JP2007121106A - Method and device monitoring cardiomyocyte - Google Patents
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Abstract
Description
請求項に係る発明は、培養容器中にある心筋細胞をモニターする（すなわち、系時的に観察したり画像データや面積等の数値データを残したりする）ための方法および装置に関するものである。 The claimed invention relates to a method and an apparatus for monitoring cardiomyocytes in a culture vessel (that is, observing systematically or leaving numerical data such as image data and area).
マルチウェルプレート等の培養容器中にある細胞について培養状況を観察する作業は、一般に、決して容易なものではない。培養容器中の生きた心筋細胞を長期間にわたって観察し、心筋細胞の拍動するコロニー（いわゆるビーティング域）について面積を算出し記録することも、観察者に相当の労力を強いる。 The operation of observing the culture state of cells in a culture container such as a multiwell plate is generally not easy. Observing the living cardiomyocytes in the culture vessel over a long period of time, and calculating and recording the area of the beating colony (so-called beating area) of the cardiomyocytes also imposes considerable effort on the observer.
心筋細胞（ビーティング域）について面積を算出する処理は、従来、生きたままの細胞に関しては、心筋特異的プロモーター下に蛍光遺伝子を導入したＥＳ細胞を心筋に分化誘導したものや、心筋特異的なタンパク質のみが光るトランスジェニックマウス由来の心筋細胞などを用い、蛍光顕微鏡下にて蛍光面積を測定することにより行っている。また、死んだ細胞に関しては、細胞をパラホルムアルデヒド等で固定（死滅させた）後、細胞に穴を開ける処理をして細胞内の心筋特異的タンパク質を抗体法にて染色することにより心筋の面積を測定する方法で実施している。つまり、生きたままの状態で系時的に変化する心筋細胞の面積を測定するには、遺伝子導入した細胞を使用するしかなかった。 The processing for calculating the area of cardiomyocytes (beating area) has conventionally been performed on cells that have been alive and differentiated into myocardium using ES cells into which a fluorescent gene has been introduced under a myocardial specific promoter. This is done by measuring the fluorescence area under a fluorescence microscope using cardiomyocytes derived from a transgenic mouse in which only the protein shines. Regarding dead cells, the area of the myocardium is obtained by fixing the cells with paraformaldehyde or the like (and killing them), then making holes in the cells and staining the myocardial specific protein in the cells with the antibody method. It is carried out by the method of measuring. In other words, the only way to measure the area of cardiomyocytes that changes with time in the living state is to use the cells into which the gene has been introduced.
なお、培養容器中の細胞の密度を検出するための装置については、下記の特許文献１に記載がある。
生きた心筋細胞（ビーティング域）の面積を算出するための従来の方法、つまり、蛍光遺伝子を導入した心筋細胞等を用いて蛍光面積を測定する方法には、つぎのような課題がある。すなわち、
・ 拍動するコロニーをカウントするには目視に頼るしかなく、観察者の主観性を排除することが難しい。したがって、データの確認をするにも観察時に複数の観察者が観察するしかなかった。
・ デジタルカメラ等で電子記録を保存するにしても、どのコロニーを選ぶかは観察者の主観に頼るしかない。そのため、真に客観的なデータを採取するには網羅的な撮影をするしかなく、非常に膨大な労力を必要とした。
・ 生きたままの通常の細胞を対象とするのではないため、遺伝子導入による副次的効果を考慮しなければならない。
The conventional method for calculating the area of a living cardiomyocyte (beating region), that is, the method of measuring the fluorescence area using a cardiomyocyte into which a fluorescent gene has been introduced has the following problems. That is,
・ Counting beating colonies requires visual reliance, and it is difficult to eliminate the observer's subjectivity. Therefore, in order to confirm the data, a plurality of observers have to observe at the time of observation.
-Even if an electronic record is stored with a digital camera or the like, the colony to choose is dependent on the subjectivity of the observer. For this reason, the only way to collect truly objective data is to take a comprehensive picture, which requires a tremendous amount of effort.
• Side effects of gene transfer must be taken into account because it does not target normal living cells.
なお、上記した特許文献１に記載の装置は、培養容器中にある多数の細胞について密度検出をするためのものであり、心筋細胞など特定の細胞を培養容器中から特定してその面積を求めるといった処理を簡単化できるものではない。 Note that the apparatus described in Patent Document 1 described above is for detecting the density of a large number of cells in a culture container. Specific cells such as cardiomyocytes are identified from the culture container and the area thereof is obtained. Such a process cannot be simplified.
本件出願に係る発明は、以上の点を考慮して完成したもので、遺伝子導入や染色を施さない生きたままの心筋細胞について、観察者に過大な労力をかけることなく、系時的にその面積を算出し数値化することのできる、心筋細胞のモニター方法およびモニター装置を提供するものである。 The invention according to the present application has been completed in consideration of the above points, and for living cardiomyocytes that are not subjected to gene transfer or staining, it is possible to systematically improve the system without putting excessive effort on the observer. A cardiomyocyte monitoring method and a monitoring apparatus capable of calculating and digitizing an area are provided.
請求項に係る心筋細胞のモニター方法は、培養容器中の心筋細胞をモニターする方法であって、心筋細胞を含む培養容器中の細胞または細胞集団を一定時間ごとに撮像し、撮像して得た細胞または細胞集団の画像（一定時間ごとに撮像したもの）を比較することにより、心筋細胞をそれ以外の細胞から区別してモニターする（系時的に観察したり画像データや面積等の数値データを残したりする）ことを特徴とする。
一定時間ごとに撮像して得た細胞または細胞集団の画像を比較すると、拍動する心筋細胞の部分（ビーティング域）をそれ以外の細胞から区別することが可能である。その区別は高い客観性をもって行えるうえ、当該区別によって観察範囲を狭く特定することができる。そのため、上記により区別したうえで心筋細胞（ビーティング域）の部分のみをモニターするなら、少ない労力で客観的なモニタリングを行える。遺伝子導入や染色を施さない、生きたままの心筋細胞について観察できるという顕著なメリットもともなう。
The cardiomyocyte monitoring method according to the claims is a method for monitoring cardiomyocytes in a culture vessel, and is obtained by imaging a cell or a cell population in a culture vessel containing cardiomyocytes at regular intervals. By comparing images of cells or cell populations (taken at regular intervals), cardiomyocytes are monitored separately from other cells (observed systematically or numerical data such as image data and area) Or the like).
Comparing images of cells or cell populations obtained by imaging at regular intervals, it is possible to distinguish a beating cardiomyocyte portion (beating area) from other cells. The distinction can be made with high objectivity, and the observation range can be narrowly specified by the distinction. Therefore, if only the cardiomyocyte (beating region) portion is monitored after the above-described distinction, objective monitoring can be performed with little effort. It also has the distinct advantage of being able to observe living cardiomyocytes without gene transfer or staining.
上記モニター方法は、所定の細胞または細胞集団について時間差のある複数の画像を撮像手段（レンズやカメラ等で構成されるもの）が撮像し、当該複数の画像について入力を受けたコンピュータが、それら複数の画像間での変化領域を抽出することにより、心筋細胞のビーティング域を画像上で特定する、という手順によって実施するなら、なお好ましい。
そのようにすれば、撮像手段およびコンピュータの作用により、観察記録を自動的に、時間軸上の複数の地点（タイムラプス）で網羅的に、かつデジタルで保存することができる。特定した部分を識別した状態の画像をコンピュータに保存するのもよい。このような点は、客観的な記録を多数残す上で非常に効果的である。
なお、このように網羅的なデジタル記録を大量に保存・確保できることは、以下のような場合に優れた効果を発揮するものと期待される。たとえば、研究者がある実験系で思いもよらぬ現象に気づいたとする。それで、これまでの実験を別の角度から眺め直し、網羅的なデジタル記録ライブラリーから過去の実験データを抽出・比較することで、この思いもよらぬ現象が、過去の実験で見落としていただけなのか、頻度は少ないが確かにこのようなことが起きていたのか、全くこの現象はおきていなかったのかを判断することができる。このような場合、膨大な記録ライブラリーからデータを抽出し判断することにより、的確な実験系の組み立ておよび実験の省力化に有効な道具としての働きを発揮するものと考えられる。
In the monitoring method, a plurality of images having a time difference with respect to a predetermined cell or cell population are imaged by an imaging means (configured by a lens, a camera, etc.), and a computer that has received an input for the plurality of images It is more preferable to carry out according to the procedure of identifying the beating area of the cardiomyocytes on the image by extracting the change area between the images.
By doing so, the observation record can be automatically and comprehensively stored at a plurality of points on the time axis (time lapse) and digitally by the action of the imaging means and the computer. It is also possible to store an image with the identified portion identified in a computer. Such a point is very effective in leaving many objective records.
In addition, it is expected that such comprehensive digital records can be stored and secured in a large amount in the following cases. For example, suppose a researcher notices an unexpected phenomenon in an experimental system. So, by reviewing previous experiments from a different angle, and extracting and comparing past experimental data from a comprehensive digital recording library, this unexpected phenomenon should not be overlooked in past experiments. However, it is possible to determine whether this has happened at all infrequently or whether this phenomenon has occurred at all. In such a case, it is considered that by extracting and judging data from a huge recording library, it can function as an effective tool for assembling an accurate experimental system and saving labor in the experiment.
とくに、上記のコンピュータが、ニューラルネットワークを用いるパターン認識によって画像上の心筋細胞を区別したうえ、上記複数の画像のうち２つの画像間で心筋細胞近傍につき差分処理を行うことにより画像間の変化領域を抽出して心筋細胞のビーティング域を画像上で特定し、特定した部分のピクセル数をカウントすることによりビーティング域の面積を求める、という手順をとるなら、さらに好ましいモニタリングを行える。
心筋細胞を培養する場合、通常、培養容器中には心筋細胞以外の細胞または細胞集団が混在することが多い。そのような場合、撮像された画像中で心筋細胞をまず区別することが、精度の高いモニタリングを効率的に行ううえで重要である。上記のようにニューラルネットワークと差分処理を用いる画像処理をコンピュータに行わせれば、画像上で心筋細胞を区別することと、さらに心筋細胞のビーティング域を特定することとが迅速かつ効率的に実現する。そのコンピュータに、特定したビーティング域のピクセル数をカウントしてその面積を求めさせると、当該細部の培養状況を適切に数値化できる。なお、ニューラルネットワークを用いるパターン認識としては、たとえば、階層型ネットワークに、教師信号を用いるバックプロパゲーションによる学習をさせパターン認識させる手法等が採用できる。
In particular, the computer distinguishes the cardiomyocytes on the image by pattern recognition using a neural network, and performs a difference process on the vicinity of the cardiomyocytes between two images of the plurality of images, thereby changing the region between the images. If the procedure is taken to identify the beating area of the cardiomyocytes on the image and to determine the area of the beating area by counting the number of pixels of the identified part, more preferable monitoring can be performed.
When culturing cardiomyocytes, cells or cell populations other than cardiomyocytes are usually mixed in the culture container. In such a case, it is important to first distinguish cardiomyocytes in the captured image in order to efficiently perform highly accurate monitoring. If the computer performs image processing using the neural network and the difference processing as described above, it is possible to quickly and efficiently identify the cardiomyocytes on the image and further specify the beating area of the cardiomyocytes. . When the computer counts the number of pixels in the specified beating area and obtains the area, the culture state of the details can be appropriately digitized. In addition, as pattern recognition using a neural network, for example, a technique of making a hierarchical network learn by back propagation using a teacher signal and recognizing the pattern can be employed.
上記のモニター方法においては、さらに、培養容器における撮像範囲を当該範囲に重なりがあるように移動させることとし、移動の前後に上記の細胞または細胞集団を撮像手段が撮像し、それら撮像画像について入力を受けた画像結合手段が移動の前後の画像をつなぎ合わせて結合画像を作成し（つまりいわゆるタイリングをし）、作成した結合画像を、上記複数の画像（つまり、時間差のある複数の画像）の各々として上記のコンピュータが入力を受けビーティング域を特定する、という手順をとるのもよい。
そのようにすれば、観察等すべき心筋細胞が撮像手段による単一の撮像範囲内に収まらない場合にも、当該心筋細胞のモニタリングを適切に行える。撮像範囲を適切に移動し、移動の前後に撮像手段が細胞または細胞集団を撮像したうえ、それらの撮像画像を画像結合手段がつなぎ合わせて結合画像を作成するからである。観察等すべき心筋細胞が結合画像中に収まるようになれば、その結合画像について上記のコンピュータが上述の手順を実施することにより、心筋細胞の必要なモニタリングが円滑に行える。そしてその結果、細胞等の全体についてのスクリーニングも可能になる。
In the above monitoring method, the imaging range in the culture vessel is further moved so that the range overlaps, and the imaging means captures the cells or cell population before and after the movement, and inputs the captured images. The image combining means that has received the image joins the images before and after the movement to create a combined image (ie, so-called tiling), and creates the combined image as a plurality of images (that is, multiple images having time differences). It is also possible to take a procedure in which the above-mentioned computer receives an input and specifies a beating area as each of the above.
By doing so, the cardiomyocytes can be appropriately monitored even when the cardiomyocytes to be observed do not fit within the single imaging range by the imaging means. This is because the imaging range is appropriately moved, the imaging unit images the cell or the cell population before and after the movement, and the combined image is created by connecting the captured images with the image combining unit. If the cardiomyocytes to be observed can be accommodated in the combined image, the computer performs the above-described procedure on the combined image, so that necessary monitoring of the cardiomyocytes can be performed smoothly. As a result, it is possible to screen the entire cell or the like.
請求項に係る心筋細胞のモニター装置は、培養容器中の心筋細胞をモニターするための装置であって、
・ 心筋細胞を含む培養容器中の細胞または細胞集団を時間間隔をおいて撮像する撮像手段と、
・ 時間差のある複数の画像について撮像手段より入力を受け、それら複数の画像間での変化領域を抽出することにより心筋細胞のビーティング域を画像上で特定するコンピュータと
を含むことを特徴とする。
A cardiomyocyte monitoring device according to claim is a device for monitoring cardiomyocytes in a culture vessel,
An imaging means for imaging cells or cell populations in a culture vessel containing cardiomyocytes at time intervals;
A computer that receives input from the imaging means for a plurality of images having a time difference and extracts a region of change between the plurality of images to identify a beating area of the cardiomyocytes on the image;
また、このモニター装置については、
・ 上記の撮像手段と培養容器との間に相対移動をもたらす移動手段と、
・ 移動の前後に撮像手段が撮像した画像について入力を受けたうえ、移動の前後の画像をつなぎ合わせて結合画像を作成（タイリング）する画像結合手段と
をさらに含むよう構成するのが好ましい。
In addition, about this monitor device,
A moving means for providing a relative movement between the imaging means and the culture vessel;
It is preferable to further include an image combining unit that receives an input of images taken by the imaging unit before and after the movement, and creates a combined image by tiling the images before and after the movement (tiling).
以上のようなモニター装置を用いれば、上述した各モニター方法を円滑に実施することができ、上述の作用効果がもたらされる。 If the above monitoring apparatus is used, each monitoring method mentioned above can be implemented smoothly, and the above-mentioned operation effect is brought about.
とくに、上記の移動手段が、培養容器を動かすことなく、上記の撮像手段を３次元（すなわち、水平面に沿ったＸ方向とＹ方向とのほかに鉛直方向であるＺ方向を含む各方向）に移動するものであれば、さらに好ましい。
培養容器を動かさないことにより、同容器中の細胞や細胞集団が無用に変位・変形することがないので、培養中の細胞等の観察を適切に行うことができる。請求項に係る発明では、複数の画像間での変化領域を抽出することによりビーティング域を特定するのであるから、培養容器の移動によって細胞等の位置や形状・姿勢等が変化すると、それによってビーティング域の特定に誤差が生じる可能性が著しく高くなる。そのため、移動手段が培養容器ではなく撮像手段を移動させることには、上記装置においてきわめて重要な意義があるといえる。
撮像手段のその移動が、水平面に沿った２次元のものでなく鉛直方向を含む３次元のものであれば、培養容器中で細胞等が鉛直に盛り上がっている場合にも、その細胞等のうちビーティング域など最も観察したい部分に焦点を合わせた適切なモニタリングが実施できることになる。
In particular, the moving means moves the imaging means in three dimensions (that is, each direction including the Z direction which is the vertical direction in addition to the X direction and the Y direction along the horizontal plane) without moving the culture vessel. It is more preferable if it moves.
By not moving the culture container, the cells and cell population in the container are not displaced or deformed unnecessarily, so that the cells in culture can be appropriately observed. In the claimed invention, since the beating area is specified by extracting the change area between a plurality of images, if the position, shape, posture, etc. of the cells change due to the movement of the culture container, the beating There is a significant increase in the possibility of errors in area identification. Therefore, it can be said that it is extremely important in the above apparatus that the moving means moves the imaging means instead of the culture vessel.
If the movement of the imaging means is not two-dimensional along the horizontal plane but three-dimensional including the vertical direction, even if the cells etc. are rising vertically in the culture vessel, Appropriate monitoring focusing on the most observable part such as the beating area can be performed.
請求項に係るモニター方法によれば、心筋細胞に関し、少ない労力で客観的なモニタリングを行うことができる。また、遺伝子導入や染色などの特別な操作を必要とせず、生きたままの状態で、細胞を全く侵襲することなく、系時的に心筋細胞の観察を行える。撮像手段とコンピュータとを適切に使用するなら、網羅的な観察記録を大量に保存・確保することができ、またはさらに観察を効率化してその結果を適切に数値化することも可能になる。撮像範囲を適切に移動するとともにコンピュータに適切に画像処理を行わせるなら、観察等すべき心筋細胞が撮像手段による単一の撮像範囲内に収まらない場合にも適切なモニタリングが行える。 According to the monitoring method according to the claims, it is possible to perform objective monitoring of cardiomyocytes with little effort. In addition, cardiomyocytes can be observed systematically without requiring any special operations such as gene transfer and staining, and without invasive cells at all. If the imaging means and the computer are used appropriately, a comprehensive observation record can be stored and secured in large quantities, or the observation can be made more efficient and the result can be appropriately digitized. By appropriately moving the imaging range and causing the computer to appropriately perform image processing, appropriate monitoring can be performed even when cardiomyocytes to be observed do not fit within the single imaging range by the imaging means.
請求項に係るモニター装置によれば、請求項に係るモニター方法を円滑に実施することができ、上述の効果を得ることができる。移動手段が、培養容器を動かすことなく撮像手段を３次元に移動するようにすれば、培養中の細胞等の観察をとくに適切に行えるほか、細胞等が鉛直に盛り上がっている場合にも適切なモニタリングが可能である。 According to the monitoring apparatus according to the claims, the monitoring method according to the claims can be smoothly performed, and the above-described effects can be obtained. If the moving means moves the imaging means in a three-dimensional manner without moving the culture vessel, it is possible to observe the cells in culture in particular appropriately, and it is also appropriate when the cells are raised vertically. Monitoring is possible.
発明の実施についての一形態を図１〜図９に示す。図１は、モニター装置の概略構成を示す正面図であり、図２は、そのモニター装置で使用する培養容器を示す平面図に、同容器中の撮像範囲（観察視野範囲）の移動態様を示す模式図（拡大引出し図）を併記したものである。また、図３〜図９のそれぞれは、モニター装置における撮像画像、またはコンピュータによる処理が加えられた画像を示す図（顕微鏡写真）である。 One form about implementation of invention is shown in FIGS. FIG. 1 is a front view showing a schematic configuration of a monitor device, and FIG. 2 is a plan view showing a culture vessel used in the monitor device, and shows a moving mode of an imaging range (observation visual field range) in the vessel. A schematic diagram (enlarged drawing) is also shown. Each of FIGS. 3 to 9 is a diagram (micrograph) showing a captured image in a monitor device or an image subjected to processing by a computer.
図１に示すモニター装置は、培養容器３１（図２参照）中の細胞または細胞集団を、撮像手段１０によって顕微鏡観察することを基本機能とするものである。同装置は、図示のように固定フレーム１と移動フレーム３、ならびに撮像手段１０および移動手段２０等により構成している。移動手段２０であるＸステージ２１・Ｙステージ２２・Ｚステージ２３の上に撮像手段１０を組み付け、培養容器３１を含むたとえばマルチウェルプレート３０（図２参照）を、固定フレーム１の上部に設けた支持部２に交換可能に取り付けることとしている。 The monitor device shown in FIG. 1 has a basic function of observing a cell or a cell population in a culture vessel 31 (see FIG. 2) with a microscope using the imaging means 10. The apparatus comprises a fixed frame 1, a moving frame 3, an imaging means 10, a moving means 20, and the like as shown in the figure. The imaging means 10 is assembled on the X stage 21, the Y stage 22, and the Z stage 23, which are the moving means 20, and, for example, a multiwell plate 30 (see FIG. 2) including the culture vessel 31 is provided on the upper part of the fixed frame 1. The support part 2 is attached so as to be replaceable.
撮像手段１０は、対物レンズ１１と光学筒１２およびＣＣＤカメラ１３を主要部とし、レンズ１１を上に向けて上記支持部２の下方に設けている。移動手段２０は、Ｘ方向（水平面内の一方向）への移動を行うためのＸステージ２１と、Ｙ方向（Ｘ方向と直交する水辺面内の一方向）への移動のためのＹステージ２２、およびＺ方向（鉛直方向）への移動のためのＺステージ２３を、この順に下から上へと積み上げたものである。各ステージ２１〜２３には、ボールネジによる移動機構と当該ネジを駆動するステッピングモータ等を組み込んでいる（図示省略）。撮像手段１０は、Ｚステージ２３の可動部に組み付けているため、各ステージ２１〜２３の作用によりＸ方向・Ｙ方向・Ｚ方向の三次元に移動することができる。光源１６は、撮像手段１０とは別にその上方（支持部２のさらに上）に配置したが、つねに撮像手段１０の真上に位置する必要があるので、Ｘステージ２１上のＹステージ２２に取り付けた移動フレーム３に支持させ、Ｘ方向およびＹ方向に撮像手段１０とともに移動するようにしている。 The imaging means 10 has an objective lens 11, an optical cylinder 12 and a CCD camera 13 as main parts, and is provided below the support part 2 with the lens 11 facing upward. The moving means 20 includes an X stage 21 for moving in the X direction (one direction in the horizontal plane) and a Y stage 22 for moving in the Y direction (one direction in the water surface perpendicular to the X direction). The Z stage 23 for movement in the Z direction (vertical direction) is stacked in this order from bottom to top. Each stage 21 to 23 incorporates a moving mechanism using a ball screw and a stepping motor for driving the screw (not shown). Since the imaging means 10 is assembled to the movable part of the Z stage 23, it can move in three dimensions in the X direction, the Y direction, and the Z direction by the action of the stages 21 to 23. The light source 16 is arranged above the image pickup means 10 (above the support portion 2) separately from the image pickup means 10, but it must always be located directly above the image pickup means 10, so it is attached to the Y stage 22 on the X stage 21. It is supported by the moving frame 3 and moves together with the image pickup means 10 in the X direction and the Y direction.
図示のモニター装置にはさらに、演算部や記憶部、入力部、ディスプレイ、インターフェース等を含むコンピュータ（パソコン等。図示省略）を組み込み、撮像手段１０や移動手段２０の各駆動用モータ等をそのコンピュータに接続している。そして当該コンピュータには、撮像手段１０から入力される時間差のある複数の画像同士を比較してそれらの変化領域を抽出するためのソフトウェアや、撮像範囲の隣接する複数の画像をつなぎ合わせるためのソフトウェアを搭載し、それらによってコンピュータ内にそれぞれ画像抽出手段および画像結合手段（いずれも図示省略）を形成している。 The illustrated monitor device further incorporates a computer (such as a personal computer, not shown) including a calculation unit, a storage unit, an input unit, a display, an interface, etc. Connected to. The computer also includes software for comparing a plurality of images with time differences input from the imaging means 10 and extracting their change areas, and software for connecting a plurality of adjacent images in the imaging range. And image forming means and image combining means (both not shown) are formed in the computer.
このように構成したモニター装置では、以下の手順によって、培養容器３１内の心筋細胞の観察（モニタリング）を行うことができる。 With the monitor device configured as described above, cardiomyocytes in the culture vessel 31 can be observed (monitored) by the following procedure.
1) まず、たとえば図２のようなマルチウェルプレート３０（ウェルに相当する各培養容器３１中に心筋細胞等を含むもの）を、図１のモニター装置における支持部２に取り付ける。マルチウェルプレート３０は所定のチャンバーに入れ、このチャンバー内に温度、湿度、ガス濃度が最適に制御されたＣＯ2ガスを導入する。この状態で、長期間細胞を培養しながら、設定された位置でタイムラプス観察をするのである。 1) First, for example, a multi-well plate 30 as shown in FIG. 2 (one containing cardiomyocytes or the like in each culture vessel 31 corresponding to a well) is attached to the support portion 2 in the monitor device of FIG. The multiwell plate 30 is placed in a predetermined chamber, and CO2 gas whose temperature, humidity, and gas concentration are optimally controlled is introduced into the chamber. In this state, time-lapse observation is performed at a set position while culturing cells for a long time.
2) 特定の培養容器３１における観察範囲Ｍ内を、撮像手段１０によって撮像する。撮像手段１０によって一度に観察できる視野範囲Ｖ（撮像範囲）は通常２ｍｍ×２ｍｍ程度であって、一般的には３ｃｍ×３ｃｍ程度に及ぶ観察範囲Ｍよりもせまいので、移動手段２０にて撮像手段１０を図２（拡大引出し図）のように移動させながら撮像する。このとき、隣接する視野範囲Ｖが前回の視野範囲Ｖに対し面積比で５％ずつ重なる（つまりラップ範囲が５％になる）ように撮像手段１０を移動することとし、各停止箇所で数秒の間に５回の撮像をする。なお、このような移動と撮像のためには、移動手段２０と撮像手段１０とを前記のコンピュータがコントロールし、また、撮像した画像とその撮像箇所のデータ（ＸＹ座標）をもそのコンピュータが保存する。 2) The inside of the observation range M in the specific culture vessel 31 is imaged by the imaging means 10. The field-of-view range V (imaging range) that can be observed at once by the imaging means 10 is usually about 2 mm × 2 mm, and is generally less than the observation range M that extends to about 3 cm × 3 cm. 10 is imaged while moving as shown in FIG. 2 (enlarged drawing). At this time, the imaging means 10 is moved so that the adjacent visual field range V overlaps the previous visual field range V by 5% in terms of area ratio (that is, the lap range becomes 5%). Take 5 images in between. For such movement and imaging, the computer controls the moving unit 20 and the imaging unit 10, and the computer also stores the captured image and data (XY coordinates) of the imaging location. To do.
3) 広い観察範囲Ｍを網羅して観察するために、各視野範囲Ｖで撮像し保存した画像をつなぎ合わせて、１つの結合画像を作成する。つまり、上記コンピュータにおける前記の画像結合手段によって、各画像の平行移動・回転移動を行い画像のマッチングを判別（パターンマッチング）しながら並べ合わせて（タイリング）、新たな大きな１枚の画像とするのである。パターンマッチングは、
i) 各箇所での撮像画像を並べて（図３）、画像データの処理する順番を決める、
ii) オーバーラッピング量を入れる、
iii) 特徴量の抽出をする（図４）、
iv) パターンの合致箇所を見つけて最終位置（ＸＹ）を決め、画像をつなぐ（図５）
という要領で行う。ここで、iii)の特徴量の抽出は、実画像の一部分から取り出して使用する濃淡パターンマッチング（周囲と輝度が異なる部分に輪郭ができることを利用する方法）とか、この輪郭データに基づく形状ベースパターンマッチングなどの手法を用いる。
3) In order to cover a wide observation range M, the images captured and stored in each visual field range V are connected to create one combined image. That is, by the image combining means in the computer, the images are translated and rotated to be aligned (tiling) while discriminating image matching (pattern matching) to form a new large image. It is. Pattern matching is
i) Arrange the captured images at each location (FIG. 3), and determine the processing order of the image data.
ii) Insert the amount of overlap,
iii) Extract features (Fig. 4),
iv) Find the matching part of the pattern, determine the final position (XY), and connect the images (Fig. 5)
This is done. Here, the feature amount extraction of iii) is a shading pattern matching (a method utilizing the fact that a contour is different from the surroundings) that is extracted from a part of an actual image, or a shape-based pattern based on this contour data. Use a technique such as matching.
4) 培養容器３１中には心筋細胞とそうでない細胞とが混在するので、それらのうちから心筋細胞を区別する。この作業を、上記のコンピュータ内に細胞認識手段として形成した、学習能力のあるニューラルネットワークと差分処理を用いた画像処理によって行う。ニューラルネットワークは、もっともらしい値を色々な統計処理回路を経由して求めていく方法であるので、まず、
i) 得られた実画像で代表的な心筋細胞のコロニーとそうでない部分を教師信号として観察者がコンピュータに入力し、学習のスタートをきる。図６は、心筋細胞のコロニー（丸囲みの部分）とそうでない細胞である背景部分（四角囲みの部分）とを入力する過程を示している。
ii) 学習を経てそのコンピュータが、心筋細胞のコロニーを次々と規定していくと共にその面積計算も行う（図７）。心筋細胞の一つのコロニーが複数の撮像画像間にまたがる場合には、上記3)のタイリング処理により作成された結合画像より当該コロニーを特定する（図８）。
4) Since cardiomyocytes and cells that are not are mixed in the culture vessel 31, cardiomyocytes are distinguished from them. This work is performed by image processing using a neural network capable of learning and a difference process formed as a cell recognition means in the computer. A neural network is a method of finding plausible values via various statistical processing circuits.
i) An observer inputs a representative myocardial cell colony and a non-represented portion of the obtained real image into a computer as a teacher signal, and starts learning. FIG. 6 shows a process of inputting a colony of cardiomyocytes (circled portion) and a background portion that is not a cell (square enclosed portion).
ii) After learning, the computer defines the cardiomyocyte colonies one after another and calculates the area (Fig. 7). When a single colony of cardiomyocytes spans between a plurality of captured images, the colony is specified from the combined image created by the tiling process in 3) above (FIG. 8).
5) 次に、規定されたコロニー内で動いている（ビーティング）細胞と動いていない細胞との識別を行う。この識別は、上記のコンピュータ（画像抽出手段）が、同じコロニー内の画像を複数枚取り込み、上記2)で５回撮像した画像のうち１枚目の画像と２枚目以降の画像の差分処理（画像中の細胞のエッジ、即ち濃淡の変化のある領域につき横差分・縦差分をとり境界線を抽出する方法）を行うことにより実施する。そうして動きのある部分を抜き出してその部分の面積計算を行う（図９）とともに、当該部分を識別した画像をコンピュータが保存する。同じコロニー内の画像データは、多い方が精度的に有利であるが、計算処理時間の短縮のため、数枚の画像で解析する。 5) Next, distinguish between moving (beating) cells and non-moving cells within a defined colony. For this identification, the above computer (image extracting means) takes in a plurality of images in the same colony, and the difference processing between the first image and the second and subsequent images among the images captured five times in the above 2) (A method of extracting a boundary line by taking a horizontal difference and a vertical difference for an edge of a cell in an image, that is, a region having a change in shading). Then, a moving part is extracted and the area of the part is calculated (FIG. 9), and the computer stores an image identifying the part. A larger number of image data within the same colony is more advantageous in terms of accuracy, but in order to shorten the calculation processing time, analysis is performed with several images.
以上に紹介したモニター装置によって心筋細胞の拍動コロニー（ビーティング域）を識別するとともに、熟練観察者の目視によっても同じ心筋細胞の拍動コロニーを識別し、双方で識別された拍動コロニー数の比較を行った。実験の内容と結果等はつぎのとおりである。 In addition to identifying the beating colony (beating area) of cardiomyocytes by the monitoring device introduced above, the beating colony of the same cardiomyocyte is also identified by visual observation of an expert observer, and the number of beating colonies identified by both A comparison was made. The contents and results of the experiment are as follows.
（実験）
マウス胚性幹細胞株 EB5（理化学研究所 神戸発生再生科学総合センター 丹羽仁史氏 供与）の未分化維持状態での培養では、0.1％ゼラチンコートしたφ60mm培養皿上で、1％ウシ胎児血清（EQUITECH）、10％Kckout Serum Replacement (GIBCO/BRL)、1％ピルビン酸ナトリウム(Sigma)、1％非必須アミノ酸(GIBCO/BRL)、1％ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO/BRL)、100μM 2-メルカプトエタノール(Sigma)、1000 U/mL Leukemia Inhibitory Factor (Chemicon International Inc.)および10 μg/mL ブラストサイジン (FUNAKOSHI)を添加したGlasgow最小必須培地 (GMEM) (GIBCO/BRL) 中で、5％CO2、温度37℃で培養した。未分化ES細胞株EB5から中胚葉系細胞の分化誘導には、EB5細胞を0.1％ゼラチンコートしたφ100mm培養皿上で、10％ウシ胎児血清（GIBCO/BRL）、100μM 2-メルカプトエタノール(Sigma)、100U/mlペニシリン(GIBCO/BRL)、100mg/mlストレプトマイシン(GIBCO/BRL)、100μM 2-メルカプトエタノール(Sigma)を添加したα最小必須培地（α-MEM）（分化培地）中で、5％CO2、温度37℃で5日間培養した。ゼラチンコート培養皿上での分化誘導5日後に、0.05％Tripsin/EDTA液(GIBCO/BRL)にて細胞を回収し、37℃30分間分化培地とともに培養した後、PE標識抗マウスFlk-1抗体（クローン名：Avas12α1、理化学研究所 西川伸一氏供与または日本ベクトン・ディッキンソンより購入）にて染色し、日本ベクトン・ディッキンソン社製FACS AriaにてFlk-1陽性細胞を採取し、6-well culture plateにconfluentな状態になったストローマ細胞株OP9細胞上に播種した（播種密度は1x104/well）。ストローマ細胞株OP9細胞との共培養5-10日後、目視およびモニター装置にて、拍動するコロニー数を測定した。
(Experiment)
When culturing the mouse embryonic stem cell line EB5 (provided by Dr. Hitoshi Niwa, RIKEN Kobe Development and Regeneration Science Center) in an undifferentiated state, 1% fetal bovine serum (EQUITECH) on a φ60mm culture dish coated with 0.1% gelatin 10% Kckout Serum Replacement (GIBCO / BRL), 1% sodium pyruvate (Sigma), 1% non-essential amino acid (GIBCO / BRL), 1% penicillin-streptomycin (GIBCO / BRL), 100 μM 2-mercaptoethanol (Sigma ), 1000 U / mL Leukemia Inhibitory Factor (Chemicon International Inc.) and 10 μg / mL Blasticidin (FUNAKOSHI) in Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) (GIBCO / BRL), 5% CO2, temperature 37 Incubated at 0 ° C. For differentiation induction of mesoderm cells from the undifferentiated ES cell line EB5, 10% fetal calf serum (GIBCO / BRL), 100 μM 2-mercaptoethanol (Sigma) on a φ100 mm culture dish coated with 0.1% gelatin of EB5 cells , 5% in α minimum essential medium (α-MEM) (differentiation medium) supplemented with 100 U / ml penicillin (GIBCO / BRL), 100 mg / ml streptomycin (GIBCO / BRL), 100 μM 2-mercaptoethanol (Sigma) Culturing was performed at CO2 and a temperature of 37 ° C. for 5 days. Five days after differentiation induction on gelatin-coated culture dishes, cells were collected with 0.05% Tripsin / EDTA solution (GIBCO / BRL), cultured at 37 ° C for 30 minutes with differentiation medium, and then labeled with PE-labeled anti-mouse Flk-1 antibody. (Clone name: Avas12α1, donated by Shinichi Nishikawa from RIKEN or purchased from Nippon Becton Dickinson), and Flk-1-positive cells were collected using FACS Aria manufactured by Nippon Becton Dickinson. 6-well culture plate The cells were seeded on the stromal cell line OP9 cells in a confluent state (seeding density was 1 × 10 4 / well). After 5-10 days of co-culture with the stromal cell line OP9 cells, the number of beating colonies was measured visually and with a monitoring device.
（結果と考察）
目視観察にて識別した拍動コロニー数と上記モニター装置（観察装置）にて識別したものの数との比較を図１０に示す。同図の縦軸の数字は拍動コロニー数であり、横軸の数字は培養容器３１（図２）の番号である。目視での評価の場合とモニター装置での評価において有意な差は認められなかったが、小型の拍動コロニーを確実に評価する点で、モニター装置の優位性が示唆された。すなわち、目視による評価では小型のコロニーに対する見落としが懸念されるが、モニター装置では見落としがないため、分化誘導初期の心筋細胞が拍動を開始する時点など、拍動面積が小さい時の評価には上記したモニター装置の方が有効であると考えられる。
(Results and discussion)
FIG. 10 shows a comparison between the number of beating colonies identified by visual observation and the number identified by the monitor device (observation device). The number on the vertical axis in the figure is the number of beating colonies, and the number on the horizontal axis is the number of the culture vessel 31 (FIG. 2). Although no significant difference was observed between the case of visual evaluation and the evaluation on the monitor device, the superiority of the monitor device was suggested in terms of reliably evaluating small pulsating colonies. In other words, there is concern about overlooking small colonies in the visual evaluation, but since there is no oversight in the monitor device, for evaluation when the pulsation area is small, such as when the cardiomyocytes in the early stage of differentiation induction start pulsation. It is considered that the above monitor device is more effective.
心筋特異的プロモーター下に蛍光遺伝子をぶら下げたES細胞の分化実験（心筋のみが蛍光を発している）を行い、上記のモニター装置が識別する拍動エリアと蛍光面積に基づくそれとの比較を行った。この実験の内容と結果等はつぎのとおりである。 Differentiation experiment of ES cells with fluorescent gene hanging under myocardial specific promoter (only myocardium emits fluorescence) was compared with the pulsation area identified by the monitoring device and that based on the fluorescence area . The contents and results of this experiment are as follows.
（実験） (Experiment)
心筋特異的遺伝子であるαMHCのプロモーター下に赤色蛍光を発するタンパク質であるDs-Redの遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子を組み込んだconstractを作製し、エレクトロポレーション法にてマウス胚性幹細胞株 EB5（理化学研究所 神戸発生再生科学総合センター 丹羽仁史氏 供与）に打ち込みG418による選択後、コロニーを選択し、心筋細胞に分化すると赤色蛍光を発するEB5-αMHC-DsRedを作製した。
EB5-αMHC-DsRedの未分化維持状態での培養は、EB5細胞同様、0.1％ゼラチンコートしたφ60mm培養皿上で、1％ウシ胎児血清（EQUITECH）、10％Kckout Serum Replacement (GIBCO/BRL)、1％ピルビン酸ナトリウム(Sigma)、1％非必須アミノ酸(GIBCO/BRL)、1％ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO/BRL)、100μM 2-メルカプトエタノール(Sigma)、1000 U/mL Leukemia Inhibitory Factor (Chemicon International Inc.)および10 μg/mL ブラストサイジン (FUNAKOSHI)を添加したGlasgow最小必須培地 (GMEM) (GIBCO/BRL) 中で、5％CO2、温度37℃で培養した。未分化ES細胞株EB5-αMHC-DsRedから中胚葉系細胞の分化誘導には、EB5細胞同様、0.1％ゼラチンコートしたφ100mm培養皿上で、10％ウシ胎児血清（GIBCO/BRL）、100μM 2-メルカプトエタノール(Sigma)、100U/mlペニシリン(GIBCO/BRL)、100mg/mlストレプトマイシン(GIBCO/BRL)、100μM 2-メルカプトエタノール(Sigma)を添加したα最小必須培地（α-MEM）（分化培地）中で、5％CO2、温度37℃で5日間培養した。ゼラチンコート培養皿上での分化誘導5日後に、0.05％Tripsin/EDTA液(GIBCO/BRL)にて細胞を回収し、37℃30分間分化培地とともに培養した後、PE標識抗マウスFlk-1抗体（クローン名：Avas12α1、理化学研究所 西川伸一氏供与または日本ベクトン・ディッキンソンより購入）にて染色し、日本ベクトン・ディッキンソン社製FACS AriaにてFlk-1陽性細胞を採取し、6-well culture plateにconfluentな状態になったストローマ細胞株OP9細胞上に播種した（播種密度は1x104/well）。ストローマ細胞株OP9細胞との共培養7日後、モニター装置にて各コロニーの拍動する面積を算出した。比較対照群として、蛍光顕微鏡下での蛍光観察（撮像）した赤色蛍光画像を画像処理（２値化および蛍光部分の面積測定）し、両者の比較を行った。図１１は、２値化処理したその蛍光画像を示している。
A constract incorporating the Ds-Red gene, which emits red fluorescence under the promoter of αMHC, which is a myocardial specific gene, and the neomycin resistance gene was prepared, and the mouse embryonic stem cell line EB5 (RIKEN) was electroporated. EB5-αMHC-DsRed that emits red fluorescence when selected by G418, colonies were selected and differentiated into cardiomyocytes.
EB5-αMHC-DsRed was cultured in an undifferentiated state in the same manner as EB5 cells, on a φ60 mm culture dish coated with 0.1% gelatin, 1% fetal calf serum (EQUITECH), 10% Kckout Serum Replacement (GIBCO / BRL), 1% sodium pyruvate (Sigma), 1% non-essential amino acid (GIBCO / BRL), 1% penicillin-streptomycin (GIBCO / BRL), 100 μM 2-mercaptoethanol (Sigma), 1000 U / mL Leukemia Inhibitory Factor (Chemicon International Inc.) and 10 μg / mL blasticidin (FUNAKOSHI) in Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) (GIBCO / BRL) and cultured at 5% CO 2 and a temperature of 37 ° C. Differentiation of mesoderm cells from the undifferentiated ES cell line EB5-αMHC-DsRed was carried out using a 0.1% gelatin-coated φ100 mm culture dish, 10% fetal bovine serum (GIBCO / BRL), 100 μM 2- Α minimum essential medium (α-MEM) (differentiation medium) supplemented with mercaptoethanol (Sigma), 100 U / ml penicillin (GIBCO / BRL), 100 mg / ml streptomycin (GIBCO / BRL), 100 μM 2-mercaptoethanol (Sigma) Incubated for 5 days at 5% CO 2 and a temperature of 37 ° C. Five days after differentiation induction on gelatin-coated culture dishes, cells were collected with 0.05% Tripsin / EDTA solution (GIBCO / BRL), cultured at 37 ° C for 30 minutes with differentiation medium, and then labeled with PE-labeled anti-mouse Flk-1 antibody. (Clone name: Avas12α1, donated by Shinichi Nishikawa from RIKEN or purchased from Nippon Becton Dickinson), and Flk-1-positive cells were collected using FACS Aria manufactured by Nippon Becton Dickinson. 6-well culture plate The cells were seeded on the stromal cell line OP9 cells in a confluent state (seeding density was 1 × 10 4 / well). After 7 days of co-culture with the stromal cell line OP9 cells, the beating area of each colony was calculated with a monitor device. As a comparative control group, red fluorescence images observed (imaged) under a fluorescence microscope were subjected to image processing (binarization and area measurement of the fluorescent portion), and the two were compared. FIG. 11 shows the fluorescence image that has been binarized.
（結果と考察）
図１２は、上記モニター装置にて導き出された拍動エリアと、蛍光観察による撮像結果とを合成した図である。同図の例では、概ね外側に位置する明度の高い線がモニター装置の識別したもので、やや内側に位置する中明度の線が蛍光観察で識別したものである。この図からわかるように、両方式で特定されたエリアは非常に似通っている。２５個のコロニーについて両方式で得られた面積を比較したところ、相関性の高い結果が得られた（図１３。横軸はモニター装置が求めた面積、縦軸は蛍光観察で求められた面積を示す）。両者に多少の相違があるのは、モニター装置が拍動エリア（ビーティング域）の面積を求めているのに対して、蛍光観察では拍動エリアに限らない心筋細胞の面積を求めていることに主として起因すると考えられる。培養中の心筋細胞に関する情報として関心がもたれるのは一般に前者（拍動エリア）であるため、モニター装置による観察結果にそれだけ高い有用性があると考えることができる。
(Results and discussion)
FIG. 12 is a diagram in which the pulsation area derived by the monitor device and the imaging result by fluorescence observation are combined. In the example shown in the figure, a line with high brightness located almost on the outside is identified by the monitor device, and a line with medium brightness located slightly on the inside is identified by fluorescence observation. As can be seen from this figure, the areas specified by both methods are very similar. When the areas obtained by both methods were compared for 25 colonies, highly correlated results were obtained (FIG. 13. The horizontal axis represents the area obtained by the monitor device, and the vertical axis represents the area obtained by fluorescence observation. Showing). The difference between the two is that the monitor device calculates the area of the beating area (beating area), whereas the fluorescence observation determines the area of the cardiomyocytes that is not limited to the beating area. It is thought to be mainly due to this. Since it is generally the former (pulsation area) that is of interest as information regarding cardiomyocytes in culture, it can be considered that the observation result by the monitor device has high utility.
１０ 撮像手段
２０ 移動手段
３１ 培養容器
10 Imaging means 20 Moving means 31 Culture vessel
Claims (7)
心筋細胞を含む培養容器中の細胞または細胞集団を一定時間ごとに撮像し、撮像して得た細胞または細胞集団の画像を比較することにより、心筋細胞をそれ以外の細胞から区別してモニターすることを特徴とする心筋細胞のモニター方法。 A method for monitoring cardiomyocytes in a culture vessel, comprising:
To monitor cardiomyocytes separately from other cells by imaging cells or cell populations in culture vessels containing cardiomyocytes at regular intervals and comparing the images of the cells or cell populations obtained by imaging. Cardiomyocyte monitoring method characterized by the above.
ことを特徴とする請求項２に記載した心筋細胞のモニター方法。 The above computer distinguishes cardiomyocytes on the image by pattern recognition using a neural network, and extracts a change area between the images by performing a difference process on the vicinity of the cardiomyocytes between the two images of the plurality of images. The cardiomyocyte monitoring method according to claim 2, wherein the beating area of the cardiomyocytes is specified on the image, and the area of the beating area is obtained by counting the number of pixels of the specified portion.
作成された結合画像を上記複数の画像の各々として上記のコンピュータが入力を受け、ビーティング域を特定することを特徴とする請求項２または３に記載した心筋細胞のモニター方法。 The imaging range in the culture vessel is moved so that there is an overlap in the range, the imaging means captures the cells or cell population before and after the movement, and the image combining means that receives the input about the captured images moves Create a combined image by joining the previous and next images,
The cardiomyocyte monitoring method according to claim 2 or 3, wherein the computer receives the generated combined image as each of the plurality of images and specifies a beating area.
心筋細胞を含む培養容器中の細胞または細胞集団を時間間隔をおいて撮像する撮像手段と、時間差のある複数の画像について撮像手段より入力を受け、それら複数の画像間での変化領域を抽出することにより、心筋細胞のビーティング域を画像上で特定するコンピュータとを含むことを特徴とする心筋細胞のモニター装置。 An apparatus for monitoring cardiomyocytes in a culture vessel,
An imaging means for imaging cells or cell populations in a culture container containing cardiomyocytes at time intervals and a plurality of images with time differences received from the imaging means, and a change area between the plurality of images is extracted. And a computer for identifying the beating area of the cardiomyocytes on the image.
The cardiomyocyte monitoring apparatus according to claim 5 or 6, wherein the moving means moves the imaging means three-dimensionally without moving a culture vessel.
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Legal Events
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