JP2007106688A - Agent for suppressing expression of cytokine-related gene and chemokine-related gene - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒアルロナンを有効成分とするサイトカイン関連遺伝子及びケモカイン関連遺伝子の発現抑制剤に関する。 The present invention relates to a cytokine-related gene and a chemokine-related gene expression inhibitor that contain hyaluronan as an active ingredient.
ヒアルロナンは、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとの２糖繰り返し単位から構成されている長鎖の多糖であり、一方、オリゴ糖も知られている。ヒアルロナンは鶏冠、さい体、皮膚、関節液などの生体組織からの抽出液、またはストレプトコッカス属の細菌を用いる発酵法などにより製造され、毒性学的および免疫学的作用が存在しないため、薬剤や化粧品として利用されており、例えばヒアルロナンの関節内注射による関節炎の治療がよく知られている。以下の説明において、４糖のヒアルロナンをHA4と記載する。 Hyaluronan is a long-chain polysaccharide composed of disaccharide repeating units of D-glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine, while oligosaccharides are also known. Hyaluronan is produced by extraction from biological tissues such as chicken crowns, corpses, skin, joint fluid, or fermentation methods using bacteria belonging to the genus Streptococcus, and has no toxicological or immunological effects. For example, treatment of arthritis by intraarticular injection of hyaluronan is well known. In the following description, the tetrasaccharide hyaluronan is referred to as HA4.
HA4には、臓器保存、肝障害および胃潰瘍に対する治療・抑制効果があることが報告されている（特許文献１参照）。また、HA4には、ストレス蛋白発現増強作用および細胞死
抑制作用があることが知られている（非特許文献１参照）。さらに、ヒアルロン酸オリゴ糖には、さまざまな生理活性があることも報告されている（非特許文献２参照）。
HA4 has been reported to have therapeutic / suppressive effects on organ preservation, liver damage, and gastric ulcers (see Patent Document 1). Moreover, it is known that HA4 has a stress protein expression enhancing action and a cell death suppressing action (see Non-Patent Document 1). Furthermore, it has also been reported that hyaluronic acid oligosaccharides have various physiological activities (see Non-Patent Document 2).
一方、サイトカインは、細胞から放出され、免疫、炎症反応の制御作用、抗ウィルス作用、抗腫瘍作用、細胞増殖・分化の調節作用といった細胞間相互作用を媒介する蛋白性因子（多くは糖タンパク質）を総称した呼称である。サイトカインとしては、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子（TNF）等が知られている。また、ケモカインは、白血球走化性を有する因子群（chemotactic cyokine）として定義される。本明細書において、ケモカインはサイトカインに含まれない概念として定義する。 Cytokines, on the other hand, are released from cells and are protein factors (mostly glycoproteins) that mediate cell-to-cell interactions such as immunity, inflammatory response control, antiviral, antitumor, and cell growth / differentiation regulation. Is a generic name. As cytokines, interleukin, interferon, tumor necrosis factor (TNF) and the like are known. A chemokine is defined as a group of chemotactic cyokine having leukocyte chemotaxis. In this specification, chemokine is defined as a concept not included in cytokines.
また、サイトカイン関連遺伝子とは、サイトカインをコードする遺伝子及び当該遺伝子の発現を調節する遺伝子の総称である。サイトカイン関連遺伝子としては種々知られており、サイトカイン関連遺伝子の発現亢進と疾患との関連性が指摘されている。サイトカイン関連遺伝子の発現を効果的に抑制することで、各種疾患の治療に大いに寄与することが指摘されている。
そこで、本発明は、新規なサイトカイン関連遺伝子及びケモカイン関連遺伝子の発現抑制剤を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a novel cytokine-related gene and chemokine-related gene expression inhibitor.
上述した目的を達成した本発明に係る、サイトカイン関連遺伝子ケモカイン関連遺伝子の発現抑制剤は、ヒアルロナンを有効成分として含有する。すなわち、ヒアルロナンにはサイトカイン関連遺伝子及びケモカイン関連遺伝子の発現を抑制する新規な機能があることを見いだし、本発明を完成するに至った。 The expression inhibitor of a cytokine-related gene chemokine-related gene according to the present invention that has achieved the above-described object contains hyaluronan as an active ingredient. That is, it has been found that hyaluronan has a novel function of suppressing the expression of cytokine-related genes and chemokine-related genes, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明に係るサイトカイン関連遺伝子及びケモカイン関連遺伝子の発現抑制剤は、ヒアルロナンを有効成分とする。ここでヒアルロナンとしては、-Ｄ-グルクロン酸-β-１,３-D-Ｎ-アセチルグルコサミン-β-１,４-を１単位とし、これを２個含む４糖であることが望ましい。また、上記サイトカイン関連遺伝子として、特に炎症性のサイトカインに関連する遺伝子の発現を抑制することができる。 That is, the cytokine-related gene and chemokine-related gene expression inhibitor according to the present invention contains hyaluronan as an active ingredient. Here, the hyaluronan is preferably a tetrasaccharide containing 1 unit of -D-glucuronic acid-β-1,3-DN-acetylglucosamine-β-1,4-. In addition, as the cytokine-related gene, expression of a gene particularly related to an inflammatory cytokine can be suppressed.
本発明に係るサイトカイン関連遺伝子及びケモカイン関連遺伝子の発現抑制剤は、ヒアルロナンを有効成分とするものであるから、比較的安価にかつ容易に大量生産できる利点がある。また、ヒアルロナンは毒性や抗原性がほとんどないこと、生体が元来有している治療作用や疾患の防止作用を増強することから副作用の極めて少ない抑制剤として期待される。したがって、本発明によれば、サイトカイン関連遺伝子及びケモカイン関連遺伝子の発現亢進に起因する疾患の治療に有効な新規な薬剤を提供することができる。 Since the expression inhibitor of cytokine-related gene and chemokine-related gene according to the present invention contains hyaluronan as an active ingredient, it has an advantage that it can be easily mass-produced relatively inexpensively. Hyaluronan is expected to be an inhibitor with very few side effects because it has almost no toxicity and antigenicity, and enhances the therapeutic action and disease prevention action inherent in the living body. Therefore, according to the present invention, it is possible to provide a novel drug effective for the treatment of diseases caused by increased expression of cytokine-related genes and chemokine-related genes.
以下、本発明を詳細に説明する。本発明に係るサイトカイン関連遺伝子及びケモカイン関連遺伝子の発現抑制剤は、種々のサイトカイン関連遺伝子及びケモカイン関連遺伝子の発現を抑制する機能を有する剤である。サイトカイン関連遺伝子及びケモカイン関連遺伝子の発現を抑制するとは、未処理の動物細胞における当該遺伝子の発現量と、本剤で処理した動物細胞における当該遺伝子の発現量とを比較したときに、後者の発現量が有意に小であることを意味する。発現量は、多数のプローブDNAが基板に固定化されてなるDNAチップを使用して測定することができる。 Hereinafter, the present invention will be described in detail. The expression inhibitor of cytokine-related genes and chemokine-related genes according to the present invention is an agent having a function of suppressing the expression of various cytokine-related genes and chemokine-related genes. Suppressing the expression of cytokine-related genes and chemokine-related genes is the expression of the latter when comparing the expression level of the gene in untreated animal cells with the expression level of the gene in animal cells treated with this drug. Means that the amount is significantly smaller. The expression level can be measured using a DNA chip in which a large number of probe DNAs are immobilized on a substrate.
以下の説明において、本発明に係るサイトカイン関連遺伝子及びケモカイン関連遺伝子の発現抑制剤を単に薬剤と称する。 In the following description, the cytokine-related gene and chemokine-related gene expression inhibitor according to the present invention is simply referred to as a drug.
本発明に係る薬剤に含まれるヒアルロナンとしては、基本的にはβ−Ｄ−グルクロン酸の１位とβ−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンの３位とが結合した２糖単位を少なくとも１個含む２糖以上のものでかつβ−Ｄ−グルクロン酸とβ−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとから基本的に構成されるものであれば、２糖単位が１個または複数個結合したものにそれらの要素が結合した糖であってもよく、またこれらの誘導体、例えば、アシル基等の加水分解性保護基を有したもの等も使用し得る。該糖は不飽和糖であってもよく、不飽和糖としては、非還元末端糖、通常、グルクロン酸の４，５位炭素間が不飽和のもの等が挙げられる。本発明で使用するヒアルロナンとしては、具体的には動物等の天然物から抽出されたもの、微生物を培養して得られたもの、化学的もしくは酵素的に合成されたものなどいずれも使用することができる。例えば鶏冠、さい体、皮膚、関節液などの生体組織から公知の抽出法と精製法によって得ることができる。またストレプトコッカス属の細菌等を用いた発酵法によっても製造できる。 The hyaluronan contained in the drug according to the present invention basically includes at least one disaccharide unit in which the 1-position of β-D-glucuronic acid and the 3-position of β-D-N-acetylglucosamine are bonded. As long as it is more than sugar and is basically composed of β-D-glucuronic acid and β-DN-acetylglucosamine, those elements are combined with one or more disaccharide units combined. May be used, and derivatives thereof such as those having a hydrolyzable protecting group such as an acyl group can also be used. The sugar may be an unsaturated sugar, and examples of the unsaturated sugar include non-reducing terminal sugars, usually those in which the 4- and 5-position carbons of glucuronic acid are unsaturated. As the hyaluronan used in the present invention, specifically, those extracted from natural products such as animals, those obtained by culturing microorganisms, those synthesized chemically or enzymatically, etc. should be used. Can do. For example, it can be obtained by known extraction and purification methods from biological tissues such as chicken crown, corpse, skin, and joint fluid. It can also be produced by a fermentation method using Streptococcus bacteria or the like.
本発明においては、ヒアルロナンオリゴ糖もヒアルロナンに包含され、上記２糖単位１個からなる２糖およびその誘導体のような低分子量のヒアルロナンから、重量平均分子量４００万程度の高分子量のヒアルロナンまで使用することができる。好ましくは組織における浸透性などの点で優れる重量平均分子量３８０程度〜９００，０００程度のヒアルロナンが挙げられ、より好ましくは２〜２０糖程度のヒアルロナンを挙げることができる。 In the present invention, hyaluronan oligosaccharides are also included in hyaluronan, and use from low molecular weight hyaluronan such as the above-mentioned disaccharide consisting of one disaccharide unit and its derivatives to high molecular weight hyaluronan having a weight average molecular weight of about 4 million. be able to. Preferably, hyaluronan having a weight average molecular weight of about 380 to 900,000, which is excellent in terms of permeability in tissues, and the like, more preferably about 2 to 20 sugars.
ヒアルロナンのうち分子量の低いものは、具体的には、酵素分解法、アルカリ分解法、加熱処理法、超音波処理法(Biochem., 33(1994)p6503-6507)等の公知の方法によってヒアルロナンを低分子化する方法、化学的もしくは酵素的に合成する方法(Glycoconjugate J., (1993)p435-439、WO93/20827) などで製造することが好ましい。例えば酵素分解法としては、ヒアルロナン分解酵素（ヒアルロニダーゼ（睾丸由来）、ヒアルロニダーゼ（Streptomyces由来）、ヒアルロニダーゼＳＤなど）、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣII、コンドロイチナーゼＡＣIII 、コンドロイチナーゼＡＢＣなどのヒアルロナンを分解する酵素をヒアルロナンに作用させてヒアルロナンオリゴ糖を生成する方法（新生化学実験講座「糖質II−プロテオグリカンとグリコサミノグリカン−」p244-248、1991年発行、東京化学同人 参照）などが挙げられる。 Specifically, hyaluronan having a low molecular weight can be obtained by known methods such as enzymatic decomposition, alkaline decomposition, heat treatment, and ultrasonic treatment (Biochem., 33 (1994) p6503-6507). It is preferably produced by a method of reducing the molecular weight, a method of chemically or enzymatically synthesizing (Glycoconjugate J., (1993) p435-439, WO93 / 20827). For example, hyaluronan degrading enzymes (hyaluronidase (derived from testicles), hyaluronidase (derived from Streptomyces), hyaluronidase SD, etc.), chondroitinase AC, chondroitinase ACII, chondroitinase ACIII, chondroitinase ABC, etc. A method to produce hyaluronan oligosaccharides by causing an enzyme that degrades hyaluronan to produce hyaluronan oligosaccharides (see Shinsei Chemistry Laboratory "Carbohydrate II-Proteoglycans and Glycosaminoglycans" p244-248, published in 1991, Tokyo Chemical Dojin) Can be mentioned.
また、アルカリ分解法としては、例えばヒアルロナンの溶液に１Ｎ程度の水酸化ナトリウム等の塩基を加え、数時間加温して、低分子化させた後、塩酸等の酸を加えて中和して、低分子量のヒアルロナンを得る方法などが挙げられる。本発明で用いるヒアルロナンは、塩の形態を包含し、製剤上の必要に応じて、その薬学上許容できる塩を用いることができる。例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、トリ（ｎ−ブチル）アミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、アミノ酸塩等のアミン塩などであることができる。 As an alkali decomposition method, for example, a base such as about 1N sodium hydroxide is added to a hyaluronan solution, heated for several hours to lower the molecular weight, and then neutralized by adding an acid such as hydrochloric acid. And a method for obtaining a low molecular weight hyaluronan. Hyaluronan used in the present invention includes a salt form, and a pharmaceutically acceptable salt thereof can be used as necessary in the preparation. For example, alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, amine salts such as tri (n-butyl) amine salt, triethylamine salt, pyridine salt and amino acid salt Can do.
本発明の薬剤は、ある分子量のヒアルロナン単独又は種々の分子量のヒアルロナンを組み合わせたものなど特に限定することなく使用できる。本発明の薬剤は、ヒアルロナンを有効成分とするものであり、その有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって生体に悪影響を与えることなく、ある種の活性化サイトカイン及びケモカイン関連遺伝子の発現を抑制することができる。 The drug of the present invention can be used without particular limitation, such as hyaluronan having a certain molecular weight alone or a combination of hyaluronan having various molecular weights. The agent of the present invention comprises hyaluronan as an active ingredient, and expression of certain activated cytokines and chemokine-related genes without adversely affecting the living body by administering an effective amount thereof to mammals including humans. Can be suppressed.
本発明の薬剤は、ヒアルロナン又はその塩を、そのまままたは必要に応じて担体、賦形剤、その他の添加物と共に、経口的あるいは非経口的に投与（関節内投与、静脈内、筋肉内、皮下などの組織内投与（注射）、経腸投与、経皮投与など）するための医薬品として、任意の剤形に製剤化することが可能であり、任意の投与方法で患者に投与される。特に、本発明に係る薬剤は、注射剤及び経口製剤とすることが好ましい。 The agent of the present invention is administered hyaluronan or a salt thereof, as it is or as necessary, with a carrier, excipient, or other additive, orally or parenterally (intra-articular administration, intravenous, intramuscular, subcutaneous). As a pharmaceutical for administration (injection), enteral administration, transdermal administration, etc.), it can be formulated into any dosage form and administered to a patient by any administration method. In particular, the drug according to the present invention is preferably an injection or an oral preparation.
経口製剤としては、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤等の固形製剤；シロップ剤、エリキシル剤、乳剤等の液状製剤を挙げることができる。散剤は、例えば、乳糖、デンプン、結晶セルロース、乳酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水ケイ酸等の賦形剤と混合して得ることができる。顆粒剤は、上記賦形剤のほか、必要に応じ、例えば白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤や、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の結合剤や、カルボキシメチルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤をさらに加え、湿式又は乾式で造粒して得ることができる。錠剤は、上記散剤又は顆粒剤をそのまま、或いはステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤を加えて打錠して得ることができる。また、上記錠剤又は顆粒剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタアクリル酸メチルコポリマー等の腸溶性基剤で被覆し、或いはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油等で被覆し、これらを腸溶性或いは持続性製剤にすることができる。硬カプセル剤は、上記散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填して得ることができる。また軟カプセル剤は、ヒアルロナン又はその塩を、グリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油等に混合し、これをゼラチン膜で被覆して得ることができる。シロップ剤は、白糖、ソルビトール、グルセリン等の甘味剤とヒアルロナン又はその塩とを、水に溶解して得ることができる。また、甘味剤及び水のほかに、精油、エタノール等を加えてエリキシル剤とするか、或いはアラビアゴム、トラガカント、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウム等を加えて乳剤又は懸濁剤にすることができる。またこれらの液状製剤には必要に応じ、矯味剤、着色剤、保存剤等を加えることができる。 Examples of oral preparations include solid preparations such as powders, granules, capsules and tablets; liquid preparations such as syrups, elixirs and emulsions. The powder can be obtained by mixing with excipients such as lactose, starch, crystalline cellulose, calcium lactate, calcium hydrogen phosphate, magnesium aluminate metasilicate, and silicic anhydride. In addition to the above excipients, the granule is optionally combined with a binder such as sucrose, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, a binder such as carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose calcium, carboxymethylrose, carboxymethylcellulose calcium, etc. Further, a disintegrant may be added and granulated by wet or dry method. Tablets can be obtained by compressing the powder or granules as they are or by adding a lubricant such as magnesium stearate or talc. The tablet or granule is coated with an enteric base such as hydroxypropylmethylcellulose phthalate or methyl methacrylate copolymer, or coated with ethylcellulose, carnauba wax, hardened oil, etc. can do. A hard capsule can be obtained by filling a hard capsule with the above powder or granule. Soft capsules can be obtained by mixing hyaluronan or a salt thereof with glycerin, polyethylene glycol, sesame oil, olive oil or the like and coating it with a gelatin film. A syrup can be obtained by dissolving a sweetener such as sucrose, sorbitol, and glycerin and hyaluronan or a salt thereof in water. In addition to sweeteners and water, essential oils, ethanol and the like can be added to make elixirs, or gum arabic, tragacanth, polysorbate 80, sodium carboxymethylcellulose and the like can be added to make emulsions or suspensions. Moreover, a corrigent, a coloring agent, a preservative, etc. can be added to these liquid preparations as needed.
非経口製剤としては、注射剤、直腸投与剤、ペッサリー、皮膚外用剤、吸入剤、エアゾール剤、点眼剤等を挙げることができる。注射剤は、ヒアルロナン又はその塩に塩酸、水酸化ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等のｐＨ調節剤；塩化ナトリウムウム、ブドウ糖等の等張化剤；及び注射用蒸留水を加え、滅菌濾過した後、アンプルに充填して得ることができる。また、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチン等を加えて真空凍結乾燥し、用時溶解型の注射剤とすることができる。またヒアルロナン又はその塩にレシチン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の乳化剤を加えた後、水中で乳化された注射用乳剤とすることもできる。 Examples of parenteral preparations include injections, rectal administration agents, pessaries, external preparations for skin, inhalants, aerosols, eye drops and the like. Injections include hyaluronan or salts thereof, pH regulators such as hydrochloric acid, sodium hydroxide, lactic acid, sodium lactate, sodium monohydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate; isotonic agents such as sodium chloride and glucose; and It can be obtained by adding distilled water for injection, sterilizing and filtering and then filling ampoules. Further, mannitol, dextrin, cyclodextrin, gelatin and the like can be added and lyophilized in a vacuum to obtain an injection that can be dissolved at the time of use. Moreover, after adding an emulsifier, such as lecithin, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, to hyaluronan or its salt, it can also be set as the emulsion for injection emulsified in water.
直腸投与剤は、ヒアルロナン又はその塩にカカオ脂肪酸のモノ、ジ又はトリグリセリド、ポリエチレングリコール等の坐剤用基剤を加えた後、加温して溶解し、これを型に流し込んで冷却するか、或いはヒアルロナン又はその塩をポリエチレングリコール、大豆油等に混合した後、ゼラチン膜で被覆して得ることができる。皮膚外用剤は、ヒアルロナン又はその塩に、白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコール等を加え、必要に応じて加温し、混練して得ることができる。テープ剤は、ヒアルロナン又はその塩を、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体等の粘着剤と混練し、これを不織布等に展延して得ることができる。吸入剤は、例えば薬学的に許容される不活性ガス等の噴射剤に、ヒアルロナン又はその塩を溶解又は分散し、これを耐圧容器に充填して得ることができる。 For rectal administration, after adding a suppository base such as mono-, di- or triglyceride of cacao fatty acid or polyethylene glycol to hyaluronan or a salt thereof, dissolve by heating, and pour it into a mold to cool, Alternatively, hyaluronan or a salt thereof can be mixed with polyethylene glycol, soybean oil or the like and then coated with a gelatin film. The external preparation for skin can be obtained by adding white petrolatum, beeswax, liquid paraffin, polyethylene glycol or the like to hyaluronan or a salt thereof, and heating and kneading as necessary. The tape agent can be obtained by kneading hyaluronan or a salt thereof with a pressure-sensitive adhesive such as rosin or an alkyl acrylate polymer and spreading it on a nonwoven fabric or the like. The inhalant can be obtained by, for example, dissolving or dispersing hyaluronan or a salt thereof in a propellant such as a pharmaceutically acceptable inert gas and filling the pressure-resistant container.
（投与方法）本発明のヒアルロナンを有効成分とする薬剤の投与方法は、特に限定されないが、静脈内投与、経口投与および関節内投与を挙げることができる。
（投与量）投与量は、対象とする疾患、患者の年令、健康状態、体重等に応じ適宜決定するが、一般には０．０５〜５０mg/kg を１日１回あるはそれ以上に分けて投与する。
（毒性）本発明で使用するヒアルロナンは、医薬としての生物活性を示す投与量において細胞毒性はほとんどもしくは全く認められなかった。
(Administration method) The administration method of the drug comprising the hyaluronan of the present invention as an active ingredient is not particularly limited, and examples thereof include intravenous administration, oral administration and intra-articular administration.
(Dosage) The dosage is appropriately determined according to the target disease, patient age, health condition, body weight, etc. Generally, 0.05 to 50 mg / kg is divided once or more once a day. To administer.
(Toxicity) The hyaluronan used in the present invention showed little or no cytotoxicity at doses showing biological activity as a medicine.
以下、本発明に係る薬剤を、実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, although the chemical | medical agent which concerns on this invention is demonstrated in detail using an Example, the technical scope of this invention is not limited to a following example.
〔実施例１〕
本実施例では、本発明に係る薬剤によるサイトカイン関連遺伝子及びケモカイン関連遺伝子の発現抑制剤を、遺伝子の発現促進・発現抑制をモニターすることができるDNAチップを用いて評価した。
[Example 1]
In this example, the cytokine-related gene and chemokine-related gene expression inhibitors by the drug according to the present invention were evaluated using a DNA chip capable of monitoring gene expression promotion / expression suppression.
実験方法
先ず、１、２群に分けてK562を上記RPMI培地で培養した。両群は、42℃で20分、次いで37℃で30分インキュベートする培養条件とした。なお、２群の培地には、HA4（10ng/ml）を添加した。
Experimental Method First, K562 was cultured in the above RPMI medium divided into 1 and 2 groups. Both groups had culture conditions of incubation at 42 ° C. for 20 minutes and then at 37 ° C. for 30 minutes. Note that HA4 (10 ng / ml) was added to the two groups of media.
次に、培養の後、1000rpmで遠心分離して培地を除去した。得られた細胞を-60℃ディープフリーザーにて保存した。保存した細胞から、次に、定法に従ってRNAを抽出した。抽出したRNAを用いてDNAチップにて遺伝子発現を解析した。DNAチップによる遺伝子発現解析はDNAチップ研究所に外注した。詳細には、DNAチップ研究所製、商品名：AceGene Human Oligo Chip 30K 1 Chip Versionを使用した。 Next, after culture, the medium was removed by centrifugation at 1000 rpm. The obtained cells were stored in a -60 ° C deep freezer. Next, RNA was extracted from the preserved cells according to a conventional method. Gene expression was analyzed with a DNA chip using the extracted RNA. Gene expression analysis using a DNA chip was outsourced to the DNA chip laboratory. In detail, the product name: AceGene Human Oligo Chip 30K 1 Chip Version manufactured by DNA Chip Research Institute was used.
結果
DNAチップによる発現解析の結果、HA4を含む培地で培養した細胞においては、表1にあげる、細胞の賦活に関する多くの遺伝子の発現プロファイルに有意な変化が観察された。
result
As a result of expression analysis using a DNA chip, in cells cultured in a medium containing HA4, significant changes were observed in the expression profiles of many genes related to cell activation listed in Table 1.
表１に示すように、HA4処理によって、複数のサイトカイン関連遺伝子及びケモカイン関連遺伝子の発現が抑制されていることが明らかになった。表１に示したサイトカイン関連遺伝子及びケモカイン関連遺伝子のなかで、IFN-γ遺伝子については、Schroder K, Hertzog PJ, Ravasi T, Hume DA. Interferon-gamma: an overview of signals, mechanisms and functions. J Leukoc Biol. 2004 75(2):163-89.を参照することができる。また、Mig（CXCL9）遺伝子については、Farber JM. Mig and IP-10: CXC chemokines that target lymphocytes. J Leukoc Biol. 1997 61(3):246-57.を参照することができる。また、IL-5遺伝子については、Adachi T, Alam R. The mechanism of IL-5 signal transduction. Am J Physiol. 1998 275(3 Pt 1):C623-33.を参照することができる。さらに、IL-17bについては、Li H, Chen J, Huang A, Stinson J, Heldens S, Foster J, Dowd P, Gurney AL, Wood WI. Cloning and characterization of IL-17B and IL-17C, two new members of the IL-17 cytokine family. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 18 97(2):773-8.を参照することができる。さらにまた、IL-18RAPについては、Cheung H, Chen NJ, Cao Z, Ono N, Ohashi PS, Yeh WC. Accessory protein-like is essential for IL-18-mediated signaling. J Immunol. 2005 174(9):5351-7.を参照することができる。さらにまた、CCL28については、Wang W, Soto H, Oldham ER, Buchanan ME, Homey B, Catron D, Jenkins N, Copeland NG, Gilbert DJ, Nguyen N, Abrams J, Kershenovich D, Smith K, McClanahan T, Vicari AP, Zlotnik A. Identification of a novel chemokine (CCL28), which binds CCR10 (GPR2). J Biol Chem. 2000 275(29):22313-23.を参照することができる。さらにまた、IL-1βについては、Okamura H. IL-1 family (IL-1alpha/beta, IL-1Ra, IL-18), IL-16, IL-17. Nippon Rinsho. 2005 63 Suppl 4:226-33.を参照することができる。さらにまた、IFN-ω1については、Bekisz J, Schmeisser H, Hernandez J, Goldman ND, Zoon KC. Human interferons alpha, beta and omega. Growth Factors. 2004 22(4):243-51.及びAdolf GR, Maurer-Fogy I, Kalsner I, Cantell K. Purification and characterization of natural human interferon omega 1. Two alternative cleavage sites for the signal peptidase. J Biol Chem. 1990 265(16):9290-5.を参照することができる。 As shown in Table 1, it was revealed that the expression of a plurality of cytokine-related genes and chemokine-related genes was suppressed by HA4 treatment. Among the cytokine-related genes and chemokine-related genes shown in Table 1, for IFN-γ genes, Schroder K, Hertzog PJ, Ravasi T, Hume DA. Interferon-gamma: an overview of signals, mechanisms and functions. Biol. 2004 75 (2): 163-89. For the Mig (CXCL9) gene, reference can be made to Farber JM. Mig and IP-10: CXC chemokines that target lymphocytes. J Leukoc Biol. 1997 61 (3): 246-57. For the IL-5 gene, Adachi T, Alam R. The mechanism of IL-5 signal transduction. Am J Physiol. 1998 275 (3 Pt 1): C623-33. Furthermore, for IL-17b, Li H, Chen J, Huang A, Stinson J, Heldens S, Foster J, Dowd P, Gurney AL, Wood WI.Cloning and characterization of IL-17B and IL-17C, two new members of the IL-17 cytokine family. Proc Natl Acad Sci US A. 2000 18 97 (2): 773-8. Furthermore, for IL-18RAP, Cheung H, Chen NJ, Cao Z, Ono N, Ohashi PS, Yeh WC. Accessory protein-like is essential for IL-18-mediated signaling. J Immunol. 2005 174 (9): Reference may be made to 5351-7. Furthermore, for CCL28, Wang W, Soto H, Oldham ER, Buchanan ME, Homey B, Catron D, Jenkins N, Copeland NG, Gilbert DJ, Nguyen N, Abrams J, Kershenovich D, Smith K, McClanahan T, Vicari AP, Zlotnik A. Identification of a novel chemokine (CCL28), which binds CCR10 (GPR2). J Biol Chem. 2000 275 (29): 22313-23. Furthermore, for IL-1β, Okamura H. IL-1 family (IL-1alpha / beta, IL-1Ra, IL-18), IL-16, IL-17. Nippon Rinsho. 2005 63 Suppl 4: 226- See 33. Furthermore, for IFN-ω1, Bekisz J, Schmeisser H, Hernandez J, Goldman ND, Zoon KC. Human interferons alpha, beta and omega.Growth Factors. 2004 22 (4): 243-51. And Adolf GR, Maurer -Fogy I, Kalsner I, Cantell K. Purification and characterization of natural human interferon omega 1. Two alternative cleavage sites for the signal peptidase. J Biol Chem. 1990 265 (16): 9290-5.
考察
本実施例において、HA4の処理により、サイトカイン関連遺伝子及びケモカイン関連遺伝子の発現抑制が認められた。本例で使用したK562細胞は、白血球系の細胞であることから、本来的にサイトカイン関連遺伝子及びケモカイン関連遺伝子の発現がある。HA4はHsp72発現を増強させる（Xu H, Ito T, Tawada A, Maeda H, Yamanokuchi H, Isahara K, Yoshida K, Uchiyama Y, Asari A. Effect of hyaluronan oligosaccharides on the expression of heat shock protein 72. J Biol Chem, 2002 10;277(19):17308-14.）ことから、In vivoでは、そのHsp72がγδT細胞に認識されてIL-10産生がおこり、そのIL-10が各種炎症性サイトカインやケモカイン産生を抑制することが考えられる。しかし、本実施例においては、γδT細胞を含まないことから、炎症や自己免疫疾患に関与するサイトカイン関連遺伝子及びケモカイン関連遺伝子の発現がHA4処理により、直接抑制されたことを意味する。
Discussion In this example, suppression of the expression of cytokine-related genes and chemokine-related genes was observed by treatment with HA4. Since the K562 cells used in this example are leukocyte cells, they naturally have expression of cytokine-related genes and chemokine-related genes. HA4 enhances Hsp72 expression (Xu H, Ito T, Tawada A, Maeda H, Yamanokuchi H, Isahara K, Yoshida K, Uchiyama Y, Asari A. Effect of hyaluronan oligosaccharides on the expression of heat shock protein 72. J Biol Chem, 2002 10; 277 (19): 17308-14.) Therefore, in vivo, Hsp72 is recognized by γδT cells and IL-10 production occurs, and IL-10 produces various inflammatory cytokines and chemokines. It is conceivable to suppress this. However, since γδT cells are not included in this example, it means that the expression of cytokine-related genes and chemokine-related genes involved in inflammation and autoimmune diseases was directly suppressed by HA4 treatment.
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