JP2007191643A - Polyamino acid derivative imparted with fixability to living body - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、化粧品成分や医薬品成分等の生体機能分子を担持し生体における物理化学的状態を制御することで、該生体機能分子の機能を好適に発揮させるための材料に関する。さらに詳しくは、本発明は、細胞や生体組織への定着能を有する化合物を保有する生体適合性の高い水溶性高分子を骨格として、該水溶性高分子に生体機能分子に担持させることで、該生体機能分子が保有する機能を所望する細胞や生体組織において好適に発揮させることが可能な材料に関する。また、本発明は、生体組織への定着能を有する生体適合性の高い水溶性高分子を用いて生体機能分子を好適に機能させるための方法に関する。 The present invention relates to a material for suitably exerting the function of a biofunctional molecule by supporting a biofunctional molecule such as a cosmetic ingredient or a pharmaceutical ingredient and controlling the physicochemical state in the living body. More specifically, the present invention uses a highly biocompatible water-soluble polymer having a compound capable of fixing to cells and biological tissues as a skeleton, and supports the water-soluble polymer on a biofunctional molecule. The present invention relates to a material capable of suitably exerting the function possessed by the biofunctional molecule in a desired cell or biological tissue. The present invention also relates to a method for suitably functioning a biofunctional molecule using a highly biocompatible water-soluble polymer having a fixing ability to a living tissue.
化粧品や医薬品として、様々な生理活性を有する化合物が開発され、利用されてきている。これら化合物は、生理・生化学的な機能、すなわち、生体分子や細胞と相互作用することで、生体における様々な化学反応を促進または抑制する能力を示す。しかしながら、これらの化合物を単体で生体に作用させるだけでは、化合物が本来持っている生理・生化学的機能を十分に発揮できない場合がある。また、多くの化合物は望まれる生理・生化学的機能に加えて、生体にとって好ましくない副次的な影響を及ぼすことがある。このような観点から、生理活性を有する化合物を所望の部位で所望の時期、あるいは期間にわたって、所望の量だけ作用させるようなシステムの開発が試みられてきた。これらの多くは、生理活性を有する化合物とは直接関連のない他の材料との複合化を中心とした製剤化技術によってなされてきた。 Compounds having various physiological activities have been developed and used as cosmetics and pharmaceuticals. These compounds exhibit physiological / biochemical functions, that is, the ability to promote or suppress various chemical reactions in the living body by interacting with biomolecules and cells. However, there are cases in which the physiological and biochemical functions inherent to a compound cannot be sufficiently exhibited by simply allowing these compounds to act on a living body alone. In addition to the desired physiological and biochemical functions, many compounds may have side effects that are undesirable for the living body. From such a viewpoint, there has been an attempt to develop a system that allows a compound having physiological activity to act at a desired site at a desired time or for a desired amount. Many of these have been achieved by formulation techniques centering on complexation with other materials not directly related to compounds having physiological activity.
例えば、化粧料において、それを構成する各成分がそれぞれの機能を発揮することは重要な課題である。化粧料に求められる機能である、保湿、しわ改善、美白、酸化防止、ＵＶ阻害等の機能を肌上で効果的に発揮させるには高度な剤形設計が施されなければならない。化粧料の一般的な剤形としては、溶液、乳化、粉末、粘液状、ゼリー状、軟膏状などが挙げられる。また、基本３成分、すなわち、油相、水相、界面活性剤相から構成される種々相状態からなる剤形がある。例えば、乳化分散技術のひとつである油中水分散型（Ｗ／Ｏ型）や水中油分散型（Ｏ／Ｗ型）がある。また、これら分散型を更に高度に設計した多相分散型（Ｗ／Ｏ／Ｗ型やＯ／Ｗ／Ｏ型）は含有成分の安定化、徐放性が期待される。剤形を高度化する一方で、化粧料に期待される本質が損なわれることもある。肌に化粧料を塗ったときの感触である使用感が劣ること、有効成分の機能発現に加えて、機能の持続といった“化粧持ち”が低下するなども重要な課題である。化粧持ちの改善としては化粧崩れの防止が最も重要な課題である。化粧崩れの要因としては、皮脂や汗による肌からの浮き上がりとハンカチ等による物理的刺激による剥離が挙げられる。その問題を解決する手段として、肌への付着性向上、浮き上がり防止を目的とした高分子や油剤を利用した剤形設計が行われてきている。 For example, in cosmetics, it is an important subject that each component which comprises it exhibits each function. In order to effectively exert functions such as moisturizing, wrinkle improvement, whitening, antioxidant, and UV inhibition, which are required for cosmetics, on the skin, a high dosage form design must be applied. Common dosage forms of cosmetics include solutions, emulsifications, powders, mucilages, jellies, ointments and the like. There are also dosage forms composed of various three-phase states composed of three basic components, that is, an oil phase, an aqueous phase, and a surfactant phase. For example, there are a water-in-oil dispersion type (W / O type) and an oil-in-water dispersion type (O / W type), which are one of emulsification and dispersion techniques. Further, the multi-phase dispersion type (W / O / W type or O / W / O type) in which these dispersion types are designed to be more advanced is expected to stabilize the components contained and to provide sustained release. While improving the dosage form, the essence expected of cosmetics may be impaired. It is also important that the feeling of use, which is the feel when the cosmetic is applied to the skin, is inferior, and that “long-lasting” such as sustained function is reduced in addition to the expression of the function of the active ingredient. The most important issue for improving makeup retention is the prevention of makeup collapse. Causes of makeup collapse include lifting from the skin due to sebum and sweat and peeling due to physical stimulation such as handkerchief. As means for solving this problem, dosage form design using polymers and oils for the purpose of improving adhesion to the skin and preventing lifting has been performed.
また、医薬品の場合は、薬の副作用軽減と、有効医薬成分のバイオアベイラビリティーの向上を目的として、薬物を適量、適時に、適所へ到達せしめ、それ以外の部位への分布を抑えるような試みがなされている。このような技術概念はドラッグデリバリーシステムと呼ばれている。製剤化によるこれまでの主な試みとしては、シクロデキストリンやキトサン類を用いて薬剤の溶解性や、安定性、吸収性を改善したり、体内動態を制御しようとする研究が挙げられる。また、生体膜を模した脂質二重膜からなる小胞であるリポソームを用いた薬物の輸送、徐放についても研究例が多い。さらに、合成高分子からなるミセルやハイドロゲル、あるいはマイクロスフェアの中に薬剤を含有させ、輸送、徐放する系も開発されている。また、このようなドラッグデリバリーシステムを高度化したものとして、特定の細胞の表層や生体組織に薬剤をターゲッティングさせる技術も開発されている。細胞の表面にある特異的な抗原を認識するモノクローナル抗体と薬剤との連結などはその例である。これらの技術開発において、薬剤成分を担持または包含し、生体内での輸送を担い、必要な場所で必要な時期に、必要な量だけ該薬剤を放出させるような材料が求められている。 In the case of pharmaceuticals, in order to reduce the side effects of drugs and improve the bioavailability of active pharmaceutical ingredients, try to reach the right place in the right amount and time and reduce the distribution to other parts. Has been made. Such a technical concept is called a drug delivery system. The main attempts so far by formulation include studies to improve the solubility, stability and absorption of drugs and to control the pharmacokinetics using cyclodextrins and chitosans. There are also many examples of research on drug transport and sustained release using liposomes, which are vesicles composed of lipid bilayer membranes that mimic biological membranes. Furthermore, a system in which a drug is contained in micelles, hydrogels, or microspheres made of a synthetic polymer for transport and sustained release has been developed. Further, as a sophisticated version of such a drug delivery system, a technique for targeting a drug to the surface layer of a specific cell or a living tissue has been developed. An example is a linkage between a monoclonal antibody that recognizes a specific antigen on the surface of a cell and a drug. In these technological developments, there is a demand for a material that carries or includes a drug component, is responsible for transport in the living body, and releases the drug in a necessary amount at a necessary place and at a necessary time.
一方、外科的な医療の分野では、機能損失した臓器や、失われた生体組織を代替するために様々な材料が利用されている。これらは、人工皮膚や人工血管、人工心臓などの人工臓器として生体に埋め込まれて使用されたり、生体外で使用されて生体機能を補助する。また、診断や治療において様々な医療材料が直接生体と接触して用いられる。このような医療材料の例としては、カテーテルや各種のチューブ類、ステント、カニューレ、創傷被覆材、生体接着剤などが挙げられる。さらに、近年、再生医療に関する基礎研究や臨床応用が活発化しており、組織再生のための足場材料、体外細胞培養用の基材などの材料研究も進んでいる。 On the other hand, in the field of surgical medicine, various materials are used in order to replace organs that have lost their functions or living tissues that have been lost. These are used by being embedded in the living body as artificial organs such as artificial skin, artificial blood vessels, and artificial hearts, or used outside the living body to assist in the biological function. Also, various medical materials are used in direct contact with living bodies in diagnosis and treatment. Examples of such medical materials include catheters and various tubes, stents, cannulas, wound dressings, bioadhesives, and the like. Furthermore, in recent years, basic research and clinical application on regenerative medicine have been activated, and research on materials such as scaffold materials for tissue regeneration and base materials for in vitro cell culture has also been advanced.
これまで、生体材料には、生体に対して、抗原性を持たない、炎症反応を誘起しない、血栓が付着しないなどの、どちらかといえば不活性な特性が求められてきた。しかしながら、再生医療のような新しい治療概念においては、材料そのものに生体に積極的に働きかけ、細胞の増殖や組織分化を促すことで、治癒効果をもたせることも求められている。具体的には、細胞が定着して増殖するような環境を提供する足場材料であって、細胞増殖や分化を制御するような生理活性成分を担持して、適切に徐放させることができるような材料の開発が期待されている。 Until now, biomaterials have been required to have rather inactive characteristics such as non-antigenicity to the living body, no induction of inflammatory reaction, and no adhesion of thrombus. However, new therapeutic concepts such as regenerative medicine are also required to have a healing effect by actively acting on the living body of the material itself to promote cell proliferation and tissue differentiation. Specifically, it is a scaffold material that provides an environment in which cells settle and proliferate, and carries a physiologically active component that controls cell growth and differentiation so that it can be appropriately and slowly released. Development of new materials is expected.
上記のように化粧品や医薬品、医療材料の分野で、共通して求められる機能は、有効成分を担持して、適切な時期に適切な細胞または生体組織、器官において、適切な量だけ作用させるというものである。このような材料を開発することで、化粧品分野では、有効成分を担持させ皮膚上で好適に機能させるための基剤として、医薬品分野では、薬剤を細胞や組織に送達させて好適に機能させるためのＤＤＳ基剤として、医療材料や再生医療材料の分野では、生体に接触または埋め込んで用いることで治療効果や組織再生効果を発揮させるための材料、または材料創製のためのコーティング材としての展開が可能となる。さらに、これらの材料は、共通して、生体に対して利用されるため、生体適合性を有していることが望まれる。 As described above, a function that is commonly required in the fields of cosmetics, pharmaceuticals, and medical materials is to carry an active ingredient and act in an appropriate amount on an appropriate cell, body tissue, or organ at an appropriate time. Is. By developing such a material, in the cosmetics field, as a base for carrying an active ingredient and functioning suitably on the skin, in the pharmaceutical field, the drug is delivered to cells and tissues to function appropriately. As a DDS base, in the field of medical materials and regenerative medical materials, it can be used as a material for exerting a therapeutic effect and tissue regeneration effect by contacting or embedding in a living body, or as a coating material for material creation. It becomes possible. Furthermore, since these materials are commonly used for living organisms, it is desired that they have biocompatibility.
最近、このような機能を持つことが期待される化合物が報告されている（特許文献１、非特許文献１）。具体的には、ポリエチレングリコールのような両親媒性を有する水溶性高分子を骨格とし、末端に細胞定着性を付与するための不飽和脂肪族炭化水素基を結合させ、その反対側の末端に活性成分を結合させるために結合部位を有する構造をしている。しかしながら、この化合物は一分子内に活性化合物を一分子のみしか結合できないことから細胞の修飾剤としては相応しいものの、化粧品の基剤や、ＤＤＳ基剤としての展開には限界があると考えられる。また、化合物同士を架橋させることによる三次元構造化は困難であり、医療材料や再生医療用材料としての展開も限られてしまう。
これまでに、有効成分を担持した状態で細胞や生体組織へ定着させることで、該有効成分の機能を細胞や生体組織において好適に発揮させることが可能であり、かつ好適な生体適合性を有する材料は開発されていない。本発明の課題は、生体適合性を有する高分子材料であって、さまざまな生体機能分子をその量を制御しながら担持することが可能であり、さらに細胞や生体への定着能を有する化合物を保有することで、担持した生体機能分子の機能を好適に発揮させることができる高分子材料を提供することにある。本発明の別の課題は、細胞や生体組織に障害を与えることなく、また免疫系による排除などの好ましくない生体応答を引き起こすことなく、所望する生体機能分子を細胞や生体組織に定着させてその機能を好適に発揮させるための方法を提供することにある。 Until now, by fixing the active ingredient to a cell or living tissue, the function of the active ingredient can be suitably exerted on the cell or living tissue, and has suitable biocompatibility. The material has not been developed. An object of the present invention is a polymer material having biocompatibility, which is capable of supporting various biofunctional molecules while controlling the amount thereof, and further having a compound capable of fixing to a cell or a living body. An object of the present invention is to provide a polymer material capable of suitably exhibiting the function of the supported biofunctional molecule. Another object of the present invention is to fix a desired biofunctional molecule in a cell or living tissue without causing damage to the cell or living tissue or causing an undesirable biological response such as elimination by the immune system. It is in providing the method for making a function exhibit suitably.
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行ったところ、分子鎖内に複数の反応性官能基を有する水溶性高分子であり、生体適合性にも優れるポリアミノ酸を骨格とした材料を見出した。ポリアミノ酸の官能基を利用して、各種の生体機能分子を共有結合により担持させることができると同時に、細胞や生体組織への定着能を有する脂肪族炭化水素分子や細胞接着性ペプチド等をも担持させることが可能であり、細胞や生体組織に定着させることで、該生体機能分子の機能を好適に発揮させることが可能であることを見出した。生体機能分子を担持し、細胞や生体組織への定着性が付与された複合体は、溶性を保っており、化粧料や医薬品としての展開が容易であること、さらに、架橋することで三次元構造形成が可能であり、各種の医療材料や再生医療用材料への展開も可能であることを発見し、発明を完成させた。 The inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above-mentioned problems. As a result, the backbone is a polyamino acid that is a water-soluble polymer having a plurality of reactive functional groups in the molecular chain and has excellent biocompatibility. Found material. By using the functional group of polyamino acid, various biofunctional molecules can be supported by covalent bonds, and at the same time, aliphatic hydrocarbon molecules and cell adhesive peptides that have the ability to fix to cells and living tissues can be obtained. It has been found that the function of the biofunctional molecule can be suitably exerted by being carried on a cell or living tissue. Complexes that carry biofunctional molecules and are fixed to cells and biological tissues remain soluble, and can be easily developed as cosmetics and pharmaceuticals. The inventors have found that it is possible to form a structure and that it can be applied to various medical materials and regenerative medical materials, and have completed the invention.
すなわち、本発明は、
〔１〕下記一般式（Ｉ）乃至（III）
That is, the present invention
[1] The following general formulas (I) to (III)
（式中、Ｒ１は、生体機能分子の誘導体残基を示し、Ｒ２は細胞や生体組織への定着能を有する化合物の誘導体残基を示し、Ｘは酸素原子、窒素原子およびイオウ原子から選択され、Ｙは水素、アルカリ金属およびアルカリ土類金属から選択される少なくとも１種以上の元素を示し、ｍは１〜２の整数を示し、ｎは１〜３の整数を示す。）
で表されるα型又はβ型又はγ型ポリアミノ酸単量体単位から構成されるポリアミノ酸誘導体であり、かつ、下記の（ａ）または（ｂ）の少なくとも一方の様式により分子中に生体機能分子を有するポリアミノ酸誘導体であり、かつ、下記の（ｃ）または（ｄ）の少なくとも一方の様式により、細胞や生体組織への定着能を有する化合物を有することを特徴とするポリアミノ酸誘導体。
（ａ）一般式（Ｉ）の単量体単位を少なくとも１単位以上含むこと
（ｂ）少なくとも一方の末端が、生体機能分子で封止されていること
（ｃ）一般式（II）の単量体単位を少なくとも１単位以上含むこと
（ｄ）少なくとも一方の末端が、細胞や生体組織への定着能を有する化合物で封止されていること
〔２〕ポリアミノ酸誘導体が、ポリアスパラギン酸誘導体である前記〔１〕に記載のポリアミノ酸誘導体。
〔３〕前記一般式（Ｉ）における生体機能分子が、抗酸化剤、ＵＶ吸収剤、抗菌剤、サイトカイン類、ホルモン類、からなる群から選択される少なくとも１種類を含む前記〔１〕〜〔２〕のいずれかに記載のポリアミノ酸誘導体。
〔４〕末端の封止に用いられる生体機能分子が、抗酸化剤、ＵＶ吸収剤、抗菌剤、サイトカイン類、ホルモン類、からなる群から選択される少なくとも１種類を含む前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のポリアミノ酸誘導体。
〔５〕前記一般式（II）におけるＲ２が、ヒドロキシ基またはヘテロ原子を含んでも構わない炭素原子数１〜２２の不飽和または飽和炭化水素基からなる、前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のポリアミノ酸誘導体。
〔６〕末端の封止に用いられる細胞や生体組織への定着能を有する化合物が、ヒドロキシ基またはヘテロ原子を含んでも構わない炭素原子数１〜２２の不飽和または飽和炭化水素基並びに当該基を有する化合物からなる、前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のポリアミノ酸誘導体。
〔７〕前記一般式（II）におけるＲ２が、炭素数１２〜２２の不飽和または飽和脂肪族炭化水素基群から選択される少なくとも１種類を含む前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のポリアミノ酸誘導体。
〔８〕末端の封止に用いられる細胞や生体組織への定着能を有する化合物が、炭素数１２〜２２の不飽和または飽和脂肪族炭化水素基群並びに当該基を有する化合物から選択される少なくとも１種類を含む前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のポリアミノ酸誘導体。
〔９〕前記一般式（II）におけるＲ2が、ラウリル基、ミリスチル基、パルミチル基、パルミトレオイル基、ステアリル基、オレイル基、リノレオイル基、α−リノレノイル基、γ−リノレノイル基、アラキドノイル基、エイコサペンタノイル基及びドコサヘキサエノイル基からなる群から選択される少なくとも１種類を含む前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載のポリアミノ酸誘導体。
〔１０〕末端の封止に用いられる細胞や生体組織への定着能を有する化合物が、ラウリル基、ミリスチル基、パルミチル基、パルミトレオイル基、ステアリル基、オレイル基、リノレオイル基、α−リノレノイル基、γ−リノレノイル基、アラキドノイル基、エイコサペンタノイル基及びドコサヘキサエノイル基からなる群並びに当該基を有する化合物から選択される少なくとも１種類を含む前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載のポリアミノ酸誘導体。
〔１１〕前記一般式（II）における細胞や生体組織への定着能を有する化合物が、細胞接着性ペプチド、細胞表面に存在するレセプターに対するリガンド、細胞表面に存在するレセプターに対するアンタゴニスト、前記以外の細胞への定着活性を有する化合物群から選択される少なくとも１種類を含む前記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載のポリアミノ酸誘導体。
〔１２〕末端の封止に用いられる細胞や生体組織への定着能を有する化合物が、細胞接着性ペプチド、細胞表面に存在するレセプターに対するリガンド、細胞表面に存在するレセプターに対するアンタゴニスト、前記以外の細胞への定着活性を有する化合物群から選択される少なくとも１種類を含む前記〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載のポリアミノ酸誘導体。
〔１３〕前記〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の記載のポリアミノ酸誘導体が、架橋され三次元構造を形成していることを特徴とする材料。
〔１４〕前記〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載のポリアミノ酸誘導体または〔１３〕に記載の材料を細胞や生体に作用させることにより、該ポリアミノ酸誘導体または材料に担持された生体機能分子の機能を持続的かつ有効に発揮させる方法。
に関する。
(In the formula, R 1 represents a derivative residue of a biofunctional molecule, R 2 represents a derivative residue of a compound capable of fixing to a cell or a living tissue, and X represents an oxygen atom, a nitrogen atom, or a sulfur atom. And Y represents at least one element selected from hydrogen, alkali metals and alkaline earth metals, m represents an integer of 1 to 2, and n represents an integer of 1 to 3).
A polyamino acid derivative composed of an α-type, β-type, or γ-type polyamino acid monomer unit represented by the formula, and a biological function in the molecule by at least one of the following modes (a) or (b): A polyamino acid derivative having a molecule and having a compound capable of fixing to a cell or a living tissue in at least one of the following modes (c) and (d):
(A) at least one monomer unit of the general formula (I) is included (b) at least one terminal is sealed with a biofunctional molecule (c) a single monomer of the general formula (II) (D) at least one end is sealed with a compound capable of fixing to cells and living tissues [2] The polyamino acid derivative is a polyaspartic acid derivative The polyamino acid derivative according to the above [1].
[3] The biofunctional molecule in the general formula (I) includes at least one selected from the group consisting of an antioxidant, a UV absorber, an antibacterial agent, a cytokine, and a hormone. [2] The polyamino acid derivative according to any one of [2].
[4] The above-mentioned [1] to [1], wherein the biofunctional molecule used for terminal sealing contains at least one selected from the group consisting of antioxidants, UV absorbers, antibacterial agents, cytokines and hormones. 3] The polyamino acid derivative according to any one of [3].
[5] The above-mentioned [1] to [4], wherein R 2 in the general formula (II) is an unsaturated or saturated hydrocarbon group having 1 to 22 carbon atoms which may contain a hydroxy group or a hetero atom. The polyamino acid derivative according to any one of the above.
[6] Unsaturated or saturated hydrocarbon group having 1 to 22 carbon atoms, which may contain a hydroxy group or a hetero atom, and the group used as the compound having the ability to fix to cells and living tissues used for terminal sealing The polyamino acid derivative according to any one of [1] to [5], comprising a compound having
[7] Any one of [1] to [6], wherein R 2 in the general formula (II) includes at least one selected from an unsaturated or saturated aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms. The polyamino acid derivative according to 1.
[8] The compound having the ability to fix to cells or living tissues used for terminal sealing is at least selected from an unsaturated or saturated aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms and a compound having the group The polyamino acid derivative according to any one of [1] to [7], including one kind.
[9] R 2 in the general formula (II) is a lauryl group, a myristyl group, a palmityl group, a palmitoleyl group, a stearyl group, an oleyl group, a linoleoyl group, an α-linolenoyl group, a γ-linolenoyl group, an arachidonoyl group, The polyamino acid derivative according to any one of [1] to [8], including at least one selected from the group consisting of an eicosapentanoyl group and a docosahexaenoyl group.
[10] A compound having an ability of fixing to a cell or a living tissue used for terminal sealing is a lauryl group, a myristyl group, a palmityl group, a palmitoleyl group, a stearyl group, an oleyl group, a linoleoyl group, or an α-linolenoyl group. Γ-linolenoyl group, arachidonoyl group, eicosapentanoyl group and docosahexaenoyl group, and at least one selected from compounds having the group, any one of [1] to [8] The polyamino acid derivative described.
[11] The compound having the ability to adhere to a cell or a living tissue in the general formula (II) is a cell adhesion peptide, a ligand for a receptor present on the cell surface, an antagonist for a receptor present on the cell surface, a cell other than the above The polyamino acid derivative according to any one of the above [1] to [10], which comprises at least one selected from the group of compounds having a fixing activity to the skin.
[12] A compound used to seal a cell or a living tissue used for terminal sealing is a cell-adhesive peptide, a ligand for a receptor present on the cell surface, an antagonist for a receptor present on the cell surface, or any other cell The polyamino acid derivative according to any one of the above [1] to [11], which comprises at least one selected from the group of compounds having fixing activity.
[13] A material in which the polyamino acid derivative according to any one of [1] to [12] is crosslinked to form a three-dimensional structure.
[14] A biological function carried on the polyamino acid derivative or material by allowing the polyamino acid derivative according to any one of [1] to [12] or the material according to [13] to act on a cell or a living body. A method to make the function of molecules last and effectively.
About.
本発明によれば、有効成分を担持した状態で細胞や生体組織へ定着させることで、該有効成分の機能を細胞や生体組織において好適に発揮させることが可能であり、かつ好適な生体適合性を有するポリアミノ酸誘導体を提供することができる。ポリアミノ酸は、分子鎖中に複数の反応性官能基を有しており、さまざまな生体機能分子をその量を制御しながら担持することが可能であり、細胞や生体への定着能を有する化合物を同時に保有することで、担持した生体機能分子の機能を好適に発揮させることができる高分子材料を提供し得る。また、ポリアミノ酸を骨格とした材料は、細胞や生体組織に障害を与えることなく、また免疫系による排除などの好ましくない生体応答を引き起こす可能性が低いため、所望する生体機能分子を細胞や生体組織に定着させてその機能を好適に発揮させるための方法を提供することが可能である。 According to the present invention, the function of the active ingredient can be suitably exerted in the cell or the living tissue by being fixed to the cell or the living tissue in a state where the active ingredient is supported, and the suitable biocompatibility. It is possible to provide a polyamino acid derivative having Polyamino acid has a plurality of reactive functional groups in the molecular chain, and can carry various biofunctional molecules while controlling the amount of the compound, and is a compound that has the ability to fix to cells and living bodies. Can be provided at the same time to provide a polymer material capable of suitably exerting the function of the supported biofunctional molecule. In addition, polyamino acid-based materials are unlikely to cause unfavorable biological responses such as exclusion by the immune system without causing damage to cells and biological tissues. It is possible to provide a method for allowing the tissue to settle and suitably exhibit its function.
本発明は、分子中に生体機能(性)分子及び細胞や生体組織への定着能を有する化合物を含むポリアミノ酸誘導体に関するものであり、さらに、当該ポリアミノ酸誘導体を用いて各種の生体機能分子の機能を細胞や生体組織において好適に発揮させるための方法に関する。 The present invention relates to a polyamino acid derivative containing a biofunctional (sex) molecule in the molecule and a compound capable of fixing to a cell or a living tissue, and further using the polyamino acid derivative, The present invention relates to a method for suitably exerting a function in a cell or a living tissue.
本発明とは、下記一般式（Ｉ）乃至（III） The present invention refers to the following general formulas (I) to (III)
（式中、Ｒ１は、生体機能分子の誘導体残基を示し、Ｒ２は細胞や生体組織への定着能を有する化合物の誘導体残基を示し、Ｘは酸素原子、窒素原子およびイオウ原子から選択され、Ｙは水素、アルカリ金属およびアルカリ土類金属から選択される少なくとも１種以上の元素を示し、ｍは１〜２の整数を示し、ｎは１〜３の整数を示す。）
で表されるα型又はβ型又はγ型ポリアミノ酸単量体単位から構成されるポリアミノ酸誘導体であり、かつ、下記の（ａ）または（ｂ）の少なくとも一方の様式により分子中に生体機能分子を有するポリアミノ酸誘導体であり、かつ、下記の（ｃ）または（ｄ）の少なくとも一方の様式により、細胞や生体組織への定着能を有する化合物を有することを特徴とするポリアミノ酸誘導体である。
（ａ）一般式（Ｉ）の単量体単位を少なくとも１単位以上含むこと
（ｂ）少なくとも一方の末端が、生体機能分子で封止されていること
（ｃ）一般式（II）の単量体単位を少なくとも１単位以上含むこと
（ｄ）少なくとも一方の末端が、細胞や生体組織への定着能を有する化合物で封止されていること
(In the formula, R 1 represents a derivative residue of a biofunctional molecule, R 2 represents a derivative residue of a compound capable of fixing to a cell or a living tissue, and X represents an oxygen atom, a nitrogen atom, or a sulfur atom. And Y represents at least one element selected from hydrogen, alkali metals and alkaline earth metals, m represents an integer of 1 to 2, and n represents an integer of 1 to 3).
A polyamino acid derivative composed of an α-type, β-type, or γ-type polyamino acid monomer unit represented by the formula, and a biological function in the molecule by at least one of the following modes (a) or (b): A polyamino acid derivative having a molecule and having a compound capable of fixing to a cell or a living tissue in at least one of the following modes (c) and (d): .
(A) at least one monomer unit of the general formula (I) is included (b) at least one terminal is sealed with a biofunctional molecule (c) a single monomer of the general formula (II) Containing at least one body unit (d) at least one end being sealed with a compound capable of fixing to cells or living tissue
また、本発明とは、当該ポリアミノ酸誘導体が、架橋され三次元構造を形成していることを特徴とする材料である。さらに、本発明とは、当該ポリアミノ酸誘導体または材料を細胞や生体に作用させることにより、当該ポリアミノ酸誘導体または材料に担持された生体機能分子の機能を持続的かつ有効に発揮させる方法である。 The present invention is a material characterized in that the polyamino acid derivative is crosslinked to form a three-dimensional structure. Furthermore, the present invention is a method for continuously and effectively exerting the function of a biofunctional molecule carried on the polyamino acid derivative or material by allowing the polyamino acid derivative or material to act on cells or a living body.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、ポリアミノ酸とは、アミノ酸がペプチド縮重合した重合体をも包含する。また本発明において、重合体及びポリマーは相互に等価な意味である。重合体（ポリマー）を構成する単量体単位の配列の様式は、共重合体（コポリマー）である場合はランダム共重合体、ブロック共重合体、グラフト共重合体の何れでもよい。また、重合体（ポリマー）の分子鎖は、線状、大環状、分岐状、星状、三次元網目状のいずれでも良い。本発明において、炭化水素基は、直鎖状、分岐状、環状の何れでもよく、原子団の中に、Ｎ、Ｏ、Ｓ等のＣやＨ以外の原子が含まれていてもよい。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the present invention, the polyamino acid also includes a polymer obtained by peptide condensation polymerization of amino acids. In the present invention, a polymer and a polymer are equivalent to each other. The arrangement of the monomer units constituting the polymer (polymer) may be any of a random copolymer, a block copolymer, and a graft copolymer in the case of a copolymer (copolymer). The molecular chain of the polymer (polymer) may be linear, macrocyclic, branched, star-shaped, or three-dimensional network-shaped. In the present invention, the hydrocarbon group may be linear, branched or cyclic, and atoms other than C and H such as N, O and S may be contained in the atomic group.
本発明のポリアミノ酸誘導体は、その基本骨格がアミノ酸誘導体の単量体単位から成るものであればよく、特に制限はないが、特に、ポリアスパラギン酸誘導体であることが好ましい。 The polyamino acid derivative of the present invention is not particularly limited as long as its basic skeleton is composed of a monomer unit of an amino acid derivative, and is particularly preferably a polyaspartic acid derivative.
本発明におけるポリアスパラギン酸およびその誘導体は、分子鎖中には、α−カルボキシル基またはβ−カルボキシル基が反応性官能基として存在し、水溶性に優れている。また、加水分解、酵素分解によりアスパラギン酸モノマーに分解されるため、生体吸収性を示す。さらに、抗原性や発ガン性などの生体にとって好ましくない性質については報告されておらず、極めて安全性の高い材料である。 The polyaspartic acid and derivatives thereof in the present invention have an α-carboxyl group or β-carboxyl group as a reactive functional group in the molecular chain and are excellent in water solubility. Moreover, since it is decomposed into an aspartic acid monomer by hydrolysis and enzymatic decomposition, it exhibits bioabsorbability. Furthermore, properties that are undesirable for the living body such as antigenicity and carcinogenicity have not been reported, and the material is extremely safe.
本発明で用いられるポリアミノ酸誘導体は、例えば、ポリこはく酸イミドを原料として製造できる。 The polyamino acid derivative used in the present invention can be produced using, for example, polysuccinimide as a raw material.
ポリこはく酸イミドは、従来より知られる各種の方法で製造でき、例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８０，３３６１（１９８５） には、アスパラギン酸を２００℃で２〜３時間加熱縮合させることにより、ポリこはく酸イミドを製造する方法が開示されている。特公昭４８−２０６３８号公報には、８５％のリン酸を触媒としてロータリーエバポレーターを使用して薄膜状でアスパラギン酸の反応を行うことにより、高分子量のポリこはく酸イミドを得る方法が開示されている。米国特許第５０５７５９７号には、工業的にポリこはく酸イミドを得る方法として、流動床によりポリアスパラギン酸を加熱縮合させる方法が開示されている。また。さらに高分子量のポリこはく酸イミドを必要とする場合には、上記の方法で得られたポリこはく酸イミドを、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの縮合剤で処理することにより連結することもできる。 Polysuccinimide can be produced by various methods known in the art. Am. Chem. Soc. , 80, 3361 (1985) discloses a method for producing polysuccinimide by heat condensation of aspartic acid at 200 ° C. for 2 to 3 hours. Japanese Patent Publication No. 48-20638 discloses a method of obtaining a high molecular weight polysuccinimide by reacting aspartic acid in a thin film using a rotary evaporator with 85% phosphoric acid as a catalyst. Yes. US Pat. No. 5,057,597 discloses a method for industrially obtaining polysuccinimide by heat condensation of polyaspartic acid in a fluidized bed. Also. Further, when a high molecular weight polysuccinimide is required, the polysuccinimide obtained by the above method can be linked by treating with a condensing agent such as dicyclohexylcarbodiimide.
本発明のポリアミノ酸誘導体を製造する為に使用するポリこはく酸イミドの分子量は、所望の特性を有する生成物が実質的に得られれば特に制限されない。一般的には、ポリこはく酸イミドの分子量は、２０００〜５０００００程度が好ましく、１００００〜４０００００程度がより好ましく、１５０００〜２０００００程度が特に好ましい。この分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーで、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液中、４５℃で測定し、ポリスチレン標準で求めた値である。使用するポリこはく酸イミドの分子量が低ければ、得られるポリアミノ酸誘導体の分子量も低くなり、ポリこはく酸イミドの分子量が高ければ、得られるポリアミノ酸誘導体の分子量も高くなる。 The molecular weight of the polysuccinimide used for producing the polyamino acid derivative of the present invention is not particularly limited as long as a product having desired characteristics is substantially obtained. Generally, the molecular weight of polysuccinimide is preferably about 2000 to 500000, more preferably about 10000 to 400000, and particularly preferably about 15000 to 200000. This molecular weight is a value obtained by measuring with a gel permeation chromatography at 45 ° C. in an N, N-dimethylformamide solution and using a polystyrene standard. If the molecular weight of the polysuccinimide used is low, the molecular weight of the resulting polyamino acid derivative will be low, and if the molecular weight of the polysuccinimide is high, the molecular weight of the polyamino acid derivative obtained will also be high.
本発明のポリこはく酸イミドからポリアミノ酸誘導体を製造する際の方法は、特に制限されず、例えば、以下の製造方法が挙げられる。先ず、ポリこはく酸イミドを適当な溶媒に溶解する。この溶媒としては、ポリこはく酸イミドが溶解し、アミン類との反応で副反応を起こさなければ特に限定されない。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、スルホラン等が用いられる。 The method in particular when manufacturing a polyamino acid derivative from the polysuccinimide of this invention is not restrict | limited, For example, the following manufacturing methods are mentioned. First, polysuccinimide is dissolved in a suitable solvent. The solvent is not particularly limited as long as polysuccinimide is dissolved and no side reaction is caused by reaction with amines. For example, N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, sulfolane and the like are used.
この溶媒中で、ポリこはく酸イミドのイミド環に対して、アミノ基を有する化合物（アミン類）を反応させる。ポリこはく酸イミドのイミド環のモル数に対して、アミン類を１倍モル添加し反応を行うと、アミン類はイミド環を開環させて付加し、側鎖のグラフト構造を形成する。 In this solvent, the compound (amines) having an amino group is reacted with the imide ring of polysuccinimide. When the reaction is performed by adding 1 mole of amine to the number of moles of the imide ring of polysuccinimide, the amine is added by opening the imide ring to form a side chain graft structure.
次いで、得られた反応混合物を、貧溶媒中に排出する。この貧溶媒としては、ポリアミノ酸誘導体が沈殿し、その後濾過乾燥した際に、ポリアミノ酸誘導体の結晶中に残存しないような溶媒であれば特に限定されない。例えば、アセトニトリル、アセトン、メタノール、エタノール等が用いられる。上述のようにして得た沈殿を濾取し、貧溶媒で洗浄し、乾燥することにより、目的のポリアミノ酸誘導体が得られる。 The resulting reaction mixture is then discharged into a poor solvent. The poor solvent is not particularly limited as long as the polyamino acid derivative is precipitated and then filtered and dried so that it does not remain in the crystal of the polyamino acid derivative. For example, acetonitrile, acetone, methanol, ethanol or the like is used. The target polyamino acid derivative is obtained by filtering the precipitate obtained as described above, washing with a poor solvent, and drying.
また本発明のポリアミノ酸誘導体は、適当な溶媒に溶解することが好ましいが、特に水、エタノール、グリセリン、エチレングリコール、１，３−ブタンジオールなどの溶媒に溶解することが好ましい。更に水に溶解することが最も好ましい。 The polyamino acid derivative of the present invention is preferably dissolved in a suitable solvent, but is particularly preferably dissolved in a solvent such as water, ethanol, glycerin, ethylene glycol, 1,3-butanediol. Further, it is most preferable to dissolve in water.
本発明のポリアミノ酸の分子量範囲は特に限定させるものではない。好ましくは、１００〜１０００００、より好ましくは１０００〜１００００である。 The molecular weight range of the polyamino acid of the present invention is not particularly limited. Preferably, it is 100-100000, More preferably, it is 1000-10000.
上記一般式（Ｉ）におけるＲ１は、生体機能分子の誘導体残基を示す。 R 1 in the general formula (I) represents a derivative residue of a biofunctional molecule.
本発明における生体機能分子とは、化粧品や医薬品の活性成分を初めとして、天然、非天然の化合物のうち、細胞や生体に対して何らかの化学的、物理的作用を有する化合物を指す。このような生体機能分子の種類としては、化粧品成分の場合、化粧品として用いられ可能性のあるすべての活性成分が対象である。例えば、酸化防止、美白、しわ改善、抗菌、ＵＶ吸収、保湿などの機能を有する化合物が挙げられる。酸化防止効果を有する成分（所謂、抗酸化剤）としてビオチンやチオタウリンなどがあげられる。これらは、化粧料に配合されて用いられているが、化粧料塗布後、洗浄等で簡単に皮膚から脱離してしまい効果を持続させるのが難しいため、本発明のポリアミノ酸誘導体に担持させて、皮膚への定着により持続的に効果を発揮させるのに好適な成分である。また、ＵＶ吸収剤としては、パラメトキシ桂皮酸類やパラアミノ安息香酸などが挙げられるが、皮膚刺激性が強く、皮膚浸透を抑えることが望まれているため、これらについても本発明のポリアミノ酸誘導体担持させることにより、皮膚浸透性を抑え、ＵＶ遮断効果を持続的に発揮させるのに好適の成分である。消臭等の目的で利用される抗菌剤として、銀イオンなどが挙げられるが、これらについても、皮膚上で持続的に機能を発揮することが求められており、本発明の生体機能分子の対象として好適である。 The biofunctional molecule in the present invention refers to a compound having some chemical or physical action on cells or living bodies among natural and non-natural compounds including active ingredients of cosmetics and pharmaceuticals. In the case of cosmetic ingredients, the types of such biofunctional molecules are all active ingredients that may be used as cosmetics. For example, the compound which has functions, such as antioxidant, whitening, wrinkle improvement, antibacterial, UV absorption, and moisture retention, is mentioned. Examples of components having an antioxidant effect (so-called antioxidants) include biotin and thiotaurine. These are used by being blended in cosmetics, but after application of the cosmetics, they are easily detached from the skin by washing or the like and it is difficult to maintain the effect, so they are supported on the polyamino acid derivative of the present invention. It is a component suitable for exerting an effect continuously by fixing to the skin. Examples of UV absorbers include paramethoxycinnamic acids and paraaminobenzoic acid. However, since the skin irritation is strong and it is desired to suppress skin penetration, these are also supported on the polyamino acid derivative of the present invention. Therefore, it is a suitable component for suppressing the skin permeability and continuously exerting the UV blocking effect. Antibacterial agents used for the purpose of deodorization and the like include silver ions, etc., and these are also required to exert their functions continuously on the skin, and are subject to the biofunctional molecules of the present invention. It is suitable as.
医薬品の領域では、活性を有する薬剤の全てが対象となる。特に、制癌剤、免疫抑制剤などの医薬品では、ＤＤＳに基づく投薬が重要であり、好適に用いられる。 In the pharmaceutical field, all active drugs are targeted. In particular, in medicines such as anticancer agents and immunosuppressants, medication based on DDS is important and is preferably used.
医療材料、再生医療材料の領域においても、医薬品の領域で対象となる薬剤が対象となるが、特に、細胞増殖や分化にかかわる因子、いわゆるサイトカイン類が主な対象となる。サイトカインのようなタンパク質を本発明のポリアミノ酸誘導体に担持させる場合、その結合様式は特に制限されないが、タンパク質の高次構造や活性を損なわないような工夫が必要である。主な結合様式としては、Ｎ末端のアミノ基やリジン残基のε−アミノ基を介した結合、システイン残基のＳＨ基を介した結合などが挙げられる。また、化学的あるいは遺伝子工学的な手法により、対象となるポリペプチド鎖にスペーサーやタグを付加して、これらを介して本発明の水溶性高分子骨格と結合させることも可能である。 In the field of medical materials and regenerative medical materials, drugs targeted in the field of pharmaceuticals are targeted, but in particular, factors related to cell proliferation and differentiation, so-called cytokines, are mainly targeted. When a protein such as a cytokine is supported on the polyamino acid derivative of the present invention, the binding mode is not particularly limited, but it is necessary to devise so as not to impair the higher-order structure and activity of the protein. Examples of the main binding mode include binding via the N-terminal amino group or the ε-amino group of a lysine residue, and binding via the SH group of a cysteine residue. It is also possible to add a spacer or tag to the polypeptide chain of interest by chemical or genetic engineering techniques, and to bind to the water-soluble polymer skeleton of the present invention through these.
また、ホルモンやホルモン様活性を示す化合物（ホルモン類）も本発明の生体機能分子の対象であり、インシュリンや成長ホルモンなどのペプチドまたはタンパク性のホルモンが好適に用いられる。これらホルモン類についても、サイトカイン類と同様に、本発明のポリアミノ酸誘導体に担持させることができ、細胞や生体組織への定着能を付与することで、該ホルモン類の機能を持続的かつ好適に発揮することが可能となる。 In addition, hormones and compounds exhibiting hormone-like activity (hormones) are also targets of the biofunctional molecules of the present invention, and peptides or protein hormones such as insulin and growth hormone are preferably used. Similar to cytokines, these hormones can be supported on the polyamino acid derivative of the present invention, and by imparting fixing ability to cells and living tissues, the function of the hormones can be maintained continuously and suitably. It becomes possible to demonstrate.
本発明における生体機能分子としては、抗酸化剤、ＵＶ吸収剤、抗菌剤、サイトカイン類またはホルモン類等が好適な例として挙げられる。 Preferred examples of the biofunctional molecule in the present invention include antioxidants, UV absorbers, antibacterial agents, cytokines or hormones.
本発明のポリアミノ酸誘導体における生体機能分子の結合の様式については、特に限定されない。より好ましいポリアミノ酸骨格であるポリアスパラギン酸誘導体の場合、カルボキシル基と結合可能な官能基があればそれを利用することができる。結合可能な官能基がない場合でも、生体機能分子を誘導体化したり、適当なスペーサーを介することにより、結合可能となる。結合に利用可能な官能基としては、アミノ基、水酸基、チオール基、カルボキシル基等が挙げられる。また、スペーサーの種類や構造についても特に限定されない。 There are no particular restrictions on the mode of biofunctional molecule binding in the polyamino acid derivative of the present invention. In the case of a polyaspartic acid derivative which is a more preferable polyamino acid skeleton, any functional group capable of binding to a carboxyl group can be used. Even when there is no functional group capable of binding, binding can be achieved by derivatizing the biofunctional molecule or through an appropriate spacer. Examples of functional groups that can be used for bonding include amino groups, hydroxyl groups, thiol groups, and carboxyl groups. Also, the type and structure of the spacer are not particularly limited.
上記一般式（II）におけるＲ２は細胞や生体組織への定着能を有する化合物の誘導体残基を示す。 R 2 in the above general formula (II) represents a derivative residue of a compound having the ability to fix cells or living tissues.
本発明の細胞や生体組織への定着能を有する化合物とは、細胞膜を構成するリン脂質やタンパク質と相互作用することにより、非共有結合的に細胞膜に結合する能力を有する化合物を指す。このような化合物の一例としては、細胞膜を構成する脂質部分と高い親和性を有する炭化水素基が挙げられ、より具体的には、ヒドロキシ基またはヘテロ原子を含んでも構わない炭素原子数１〜２２の不飽和または飽和炭化水素基からなる化合物が好適に用いられる。上記において、より具体的には、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアルケニル基、ヒドロキシアルキニル基、アルコキシアルキル基、アルコキシアルケニル基、アルコキシアルキニル基、アミノアルキル基、アミノアルケニル基、アミノアルキニル基、アルキルアミノアルキル基、アルキルアミノアルケニル基、アルキルアミノアルキニル基、等が挙げられる。以下、より具体的に説明する。 The compound having the ability to fix to cells and living tissues of the present invention refers to a compound having the ability to bind to the cell membrane non-covalently by interacting with phospholipids and proteins constituting the cell membrane. An example of such a compound is a hydrocarbon group having a high affinity with a lipid moiety constituting a cell membrane. More specifically, the number of carbon atoms may be 1 to 22 which may contain a hydroxy group or a hetero atom. A compound consisting of an unsaturated or saturated hydrocarbon group is preferably used. In the above, more specifically, alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, hydroxyalkyl group, hydroxyalkenyl group, hydroxyalkynyl group, alkoxyalkyl group, alkoxyalkenyl group, alkoxyalkynyl group, aminoalkyl group, aminoalkenyl group, Examples thereof include an aminoalkynyl group, an alkylaminoalkyl group, an alkylaminoalkenyl group, and an alkylaminoalkynyl group. More specific description will be given below.
ここで、上記「アルキル」とは、線状でもよいし、枝分かれしてもよいアルキルであり、具体的には例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル等が挙げられる。上記「アルケニル」としては、１〜３個の２重結合を有する炭素数２〜１０の直鎖または分岐鎖のアルケニルが挙げられ，具体的には例えば、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−メチルエテニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−メチル−２−プロペニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、４−ペンテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、１−ヘプテニル、２−ヘプテニル、１−オクテニル、２−オクテニル、１，３−オクタジエニル、２−ノネニル、１，３−ノナジエニル、２−デセニル等が挙げられる。上記「アルキニル基」としては、１〜３個の３重結合を有する炭素数２〜１０の直鎖または分岐鎖のアルキニルが挙げられ、具体的には例えば、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、４−ペンチニル、１−オクチニル、６−メチル−１−ヘプチニル、２−デシニル等が挙げられる。 Here, the “alkyl” may be linear or branched alkyl, specifically, for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, t-butyl, pentyl, isopentyl, Neopentyl, hexyl, isohexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, nonadecyl and the like. Examples of the “alkenyl” include straight-chain or branched alkenyl having 1 to 3 double bonds and specifically include ethenyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-methylethenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, 2-methyl-2-propenyl, 1-pentenyl, 2-pentenyl, 4-pentenyl, 3-methyl-2-butenyl, 1-hexenyl, 2- Hexenyl, 1-heptenyl, 2-heptenyl, 1-octenyl, 2-octenyl, 1,3-octadienyl, 2-nonenyl, 1,3-nonadienyl, 2-decenyl and the like can be mentioned. Examples of the “alkynyl group” include straight-chain or branched alkynyl having 1 to 3 triple bonds and specifically include ethynyl, 1-propynyl, 2-propynyl. 1-butynyl, 2-butynyl, 3-butynyl, 1-pentynyl, 2-pentynyl, 4-pentynyl, 1-octynyl, 6-methyl-1-heptynyl, 2-decynyl and the like.
さらに、上記に説明したアルキル基、アルケニル基、アルキニル基にそれぞれヒドロキシル基が結合したヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアルケニル基、ヒドロキシアルキニル基、また、（アルキル基に酸素が結合した）アルコキシ基が結合したアルコキシアルキル基、アルコキシアルケニル基、アルコキシアルキニル基、また、アミノ基が結合したアミノアルキル基、アミノアルケニル基、アミノアルキニル基、また、（アミノ基にアルキル基が結合した）アルキルアミノ基が結合したアルキルアミノアルキル基、アルキルアミノアルケニル基、アルキルアミノアルキニル基、等が挙げられる。 Furthermore, the hydroxy group, the hydroxy alkenyl group, the hydroxy alkynyl group in which the hydroxyl group is bonded to the alkyl group, the alkenyl group, and the alkynyl group described above, or the alkoxy in which the alkoxy group (oxygen is bonded to the alkyl group) is bonded. An alkyl group, an alkoxyalkenyl group, an alkoxyalkynyl group, an aminoalkyl group to which an amino group is bonded, an aminoalkenyl group, an aminoalkynyl group, or an alkylamino group (to which an alkyl group is bonded to an amino group) Examples thereof include an alkyl group, an alkylaminoalkenyl group, and an alkylaminoalkynyl group.
これらの中でも炭素数１２〜２２の不飽和または飽和脂肪族炭化水素基であることが好ましい。さらに、このような脂肪族炭化水素基のうち、生体膜を構成するリン脂質の成分である脂肪酸に由来する脂肪族炭化水素基がより好ましく、例えば、ラウリル基、ミリスチル基、パルミチル基、パルミトレオイル基、ステアリル基、オレイル基、リノレオイル基、α−リノレノイル基、γ−リノレノイル基、アラキドノイル基、エイコサペンタノイル基及びドコサヘキサエノイル基、などがより好適に用いられる。 Among these, an unsaturated or saturated aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms is preferable. Further, among these aliphatic hydrocarbon groups, aliphatic hydrocarbon groups derived from fatty acids that are components of phospholipids constituting biological membranes are more preferable. For example, lauryl group, myristyl group, palmityl group, palmitole Oil groups, stearyl groups, oleyl groups, linoleoyl groups, α-linolenoyl groups, γ-linolenoyl groups, arachidonoyl groups, eicosapentanoyl groups, docosahexaenoyl groups, and the like are more preferably used.
炭化水素基が結合する場合は１種以上でよく、２種以上結合する場合はその組み合わせが制限されるものではない。 When the hydrocarbon groups are bonded, one or more types may be used, and when two or more types are bonded, the combination is not limited.
また、細胞や生体組織への定着能を有する化合物（細胞への定着活性を有する化合物）、即ち細胞や生体組織への定着性を付与する機能を持つ化合物の別の例としては、細胞接着性ペプチドが挙げられる。フィブロネクチンやラミニン等の細胞外マトリックス分子中に存在するアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列は、細胞膜タンパク質であるインテグリンに認識され、細胞外マトリックスと細胞との接着に関与している。このＲＧＤトリペプチドまたはセリンを付加したＲＧＤＳからなるテトラペプチドは、材料への細胞接着性付与に利用されている。 Further, as another example of a compound having a fixing ability to cells or living tissues (compound having a fixing activity to cells), that is, a compound having a function of imparting fixing properties to cells or living tissues, cell adhesion Peptides are mentioned. Arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences present in extracellular matrix molecules such as fibronectin and laminin are recognized by integrin, which is a cell membrane protein, and are involved in adhesion between the extracellular matrix and cells. This tetrapeptide consisting of RGD tripeptide or RGDS to which serine is added is used for imparting cell adhesion to a material.
さらに、細胞や生体組織への定着性を付与する機能を持つ化合物の別の例としては、細胞表面に存在するレセプター（受容体）に対するリガンド（レセプターに対して特異的に結合する化合物）、またはレセプターに対するアンタゴニスト（リガンドと競合してレセプターに結合する化合物）が挙げられる。細胞表面には、特定のタンパク質や糖鎖をリガンドとして認識するレセプターが存在している。これらの中には、細胞同士の接着や、細胞と細胞外マトリクスとの間の接着に関わるレセプターがあり、細胞表面のタンパク質や、細胞外マトリクスの成分をリガンドとして認識している。例えば、上述したインテグリンは細胞外マトリクス分子に存在するＲＧＤトリペプチドをリガンドとして認識する。また、肝細胞表面に存在するアシアロ糖タンパク質レセプターは、糖鎖の末端に存在するβ−ガラクトースをリガンドとして認識する。これらのリガンド分子をそのまま、あるいは、化学修飾を行うなどして改変したアンタゴニストとして、本発明の細胞や生体組織への定着能を付与する化合物として利用することが可能である。 Furthermore, as another example of a compound having a function of imparting fixing property to a cell or a living tissue, a ligand (compound that specifically binds to the receptor) to a receptor (receptor) existing on the cell surface, or And antagonists to the receptor (compounds that bind to the receptor in competition with the ligand). A receptor that recognizes a specific protein or sugar chain as a ligand exists on the cell surface. Among these, there are receptors involved in cell-cell adhesion and cell-extracellular matrix adhesion, and recognize cell surface proteins and extracellular matrix components as ligands. For example, the integrin described above recognizes an RGD tripeptide present in an extracellular matrix molecule as a ligand. The asialoglycoprotein receptor present on the surface of hepatocytes recognizes β-galactose present at the end of the sugar chain as a ligand. These ligand molecules can be used as compounds that impart the ability of fixing to cells and living tissues of the present invention as antagonists that are modified as they are or by chemical modification.
本発明のポリアミノ酸誘導体における細胞や生体組織への定着能を有する化合物との結合の様式については、特に限定されない。より好ましいポリアミノ酸骨格であるポリアスパラギン酸誘導体の場合、カルボキシル基と結合可能な官能基があればそれを利用することができる。結合可能な官能基がない場合でも、生体機能分子を誘導体化したり、適当なスペーサーを介することにより、結合可能となる。結合に利用可能な官能基としては、アミノ基、水酸基、チオール基、カルボキシル基等が挙げられる。また、スペーサーの種類や構造についても特に限定されない。 There are no particular limitations on the mode of binding of the polyamino acid derivative of the present invention to a compound having the ability to fix cells or living tissues. In the case of a polyaspartic acid derivative which is a more preferable polyamino acid skeleton, any functional group capable of binding to a carboxyl group can be used. Even when there is no functional group capable of binding, binding can be achieved by derivatizing the biofunctional molecule or through an appropriate spacer. Examples of functional groups that can be used for bonding include amino groups, hydroxyl groups, thiol groups, and carboxyl groups. Also, the type and structure of the spacer are not particularly limited.
本発明においては、上記「生体機能分子」、「細胞や生体組織への定着能を有する化合物」を、本願のポリアミノ酸誘導体の末端を封止するのに使用しても構わない。末端が封止された状態とは、より具体的には、ポリアミノ酸鎖のアミノ末端、または、カルボキシル末端の少なくともいずれか一方に、生体機能分子、または、細胞や生体組織への定着能を有する化合物の少なくともいずれか一方が結合している状態を指す。 In the present invention, the above-mentioned “biofunctional molecules” and “compounds capable of fixing to cells and biological tissues” may be used to seal the end of the polyamino acid derivative of the present application. More specifically, the state in which the terminal is sealed has a function of fixing to a biofunctional molecule or a cell or a biological tissue at at least one of the amino terminal and the carboxyl terminal of the polyamino acid chain. It refers to the state in which at least one of the compounds is bound.
上記一般式（III）において、Ｘは酸素原子、窒素原子およびイオウ原子から選択され、Ｙは水素、アルカリ金属およびアルカリ土類金属から選択される少なくとも１種以上の元素を示す。 In the general formula (III), X is selected from an oxygen atom, a nitrogen atom, and a sulfur atom, and Y represents at least one element selected from hydrogen, an alkali metal, and an alkaline earth metal.
また、ｍは１〜２の整数を示し、ｎは１〜３の整数を示す。 Moreover, m shows the integer of 1-2, n shows the integer of 1-3.
より具体的には、Ｙは水素、アルカリ金属またはアルカリ土類金属から選択でき、特にリチウム、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、ベリリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属から選択されることが好ましい。 More specifically, Y can be selected from hydrogen, alkali metals or alkaline earth metals, and is preferably selected from alkali metals such as lithium, sodium and potassium, and alkaline earth metals such as beryllium, magnesium and calcium. .
本発明のポリアミノ酸誘導体において、α−アミド型単量体単位、β−アミド型単量体単位及びγ−アミド型単量体単位は、何れか一方のみが存在していてもよく、これらが併存していてもよい。併存している場合、α−アミド型単量体単位、β−アミド型単量体単位及びγ−アミド型単量体単位の比率は特に限定されない。 In the polyamino acid derivative of the present invention, only one of the α-amide type monomer unit, the β-amide type monomer unit, and the γ-amide type monomer unit may be present. You may coexist. When they coexist, the ratio of the α-amide type monomer unit, the β-amide type monomer unit, and the γ-amide type monomer unit is not particularly limited.
本発明のポリアミノ酸誘導体を架橋化して三次元構造化する方法については、特に限定されない。化学的な架橋形成としては、ポリカルボン酸からなる骨格に対して、ポリアミン類を作用させることによりペプチド結合を形成させたり、アルデヒド基とアミンによるシッフ塩基形成を利用することができる。物理的な方法としては、γ線や電子線の照射などが挙げられる。また、カルボキシルアニオンと多価金属イオンを用いたキレート形成も利用することができる。 The method for cross-linking the polyamino acid derivative of the present invention to form a three-dimensional structure is not particularly limited. As chemical crosslink formation, a peptide bond can be formed by allowing polyamines to act on a skeleton composed of polycarboxylic acid, or Schiff base formation by an aldehyde group and an amine can be used. Examples of physical methods include irradiation with γ rays and electron beams. Further, chelate formation using a carboxyl anion and a polyvalent metal ion can also be used.
本発明のポリアミノ酸誘導体を用いて担持された生体機能分子の機能を細胞や生体組織において好適に発揮させるための方法としては、例えば、酸化防止、美白、しわ改善、抗菌、ＵＶ吸収、保湿などの機能を有する化合物を生体機能分子として担持したポリアミノ酸誘導体を合成し、当該ポリアミノ酸誘導体を配合した化粧料を提供することで、当該生体機能分子の機能を皮膚等の生体組織において持続的かつ好適に機能させる方法が含まれる。また、別の例としては、医薬品としての活性を有する薬剤を生体機能分子として担持したポリアミノ酸誘導体を合成し、当該ポリアミノ酸誘導体を含有する医薬品を提供することで、当該生体機能分子を特定の細胞において持続的かつ好適に機能させるドラッグデリバリーシステムとしての利用法が含まれる。 Examples of a method for suitably exerting the function of a biofunctional molecule supported by using the polyamino acid derivative of the present invention in cells and biological tissues include, for example, antioxidant, whitening, wrinkle improvement, antibacterial, UV absorption, and moisture retention. By synthesizing a polyamino acid derivative carrying a compound having the above function as a biofunctional molecule and providing a cosmetic compounded with the polyamino acid derivative, the function of the biofunctional molecule is sustained in biological tissues such as skin and Methods that allow it to function properly are included. Further, as another example, by synthesizing a polyamino acid derivative carrying a drug having a pharmaceutical activity as a biofunctional molecule, and providing the drug containing the polyamino acid derivative, the biofunctional molecule is identified. The use method as a drug delivery system which functions continuously and suitably in cells is included.
以下に本発明に関する実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明の範囲が下記の実施例に限定されるものではない。 The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited to the following examples.
［合成例１］
＜ポリこはく酸イミド（ＰＳＩ）の合成＞
ポリこはく酸イミドの合成を特開平１１−２４０９４７号公報に記載の実施例に従い実施した。反応槽にＬ−アスパラギン酸、スルホラン、キシレンをそれぞれ６６．５ｇ、塩酸２６ｇを量り採り、窒素気流下で約１０分程度で１００℃まで昇温させた後、徐々に約１４０℃まで上昇させ脱水縮合反応を行った。反応終了後、生成したポリマーにスルホラン６６．５ｇを加え約１３０℃で融解した。融解したポリマーをメタノールへ排出し晶析させた。ろ過後、３回のメタノール洗浄を行い、ろ塊を回収し乾燥させた。得られたポリこはく酸イミドの分子量は高速液体クロマトグラフィーのＧＰＣ分析から求めた。得られたＰＳＩの分子量は、２１００及び２６００であった。
[Synthesis Example 1]
<Synthesis of polysuccinimide (PSI)>
The synthesis of polysuccinimide was carried out according to the examples described in JP-A-11-240947. Weigh 66.5 g of L-aspartic acid, sulfolane, and xylene, and 26 g of hydrochloric acid in a reaction tank, raise the temperature to 100 ° C. in about 10 minutes under a nitrogen stream, and then gradually raise the temperature to about 140 ° C. for dehydration. A condensation reaction was performed. After completion of the reaction, 66.5 g of sulfolane was added to the resulting polymer and melted at about 130 ° C. The molten polymer was discharged into methanol for crystallization. After filtration, washing with methanol three times was performed, and the filter cake was collected and dried. The molecular weight of the obtained polysuccinimide was determined from GPC analysis by high performance liquid chromatography. The molecular weights of the obtained PSI were 2100 and 2600.
［合成例２］
＜細胞や生体組織への定着性を付与する化合物を導入したポリアスパラギン酸誘導体の合成＞
酸無水物法によりポリこはく酸イミドへの脂肪族炭化水素基の導入を行った。
反応槽内でオレイン酸１．２ｍｌとペプチド合成用ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）７ｍｌを室温で混合し、反応槽を−１５℃前後でコントロールしたドライアイス−アセトニトリル冷媒中で冷やした後、窒素気流下、Ｎ−メチルモルホリン０．４ｍｌを添加し、次いで塩化イソブチルホルメート０．４７６ｍｌを加えて２分間反応させた。予め、ポリこはく酸イミドをＤＭＦで溶解した液にＮ−メチルモルホリン０．４ｍｌを反応槽内に滴下した。反応温度を−１５℃に保ちながら３０分間反応した後、室温で６０分間反応を行った。反応液をメタノールに排出し晶析を行い、生じた沈殿物をろ過してオレイル化ポリこはく酸イミド（ｏ−ＰＳＩ）を回収した。
[Synthesis Example 2]
<Synthesis of a polyaspartic acid derivative into which a compound imparting fixing properties to cells and living tissues is introduced>
Aliphatic hydrocarbon groups were introduced into polysuccinimide by the acid anhydride method.
In the reaction vessel, 1.2 ml of oleic acid and 7 ml of DMF (N, N-dimethylformamide) for peptide synthesis were mixed at room temperature, and the reaction vessel was cooled in a dry ice-acetonitrile refrigerant controlled at around −15 ° C. Under a nitrogen stream, 0.4 ml of N-methylmorpholine was added, and then 0.476 ml of isobutyl formate was added and reacted for 2 minutes. In advance, 0.4 ml of N-methylmorpholine was dropped into a reaction vessel in a solution obtained by dissolving polysuccinimide in DMF. After reacting for 30 minutes while maintaining the reaction temperature at −15 ° C., the reaction was performed at room temperature for 60 minutes. The reaction solution was discharged into methanol for crystallization, and the resulting precipitate was filtered to recover oleylated polysuccinimide (o-PSI).
［実施例１及び比較例１］
＜ポリアスパラギン酸−ビオチン複合体の合成＞
ｏ−ＰＳＩ １８８ｍｇをＤＭＦ０．９４ｍｌで溶解した。ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、ＰＩＥＲＣＥ社）１５ｍｇをＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）０．４５ｍｌで溶解した。ビオチン誘導体５−（ビオチンアミド）ペンチルアミン（ＰＩＥＲＣＥ社）２５ｍｇをＤＭＦ２．５ｍｌに超音波を施し溶解後、これらを混合し、２５℃で１時間反応させた。反応液に２０倍量のエタノールを加えて晶析し沈殿物を得た。得られた沈殿物は乾燥機にて乾燥した。
[Example 1 and Comparative Example 1]
<Synthesis of polyaspartic acid-biotin complex>
188 mg of o-PSI was dissolved in 0.94 ml of DMF. 15 mg of EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, PIERCE) was dissolved in 0.45 ml of DMSO (dimethyl sulfoxide). 25 mg of the biotin derivative 5- (biotinamide) pentylamine (PIERCE) was dissolved in 2.5 ml of DMF by sonication, mixed, and reacted at 25 ° C. for 1 hour. A 20-fold amount of ethanol was added to the reaction solution and crystallized to obtain a precipitate. The resulting precipitate was dried with a dryer.
さらに攪拌しながらＤＭＦの２倍量の純水を添加した後、０．５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を少しずつ加えｐＨを９〜１０の範囲に保ちながらイミドの加水分解を行った。ｐＨの変化がなくなったところで２０倍量のアセトニトリルを加えて晶析し沈殿物を得た。得られた沈殿物は真空乾燥機にて乾燥し、オレイル化ポリアスパラギン−ビオチン（ｏ−ＰＡ−ビオチン）複合体を得た。 After adding pure water twice the amount of DMF while stirring, 0.5M sodium hydroxide solution was added little by little to hydrolyze the imide while maintaining the pH in the range of 9-10. When there was no change in pH, 20 times the amount of acetonitrile was added and crystallized to obtain a precipitate. The obtained precipitate was dried in a vacuum dryer to obtain an oleylated polyasparagine-biotin (o-PA-biotin) complex.
また、ポリこはく酸イミドとビオチン誘導体を材料として同様の操作により、オレイル化されていない材料として、ポリアスパラギン酸−ビオチン（ＰＡ−ビオチン）複合体を得た。 Further, a polyaspartic acid-biotin (PA-biotin) complex was obtained as a non-oleylated material by the same operation using polysuccinimide and a biotin derivative as materials.
用いたビオチン誘導体はアミン誘導体であることから、活性成分のＰＳＩまたはｏ−ＰＳＩへの結合率はＨＰＬＣを用いアミンのＯＰＡ（ｏ−フタルアルデヒド）ポストカラム法で実施した。反応に供した活性成分を１００とし、反応液中に残存する活性成分の量から結合率を求めた。ＨＰＬＣ分析条件を以下に示す。カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＭＧ−５（φ４．６×１５０ｍｍ）、移動相：リン酸混液（０．１１％１−オクタンスルホン酸ナトリウム、０．０７５％リン酸二水素ナトリウム、０．１％（ｖ／ｖ）リン酸）：純水：メタノール＝１：２：２、流速：０．７５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出：ＵＶ検出 ２１０ｎｍ、蛍光検出 Ｅｘ：３４０ｎｍ、Ｅｍ：４５５ｎｍ、ポストカラム用ｏ−フタルアルデヒド混液（３．４％ほう酸、３％水酸化カリウム、０．４％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、１％（ｖ／ｖ）ｏ−フタルアルデヒド−エタノール溶液８０ｇ／Ｌ）、ｏ−フタルアルデヒド混液流速：０．４５ｍＬ／ｍｉｎ、試料添加：１０μＬ。 Since the biotin derivative used was an amine derivative, the binding rate of the active ingredient to PSI or o-PSI was measured by HPLC using an amine OPA (o-phthalaldehyde) post-column method. The active ingredient subjected to the reaction was defined as 100, and the binding rate was determined from the amount of the active ingredient remaining in the reaction solution. The HPLC analysis conditions are shown below. Column: Develosil ODS-MG-5 (φ4.6 × 150 mm), mobile phase: phosphoric acid mixed solution (0.11% 1-octane sodium phosphate, 0.075% sodium dihydrogen phosphate, 0.1% (v / V) phosphoric acid): pure water: methanol = 1: 2: 2, flow rate: 0.75 mL / min, column temperature: 40 ° C., detection: UV detection 210 nm, fluorescence detection Ex: 340 nm, Em: 455 nm, post column O-phthalaldehyde mixed solution (3.4% boric acid, 3% potassium hydroxide, 0.4% (v / v) 2-mercaptoethanol, 1% (v / v) o-phthalaldehyde-ethanol solution 80 g / L ), O-phthalaldehyde mixed liquid flow rate: 0.45 mL / min, sample addition: 10 μL.
合成された複合体の回収率は８０％以上、活性成分の導入効率は９０％以上であった。 The recovery rate of the synthesized complex was 80% or more, and the introduction efficiency of the active ingredient was 90% or more.
［実施例２及び比較例２］
＜ポリアスパラギン酸−チオタウリン複合体の合成＞
チオタウリン（２−アミノエタンチオスルホン−Ｓ−酸）は、和光純薬工業(株)より購入した。
[Example 2 and Comparative Example 2]
<Synthesis of polyaspartic acid-thiotaurine complex>
Thiotaurine (2-aminoethanethiosulfone-S-acid) was purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
ＰＳＩ又はｏ−ＰＳＩ（分子量：２１００）０．１ｇを０．５ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。チオタウリン７ｍｇを７０μＬのＤＭＳＯに溶解した。ＥＤＣ１０ｍｇを３００μＬのＤＭＳＯに溶解した。これらをよく混ぜ、室温に１時間放置した。チオタウリンの結合量はＨＰＬＣによる遊離アミンの定量で確認した。活性成分が結合したＰＳＩまたはｏ−ＰＳＩの加水分解は活性成分が９０％以上結合したものについて行った。加水分解の手順は実施例３に記載の方法い、ＰＳＩ及びｏ−ＰＳＩのチオタウリン複合体の加水分解物を、それぞれ、ＰＡ−チオタウリン複合体、及びｏ−ＰＡ−チオタウリン複合体とした。 0.1 g of PSI or o-PSI (molecular weight: 2100) was dissolved in 0.5 mL of DMSO. 7 mg of thiotaurine was dissolved in 70 μL of DMSO. 10 mg of EDC was dissolved in 300 μL of DMSO. These were mixed well and left at room temperature for 1 hour. The amount of thiotaurine bound was confirmed by quantification of free amine by HPLC. Hydrolysis of PSI or o-PSI to which the active ingredient was bound was carried out for those in which 90% or more of the active ingredient was bound. The hydrolysis procedure was the method described in Example 3. The hydrolysates of PSI and o-PSI thiotaurine conjugates were PA-thiotaurine conjugates and o-PA-thiotaurine conjugates, respectively.
活性成分のＰＳＩまたはｏ−ＰＳＩへの結合率は、後述する［実施例３］に記載の方法で行い、合成された複合体の回収率は８０％以上、活性成分の導入効率は９０％以上であった。 The binding rate of the active ingredient to PSI or o-PSI is determined by the method described in [Example 3], which will be described later. The recovery rate of the synthesized complex is 80% or more, and the introduction efficiency of the active ingredient is 90% or more. Met.
［実施例３］
＜ポリアスパラギン酸−メチオニン−銀イオン複合体の合成＞
ｏ−ＰＡ（分子量：２１００）０．１ｇを１ｍＬの純水に溶解した。メチオニン２４ｍｇを１ｍＬの純水に溶解した。ＥＤＣ３１ｍｇを３１０μＬのＤＭＳＯに溶解した。これらをよく混ぜ、室温に１時間放置した。メチオニンの結合量はＨＰＬＣによる遊離アミンの定量で確認した。未反応メチオニンの分離はメチオニンが９０％以上結合したものについて以下の手順で行った。５ｍＬ容量の脱塩カラムを２本連結し純水で平衡化した後、反応液の全量をカラムに添加し、０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速でカラムから溶出し、１ｍＬづつのフラクションを得た。各フラクションの２１０ｎｍの吸光度と遊離アミン量を定量し、吸収を持ちかつ遊離アミンを含まないフラクションをプールした。既知濃度のｏ−ＰＡを標準としてＨＰＬＣのピーク面積からｏ−ＰＡ−メチオニン複合体の濃度を算出した。ｏ−ＰＡ−メチオニン複合体０．０５ｍｇ相当の水溶液に硝酸銀水溶液１００ｍｇ／ｍＬの３μＬを加えて室温に１時間放置した後、１００００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清をｏ−ＰＡ−メチオニン−銀イオン複合体溶液とした。
[Example 3]
<Synthesis of polyaspartic acid-methionine-silver ion complex>
0.1 g of o-PA (molecular weight: 2100) was dissolved in 1 mL of pure water. 24 mg of methionine was dissolved in 1 mL of pure water. 31 mg of EDC was dissolved in 310 μL of DMSO. These were mixed well and left at room temperature for 1 hour. The amount of methionine bound was confirmed by quantification of free amine by HPLC. Separation of unreacted methionine was carried out according to the following procedure for 90% or more of methionine bound. Two desalting columns of 5 mL capacity were connected and equilibrated with pure water, and then the entire amount of the reaction solution was added to the column and eluted from the column at a flow rate of 0.5 mL / min to obtain 1 mL fractions. The absorbance at 210 nm and the amount of free amine in each fraction were quantified, and fractions having absorption and free amine were pooled. The concentration of o-PA-methionine complex was calculated from the peak area of HPLC using o-PA at a known concentration as a standard. 3 μL of silver nitrate
［評価例１］
＜ミニブタ摘出皮膚を用いたポリアスパラギン酸誘導体の皮膚定着性評価＞
ミニブタ（Ｙucatan Ｍicropig）摘出皮膚は日本チャールスリバーより入手した。凍結皮膚は常法に従い、皮下脂肪切除、結合組織除去、皮脂除去を行った。皮膚表面に外径１３ｍｍ、内径７ｍｍの金属製リングを接着剤を用いて取り付けた。ｏ−ＰＡ−ビオチン複合体、または、ＰＡ−ビオチン複合体の水溶液を皮膚表面に添加し６０分間静置した。リン酸緩衝食塩液で３回洗浄後のブロッキング液（１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ（Ｐhosphate Ｂuffer Ｓaline））を添加し６０分間ブロッキングを行った。金属リング内をリン酸緩衝食塩液で３回洗浄を行い、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン溶液を加えビオチン結合反応を行った。反応後ＰＢＳによる洗浄を３回行い、ｐ−ニトロフェニルフォスフェート溶液を加え酵素反応を行った。３０分後反応液を回収し、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
[Evaluation Example 1]
<Evaluation of skin fixability of polyaspartic acid derivatives using minipig isolated skin>
Skin removed from Yucatan Micropig was obtained from Charles River, Japan. The frozen skin was subjected to subcutaneous fat excision, connective tissue removal, and sebum removal in accordance with conventional methods. A metal ring having an outer diameter of 13 mm and an inner diameter of 7 mm was attached to the skin surface using an adhesive. An o-PA-biotin complex or an aqueous solution of PA-biotin complex was added to the skin surface and allowed to stand for 60 minutes. Blocking solution (PBS containing 1% bovine serum albumin) after washing 3 times with phosphate buffered saline was added to perform blocking for 60 minutes. The metal ring was washed three times with a phosphate buffered saline solution, and an alkaline phosphatase-labeled streptavidin solution was added to carry out a biotin binding reaction. After the reaction, washing with PBS was performed three times, and p-nitrophenyl phosphate solution was added to carry out an enzyme reaction. After 30 minutes, the reaction solution was recovered, and the absorbance at a wavelength of 405 nm was measured.
両材料における定着評価の結果を図１に示す。オレイル基が結合したｏ−ＰＡ−ビオチン複合体は濃度の増加に伴い波長４０５ｎｍにおける吸光度の上昇が認められた。一方、オレイル基の結合していないＰＡ−ビオチン複合体は吸光度の上昇が認められないことから、アスパラギン酸へのオレイル基の結合により皮膚定着能が付与されたことが確認された。 FIG. 1 shows the result of fixing evaluation for both materials. In the o-PA-biotin complex to which the oleyl group was bound, an increase in absorbance at a wavelength of 405 nm was observed as the concentration increased. On the other hand, since no increase in absorbance was observed in the PA-biotin complex to which no oleyl group was bound, it was confirmed that skin fixing ability was imparted by the binding of the oleyl group to aspartic acid.
［評価例２］
＜モルモット皮膚を用いたポリアスパラギン酸複合体の皮膚定着性試験＞
１週間の予備飼育を経たモルモットを定着試験前日に背部の毛をバリカン、カミソリで剃毛後、除毛剤で出来るだけ除毛処置を施した。４匹のモルモットに麻酔（ネンブタール）をかけて眠らせた後、背部皮膚に油性インクで１ｃｍ２のマーキングを行い塗布部を規定した。モルモット１匹に対して５〜６の塗布部を設けた。ｏ−ＰＡ−ビオチン複合体、または、ＰＡ−ビオチン複合体の水溶液を１ｃｍ２当たりの皮膚に対して１３μＬ塗布し、そのまま室温で３０分間放置した。モルモット背部皮膚を剃毛部分に沿ってハサミで切り取り、得られた皮膚をコルク板上に広げ皮膚の隅を注射針で固定した。塗布部がＯリング内に位置するように瞬間接着剤を用いてＯリングを装着した。
[Evaluation Example 2]
<Skin Fixability Test of Polyaspartic Acid Complex Using Guinea Pig Skin>
Guinea pigs that had undergone preliminary breeding for 1 week were shaved with hair clippers and razors on the day before the fixation test, and then subjected to hair removal treatment with a hair remover as much as possible. After four guinea pigs were anesthetized (Nembutal) and allowed to sleep, the back skin was marked with 1 cm 2 with oil-based ink to define the application part. The application part of 5-6 was provided with respect to 1 guinea pig. 13 μL of o-PA-biotin complex or an aqueous solution of PA-biotin complex was applied to 1 cm 2 of skin, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. The back skin of the guinea pig was cut with scissors along the shaved portion, the obtained skin was spread on a cork board, and the corners of the skin were fixed with an injection needle. The O-ring was mounted using an instantaneous adhesive so that the application part was positioned in the O-ring.
ストレプトアビジンを介した発色反応を以下の手順で行った。Ｏリング内を０．２ｍｌＰＢＳ（Ｐhosphate Ｂuffer Ｓaline）で２回洗浄した後、０．１ｍｌブロッキング液を注ぎ、室温で１時間ブロッキングを行った。ブロッキング液を除去した後、５００倍希釈（３μｇ／ｍｌ）のストレプトアビジン溶液０．１ｍｌを加え１時間のビオチン−アビジン反応を行った。０．２ｍｌのＰＢＳで７回洗浄した後、１ｍＭ Ｌｅｖａｍｉｓｏｌを含む１．２ｍｇ／ｍｌ ＰＮＰＰ溶液を０．１ｍｌ加えて発色反応を行った。約１５分反応させたところで発色液０．０８ｍｌをマイクロプレートに採取し、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。 The color reaction via streptavidin was performed according to the following procedure. The inside of the O-ring was washed twice with 0.2 ml PBS (Phosphate Buffer Saline), then 0.1 ml blocking solution was poured, and blocking was performed at room temperature for 1 hour. After removing the blocking solution, 0.1 ml of a 500-fold diluted (3 μg / ml) streptavidin solution was added to carry out a biotin-avidin reaction for 1 hour. After washing 7 times with 0.2 ml of PBS, 0.1 ml of 1.2 mg / ml PNPP solution containing 1 mM Levamisol was added to carry out a color reaction. After reacting for about 15 minutes, 0.08 ml of the color developing solution was collected on a microplate, and the absorbance at a wavelength of 405 nm was measured.
その結果、図２に示すように、ｏ−ＰＡ−ビオチン複合体のみが顕著な皮膚定着性を示した。 As a result, as shown in FIG. 2, only the o-PA-biotin complex showed remarkable skin fixing properties.
［評価例３］
＜培養細胞を用いたポリアスパラギン酸複合体の細胞定着性評価＞
培養したヒト表皮角化培養細胞にｏ−ＰＡ−ビオチン複合体または、ＰＡ−ビオチン複合体の水溶液を加え定着反応を行った。ＰＢＳで３回洗浄した後、蛍光標識ストレプトアビジン（モレキュラープローブ社製 Ａlexa Ｆluor ４８８）を反応させた。反応後、ＰＢＳで１０回細胞を洗浄した。蛍光標識ストレプトアビジンを反応させた細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。顕微鏡観察した結果を図３に示す。観察の結果、明らかにオレイル化した材料は細胞への定着が確認されたが、オレイル化をしていない材料の定着は認められなかった。
[Evaluation Example 3]
<Evaluation of cell fixation of polyaspartic acid complex using cultured cells>
An o-PA-biotin complex or an aqueous solution of PA-biotin complex was added to the cultured human epidermal keratinized cultured cells to perform a fixing reaction. After washing 3 times with PBS, fluorescence labeled streptavidin (Alexa Fluor 488 manufactured by Molecular Probes) was reacted. After the reaction, the cells were washed 10 times with PBS. Cells reacted with fluorescently labeled streptavidin were observed with a confocal laser microscope. The result of microscopic observation is shown in FIG. As a result of observation, it was confirmed that the oleylated material clearly settled on the cells, but the non-oleylated material did not settle.
［評価例４］
＜ポリアスパラギン酸−抗酸化剤複合体の活性酸素消去効果＞
１）電子スピン共鳴法（ＥＳＲ）を用いた一重項酸素（１Ｏ２）消去能評価
ポリアスパラギン酸−抗酸化剤複合体の活性酸素消去能の評価を電子スピン共鳴（ＥＳＲ）により行った。終濃度２ｍＭの種々測定サンプル（ｏ−ＰＡ、ＰＡ、ｏ−ＰＡ−ビオチン複合体、ｏ−ＰＡ−チオタウリン複合体、ビオチン、チオタウリン）と０．０５ｍＭヘマトポルフィリン及び５０ｍＭテトラメチルピペリドンハイドロクロライドを１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）で調製した。この混合物をＥＳＲ測定用の石英セルに注入した後、主波長３６５ｎｍの紫外光を３分間照射し活性酸素の一種である一重項酸素を発生させ、その消去能をＥＳＲのスペクトルより評価した。その評価結果を図４に示す。
[Evaluation Example 4]
<Active oxygen scavenging effect of polyaspartic acid-antioxidant complex>
1) Evaluation of singlet oxygen ( 1 O 2 ) scavenging ability using electron spin resonance (ESR) Evaluation of active oxygen scavenging ability of the polyaspartic acid-antioxidant complex was performed by electron spin resonance (ESR). Various measurement samples (o-PA, PA, o-PA-biotin complex, o-PA-thiotaurine complex, biotin, thiotaurine) having a final concentration of 2 mM, 0.05 mM hematoporphyrin and 50 mM tetramethylpiperidone hydrochloride at 100 mM Prepared with Tris-HCl (pH 8). After this mixture was injected into a quartz cell for ESR measurement, ultraviolet light having a main wavelength of 365 nm was irradiated for 3 minutes to generate singlet oxygen which is a kind of active oxygen, and its erasing ability was evaluated from the spectrum of ESR. The evaluation results are shown in FIG.
スペクトルのパターンにおいて、一重項酸素に特異的な３本のピーク値が小さくなるほど抗酸化能が高いことになる。抗酸化能をもつ活性成分が結合していないサンプル[１][２]はＵＶＡ照射により発生した１Ｏ２を消去しなかったが、ｏ−ＰＡ−ビオチン複合体[４]は１Ｏ２を有意に消去した。また、ｏ−ＰＡ−チオタウリン[６]についても同様に１Ｏ２を消去する結果を得た。 In the spectrum pattern, the smaller the three peak values specific to singlet oxygen, the higher the antioxidant ability. The sample [1] [2] to which the active ingredient having antioxidative ability was not bound did not erase 1 O 2 generated by UVA irradiation, whereas the o-PA-biotin complex [4] did not remove 1 O 2 . Significantly eliminated. Further, for o-PA-thiotaurine [6], 1 O 2 was similarly erased.
２）過酸化物の定量による１Ｏ２消去能評価
リノール酸をエタノールに溶解し、１．３％とした。この溶液６９μＬに０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）３５μＬと０．１〜１％抗酸化活性評価サンプル（ｏ−ＰＡ、ＰＡ、ｏ−ＰＡ−ビオチン複合体、ｏ−ＰＡ−チオタウリン複合体、ビオチン、チオタウリン）の水溶液をそれぞれ３５μＬを加え、さらに０．５Ｍ酸化助剤 2,2-Ａzobis(2-Ａmidinopropane)Ｄihydrochloride水溶液０．７μＬを加えて３５４ｎｍ（ＵＶＡ）４０Ｊ／ｃｍ２／１６ｈｒの紫外線を照射した。ＵＶＡ照射後の溶液を１０ｍｇ／ｍＬ２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール−（アセトン：メタノール＝２：１）溶液で１００００〜１０００００倍に希釈した。この溶液１００μＬに１００ｍｇ／ｍＬ ＤＰＰＰ−（クロロホルム：メタノール＝２：１）溶液５０μＬを加え、６０℃で６０分加熱した。氷上で冷却した後、２−プロパノールで１００倍に希釈してＥＸ ３５２ｎｍ／ＥＭ ３８０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。リノール酸：抗酸化剤：ＡＡＰＨ≒２５：１：３（モル比）
2) Evaluation of 1 O 2 elimination ability by quantitative determination of peroxide Linoleic acid was dissolved in ethanol to give 1.3%. To 69 μL of this solution, 35 μL of 0.1 M sodium phosphate (pH 7.0) and 0.1 to 1% antioxidant activity evaluation sample (o-PA, PA, o-PA-biotin complex, o-PA-thiotaurine complex) , biotin, an aqueous solution was added to 35μL each thiotaurine), further 0.5M oxidizing aid 2,2-azobis (2-Amidinopropane) Dihydrochloride aqueous 0.7μL added 354 nm (UVA) ultraviolet 40J / cm 2 / 16hr Was irradiated. The solution after UVA irradiation was diluted 10,000 to 100,000 times with a 10 mg / mL 2,6-di-t-butyl-4-methylphenol- (acetone: methanol = 2: 1) solution. To 100 μL of this solution, 50 μL of a 100 mg / mL DPPP- (chloroform: methanol = 2: 1) solution was added and heated at 60 ° C. for 60 minutes. After cooling on ice, it was diluted 100-fold with 2-propanol, and the fluorescence intensity at EX 352 nm / EM 380 nm was measured. Linoleic acid: Antioxidant: AAPH≈25: 1: 3 (molar ratio)
ＵＶＡ照射により発生した１Ｏ２はリノール酸を酸化し、その過酸化物に反応して蛍光試薬の蛍光強度が増加するが、ビオチンやチオタウリンを含む複合体サンプルではリノール酸単独と比較して蛍光強度が下がった。すなわち、いずれのアスパラギン酸−抗酸化剤複合体もＵＶＡ照射により発生する１Ｏ２を抑制することがリノール酸の過酸化反応から確認された。その抗酸化能は、ビオチンよりもチオタウリンの方が高い結果となった。この結果は、抗酸化成分であるビオチンやチオタウリンが材料と結合しても抗酸化活性を失わないことを示唆する結果であった（図５）。 1 O 2 generated by UVA irradiation oxidizes linoleic acid and reacts with the peroxide to increase the fluorescence intensity of the fluorescent reagent. However, the complex sample containing biotin and thiotaurine is more fluorescent than linoleic acid alone. The strength decreased. That is, it was confirmed from the peroxidation reaction of linoleic acid that any aspartic acid-antioxidant complex suppresses 1 O 2 generated by UVA irradiation. The antioxidant capacity of thiotaurine was higher than that of biotin. This result suggested that biotin and thiotaurine, which are antioxidant components, do not lose their antioxidant activity even when bound to the material (FIG. 5).
［評価例５］
＜ポリアスパラギン酸−抗菌剤複合体の抗菌活性評価＞
大腸菌Ｋ１２株由来のＭＧ１６５５の凍結ストックをＬＢ液体培地が入った試験管に播種して、３０℃で一晩培養した。培養液を生理食塩水で５倍に希釈し、６００ｎｍの吸光度を測定し、吸光度の値が０．４〜０．０４になるように生理食塩水で希釈した。
[Evaluation Example 5]
<Evaluation of antibacterial activity of polyaspartic acid-antibacterial agent complex>
A frozen stock of MG1655 derived from E. coli K12 strain was inoculated into a test tube containing LB liquid medium and cultured at 30 ° C. overnight. The culture solution was diluted 5-fold with physiological saline, the absorbance at 600 nm was measured, and diluted with physiological saline so that the absorbance value was 0.4 to 0.04.
抗菌性評価サンプルとして、ｏ−ＰＡ−メチオニン−銀イオン複合体、または、ｏ−ＰＡ、硝酸銀をそれぞれ、３ｎモル、３ｎモル、６ｎモル含むＬＢ寒天培地（２０ｍＬ）を作成し、上記の大腸菌培養液の希釈液を５０μＬ添加してコンラージ棒で均一になるように塗り広げた。蓋をしてシャーレの周囲をビニールテープで塞ぎ、逆さにして３０℃のインキュベータ内で一晩培養した。 As an antibacterial evaluation sample, an LB agar medium (20 mL) containing 3 nmol, 3 nmol, and 6 nmol of o-PA-methionine-silver ion complex or o-PA and silver nitrate, respectively, was prepared, and the above E. coli culture was performed. 50 μL of the diluted solution was added and spread evenly with a large rod. The lid was covered and the periphery of the petri dish was covered with vinyl tape, and inverted and cultured overnight in an incubator at 30 ° C.
銀イオンは、タンパク質とよく結合することが知られていることから本実施例ではポリアスパラギン酸に銀イオンと強い結合力を有するアミノ酸であるメチオニンを結合させたが、このメチオニンと銀が複合体を形成することで、抗菌活性を示すことが期待された。結果として、図６に示すように、ｏ−ＰＡ−メチオニン−銀イオン複合体の場合にのみ、コロニー形成の抑制が認められたことから、高い抗菌活性が確認された。 Since silver ions are known to bind well to proteins, methionine, which is an amino acid having a strong binding force with silver ions, is bound to polyaspartic acid in this example, but this methionine and silver are complexed. It was expected to show antibacterial activity by forming. As a result, as shown in FIG. 6, suppression of colony formation was observed only in the case of the o-PA-methionine-silver ion complex, and thus high antibacterial activity was confirmed.
本発明によれば、複数の反応性官能基を有する水溶性高分子に、化粧品成分や医薬成分などの生理活性成分を担持させ、さらに細胞や生体組織への定着や浸透といった物理化学的な特性を制御することで、これら生理活性成分を持続的かつ有効に機能させることができ、高機能化粧品やドラッグデリバリーシステム、医療材料、再生医療材料などに応用することが可能となる。 According to the present invention, a water-soluble polymer having a plurality of reactive functional groups is loaded with a physiologically active ingredient such as a cosmetic ingredient or a pharmaceutical ingredient, and further has physicochemical properties such as fixation and penetration into cells and living tissues. By controlling the above, these physiologically active components can be functioned continuously and effectively, and can be applied to highly functional cosmetics, drug delivery systems, medical materials, regenerative medical materials, and the like.
Claims (14)
で表されるα型又はβ型又はγ型ポリアミノ酸単量体単位から構成されるポリアミノ酸誘導体であり、かつ、下記の（ａ）または（ｂ）の少なくとも一方の様式により分子中に生体機能分子を有するポリアミノ酸誘導体であり、かつ、下記の（ｃ）または（ｄ）の少なくとも一方の様式により、細胞や生体組織への定着能を有する化合物を有することを特徴とするポリアミノ酸誘導体。
（ａ）一般式（Ｉ）の単量体単位を少なくとも１単位以上含むこと
（ｂ）少なくとも一方の末端が、生体機能分子で封止されていること
（ｃ）一般式（II）の単量体単位を少なくとも１単位以上含むこと
（ｄ）少なくとも一方の末端が、細胞や生体組織への定着能を有する化合物で封止されていること The following general formulas (I) to (III)
A polyamino acid derivative composed of an α-type, β-type, or γ-type polyamino acid monomer unit represented by the formula, and a biological function in the molecule by at least one of the following modes (a) or (b): A polyamino acid derivative having a molecule and having a compound capable of fixing to a cell or a living tissue in at least one of the following modes (c) and (d):
(A) at least one monomer unit of the general formula (I) is included (b) at least one terminal is sealed with a biofunctional molecule (c) a single monomer of the general formula (II) Containing at least one body unit (d) at least one end being sealed with a compound capable of fixing to cells or living tissue
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