c is XXFFFVLK (SEQ ID NO: 10). ,
(7) The a is KLVFFFX (SEQ ID NO: 1), and the c is FFVLCKX (SEQ ID NO: 11). ,
(8) The a is XXFFFVLK (SEQ ID NO: 10), and the c is KLVFFFX (SEQ ID NO: 1). ,
(9) The a is XXFFFVLK (SEQ ID NO: 10), and the c is XXLKLFVF (SEQ ID NO: 3). ,
(10) The a is XXFFFVLK (SEQ ID NO: 10), and the c is XXFFFVLK (SEQ ID NO: 10). ,
(11) The a is XXFFFFLK (SEQ ID NO: 10), and the c is FFVLCKX (SEQ ID NO: 11). ,
(12) The a is KLVFFFX (SEQ ID NO: 1), and the c is XXLVFX (SEQ ID NO: 2). ,
(13) The a is KLVFFFX (SEQ ID NO: 1), and the c is XFFFXVLK (SEQ ID NO: 12). ,
(14) The a is X-X-F-F-V-L-K (SEQ ID NO: 10), and the c is X-K-L-V-F-F-X (SEQ ID NO: 2). ,
(15) The a is XXXFFVLK (SEQ ID NO: 10), and the c is XFFFFVLCK (SEQ ID NO: 12). ,
(16) The a is KLVFFF (SEQ ID NO: 4), the c is LVFFF (SEQ ID NO: 6),
(17) The a is KLVFFF (SEQ ID NO: 4), the c is FFVLF (SEQ ID NO: 13),
(18) The a is FFVLLX (SEQ ID NO: 13), the c is LVFFF (SEQ ID NO: 6),
(19) The a is FFVLX (SEQ ID NO: 13), the c is FFVLX (SEQ ID NO: 13),
The peptide according to any one of Items 1 to 6,
項８． 以下の（２０）〜（３１）：
（２０）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ（配列番号：14）であり、前記ｃがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ（配列番号：14）、
（２１）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ（配列番号：14）であり、前記ｃがＥ−Ａ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：15）、
（２２）前記ａがＥ−Ａ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：15）であり、前記ｃがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ（配列番号：14）、
（２３）前記ａがＥ−Ａ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：15）であり、前記ｃがＥ−Ａ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：15）、
（２４）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ（配列番号：14）であり、前記ｃがＱ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ（配列番号：16）、
（２５）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ（配列番号：14）であり、前記ｃがＡ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ−Ｑ（配列番号：17)、
（２６）前記ａがＥ−Ａ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：15）であり、前記ｃがＱ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ（配列番号：16）、
（２７）前記ａがＥ−Ａ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：15）であり、前記ｃがＡ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ−Ｑ（配列番号：17)、
（２８）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：４）であり、前記ｃがＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ（配列番号：18）、
（２９）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：４）であり、前記ｃがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：５）、
（３０）前記ａがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：５）であり、前記ｃがＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ（配列番号：18）、
（３１）前記ａがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：５）であり、前記ｃがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：５）、
のいずれかである、項７記載のペプチド、
Item 8. The following (20) to (31):
(20) The a is KLVFFFAE (SEQ ID NO: 14), and the c is KLVFAFAE (SEQ ID NO: 14). ,
(21) The a is KLVFFFAE (SEQ ID NO: 14) and the c is EAFFFFLK (SEQ ID NO: 15). ,
(22) The a is EAFFFVLK (SEQ ID NO: 15), and the c is KLVVFFAE (SEQ ID NO: 14). ,
(23) The a is EAFFFVLK (SEQ ID NO: 15), and the c is EAFFFVLK (SEQ ID NO: 15). ,
(24) The a is KLVFFFAE (SEQ ID NO: 14), and the c is QKLVVFFA (SEQ ID NO: 16). ,
(25) The a is KLVFFFAE (SEQ ID NO: 14), and the c is AFFFVLKQ (SEQ ID NO: 17). ,
(26) The a is EAFFFVLK (SEQ ID NO: 15), and the c is QKLVVFA (SEQ ID NO: 16). ,
(27) a is EAFFFVLCK (SEQ ID NO: 15), and c is AFFFFLKQ (SEQ ID NO: 17). ,
(28) a is KLVFFF (SEQ ID NO: 4), c is LVFFFA (SEQ ID NO: 18),
(29) The a is KLVFFF (SEQ ID NO: 4), the c is FFVFLK (SEQ ID NO: 5),
(30) a is FFVLK (SEQ ID NO: 5), c is LVFFF (SEQ ID NO: 18),
(31) The a is FFVLK (SEQ ID NO: 5), the c is FFVLK (SEQ ID NO: 5),
The peptide according to Item 7, which is any one of
項９． 以下の（３２）〜（３４）：
（３２）（ＤＮＳ−）Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ−Ｙ−Ｎ−Ｇ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ−Ｇ−Ｗ（配列番号：20）、
（３３）（ＤＮＳ−）Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ−Ｙ−Ｎ−Ｇ−Ｋ−Ｑ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｇ−Ｗ（配列番号：21）、
（３４）（ＤＮＳ−）Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｙ−Ｎ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｇ−Ｗ（配列番号：22）、
のいずれかからなる、項８記載のペプチド、ならびに
項１０． 以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、アミロイドβのオリゴマー化阻害剤のスクリーニング方法：
(ａ)被験物質と項１〜９いずれか記載のペプチドとを接触させる工程、
(ｂ)前記（ａ）におけるFRET活性を測定し、該測定値を被験物質を接触させない場合のFRET活性値と比較する工程、
(ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、FRET活性を低下させる被験物質を選択する工程、に関する。
Item 9. The following (32) to (34):
(32) (DNS-) G-K-L-V-F-F-A-E-Y-N-G-K-K-L-V-F-F-A-E-G-W (sequence) Number: 20),
(33) (DNS-) G-K-L-V-F-F-A-E-Y-N-G-K-Q-K-L-F-F-F-A-G-W (sequence) Number: 21),
(34) (DNS-) G-K-L-V-F-F-Y-N-G-K-L-V-F-F-A-G-W (SEQ ID NO: 22),
Item 10. The peptide according to Item 8 and any one of Items 10. A screening method for an amyloid β oligomerization inhibitor comprising the following steps (a), (b) and (c):
(a) contacting the test substance with the peptide according to any one of Items 1 to 9,
(b) measuring the FRET activity in (a), and comparing the measured value with the FRET activity value when the test substance is not contacted;
(c) It relates to a step of selecting a test substance that reduces FRET activity based on the comparison result of (b).
本発明は、アミロイドβ凝集の最初のステップであるダイマー化、オリゴマー化を阻害する阻害剤を効率よく簡便にスクリーニングするための新規なペプチド、およびこれを用いたアミロイドβオリゴマー化阻害剤のスクリーニング方法を提供する。本発明によって提供されるスクリーニング法は、アルツハイマー病の予防または治療薬の候補物質を効率よく同定することが可能である。また本発明のスクリーニング法は、アミロイドβのダイマー化、オリゴマー化を阻害する生体内物質を探索することも可能である。 The present invention relates to a novel peptide for efficiently and conveniently screening an inhibitor that inhibits dimerization and oligomerization, which is the first step of amyloid β aggregation, and a method for screening an amyloid β oligomerization inhibitor using the same I will provide a. The screening method provided by the present invention can efficiently identify candidate substances for preventive or therapeutic agents for Alzheimer's disease. The screening method of the present invention can also search for in vivo substances that inhibit amyloid β dimerization and oligomerization.
以下、本明細書において、アミノ酸、(ポリ)ペプチド、(ポリ)ヌクレオチドなどの略号による表示は、IUPAC-IUBの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」(日本国特許庁編)および当該分野における慣用記号に従う。 Hereinafter, in the present specification, indications by abbreviations such as amino acids, (poly) peptides, (poly) nucleotides, etc., are defined by IUPAC-IUB [IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem. 1984)], “Guidelines for the preparation of specifications including base sequences or amino acid sequences” (edited by the Japan Patent Office) and conventional symbols in the field.
本明細書及び図面において、アミノ酸残基を略号(三文字表記、一文字表記）で表示する場合、次の略号で記述する。
Ala またはＡ：アラニン残基
Arg またはＲ：アルギニン残基
Asn またはＮ：アスパラギン残基
Asp またはＤ：アスパラギン酸残基
Cys またはＣ：システイン残基
Gln またはＱ：グルタミン残基
Glu またはＥ：グルタミン酸残基
Gly またはＧ：グリシン残基
His またはＨ：ヒスチジン残基
Ile またはＩ：イソロイシン残基
Leu またはＬ：ロイシン残基
Lys またはＫ：リジン残基
Met またはＭ：メチオニン残基
Phe またはＦ：フェニルアラニン残基
Pro またはＰ：プロリン残基
Ser またはＳ：セリン残基
Thr またはＴ：トレオニン残基
Trp またはＷ：トリプトファン残基
Tyr またはＹ：チロシン残基
Val またはＶ：バリン残基
In the present specification and drawings, when an amino acid residue is represented by an abbreviation (three letter notation, one letter notation), the following abbreviation is used.
Ala or A: Alanine residue
Arg or R: Arginine residue
Asn or N: Asparagine residue
Asp or D: aspartic acid residue
Cys or C: Cysteine residue
Gln or Q: Glutamine residue
Glu or E: Glutamic acid residue
Gly or G: Glycine residue
His or H: histidine residue
Ile or I: isoleucine residue
Leu or L: Leucine residue
Lys or K: Lysine residue
Met or M: methionine residue
Phe or F: phenylalanine residue
Pro or P: Proline residue
Ser or S: Serine residue
Thr or T: Threonine residue
Trp or W: Tryptophan residue
Tyr or Y: tyrosine residue
Val or V: valine residue
本発明のペプチドとは、
アミノ酸配列ａ−ｂ−ｃ：
〔ここでａおよびｃは、
（１）Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）、Ｘ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ(配列番号：２）、Ｘ−Ｘ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：３）、およびこれらの配列においてＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：４）部分がＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：５）となったもの、から選択されるいずれかの組み合わせ、
（２）Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：４）、Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ（配列番号：６）およびこれらの配列においてＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：７）部分がＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ（配列番号：８）となったもの、から選択されるいずれかの組み合わせ、または
（３）前記（１）または（２）のアミノ酸配列中、ａにおけるＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：７）またはＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ（配列番号：８）のいずれか１アミノ酸、および／またはｃにおけるＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：７）またはＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ（配列番号：８）のいずれか１アミノ酸がＡ（アラニン残基）に置換されたものの組み合わせからなり、
(ここでＸは如何なるアミノ酸であっても良い)、
ｂはＹ−Ｎ−Ｇ−Ｋ（配列番号：９）またはそれに類似するペプチドミミックな化合物である。〕
を含有し、かつ片端にエネルギー供与体構造、もう片端にエネルギー受容体構造が結合している、FRET活性を有するペプチド、である。
The peptide of the present invention is
Amino acid sequence abc:
[Where a and c are
(1) KLVFFFX (SEQ ID NO: 1), XXLVVFFX (SEQ ID NO: 2), XXKL -VFFF (SEQ ID NO: 3), and in these sequences, the KLVFFF (SEQ ID NO: 4) portion is FFVFLK (SEQ ID NO: 5). Any combination selected from,
(2) KLVFFF (SEQ ID NO: 4), LVFFF (SEQ ID NO: 6) and LVVF in these sequences (SEQ ID NO: 7) any combination selected from those in which the portion is FFVL (SEQ ID NO: 8), or (3) in the amino acid sequence of (1) or (2) above, LVFFF (SEQ ID NO: 7) in either one amino acid of LVFFF (SEQ ID NO: 7) or FFVL (SEQ ID NO: 8) and / or c ) Or F-F-V-L (SEQ ID NO: 8) consisting of a combination of amino acids substituted with A (alanine residue),
(Where X can be any amino acid),
b is YNGK (SEQ ID NO: 9) or a peptide mimic compound similar thereto. ]
A peptide having FRET activity, containing an energy donor structure at one end and an energy acceptor structure at the other end.
前記（１）において「Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：４）」が「Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：５）」に、また前記（２）において「Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：７）」が「Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ（配列番号：８）」になっていても良い理由は、以下のとおりである。
すなわち論文（J Mol Biol. 2005, 4;353(4):804-21. Molecular dynamics simulations of Alzheimer's beta-amyloid protofilaments. Buchete NV, Tycko R, Hummer G.）におけるNMRの解析では、Aβ1-40の結合は繊維の中心に対して平行に結合していると記載されている。一方、論文（Biophys Chem. 2005, 8; 120, 55-61. Quantitative determination of the topological propensities of amyloidogenic peptides. Shi Y, Stouten PF, Pillalamarri N, Barile L, Rosal RV, Teichberg S, Bu Z,Callaway DJ.)におけるＣＤスペクトル解析によれば、Aβ1-40は逆平行に結合していると記載されている。
In the above (1), “KLVFF (SEQ ID NO: 4)” is changed to “FFVVLK (SEQ ID NO: 5)”, and in “(2)” “L The reason that “-VFF (SEQ ID NO: 7)” may be “FFFF (SEQ ID NO: 8)” is as follows.
That is, in the analysis of NMR in the paper (J Mol Biol. 2005, 4; 353 (4): 804-21. Molecular dynamics simulations of Alzheimer's beta-amyloid protofilaments. Buchete NV, Tycko R, Hummer G.) The bond is described as being bonded parallel to the center of the fiber. On the other hand, the paper (Biophys Chem. 2005, 8; 120, 55-61. Quantitative determination of the topological propensities of amyloidogenic peptides. Shi Y, Stouten PF, Pillalamarri N, Barile L, Rosal RV, Teichberg S, Bu Z, Callaway DJ According to the CD spectrum analysis in.), Aβ1-40 is described as bound antiparallel.
また前記（３）において、ａにおけるＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：７）またはＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ（配列番号：８）のいずれか１アミノ酸、および／またはｃにおけるＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：７）またはＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ（配列番号：８）のいずれか１アミノ酸がＡに置換されていても良い理由は、論文（J Biol Chem. 1996 12;271(15):8545-8. Arrest of beta-amyloid fibril formation by a pentapeptide ligand. Tjernberg LO, Naslund J, Lindqvist F, Johansson J, Karlstrom AR, Thyberg J,Terenius L, Nordstedt C.）におけるＫＬＶＦＦおよびそのアラニン一置換体に対する[I125]Aβ1-40結合親和性のデータに基づく。 In the above (3), any one amino acid of LVFF (SEQ ID NO: 7) or FFVL (SEQ ID NO: 8) in a and / or LV in c The reason why any one amino acid of -FF (SEQ ID NO: 7) or FFVL (SEQ ID NO: 8) may be substituted with A is described in a paper (J Biol Chem. 1996 12; 271 (15): 8545-8. KLVFF in Arrest of beta-amyloid fibril formation by a pentapeptide ligand. Tjernberg LO, Naslund J, Lindqvist F. Based on [I 125 ] Aβ1-40 binding affinity data for alanine monosubstitution.
前記（１）におけるａおよびｃは、以下の配列より選択されるいずれかの組み合わせからなる。
Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）
Ｘ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ（配列番号：２）
Ｘ−Ｘ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：３）
Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ−Ｘ−Ｘ（配列番号：11）
Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ−Ｘ（配列番号：12）
Ｘ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）
A and c in the above (1) are composed of any combination selected from the following sequences.
K-L-V-F-F-X-X (SEQ ID NO: 1)
XK-L-V-F-F-X (SEQ ID NO: 2)
X-X-K-L-V-F-F (SEQ ID NO: 3)
FFVLLKXX (SEQ ID NO: 11)
X-F-F-V-L-K-X (SEQ ID NO: 12)
XX-F-F-V-LK (SEQ ID NO: 10)
前記（２）におけるａおよびｃは、以下の配列より選択されるいずれかの組み合わせからなる。
Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：４）
Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ（配列番号：６）
Ｋ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ（配列番号：19）
Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｘ（配列番号：13）
A and c in the above (2) consist of any combination selected from the following sequences.
KLVVFF (SEQ ID NO: 4)
L-V-F-F-X (SEQ ID NO: 6)
K-F-F-V-L (SEQ ID NO: 19)
FFV-L-X (SEQ ID NO: 13)
前記（３）におけるａおよびｃは、前記（１）または（２）のアミノ酸配列中、ａにおけるＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：７）またはＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ（配列番号：８）のいずれか１アミノ酸、および／またはｃにおけるＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：７）またはＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ（配列番号：８）のいずれか１アミノ酸がＡ（アラニン残基）に置換されたものの組み合わせからなる。 A and c in the above (3) are LVVF (SEQ ID NO: 7) or FFVL in a in the amino acid sequence of (1) or (2) (SEQ ID NO: 8) and / or any one amino acid of LVFFF (SEQ ID NO: 7) or FFVL (SEQ ID NO: 8) in c is A (an alanine residue). It consists of a combination of those substituted in the group).
前記においてＸは、天然に存在する20種類のアミノ酸であれば、如何なるアミノ酸であっても良い。好ましくはアラニン残基、グルタミン酸残基、グルタミン残基などが例示される。 In the above, X may be any amino acid as long as it is 20 kinds of naturally occurring amino acids. Preferably, an alanine residue, a glutamic acid residue, a glutamine residue and the like are exemplified.
このようなａおよびｃの組み合わせとして好ましくは、以下の組み合わせが例示される。
ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）であり、ｃがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）
ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）であり、ｃがＸ−Ｘ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：３）
ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）であり、ｃがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）
ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）であり、ｃがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ−Ｘ−Ｘ（配列番号：11）
ａがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）であり、ｃがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）
ａがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）であり、ｃがＸ−Ｘ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：３）
ａがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）であり、ｃがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）
ａがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）であり、ｃがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ−Ｘ−Ｘ（配列番号：11）
ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）であり、ｃがＸ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ(配列番号：２）
ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）であり、ｃがＸ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ−Ｘ（配列番号：12）
ａがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）であり、ｃがＸ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ(配列番号：２）
ａがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）であり、ｃがＸ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ−Ｘ（配列番号：12）
ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：４）であり、ｃがＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ（配列番号：６）
ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：４）であり、ｃがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｘ（配列番号：13）
ａがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｘ（配列番号：13）であり、ｃがＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ（配列番号：６）
ａがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｘ（配列番号：13）であり、ｃがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｘ（配列番号：13）
ここでＸの好ましい例については前述の通りである。
Preferably, the following combinations are exemplified as such a and c combinations.
a is KLVFFFX (SEQ ID NO: 1), and c is KLVFFFX (SEQ ID NO: 1).
a is KLVFFFX-X (SEQ ID NO: 1), and c is XXLKLFVF (SEQ ID NO: 3).
a is KLVFFFX-X (SEQ ID NO: 1), and c is XXFFFVLK (SEQ ID NO: 10).
a is KLV-F-F-X-X (SEQ ID NO: 1), and c is FFV-L-K-X-X (SEQ ID NO: 11).
a is X-X-F-F-V-L-K (SEQ ID NO: 10), c is K-L-V-F-F-X-X (SEQ ID NO: 1)
a is X-X-F-F-V-L-K (SEQ ID NO: 10), and c is X-X-K-L-V-F-F (SEQ ID NO: 3).
a is X-X-F-F-V-L-K (SEQ ID NO: 10), and c is X-X-F-F-V-L-K (SEQ ID NO: 10).
a is X-X-F-F-V-L-K (SEQ ID NO: 10), and c is FF-V-L-K-X-X (SEQ ID NO: 11).
a is KLVFFFX (SEQ ID NO: 1) and c is XXLVFX (SEQ ID NO: 2).
a is KLVFFFX-X (SEQ ID NO: 1), and c is XFFFXVLK (SEQ ID NO: 12).
a is X-X-F-F-V-L-K (SEQ ID NO: 10), and c is X-K-L-V-F-F-X (SEQ ID NO: 2).
a is X-X-F-F-V-L-K (SEQ ID NO: 10), c is X-F-F-V-L-K-X (SEQ ID NO: 12)
a is KLVFFF (SEQ ID NO: 4), and c is LVFFF (SEQ ID NO: 6).
a is KLVFFF (SEQ ID NO: 4), and c is FFVLX (SEQ ID NO: 13).
a is F-FV-L-X (SEQ ID NO: 13), c is L-V-F-F-X (SEQ ID NO: 6)
a is FFV-L-X (SEQ ID NO: 13), and c is FFV-L-X (SEQ ID NO: 13).
Here, preferred examples of X are as described above.
より好ましくは、以下の組み合わせが例示される。
ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ（配列番号：14）であり、ｃがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ（配列番号：14）
ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ（配列番号：14）であり、ｃがＥ−Ａ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：15）
ａがＥ−Ａ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：15）であり、ｃがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ（配列番号：14）
ａがＥ−Ａ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：15）であり、ｃがＥ−Ａ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：15）
ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ（配列番号：14）であり、ｃがＱ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ（配列番号：16）
ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ（配列番号：14）であり、ｃがＡ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ−Ｑ（配列番号：17)
ａがＥ−Ａ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：15）であり、ｃがＱ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ（配列番号：16）
ａがＥ−Ａ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：15）であり、ｃがＡ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ−Ｑ（配列番号：17)
ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：４）であり、ｃがＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ（配列番号：18）
ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：４）であり、ｃがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：５）
ａがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：５）であり、ｃがＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ（配列番号：18）
ａがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：５）であり、ｃがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：５）
More preferably, the following combinations are exemplified.
a is K-L-V-F-F-A-E (SEQ ID NO: 14), and c is K-L-V-F-F-A-E (SEQ ID NO: 14).
a is KLVFFFAE (SEQ ID NO: 14), and c is EAFFFFLV (SEQ ID NO: 15).
a is EAFFFVLK (SEQ ID NO: 15) and c is KLVVFFAE (SEQ ID NO: 14).
a is EAFFFVLK (SEQ ID NO: 15), and c is EAFFFVLCK (SEQ ID NO: 15).
a is K-L-V-F-F-A-E (SEQ ID NO: 14), c is Q-K-L-V-F-F-A (SEQ ID NO: 16)
a is K-L-V-F-F-A-E (SEQ ID NO: 14), c is A-F-F-V-L-K-Q (SEQ ID NO: 17)
a is EAFFFVLK (SEQ ID NO: 15), and c is QKLVFFFA (SEQ ID NO: 16).
a is EAFFFVLK (SEQ ID NO: 15), and c is AFFFVLCK (SEQ ID NO: 17).
a is KLVFFF (SEQ ID NO: 4), and c is LVFFFA (SEQ ID NO: 18).
a is KLVFFF (SEQ ID NO: 4), and c is FFVLK (SEQ ID NO: 5).
a is FFV-L-K (SEQ ID NO: 5), and c is L-V-F-F-A (SEQ ID NO: 18).
a is FFVLK (SEQ ID NO: 5), and c is FFVLK (SEQ ID NO: 5).
前記においてｂは、Ｙ−Ｎ−Ｇ−Ｋ（配列番号：９）またはそれに類似するペプチドミミックな化合物である。ここで「Ｙ−Ｎ−Ｇ−Ｋ（配列番号：９）に類似するペプチドミミックな化合物」とは、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変体が包含される。具体的には、例えば公知のＮ置換グリシンオリゴマーであるペプトイド(S.M.Miller, R.J.Simon, S.Ng, R.N.Zuckermann, J.S. Kerr, W.H.Moos, Bioorg. Med.Chem Lett., 4, 2657(1994) )、またはタンパク質のβ、γターン構造をミミックした非ペプチド化合物(M. Kahn Tetrahedron, 49, 3433(1993),コンビナトリアルケミストリー、（株）化学同人p44-64, 1997)などが例示される。 In the above, b is YNGK (SEQ ID NO: 9) or a peptide mimic compound similar thereto. As used herein, “peptidomimetic compound similar to YNGK (SEQ ID NO: 9)” includes peptide-like compounds (eg, peptoids) and other variants known in the art. Specifically, for example, peptoid which is a known N-substituted glycine oligomer (SMMiller, RJSimon, S.Ng, RNZuckermann, JS Kerr, WHMoos, Bioorg. Med. Chem Lett., 4, 2657 (1994)). Or non-peptide compounds mimicking the β and γ turn structures of proteins (M. Kahn Tetrahedron, 49, 3433 (1993), combinatorial chemistry, Kagaku Dojin p44-64, 1997) and the like.
前記のように本発明のペプチドは、アミノ酸配列ａ−ｂ−ｃを含有するものであれば、ａのＮ末端側、および／またはｃのＣ末端側にさらにアミノ酸が付加されていても良い。ここで付加されるアミノ酸の数は1残基〜2残基が好ましく、1残基がより好ましい。また付加されるアミノ酸の種類としては、ａのＮ末端、ｃのＣ末端共に、グリシン残基がＬ配位に固定されないので、分子の回転の自由度が高く、スペーサーとしての作用が期待されるので特に好ましい。 As described above, as long as the peptide of the present invention contains the amino acid sequence abc, an amino acid may be further added to the N-terminal side of a and / or the C-terminal side of c. The number of amino acids added here is preferably 1 to 2 residues, more preferably 1 residue. As for the type of amino acid to be added, since the glycine residue is not fixed in the L-coordinate at both the N-terminus of a and the C-terminus of c, the molecule has a high degree of freedom of rotation and is expected to act as a spacer. Therefore, it is particularly preferable.
ここで前記ａのＮ末端に付加されるアミノ酸は修飾されていても良い。ここで言う「修飾」とは、蛍光基による修飾を意味する。蛍光基としてはDNS基が挙げられる（DNS基については後述する）。DNS基は後述する蛍光共鳴エネルギー転移受容体構造となる。よって、好ましくはDNS基で修飾されたグリシン残基が挙げられる。 Here, the amino acid added to the N terminus of a may be modified. The “modification” here means modification with a fluorescent group. Examples of the fluorescent group include a DNS group (the DNS group will be described later). The DNS group has a fluorescence resonance energy transfer acceptor structure described later. Therefore, a glycine residue modified with a DNS group is preferable.
本発明のペプチドは、FRET活性を検出するために、ペプチドの片方の末端（N末端かC末端）にエネルギー供与体構造（以下エネルギー供与体）が、またもう片方の末端（N末端かC末端）にエネルギー受容体構造（以下エネルギー受容体）が、それぞれ結合している。
ここでFRET活性とは、蛍光共鳴エネルギー転移反応により増強されるエネルギー受容体による蛍光強度の変化を測定することにより検出される。すなわちAβオリゴマー化阻害剤の影響によりFRET効率が低下すれば供与体自身の蛍光が増加し、受容体の蛍光強度は減少するため、これらの減少と増加の程度を測定すればよい。最も簡便な方法としては供与体もしくは受容体の蛍光強度のどちらか一方、感度の良い方を測定すればよい。
In order to detect FRET activity, the peptide of the present invention has an energy donor structure (hereinafter referred to as an energy donor) at one end (N-terminal or C-terminal) and the other end (N-terminal or C-terminal). ) Are bonded to energy receptor structures (hereinafter referred to as energy receptors).
Here, FRET activity is detected by measuring a change in fluorescence intensity by an energy acceptor enhanced by a fluorescence resonance energy transfer reaction. That is, if the FRET efficiency decreases due to the influence of the Aβ oligomerization inhibitor, the fluorescence of the donor itself increases and the fluorescence intensity of the acceptor decreases. Therefore, the degree of the decrease and increase may be measured. The simplest method is to measure the more sensitive one of the fluorescence intensity of the donor or acceptor.
FRETは、当該分野で広く知られている（概説については、Matyus，１９９２，Ｊ．Photochem．Photobiol．B：Biol.,12：323-337（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照のこと）。FRETとは、エネルギーが励起した供与体からエネルギー受容体へのエネルギーの移動である無放射プロセスである。FRETは蛍光分子間の距離に依存した励起状態の相互作用であり、隣接して存在する一方の蛍光分子（供与体）の発光と他方の励起とがカップリングして起きる。エネルギー供与体を励起した際に、エネルギー供与体と受容体が近傍に存在するとFRET効率が増加して、エネルギーが受容体へ吸収され、励起状態のエネルギー受容体を得ることができる。FRET効率が増加しエネルギー受容体が励起されると、全体としてエネルギー受容体からの蛍光強度が増加する。FRET活性はエネルギー供与体および受容体の距離が1-10nmの距離範囲（好ましくは4-6nmの距離範囲）で検出される。よってこの距離が遠くなるとFRET効率は低下して受容体の蛍光強度は減少し、一方、エネルギー供与体からの蛍光は増加する。 FRET is widely known in the art (for review, see Matyus, 1992, J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 12: 323-337, which is hereby incorporated by reference. See)). FRET is a non-radiative process that is the transfer of energy from an energy-excited donor to an energy acceptor. FRET is an interaction in an excited state depending on the distance between fluorescent molecules, and is caused by coupling of the emission of one fluorescent molecule (donor) that is adjacent to the other and the other excitation. When the energy donor is excited, if the energy donor and the acceptor are present in the vicinity, the FRET efficiency increases, energy is absorbed into the acceptor, and an excited energy acceptor can be obtained. When the FRET efficiency increases and the energy acceptor is excited, the fluorescence intensity from the energy acceptor increases as a whole. FRET activity is detected when the distance between the energy donor and acceptor is 1-10 nm (preferably 4-6 nm). Thus, as this distance increases, the FRET efficiency decreases and the fluorescence intensity of the acceptor decreases, while the fluorescence from the energy donor increases.
本発明のペプチドにおいてFRETが効率よく生じる適切なエネルギー供与体と受容体の組み合わせは蛍光特性が異なる2種類の蛍光分子が利用される。すなわち両者の励起波長が異なり、供与体の放射波長が受容体の励起波長付近の適切な組み合わせが必要である。例えば実施例で用いたトリプトファンは290nm付近の波長の光で励起され、350nm付近の放射光を放つ。一方、DNS基はこの350nm付近の光で励起され510nmの放射光を放つ最適な組み合わせのひとつと考えられる。したがってFRETが効率よく起こった場合、分子全体としては290nm付近の波長による励起によって350nm付近の放射光は検出されず、受容体としてのDNSの510nm付近の放射光のみ検出される。供与体と受容体との組み合わせもしくは供与体をトリプトファンに設定した場合の各種受容体とのFRETが生じる際の分子間距離の例は、文献(P. Wu & L. Brand, Resonance energy transfer: method and application, Analitical biochemistry 218, 1-13(1994))に記載されている。 In the peptide of the present invention, two types of fluorescent molecules having different fluorescent properties are used as an appropriate combination of energy donor and acceptor in which FRET is efficiently generated. That is, the excitation wavelengths of the two are different, and an appropriate combination is necessary in which the emission wavelength of the donor is close to the excitation wavelength of the acceptor. For example, tryptophan used in the examples is excited by light having a wavelength near 290 nm and emits radiation at around 350 nm. On the other hand, the DNS group is considered to be one of the most suitable combinations that are excited by the light near 350 nm and emit 510 nm radiation. Therefore, if FRET occurs efficiently, the whole molecule will not detect synchrotron radiation near 350 nm due to excitation at a wavelength near 290 nm, but detect only synchrotron radiation near 510 nm in the DNS as an acceptor. Examples of intermolecular distances when FRET occurs with various acceptors when the donor and acceptor combination or the donor is set to tryptophan can be found in the literature (P. Wu & L. Brand, Resonance energy transfer: method and application, Analitical biochemistry 218, 1-13 (1994)).
本発明のペプチドにおいて、エネルギー供与体およびエネルギー受容体は、どちらの末端に結合していても良いが、エネルギー供与体がペプチドのＣ末端に結合し、エネルギー受容体がペプチドのＮ末端に結合していることが好ましい。ここでエネルギー供与体の具体例としては、例えばトリプトファン残基が挙げられる。またエネルギー受容体の具体例としては、DNS基、1-anilinonaphtalene-8-sulfonate (1,8-ANSと称する）基が挙げられる。例えばペプチドのＮ末端にDNS基が結合している場合、最初の(第1位の)アミノ酸はDNS基で修飾されていることになる。
好ましくは、ペプチドのＮ末端にDNS基が結合し、Ｃ末端にトリプトファン残基が結合したペプチドが例示される。この場合、波長290nmで励起させた時の放射波長510nmの蛍光強度を、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて測定することにより、FRET活性を検出することができる。
In the peptide of the present invention, the energy donor and energy acceptor may be bound to either end, but the energy donor is bound to the C-terminus of the peptide, and the energy acceptor is bound to the N-terminus of the peptide. It is preferable. Here, specific examples of the energy donor include a tryptophan residue. Specific examples of the energy acceptor include a DNS group and a 1-anilinonaphtalene-8-sulfonate (referred to as 1,8-ANS) group. For example, when a DNS group is bonded to the N-terminus of the peptide, the first (first position) amino acid is modified with the DNS group.
Preferably, a peptide in which a DNS group is bonded to the N-terminus of the peptide and a tryptophan residue is bonded to the C-terminus is exemplified. In this case, FRET activity can be detected by measuring the fluorescence intensity at an emission wavelength of 510 nm when excited at a wavelength of 290 nm using a fluorescence microplate reader.
以上のような本発明ペプチドは、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて合成することができる。合成方法としては、文献（ペプタイド・シンセシス（Peptide Synthesis ），Interscience，New York，1966；ザ・プロテインズ（The Proteins），Vol 2 ，Academic Press Inc. ，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発 続 第14巻・ペプチド合成，広川書店，1991）などに記載されている方法が挙げられる。具体的には、例えばＦｍｏｃ法を用いて固相合成機で製造することができる。
The peptide of the present invention as described above can be synthesized according to a method used in normal peptide chemistry. As a synthesis method, literature (Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins,
以上に示した本発明ペプチドの好ましい例として、Ｎ末端のグリシン残基がＤＮＳ基で修飾されており、またＣ末端がトリプトファン残基である以下のペプチドが例示される。
（ＤＮＳ−）Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ−Ｙ−Ｎ−Ｇ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ−Ｇ−Ｗ（配列番号：20）
（ＤＮＳ−）Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ−Ｙ−Ｎ−Ｇ−Ｋ−Ｑ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｇ−Ｗ（配列番号：21）
（ＤＮＳ−）Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｙ−Ｎ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｇ−Ｗ（配列番号：22）
このうち（ＤＮＳ−）Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ−Ｙ−Ｎ−Ｇ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ−Ｇ−Ｗ（配列番号：20）が特に好ましい。
Preferred examples of the peptide of the present invention shown above include the following peptides in which the N-terminal glycine residue is modified with a DNS group and the C-terminal is a tryptophan residue.
(DNS-) G-K-L-V-F-F-A-E-Y-N-G-K-K-L-F-F-F-A-E-G-W (SEQ ID NO: 20 )
(DNS-) G-K-L-V-F-F-A-E-Y-N-G-K-Q-K-L-V-F-F-A-G-W (SEQ ID NO: 21 )
(DNS-) G-K-L-V-F-F-Y-N-G-K-L-V-F-F-A-G-W (SEQ ID NO: 22)
Of these, (DNS-) G-K-L-V-F-F-A-E-Y-N-G-K-K-L-V-F-F-A-E-G-W (SEQ ID NO: : 20) is particularly preferable.
本発明はまた、前記本発明のペプチドを利用したアミロイドβのオリゴマー化阻害剤のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は以下の工程(a)、(b)および(c)を含む：
(ａ)被験物質と本発明のペプチドとを接触させる工程、
(ｂ)前記（ａ）におけるFRET活性を測定し、該測定値を被験物質を接触させない場合のFRET活性値と比較する工程、
(ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、FRET活性を低下させる被験物質を選択する工程。
The present invention also provides a screening method for an amyloid β oligomerization inhibitor using the peptide of the present invention. The screening method of the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c):
(a) contacting the test substance with the peptide of the present invention,
(b) measuring the FRET activity in (a), and comparing the measured value with the FRET activity value when the test substance is not contacted;
(c) A step of selecting a test substance that decreases FRET activity based on the comparison result of (b).
以下に代表的なものとして、96ウエルプレートを用いて蛍光強度を測定する場合の具体例を記載する。
まず、Dimethyl sulphoxide(DMSO)溶液に溶解した1mM 被験物質2μlを96ウエルアッセイプレートに分注する。陰性対照として被験物質無添加同容量のDMSO含有溶媒のみのウェルも用意する。その際、陽性対照としてクルクミン（1mM、DMSOで希釈)添加ウェルも用意することが好ましい。
次に、本発明のペプチド(1μM PBSで希釈)を各ウェルに200μl添加し、混合後、室温で30分程度反応させる。ここで用いるペプチドとしては、配列番号：20に記載のペプチド（ペプチドNo.1）が好ましい。
最後に波長290nmで励起させた時の放射波長510nmの蛍光強度を蛍光マイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス社製)を用いて測定する。陰性対象に比して蛍光強度が減弱した（すなわちFRET活性の低下した）ウェル中に含まれる被験物質を、アミロイドβのオリゴマー化阻害剤として選択する。その際、クルクミンと同等まで蛍光強度が減弱したウェル中に含まれる被験物質を、より好ましい阻害剤として選択する。
以上のスクリーニングにより選択されたアミロイドβオリゴマー化阻害剤は、アルツハイマー病等のアミロイドβの沈着によって引き起こされる疾患の治療または予防に有効な治療薬の候補物質となる。
The following is a specific example of measuring fluorescence intensity using a 96-well plate as a representative example.
First, 2 μl of 1 mM test substance dissolved in dimethyl sulphoxide (DMSO) solution is dispensed into a 96-well assay plate. As a negative control, prepare a well containing only the same volume of DMSO-containing solvent with no test substance added. At that time, it is preferable to prepare a well containing curcumin (1 mM, diluted with DMSO) as a positive control.
Next, 200 μl of the peptide of the present invention (diluted with 1 μM PBS) is added to each well, and after mixing, the mixture is allowed to react at room temperature for about 30 minutes. As a peptide used here, the peptide (peptide No. 1) described in SEQ ID NO: 20 is preferable.
Finally, the fluorescence intensity at an emission wavelength of 510 nm when excited at a wavelength of 290 nm is measured using a fluorescence microplate reader (manufactured by Molecular Devices). A test substance contained in a well having a reduced fluorescence intensity compared to a negative subject (ie, having a reduced FRET activity) is selected as an oligomerization inhibitor of amyloid β. At that time, a test substance contained in a well whose fluorescence intensity is reduced to the same level as that of curcumin is selected as a more preferable inhibitor.
The amyloid β oligomerization inhibitor selected by the above screening becomes a candidate substance for a therapeutic agent effective for treatment or prevention of diseases caused by amyloid β deposition such as Alzheimer's disease.
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited at all by these Examples.
ペプチドの調製および選別
KLVFF関連配列をリンカーペプチドで結合させた4種類のペプチドを設計し、合成した（ペプチドNo.1：配列番号：20、ペプチドNo.2：配列番号：21、ペプチドNo.3：配列番号：23、ペプチドNo.4：配列番号：22）、（配列番号：23は(DNS-)GKLVFFYNGKVFFAEGW）。各ペプチドはDMSOで1mMに溶解希釈し、10μl/tubeの濃度で分注し、実験に用いるまで-７0℃で保管した。各ペプチド、アセチルトリプトファン(Ac-Trp)および5-(Dimethylamino)-1-naphthalenesulfonic acid hydrate(DNS)はリン酸緩衝液（pH7.4 ）または6M尿素含有リン酸緩衝液を用いて最終濃度１μMに溶解した。溶液を96ウェルプレート（Corning NSB micro plate）に200μl 添加し、室温にて波長290nmで励起させた時の放射波長510nmの蛍光強度を蛍光マイクロプレートリーダー(FLUO star BMG LABTECH社製)を用いて測定した。結果を図１に示す。黒色のカラムはペプチドをPBSに溶解した時の蛍光強度を示しており、白色のカラムは６M尿素含有PBSにペプチドを溶解し、ペプチドを変性させ構造を変化させたときの蛍光強度を示している。
Peptide preparation and selection
Four types of peptides in which KLVFF-related sequences are linked by a linker peptide were designed and synthesized (peptide No. 1: SEQ ID NO: 20, peptide No. 2: SEQ ID NO: 21, peptide No. 3: SEQ ID NO: 23 Peptide No. 4: SEQ ID NO: 22) (SEQ ID NO: 23 is (DNS-) GKLVFFYNGKVFFAEGW). Each peptide was dissolved and diluted to 1 mM with DMSO, dispensed at a concentration of 10 μl / tube, and stored at −70 ° C. until used for experiments. Each peptide, acetyltryptophan (Ac-Trp) and 5- (Dimethylamino) -1-naphthalenesulfonic acid hydrate (DNS) is adjusted to a final concentration of 1 μM using phosphate buffer (pH 7.4) or phosphate buffer containing 6M urea. Dissolved. Add 200 μl of the solution to a 96-well plate (Corning NSB micro plate), and measure the fluorescence intensity at an emission wavelength of 510 nm when excited at a wavelength of 290 nm at room temperature using a fluorescence microplate reader (FLUO star BMG LABTECH). did. The results are shown in FIG. The black column indicates the fluorescence intensity when the peptide is dissolved in PBS, and the white column indicates the fluorescence intensity when the peptide is denatured and the structure is changed by dissolving the peptide in PBS containing 6M urea. .
その結果、No.１(配列番号：20)、No.2(配列番号：21）およびNo.4(配列番号：22）の3種類のペプチドで、尿素含有PBS群よりもPBS溶解群で高値となり、FRET反応が観察されたことから、これら3種のペプチドがFRET活性を有することが明らかとなった。中でもペプチドNo.1（配列番号：20）蛍光強度最大であり、No.2(配列番号：21）およびNo.4（配列番号：22）のペプチドの約2倍以上の強力な蛍光強度が得られ、ペプチドNo.1の配列構造がFRET反応に最適な構造を持ったペプチドであることが明らかとなった。一方、ペプチドNo.3(配列番号：23）はFRET反応による蛍光強度を検出できなかった。また蛍光のドナーとアクセプターに用いた蛍光試薬Ac-Trp (Sigma社製)およびDNS（Sigma 社製）の波長510nmにおける蛍光強度は測定限界以下であった。以上からペプチドNo.1はFRET反応に最適なドナーとアクセプターの距離を保つ構造を持っていることが示された。 As a result, No. 1 (SEQ ID NO: 20), No. 2 (SEQ ID NO: 21) and No. 4 (SEQ ID NO: 22) peptides were higher in the PBS-dissolved group than the urea-containing PBS group. From the fact that FRET reaction was observed, it became clear that these three peptides had FRET activity. In particular, peptide No. 1 (SEQ ID NO: 20) has the highest fluorescence intensity, and a strong fluorescence intensity more than twice that of peptides No. 2 (SEQ ID NO: 21) and No. 4 (SEQ ID NO: 22) is obtained. As a result, it was revealed that the sequence structure of peptide No. 1 is a peptide having an optimal structure for the FRET reaction. On the other hand, peptide No. 3 (SEQ ID NO: 23) could not detect the fluorescence intensity by FRET reaction. In addition, the fluorescence intensity at a wavelength of 510 nm of the fluorescent reagents Ac-Trp (Sigma) and DNS (Sigma) used for the fluorescent donor and acceptor was below the measurement limit. From the above, it was shown that peptide No. 1 has a structure that keeps the optimum distance between the donor and the acceptor for the FRET reaction.
選別されたペプチドによるFRET反応の蛍光スペクトル
実施例１でFRET活性が最も強かったペプチドNo.1について、蛍光スペクトルデータを測定した。ペプチドはPBSで1μMに希釈後、96ウェルプレート（Corning NSB micro plate）に100μl 添加し、波長290nmで励起させた時の蛍光スペクトルを蛍光測定装置（モレキュラーデバイス社製）で測定した。結果を図２に示す。その結果、510nm付近のFRET反応の結果としてのDNSの蛍光ピークが観察された。したがってペプチドのC末端トリプトファンからN末端DNS基へのエネルギー転移（FRET）反応が期待通りに再現されていることが示された。
Fluorescence spectrum of FRET reaction with selected peptides Fluorescence spectrum data was measured for peptide No. 1 having the strongest FRET activity in Example 1. The peptide was diluted to 1 μM with PBS, 100 μl was added to a 96-well plate (Corning NSB micro plate), and the fluorescence spectrum when excited at a wavelength of 290 nm was measured with a fluorometer (Molecular Device). The results are shown in FIG. As a result, a DNS fluorescence peak as a result of the FRET reaction around 510 nm was observed. Therefore, it was shown that the energy transfer (FRET) reaction from the C-terminal tryptophan of the peptide to the N-terminal DNS group was reproduced as expected.
公知のオリゴマー化阻害剤を用いたFRET反応阻害活性の測定
クルクミンはすでにThe Journal of biological chemistry Vol. 280, No7 5892-5901, 2005によりアミロイドβのオリゴマー化を阻害する効果を持つと報告されている化合物である。ペプチドNo.1とクルクミン（Sigma社製）を混合し、FRET反応阻害活性を測定した。
1mMクルクミンDMSO溶液2μlをウェルに添加し、続いてPBSにペプチドNo.1を1μMの濃度で溶解したものを200μl添加した。対照として、DMSO溶液2μlをウェルに添加し、続いて前記ペプチド溶液200μlを添加したウェル、および、1mMクルクミンDMSO溶液2μlをウェルに添加し、続いてPBS200μlを添加したウェルも調製した。結果を図３に示す。
図３より明らかなように、クルクミンの添加により極大吸収は大幅に減弱した。すなわちクルクミンはアミロイドβ自己凝集配列(ＫＬＶＦＦ：配列番号：４)に作用し、ペプチドの構造を変化させた結果、供与体（トリプトファン残基）と受容体（ＤＮＳ基）の距離が変化することにより、エネルギー転移を減少させたことが示された。なお、クルクミンの自発蛍光は認められなかった(図３)。このように、アミロイドβのオリゴマー化阻害剤の存在によるFRET活性の低下が良好に検出できたため、本発明のペプチドを用いてアミロイドβのオリゴマー化阻害剤を容易にスクリーニングできることが明らかとなった。
Measurement of FRET reaction inhibitory activity using known oligomerization inhibitors Curcumin has already been reported to have the effect of inhibiting oligomerization of amyloid β by The Journal of biological chemistry Vol. 280, No7 5892-5901, 2005 A compound. Peptide No. 1 and curcumin (manufactured by Sigma) were mixed and the FRET reaction inhibitory activity was measured.
2 μl of 1 mM curcumin DMSO solution was added to the well, and then 200 μl of peptide No. 1 dissolved in PBS at a concentration of 1 μM was added. As controls, 2 μl of DMSO solution was added to the wells, followed by wells added with 200 μl of the peptide solution, and wells with 2 μl of 1 mM curcumin DMSO solution added to the wells, followed by addition of 200 μl of PBS. The results are shown in FIG.
As is clear from FIG. 3, the maximum absorption was significantly attenuated by the addition of curcumin. That is, curcumin acts on the amyloid β self-aggregating sequence (KLVFF: SEQ ID NO: 4), and as a result of changing the peptide structure, the distance between the donor (tryptophan residue) and the acceptor (DNS group) changes. It was shown to reduce energy transfer. In addition, the autofluorescence of curcumin was not recognized (FIG. 3). As described above, since the decrease in FRET activity due to the presence of the amyloid β oligomerization inhibitor was successfully detected, it was revealed that the amyloid β oligomerization inhibitor can be easily screened using the peptide of the present invention.
アミロイドβダイマー化抑制剤のスクリーニング
実施例３で用いたクルクミンの変わりに被験物質を用いることにより、アミロイドβオリゴマー化阻害剤を簡便にスクリーニングすることができる。以下に具体例を示す。
工程１：被験物質を96ウェルなどのアッセイプレートに分注する工程。
工程２：緩衝液に溶解したペプチド溶液をアッセイプレートに添加し、混和、室温にて反応させる工程。
工程３：蛍光プレートリーダーを用いて蛍光強度を測定する工程。
Screening for Amyloid β Dimerization Inhibitor By using a test substance instead of curcumin used in Example 3, an amyloid β oligomerization inhibitor can be easily screened. Specific examples are shown below.
Step 1: A step of dispensing a test substance into an assay plate such as 96 well.
Step 2: A step of adding a peptide solution dissolved in a buffer solution to the assay plate, mixing and reacting at room temperature.
Step 3: A step of measuring fluorescence intensity using a fluorescence plate reader.
まず工程１において、DMSO溶液に溶解した1mM 被験物質2μlを96ウエルアッセイプレートに分注する。その際、陽性対照としてクルクミン（1mM、DMSOで希釈)添加ウェル、および陰性対照として被験物質無添加同容量のDMSO含有溶媒のみのウェルも用意する。
次に工程２において、ペプチドNo.1 (1μM、PBSで希釈)を各ウェルに添加し、混合後、室温で30分程度反応させる。
次に工程３において波長290nmで励起させた時の放射波長510nmの蛍光強度を蛍光マイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス社製)を用いて測定する。陰性対象に比して蛍光強度が減弱した（すなわちFRET活性の低下した）ウェル中に含まれる被験物質を、アミロイドβのオリゴマー化阻害剤として選択する。その際、クルクミンと同等まで蛍光強度が減弱したウェル中に含まれる被験物質を、より好ましい阻害剤として選択する。
First, in
Next, in
Next, in step 3, the fluorescence intensity at an emission wavelength of 510 nm when excited at a wavelength of 290 nm is measured using a fluorescence microplate reader (manufactured by Molecular Devices). A test substance contained in a well having a reduced fluorescence intensity compared to a negative subject (ie, having a reduced FRET activity) is selected as an oligomerization inhibitor of amyloid β. At that time, a test substance contained in a well whose fluorescence intensity is reduced to the same level as that of curcumin is selected as a more preferable inhibitor.
本発明により、FRET活性を有する新規ペプチドが提供される。本発明の新規ペプチドをスクリーニングツールとして用いることにより、アミロイドβオリゴマー化阻害剤を効率よく簡便にスクリーニングすることができる。当該スクリーニングにより得られるアミロイドβオリゴマー化阻害剤は、アミロイドβの沈着によって引き起こされる疾患の治療または予防に有効な治療薬となり得る。 According to the present invention, a novel peptide having FRET activity is provided. By using the novel peptide of the present invention as a screening tool, an amyloid β oligomerization inhibitor can be screened efficiently and simply. The amyloid β oligomerization inhibitor obtained by the screening can be an effective therapeutic agent for treating or preventing a disease caused by amyloid β deposition.
配列番号：１に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。また第６位および第７位のXaaアミノ酸残基は、天然に存在する如何なるアミノ酸残基であっても良い。
配列番号：２に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。また第１位および第７位のXaaアミノ酸残基は、天然に存在する如何なるアミノ酸残基であっても良い。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。また第１位および第２位のXaaアミノ酸残基は、天然に存在する如何なるアミノ酸残基であっても良い。
配列番号：４に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：５に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：６に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。また第５位のXaaアミノ酸残基は、天然に存在する如何なるアミノ酸残基であっても良い。
配列番号：７に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：８に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：９に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：１０に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。また第１位および第２位のXaaアミノ酸残基は、天然に存在する如何なるアミノ酸残基であっても良い。
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is a synthetic peptide. The Xaa amino acid residues at the 6th and 7th positions may be any amino acid residue that exists in nature.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is a synthetic peptide. The Xaa amino acid residues at the 1st and 7th positions may be any amino acid residues that exist in nature.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 is a synthetic peptide. The Xaa amino acid residues at the 1st and 2nd positions may be any amino acid residues that exist in nature.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 is a synthetic peptide.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 is a synthetic peptide.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 is a synthetic peptide. The Xaa amino acid residue at the 5th position may be any amino acid residue that exists in nature.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 is a synthetic peptide.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 is a synthetic peptide.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9 is a synthetic peptide.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10 is a synthetic peptide. The Xaa amino acid residues at the 1st and 2nd positions may be any amino acid residues that exist in nature.
配列番号：１１に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。また第６位および第７位のXaaアミノ酸残基は、天然に存在する如何なるアミノ酸残基であっても良い。
配列番号：１２に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。また第１位および第７位のXaaアミノ酸残基は、天然に存在する如何なるアミノ酸残基であっても良い。
配列番号：１３に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。また第５位のXaaアミノ酸残基は、天然に存在する如何なるアミノ酸残基であっても良い。
配列番号：１４に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：１５に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：１６に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：１７に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：１８に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：１９に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：２０に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。また第１位のXaaアミノ酸残基は、ＤＮＳ(５−(ジメチルアミノ)−１−ナフタレンスルホン酸）基で修飾されたグリシン残基である。
配列番号：２１に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。また第１位のXaaアミノ酸残基は、ＤＮＳ(５−(ジメチルアミノ)−１−ナフタレンスルホン酸）基で修飾されたグリシン残基である。
配列番号：２２に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。また第１位のXaaアミノ酸残基は、ＤＮＳ(５−(ジメチルアミノ)−１−ナフタレンスルホン酸）基で修飾されたグリシン残基である。
配列番号：２３に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。また第１位のXaaアミノ酸残基は、ＤＮＳ(５−(ジメチルアミノ)−１−ナフタレンスルホン酸）基で修飾されたグリシン残基である。
配列番号：２４に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 is a synthetic peptide. The Xaa amino acid residues at the 6th and 7th positions may be any amino acid residue that exists in nature.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 is a synthetic peptide. The Xaa amino acid residues at the 1st and 7th positions may be any amino acid residues that exist in nature.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 is a synthetic peptide. The Xaa amino acid residue at the 5th position may be any amino acid residue that exists in nature.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14 is a synthetic peptide.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15 is a synthetic peptide.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16 is a synthetic peptide.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17 is a synthetic peptide.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18 is a synthetic peptide.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 is a synthetic peptide.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20 is a synthetic peptide. The Xaa amino acid residue at the first position is a glycine residue modified with a DNS (5- (dimethylamino) -1-naphthalenesulfonic acid) group.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21 is a synthetic peptide. The Xaa amino acid residue at the first position is a glycine residue modified with a DNS (5- (dimethylamino) -1-naphthalenesulfonic acid) group.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22 is a synthetic peptide. The Xaa amino acid residue at the first position is a glycine residue modified with a DNS (5- (dimethylamino) -1-naphthalenesulfonic acid) group.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 23 is a synthetic peptide. The Xaa amino acid residue at the first position is a glycine residue modified with a DNS (5- (dimethylamino) -1-naphthalenesulfonic acid) group.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24 is a synthetic peptide.
Claims (10)
〔ここでａおよびｃは、
（１）Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）、Ｘ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ(配列番号：２）、Ｘ−Ｘ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：３）、およびこれらの配列においてＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：４）部分がＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：５）となったもの、から選択されるいずれかの組み合わせ、
（２）Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：４）、Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ（配列番号：６）およびこれらの配列においてＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：７）部分がＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ（配列番号：８）となったもの、から選択されるいずれかの組み合わせ、または
（３）前記（１）または（２）のアミノ酸配列中、ａにおけるＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：７）またはＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ（配列番号：８）のいずれか１アミノ酸、および／またはｃにおけるＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：７）またはＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ（配列番号：８）のいずれか１アミノ酸がＡ（アラニン残基）に置換されたものの組み合わせからなり、
(ここでＸは如何なるアミノ酸であっても良い)、
ｂはＹ−Ｎ−Ｇ−Ｋ（配列番号：９）またはそれに類似するペプチドミミックな化合物である。〕
を含有し、かつ片端にエネルギー供与体構造、もう片端にエネルギー受容体構造が結合している、FRET（Fluorescent Resonance Energy Transfer）活性を有するペプチド。 Amino acid sequence abc:
[Where a and c are
(1) KLVFFFX (SEQ ID NO: 1), XXLVVFFX (SEQ ID NO: 2), XXKL -VFFF (SEQ ID NO: 3), and in these sequences, the KLVFFF (SEQ ID NO: 4) portion is FFVFLK (SEQ ID NO: 5). Any combination selected from,
(2) KLVFFF (SEQ ID NO: 4), LVFFF (SEQ ID NO: 6) and LVVF in these sequences (SEQ ID NO: 7) any combination selected from those in which the portion is FFVL (SEQ ID NO: 8), or (3) in the amino acid sequence of (1) or (2) above, LVFFF (SEQ ID NO: 7) in either one amino acid of LVFFF (SEQ ID NO: 7) or FFVL (SEQ ID NO: 8) and / or c ) Or F-F-V-L (SEQ ID NO: 8) consisting of a combination of amino acids substituted with A (alanine residue),
(Where X can be any amino acid),
b is YNGK (SEQ ID NO: 9) or a peptide mimic compound similar thereto. ]
A peptide having FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer) activity, comprising an energy donor structure at one end and an energy acceptor structure at the other end.
（４）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）であり、前記ｃがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）、
（５）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）であり、前記ｃがＸ−Ｘ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：３）、
（６）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）であり、前記ｃがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）、
（７）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）であり、前記ｃがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ−Ｘ−Ｘ（配列番号：11）、
（８）前記ａがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）であり、前記ｃがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）、
（９）前記ａがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）であり、前記ｃがＸ−Ｘ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：３）、
（１０）前記ａがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）であり、前記ｃがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）、
（１１）前記ａがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）であり、前記ｃがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ−Ｘ−Ｘ（配列番号：11）、
（１２）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）であり、前記ｃがＸ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ(配列番号：２）、
（１３）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ−Ｘ（配列番号：１）であり、前記ｃがＸ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ−Ｘ（配列番号：12）、
（１４）前記ａがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）であり、前記ｃがＸ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ(配列番号：２）、
（１５）前記ａがＸ−Ｘ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：10）であり、前記ｃがＸ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ−Ｘ（配列番号：12）、
（１６）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：４）であり、前記ｃがＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ（配列番号：６）、
（１７）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：４）であり、前記ｃがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｘ（配列番号：13）、
（１８）前記ａがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｘ（配列番号：13）であり、前記ｃがＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｘ（配列番号：６）、
（１９）前記ａがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｘ（配列番号：13）であり、前記ｃがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｘ（配列番号：13）、
のいずれかである、請求項１〜６いずれか記載のペプチド。 The following (4) to (19):
(4) a is KLVFFFX (SEQ ID NO: 1), and c is KLVFFX (SEQ ID NO: 1). ,
(5) The a is KLVFFFX (SEQ ID NO: 1), and the c is XXLKLFVF (SEQ ID NO: 3). ,
(6) The a is KLVFFFX (SEQ ID NO: 1), and the c is XXFFFVLK (SEQ ID NO: 10). ,
(7) The a is KLVFFFX (SEQ ID NO: 1), and the c is FFVLCKX (SEQ ID NO: 11). ,
(8) The a is XXFFFVLK (SEQ ID NO: 10), and the c is KLVFFFX (SEQ ID NO: 1). ,
(9) The a is XXFFFVLK (SEQ ID NO: 10), and the c is XXLKLFVF (SEQ ID NO: 3). ,
(10) The a is XXFFFVLK (SEQ ID NO: 10), and the c is XXFFFVLK (SEQ ID NO: 10). ,
(11) The a is XXFFFFLK (SEQ ID NO: 10), and the c is FFVLCKX (SEQ ID NO: 11). ,
(12) The a is KLVFFFX (SEQ ID NO: 1), and the c is XXLVFX (SEQ ID NO: 2). ,
(13) The a is KLVFFFX (SEQ ID NO: 1), and the c is XFFFXVLK (SEQ ID NO: 12). ,
(14) The a is X-X-F-F-V-L-K (SEQ ID NO: 10), and the c is X-K-L-V-F-F-X (SEQ ID NO: 2). ,
(15) The a is XXXFFVLK (SEQ ID NO: 10), and the c is XFFFFVLCK (SEQ ID NO: 12). ,
(16) The a is KLVFFF (SEQ ID NO: 4), the c is LVFFF (SEQ ID NO: 6),
(17) The a is KLVFFF (SEQ ID NO: 4), the c is FFVLF (SEQ ID NO: 13),
(18) The a is FFVLLX (SEQ ID NO: 13), the c is LVFFF (SEQ ID NO: 6),
(19) The a is FFVLX (SEQ ID NO: 13), the c is FFVLX (SEQ ID NO: 13),
The peptide according to any one of claims 1 to 6, which is either
（２０）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ（配列番号：14）であり、前記ｃがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ（配列番号：14）、
（２１）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ（配列番号：14）であり、前記ｃがＥ−Ａ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：15）、
（２２）前記ａがＥ−Ａ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：15）であり、前記ｃがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ（配列番号：14）、
（２３）前記ａがＥ−Ａ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：15）であり、前記ｃがＥ−Ａ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：15）、
（２４）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ（配列番号：14）であり、前記ｃがＱ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ（配列番号：16）、
（２５）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ（配列番号：14）であり、前記ｃがＡ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ−Ｑ（配列番号：17)、
（２６）前記ａがＥ−Ａ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：15）であり、前記ｃがＱ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ（配列番号：16）、
（２７）前記ａがＥ−Ａ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：15）であり、前記ｃがＡ−Ｆ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ−Ｑ（配列番号：17)、
（２８）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：４）であり、前記ｃがＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ（配列番号：18）、
（２９）前記ａがＫ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ（配列番号：４）であり、前記ｃがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：５）、
（３０）前記ａがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：５）であり、前記ｃがＬ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ（配列番号：18）、
（３１）前記ａがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：５）であり、前記ｃがＦ−Ｆ−Ｖ−Ｌ−Ｋ（配列番号：５）、
のいずれかである、請求項７記載のペプチド。 The following (20) to (31):
(20) The a is KLVFFFAE (SEQ ID NO: 14), and the c is KLVFAFAE (SEQ ID NO: 14). ,
(21) The a is KLVFFFAE (SEQ ID NO: 14) and the c is EAFFFFLK (SEQ ID NO: 15). ,
(22) The a is EAFFFVLK (SEQ ID NO: 15), and the c is KLVVFFAE (SEQ ID NO: 14). ,
(23) The a is EAFFFVLK (SEQ ID NO: 15), and the c is EAFFFVLK (SEQ ID NO: 15). ,
(24) The a is KLVFFFAE (SEQ ID NO: 14), and the c is QKLVVFFA (SEQ ID NO: 16). ,
(25) The a is KLVFFFAE (SEQ ID NO: 14), and the c is AFFFVLKQ (SEQ ID NO: 17). ,
(26) The a is EAFFFVLK (SEQ ID NO: 15), and the c is QKLVVFA (SEQ ID NO: 16). ,
(27) a is EAFFFVLCK (SEQ ID NO: 15), and c is AFFFFLKQ (SEQ ID NO: 17). ,
(28) a is KLVFFF (SEQ ID NO: 4), c is LVFFFA (SEQ ID NO: 18),
(29) The a is KLVFFF (SEQ ID NO: 4), the c is FFVFLK (SEQ ID NO: 5),
(30) a is FFVLK (SEQ ID NO: 5), c is LVFFF (SEQ ID NO: 18),
(31) The a is FFVLK (SEQ ID NO: 5), the c is FFVLK (SEQ ID NO: 5),
The peptide of Claim 7 which is either.
（３２）（ＤＮＳ−）Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ−Ｙ−Ｎ−Ｇ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ−Ｇ−Ｗ（配列番号：20）、
（３３）（ＤＮＳ−）Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｅ−Ｙ−Ｎ−Ｇ−Ｋ−Ｑ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｇ−Ｗ（配列番号：21）、
（３４）（ＤＮＳ−）Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｙ−Ｎ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ａ−Ｇ−Ｗ（配列番号：22）、
のいずれかからなる、請求項８記載のペプチド。 The following (32) to (34):
(32) (DNS-) G-K-L-V-F-F-A-E-Y-N-G-K-K-L-V-F-F-A-E-G-W (sequence) Number: 20),
(33) (DNS-) G-K-L-V-F-F-A-E-Y-N-G-K-Q-K-L-F-F-F-A-G-W (sequence) Number: 21),
(34) (DNS-) G-K-L-V-F-F-Y-N-G-K-L-V-F-F-A-G-W (SEQ ID NO: 22),
The peptide of Claim 8 which consists of either of these.
(ａ)被験物質と請求項１〜９いずれか記載のペプチドとを接触させる工程、
(ｂ)前記（ａ）におけるFRET活性を測定し、該測定値を被験物質に接触させない場合のFRET活性値と比較する工程、
(ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、FRET活性を低下させる被験物質を選択する工程。
A screening method for an amyloid β oligomerization inhibitor comprising the following steps (a), (b) and (c):
(a) contacting the test substance with the peptide according to any one of claims 1 to 9,
(b) measuring the FRET activity in the above (a), and comparing the measured value with the FRET activity value when not contacting the test substance;
(c) A step of selecting a test substance that decreases FRET activity based on the comparison result of (b).
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