JP2007202546A - Pcr primer for detecting mutation of epithelial growth factor receptor gene - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒト悪性腫瘍におけるEGFR遺伝子のチロシンキナーゼ部位の異常を検出するPCR用プライマー、PCR増幅産物であるDNA、及び該プライマーを用いる各種の検出方法に関する。The present invention relates to a PCR primer for detecting an abnormality in a tyrosine kinase site of an EGFR gene in a human malignant tumor, DNA as a PCR amplification product, and various detection methods using the primer.
EGFRの阻害剤であるゲフィチニブは肺癌の治療に有効であるため、わが国でもすでに臨床現場で使用されている。この際、標的であるEGFR遺伝子のチロシンキナーゼ部位に変異を持つ症例の方が、変異のない例に比べゲフィチニブの有効性が高いと報告されている(例えば、非特許文献1参照)。一方、ゲフィチニブについては副作用として致死的な肺線維症を生ずる例も多く報告され、社会問題にもなっている。そのため、EGFRの変異の有無を検出し、有効であると予測される症例にのみ投与を行うことが、治療効果/副作用の比を最大限にする上で重要であるとされる。現在までの報告では、特にわが国を含む東アジア諸国でEGFR遺伝子変異の頻度が高く、ゲフィチニブの有効性を高める上で、肺癌症例においてEGFR遺伝子の変異の有無を調べることが必要であると思われる。Since gefitinib, an EGFR inhibitor, is effective in the treatment of lung cancer, it has already been used in clinical settings in Japan. At this time, it has been reported that gefitinib is more effective in a case having a mutation in the tyrosine kinase site of the target EGFR gene than in a case without a mutation (see, for example, Non-Patent Document 1). On the other hand, gefitinib has been reported to cause fatal pulmonary fibrosis as a side effect and has become a social problem. Therefore, it is important to detect the presence or absence of EGFR mutation and administer only to cases that are expected to be effective in order to maximize the therapeutic effect / side effect ratio. In the reports to date, the frequency of EGFR gene mutations is particularly high in East Asian countries including Japan, and it seems necessary to investigate the presence or absence of EGFR gene mutations in lung cancer cases in order to increase the efficacy of gefitinib. .
従来EGFR遺伝子変異を検出するには主にダイレクトシークエンス法が用いられてきたが、臨床検体では正常細胞の混入のため異常を見逃す場合があること、手技が煩雑なこと、特別な機器が必要であること、コストが高いことなどの欠点があった。他にも単鎖立体構造異型(single strand conformation polymorphism)法やリアルタイムPCR法が応用できるとする報告もあるが、これらも検出力ではダイレクトシークエンス法にまさるものの、機器の普遍性や技術の簡便性の点で問題があった(例えば、非特許文献2参照)。
われわれは、EGFR遺伝子の変異が特定の部分に集中しており、大部分が3種類の遺伝子異常のうちのいずれかであることに注目し、この3種類の異常についてはPCR法を応用した簡便な変異検出法が可能であると考えた。この3種類とは、1)エクソン19内の15塩基対(塩基対番号2481番から2495番)の欠失(EGFR19deltype1)、2)エクソン19内の15塩基対(塩基対番号2482番から2496番)の欠失(EGFR19deltype2)、3)エクソン21内の塩基対番号2819番のチロシンからグアニンへの点突然変異(EGFR21L858R)、である。本法を応用し実用化するには、チロシンキナーゼ部位にこれら3種類の変異のいずれかをもつEGFR遺伝子を特異的に増幅することのできるプライマーを作製することが必要であった。We noticed that EGFR gene mutations are concentrated in a specific part, and most of them are one of three types of gene abnormalities. It was thought that a simple mutation detection method was possible. These three types are 1) deletion of 15 base pairs in exon 19 (base pair numbers 2481 to 2495) (EGFR19deltype1), 2) 15 base pairs in exon 19 (base pair numbers 2482 to 2496) ) Deletion (EGFR19deltype2), 3) a tyrosine to guanine point mutation (EGFR21L858R) of base pair # 2819 in exon 21. In order to apply this method and put it to practical use, it was necessary to prepare a primer capable of specifically amplifying the EGFR gene having any of these three types of mutations at the tyrosine kinase site.
そこで本発明者は、上記の3種類のEGFRのチロシンキナーゼ部位の変異に特異的なプライマーを作製して、迅速かつ特異的にこれら3種類のEGFRのチロシンキナーゼ部位の特定の変異を検出できるような遺伝子診断法が可能であるかを精査、検証した。Therefore, the present inventor can prepare primers specific to the above-mentioned three types of EGFR tyrosine kinase site mutations and detect specific mutations in these three types of EGFR tyrosine kinase sites quickly and specifically. Scrutinized and verified whether a simple genetic diagnosis was possible.
即ち、本発明者は、これら3種類の特定のチロシンキナーゼ部位の変異をもつEGFR遺伝子の一部(遺伝子断片)を特異的に増幅することが出来るプライマーを作成し、本発明を完成した。更に、これらのプライマーを用いてPCRを行うことにより、上記の特異的な遺伝子断片を増幅することが出来た。That is, the present inventor created a primer capable of specifically amplifying a part (gene fragment) of the EGFR gene having mutations in these three specific tyrosine kinase sites, and completed the present invention. Furthermore, by carrying out PCR using these primers, the above specific gene fragment could be amplified.
即ち、本発明は、上記3種類のEGFR遺伝子の異常のいずれかを検出することの出来るPCR用プライマーに係る。
かかるプライマーの好適な例として、塩基配列として、「tgcatcgctggtaacat(EGFR19S4)(配列番号1)及び「cggagatgttttgatagcg(EGFR19ASD1)」(配列番号2)を有するプライマーがある。後者はEGFR遺伝子の塩基対番号2472番から2505番までの配列から、塩基対番号2481番から2495番の塩基を除いたものと相補的な配列である。That is, the present invention relates to a PCR primer that can detect any of the three types of EGFR gene abnormalities.
As a suitable example of such a primer, there is a primer having “tgcatcgctggtaacat (EGFR19S4) (SEQ ID NO: 1)” and “cggagagtgtttgatagcg (EGFR19ASD1)” (SEQ ID NO: 2) as a base sequence. The latter is a sequence complementary to a sequence obtained by removing the base pairs numbered 2481 to 2495 from the base pair number 2472 to number 2505 of the EGFR gene.
かかるプライマーのもうひとつの例としては、塩基配列として、「atgtcaagatcacagattttgggcg(EGFR21SM1)」(配列番号3)および「ctggctgacctaaagc(EGFR21AS4)」(配列番号4)を有するプライマーがある。Another example of such a primer is a primer having “atgtcaagatcacagattttggggcg (EGFR21SM1)” (SEQ ID NO: 3) and “ctggctgacctaagac (EGFR21AS4)” (SEQ ID NO: 4) as the base sequence.
本明細書の実施例に示されるように、本発明のプライマーを用いることによって、上記3種類のEGFR遺伝子の異常をもつDNAにおいてのみ、PCRにおいて異常EGFR遺伝子の一部の塩基配列を増幅することが出来る。従って、上記3種類のEGFR遺伝子の異常のいずれももたないDNAにおいては、かかる塩基配列を有するPCR産物は増幅されない。PCR自体は、当業者には周知の反応であり、当業者であれば、適宜、反応条件を設定し実施することが出来る。このようなPCRの好適条件は、本明細書の実施例に記載されたものである。As shown in the Examples of the present specification, by using the primer of the present invention, a part of the base sequence of the abnormal EGFR gene is amplified by PCR only in the DNA having the abnormality of the above three types of EGFR genes. I can do it. Therefore, a PCR product having such a base sequence is not amplified in DNA having none of the three types of EGFR gene abnormalities. PCR itself is a reaction well known to those skilled in the art, and those skilled in the art can appropriately set and carry out reaction conditions. Suitable conditions for such PCR are those described in the Examples herein.
本発明は更に、本発明のプライマーから選択された1組または2組のプライマーをPCRに用いることを特徴とする、上記3種類のEGFR遺伝子の異常を検出する方法に係る。特に、EGFRdel19type1およびEGFRdeltype2を検出できるプライマー1組と、EGFR21L858Rを検出できるプライマー1組を同時に使用することによって、EGFRdel19Type1またはEGFRdel19type2と、EGFR21L858Rとを同時に検出し、識別することが可能となる。The present invention further relates to a method for detecting an abnormality in the above three types of EGFR genes, wherein one or two sets of primers selected from the primers of the present invention are used for PCR. In particular, by simultaneously using one set of primers capable of detecting EGFRdel19type1 and EGFRdeltype2 and one set of primers capable of detecting EGFR21L858R, EGFRdel19Type1 or EGFRdel19type2 and EGFR21L858R can be simultaneously detected and distinguished.
又、本発明は、上記の検出方法を用いて、ヒト組織におけるEGFR遺伝子の上記3種類の異常を検出する方法にも係る。ヒト組織としては、例えば肺癌組織、その他の癌組織、肺、リンパ節、血液、およびこれらをパラフィンで包埋した組織などが挙げられる。The present invention also relates to a method for detecting the three types of abnormalities of the EGFR gene in human tissues using the detection method described above. Examples of human tissues include lung cancer tissues, other cancer tissues, lungs, lymph nodes, blood, and tissues in which these are embedded in paraffin.
より具体的には、本発明者は、非特許文献1により報告されたEGFR19deltype1,EGFR19deltype2,EGFR21L858Rの3種類のEGFR遺伝子の異常についての遺伝子情報を基に特異的なプライマーを作製して、迅速かつ特異的に上記3種類の遺伝子異常を検出できるような遺伝子診断法が可能であるかを精査、検証した。More specifically, the present inventor prepared specific primers based on genetic information on abnormalities of the three types of EGFR genes, EGFR19deltype1, EGFR19deltype2, EGFR21L858R reported by Non-Patent Document 1, It was examined and verified whether a genetic diagnosis method capable of specifically detecting the above three types of gene abnormalities was possible.
EGFR19deltype1の異常をもつ塩基配列のPCR産物を特異的に増幅させるための1組の特異プライマー(EGFR19S4とEGFR19ASD1)を設計した。後者はEGFR遺伝子の塩基対番号2472番から2505番までの配列から、塩基対番号2481番から2495番の塩基を除いたものと相補的な配列である。このプライマーを用いてPCRを行ったところ、塩基対番号2481番から2495番の15塩基の欠失であるEGFR19deltype1の異常をもつDNAにおいて133bpの遺伝子が増幅された。一方、塩基対番号2482番から2496番のEGFR19deltype2はEGFR19deltype1と1塩基対のみが異なる異常であるが、上記のプライマーを用いたPCRではやはり19deltype2の異常をもつDNAにおいても133bpの遺伝子が増幅された。このPCR産物は確かに当該異常を持つEGFR遺伝子の一部であることがPCR産物を用いたダイレクトシークエンス法で確認された。以降、EGFR19deltype1ならびにEGFR19deltype2をまとめてEGFR19delと記す。A set of specific primers (EGFR19S4 and EGFR19ASD1) for specifically amplifying a PCR product having a base sequence having an abnormality of EGFR19deltype1 was designed. The latter is a sequence complementary to a sequence obtained by removing the base pairs Nos. 2481 to 2495 from the base pair Nos. 2472 to 2505 of the EGFR gene. When PCR was performed using this primer, a 133 bp gene was amplified in DNA having an abnormality of EGFR19deltype1, which is a deletion of 15 bases from base pairs No. 2481 to No. 2495. On the other hand, EGFR19deltype2 with base pair numbers 2482 to 2496 differs from EGFR19deltype1 only by one base pair, but the PCR using the above primers also amplified a 133 bp gene in DNA having 19deltype2 abnormality. . It was confirmed by the direct sequencing method using the PCR product that this PCR product was indeed part of the EGFR gene having the abnormality. Hereinafter, EGFR19deltype1 and EGFR19deltype2 are collectively referred to as EGFR19del.
また、配列番号3に示されたEGFR21L858Rの異常をもつ塩基配列のPCR産物を特異的に増幅させるための1組の特異プライマー(EGFR21SM1とEGFR21AS4)を設計した。このプライマーを用いてPCRを行ったところ、EGFR21L858Rの異常をもつDNAにおいて予測された104bpの遺伝子が増幅された。このPCR産物は確かに当該異常を持つEGFR遺伝子の一部であることがPCR産物を用いたダイレクトシークエンス法で確認された。In addition, a set of specific primers (EGFR21SM1 and EGFR21AS4) for specifically amplifying a PCR product having a nucleotide sequence having an abnormality of EGFR21L858R shown in SEQ ID NO: 3 was designed. When PCR was performed using this primer, a 104 bp gene predicted in DNA having an abnormality of EGFR21L858R was amplified. It was confirmed by the direct sequencing method using the PCR product that this PCR product was indeed part of the EGFR gene having the abnormality.
更に、これらのPCR産物は、正常ヒト血液や上記3種類以外のEGFR遺伝子の異常をもつ肺癌などから両検査法では増幅されなかった。また、2組のプライマーを混合してPCRを行うと、1回の反応でEGFR19delとEGFR21L858Rを同時に検出、鑑別することができた(図1参照)。Furthermore, these PCR products were not amplified by both test methods from normal human blood or lung cancer with EGFR gene abnormality other than the above three types. In addition, when two sets of primers were mixed and PCR was performed, EGFR19del and EGFR21L858R could be simultaneously detected and differentiated in one reaction (see FIG. 1).
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, this invention is not limited at all by these Examples.
EGFR19deltype1の異常をもつEGFR遺伝子の塩基配列に基づいて、新しいプライマーEGFR19ASD1及びEGFR19S4(133bp増幅)を設計した。また、L858Rの異常をもつEGFR遺伝子の塩基配列に基づいて、新しいプライマー、EGFR21SM1及びEGFR21AS4(104bp増幅)を設計した。New primers EGFR19ASD1 and EGFR19S4 (133 bp amplification) were designed based on the nucleotide sequence of the EGFR gene having an abnormality of EGFR19deltype1. In addition, new primers, EGFR21SM1 and EGFR21AS4 (104 bp amplification) were designed based on the nucleotide sequence of the EGFR gene having an abnormality of L858R.
次に、このプライマーの組合せ、EGFR19S4−EGFR19ASD1ならびにEGFR21SM1−EGFR21AS4により、EGFR19delならびにEGFR21L858Rの異常をもつDNAが特異的に増幅できることを確認するため、PCRを行った。PCRは、鋳型DNA 1μl、10XPCRバッファー(Qiagen)2.5μl、667nMの各プライマー、0.2UのTaqポリメラーゼ(Qiagen)、250μMの各デオキシヌクレオチド3リン酸(Amersham Pharmacia Biotech)を含んだ30μlの反応で行った。PCR反応は、94℃5分の一本鎖化反応の後、94℃30秒、56℃30秒、72℃30秒を32サイクル、その後72℃10分の伸長反応を行った。PCR増幅産物は、アガロースゲルの電気泳動で解析した。Next, PCR was performed in order to confirm that DNA having an abnormality in EGFR19del and EGFR21L858R can be specifically amplified with this combination of primers, EGFR19S4-EGFR19ASD1 and EGFR21SM1-EGFR21AS4. PCR was performed using 30 μl of reaction containing 1 μl of template DNA, 2.5 μl of 10 × PCR buffer (Qiagen), 667 nM of each primer, 0.2 U of Taq polymerase (Qiagen), 250 μM of each deoxynucleotide triphosphate (Amersham Pharmacia Biotech). I went there. The PCR reaction was performed at 94 ° C. for 5 minutes, followed by a single strand reaction, followed by 32 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 56 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 30 seconds, and then 72 ° C. for 10 minutes. PCR amplification products were analyzed by agarose gel electrophoresis.
その結果、EGFR19delに特異的なEGFR19S4−EGFR19ASD1のプライマーでは、予測された133bpの一本のバンドが、供試したEGFR19deltype1をもつことが判明している肺癌細胞株NCI−H1650(例えば、非特許文献3を参照)およびダイレクトシークエンスによりEGFR19deltype2をもつことが判明している肺癌患者検体L48の両者で増幅されたが、対照の正常人血液細胞およびダイレクトシークエンスによりEGFR19deltype1,EGFR19deltype2以外の異常をもつことが判明している肺癌細胞では増幅されなかった。それに対し、EGFR21L858Rに特異的なEGFR21SM1−EGFR21AS4を用いると、供試したEGFR21L858Rをもつことが判明している肺癌細胞株NCI−H1975(非特許文献3)では、予測された104bpのバンドが増幅されたが、対照の正常人血液細胞およびダイレクトシークエンスによりEGFR21L858R以外の異常をもつことが判明している肺癌細胞では増幅されなかった。なお、このPCR反応はパラフィン包埋組識から抽出したDNAにおいても増幅可能であった。As a result, in the primer for EGFR19S4-EGFR19ASD1 specific for EGFR19del, a lung band of the lung cancer cell line NCI-H1650 in which one predicted 133 bp band has been found to have EGFR19deltype1 (for example, non-patent literature) 3) and lung cancer specimen L48, which is known to have EGFR19deltype2 by direct sequencing, but was found to have abnormalities other than EGFR19deltype1 and EGFR19deltype2 by control normal human blood cells and direct sequencing It was not amplified in the lung cancer cells. On the other hand, when EGFR21SM1-EGFR21AS4 specific for EGFR21L858R is used, a predicted 104 bp band is amplified in the lung cancer cell line NCI-H1975 (Non-patent Document 3) that is known to have the tested EGFR21L858R. However, it was not amplified in control normal human blood cells and lung cancer cells that were found to have abnormalities other than EGFR21L858R by direct sequencing. This PCR reaction could be amplified even in DNA extracted from paraffin-embedded tissue.
従って、上記の133bp及び104bpのPCR増幅産物は、EGFR19delならびにEGFR21L858R固有の塩基配列であり、これらの特異的な検出に利用することが出来ることが判明した。Therefore, it was found that the 133 bp and 104 bp PCR amplification products described above are EGFR19del and EGFR21L858R-specific base sequences and can be used for specific detection thereof.
一回のPCR反応でEGFR19del、ならびにEGFR21L858Rの同時の検出と同定を可能にするため、EGFR19S4−EGFR19ASD1ならびにEGFR21SM1−EGFR21AS4のプライマーを混合してワンステップデュプレックスPCRを行った。PCRの反応条件およびプログラムは、上述の特異的PCR増幅反応と同じ条件で行った。
デュプレックスPCRの結果を図1に示す。2種類の特異的プライマーセットを用いることで、肺癌細胞株H1650および肺癌検体L48からは133bpの1本のバンドが得られたのに対し、肺癌細胞株H197では104bpの1本のバンドが観察できた。正常血液や、他の種類のEGFR遺伝子異常をもつ肺癌検体からは増幅産物は得られなかった。In order to enable simultaneous detection and identification of EGFR19del and EGFR21L858R in a single PCR reaction, one-step duplex PCR was performed by mixing EGFR19S4-EGFR19ASD1 and EGFR21SM1-EGFR21AS4 primers. The PCR reaction conditions and program were the same as those for the specific PCR amplification reaction described above.
The results of duplex PCR are shown in FIG. By using two kinds of specific primer sets, one band of 133 bp was obtained from lung cancer cell line H1650 and lung cancer specimen L48, whereas one band of 104 bp could be observed in lung cancer cell line H197. It was. No amplification products were obtained from normal blood or other types of lung cancer specimens with EGFR gene abnormalities.
本発明の2組の特異プライマーを用いたPCRによる遺伝子診断法は、EGFR19deltype1、EGFR19deltype2ならびにEGFR21L858Rの3種のEGFR遺伝子異常を検出することができることに加え、EGFR19delおよびEGFR21L858Rの2種の異常を同時に鑑別することが可能となった。さらに従来のダイレクトシークエンス法に比べ診断に要する時間を飛躍的に短縮することができる。よって今回作成された新たなプライマーの塩基配列は、今後ダイレクトシークエンス法が不可能であるパラフィン包埋臨床検体やダイレクトシークエンスを行うための設備のない場所におけるEGFR遺伝子の主要な異常の検出法、およびダイレクトシークエンス法の前のスクリーニング検査法として応用されることが期待される。
即ち、肺癌などの悪性腫瘍の治療のターゲットであるEGFR遺伝子の異常を特異的かつ迅速に検出、鑑別するための遺伝子診断法を提供することにより、肺癌などEGFR遺伝子の異常をもつヒト悪性腫瘍の治療に大きく貢献する。
また、一部を欠失した遺伝子に相補的なプライマーを用いてPCRを行うことにより、遺伝子の欠失を検出する方法は、他の遺伝子の欠失による異常についても応用可能であり、遺伝子欠失の簡便な検出法として役立つことが期待される。In addition to being able to detect three types of EGFR gene abnormalities of EGFR19deltype1, EGFR19deltype2 and EGFR21L858R, the genetic diagnosis method by PCR using the two sets of specific primers of the present invention simultaneously distinguishes two types of abnormalities of EGFR19del and EGFR21L858R. It became possible to do. Furthermore, the time required for diagnosis can be drastically reduced as compared with the conventional direct sequencing method. Therefore, the base sequence of the new primer created this time is a method for detecting major abnormalities of the EGFR gene in paraffin-embedded clinical specimens that cannot be directly used in the future, or where there are no facilities for direct sequencing, and It is expected to be applied as a screening test method before the direct sequencing method.
That is, by providing a genetic diagnostic method for specifically and rapidly detecting and distinguishing an abnormality in the EGFR gene, which is a target for the treatment of malignant tumors such as lung cancer, Contributes greatly to treatment.
In addition, the method of detecting a gene deletion by performing PCR using a primer complementary to a partially deleted gene can be applied to abnormalities caused by deletion of other genes. It is expected to be useful as a simple method for detecting loss.
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