JP2007153797A - Therapeutic agent and preventive agent of autoimmune disease, inflammation, and nervous disease - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒアルロニダーゼを有効成分とする自己免疫疾患治療剤、炎症治療剤及び神経疾患治療剤に関する。また、本発明は、ヒアルロニダーゼを有効成分とする自己免疫疾患予防剤、炎症予防剤及び神経疾患予防剤に関する。 The present invention relates to a therapeutic agent for autoimmune diseases, a therapeutic agent for inflammation and a therapeutic agent for neurological diseases, which comprises hyaluronidase as an active ingredient. The present invention also relates to an autoimmune disease preventive agent, inflammation preventive agent and neurological disease preventive agent comprising hyaluronidase as an active ingredient.
多発性硬化症（multiple sclerosis : MS）は、寛解と再発きたすヒトの中枢神経系の自己免疫疾患であり、炎症に伴って中枢神経系の髄鞘のみが崩壊する代表的な脱髄性疾患と知られている。MSは、多くは思春期から40歳代のあいだに発症し、歩くとふらつく、目がかすむ、二重に見える、尿が出にくい、および痛みやしびれなどの症状がある。子供や若い人が発症する場合には、てんかんが出ることもある。症状を現す原因となる病巣が大脳や脊髄神経に、一つ以上、散在性にできる。また、病巣が空間的に散在しているだけでなく、時間的にも症状が次々と出たり消失を呈する。多発性硬化症の病態には、免疫系が絡み、自己免疫疾患・炎症と捉えられている。また、脊髄神経が侵されることから、神経疾患のひとつとしても捉えられている。 Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the human central nervous system that causes remission and relapse, and is a typical demyelinating disease in which only the myelin sheath of the central nervous system collapses due to inflammation. Are known. MS often develops from adolescence to the 40s, and includes symptoms such as staggering, blurred vision, double vision, difficulty in urinating, and pain and numbness when walking. Epilepsy may occur when children or young people develop. One or more lesions that cause symptoms can be scattered in the cerebrum or spinal nerve. In addition, the lesions are not only spatially scattered, but also symptoms appear and disappear one after another. The pathology of multiple sclerosis involves the immune system and is regarded as an autoimmune disease / inflammation. In addition, since the spinal nerve is affected, it is also regarded as one of the neurological diseases.
近年、MSの予防薬として、インターフェロンβ1bが使用され、Th1系細胞からTh2系細胞への免疫シフトにより再発予防に効果があるとされる（非特許文献１）。MSでは、脊髄にヒアルロン酸の蓄積がみられ、oligodendrocyteの前駆細胞の成熟が抑制されることが、報告されている（非特許文献２）。 In recent years, interferon β1b has been used as a prophylactic agent for MS and is said to be effective in preventing recurrence by immune shift from Th1 cells to Th2 cells (Non-patent Document 1). In MS, it has been reported that hyaluronic acid is accumulated in the spinal cord and maturation of precursor cells of oligodendrocytes is suppressed (Non-patent Document 2).
そこで、本発明は、自己免疫疾患治療剤、炎症治療剤及び神経疾患治療剤を提供することを目的とする。また、本発明は、自己免疫疾患予防剤、炎症予防剤及び神経疾患予防剤を提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide an autoimmune disease therapeutic agent, an inflammation therapeutic agent, and a neurological disease therapeutic agent. It is another object of the present invention to provide an autoimmune disease preventive agent, an inflammation preventive agent and a neurological disease preventive agent.
上述した目的を達成した本発明に係る自己免疫疾患治療剤、炎症治療剤及び神経疾患治療剤は、ヒアルロニダーゼを有効成分として含有する。また、本発明に係る自己免疫疾患予防剤、炎症予防剤及び神経疾患予防剤は、ヒアルロニダーゼを有効成分として含有する。 The therapeutic agent for autoimmune diseases, the therapeutic agent for inflammation and the therapeutic agent for neurological diseases according to the present invention that have achieved the above-mentioned object contain hyaluronidase as an active ingredient. Moreover, the autoimmune disease preventive agent, inflammation preventive agent, and neurological disease preventive agent according to the present invention contain hyaluronidase as an active ingredient.
本発明においてヒアルロニダーゼとしては、ヒアルロン酸を分解する活性を有するものであれば特に限定されず使用することができる。本発明では、例えば以下の（a）又は（b）のポリペプチドを有するヒアルロニダーゼを使用することができる。
（a）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（b）配列番号１に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、ヒアルロン酸を分解する活性を有するポリペプチド
In the present invention, hyaluronidase is not particularly limited as long as it has an activity of decomposing hyaluronic acid. In the present invention, for example, a hyaluronidase having the following polypeptide (a) or (b) can be used.
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (b) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and comprising hyaluronic acid Polypeptide having activity of degrading
本発明に係る薬剤は、ヒアルロニダーゼを有効成分とするものであるから、比較的安価にかつ容易に大量生産できる利点がある。また、ヒアルロニダーゼは毒性や抗原性がほとんどないこと、生体が元来有している治療作用や疾患の防止作用を増強することから副作用の極めて少ない治療剤及び予防剤として期待される。このように、本発明によれば、自己免疫疾患、炎症及び神経疾患に有効な新規な薬剤を提供することができる。 Since the chemical | medical agent based on this invention uses hyaluronidase as an active ingredient, there exists an advantage which can be mass-produced easily comparatively cheaply. Hyaluronidase is expected to be a therapeutic and prophylactic agent with very few side effects because it has almost no toxicity and antigenicity, and enhances the therapeutic action and disease prevention action inherent in the living body. Thus, according to the present invention, a novel drug effective for autoimmune diseases, inflammation and neurological diseases can be provided.
以下、本発明を詳細に説明する。以下の説明において、本発明に係る治療剤及び予防剤をまとめて薬剤と称する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail. In the following description, the therapeutic agent and prophylactic agent according to the present invention are collectively referred to as a drug.
本発明に係る薬剤の有効成分であるヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸（ヒアルロナン）を分解する活性を有するポリペプチドを意味する。本発明においてヒアルロニダーゼとしては、当該活性を有する限り、如何なる由来のヒアルロニダーゼを使用することができる。ヒアルロニダーゼとしては、例えば、哺乳類のヒアルロニダーゼ、細菌或いはストレプトミセス（放線菌）から分離されたヒアルロナンリアーゼ、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼACII、コンドロイチナーゼACI、コンドロイチナーゼB及びハチ毒ヒアルロニダーゼを挙げることができる。特に、哺乳類のヒアルロニダーゼとしては、PH-20（精巣ヒアルロニダーゼ）、Hyal-1、Hyal-2、Hyal-3及びSPAM1を挙げることができる。 Hyaluronidase, which is an active ingredient of the drug according to the present invention, means a polypeptide having an activity of degrading hyaluronic acid (hyaluronan). In the present invention, any hyaluronidase of any origin can be used as long as it has the activity. Examples of hyaluronidases include mammalian hyaluronidase, hyaluronan lyase isolated from bacteria or Streptomyces, chondroitinase ABC, chondroitinase ACII, chondroitinase ACI, chondroitinase B, and bee venom hyaluronidase. be able to. In particular, examples of mammalian hyaluronidase include PH-20 (testicular hyaluronidase), Hyal-1, Hyal-2, Hyal-3, and SPAM1.
より具体的には、ヒアルロニダーゼとしてPH-20（精巣ヒアルロニダーゼ）を使用することができる。PH-20（精巣ヒアルロニダーゼ）のアミノ酸配列を配列番号１に示す。なお、ヒアルロニダーゼとしては、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに限定されず、配列番号１に示すアミノ酸配列における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、ヒアルロン酸を分解する活性を有するポリペプチドであっても使用することができる。ここで、数個のアミノ酸とは、２〜５０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは１〜１０個のアミノ酸を意味する。 More specifically, PH-20 (testicular hyaluronidase) can be used as the hyaluronidase. The amino acid sequence of PH-20 (testis hyaluronidase) is shown in SEQ ID NO: 1. The hyaluronidase is not limited to the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, but from an amino acid sequence in which one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are substituted, deleted, added or inserted. Thus, even a polypeptide having an activity of degrading hyaluronic acid can be used. Here, several amino acids mean 2 to 50, preferably 2 to 20, more preferably 1 to 10 amino acids.
また、ヒアルロニダーゼとしては、翻訳後の修飾を受けた形であってもよいし、翻訳後の修飾を受ける前の形であっても使用することができる。翻訳後の修飾としては、末端アミノ酸配列の切断や糖鎖付加修飾を挙げることができる。 The hyaluronidase may be in a form that has undergone post-translational modification or in a form that has not undergone post-translational modification. Examples of post-translational modifications include cleavage of terminal amino acid sequences and sugar chain addition modifications.
本発明の薬剤は、ヒアルロニダーゼを有効成分とするものであり、その有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって生体に悪影響を与えることなく自己免疫疾患、炎症及び神経疾患からなる群から選ばれる少なくとも１種の疾患を改善及び予防することができる。自己免疫疾患、炎症及び神経疾患としては多発性硬化症を挙げることができる。但し、自己免疫疾患及び炎症としては、多発性硬化症に限定されず、例えば、リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸炎、ブドウ膜炎、腎炎、腎症、I型糖尿病、アトピー性皮膚炎、シェーグレン症候群、インスリン受容体異常症、血管炎、重症筋無力症、多発性筋炎、喘息、橋本病が挙げられる。また、神経疾患としては、多発性硬化症に限定されず、例えば、神経炎、神経痛、神経麻痺、脳卒中、脳性麻痺、鬱病、老人性痴呆症、パーキンソン病、アルツハイマー病、レックリングハウゼン病、もやもや病、クラッベ病、急性散在性脳脊髄炎、脊髄神経根神経障害、急性播種性脳脊髄炎、視神経脊髄炎、副腎白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、末梢神経障害（末梢神経損傷、ギランバレー症候群、絞扼性神経障害、腕神経叢麻痺、糖尿病性ニューロパチーなど）等を挙げることができる。すなわち、ヒアルロニダーゼを有効成分として含む薬剤は、上述した各種の自己免疫疾患、炎症及び神経疾患に対して治療効果及び予防効果がある。 The drug of the present invention comprises hyaluronidase as an active ingredient, and is selected from the group consisting of autoimmune diseases, inflammations and neurological diseases without adversely affecting the living body by administering an effective amount thereof to mammals including humans. At least one disease can be ameliorated and prevented. Autoimmune diseases, inflammation and neurological diseases can include multiple sclerosis. However, the autoimmune disease and inflammation are not limited to multiple sclerosis. For example, rheumatism, systemic lupus erythematosus, inflammatory enteritis, uveitis, nephritis, nephropathy, type I diabetes, atopic dermatitis, Sjogren Syndrome, insulin receptor abnormality, vasculitis, myasthenia gravis, polymyositis, asthma, Hashimoto's disease. Further, the neurological disease is not limited to multiple sclerosis, for example, neuritis, neuralgia, neuralgia, stroke, cerebral palsy, depression, senile dementia, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Recklinghausen disease, moyamoya Disease, Krabbe disease, acute disseminated encephalomyelitis, spinal radiculoneuropathy, acute disseminated encephalomyelitis, optic neuritis, adrenoleukodystrophy, metachromatic leukodystrophy, amyotrophic lateral sclerosis, peripheral neuropathy (Peripheral nerve injury, Guillain-Barre syndrome, strangulation neuropathy, brachial plexus paralysis, diabetic neuropathy, etc.). That is, a drug containing hyaluronidase as an active ingredient has a therapeutic effect and a preventive effect on the various autoimmune diseases, inflammations and neurological diseases described above.
本発明の薬剤は、ヒアルロニダーゼを、そのまままたは必要に応じて担体、賦形剤、その他の添加物と共に、経口的あるいは非経口的に投与（関節内投与、静脈内、筋肉内、皮下などの組織内投与（注射）、経腸投与、経皮投与など）するための医薬品として、任意の剤形に製剤化することが可能であり、任意の投与方法で患者に投与される。 The agent of the present invention administers hyaluronidase, as it is or as necessary, with a carrier, excipient, and other additives, orally or parenterally (intra-articular administration, intravenous, intramuscular, subcutaneous tissue, etc. As a pharmaceutical for internal administration (injection), enteral administration, transdermal administration, etc., it can be formulated into any dosage form and administered to a patient by any administration method.
経口製剤としては、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤等の固形製剤；シロップ剤、エリキシル剤、乳剤等の液状製剤を挙げることができる。散剤は、例えば、乳糖、デンプン、結晶セルロース、乳酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水ケイ酸等の賦形剤と混合して得ることができる。顆粒剤は、上記賦形剤のほか、必要に応じ、例えば白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤や、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の結合剤や、カルボキシメチルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤をさらに加え、湿式又は乾式で造粒して得ることができる。錠剤は、上記散剤又は顆粒剤をそのまま、或いはステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤を加えて打錠して得ることができる。また、上記錠剤又は顆粒剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタアクリル酸メチルコポリマー等の腸溶性基剤で被覆し、或いはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油等で被覆し、これらを腸溶性或いは持続性製剤にすることができる。硬カプセル剤は、上記散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填して得ることができる。また軟カプセル剤は、ヒアルロナン又はその塩を、グリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油等に混合し、これをゼラチン膜で被覆して得ることができる。シロップ剤は、白糖、ソルビトール、グルセリン等の甘味剤とヒアルロナン又はその塩とを、水に溶解して得ることができる。また、甘味剤及び水のほかに、精油、エタノール等を加えてエリキシル剤とするか、或いはアラビアゴム、トラガカント、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウム等を加えて乳剤又は懸濁剤にすることができる。またこれらの液状製剤には必要に応じ、矯味剤、着色剤、保存剤等を加えることができる。 Examples of oral preparations include solid preparations such as powders, granules, capsules and tablets; liquid preparations such as syrups, elixirs and emulsions. The powder can be obtained by mixing with excipients such as lactose, starch, crystalline cellulose, calcium lactate, calcium hydrogen phosphate, magnesium aluminate metasilicate, and silicic anhydride. In addition to the above excipients, the granule is optionally combined with a binder such as sucrose, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, a binder such as carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose calcium, carboxymethylrose, carboxymethylcellulose calcium, etc. Further, a disintegrant may be added and granulated by wet or dry method. Tablets can be obtained by compressing the powder or granules as they are or by adding a lubricant such as magnesium stearate or talc. The tablet or granule is coated with an enteric base such as hydroxypropylmethylcellulose phthalate or methyl methacrylate copolymer, or coated with ethylcellulose, carnauba wax, hardened oil, etc. can do. A hard capsule can be obtained by filling a hard capsule with the above powder or granule. Soft capsules can be obtained by mixing hyaluronan or a salt thereof with glycerin, polyethylene glycol, sesame oil, olive oil or the like and coating it with a gelatin film. A syrup can be obtained by dissolving a sweetener such as sucrose, sorbitol, and glycerin and hyaluronan or a salt thereof in water. In addition to sweeteners and water, essential oils, ethanol and the like can be added to make elixirs, or gum arabic, tragacanth, polysorbate 80, sodium carboxymethylcellulose and the like can be added to make emulsions or suspensions. Moreover, a corrigent, a coloring agent, a preservative, etc. can be added to these liquid preparations as needed.
非経口製剤としては、注射剤、直腸投与剤、ペッサリー、皮膚外用剤、吸入剤、エアゾール剤、点眼剤等を挙げることができる。注射剤は、ヒアルロナン又はその塩に塩酸、水酸化ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等のｐＨ調節剤；塩化ナトリウムウム、ブドウ糖等の等張化剤；及び注射用蒸留水を加え、滅菌濾過した後、アンプルに充填して得ることができる。また、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチン等を加えて真空凍結乾燥し、用時溶解型の注射剤とすることができる。またヒアルロナン又はその塩にレシチン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の乳化剤を加えた後、水中で乳化された注射用乳剤とすることもできる。 Examples of parenteral preparations include injections, rectal administration agents, pessaries, external preparations for skin, inhalants, aerosols, eye drops and the like. Injections include hyaluronan or salts thereof, pH regulators such as hydrochloric acid, sodium hydroxide, lactic acid, sodium lactate, sodium monohydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate; isotonic agents such as sodium chloride and glucose; and It can be obtained by adding distilled water for injection, sterilizing and filtering and then filling ampoules. Further, mannitol, dextrin, cyclodextrin, gelatin and the like can be added and lyophilized in a vacuum to obtain an injection that can be dissolved at the time of use. Moreover, after adding an emulsifier, such as lecithin, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, to hyaluronan or its salt, it can also be set as the emulsion for injection emulsified in water.
直腸投与剤は、ヒアルロニダーゼにカカオ脂肪酸のモノ、ジ又はトリグリセリド、ポリエチレングリコール等の坐剤用基剤を加えた後、加温して溶解し、これを型に流し込んで冷却するか、或いはヒアルロニダーゼをポリエチレングリコール、大豆油等に混合した後、ゼラチン膜で被覆して得ることができる。皮膚外用剤は、ヒアルロニダーゼに、白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコール等を加え、必要に応じて加温し、混練して得ることができる。テープ剤は、ヒアルロニダーゼを、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体等の粘着剤と混練し、これを不織布等に展延して得ることができる。吸入剤は、例えば薬学的に許容される不活性ガス等の噴射剤に、ヒアルロニダーゼを溶解又は分散し、これを耐圧容器に充填して得ることができる。 For rectal administration, add a suppository base such as mono-, di- or triglycerides of cacao fatty acid, polyethylene glycol, etc. to hyaluronidase, and then dissolve by heating, then pour it into a mold and cool it, or remove hyaluronidase. After mixing with polyethylene glycol, soybean oil or the like, it can be obtained by coating with a gelatin film. The external preparation for skin can be obtained by adding white petrolatum, beeswax, liquid paraffin, polyethylene glycol or the like to hyaluronidase, heating as necessary, and kneading. The tape agent can be obtained by kneading hyaluronidase with a pressure-sensitive adhesive such as rosin or alkyl acrylate polymer, and spreading it on a nonwoven fabric or the like. The inhalant can be obtained by, for example, dissolving or dispersing hyaluronidase in a propellant such as a pharmaceutically acceptable inert gas and filling the pressure-resistant container.
（投与方法）本発明のヒアルロニダーゼを有効成分とする薬剤の投与方法は、特に限定されないが、脊髄内投与、静脈内投与および経口投与を挙げることができる。 (Administration method) The administration method of the drug comprising the hyaluronidase of the present invention as an active ingredient is not particularly limited, and examples thereof include intraspinal administration, intravenous administration and oral administration.
（投与量）投与量は、対象とする疾患、患者の年令、健康状態、体重等に応じ適宜決定するが、一般には0.03〜3.0U/kg を１日１回あるはそれ以上に分けて投与する。 (Dosage) The dosage is appropriately determined according to the target disease, the patient's age, health condition, weight, etc. Generally, 0.03 to 3.0 U / kg is once a day or more than that. Administer.
（毒性）本発明で使用するヒアルロニダーゼは、医薬としての生物活性を示す投与量において細胞毒性はほとんどもしくは全く認められなかった。 (Toxicity) The hyaluronidase used in the present invention showed little or no cytotoxicity at doses showing biological activity as a medicine.
以下、本発明に係る薬剤を、実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, although the chemical | medical agent which concerns on this invention is demonstrated in detail using an Example, the technical scope of this invention is not limited to a following example.
〔実施例１〕
本実施例では、多発性硬化症モデルである実験的自己免疫性脊髄炎(ＥＡＥ)にPH-20（精巣ヒアルロニダーゼ）を投与し、その効果を検討した。
[Example 1]
In this example, PH-20 (testicular hyaluronidase) was administered to experimental autoimmune myelitis (EAE), which is a multiple sclerosis model, and the effect was examined.
多発性硬化症モデル動物
４週齢のLewisラットを購入し、５週齢になってから使用した。柴木らの方法（柴木謙次、野村恭一、大野良三、島津邦男：人参養栄湯による実験的自己免疫性脳脊髄炎の抑制．神経治療 19(2)：159-166,2002）に準じて、ミエリン塩基性蛋白（myelin basic protein（MBP）Sigma社製）300μg/匹をPBS 100μlに溶解し、当量のフロインド完全アジュバンド（Freund Complete Adjuvant（FCA）、H37 Ra、Difco社製）および結核死菌（MT、H37 Ra、Difco社製）濃度を0.75mg/mlに調節混合し、動物の左右後肢足蹠に50μlずつ接種した。
本実施例では、接種直後の多発性硬化症モデル動物及び多発性硬化症発症時の多発性硬化症モデル動物（１１匹）を用いた。
Multiple sclerosis model animals 4-week-old Lewis rats were purchased and used after 5 weeks of age. According to Shibaki et al.'S method (Kenji Shibaki, Junichi Nomura, Ryozo Ohno, Kunio Shimazu: Inhibition of experimental autoimmune encephalomyelitis by Ninjin Yoei-to. Neurotherapy 19 (2): 159-166,2002) , Myelin basic protein (myelin basic protein (MBP) manufactured by Sigma) 300 μg / mouse was dissolved in PBS 100 μl, and an equivalent amount of Freund Complete Adjuvant (FCA), H37 Ra, manufactured by Difco) and tuberculosis death The bacteria (MT, H37 Ra, Difco) concentration was adjusted to 0.75 mg / ml, and 50 μl each was inoculated into the left and right hind footpads of the animals.
In this example, a multiple sclerosis model animal immediately after inoculation and a multiple sclerosis model animal (11 animals) at the onset of multiple sclerosis were used.
ＥＡＥ神経症候の評価
抗原接種後より毎日、２名の観察者により神経症状を５段階に分けて、観察した。ＥＡＥ grade は、０：無症状、１：尾のtonusの低下、２：後肢不完全麻痺、３：時に尿便失禁を伴う後肢完全麻痺、４：四肢麻痺とした。
Evaluation of EAE neurological symptoms
Every day after the inoculation, neurological symptoms were divided into five stages and observed by two observers. EAE grade was defined as 0: asymptomatic, 1: decrease in tail tonus, 2: hindlimb incomplete paralysis, 3: hindlimb complete paralysis with urinary fecal incontinence, 4: limb paralysis.
投与方法及び群構成
ペントバルビタール麻酔下に、カテーテル（先端OD：0.245mm、MRE025、Braintree社製）を第６/７胸椎間から挿入し、留置後、マイクロシリンジ（25μl、伊藤製作所製）を用いて、試験物質6μL(10U/ml)を髄腔内投与（PH-20：0.06U/head）し、その後、１回/日、隔日に計６回投与した。なお、本実施例で使用したPH-20は、Hyaluronidase bovine testes, Type IV-S essentially salt-free, lyophilized powder（Sigma社製）である。
ヒアルロニダーゼ投与群（n=6）と、生理食塩水を投与したＥＡＥ対照群（n=5）の計２群でＥＡＥ神経症候を比較した。具体的には各群におけるＥＡＥ gradeを各個体について与えその平均値を算出し、臨床スコアー平均値とした。
Administration method and group composition Under pentobarbital anesthesia, a catheter (tip OD: 0.245mm, MRE025, manufactured by Braintree) was inserted from the 6/7 thoracic vertebra, and after placement, a microsyringe (25μl, manufactured by Ito Seisakusho) was used. Then, 6 μL (10 U / ml) of the test substance was administered intrathecally (PH-20: 0.06 U / head), and then administered once a day for a total of 6 times every other day. PH-20 used in this example is Hyaluronidase bovine testes, Type IV-S essentially salt-free, lyophilized powder (manufactured by Sigma).
The EAE neurological symptoms were compared between the hyaluronidase administration group (n = 6) and the EAE control group (n = 5) administered with saline. Specifically, EAE grade in each group was given to each individual, and the average value was calculated as the clinical score average value.
統計学的評価
神経スコアーはStudent’sのt-testを用いた。
Statistical evaluation Nerve score was Student's t-test.
結果
臨床スコアー平均値の経時的な変化を図１に示した。図１では、ヒアルロニダーゼ投与群のプロファイルを実線で示し、ＥＡＥ対照群のプロファイルを破線で示した。図１から判るように、抗原接種後、ヒアルロニダーゼ投与群においては、ＥＡＥ対照群と比較して、神経兆候の軽症化が認められた。ＥＡＥ極期の神経兆候の比較では、抗原接種後１６日目のＥＡＥ対照群の臨床スコアー平均値２．０±０．８９に対し、ヒアルロニダーゼ投与群では１６日目に１．２±０．４８と有意な低値（P<0.05）を示した。以上の結果から、ヒアルロニダーゼの髄腔内隔日６回投与によって、ＥＡＥに対して神経学的にＥＡＥの予防効果を有すると結論付けられた。従って、ヒアルロニダーゼは、多発性硬化症や急性散在性脳脊髄炎等の自己免疫疾患、炎症及び神経疾患の予防及び治療に有効と考えられる。
Results The changes over time in the mean clinical score are shown in FIG. In FIG. 1, the profile of the hyaluronidase administration group is indicated by a solid line, and the profile of the EAE control group is indicated by a broken line. As can be seen from FIG. 1, after the antigen inoculation, the hyaluronidase administration group showed milder neurological signs compared to the EAE control group. In the comparison of neurological signs at the extreme EAE stage, the mean clinical score of the EAE control group on the 16th day after the inoculation was 2.0 ± 0.89, whereas the hyaluronidase administration group was 1.2 ± 0.48 on the 16th day. And a significantly low value (P <0.05). From the above results, it was concluded that administration of
Claims (6)
（a）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（b）配列番号１に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、ヒアルロン酸を分解する活性を有するポリペプチド The said hyaluronidase has polypeptide of the following (a) or (b), The autoimmune disease therapeutic agent or preventive agent of Claim 1 characterized by the above-mentioned.
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (b) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and comprising hyaluronic acid Polypeptide having activity of degrading
（a）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（b）配列番号１に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、ヒアルロン酸を分解する活性を有するポリペプチド The said hyaluronidase has polypeptide of the following (a) or (b), The inflammation therapeutic agent or preventive agent of Claim 3 characterized by the above-mentioned.
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (b) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and comprising hyaluronic acid Polypeptide having activity of degrading
（a）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（b）配列番号１に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、ヒアルロン酸を分解する活性を有するポリペプチド 6. The therapeutic or prophylactic agent for neurological diseases according to claim 5, wherein the hyaluronidase has the following polypeptide (a) or (b).
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (b) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and comprising hyaluronic acid Polypeptide having activity of degrading
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2005
- 2005-12-05 JP JP2005350690A patent/JP2007153797A/en active Pending
Cited By (14)
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|---|---|---|---|---|
| WO2008149428A1 (en) * | 2007-06-05 | 2008-12-11 | Glycoscience Laboratories, Inc. | Therapeutic agent and preventive agent for autoimmune disease, inflammation and nerve disease |
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