JP2007176845A - Persimmon polyphenol - Google Patents
Persimmon polyphenol Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007176845A JP2007176845A JP2005375799A JP2005375799A JP2007176845A JP 2007176845 A JP2007176845 A JP 2007176845A JP 2005375799 A JP2005375799 A JP 2005375799A JP 2005375799 A JP2005375799 A JP 2005375799A JP 2007176845 A JP2007176845 A JP 2007176845A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polyphenol
- molecular weight
- action
- low molecular
- epigallocatechin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Pyrane Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
Description
本発明は、柿タンニンから得られる低分化柿ポリフェノールに関するものである。 The present invention relates to a poorly differentiated koji polyphenol obtained from koji tannins.
近年、少子高齢化社会の進展に伴って国民の健康指向が高まり、加齢によって加速する疾病や生活習慣病への予防を図るべく、お茶から得られたお茶カテキンのカテキン類や、リンゴ果実から得られたポリフェノール類が抗酸化食品として利用されている（例えば、特許文献１参照） In recent years, with the progress of the declining birthrate and aging society, the health orientation of the people has increased, and from the catechins of tea catechins obtained from tea and apple fruits, in order to prevent diseases and lifestyle-related diseases accelerated by aging The obtained polyphenols are used as antioxidant foods (see, for example, Patent Document 1).
ここで、お茶カテキンのカテキン類は、エピカテキン（ＥＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピカテキンガレート（ＥＣｇ）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）等であり、抗酸化活性、抗アレルギー作用や抗菌作用を有することから、お茶の原料粉より抽出してカテキン類を取得し、更に他の材料に加えて錠剤、顆粒剤や液剤などの状態の食品としてお茶のカテキン類を摂取可能にしている。 Here, the catechins of tea catechin are epicatechin (EC), epigallocatechin (EGC), epicatechin gallate (ECg), epigallocatechin gallate (EGCg), etc., and have antioxidant activity, antiallergic action and antibacterial activity. Since it has an action, catechins are obtained by extraction from tea raw powder, and in addition to other ingredients, tea catechins can be ingested as food in the form of tablets, granules or liquids.
又、ブドウ種子やリンゴ未熟果実から得られたポリフェノール類は、主としてエピカテキン（ＥＣ）が重合したプロアントシアニジンであり、お茶カテキンと同様に抗酸化活性を有すると共に、抗動脈硬化作用や発癌予防作用などの薬理活性を有するので、原料粉より抽出して、プロアントシアニジン等を含む種々のポリフェノール類を取得し、更に他の材料を加えて錠剤、顆粒剤や液剤などの状態の食品として当該ポリフェノールを摂取可能にしている。 Polyphenols obtained from grape seeds and immature apple fruits are mainly proanthocyanidins in which epicatechin (EC) is polymerized, and have antioxidant activity as well as tea catechins, as well as anti-arteriosclerotic action and carcinogenesis-preventing action. Therefore, it is extracted from the raw material powder to obtain various polyphenols including proanthocyanidins, and other ingredients are added to the polyphenols as foods in the form of tablets, granules, liquids, etc. It can be taken.
一方、他の例としては、柿タンニンから得られた縮合型ポリフェノール化合物を利用して動脈硬化の予防改善を為し得るものが考えられている（例えば、特許文献２参照）。
しかしながら、お茶カテキンのカテキン類は大部分がモノマーであるため、カテキンが２〜数個重合したオリゴマーに比べて薬理活性が低く、経口摂取した場合に薬理活性を充分に得ることができないという問題があった。又、ブドウ種子等からのポリフェノール類は、主としてエピカテキン（ＥＣ）が重合したプロアントシアニジンであるため、エピガロカテキン（ＥＧＣ）やエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）が重合したものに比べて薬理活性が充分でなく、同時に当該ポリフェノール類は平均重合度が７〜９とやや高い高分子であるのため、吸収性に劣り、経口摂取した場合に薬理活性を充分に得ることができないという問題があった。更に、柿タンニンから得られた縮合型ポリフェノール化合物は、高分子のポリマーであるため、ブドウ種子等のポリフェノール類と同様に吸収性に劣り、経口摂取した場合に薬理活性を充分に利用することができないという問題があった。 However, since catechins of tea catechins are mostly monomers, the pharmacological activity is low compared to oligomers in which 2 to several catechins are polymerized, and it is not possible to obtain sufficient pharmacological activity when taken orally. there were. In addition, since polyphenols from grape seeds are mainly proanthocyanidins in which epicatechin (EC) is polymerized, they have pharmacological activity compared to those in which epigallocatechin (EGC) or epigallocatechin gallate (EGCg) is polymerized. At the same time, the polyphenols are polymers with a slightly high average degree of polymerization of 7 to 9, so that they have poor absorbability and cannot obtain sufficient pharmacological activity when taken orally. . Furthermore, since the condensed polyphenol compound obtained from persimmon tannin is a high-molecular polymer, it has poor absorbability like polyphenols such as grape seeds and can fully utilize pharmacological activity when taken orally. There was a problem that I could not.
本発明は上述の実情に鑑みてなしたもので、経口摂取した場合に良好な吸収性を維持しつつ薬理活性を飛躍的に高める柿ポリフェノールを提供することを目的としている。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a polyphenol that dramatically increases pharmacological activity while maintaining good absorbability when taken orally.
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、低分子化した柿ポリフェノールが薬理活性を向上させると共に吸収性を高めることを見出し、本発明を完成した。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventor found that low molecular weight soot polyphenols improved pharmacological activity and increased absorbability, and completed the present invention.
すなわち、本発明は、柿タンニンから得られた低分子化柿ポリフェノールであり、前記低分子化柿ポリフェノールは、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、エピカテキン、エピカテキンガレートのカテキン類を主要構成成分とし、前記エピカテキン１モル当量に対してエピガロカテキンとエピガロカテキンガレートの合算モル当量が１以上から６以下になることを特徴とする柿ポリフェノール、に係るものである。 That is, the present invention is a low molecular weight cocoon polyphenol obtained from cocoon tannin, the low molecular weight cocoon polyphenol is epigallocatechin, epigallocatechin gallate, epicatechin, catechins of epicatechin gallate as main components And the total molar equivalent of epigallocatechin and epigallocatechin gallate is from 1 to 6 in relation to 1 molar equivalent of epicatechin.
又、本発明において、低分子化柿ポリフェノールは、二量体から五量体までのオリゴマーが主要成分であるものである。 In the present invention, the low molecular weight soot polyphenol is mainly composed of oligomers from dimers to pentamers.
このように、本発明によれば、低分子化柿ポリフェノールは、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、エピカテキン、エピカテキンガレートのカテキン類を主要構成成分とし、エピカテキン１モル当量に対してエピガロカテキンとエピガロカテキンガレートの合算モル当量が１以上から６以下になるように重合した構造であり、且つ二量体から五量体までのオリゴマーが主要成分であるので、モノマーや高分子のポリマーと異なり、経口摂取した場合に吸収性の低下をきたすことなく、高い薬理活性を示し、結果的に疾患を改善する機能を増強することができる。 Thus, according to the present invention, the low molecular weight soot polyphenol has epigallocatechin, epigallocatechin gallate, epicatechin, and catechins of epicatechin gallate as the main constituents, and epicatechin with respect to 1 molar equivalent of epicatechin. Since it is a structure in which the total molar equivalent of gallocatechin and epigallocatechin gallate is from 1 to 6, and oligomers from dimer to pentamer are the main components, Unlike a polymer, when it is orally ingested, it exhibits a high pharmacological activity without causing a decrease in absorbability, and as a result, it can enhance the function of improving the disease.
又、本発明者らは、柿由来の低分子化ポリフェノールが転写因子ＮＦ−κＢに対する強力な活性化阻害作用を有することを初めて明らかにした。すなわち、遺伝子発現制御に関与する転写因子の一つのであるＮＦ−κＢは、活性化されることによって、がん細胞が増殖したり、エイズウイルスが複製したり、リウマチが発症したり、或いは糖尿病や動脈硬化症へ関与したりすることが明らかになっているので、柿由来の低分子化ポリフェノールが有するＮＦ-κB活性化阻害機能により、抗がん作用、抗炎症作用、動脈硬化抑制作用、抗糖尿病作用を付与できる。 In addition, the present inventors have clarified for the first time that a low molecular weight polyphenol derived from silkworm has a strong activation inhibitory action on the transcription factor NF-κB. That is, NF-κB, which is one of transcription factors involved in gene expression control, is activated to cause cancer cells to proliferate, AIDS virus to replicate, rheumatism to develop, or diabetes NF-κB activation inhibitory function possessed by low molecular weight polyphenols derived from sputum, which has been shown to be involved in anti-cancer, anti-inflammatory, arteriosclerotic, Can impart anti-diabetic action.
低分子化柿ポリフェノールは、カテキン類のうちエピガロカテキンやエピガロカテキンガレートを多く含むが、これらのカテキンは、ブドウ種子やリンゴ果実由来のポリフェノールの構成成分であるエピカテキンに比べて高い薬理活性、すなわち強力な抗酸化活性、抗アレルギー活性、抗菌活性や糖分解酵素阻害活性を有しており、夫々の活性機能を介して、抗肥満作用、血圧上昇抑制作用、抗歯周病作用、抗う蝕作用の疾患の予防や症状の改善に寄与することができる。 Low molecular weight cocoon polyphenols contain a large amount of epigallocatechin and epigallocatechin gallate among catechins, but these catechins have higher pharmacological activity than epicatechin, which is a constituent of polyphenols derived from grape seeds and apple fruits. In other words, it has strong antioxidant activity, antiallergic activity, antibacterial activity and glycolytic enzyme inhibitory activity, and through each active function, it has anti-obesity effect, blood pressure rise-inhibiting effect, anti-periodontal disease effect, antidepressant It can contribute to prevention of erosive diseases and improvement of symptoms.
又、低分子化柿ポリフェノールは、モノマーでなく且つ高分子のポリマーでもなく、適度に重合した二量体から五量体までのオリゴマーであるため、経口摂取した場合に良好な吸収性を維持しつつ高い薬理活性を発揮し、結果的に疾患の予防や改善作用が飛躍的に向上する。 Low molecular weight polyphenols are not monomers and polymers, but are oligomers of moderately polymerized dimers to pentamers, and therefore maintain good absorption when taken orally. While exhibiting high pharmacological activity, the preventive and ameliorating action of the disease is dramatically improved.
上記した本発明の柿ポリフェノールによれば、経口摂取した場合に良好な吸収性を維持しつつ薬理活性を飛躍的に高めることができるという優れた効果を奏し得る。 According to the cocoon polyphenol of the present invention described above, it is possible to achieve an excellent effect that the pharmacological activity can be dramatically increased while maintaining good absorbability when taken orally.
以下のように実施例がある。 Examples are as follows.
本発明の実施の形態の柿ポリフェノールは、未熟果実や生皮中に含まれる柿タンニンを酸性下で断片化した後、吸着樹脂に吸着させ、充分水洗してからエタノール水溶液で溶出し、ついで減圧濃縮した濃縮液を凍結乾燥又は噴霧乾燥することにより粉末として得られる。得られた低分子化柿ポリフェノールは、二量体から五量体までのオリゴマーであって、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、エピカテキン、エピカテキンガレートのカテキン類を主要構成成分として重合したものであり、組成的には、エピカテキン１モル当量に対してエピガロカテキンとエピガロカテキンガレートの合算モル当量（合算モル比）が１以上から６以下までになるように、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、エピカテキン、エピカテキンガレートを含んでいる。 The straw polyphenol of the embodiment of the present invention is obtained by fragmenting the straw tannin contained in immature fruit and rawhide under acidic conditions, adsorbing it to the adsorption resin, washing it with water, eluting with an aqueous ethanol solution, and then concentrating under reduced pressure. The concentrated solution is freeze-dried or spray-dried to obtain a powder. The obtained low molecular weight polyphenol is an oligomer from dimer to pentamer, which is polymerized with catechins of epigallocatechin, epigallocatechin gallate, epicatechin, and epicatechin gallate as main constituents. In terms of composition, epigallocatechin and epigallocatechin so that the total molar equivalent (total molar ratio) of epigallocatechin and epigallocatechin gallate is from 1 to 6 with respect to 1 molar equivalent of epicatechin. Contains gallocatechin gallate, epicatechin and epicatechin gallate.
ここで、エピカテキン１モル当量に対してエピガロカテキンとエピガロカテキンガレートの合算モル当量が１以上とは、ブドウ種子やリンゴ果実由来のポリフェノールの場合、組成比の高いエピカテキンの存在によりエピガロカテキンとエピガロカテキンガレートの合算モル当量が１未満になり、本発明の柿ポリフェノールと、ブドウ種子等のポリフェノールとが全く相違することを意味している。又、エピカテキン１モル当量に対してエピガロカテキンとエピガロカテキンガレートの合算モル当量が６以下とは、エピガロカテキンやエピガロカテキンガレートが組成的に増えた場合であっても少なくとも１０％程度のエピカテキンを含むので、エピガロカテキンとエピガロカテキンガレートの合算モル当量が論理的に６以下になることから、本発明の柿ポリフェノールには、エピガロカテキンとエピガロカテキンガレートの合算モル当量に上限値があることを示している。 Here, when the combined molar equivalent of epigallocatechin and epigallocatechin gallate is 1 or more with respect to 1 molar equivalent of epicatechin, in the case of polyphenols derived from grape seeds and apple fruits, the epicatechin has a high composition ratio. The total molar equivalent of gallocatechin and epigallocatechin gallate is less than 1, which means that the straw polyphenol of the present invention is completely different from polyphenols such as grape seeds. The total molar equivalent of epigallocatechin and epigallocatechin gallate is 6 or less with respect to 1 mol equivalent of epicatechin, even if epigallocatechin or epigallocatechin gallate is increased in composition. Since the total molar equivalent of epigallocatechin and epigallocatechin gallate is logically 6 or less because it contains a certain amount of epicatechin, the polymole of the present invention has a combined mol of epigallocatechin and epigallocatechin gallate. It shows that there is an upper limit for the equivalent weight.
又、メルカプトエタノール分解法により低分子化柿ポリフェノールのカテキン組成を分析した一例を示すと、エピカテキン１モル当量に対するエピガロカテキンとエピガロカテキンガレートの合算モル当量（合算モル比）はおおよそ４であり、エピカテキンより抗酸化活性や糖分解酵素阻害活性などの薬理活性の強いエピガロカテキンやエピガロカテキンガレートをかなり多く含むことが明らかであった。 An example of analyzing the catechin composition of a low molecular weight polyphenol by a mercaptoethanol decomposition method shows that the total molar equivalent (total molar ratio) of epigallocatechin and epigallocatechin gallate is about 4 with respect to 1 molar equivalent of epicatechin. Yes, it was clear that epigallocatechin and epigallocatechin gallate, which have stronger pharmacological activities such as antioxidant activity and glycolytic enzyme inhibitory activity than epicatechin, were contained.
更に、ピロガロール型のエピガロカテキン（ＥＧＣ）やエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）は、エピカテキン（ＥＣ）に比べて水酸基の数が多く、抗酸化活性やラジカル消去活性が高いため、より強力な抗がん作用、抗炎症作用、動脈硬化抑制作用及び血圧上昇抑制作用を示すので、ガン、関節炎、動脈硬化症、高血圧症、慢性腎不全などの疾患の予防や症状の改善に有用である。 Furthermore, pyrogallol-type epigallocatechin (EGC) and epigallocatechin gallate (EGCg) have more hydroxyl groups than epicatechin (EC), and have higher antioxidant activity and radical scavenging activity. Since it exhibits a cancer action, an anti-inflammatory action, an arteriosclerosis inhibitory action, and a blood pressure rise inhibitory action, it is useful for prevention of diseases such as cancer, arthritis, arteriosclerosis, hypertension, chronic renal failure, and improvement of symptoms.
又、ガロイルエステル型のエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）は、エピカテキン(EC)に比べて糖分解酵素阻害活性、抗菌活性、抗ウイルス活性が高いため、より強力な抗糖尿病作用、抗肥満作用、抗う蝕作用、抗歯周病作用を示すので、糖尿病、虫歯、歯周病などの疾患の予防や症状の改善に有用である。 In addition, galloyl ester type epigallocatechin gallate (EGCg) has higher glycolytic enzyme inhibitory activity, antibacterial activity, and antiviral activity than epicatechin (EC), so it has more powerful anti-diabetic activity and anti-obesity activity. Since it exhibits anti-cariogenic action and anti-periodontal disease action, it is useful for prevention of diseases such as diabetes, dental caries and periodontal disease and improvement of symptoms.
更に本発明の低分子化柿ポリフェノールが、単量体であるお茶カテキン或いはエピカテキンの重合体からなるプロアントシアニジンを主成分とするブドウ種子やリンゴ果実由来のポリフェノールと比較して成分的に及び構造的に優れていることを説明すると、プロシアニジンの抗酸化力やラジカル消去活性と重合度の関係では、単量体＜二量体＜三量体と重合度が上昇するにつれて、活性が上昇する傾向が認められる。又、カテキンとエピカテキンの組み合わせからなる二量体においては、ガロイル基の導入により、例外なくプロシアニジンの抗酸化力やラジカル消去活性が上昇する。 Furthermore, the low molecular weight cocoon polyphenol of the present invention has a component and structure as compared with polyphenols derived from grape seeds and apple fruits mainly composed of proanthocyanidins consisting of a polymer of tea catechin or epicatechin as monomers. In terms of the relationship between procyanidin's antioxidant power and radical scavenging activity and the degree of polymerization, the activity tends to increase as the monomer <dimer <trimer and the degree of polymerization increase. Is recognized. In addition, in a dimer composed of a combination of catechin and epicatechin, the antioxidant power and radical scavenging activity of procyanidins are increased without exception by the introduction of a galloyl group.
すなわち本発明の低分子化柿ポリフェノールは、薬理活性の強いカテキンであるエピガロカテキンガレートやエピガロカテキンを多く含んだ二量体から五量体までのオリゴマーを主要成分とするので、単量体であるお茶カテキン或いは、エピカテキンの高分子重合体であるブドウ種子やリンゴ果実由来のポリフェノールに比較し、抗酸化活性、ラジカル消去活性、糖分解酵素阻害活性、抗菌活性及び抗ウイルス活性などが飛躍的に高まり、より強力な抗がん作用、抗炎症作用、動脈硬化抑制作用、血圧上昇抑制作用、抗糖尿病作用、抗肥満作用、抗う蝕作用及び抗歯周病作用を示し、結果的に、ガン、関節炎、動脈硬化症、高血圧症、慢性腎不全、糖尿病、虫歯及び歯周病などの種々疾患の予防と症状の改善を一層可能にしている。 That is, the low molecular weight polyphenol of the present invention is mainly composed of oligomers from dimers to pentamers containing a large amount of epigallocatechin gallate and epigallocatechin, which are catechins having strong pharmacological activity. Compared to polyphenols derived from grape catechins and apple fruits, which are high-polymers of tea catechin or epicatechin, antioxidant activity, radical scavenging activity, glycolytic enzyme inhibitory activity, antibacterial activity, and antiviral activity have jumped As a result, it shows stronger anticancer action, anti-inflammatory action, arteriosclerosis inhibitory action, blood pressure increase inhibitory action, antidiabetic action, anti-obesity action, anti-cariogenic action and anti-periodontal disease action, It further enables prevention and improvement of various diseases such as cancer, arthritis, arteriosclerosis, hypertension, chronic renal failure, diabetes, dental caries and periodontal disease.
以下に、柿ポリフェノールにおける低分子化ポリフェノールの作用を説明しえるよう、低分子化柿ポリフェノールの実施例について抗酸化活性と転写因子ＮＦ−κＢ活性化阻害活性を中心に説明する。 Hereinafter, examples of the low molecular weight polyphenols will be described focusing on the antioxidant activity and the transcription factor NF-κB activation inhibitory activity, so that the action of the low molecular weight polyphenols in the polyphenols can be explained.
実施例１は、本発明の低分子化柿ポリフェノール（柿ポリフェノール（Ｌ））と、低分子化処理前の高分子の柿ポリフェノール（柿ポリフェノール（Ｈ））の抗酸化力とを細胞生存率で比較したものである。具体的には、ブタ腎上皮細胞（LLC‐PK１）を２×１０４細胞／ｍLの濃度に懸濁した細胞懸濁液（DMEM/F‐12培養液）２００μＬを９６穴プレートに播種し、２４時間予備培養した。その後、ブタ腎上皮細胞（LLC‐PK１）の培養液に５ｍMグルコースを添加し、更に２４時間培養した。次いで、５ｍMグルコース又は３０ｍMグルコースと、５μｇ／ｍL又は１０μｇ／ｍLの高分子あるいは低分子の柿ポリフェノールを添加して２４時間培養し、細胞生存率をＭＴＴ法で測定した。 Example 1 shows the cell viability of the low molecular weight cocoon polyphenol (柿 polyphenol (L)) of the present invention and the antioxidant power of the polymer cocoon polyphenol (柿 polyphenol (H)) before the low molecular weight treatment. It is a comparison. Specifically, 200 μL of a cell suspension (DMEM / F-12 culture solution) in which porcine kidney epithelial cells (LLC-PK 1 ) are suspended at a concentration of 2 × 10 4 cells / mL is seeded in a 96-well plate. For 24 hours. Thereafter, 5 mM glucose was added to the culture solution of porcine kidney epithelial cells (LLC-PK 1 ), and further cultured for 24 hours. Subsequently, 5 mM glucose or 30 mM glucose and 5 μg / mL or 10 μg / mL high molecular or low molecular weight sputum polyphenol were added and cultured for 24 hours, and the cell viability was measured by the MTT method.
その結果、図１に示す如く、高濃度の３０ｍMグルコース処理では、５ｍMグルコース処理群に比べて細胞生存率が１７％減少するという細胞毒性を示したが、低分子及び高分子の柿ポリフェノール処理群では夫々細胞生存率が回復した。又、１０μｇ／ｍLの低分子化柿ポリフェノール（Ｌ）では、５ｍMグルコース処理群に近いレベルまで細胞生存率が回復した。
As a result, as shown in FIG. 1, high-
実施例２では、ブタ腎上皮細胞(LLC-PK１)の形態学的検討を行ったもので、具体的には２×１０４細胞／ｍLの濃度に懸濁した細胞懸濁液を６穴プレートに２ｍＬ播種し、以下実施例１と同様の方法で培養し、顕微鏡下で撮影した。 In Example 2, morphological examination of porcine kidney epithelial cells (LLC-PK 1 ) was performed. Specifically, 6 cell suspensions of cells suspended at a concentration of 2 × 10 4 cells / mL were used. 2 mL was inoculated on the plate, cultured in the same manner as in Example 1 below, and photographed under a microscope.
その結果、高濃度の３０ｍMグルコース処理によって細胞は形態学的変化をきたすが、１０μｇ／ｍLの低分子化柿ポリフェノール（Ｌ）では、高濃度グルコースによる細胞の形態学的変化を抑制した。 As a result, cells were morphologically changed by treatment with a high concentration of 30 mM glucose, but 10 μg / mL of low molecular weight polyphenol (L) suppressed the morphological changes of cells due to high concentration of glucose.
実施例３は、低分子化柿ポリフェノール（柿ポリフェノール（Ｌ））、高分子の柿ポリフェノール（柿ポリフェノール（Ｈ））、及び比較試料について、活性酸素種の一種である一酸化窒素（ＮＯ）の生成に対する抑制効果を比較したものである。具体的には、ブタ腎上皮細胞（LLC‐PK１）を２×１０４細胞／ｍLの濃度に懸濁した細胞懸濁液２００μＬを９６穴プレートに播種し、２４時間予備培養した。その後、LLC‐PK１細胞の培養液に５ｍMグルコースを添加し、更に２４時間培養した。次いで、５ｍMグルコース又は３０ｍMグルコースと、５μｇ／ｍL又は１０μｇ／ｍLの高分子あるいは低分子の柿ポリフェノール並びに比較試料を添加して２４時間培養後、グリース試薬（0.1% N(-1-naphtyl)ethylendiamine, 1% sulfanilamide,2.5% H３PO４）を加え、室温で５分間インキュベーション後、マイクロプレートリーダーで５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、一酸化窒素（ＮＯ）濃度に換算した。なお、比較試料１は、カロチノイドの中でもっとも抗酸化が強いといわれるアスタキサンチン、比較試料２は、プロアントシアニジンを高濃度含むぶどう種子の抽出物（Gravinol（登録商標））、比較試料３は、フランス沿海地域で取れる松の樹皮から得られるポリフェノール類（Pycnogenol（登録商標））である。
Example 3 shows a low molecular weight soot polyphenol (soot polyphenol (L)), a polymer soot polyphenol (soot polyphenol (H)), and a comparative sample of nitric oxide (NO) which is a kind of active oxygen species. It is a comparison of the inhibitory effect on generation. Specifically, 200 μL of a cell suspension in which porcine kidney epithelial cells (LLC-PK 1 ) were suspended at a concentration of 2 × 10 4 cells / mL was seeded in a 96-well plate and pre-cultured for 24 hours. Then, 5 mM glucose was added to the culture solution of LLC-PK 1 cell, and further cultured for 24 hours. Next, 5 mM glucose or 30 mM glucose, 5 μg / mL or 10 μg / mL high molecular or low molecular weight salmon polyphenols and a comparative sample were added and incubated for 24 hours, followed by grease reagent (0.1% N (-1-naphtyl) ethylendiamine). , 1% sulfanilamide, 2.5% H 3 PO 4 ), and after incubation at room temperature for 5 minutes, the absorbance at 540 nm was measured with a microplate reader and converted to a nitric oxide (NO) concentration.
その結果、図２に示す如く、一酸化窒素（ＮＯ）の濃度は３０ｍMグルコース処理によって、５ｍMグルコース処理群よりも２.６倍上昇し、低分子及び高分子の柿ポリフェノール処理群は一酸化窒素（ＮＯ）の濃度を低下させた。ここで、低分子化柿ポリフェノール（Ｌ）は、柿ポリフェノール（Ｈ）、比較試料１、比較試料２、比較試料３に比べて一酸化窒素（ＮＯ）の濃度を一層低下させた。
As a result, as shown in FIG. 2, the concentration of nitric oxide (NO) increased 2.6 times as much as the 30 mM glucose treatment compared to the 5 mM glucose treatment group. The concentration of (NO) was reduced. Here, the low molecular weight soot polyphenol (L) further reduced the concentration of nitric oxide (NO) as compared with soot polyphenol (H),
実施例４は、低分子化柿ポリフェノール（柿ポリフェノール（Ｌ））、高分子の柿ポリフェノール（柿ポリフェノール（Ｈ））及び比較試料について、活性酸素種のスーパーオキシド（Ｏ２ −）の生成に対する抑制効果を比較したものである。具体的には、ブタ腎上皮細胞（LLC‐PK１）を２×１０４細胞／ｍLの濃度に懸濁した細胞懸濁液２００μＬを９６穴プレートに播種し、２４時間予備培養した。その後、ブタ腎上皮細胞（LLC‐PK１）の培養液に５ｍMグルコースを添加し、更に２４時間培養した。次いで、５ｍMグルコース又は３０ｍMグルコースと、５μｇ／ｍL又は１０μｇ／ｍLの高分子あるいは低分子の柿ポリフェノール並びに比較試料とを添加して２４時間培養し、反応液（０.１２５ｍM ＥＤＴＡ，６２μＭ ＮＢＴ，９８μＭ ＮＡＤＨ含有５０ｍMリン酸緩衝液）と３３μＭのＰＭＳを加えて５分間インキュベーション後、マイクロプレートリーダーで５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、スーパーオキシド（Ｏ２ −）濃度に換算した。なお、比較試料１、比較試料２、比較試料３は、実施例３と略同様である。
Example 4 shows the suppression of the production of superoxide (O 2 − ) of reactive oxygen species for low molecular weight soot polyphenols (soot polyphenols (L)), high soot polyphenols (soot polyphenols (H)) and comparative samples. It is a comparison of effects. Specifically, 200 μL of a cell suspension in which porcine kidney epithelial cells (LLC-PK 1 ) were suspended at a concentration of 2 × 10 4 cells / mL was seeded in a 96-well plate and pre-cultured for 24 hours. Thereafter, 5 mM glucose was added to the culture solution of porcine kidney epithelial cells (LLC-PK 1 ), and further cultured for 24 hours. Subsequently, 5 mM glucose or 30 mM glucose, 5 μg / mL or 10 μg / mL high molecular or low molecular weight salmon polyphenol and a comparative sample were added and cultured for 24 hours, and the reaction solution (0.125 mM EDTA, 62 μM NBT, 98 μM) was cultured. NADH-containing 50 mM phosphate buffer) and 33 μM PMS were added and incubated for 5 minutes, and then the absorbance at 540 nm was measured with a microplate reader and converted to a superoxide (O 2 − ) concentration.
その結果、図３に示す如く、３０ｍMグルコース処理によるスーパーオキシド（Ｏ２ −）の濃度は、５ｍMグルコース処理群に比べて１.４倍上昇し、低分子及び高分子の柿ポリフェノール処理群はスーパーオキシド（Ｏ２ −）の濃度を低下させた。ここで、１０μｇ／ｍLの低分子化柿ポリフェノール（Ｌ）は、柿ポリフェノール（Ｈ）、比較試料１、比較試料２、比較試料３に比べてスーパーオキシド（Ｏ２ −）の濃度を一層低下させ、その濃度は５ｍMグルコース処理のレベルまで戻った。
As a result, as shown in FIG. 3, the concentration of superoxide (O 2 − ) by 30 mM glucose treatment increased by 1.4 times compared to the 5 mM glucose treatment group, and the low molecular and high molecular weight polyphenol treatment groups were super The concentration of oxide (O 2 − ) was reduced. Here, 10 μg / mL of low molecular weight soot polyphenol (L) further reduces superoxide (O 2 − ) concentration compared to soot polyphenol (H),
実施例５は、低分子化柿ポリフェノール（柿ポリフェノール（Ｌ））と、高分子の柿ポリフェノール（柿ポリフェノール（Ｈ））について、活性酸素種のペルオキシナイトライト（ＯＮＯＯ−）の生成に対する抑制効果を比較したものである。具体的には、ブタ腎上皮細胞（LLC‐PK１）を２×１０４細胞／ｍLの濃度で懸濁した細胞懸濁液２００μＬを９６穴プレートに播種し、２４時間予備培養した。その後、ブタ腎上皮細胞（LLC‐PK１）の培養液に５ｍMグルコースを添加し、更に２４時間培養した。次いで、５ｍMグルコース又は３０ｍMグルコースと、５μｇ／ｍL又は１０μｇ／ｍLの高分子あるいは低分子の柿ポリフェノールとを添加して２４時間培養し、ジヒドロローダミン１２３（dihydrorhodamine 123）を含む緩衝液を加えて３７℃で５分間インキュベーション後、マイクロプレートリーダーで５００ｎｍにおける吸光度で測定し、ペルオキシナイトライト（ＯＮＯＯ−）濃度に換算した。 Example 5 shows the suppression effect on the generation of peroxynitrite (ONOO − ) of active oxygen species for low molecular weight soot polyphenol (soot polyphenol (L)) and soot polyphenol (soot polyphenol (H)) as a polymer. It is a comparison. Specifically, 200 μL of a cell suspension in which porcine kidney epithelial cells (LLC-PK 1 ) were suspended at a concentration of 2 × 10 4 cells / mL was seeded in a 96-well plate and pre-cultured for 24 hours. Thereafter, 5 mM glucose was added to the culture solution of porcine kidney epithelial cells (LLC-PK 1 ), and further cultured for 24 hours. Subsequently, 5 mM glucose or 30 mM glucose and 5 μg / mL or 10 μg / mL high molecular weight or low molecular weight sputum polyphenol are added and cultured for 24 hours, and a buffer solution containing dihydrorhodamine 123 is added to 37 After incubating at 5 ° C. for 5 minutes, the absorbance at 500 nm was measured with a microplate reader and converted to a peroxynitrite (ONOO − ) concentration.
その結果、図４に示す如く、３０ｍMグルコース処理によるペルオキシナイトライト（ＯＮＯＯ−）の濃度は、５ｍMグルコース処理群よりも約７５％上昇した。これに対し、高分子の柿ポリフェノール（Ｈ）処理群では顕著な変化を認めなかったが、低分子化柿ポリフェノール（Ｌ）処理群では、高濃度グルコースによって上昇したペルオキシナイトライト（ＯＮＯＯ−）を濃度依存的に低下させた。 As a result, as shown in FIG. 4, the concentration of peroxynitrite (ONOO − ) by the treatment with 30 mM glucose was increased by about 75% as compared with the 5 mM glucose treatment group. In contrast, no significant change was observed in the high molecular weight polyphenol (H) treated group, but in the low molecular weight polyphenol (L) treated group, peroxynitrite (ONOO − ) increased by high concentration glucose was observed. The concentration was lowered depending on the concentration.
実施例６は、低分子化柿ポリフェノール（柿ポリフェノール（Ｌ））と、高分子の柿ポリフェノール（柿ポリフェノール（Ｈ））及び比較試料について、WangとJosephの方法に従い、細胞内の活性酸素量を定量して酸化ストレス状態を比較したものである。具体的には、ブタ腎上皮細胞（LLC‐PK１）を２×１０４細胞／ｍLの濃度で懸濁した液２００μＬを９６穴プレートに播種し、５ｍMグルコース含有培養液で２４時間予備培養した。次いで、５ｍMグルコース又は３０ｍMグルコースと、５μｇ／ｍL又は１０μｇ／ｍLの高分子あるいは低分子の柿ポリフェノール並びに比較試料とを添加して２４時間培養後、リン酸緩衝液で洗浄し、１００μＭの非蛍光物質ＤＣＦＨ−ＤＡ（2',7'-dichlorofluorescein diacetate）を１００μＬ加えて１５分間培養した。その後、９６穴プレートから培養液を取り除いてＤＭＥＭ／Ｆ-１２培養液を加え、１時間培養した。この９６穴プレートをマイクロプレートリーダ−（励起波長：４８５ｎｍ、蛍光波長：５３５ｎｍ）で蛍光物質ＤＣＦ（2',7'-dichlorofluorescein）の蛍光強度を測定した。なお、この測定は、非蛍光物質ＤＣＦＨ−ＤＡが活性酸素存在下で強い蛍光を示す蛍光物質ＤＣＦに変換されるという原理を応用している。ここで、なお、比較試料１は、カロチノイドの中でもっとも抗酸化が強いといわれるアスタキサンチン、比較試料２は、プロアントシアニジンを高濃度含むぶどう種子の抽出物（Gravinol（登録商標））、比較試料３は、フランス沿海地域で取れる松の樹皮から得られるポリフェノール類（Pycnogenol（登録商標））である。
In Example 6, the amount of active oxygen in cells was measured for a low molecular weight cocoon polyphenol (柿 polyphenol (L)), a polymer cocoon polyphenol (柿 polyphenol (H)) and a comparative sample according to the method of Wang and Joseph. Quantitative comparison of oxidative stress state. Specifically, 200 μL of a suspension of porcine kidney epithelial cells (LLC-PK 1 ) at a concentration of 2 × 10 4 cells / mL was seeded in a 96-well plate and pre-cultured in a culture solution containing 5 mM glucose for 24 hours. . Subsequently, 5 mM glucose or 30 mM glucose, 5 μg / mL or 10 μg / mL high molecular or low molecular weight cocoon polyphenol and a comparative sample were added and cultured for 24 hours, washed with phosphate buffer, and 100 μM non-fluorescent. 100 μL of the substance DCFH-DA (2 ′, 7′-dichlorofluorescein diacetate) was added and incubated for 15 minutes. Thereafter, the culture solution was removed from the 96-well plate, DMEM / F-12 culture solution was added, and the mixture was cultured for 1 hour. The fluorescence intensity of the fluorescent substance DCF (2 ′, 7′-dichlorofluorescein) was measured on the 96-well plate with a microplate reader (excitation wavelength: 485 nm, fluorescence wavelength: 535 nm). This measurement applies the principle that the non-fluorescent substance DCFH-DA is converted into a fluorescent substance DCF that exhibits strong fluorescence in the presence of active oxygen. Here,
その結果、図５に示す如く、３０ｍＭグルコース処理細胞における細胞内活性酸素量は、５ｍＭグルコース処理細胞と比較して約１.６倍に増加していたが、柿ポリフェノール処理細胞では濃度依存的に低下していた。特に低分子化柿ポリフェノール（Ｌ）を１０μｇ／ｍＬ添加した群において、細胞内活性酸素量の低下が顕著であった。 As a result, as shown in FIG. 5, the amount of intracellular active oxygen in 30 mM glucose-treated cells was increased by about 1.6 times compared to 5 mM glucose-treated cells. It was falling. In particular, in the group to which 10 μg / mL of low molecular weight soot polyphenol (L) was added, the decrease in the amount of intracellular active oxygen was significant.
実施例７は、低分子化柿ポリフェノール（柿ポリフェノール（Ｌ））と、高分子の柿ポリフェノール（柿ポリフェノール（Ｈ））について、転写因子ＮＦ−κＢに及ぼす影響を比較したものである。 Example 7 compares the influence of a low molecular weight soot polyphenol (soot polyphenol (L)) and a polymer soot polyphenol (soot polyphenol (H)) on the transcription factor NF-κB.
ここで、活性酸素種と転写因子ＮＦ−κＢ（nuclear factor−kappa B：免疫グロブリンｋ鎖遺伝子発現のエンハンサーのB断片）の関係を示すと、図６に示す如く、高濃度グルコースにより高血糖状態に曝された細胞質内では、スーパーオキシド（Ｏ２ −）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）、一酸化窒素（ＮＯ）等の活性酸素種（ＲＯＳ）が生成されやすい。又、抑制因子Ｉ−κＢ（inhibitor−kappa B）と結合して不活性状態で存在している転写因子ＮＦ−κＢは、活性酸素種（ＲＯＳ）により抑制因子Ｉ−κＢから解離して活性化されると、核内に移行してｉＮＯＳ（inducible nitric oxide synthase）やＣＯＸ-２（cyclooxygenase-2）等の炎症関連酵素の誘導を促進する。その中でもｉＮＯＳはマクロファージや血管平滑筋等に存在して、炎症反応等によって活性化されるが、このｉＮＯＳは一酸化窒素（ＮＯ）を生成する反応を触媒する。又、生成した一酸化窒素（ＮＯ）はスーパーオキシド（Ｏ２ −）と反応してペルオキシナイトライト（ＯＮＯＯ−）を生成する。ペルオキシナイトライト（ＯＮＯＯ−）は一酸化窒素（ＮＯ）よりも強い酸化力を有する活性酸素で、脂質や蛋白質の過酸化を引き起こす。一方、ＣＯＸ-２は炎症に関わるプロスタグランジンの生成に関与しており、多くの慢性疾患の病因となっている。なお、転写因子ＮＦ−κＢは炎症関連酵素の発現を調整して、サイトカイン（cytokines）、ケモカイン（chemokines）、免疫受容体（immunoreceptors）等の免疫応答の中心的メディエーターとして重要な役割を演じている。 Here, the relationship between reactive oxygen species and transcription factor NF-κB (nuclear factor-kappa B: B fragment of an enhancer of immunoglobulin k chain gene expression) is shown in FIG. Reactive oxygen species (ROS) such as superoxide (O 2 − ), hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), hydroxyl radical (.OH), and nitric oxide (NO) are generated in the cytoplasm exposed to Cheap. In addition, the transcription factor NF-κB existing in an inactive state by binding to the inhibitor I-κB (B) is dissociated from the inhibitor I-κB by the reactive oxygen species (ROS) and activated. Then, it moves into the nucleus and promotes induction of inflammation-related enzymes such as iNOS (inducible nitric oxide synthase) and COX-2 (cyclooxygenase-2). Among them, iNOS exists in macrophages and vascular smooth muscles and is activated by an inflammatory reaction or the like. This iNOS catalyzes a reaction for generating nitric oxide (NO). Further, the resulting nitric oxide (NO), superoxide produces the (O 2 - -) and react with peroxynitrite (ONOO). Peroxynitrite (ONOO − ) is an active oxygen having a stronger oxidizing power than nitric oxide (NO) and causes peroxidation of lipids and proteins. On the other hand, COX-2 is involved in the production of prostaglandins related to inflammation, and is the cause of many chronic diseases. The transcription factor NF-κB regulates the expression of inflammation-related enzymes and plays an important role as a central mediator of immune responses such as cytokines, chemokines, and immunoreceptors. .
このため、実施例７では、高濃度グルコースにより高血糖状態に曝されたブタ腎上皮細胞（LLC‐PK１）における転写因子ＮＦ−κＢの局在を調べた。具体的には、ブタ腎上皮細胞（LLC‐PK１）を懸濁した細胞懸濁液を６穴プレートに播種し、５ｍＭグルコース含有培養液で２４時間予備培養した。次いで、５ｍＭグルコース又は３０ｍＭグルコースと、１０μｇ／ｍＬの高分子あるいは低分子の柿ポリフェノールとを添加して２４時間培養した。次いで、３.７％パラホルムアルデヒドで３０分間、４℃で固定後洗浄し、０.２％Triton X-100を３０分間、４℃で浸透させた。更に細胞をリン酸緩衝液で洗浄し、２％ ＢＳＡ（bovine serum albumin）で１時間ブロックング後、anti-ＮＦ-κＢ抗体を加えて２時間、４℃で処理した。次に、anti-ＮＦ-κＢ抗体を結合させた細胞をリン酸緩衝液で洗浄し、ＦＩＴＣ（fluoresceinisothiocyanate）-共役anti-rabbit IgGを加えて１時間、４℃でインキュベーションし洗浄した。最後に、これらの細胞にDAPI（4',6-diamidinophenylindole）を加えて５分間室温で染色後、リン酸緩衝液で２回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した。 Therefore, in Example 7, the localization of the transcription factor NF-κB in porcine kidney epithelial cells (LLC-PK 1 ) exposed to a hyperglycemic state with high concentration glucose was examined. Specifically, a cell suspension in which porcine kidney epithelial cells (LLC-PK 1 ) was suspended was seeded in a 6-well plate and pre-cultured in a culture solution containing 5 mM glucose for 24 hours. Subsequently, 5 mM glucose or 30 mM glucose and 10 μg / mL high molecular weight or low molecular weight straw polyphenol were added and cultured for 24 hours. Subsequently, it was washed with 3.7% paraformaldehyde for 30 minutes at 4 ° C. and then washed, and 0.2% Triton X-100 was infiltrated for 30 minutes at 4 ° C. Further, the cells were washed with a phosphate buffer, blocked with 2% BSA (bovine serum albumin) for 1 hour, anti-NF-κB antibody was added, and the mixture was treated at 4 ° C. for 2 hours. Next, the cells to which the anti-NF-κB antibody was bound were washed with a phosphate buffer, and FITC (fluoresceinisothiocyanate) -conjugated anti-rabbit IgG was added and incubated at 4 ° C. for 1 hour for washing. Finally, DAPI (4 ′, 6-diamidinophenylindole) was added to these cells, stained for 5 minutes at room temperature, washed twice with a phosphate buffer, and observed with a fluorescence microscope.
その結果、図７に示す如く、転写因子ＮＦ−κＢは５ｍMグルコース処理細胞では細胞質にとどまっていたが、３０ｍMグルコースで処理した細胞では核内に移行していた。しかしながら、柿ポリフェノールで処理した細胞では、５ｍMグルコースで処理した細胞とほとんど変わらず、細胞質にとどまっていた。 As a result, as shown in FIG. 7, the transcription factor NF-κB remained in the cytoplasm in cells treated with 5 mM glucose, but moved into the nucleus in cells treated with 30 mM glucose. However, the cells treated with 柿 polyphenol remained almost the same as the cells treated with 5 mM glucose.
実施例８は、高濃度グルコースにより高血糖状態に曝されたブタ腎上皮細胞（LLC‐PK１）におけるｉＮＯＳとＣＯＸ-２の発現に及ぼす低分子化柿ポリフェノール（柿ポリフェノール（Ｌ））及び高分子の柿ポリフェノール（柿ポリフェノール（Ｈ））の影響をウェスタンブロッティング解析した。具体的には、ブタ腎上皮細胞（LLC‐PK１）を懸濁した細胞懸濁液を１０ｍＬカルチャーディッシュに播種し、５ｍＭグルコース含有培養液で２４時間予備培養した。次いで、５ｍＭグルコース又は３０ｍＭグルコースと、５μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬの高分子あるいは低分子の柿ポリフェノールを添加して２４時間培養した。次に、ブタ腎上皮細胞（LLC‐PK１）を１０ｍＬカルチャーディッシュの底面から剥離して回収後、抽出緩衝液［２５ｍＭ Tris-HCl (pH7.5)、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、1% nonidet P-40、１ｍＭ phenylmethylsulfonyl fluoride（ＰＭＳＦ）、１ｍＭ ＤＴＴ、５０μＬプロテアーゼインヒビターカクテル］を加え、細胞内の蛋白質を抽出した。抽出した蛋白質量はBio-Rad protein assay kitで測定した。次いで３０μｇの蛋白質を電気泳動用緩衝液に溶解させ、常法にてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ニトロセルロース膜にトランスファーし、当該ニトロセルロース膜について免疫ブロット解析（immunoblot analysis）を行った。免疫ブロット解析では、ａｎｔｉ−ＮＯＳ２（ｉＮＯＳ）モノクローナ抗体、ａｎｔｉ−ＣＯＸ-２モノクローナル抗体、蛋白質発現量の標準マーカーとしてのａｎｔｉ−ＣＯＸ-１モノクローナル抗体、及びペルオキシダーゼ標準化２次抗体（peroxidase-labeled secondary antibody）を用いた。なお、上記免疫ブロット解析は、ニトロセルロース膜をＥＣＬ（enhanced chemiluminescence）法にて撮影することにより実施した。 Example 8 shows the effects of low molecular weight 柿 polyphenol (柿 polyphenol (L)) and high molecular weight on the expression of iNOS and COX-2 in porcine kidney epithelial cells (LLC-PK 1 ) exposed to a hyperglycemic state with high concentration glucose. Western blotting analysis was carried out on the influence of molecular cocoon polyphenol (柿 polyphenol (H)). Specifically, a cell suspension in which porcine kidney epithelial cells (LLC-PK 1 ) were suspended was seeded in a 10 mL culture dish, and precultured in a culture solution containing 5 mM glucose for 24 hours. Subsequently, 5 mM glucose or 30 mM glucose and 5 μg / mL or 10 μg / mL high molecular weight or low molecular weight sputum polyphenol were added and cultured for 24 hours. Next, pig kidney epithelial cells (LLC-PK 1 ) are detached from the bottom of the 10 mL culture dish and collected, and then extracted buffer [25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% nonidet P -40, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM DTT, 50 μL protease inhibitor cocktail] was added to extract intracellular proteins. The amount of extracted protein was measured with a Bio-Rad protein assay kit. Next, 30 μg of the protein was dissolved in an electrophoresis buffer and subjected to SDS-PAGE by a conventional method, then transferred to a nitrocellulose membrane, and immunoblot analysis was performed on the nitrocellulose membrane. In immunoblot analysis, anti-NOS2 (iNOS) monoclonal antibody, anti-COX-2 monoclonal antibody, anti-COX-1 monoclonal antibody as a standard marker of protein expression level, and peroxidase-labeled secondary antibody (peroxidase-labeled secondary antibody) antibody). The immunoblot analysis was performed by photographing the nitrocellulose membrane by the ECL (enhanced chemiluminescence) method.
ｉＮＯＳによるＮＯ産生はマクロファージ、肝細胞、好中球、上皮細胞等の種々の細胞で見られるが、その結果では、図８に示す如く、高濃度グルコース処理によってｉＮＯＳとＣＯＸ-２が多量に発現していた。ｉＮＯＳは３０ｍＭグルコース処理群で過剰発現していたが、低分子化柿ポリフェノール（Ｌ）で処理した群では、発現量が著しく低下した。一方高分子の柿ポリフェノール（Ｈ）で処理した群では低分子化柿ポリフェノール（Ｌ）処理群よりもその作用は弱かった。ＮＯとプロスタグランジンは、いずれも多くの慢性疾患の病因であることが知られているが、プロスタグランジンの合成過程を触媒するＣＯＸはアラキドン酸をプロスタグランジンに変換する酵素である。ＣＯＸ-２は炎症に関わるプロスタグランジンの生成に関与しており、ＣＯＸ-１はほとんど全ての臓器に恒常的に発現している蛋白質であって、本実験では蛋白質発現量の標準マーカーとして用いた。図８では、ＣＯＸ-２がｉＮＯＳと同様に、高濃度グルコース処理によって過剰発現していたが、低分子と高分子の柿ポリフェノール処理群では、いずれもＣＯＸ−２の発現量を著しく低下させていた。 NO production by iNOS is observed in various cells such as macrophages, hepatocytes, neutrophils and epithelial cells. As a result, as shown in FIG. 8, a large amount of iNOS and COX-2 are expressed by high-concentration glucose treatment. Was. Although iNOS was overexpressed in the 30 mM glucose treatment group, the expression level was significantly reduced in the group treated with the low molecular weight polyphenol (L). On the other hand, the group treated with high molecular weight polyphenol (H) was weaker than the group treated with low molecular weight polyphenol (L). Both NO and prostaglandins are known to cause many chronic diseases, but COX, which catalyzes the prostaglandin synthesis process, is an enzyme that converts arachidonic acid into prostaglandins. COX-2 is involved in the production of prostaglandins related to inflammation, and COX-1 is a protein that is constitutively expressed in almost all organs and is used as a standard marker for protein expression in this experiment. It was. In FIG. 8, COX-2 was overexpressed by high-concentration glucose treatment, similar to iNOS, but in both low and high molecular weight polyphenol-treated groups, the expression level of COX-2 was significantly reduced. It was.
実施例９は、ＳＴＺ（ストレプトゾレシン）誘発糖尿病ラットによる低分子化柿ポリフェノールの効果を測定したものである。具体的には、ラットにＳＴＺ（ストレプトゾレシン）を投与して１〜２Ｗ後に糖尿病を確認した後、実験開始時に同じ血糖値を用いた。Ｃｏｎｔｒｏｌ群には水を、低分子化柿ポリフェノール群にはポリフェノール５，１０，２０ｍｇ／ｋｇを、２０日間、胃ゾンデで経口投与した。投与後には、各ラットを屠殺して血液採取及び臓器摘出を行い、血液（糖、糖化タンパク質、血清アルブミン）、組織（腎組織中のＣＯＸ-１、ＣＯＸ-２、ｉＮＯＳ、ＮＦ−κＢ（転写因子）、Ｂａｘ（Ｂａｘはミトコンドリアに存在し、酸化ストレス状態で上昇する）を測定し、コントロールのラットの値と比較した。
Example 9 is a measurement of the effect of low molecular weight cocoon polyphenols in STZ (streptozolecin) -induced diabetic rats. Specifically, after STZ (streptozolecin) was administered to rats and diabetes was confirmed after 1 to 2 W, the same blood glucose level was used at the start of the experiment. Water was orally administered to the Control group and
その結果、血糖値、糖化タンパク、血清アルブミン、ＣＯＸ-２、ｉＮＯＳ、ＮＦ−κＢ転写因子、Ｂａｘに好影響を及ぼしていた。 As a result, blood glucose level, glycated protein, serum albumin, COX-2, iNOS, NF-κB transcription factor and Bax were positively affected.
従って実施例１から実姉例９までの結果により次のことが云える。すなわち、腎上皮細胞に高濃度グルコースによる酸化ストレスを与えたところ、一酸化窒素（ＮＯ）、スーパーオキシド（Ｏ２ −）、ペルオキシナイトライト（ＯＮＯＯ−）等の活性酸素種（ＲＯＳ）が増加して、転写因子ＮＦ−κＢの核への移行を引き起こし、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ-２の発現量が著しく増加していた。また細胞生存率の低下や形態学的変化を引き起こし、細胞毒性を呈していた。これに対し、柿ポリフェノールは、図９に示す如く、活性酸素の生成を抑制し、転写因子ＮＦ−κＢの核内への移行（活性化）を抑えてｉＮＯＳ、ＣＯＸ-２の発現を抑制することによって、結果的に高血糖状態から派生する酸化ストレスシグナルを抑制していた。更に、低分子化柿ポリフェノールは、高分子の柿ポリフェノールよりその作用が強いことを明らかにした。 Therefore, the following can be said based on the results from Example 1 to Actual Sister Example 9. That is, when oxidative stress by high-concentration glucose is given to renal epithelial cells, reactive oxygen species (ROS) such as nitric oxide (NO), superoxide (O 2 − ), and peroxynitrite (ONOO − ) increase. Thus, the transcription factor NF-κB was transferred to the nucleus, and the expression levels of iNOS and COX-2 were remarkably increased. In addition, cell viability was reduced and morphological changes were caused, and the cells were cytotoxic. On the other hand, as shown in FIG. 9, polyphenols suppress the generation of active oxygen, suppress the transfer (activation) of transcription factor NF-κB into the nucleus, and suppress the expression of iNOS and COX-2. As a result, the oxidative stress signal derived from the hyperglycemic state was suppressed. Furthermore, it has been clarified that the low molecular weight soot polyphenol has a stronger action than the polymer soot polyphenol.
以上のことから、本発明の実施例によれば、柿タンニンから得られた低分子化柿ポリフェノールは、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、エピカテキン、エピカテキンガレートのカテキン類を主要構成成分とし、エピカテキン１モル当量に対してエピガロカテキンとエピガロカテキンガレートの合算モル当量が１以上からなる重合した構造であり、且つ二量体から五量体までのオリゴマーが主要成分であるため、経口摂取した場合に良好な吸収性を維持しつつ、高い薬理活性を発揮するので、各種の疾患の改善作用が飛躍的に向上する。当然のことながらモノマーであるお茶カテキンと比較して、オリゴマーである本発明の低分子化柿ポリフェノールの薬理活性は飛躍的に向上する。又、柿ポリフェノールとリンゴ未熟果実ポリフェノールの夫々のオリゴマーを比較した場合にも、柿ポリフェノールが、エピカテキンに比較してエピガロカテキンガレートを多く含む重合体であるのに対し、リンゴ未熟果実ポリフェノールのオリゴマーは、薬理活性の低いエピカテキンの重合体であるため、必然的にリンゴ未熟果実ポリフェノールのオリゴマーに比較して低分子化柿ポリフェノールの薬理活性は高く、各種の疾患の症状改善作用も高い。なお、お茶カテキンのカテキン類を化学的に重合させた場合、プロアントシアニジン以外の複雑な構造の重合体が同時に生成するので、望ましい薬理活性をもったオリゴマーを得ることは極めて困難であり、また製造コストも極めて高いものとなるので、実用的でない。 From the above, according to the examples of the present invention, the low molecular weight cocoon polyphenol obtained from cocoon tannin is mainly composed of catechins of epigallocatechin, epigallocatechin gallate, epicatechin, and epicatechin gallate. , Since the combined molar equivalent of epigallocatechin and epigallocatechin gallate is 1 or more with respect to 1 molar equivalent of epicatechin, and the oligomer from dimer to pentamer is the main component, Since it exhibits high pharmacological activity while maintaining good absorbability when taken orally, the action to improve various diseases is dramatically improved. As a matter of course, the pharmacological activity of the low molecular weight cocoon polyphenol of the present invention which is an oligomer is dramatically improved as compared with the tea catechin which is a monomer. In addition, when comparing the oligomers of persimmon polyphenols and apple immature fruit polyphenols, persimmon polyphenols are polymers containing more epigallocatechin gallate than epicatechins, whereas apple immature fruit polyphenols Since the oligomer is a polymer of epicatechin with low pharmacological activity, inevitably the pharmacological activity of the low molecular weight cocoon polyphenol is higher than that of the apple immature fruit polyphenol, and the symptom-improving action of various diseases is also high. In addition, when catechins of tea catechins are chemically polymerized, a polymer having a complex structure other than proanthocyanidins is produced at the same time, so it is extremely difficult to obtain oligomers having desirable pharmacological activity, and production Since the cost is extremely high, it is not practical.
又、渋柿の摘果した未熟果実や生皮などの廃棄物から柿タンニンは得られるので、廃棄物の利用によって環境への影響を改善することができる。 Moreover, since strawberry tannin is obtained from wastes such as immature fruits and raw hides picked from astringent persimmons, the use of waste can improve the environmental impact.
低分子化柿ポリフェノールは、カテキン類のうちエピガロカテキンやエピガロカテキンガレートを多く含むが、これらのカテキンは、ブドウ種子やリンゴ未熟果実由来のポリフェノールの主成分であるエピカテキンに比べて高い薬理活性、すなわち強力な抗酸化活性と転写因子ＮＦ−κＢの活性化阻害活性、及び高い糖分解酵素阻害作用を有しており、それらの機能を介して各種の疾患を改善することができる。 Low molecular weight polyphenols contain a large amount of epigallocatechin and epigallocatechin gallate among catechins, but these catechins have higher pharmacology than epicatechin, which is the main component of polyphenols derived from grape seeds and apple immature fruits. It has activity, that is, strong antioxidant activity, activation inhibitory activity of transcription factor NF-κB, and high glycolytic enzyme inhibitory activity, and various diseases can be improved through these functions.
低分子化柿ポリフェノールは、モノマーでなく且つ高分子のポリマーでもなく、適度に重合した二量体から五量体までのオリゴマーが主要成分であるため、経口摂取した場合に良好な吸収性を維持しつつ高い薬理活性を発揮し、各種の疾患の改善作用が飛躍的に向上する。ここで、七量体以上の構造にすると、高分子のポリマーと同様に吸収性が悪化する。又、モノマーの場合は、薬理活性が低下する。 Low molecular weight polyphenols are neither monomers nor high molecular polymers, and moderately polymerized dimer to pentamer oligomers are the main ingredients, so they maintain good absorption when taken orally. In addition, it exhibits high pharmacological activity while dramatically improving various diseases. Here, when the structure is a heptamer or higher, the absorbability deteriorates as in the case of a polymer. Moreover, in the case of a monomer, pharmacological activity falls.
又、低分子化柿ポリフェノールによる疾患を改善し得る作用は、抗がん作用、抗炎症作用、動脈硬化抑制作用、抗糖尿病作用、抗肥満作用、血圧上昇抑制作用、抗う蝕作用及び抗歯周病作用であるので、各種の疾患に対して良好な改善作用を示すことができる。 In addition, the action that can improve the disease caused by low molecular weight polyphenols is anti-cancer action, anti-inflammatory action, arteriosclerosis inhibitory action, anti-diabetic action, anti-obesity action, blood pressure increase inhibitory action, anti-cariogenic action and anti-periodontal action. Since it is a disease action, it can show a good improvement action for various diseases.
尚、本発明の柿ポリフェノールは、上述の形態例にのみ限定されるものではなく、低分子化柿ポリフェノールを含有するならば、どのような食品、錠剤、顆粒形状でもよいこと、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更を加え得ることは勿論である。 In addition, the cocoon polyphenol of the present invention is not limited to the above-described embodiments, and any food, tablet, or granule shape may be used as long as it contains a low molecular weight cocoon polyphenol. Of course, various changes can be made without departing from the scope of the invention.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005375799A JP2007176845A (en) | 2005-12-27 | 2005-12-27 | Persimmon polyphenol |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005375799A JP2007176845A (en) | 2005-12-27 | 2005-12-27 | Persimmon polyphenol |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2007176845A true JP2007176845A (en) | 2007-07-12 |
Family
ID=38302370
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005375799A Pending JP2007176845A (en) | 2005-12-27 | 2005-12-27 | Persimmon polyphenol |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2007176845A (en) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009007323A (en) * | 2007-05-29 | 2009-01-15 | Earth Chem Corp Ltd | Virus inactivation agent, method for preventing viral infection and container holding the virus inactivation agent |
| JP2009179921A (en) * | 2008-02-01 | 2009-08-13 | Taiyo Kagaku Co Ltd | Polymerization type catechin nanofiber |
| WO2010024138A1 (en) * | 2008-08-29 | 2010-03-04 | サントリーホールディングス株式会社 | Glucosyltransferase inhibitor comprising epigallocatechin gallate polymer as active ingredient |
| WO2010024396A1 (en) * | 2008-08-29 | 2010-03-04 | サントリーホールディングス株式会社 | NOVEL EPIGALLOCATECHIN GALLATE TRIMER, AND α-GLUCOSIDASE INHIBITOR COMPRISING EPIGALLOCATECHIN GALLATE POLYMER |
| WO2010116760A1 (en) * | 2009-04-10 | 2010-10-14 | 花王株式会社 | Inhibitor for elevation of gip level |
| JP2010252726A (en) * | 2009-04-27 | 2010-11-11 | Kyushu Univ | Method for reinforcing anti-oxidizing activity function of persimmon and health food material |
| JP2014198684A (en) * | 2013-03-29 | 2014-10-23 | サンスター株式会社 | Blood sugar metabolism improver |
| JP2019163211A (en) * | 2018-03-19 | 2019-09-26 | 三生医薬株式会社 | Method for producing persimmon polyphenol decomposed product |
| CN114983997A (en) * | 2022-06-02 | 2022-09-02 | 广西科学院 | Medicine for treating grouper iridovirus disease |
-
2005
- 2005-12-27 JP JP2005375799A patent/JP2007176845A/en active Pending
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009007323A (en) * | 2007-05-29 | 2009-01-15 | Earth Chem Corp Ltd | Virus inactivation agent, method for preventing viral infection and container holding the virus inactivation agent |
| JP2009179921A (en) * | 2008-02-01 | 2009-08-13 | Taiyo Kagaku Co Ltd | Polymerization type catechin nanofiber |
| JP5555166B2 (en) * | 2008-08-29 | 2014-07-23 | サントリーホールディングス株式会社 | Α-Glucosidase inhibitor containing novel epigallocatechin gallate trimer and epigallocatechin gallate polymer |
| WO2010024138A1 (en) * | 2008-08-29 | 2010-03-04 | サントリーホールディングス株式会社 | Glucosyltransferase inhibitor comprising epigallocatechin gallate polymer as active ingredient |
| WO2010024396A1 (en) * | 2008-08-29 | 2010-03-04 | サントリーホールディングス株式会社 | NOVEL EPIGALLOCATECHIN GALLATE TRIMER, AND α-GLUCOSIDASE INHIBITOR COMPRISING EPIGALLOCATECHIN GALLATE POLYMER |
| CN102137662B (en) * | 2008-08-29 | 2017-02-08 | 三得利控股株式会社 | Novel epigallocatechin gallate trimer, and alpha-glucosidase inhibitor comprising epigallocatechin gallate polymer |
| US9237996B2 (en) | 2008-08-29 | 2016-01-19 | Suntory Holdings Limited | Glucosyltransferase inhibitor containing epigallocatechin gallate polymer as active ingredient |
| US8367718B2 (en) | 2008-08-29 | 2013-02-05 | Suntory Holdings Limited | Epigallocatechin gallate trimer and α-glucosidase inhibitor containing epigallocatechin gallate polymer |
| JP2010260856A (en) * | 2009-04-10 | 2010-11-18 | Kao Corp | Inhibitor for elevation of gip level |
| WO2010116760A1 (en) * | 2009-04-10 | 2010-10-14 | 花王株式会社 | Inhibitor for elevation of gip level |
| JP2010252726A (en) * | 2009-04-27 | 2010-11-11 | Kyushu Univ | Method for reinforcing anti-oxidizing activity function of persimmon and health food material |
| JP2014198684A (en) * | 2013-03-29 | 2014-10-23 | サンスター株式会社 | Blood sugar metabolism improver |
| JP2019163211A (en) * | 2018-03-19 | 2019-09-26 | 三生医薬株式会社 | Method for producing persimmon polyphenol decomposed product |
| JP7178652B2 (en) | 2018-03-19 | 2022-11-28 | 三生医薬株式会社 | Method for producing persimmon polyphenol decomposition product |
| CN114983997A (en) * | 2022-06-02 | 2022-09-02 | 广西科学院 | Medicine for treating grouper iridovirus disease |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2007176845A (en) | Persimmon polyphenol | |
| US10183007B2 (en) | Method of producing proanthocyanidin oligomer | |
| Ku et al. | Characterization of proanthocyanidin in hot water extract isolated from Pinus radiata bark | |
| Lin et al. | UHPLC-PDA-ESI/HRMS n profiling method to identify and quantify oligomeric proanthocyanidins in plant products | |
| Labarbe et al. | Quantitative fractionation of grape proanthocyanidins according to their degree of polymerization | |
| Lazarus et al. | High-performance liquid chromatography/mass spectrometry analysis of proanthocyanidins in foods and beverages | |
| US7939116B2 (en) | Sulfur-containing proanthocyanidin oligomer composition and production method thereof | |
| JP4892690B2 (en) | Hepatitis C virus production inhibitor | |
| JP5160149B2 (en) | 柿 Polyphenol oligomer | |
| JP2001515860A (en) | Plant proanthocyanidin extract effective for inhibiting the attachment of bacteria having P-type fimbriae to the surface | |
| JP5569716B2 (en) | Drug for inhibiting lectin-like oxidized LDL receptor | |
| Czemplik et al. | Optimization of phenolic compounds extraction from flax shives and their effect on human fibroblasts | |
| JP4822291B2 (en) | Liver fibrosis inhibitor | |
| Favari et al. | Flavan‐3‐ols: Catechins and proanthocyanidins | |
| Iyke et al. | Investigation of phytocomponents and hypoglycaemic effect of hydro-methanolic leaf extract of Cnidoscolus aconitifolius (Spinach Tree) in streptozotocin induced-diabetic wistar rats | |
| Chang et al. | Cranberry juice polyphenols inhibited the formation of advanced glycation end products in collagens, inhibited advanced glycation end product-induced collagen crosslinking, and cleaved the formed crosslinks | |
| Yıldız et al. | Antioxidant effects of viburnum opulus on streptozotocin-induced experimental diabetic rats | |
| Fudouji et al. | Coupling reactions of catechins with natural aldehydes and allyl alcohols and radical scavenging activities of the triglyceride-soluble products | |
| JP2000273452A (en) | Antioxidant | |
| JP2011207796A (en) | Chaenomeles sinensis derived polyphenol having lipid metabolism improving function | |
| AU2012244090B2 (en) | Method of producing proanthocyanidin oligomer | |
| Molino | Tannins. Bioactivity and effect on gut microbiota | |
| KR20030022620A (en) | Novel chlorogenic acid methyl ether compounds isolated from Phyllostachys edulis leaf and a use thereof | |
| CN115003291A (en) | Use and composition based on polyphenols for increasing the oral bioavailability of hydroxytyrosol | |
| Ma et al. | Flavan-3-ol monomers and condensed tannins in dietary and medicinal plants |