JP2007143547A - Method for measuring constitutional ratio of gene - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は遺伝子構成比測定方法（PD−PCR方法：proportional Deductive PCR方法）、および当該方法の応用技術に関する。 The present invention relates to a gene composition ratio measurement method (PD-PCR method: proportional deductive PCR method) and an applied technique of the method.
最近、蔵田らは、以下のような技術を開示している。
Ａ）定量的（quantitative）PCR方法（非特許文献１）
蛍光色素で標識された１種の均一溶液系プライマープローブおよび１種の蛍光色素非標識の均一溶液系プライマープローブを用いて、２種の遺伝子をPCR方法により増幅し、２種の遺伝子の構成比を測定した。２種の遺伝子の構成比の分析はT−RFLP解析方法によった。
Recently, Kurata et al. Disclosed the following technology.
A) Quantitative PCR method (Non-patent Document 1)
Using one homogeneous solution primer probe labeled with a fluorescent dye and one homogeneous solution primer probe not labeled with a fluorescent dye, two genes are amplified by the PCR method, and the composition ratio of the two genes Was measured. The analysis of the composition ratio of the two genes was based on the T-RFLP analysis method.
Ｂ）定量的PCR方法を介したエンドポイント遺伝子定量法（特許文献１）
１本鎖のポリヌクレオチドの両末端に各々異なった蛍光色素で標識して得た均一系の標的核酸プローブと蛍光色素で標識していない２種のプライマー（forward primerおよびreverse primer）プローブを用いて、２種の遺伝子、すなわち標的遺伝子および内部標準遺伝子を、PCR方法で定常期まで増幅し、各蛍光色素から発生した光学的キャラクター変化量を測定し、得た各変化量の比から標的遺伝子と内部標準遺伝子との構成比を求める方法である。
しかしながら、前記方法Ａ）においては、T−RFLP解析方法を介するので、測定工程が複雑であり、前記方法Ｂ）においては、測定精度の向上がのぞまれていた。
B) Endpoint gene quantification method via quantitative PCR method (Patent Document 1)
Using a homogeneous target nucleic acid probe obtained by labeling each end of a single-stranded polynucleotide with a different fluorescent dye and two types of primers (forward primer and reverse primer) not labeled with a fluorescent dye Two types of genes, namely the target gene and internal standard gene, are amplified to the stationary phase by PCR method, the optical character change amount generated from each fluorescent dye is measured, and the target gene and the target gene are determined from the ratio of each obtained change amount. This is a method for determining the composition ratio with the internal standard gene.
However, in the method A), since the T-RFLP analysis method is used, the measurement process is complicated, and in the method B), improvement in measurement accuracy is desired.
本発明の課題は、前記の状況に鑑み、均一溶液系核酸プローブを用いて２種の遺伝子の構成比を測定する方法において、より測定精度の向上した方法を提供することである。 In view of the above situation, an object of the present invention is to provide a method with improved measurement accuracy in a method for measuring the composition ratio of two kinds of genes using a homogeneous solution nucleic acid probe.
上記目的は、以下の本発明によって達成される。すなわち、本発明は、測定系の２種類の遺伝子を、蛍光色素で標識された１種または２種以上の均一溶液系核酸プローブを用いて増幅させ、測定系の光学的キャラクター変化量を測定し、当該変化量に基づいて、遺伝子構成比を測定する定量的PCR方法において、以下の工程（１）〜（５）を含むことを特徴とする遺伝子構成比の測定方法である。
（１）２種類の遺伝子のどちらか一方に相補し、蛍光色素で標識された、１種または２種以上の均一溶液系核酸プローブを当該相補する遺伝子にハイブリダイズさせ、当該遺伝子を増幅させて増幅過程において発生するその光学的キャラクター変化量を測定し、得られた変化量に基づいて遺伝子の増幅過程をモニタリングする工程（以下、「工程１」という。）。
（２）２種類の遺伝子に同時に相補し、蛍光色素で標識された、前記工程（１）のものとは異なった１種または２種以上の均一溶液系核酸プローブを、２種類の遺伝子にハイブダイズリさせ、当該２種類の遺伝子を増幅させ、増幅過程において発生する光学的キャラクター変化量を測定し、得られた変化量に基づいて、当該２種類の遺伝子の増幅過程をモニタリングする工程（以下、「工程２」という。）。
The above object is achieved by the present invention described below. That is, the present invention amplifies two types of genes in a measurement system using one or more homogeneous solution nucleic acid probes labeled with a fluorescent dye, and measures the amount of optical character change in the measurement system. In the quantitative PCR method for measuring the gene composition ratio based on the amount of change, the method comprises the following steps (1) to (5).
(1) One or two or more homogeneous solution nucleic acid probes complementary to either one of two genes and labeled with a fluorescent dye are hybridized to the complementary gene, and the gene is amplified. A step of measuring the optical character change amount generated in the amplification process and monitoring the gene amplification process based on the obtained change amount (hereinafter referred to as “
(2) One or two or more homogeneous solution nucleic acid probes that are simultaneously complementary to two types of genes and labeled with a fluorescent dye, different from those in step (1) above, are hybridized into two types of genes. And amplifying the two kinds of genes, measuring an optical character change amount generated in the amplification process, and monitoring the amplification process of the two kinds of genes based on the obtained change amount (hereinafter, “ Step 2 ”).
（３）前記工程（２）の光学的キャラクター変化量が、一定値に達したときの前記工程（１）の光学的キャラクター変化量（以下、「補正蛍光変化量」とも呼ぶ）を測定する工程。（以下、「工程３」という。）。
（４）２種類の標準遺伝子を種々な構成比で含む複数の試料について、工程（１）〜（３）を実施し、各標準試料における補正蛍光変化量を測定し、当該測定値と遺伝子構成比との関係式を求める工程（以下、「工程４」という。）。
（５）未知試料について工程（１）〜（３）を実施し、各未知試料における補正蛍光変化量を測定し、当該測定値と、工程（４）で得られた関係式より、未知試料における遺伝子構成比を測定する工程（以下、「工程５」という。）。
(3) A step of measuring the optical character change amount of the step (1) (hereinafter also referred to as “corrected fluorescence change amount”) when the optical character change amount of the step (2) reaches a certain value. . (Hereinafter referred to as “Step 3”).
(4) Steps (1) to (3) are performed on a plurality of samples containing two types of standard genes in various composition ratios, the corrected fluorescence change amount in each standard sample is measured, and the measured value and gene configuration A step of obtaining a relational expression with the ratio (hereinafter referred to as “
(5) Steps (1) to (3) are performed on the unknown sample, the corrected fluorescence change amount in each unknown sample is measured, and the unknown sample is calculated from the measured value and the relational expression obtained in step (4). A step of measuring the gene composition ratio (hereinafter referred to as “
また、本発明は、２種類の遺伝子を標的遺伝子および内部標準遺伝子として、内部標準遺伝子を未知試料に既知量添加して得た試料について、次の工程（ａ）〜（ｂ）を実施して、未知試料中の標的遺伝子量を測定することを特徴とする標的遺伝子量測定方法である。
（ａ）前記１）に記載の工程１〜５を実施して、標的核酸と内部標準遺伝子との構成比を測定する工程。
（ｂ）当該構成比と内部標準遺伝子の添加量から標的遺伝子量を測定する工程。
In addition, the present invention performs the following steps (a) to (b) on a sample obtained by adding a known amount of an internal standard gene to an unknown sample using two kinds of genes as a target gene and an internal standard gene. A target gene amount measuring method characterized by measuring the amount of a target gene in an unknown sample.
(A) A step of measuring the constitutional ratio between the target nucleic acid and the internal standard gene by performing
(B) A step of measuring the target gene amount from the component ratio and the added amount of the internal standard gene.
また、本発明においては、工程１および工程２のいずれか一方若しくは双方の均一溶液系プローブが、蛍光消光核酸プローブであることが好ましい。
また、本発明においては、工程１および工程２のいずれか一方若しくは双方の均一溶液系プローブが、蛍光消光核酸プライマーであることが好ましい。
In the present invention, it is preferable that the homogeneous solution probe in either one or both of
In the present invention, it is preferable that the homogeneous solution probe in either one or both of
また、本発明は、以下の工程１）〜２）を含むことを特徴とするゲノムDNAのゲノムサイズを測定する方法である。
１）既知のゲノムサイズおよびゲノムコピーを有するDNAゲノム（Ａ）および既知のゲノムコピー数を有し、未知ゲノムサイズの標的DNAゲノム（Ｂ）の混合液を用いて、前記の遺伝子構成比測定方法により、遺伝子構成比を測定する工程。
２）Ａのゲノムサイズと、工程１）で得られた遺伝子構成比とから、Ｂのゲノムサイズを測定する工程。
Moreover, this invention is a method of measuring the genome size of the genomic DNA characterized by including the following processes 1) -2).
1) The above gene composition ratio measurement method using a mixture of a DNA genome (A) having a known genome size and genome copy and a target DNA genome (B) having a known genome copy number and an unknown genome size The step of measuring the gene composition ratio.
2) A step of measuring the genome size of B from the genome size of A and the gene composition ratio obtained in step 1).
本発明によれば、遺伝子構成比の測定方法が、格段に優れた測定精度になり、かつ、遺伝子量をより精度よく測定できる遺伝子量測定方法が提供される。また、本発明の遺伝子構成比の測定方法は、ゲノムサイズをより精度よく測定できるゲノムサイズ測定方法に転用できるので、有益な方法である。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the measuring method of a gene composition ratio becomes the measurement accuracy which was remarkably excellent, and the gene amount measuring method which can measure a gene amount more accurately is provided. In addition, the method for measuring the gene composition ratio of the present invention is a useful method because it can be used in a genome size measurement method that can measure the genome size more accurately.
以下に本発明を詳細に説明する。
先ず、本発明で使用する用語を説明または定義する。本発明において用いる用語は、特別な定義がない場合は、現在、分子生物学、遺伝学若しくは遺伝子工学、微生物学若しくは微生物工学等で一般的に使用されている用語と同じ意味である。
「１種若しくは２種以上」、「１種または２種以上」、「１種若しくは複数種」とは、少なくとも１種の意味である。
「標的遺伝子」とは、検出・測定を目的とした遺伝子の意味である。そして、「試料中に含まれる遺伝子」のことを単に標的遺伝子または目的遺伝子という場合がある。
The present invention is described in detail below.
First, terms used in the present invention will be explained or defined. The term used in the present invention has the same meaning as that generally used in molecular biology, genetics or genetic engineering, microbiology or microbial engineering, etc., unless otherwise defined.
“One or more species”, “one or more species”, and “one or more species” mean at least one species.
“Target gene” means a gene intended for detection and measurement. The “gene contained in the sample” may be simply referred to as a target gene or a target gene.
「光学的キャラクター」なる用語は、核酸プローブを標識する蛍光物質、クエンチャー物質等の各種の吸収スペクトル、若しくは蛍光発光スペクトル、およびそれらの吸収強度、偏光、蛍光発光、蛍光強度、蛍光寿命、蛍光偏光、蛍光異方性等の光学的特性等のことをいう（「蛍光強度」、単に「蛍光」で総称する場合がある。）。また、核酸プローブ等に標識されている少なくとも１つの蛍光物質等について少なくとも１種以上の測定波長で測定された測定値を総合的に評価して得た性質のことをもいう。
また、一般的な場合は、「光学的キャラクター」なる用語を使用し、具体的な場合は、「蛍光強度」、単に「蛍光」なる用語を使用した。
The term "optical character" refers to various absorption spectra such as fluorescent substances and quencher substances that label nucleic acid probes, or fluorescence emission spectra, and their absorption intensity, polarization, fluorescence emission, fluorescence intensity, fluorescence lifetime, fluorescence It refers to optical properties such as polarization and fluorescence anisotropy (sometimes collectively referred to as “fluorescence intensity” or simply “fluorescence”). Further, it also refers to a property obtained by comprehensively evaluating measured values measured at least one kind of measurement wavelength for at least one fluorescent substance labeled on a nucleic acid probe or the like.
In addition, the term “optical character” was used in a general case, and the term “fluorescence intensity” or simply “fluorescence” was used in a specific case.
本発明において、「光学的キャラクターの変化量」、「蛍光強度変化量」、「蛍光変化量」なる用語は、本発明の増幅核酸に基づく蛍光強度の変化だけでなく、当該増幅核酸に、蛍光物質および／またはクエンチャーで標識された均一溶液系核酸プローブをハイブリダイズさせたときの、そのハイブリダイゼーション前後の蛍光強度の変化若しくは変化量をも含めるものとする。 In the present invention, the terms “amount of change in optical character”, “amount of change in fluorescence intensity”, and “amount of change in fluorescence” include not only the change in fluorescence intensity based on the amplified nucleic acid of the present invention, but also fluorescence in the amplified nucleic acid. It also includes changes or amounts of fluorescence intensity before and after hybridization when a homogeneous solution nucleic acid probe labeled with a substance and / or quencher is hybridized.
本発明において、例えば、核酸プローブが標的核酸に「相補し」、「相補する」および「相補的である」、また、「相補しない」および「相補的でない」などの用語を使用しているが、この場合の「相補」とは、２種のオリゴヌクレオチドが存在した場合、各オリゴヌクレオチドの対応する核酸塩基同士が水素結合できるという意味である。また、ハイブリダイズできるという意味である。 In the present invention, for example, the nucleic acid probe uses terms such as “complementary”, “complementary” and “complementary”, “non-complementary” and “non-complementary”. In this case, “complementary” means that when two kinds of oligonucleotides are present, the corresponding nucleobases of each oligonucleotide can hydrogen bond with each other. It also means that it can hybridize.
本発明において「光学的キャラクター変化率」とは、本発明で用いる核酸プローブ（標的核酸プローブ、内部標準核酸プローブ）および標的核酸および／または内部標準核酸とがハイブリダイズしていない状態の反応系若しくは測定系の蛍光色素等の光学的測定値に対する、それらがハイブリダイズしている状態のものの比である。一例として｛［ハイブリダイズしている状態の測定値］／［ハイブリダイズしていない状態の測定値］｝×１００なる計算式を挙げることができる。この場合、当該変化が蛍光で、消光の場合は「蛍光消光率」と、発光の場合「蛍光発光率」等と言う。ハイブリダイズしている状態は、反応若しくは測定温度が好適には１０℃以上９０℃乃至９４℃以下で出現し、ハイブリダイズしていない状態は、前記以上（９０℃乃至９４℃）で出現する。しかし、中間状態が存在するので、実験例毎に正確に測定しておくのが好適である。
なお、本発明の核酸プローブが本発明の蛍光色素で標識される部位のことを「蛍光色素標識部位」または「蛍光標識部位」ともいう。しかし、同じ意味である。
In the present invention, the “optical character change rate” means a reaction system in a state where the nucleic acid probe (target nucleic acid probe, internal standard nucleic acid probe) and target nucleic acid and / or internal standard nucleic acid used in the present invention are not hybridized. It is the ratio of those in a hybridized state to optical measurement values such as fluorescent dyes of the measurement system. As an example, {[measured value in a hybridized state] / [measured value in a non-hybridized state]} × 100 can be given. In this case, the change is fluorescence, and in the case of quenching, it is called “fluorescence quenching rate”, and in the case of light emission, it is called “fluorescence emission rate”. The hybridized state appears when the reaction or measurement temperature is preferably 10 ° C. or higher and 90 ° C. or lower and 94 ° C. or lower, and the non-hybridized state appears when the reaction or measurement temperature is higher (90 ° C. or higher than 94 ° C.). However, since an intermediate state exists, it is preferable to measure accurately for each experimental example.
The site where the nucleic acid probe of the present invention is labeled with the fluorescent dye of the present invention is also referred to as “fluorescent dye labeling site” or “fluorescent labeling site”. But it has the same meaning.
本発明でいう蛍光色素（蛍光物質という場合もある。）とは、一般に核酸プローブに標識して、核酸の測定・検出に用いられている蛍光物質の類である。例えば、フルオレセイン（fluorescein）またはその誘導体類｛例えば、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate）（FITC）若しくはその誘導体等｝、Alexa 488、Alexa 532、cy3、cy5、6−joe、EDANS、ローダミン（rhodamine）6G（R6G）またはその誘導体｛例えば、テトラメチルローダミン（tetramethylrhodamine）（TMR）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（tetramethylrhodamine isothiocyanate）（TMRITC）｝、x−ローダミン（x−rhodamine）、テキサスレッド（Texas red）、ボデピー（BODIPY）（登録商標）FL（商品名）（モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国；BODIPYについては以下同様である。）、BODIPY FL／C3、BODIPY FL／C4、BODIPY FL／C5、BODIPY FL／C6、BODIPY FL／C7、BODIPY FL／C8、BODIPY FL／C9、BODIPY FL／C10、BODIPY FL／C11、BODIPY FL／C12、BODIPY 5−FAM、BODIPY TMRまたはその誘導体（例えば、BODIPY TR）、BODIPY R6G、BODIPY 564、BODIPY 581、BODIPY 493／503、タムラー（TAMRA）等を挙げることができる。 The fluorescent dye (sometimes referred to as a fluorescent substance) in the present invention is a kind of fluorescent substance that is generally labeled on a nucleic acid probe and used for measurement / detection of nucleic acid. For example, fluorescein or derivatives thereof (eg, fluorescein isothiocyanate (FITC) or derivatives thereof), Alexa 488, Alexa 532, cy3, cy5, 6-joe, EDANS, rhodamine 6G (R6G) or derivatives thereof {eg, tetramethylrhodamine (TMR), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TMRITC)}, x-rhodamine, Texas red, bodepy (BODIPY) (registered trademark) FL (trade name) (Molecular Probes, USA; the same applies to BODIPY below), BODIPY FL / C3, BODIPY FL / C4, BODIPY FL / C5, BODIPY FL / C6, BODIPY FL / C7, BODIPY FL / C8, BODIPY FL / C9, BODIPY FL / C10, BODIPY FL / C11, BODIPY FL / C12, BODIPY 5-FAM, BO Examples thereof include DIPY TMR or a derivative thereof (for example, BODIPY TR), BODIPY R6G, BODIPY 564, BODIPY 581, BODIPY 493/503, Tamler (TAMRA), and the like.
上記の中でも、TAMRA、FITC、EDANS、テキサスレッド、6−joe、TMR、Alexa 488、Alexa 532、BODIPY FL／C3、BODIPY R6G、BODIPY FL、BODIPY FL／C6、BODIPY TMR、BODIPY 5−FAM、BODIPY 493／503、BODIPY 564、BODIPY 581、Cy3、Cy5、x−Rhodamine等を好適なものとして挙げることができる。 Among the above, TAMRA, FITC, EDANS, Texas Red, 6-joe, TMR, Alexa 488, Alexa 532, BODIPY FL / C3, BODIPY R6G, BODIPY FL, BODIPY FL / C6, BODIPY TMR, BODIPY 5-FAM, BODIPY Preferred examples include 493/503, BODIPY 564, BODIPY 581, Cy3, Cy5, x-Rhodamine and the like.
核酸増幅方法は、本発明の目的を達成できればどのような方法でもよい。
本発明でいう核酸増幅方法とは、インビトロ（in vitro）で核酸を増幅する方法のことをいう。公知、未公知を問わない。例えば、PCR方法、LCR方法（ligase chain reaction）、TAS方法、ICAN（Isothermal and Chimeric Primer−Initiated Amplification of Nucleic acids）方法、LAMP方法、NASRA方法、RCA方法、TAMA方法、UCAN方法等を全て含めるものとする。好適にはプライマープローブまたは単なるプローブを用いるPCR方法で行うのが好適である。
The nucleic acid amplification method may be any method as long as the object of the present invention can be achieved.
The nucleic acid amplification method referred to in the present invention refers to a method for amplifying a nucleic acid in vitro. It does not ask | require well-known and unknown. For example, PCR method, LCR method (ligase chain reaction), TAS method, ICAN (Isothermal and Chimeric Primer-Initiated Amplification of Nucleic acids) method, LAMP method, NASRA method, RCA method, TAMA method, UCAN method etc. And The PCR method using a primer probe or a simple probe is preferably used.
前記PCR方法はどのような形式のものでも好適に採用できる。例えば、定量的PCR方法、リアルタイムモニタリング定量的PCR方法、RT−PCR、RNA−primed PCR、Stretch PCR、逆PCR、Alu配列を利用したPCR、多重PCR、混合プライマープローブを用いたPCR、PNAを用いたPCR、PCRにより増幅した核酸について、融解曲線の解析若しくは分析する方法等をも含むものとする。 The PCR method can be suitably employed in any format. For example, quantitative PCR method, real-time monitoring quantitative PCR method, RT-PCR, RNA-primed PCR, Stretch PCR, reverse PCR, PCR using Alu sequence, multiplex PCR, PCR using mixed primer probe, PNA PCR, and a method for analyzing or analyzing a melting curve of a nucleic acid amplified by PCR.
「均一溶液系核酸プローブ」とは、「固相系核酸プローブ」の対の用語で、固相を含まない均一溶液で作用する核酸プローブである。また、このプローブを「均一溶液系プローブ」という場合もある。
「Ｑプローブ」、「QProbe」（J−Bio21（株）社製）とは、本発明者らにより開発された蛍光消光核酸プローブ（Quenching Probe）（以下、単に「QProbe」と呼ぶこともある。）（KURATA et al., Nucleic acids Research, 2001, vol.29, No.6 e34）である。このプローブは、１本鎖のオリゴヌクレオチドを蛍光色素で標識した均一溶液系核酸プローブであるが、蛍光色素で標識した部位の塩基がＧまたはＣであるか、またはプローブの標識塩基から、また対応核酸の標識塩基に対応する塩基から１乃至３塩基離れて（標識塩基に対応する塩基を１と数える。）ＧまたはＣが少なくとも１つ存在する均一溶液系核酸プローブである。
また、このQProbeは、遺伝子増幅用のプライマー（「Ｑプライマー」、「Qprimer」（J−Bio21（株）社製） 以下、これらを単に「QPrimer」と呼ぶこともある。）として用いることが可能である。
The term “homogeneous solution-based nucleic acid probe” is a term of a pair of “solid-phase nucleic acid probe” and is a nucleic acid probe that operates in a homogeneous solution not containing a solid phase. In addition, this probe may be referred to as a “homogeneous solution system probe”.
“Q probe” and “QProbe” (manufactured by J-Bio21 Co., Ltd.) may be referred to as a fluorescence quenching nucleic acid probe (Quenching Probe) (hereinafter simply referred to as “QProbe”) developed by the present inventors. (KURATA et al., Nucleic acids Research, 2001, vol. 29, No. 6 e34). This probe is a homogeneous solution type nucleic acid probe in which a single-stranded oligonucleotide is labeled with a fluorescent dye, but the base of the site labeled with the fluorescent dye is G or C, or from the labeled base of the probe. A homogeneous solution-type nucleic acid probe in which at least one G or C is present 1 to 3 bases away from the base corresponding to the labeled base of the nucleic acid (the base corresponding to the labeled base is counted as 1).
Further, this QProbe can be used as a primer for gene amplification (“Q primer”, “Qprimer” (manufactured by J-Bio21 Co., Ltd.); hereinafter, these may be simply referred to as “QPrimer”). It is.
蛍光色素のオリゴヌクレオチドの標識部位は、末端部、鎖中のどちらでも良い。標識位置は糖部位、リン酸部位、塩基部位どちらでもよい。糖部位においては、３’末端の３’または２’位ＣのＯＨ基、または５’末端を脱リンして得られる５’位ＣのＯＨ基である。リン酸部においては、リン酸に替えて、スルホン酸基、スルホニル基でもよい。好ましくは、５’または３’末端部位、より好ましくは５’または３’末端部、最良は５’または３’末端である。好適には、ＣまたはＧを含む部位か、それら自身である。最適には、Ｃを含む部位か、Ｃ自身である。 The labeling site of the fluorescent dye oligonucleotide may be either at the end or in the chain. The labeling position may be either a sugar moiety, a phosphate moiety or a base moiety. In the sugar site, it is an OH group at the 3 'or 2' position at the 3 'end, or an OH group at the 5' position obtained by dephosphorylation at the 5 'end. In the phosphoric acid part, a sulfonic acid group or a sulfonyl group may be used instead of phosphoric acid. Preferably, the 5 'or 3' end site, more preferably the 5 'or 3' end, and most preferably the 5 'or 3' end. Preferably, it is a site containing C or G or itself. Optimally, it is a part containing C or C itself.
遺伝子構成比の測定方法における工程３でいう「補正蛍光変化量」とは実施例に例示されているものである。
遺伝子構成比の測定方法における工程４でいう「標準遺伝子」とは、スタンダードとなり得る遺伝子という意味である。例えば、好適に使用できる遺伝子として、標的遺伝子を精製して得た遺伝子DNAを挙げることができる。
The “corrected fluorescence change amount” in step 3 in the method for measuring the gene composition ratio is exemplified in the examples.
The “standard gene” in
［本発明の原理］
本発明は、２種の遺伝子の構成比を測定する方法である。
２種の遺伝子のうち、一方の遺伝子を、均一溶液系プローブにて特異的に検出する。しかしながら、未知試料の場合、２種遺伝子のトータル数は、サンプルによって異なるため、例え遺伝子構成比が同じであっても、光学的キャラクター変化量は一致しない（図１参照）。よって、一方の遺伝子由来の光学的キャラクター変化量からは、遺伝子構成比を正確に測定することは実質的に不可能である。しかしながら、トータルの遺伝子量が一定であれば、均一溶液系プローブの光学的キャラクターの変化量は、検出する遺伝子の構成比が大きい場合、相対的に大きく、逆に小さい場合は、相対的に小さくなる。この場合、蛍光変化量は、遺伝子構成比と相関がある。この相関を検量線として利用することで、未知試料に含まれる２種の遺伝子間の構成比を求めることができると考えられる（図２参照）。
[Principle of the present invention]
The present invention is a method for measuring the composition ratio of two kinds of genes.
One of the two genes is specifically detected with a homogeneous solution probe. However, in the case of an unknown sample, since the total number of the two types of genes varies depending on the sample, even if the gene composition ratio is the same, the optical character change amounts do not match (see FIG. 1). Therefore, it is virtually impossible to accurately measure the gene composition ratio from the optical character change amount derived from one gene. However, if the total gene amount is constant, the amount of change in the optical character of the homogeneous solution probe is relatively large when the composition ratio of the gene to be detected is large, and conversely small when it is small. Become. In this case, the amount of change in fluorescence has a correlation with the gene composition ratio. By utilizing this correlation as a calibration curve, it is considered that the composition ratio between two genes contained in an unknown sample can be obtained (see FIG. 2).
例えば、PCRのような遺伝子増幅法を用いて、２つの遺伝子を、同じプライマーにて同時に増幅し、その遺伝子構成比を求める場合、トータルの増幅産物を、産物量に応じて変化するシグナルに変換し、そのシグナルをリアルタイムにモニタリングすることができれば、トータルの産物量が一定となるサイクル数を特定化することができる。トータルの遺伝子量が同じである場合、前述したように一方の遺伝子を検出する均一溶液系プローブ由来の蛍光変化量から、遺伝子構成比を求めることが可能であると考えられる。 For example, when a gene amplification method such as PCR is used to simultaneously amplify two genes with the same primer and determine the gene composition ratio, the total amplification product is converted into a signal that changes according to the amount of product. If the signal can be monitored in real time, the number of cycles in which the total product amount is constant can be specified. When the total gene amount is the same, it is considered that the gene composition ratio can be obtained from the fluorescence change amount derived from the homogeneous solution-based probe that detects one gene as described above.
本発明は、２種の均一溶液系プローブを用いて、トータルの遺伝子を測定し、その量がある値に達した際に、一方の遺伝子由来のシグナルを測定することによって、標的とする２種の遺伝子の構成比を求める新規の遺伝子構成比測定方法である。 The present invention measures the total genes using two kinds of homogeneous solution-based probes, and when the amount reaches a certain value, the signal derived from one gene is measured to thereby obtain two kinds of targets. This is a novel gene composition ratio measurement method for determining the gene composition ratio.
以下に、より具体的に本発明を説明する。
本発明は、測定系の２種類の遺伝子を、蛍光色素で標識された１種または２種以上の均一溶液系核酸プローブを用いて増幅させ、測定系の光学的キャラクター変化量を測定し、当該変化量に基づいて、遺伝子構成比を測定する定量的PCR方法において、以下の工程（１）〜（５）を含むことを特徴とする遺伝子構成比の測定方法である。以下、工程別に説明する。
工程１は、２種類の遺伝子のどちらか一方に相補し、蛍光色素で標識された１種または２種以上の均一溶液系核酸プローブを当該相補する遺伝子にハイブリダイズさせ、当該遺伝子を増幅させ、増幅過程中に発生するその光学的キャラクター変化量を測定し、得た当該変化量に基づいて遺伝子の増幅過程をモニタリングする工程である。
蛍光色素で標識された１種または２種以上の均一溶液系核酸プローブとしては、プライマーとして使用できるものでもよく、単に核酸プローブとして使用できるものでもよい。遺伝子の増幅過程をモニタリングできるものであればよい。このモニタリングで２種の遺伝子の一方（均一溶液系核酸プローブと相補した遺伝子）の量に対応した光学的キャラクター変化量が測定できる。
Hereinafter, the present invention will be described more specifically.
The present invention amplifies two types of genes of the measurement system using one or more homogeneous solution nucleic acid probes labeled with a fluorescent dye, measures the optical character change amount of the measurement system, In the quantitative PCR method for measuring gene composition ratio based on the amount of change, the method comprises the following steps (1) to (5). Hereinafter, it demonstrates according to a process.
One or two or more homogeneous solution nucleic acid probes labeled with a fluorescent dye may be used as primers or may be used as simple nucleic acid probes. Any device capable of monitoring the gene amplification process may be used. With this monitoring, it is possible to measure the amount of optical character change corresponding to the amount of one of the two genes (the gene complementary to the homogeneous solution nucleic acid probe).
核酸プローブの蛍光色素としては、本発明の目的を達成できるものであればよく、前述したような蛍光色素が好ましく用いられる。
また、核酸プローブとしては、蛍光消光核酸プローブ、蛍光消光核酸プライマーを用いることが好ましく、具体的には、QProbe、QPrimer（J−Bio21（株）社製）が好適に用いられる。
核酸を増幅する方法は、前記した何れでもよいのであるが、好適にはPCR方法である。
The fluorescent dye of the nucleic acid probe is not particularly limited as long as the object of the present invention can be achieved, and the fluorescent dye as described above is preferably used.
Further, as the nucleic acid probe, a fluorescence-quenched nucleic acid probe or a fluorescence-quenched nucleic acid primer is preferably used, and specifically, QProbe and QPrimer (manufactured by J-Bio21) are preferably used.
The method for amplifying the nucleic acid may be any of those described above, but the PCR method is preferred.
工程２は、２種類の遺伝子に同時に相補し、蛍光色素で標識され、前記工程１のものとは異なった１種または２種以上の均一溶液系核酸プローブを、２種類の遺伝子にハイブリダイズさせ、当該２種の遺伝子を増幅させ、遺伝子増幅中に発生する光学的キャラクター変化量を測定し、得た当該変化量に基づいて、当該２種類の遺伝子の増幅過程をモニタリングする工程である。
この工程は、２種の遺伝子のトータル量に対応した光学的キャラクター変化量を測定するための工程である。
工程２で使用する均一溶液系核酸プローブは、プライマーでも、単に核酸プローブでもよく、単に２種の遺伝子に相補できるものであればよい。
核酸プローブとしては、蛍光消光核酸プローブ、蛍光消光核酸プライマーを用いることが好ましく、具体的には、QProbe、QPrimer（J−Bio21（株）社製）が好適に用いられる。
In step 2, two or more homogeneous solution nucleic acid probes that are complementary to two types of genes simultaneously and labeled with a fluorescent dye and differ from those in
This step is a step for measuring the optical character change amount corresponding to the total amount of the two types of genes.
The homogeneous solution nucleic acid probe used in step 2 may be a primer or simply a nucleic acid probe, as long as it can simply complement two types of genes.
As the nucleic acid probe, it is preferable to use a fluorescence-quenched nucleic acid probe or a fluorescence-quenched nucleic acid primer. Specifically, QProbe and QPrimer (manufactured by J-Bio21) are preferably used.
工程３は、前記工程２の光学的キャラクター変化量が、一定値に達したときの前記工程（１）の光学的キャラクター変化量を測定する工程である。この変化量を「補正蛍光変化量」と呼ぶこともある。
この工程で、２種の遺伝子のトータル量に対応した正確な光学的キャラクター変化量が測定される。
具体的には実施例に詳しく記載されている。
Step 3 is a step of measuring the optical character change amount of the step (1) when the optical character change amount of the step 2 reaches a certain value. This amount of change may be referred to as “corrected fluorescence change amount”.
In this step, an accurate optical character change amount corresponding to the total amount of the two genes is measured.
Specifically, it is described in detail in Examples.
工程４は、２種類の標準遺伝子を種々な構成比で含む複数の試料について、工程１〜３を実施し、各標準試料における補正蛍光変化量を測定し、当該測定値と遺伝子構成比との関係式を求める工程である。
具体的には実施例に詳しく記載されている。
Specifically, it is described in detail in Examples.
工程５は、未知試料について工程１〜３を実施し、各未知試料における補正蛍光変化量を測定し、当該測定値と、工程４で得られた関係式より、未知試料における遺伝子構成比を測定する工程である。
この工程で、実施の試料についての遺伝子構成比が測定される。
上記各工程は、上記の順に行わなくともよい。適当に組み合わせて一緒に行ってもよい。
In this step, the gene composition ratio for the sample to be implemented is measured.
The above steps may not be performed in the order described above. Appropriate combinations may be performed together.
また、本発明は、２種類の遺伝子を標的遺伝子および内部標準遺伝子として、内部標準遺伝子を未知試料に既知量添加して得た試料について、（ａ）前述の工程１〜５を実施して、標的核酸と内部標準遺伝子との構成比を測定する工程、および（ｂ）当該構成比と内部標準遺伝子の添加量から標的遺伝子量を測定する工程を実施して、未知試料中の標的遺伝子量を測定することを特徴とする標的遺伝子量測定方法である。
すなわち、前述した遺伝子構成比測定方法を使用するならば、標的遺伝子の絶対量を測定（定量）することができる。すなわち、前記の２種遺伝子のうち、一方を内部標準遺伝子とし、他方を標的遺伝子として、標的遺伝子が含まれているか或いは含まれていない未知試料に内部標準遺伝子を、既知濃度宛を測定系に添加し、前記の遺伝子構成比測定方法の工程を実施する。結果として、標的遺伝子と内部標準遺伝子の構成比が測定される（工程ａ）。内部標準遺伝子が既知量であるので、標的遺伝子の絶対量を測定できることになる（工程ｂ）。
In addition, the present invention uses (a) the above-described
That is, if the gene composition ratio measuring method described above is used, the absolute amount of the target gene can be measured (quantified). That is, one of the two types of genes is an internal standard gene, the other is a target gene, the internal standard gene is used for an unknown sample that contains or does not contain the target gene, and the measurement system is used for a known concentration. And the steps of the gene composition ratio measuring method are carried out. As a result, the constituent ratio between the target gene and the internal standard gene is measured (step a). Since the internal standard gene is a known amount, the absolute amount of the target gene can be measured (step b).
さらに、本発明は、以下の工程１）〜２）を含むことを特徴とするゲノムDNAのゲノムサイズを測定する方法である。
１）既知のゲノムサイズおよびゲノムコピーを有するDNAゲノム（Ａ）および既知のゲノムコピー数を有し、未知ゲノムサイズの標的DNAゲノム（Ｂ）の混合液を用いて、前記の遺伝子構成比測定方法により、遺伝子構成比を測定する工程。
２）Ａのゲノムサイズと、工程１）で得られた遺伝子構成比とから、Ｂのゲノムサイズを測定する工程。
Furthermore, this invention is the method of measuring the genome size of the genomic DNA characterized by including the following processes 1) -2).
1) The above gene composition ratio measurement method using a mixture of a DNA genome (A) having a known genome size and genome copy and a target DNA genome (B) having a known genome copy number and an unknown genome size The step of measuring the gene composition ratio.
2) A step of measuring the genome size of B from the genome size of A and the gene composition ratio obtained in step 1).
以下に本発明を実施例をもってより具体的に説明する。
なお、本実施例において、使用した蛍光色素で標識された均一溶液系プローブ類は、全てJ−Bio21株式会社製（つくば市）のものである。
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
In this example, the homogeneous solution type probes labeled with the fluorescent dye used are all manufactured by J-Bio21 (Tsukuba City).
＜実施例１＞
蔵田らによって開発された蛍光消光するプローブ（QProbe）は、遺伝子増幅用のプライマー（QPrimer）として、用いることが可能であり、このQPrimerを用いてPCRを実施し、その蛍光変化量から、増幅産物量をリアルタイムに定量することが可能であることが報告されている（Shinya Kurata, Takahiro Kanagawa, Yukio Magariyama, Kyoko Takatsu, Kazutaka Yamada, Toyokazu Yokomaku, and Yoichi Kamagata, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Dec. 2004, p.7545−7549）。よって、このQPrimerを用いることにより、その蛍光変化量から、産物量がある一定量に達するサイクル数を特定化することができる。このサイクルにおいて、QPrimerとは異なる蛍光色素でラベルされた均一溶液系プローブを用い、一方の遺伝子由来の蛍光変化量を求めることにより、遺伝子の構成比を定量することが可能であると考えられた（図３）。以下、その実施例について記す。
<Example 1>
The fluorescence quenching probe (QProbe) developed by Kurata et al. Can be used as a primer for gene amplification (QPrimer). PCR is performed using this QPrimer, and the amplification change product is determined from the amount of fluorescence change. It is reported that the amount can be quantified in real time (Shinya Kurata, Takahiro Kanagawa, Yukio Magariyama, Kyoko Takatsu, Kazutaka Yamada, Toyokazu Yokomaku, and Yoichi Kamagata, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Dec. 2004, p. .7545-7549). Therefore, by using this QPrimer, it is possible to specify the number of cycles in which the product amount reaches a certain amount from the amount of change in fluorescence. In this cycle, it was thought that the composition ratio of genes could be quantified by using a homogeneous solution system probe labeled with a fluorescent dye different from QPrimer and determining the amount of fluorescence change from one gene. (Figure 3). Hereinafter, the examples will be described.
１．実験方法
ａ．鋳型の調整
Escherichia coli（以下、E.coliという。） K12株とMicrolunatus phosphovorus（以下、M.phosphovorusという。） NM−1株のゲノムDNAを、Genomic−tip（キアゲン社製、Hilden、Germany）を用いて抽出した。これを鋳型として、16S rRNA遺伝子（16S rDNA）を、PCR法にて増幅した。プライマーは、ｐＡおよびｐＨを使用した。得られた増幅産物は、GFX spin−column（アマシャムバイオサイエンス社製、Piscataway、NJ、USA）を用いて精製し、精製された産物は、Pico Green dsDNA定量キット（モルキュラープローブ社製、Eugene、OR、USA）を用いて定量した。産物濃度を、１０9コピー／μＬに調整した後、これを用いて１０2コピー／μＬまでの１０倍毎の連続希釈系列を調整した。これら希釈系列を用いて、各希釈段階にて、M.phosphovorus NM−1株由来の増幅産物が、５０％、２５％、１２．５％、６．２５％、３．１２５％の割合で含まれる16S rDNA増幅産物混合液を作成した。
1. Experimental method a. Mold adjustment
Escherichia coli (hereinafter referred to as E.coli ) K12 strain and Microlunatus phosphovorus (hereinafter referred to as M. phosphovorus ) NM-1 genomic DNA was extracted using Genomic-tip (Qiagen, Hilden, Germany) did. Using this as a template, 16S rRNA gene (16S rDNA) was amplified by PCR. Primers used were pA and pH. The obtained amplification product was purified using GFX spin-column (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA), and the purified product was Pico Green dsDNA quantification kit (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). After adjusting the product concentration to 10 9 copies / μL, this was used to adjust serial dilution series every 10-fold up to 10 2 copies / μL. Using these dilution series, amplification products derived from the M. phosphovorus NM-1 strain are contained at a ratio of 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125% at each dilution stage. A 16S rDNA amplification product mixture was prepared.
ｂ．プローブおよびプライマー
本実施例において、均一溶液系プローブ、プライマーは以下のものを用いた。
51−70F：５’−ＡＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＧＴ−３’
380−360R：５’−ＣＧＣＣＣＡＴＴＧＴＧＣＡＡＴＡＴＴＣＣＣ−３’
380−360R−5T：５’−ＣＧＣＣＣＡＴＴＧＴＧＣＡＡＴＡＴＴＣＣＣ−３’
MP197−178R：５’−ＡＴＧＴＣＧＧＣＣＧＡＧＧＴＣＧＴＡＴＣ−３’
b. Probe and Primer In this example, the following homogeneous solution system probe and primer were used.
51-70F: 5'-ACACATGCCAAGTCGAACGGGT-3 '
380-360R: 5'-CGCCCATGTGCCAATTTCCC-3 '
380-360R-5T: 5′-CGCCCATTGTGCAAATTTCCC-3 ′
MP197-178R: 5'-ATGTCGGCCGAGGTCGTATC-3 '
51−70Fおよび380−360Rは、つくばオリゴサービス社（つくば市）より購入した。
51−70F（フォワードプライマー）、および380−360R（リバースプライマー）は、E.coliおよびM.phosphovorusの両方の16S rDNAを増幅できるよう設計した。
380−360R−5TはQPrimer−R5’（J−Bio21社製）であり、配列は380−360Rと同様で、５’末端はグアニンとの相互作用によって、蛍光消光する性質を有する蛍光色素にて標識されている。
MP197−178RはQProbe−G3’（J−Bio21社製）であり、M.phosphovorusに特異的なプローブであり、その３’末端は、上記の380−360R−5Tと蛍光波長の異なる蛍光消光性の色素で標識されている。
51-70F and 380-360R were purchased from Tsukuba Oligo Service (Tsukuba City).
51-70F (forward primer) and 380-360R (reverse primer) were designed to amplify both E. coli and M. phosphovorus 16S rDNA.
380-360R-5T is QPrimer-R5 ′ (manufactured by J-Bio21), the sequence is the same as 380-360R, and the 5 ′ end is a fluorescent dye that has the property of quenching fluorescence by interaction with guanine. It is labeled.
MP197-178R is QProbe-G3 ′ (manufactured by J-Bio21), which is a probe specific to M. phosphovorus , and its 3 ′ end has a fluorescence quenching property different from that of 380-360R-5T described above. Labeled with a dye.
ｃ．本発明：PD−PCR方法
PCR過程の蛍光モニタリングには、リアルタイムPCR装置であるLight CyclerTM（ロッシュ社製、Mannheim、Germany）を用いた。反応溶液の組成等を以下の表１に示す。
c. The present invention: PD-PCR method
For the fluorescence monitoring of the PCR process, Light Cycler ™ (manufactured by Roche, Mannheim, Germany), which is a real-time PCR apparatus, was used. The composition of the reaction solution is shown in Table 1 below.
PCR反応条件を以下の表２に示す。QProbeおよびQPrimerの蛍光は、アニーリングおよび解離の最後に、毎サイクル測定した。これら蛍光値から、Kurataらの報告（Nucleic Acids Research, 2001, Vol.29, No.6 e34）に従い、蛍光消光率を計算した。 PCR reaction conditions are shown in Table 2 below. QProbe and QPrimer fluorescence was measured every cycle at the end of annealing and dissociation. From these fluorescence values, the fluorescence quenching rate was calculated according to the report of Kurata et al. (Nucleic Acids Research, 2001, Vol. 29, No. 6 e34).
１）工程１：蛍光色素で標識された均一溶液系プローブとしてMP197−178R（QProbe−G3’）を用いてPCR反応を行った。すなわち、M.phosphovorusの16S rDNAの増幅をモニタリングした。反応条件等は前記に示した通りである。
２）工程２：蛍光色素で標識された均一溶液系プローブは、フォワードプライマーとして51−70F、リバースプライマーとして380−360R−5T（QPrimer−R5’）を使用した。これらのプライマーは、E.coliおよびM.phosphovorusの両方の16S rDNAを増幅できるよう設計した。反応条件等は前記に示した通りである。
３）工程３、４および５：具体的には、下記の「結果と考察」に示した。なお、工程４における標準試料として、M.phosphovorus由来の16S rDNAを用いた。
1) Step 1: PCR reaction was carried out using MP197-178R (QProbe-G3 ′) as a homogeneous solution probe labeled with a fluorescent dye. That is, amplification of 16S rDNA of M. phosphovorus was monitored. The reaction conditions and the like are as described above.
2) Step 2: 51-70F as a forward primer and 380-360R-5T (QPrimer-R5 ′) as a reverse primer were used as the homogeneous solution system probe labeled with a fluorescent dye. These primers were designed to amplify both E. coli and M. phosphovorus 16S rDNA. The reaction conditions and the like are as described above.
3) Steps 3, 4 and 5: Specifically, the results are shown in “Results and Discussion” below. In addition, 16S rDNA derived from M. phosphovorus was used as a standard sample in
＜QPrimer−PCRおよびQProbe−PCR＞
PD−PCRの比較対照として、QPrimerおよびQProbeを用いてリアルタイムPCR法を実施し、２種遺伝子間の構成比を求めた。トータルの16S rDNAは、QPrimer−R5’（380−360R−5T）を用いたリアルタイムPCR法（QPrimer−PCR法）にて実施した。QPrimer−PCR法の反応条件等は、QProbe−G3’を添加していないこと以外、PD−PCRと同様である。２種鋳型を含む溶液中のM.phosphovorusの16S rDNA量は、QProbe−G3’（MP197−178R）を用いたリアルタイムPCR法（QProbe−PCR法）にて測定した。QProbe−PCR法の反応条件等は、リバースプライマーとしてQPrimer−R5’ではなく、非標識の380−360Rを用いたこと以外、PD−PCRと同様である。検量線作成の際は、標準サンプルとして、M.phosphovorusの16S rDNAを、反応チューブ（反応容量：２０μＬ）あたり、４×１０5、４×１０6、４×１０7コピー添加した。QPrimer−PCRおよびQProbe−PCRによる定量は、谷らによって報告されたＣｔ（cycle of threshold）値をベースとした計算法（Journal of Agricultural and Food chemistry, 2005, Vol.53, No.7 p2535−2540）にて行った。
M.phosphovorus 16S rDNAの構成率（％）は、以下の計算式（１）により実施した。
M.phosphovorus 16S rDNA（％）＝［Ｎ1／Ｎ2］×１００ （１）
ここで、Ｎ1およびＮ2は、各々、M.phosphovorus 16S rDNAと、トータルの16S rDNAを表す。
<QPrimer-PCR and QProbe-PCR>
As a comparative control for PD-PCR, real-time PCR was performed using QPrimer and QProbe to determine the composition ratio between the two genes. Total 16S rDNA was performed by real-time PCR method (QPrimer-PCR method) using QPrimer-R5 ′ (380-360R-5T). The reaction conditions for the QPrimer-PCR method are the same as for PD-PCR, except that QProbe-G3 ′ is not added. The amount of 16S rDNA of M. phosphovorus in the solution containing the two types of templates was measured by a real-time PCR method (QProbe-PCR method) using QProbe-G3 ′ (MP197-178R). The reaction conditions and the like of the QProbe-PCR method are the same as those of PD-PCR except that non-labeled 380-360R is used as a reverse primer instead of QPrimer-R5 ′. When preparing a calibration curve, 4 × 10 5 , 4 × 10 6 , and 4 × 10 7 copies of 16S rDNA of M. phosphovorus were added as a standard sample per reaction tube (reaction volume: 20 μL). Quantification by QPrimer-PCR and QProbe-PCR is performed by a calculation method based on the Ct (cycle of threshold) value reported by Tani et al. (Journal of Agricultural and Food chemistry, 2005, Vol. 53, No. 7 p2535-2540 )
The composition ratio (%) of M. phosphovorus 16S rDNA was determined by the following calculation formula (1).
M.phosphovorus 16S rDNA (%) = [N 1 / N 2 ] × 100 (1)
Here, N 1 and N 2 represent M. phosphovorus 16S rDNA and total 16S rDNA, respectively.
２．結果と考察
ａ． 検量線作成
図４は、PD−PCRにおける各サイクルの蛍光消光率の変化（光学的キャラクターの変化量）を示す。図４のａは、工程２のものであり、図４のｂは、工程１および工程４のものである。
蛍光波長：６４０ｎｍで測定したQPrimer−R5’（QPrimer）の蛍光消光率（ＲRn）の変化を図４のａに、５３０ｎｍで測定したQProbe−G3’（QProbe）の蛍光消光率（ＲGn）の変化を図４のｂに、それぞれ示した。QPrimerの蛍光消光率の推移は、トータルの鋳型量（４×１０5（●）、４×１０6（△）または４×１０7（■））に依らず、ほぼ同じであった。トータルの16S rDNA遺伝子は、２種遺伝子間の構成比に関わらず、同じように増幅したと考えられた（図４のａ）。一方、QProbeの蛍光推移は、M.phosphovorus由来の16S rDNA遺伝子の構成比およびトータル遺伝子量によって異なった（図４のａ）。
2. Results and Discussion a. Calibration Curve Creation FIG. 4 shows changes in the fluorescence quenching rate (changes in optical character) of each cycle in PD-PCR. FIG. 4 a shows the process 2, and FIG. 4 b shows the
Fluorescence wavelength: The change in the fluorescence quenching rate (R Rn ) of QPrimer-R5 ′ (QPrimer) measured at 640 nm is shown in FIG. 4A, and the fluorescence quenching rate (R Gn ) of QProbe-G3 ′ (QProbe) measured at 530 nm. These changes are shown in FIG. The transition of the fluorescence quenching rate of QPrimer was almost the same regardless of the total template amount (4 × 10 5 (●), 4 × 10 6 (Δ) or 4 × 10 7 (■)). It was considered that the total 16S rDNA gene was amplified in the same manner regardless of the composition ratio between the two genes (a in FIG. 4). On the other hand, the fluorescence transition of QProbe varied depending on the composition ratio and total gene amount of 16S rDNA gene derived from M. phosphovorus (FIG. 4a ).
以下、工程３を記す。
図５で、各サイクルにおける消光率を比較した。同じＲRn値（QPrimerの消光率）で比較した時、M.phosphovorus由来の16S rDNA遺伝子の存在比が高い場合、高いＲGn値（QProbeの消光率）が測定された。ＲRn値に一定のスレショールドラインを設定し（以下、ＲRT（％）とする。）、そのスレショールド値に達するＲGn値（以下、ＲGTとする。）を以下の計算式（２）より求めた。
Hereinafter, step 3 will be described.
In FIG. 5, the extinction rates in each cycle were compared. When compared with the same R Rn value (extinction rate QPrimer), if the abundance ratio of the 16S rDNA gene from M.phosphovorus high, high R Gn value (extinction ratio of QProbe) was measured. A certain threshold line is set for the R Rn value (hereinafter referred to as R RT (%)), and the R Gn value (hereinafter referred to as R GT ) reaching the threshold value is calculated by the following formula ( Obtained from 2).
RGT＝RRT×(RGA−RGB)／(RRA−RRB)＋(RRA×RGB−RRB×RGA)／(RRA−RRB) （２）
ここでＲGBとＲGAはＲGn値、ＲRBとＲRAはＲRn値であり、ＲGBとＲRBはスレショールド値に達する直前のサイクルにおける値であり、ＲGAとＲRAはスレショールド値に達した直後のサイクルにおける値である。
ＲGTが工程３でいう補正蛍光変化量である。
R GT = R RT × (R GA −R GB ) / (R RA −R RB ) + (R RA × R GB −R RB × R GA ) / (R RA −R RB ) (2)
Here, R GB and R GA are R Gn values, R RB and R RA are R Rn values, R GB and R RB are values in the cycle immediately before reaching the threshold value, and R GA and R RA are It is the value in the cycle immediately after the threshold value is reached.
R GT is the corrected fluorescence change amount referred to in step 3.
以下、工程４を記す。
各PD−PCR反応におけるＲRT値が１２．５％時におけるＲGT値を、M.phosphovorusの16S rDNA遺伝子構成率に対して、プロットした（図６ａ−ｃ）。ＲGT値の回帰曲線は、トータル遺伝子量（４×１０5（図６ａ）、４×１０6（図６ｂ）、４×１０7（図６ｃ））に関わらず、ＲGT値はlog［M.phosphovorus％］に対して直線となった。３つの回帰曲線（図６ａ−ｃ）は、ほとんど同一であったことから、図６ｄで示した同一の回帰曲線で表すことができると想定した。この回帰曲線が示す関係式は以下のように表すことができ、この関係式（３）は、トータル遺伝子量が４×１０4から４×１０9コピーの範囲で満足することが確認された。
Hereinafter,
The R GT value when the R RT value in each PD-PCR reaction was 12.5% was plotted against the composition ratio of 16S rDNA gene of M. phosphovorus (FIGS. 6a-c). Regression curve of R GT value, regardless of the total amount of genes (4 × 10 5 (Fig. 6a), 4 × 10 6 (Fig. 6b), 4 × 10 7 (FIG. 6c)), R GT value log [M .phosphovorus %]. Since the three regression curves (FIGS. 6a-c) were almost identical, it was assumed that they could be represented by the same regression curve shown in FIG. 6d. The relational expression indicated by this regression curve can be expressed as follows, and it was confirmed that this relational expression (3) is satisfied when the total gene dosage is in the range of 4 × 10 4 to 4 × 10 9 copies.
M.phosphovorus％＝0.7396×e0.1829×RGT （３）
当該関係式（３）が工程４の関係式である。
トータル遺伝子量が４×１０3、４×１０2コピーで、M.phosphovorusの16S rDNA遺伝子の絶対量が少ない時（トータル遺伝子量が２０００コピーの時１２５コピー、トータル遺伝子量が２００コピーの時１２．５コピー）は、この関係式（３）に当てはまらなかった。よって、今回実施したPD−PCRのモデル系においてはトータル遺伝子量が４×１０4〜４×１０9コピー、大腸菌に対して、M.phosphovorus 16S rDNA遺伝子が３．１２５％〜５０％の構成率において、同一の検量線を用いて定量可能であると考えられる（図６ｄ）。
M.phosphovorus ＝ 0.7396 × e 0.1829 × RGT (3)
The relational expression (3) is the relational expression of
When the total gene amount is 4 × 10 3 and 4 × 10 2 copies and the absolute amount of 16S rDNA gene of M. phosphovorus is small (125 copies when the total gene amount is 2000 copies, 12 when the total gene amount is 200 copies) .5 copies) did not apply to this relation (3). Therefore, in the model system of PD-PCR performed this time, the total gene amount is 4 × 10 4 to 4 × 10 9 copies, and the M.phosphovorus 16S rDNA gene is 3.125% to 50% of the E. coli. In Fig. 6d, it can be quantified using the same calibration curve (Fig. 6d).
ｂ． PD−PCRおよびＣｔ値をベースとしたリアルタイムPCR法による構成比測定結果の比較
PD−PCRおよびＣｔ値をベースとした一般的なリアルタイムPCR法による構成比測定の結果を、図７に示す。Ｃｔ値をベースとした測定では、幾つかのサンプルにおいて（トータル遺伝子量が４×１０6コピーで、M.phosphovorusの16S rDNA遺伝子構成率が３．１２５％から６．２５％の場合と、トータル遺伝子量が４×１０5コピーである全てのサンプル）、測定結果が示されていないが、それはM.phosphovorusの16S rDNA遺伝子の測定が、測定範囲より低かったためである。M.phosphovorusの構成率が５０％の場合、どちらの方法でも、１．１％から８．０％のエラー率で、正確に推定することができた。しかしながら、M.phosphovorusの構成率が低い場合、M.phosphovorusの構成率は、実際よりも高く見積もられてしまった（図７中のクロカラム、グレーカラム）。PD−PCRの場合、標準偏差（％）は１．１〜２０．１％（平均：９．８％）であったが、Ｃｔ値をベースとしたリアルタイムPCR法の場合、７．５〜５５．０％（平均：９．８％）であった。谷らは、QProbe／QPrimer−PCR法の正確性が、ＴａｑＭａｎ法と同等であることを確認している（Journal of Agricultural and Food chemistry, 2005, Vol.53, No.7 p2535−2540）。以上より、遺伝子構成比を求める場合、PD−PCRは、QProbe／QPrimer−PCRやＴａｑＭａｎ法などＣｔ値をベースとしたリアルタイムPCR法よりも、正確であることが示された。
b. Comparison of composition ratio measurement results by real-time PCR based on PD-PCR and Ct values
FIG. 7 shows the results of composition ratio measurement by a general real-time PCR method based on PD-PCR and Ct values. In the measurement based on the Ct value, in some samples (total gene amount is 4 × 10 6 copies and M.phosphovorus 16S rDNA gene composition ratio is 3.125% to 6.25%, total All samples having a gene dosage of 4 × 10 5 copies), the measurement results are not shown, because the measurement of the 16S rDNA gene of M. phosphovorus was lower than the measurement range. When the composition rate of M. phosphovorus was 50%, it was possible to accurately estimate the error rate from 1.1% to 8.0% by either method. However, when the composition ratio of M. phosphovorus was low, the composition ratio of M. phosphovorus was estimated to be higher than the actual one (chromocolumn, gray column in FIG. 7). In the case of PD-PCR, the standard deviation (%) was 1.1 to 20.1% (average: 9.8%), but in the case of the real-time PCR method based on the Ct value, 7.5 to 55 0.0% (average: 9.8%). Tani et al. Have confirmed that the accuracy of the QProbe / QPrimer-PCR method is equivalent to that of the TaqMan method (Journal of Agricultural and Food chemistry, 2005, Vol. 53, No. 7 p2535-2540). From the above, it was shown that PD-PCR is more accurate than real-time PCR methods based on Ct values such as QProbe / QPrimer-PCR and TaqMan method when determining the gene composition ratio.
ｃ． PD−PCRの応用
本方法の応用として、M.phosphovorusのゲノムサイズをPD−PCRにより定量した。E.coli K12株は、16S rDNAがゲノム中に７コピー存在し、ゲノムサイズも４．６４Ｍｂｐであることが分かっている。本発明者らは、M.phosphovorus NM1株の16S rDNA遺伝子のゲノムあたりのコピー数が、１コピーであることを明らかにしたが、そのゲノムサイズはまだ明らかとなっていなかった。ゲノムあたりの16S rDNA遺伝子のコピー数をベースとして、Ｃｔ値をベースとしたリアルタイムPCR法により16S rDNA遺伝子のコピー数を見積もることや、PD−PCRにより、ゲノムサイズが既知の生物をリファレンスとして、16S rDNA遺伝子のコピーの構成率を見積もることによって、ゲノムサイズが未知の生物についても、そのゲノムサイズを見積もることが可能であると考えられる。
c. Application of PD-PCR As an application of this method, the genome size of M. phosphovorus was quantified by PD-PCR. The E. coli K12 strain is known to have 7 copies of 16S rDNA in the genome and a genome size of 4.64 Mbp. The present inventors have clarified that the number of copies per genome of the 16S rDNA gene of the M. phosphovorus NM1 strain is 1 copy, but the genome size has not yet been clarified. Based on the copy number of 16S rDNA gene per genome, 16S rDNA gene copy number can be estimated by real-time PCR method based on Ct value, or by using PD-PCR, It is considered possible to estimate the genome size of an organism whose genome size is unknown by estimating the composition ratio of rDNA gene copies.
表３−２は、QPrimer−PCRにより16S rDNA遺伝子のコピー数を測定することによって推定したE.coliとM.phosphovorusのゲノムサイズを示している。この方法により、E.coliゲノムサイズは、４００ｐｇ DNAを鋳型とした時は２．３Ｍｂｐ、４ｎｇ DNAを鋳型とした時は３．６Ｍｂｐと推定された。これは、E.coliの実際のゲノムサイズが、４．６４Ｍｂｐであるので、低く見積もられたこととなる。これは、E.coliの16S rDNA遺伝子のコピー数が高く定量されたためである。M.phosphovorusのゲノムサイズは、４００ｐｇ DNAを鋳型とした時は１１．０Ｍｂｐ、４ｎｇ DNAを鋳型とした時は１４．８Ｍｂｐと推定されたが、他のActinobacteriaがそのような大きなゲノムサイズを有していないこと（Bifidobacterium longum：２．２６Ｍｂｐ、Corynebacterium diphtheriae：２．４９Ｍｂｐ、C.efficiens：３．１５Ｍｂｐ、C.glutamicum：３．２８Ｍｂｐもしくは３．３１Ｍｂｐ、Corynebacterium jeikeium：２．４６Ｍｂｐ、Leifsonia xyli：２．５８Ｍｂｐ、Mycobacterium bovis：４．３５Ｍｂｐ、Mycobacterium leprae：３．２７Ｍｂｐ、M.tuberculosis：４．４１Ｍｂｐ、Nocardia farcinica：６．０２Ｍｂｐ、Propionibacterium acnes：２．５６Ｍｂｐ、Streptomyces avermitilis：９．０３Ｍｂｐ、S.coelicolor：８．６７Ｍｂｐ、Symbiobacterium thermophilum：３．５７ＭｂｐまたはTropheryma whipplei：０．９２６〜０．９２７Ｍｂｐ）から、この推定値はおそらく正確ではないと考えられる。よって、この場合、M.phosphovorusのゲノムサイズは過大に評価されたと推察された。この問題に加えて、QPrimer−PCRの場合、初期添加した鋳型量によって、16S rDNA遺伝子数の定量値が変化した（表３−１、３−２）。以上より、Ｃｔ値をベースとしたリアルタイムPCR法により16S rDNAを定量する手法は、ゲノムサイズを推定する手法として適さないことが明らかとなった。 Table 3-2 shows the genome sizes of E. coli and M. phosphovorus estimated by measuring the copy number of 16S rDNA gene by QPrimer-PCR. By this method, the E. coli genome size was estimated to be 2.3 Mbp when using 400 pg DNA as a template and 3.6 Mbp when using 4 ng DNA as a template. This is underestimated because the actual genome size of E. coli is 4.64 Mbp. This is because the E. coli 16S rDNA gene copy number was highly quantified. Genome size of M.phosphovorus, when the 400 pg DNA as a template is 11.0Mbp, but when the 4 ng DNA as a template was estimated 14.8Mbp, other Actinobacteria has such a large genome size ( Bifidobacterium longum : 2.26 Mbp, Corynebacterium diphtheriae : 2.49 Mbp, C. efficiens : 3.15 Mbp, C. glutamicum : 3.28 Mbp or 3.31 Mbp, Corynebacterium jeikeium : 2.46 Mbp, Leifsonia xyli : 2. 58 Mbp, Mycobacterium bovis : 4.35 Mbp, Mycobacterium leprae : 3.27 Mbp, M. tuberculosis : 4.41 Mbp, Nocardia farcinica : 6.02 Mbp, Propionibacterium acnes : 2.56 Mbp, Streptomyces avermitilis : 9.03 Mbp : 8.03 Mbp .67 Mbp, Symbiobacterium thermophilum : 3.57 Mbp or Tr opheryma whipplei : 0.926-0.927 Mbp), this estimate is probably not accurate. Therefore, in this case, it was speculated that the genome size of M. phosphovorus was overestimated. In addition to this problem, in the case of QPrimer-PCR, the quantitative value of the number of 16S rDNA genes varied depending on the amount of template added initially (Tables 3-1 and 3-2). From the above, it has been clarified that the technique for quantifying 16S rDNA by the real-time PCR method based on the Ct value is not suitable as a technique for estimating the genome size.
表３−１は、PD−PCRによって、M.phosphovorusとE.coliの構成率の推定値を示している。表３−２に示したように、２８０ｐｇの大腸菌ゲノムと１２０ｐｇのM.phosphovorusを含むゲノム混合液と、２．８ｎｇの大腸菌ゲノムと１．２ｎｇのM.phosphovorusを含むゲノム混合液を対象として、PD−PCRを実施した結果、M.phosphovorusの16S rDNA遺伝子は、それぞれ３．５５％、４．３％含まれると推定された。また、１６０ｐｇの大腸菌ゲノムと２４０ｐｇのM.phosphovorusを含むゲノム混合液と、１．６ｎｇの大腸菌ゲノムと２．４ｎｇのM.phosphovorusを含むゲノム混合液を対象として、PD−PCRを実施した結果、M.phosphovorusの16S rDNA遺伝子は、それぞれ１３．４５％、１５．８９％含まれると推定された。このようにサンプルが異なっても、得られる結果は、比較的近い遺伝子構成率が得られた。E.coliのゲノムサイズ（ゲノムサイズ：４．６４Ｍｂｐ、１ゲノムあたりの16S rDNA遺伝子数：７コピー）とM.phosphovorusの１ゲノムあたりの16S rDNA遺伝子数（１コピー）より、M.phosphovorusのゲノムサイズを計算した結果、７．７Ｍｂｐ、６．３Ｍｂｐ、６．４Ｍｂｐまたは５．４Ｍｂｐと算出された（表３−２）。M.phosphovorusのゲノムサイズに関しては、正しい答えは調べられていないが、この値は他の近縁微生物から考えて妥当であり、定量値も収束した。 Table 3-1 shows the estimated values of the composition ratios of M. phosphovorus and E. coli by PD-PCR. As shown in Table 3-2, for a genome mixture containing 280 pg E. coli genome and 120 pg M. phosphovorus, and a genome mixture containing 2.8 ng E. coli genome and 1.2 ng M. phosphovorus , As a result of PD-PCR, it was estimated that the 16S rDNA gene of M. phosphovorus was contained in 3.55% and 4.3%, respectively. In addition, as a result of carrying out PD-PCR on a genomic mixed solution containing 160 pg of E. coli genome and 240 pg of M. phosphovorus, and a genomic mixed solution containing 1.6 ng of E. coli genome and 2.4 ng of M. phosphovorus , The 16S rDNA gene of M. phosphovorus was estimated to be 13.45% and 15.89%, respectively. Thus, even if the samples were different, the results obtained were relatively close to the gene composition rate. From the genome size of E. coli (genome size: 4.64 Mbp, number of 16S rDNA genes per genome: 7 copies) and the number of 16S rDNA genes per genome of M. phosphovorus (1 copy), the genome of M. phosphovorus As a result of calculating the size, it was calculated as 7.7 Mbp, 6.3 Mbp, 6.4 Mbp, or 5.4 Mbp (Table 3-2). As for the genome size of M. phosphovorus , the correct answer has not been investigated, but this value is reasonable considering other related microorganisms, and the quantitative value has also converged.
以上の結果より、PD−PCRは、Ｃｔ値をベースとしたリアルタイムPCR法の弱点を補う新しい遺伝子解析手法であり、遺伝子の構成比を求める際の正確性は、PD−PCRによって大きく改善されることが明らかとなった。 Based on the above results, PD-PCR is a new gene analysis technique that compensates for the weaknesses of real-time PCR based on Ct values, and the accuracy in determining the gene composition ratio is greatly improved by PD-PCR. It became clear.
本発明を活用することによって、環境中の複雑な場所に住んでいる微生物の種の構成比または量の測定が簡便に測定できるようになる。従って、ある環境の微生物の生態の解析が簡便・容易にできるようになる。さらに、ゲノム遺伝子中のコピー数や、ゲノムサイズを簡便・容易に測定することができる。 By utilizing the present invention, it becomes possible to easily measure the composition ratio or amount of the species of microorganisms living in a complex place in the environment. Therefore, the ecology of microorganisms in a certain environment can be easily and easily analyzed. Furthermore, the number of copies in the genomic gene and the genome size can be measured easily and easily.
Claims (6)
（１）２種類の遺伝子のどちらか一方に相補し、蛍光色素で標識された、１種または２種以上の均一溶液系核酸プローブを当該相補する遺伝子にハイブリダイズさせ、当該遺伝子を増幅させて増幅過程において発生するその光学的キャラクター変化量を測定し、得られた変化量に基づいて遺伝子の増幅過程をモニタリングする工程。
（２）２種類の遺伝子に同時に相補し、蛍光色素で標識された、前記工程（１）のものとは異なった１種または２種以上の均一溶液系核酸プローブを、２種類の遺伝子にハイブダイズリさせ、当該２種類の遺伝子を増幅させ、増幅過程において発生する光学的キャラクター変化量を測定し、得られた変化量に基づいて、当該２種類の遺伝子の増幅過程をモニタリングする工程。
（３）前記工程（２）の光学的キャラクター変化量が、一定値に達したときの前記工程（１）の光学的キャラクター変化量（以下、補正蛍光変化量と呼ぶ）を測定する工程。
（４）２種類の標準遺伝子を種々な構成比で含む複数の試料について、工程（１）〜（３）を実施し、各標準試料における補正蛍光変化量を測定し、当該測定値と遺伝子構成比との関係式を求める工程。
（５）未知試料について工程（１）〜（３）を実施し、各未知試料における補正蛍光変化量を測定し、当該測定値と、工程（４）で得られた関係式より、未知試料における遺伝子構成比を測定する工程。 Two types of genes in the measurement system are amplified using one or more homogeneous solution nucleic acid probes labeled with fluorescent dyes, and the amount of optical character change in the measurement system is measured. Based on the amount of change In the quantitative PCR method for measuring the gene composition ratio, the method comprising the following steps (1) to (5):
(1) One or two or more homogeneous solution nucleic acid probes complementary to either one of two genes and labeled with a fluorescent dye are hybridized to the complementary gene, and the gene is amplified. The process of measuring the optical character change amount generated in the amplification process and monitoring the gene amplification process based on the obtained change amount.
(2) One or two or more homogeneous solution nucleic acid probes that are simultaneously complementary to two types of genes and labeled with a fluorescent dye, different from those in step (1) above, are hybridized into two types of genes. And amplifying the two types of genes, measuring an optical character change amount generated in the amplification process, and monitoring the amplification process of the two types of genes based on the obtained change amount.
(3) A step of measuring an optical character change amount of the step (1) (hereinafter referred to as a corrected fluorescence change amount) when the optical character change amount of the step (2) reaches a certain value.
(4) Steps (1) to (3) are performed on a plurality of samples containing two types of standard genes in various composition ratios, the corrected fluorescence change amount in each standard sample is measured, and the measured value and gene configuration A process for obtaining a relational expression with a ratio.
(5) Steps (1) to (3) are performed on the unknown sample, the corrected fluorescence change amount in each unknown sample is measured, and the unknown sample is calculated from the measured value and the relational expression obtained in step (4). A step of measuring a gene composition ratio.
（ａ）前記請求項１に記載の工程（１）〜（５）を実施して、標的核酸と内部標準遺伝子との構成比を測定する工程。
（ｂ）当該構成比と内部標準遺伝子の添加量から標的遺伝子量を測定する工程。 The following steps (a) to (b) are performed on a sample obtained by adding a known amount of an internal standard gene to an unknown sample using two types of genes as a target gene and an internal standard gene, and the target in the unknown sample A method for measuring a target gene amount, comprising measuring a gene amount.
(A) A step of performing the steps (1) to (5) according to claim 1 and measuring a composition ratio between the target nucleic acid and the internal standard gene.
(B) A step of measuring the target gene amount from the component ratio and the added amount of the internal standard gene.
１）既知のゲノムサイズおよびゲノムコピーを有するDNAゲノム（Ａ）および既知のゲノムコピー数を有し、未知ゲノムサイズの標的DNAゲノム（Ｂ）の混合液を用いて、前記請求項１に記載の遺伝子構成比測定方法により、遺伝子構成比を測定する工程。
２）Ａのゲノムサイズと、工程１）で得られた遺伝子構成比とから、Ｂのゲノムサイズを測定する工程。 A method for measuring the genomic size of genomic DNA, comprising the following steps 1) to 2).
1) A mixture of a DNA genome (A) having a known genome size and genome copy and a target DNA genome (B) having a known genome copy number and an unknown genome size, according to claim 1 A step of measuring a gene composition ratio by a gene composition ratio measurement method.
2) A step of measuring the genome size of B from the genome size of A and the gene composition ratio obtained in step 1).
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