JP2007099967A - Chemiluminescence substance - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ローダミン-シクロデキストリン-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン結合化合物に関する。本発明のローダミン-シクロデキストリン-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン結合化合物は、化学発光することができる化合物であり、スーパーオキシドアニオンの発光分析用試薬として利用することができ、生体内外のスーパーオキシドアニオンを検出することによる疾病の診断あるいは疾患の研究に寄与するものとして使用できる。 The present invention relates to rhodamine-cyclodextrin-imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one linked compounds. The rhodamine-cyclodextrin-imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one binding compound of the present invention is a compound capable of chemiluminescence, and can be used as a reagent for luminescence analysis of superoxide anion, It can be used to contribute to diagnosis of diseases or research of diseases by detecting superoxide anions inside and outside the living body.
これまでイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類は、種々合成されており、それらは、化学発光試薬として有用であることが知られている。これらのイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類の中でCLA、 MCLA、 FCLAは、スーパーオキシドアニオンの発光分析試薬としても用いられ、市販（東京化成工業株式会社）されている。しかし、これらの発光試薬から誘導される発光は、水溶液中、中性条件下ではCLAおよびMCLAでは青色であり、FCLAでは緑色の発光であり、被検体中の夾雑物による消光や被検体からの光透過性が低いという欠点がある。又、以下に示す特許文献が公知であるが、これらの発光試薬では、使用できる発光波長（発光色）の範囲が狭く、分析の多様化のためにはさらに長波長域での発光、例えば黄色、橙色、紅色、赤色の発光が可能な発光試薬が望まれる。 Until now, various imidazo [1,2-a] pyrazin-3-ones have been synthesized, and they are known to be useful as chemiluminescent reagents. Among these imidazo [1,2-a] pyrazin-3-ones, CLA, MCLA, and FCLA are also used as luminescence analysis reagents for superoxide anions and are commercially available (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.). However, the luminescence derived from these luminescent reagents is blue in CLA and MCLA under neutral conditions in aqueous solution, and green in FCLA, and is quenched by impurities in the specimen and from the specimen. There is a drawback of low light transmission. In addition, the following patent documents are known. However, these luminescent reagents have a narrow range of luminescent wavelengths (luminescent colors) that can be used. For diversification of analysis, luminescence in a longer wavelength range, for example, yellow A luminescent reagent capable of emitting orange, red and red light is desired.
本発明は、発光波長の長い、紅色、赤色の発光が可能な発光化合物を提供し、さらには、発光波長を長くすることにより被検体からの透過性を高め、高い発光強度を示し且つ高い検出感度を有するスーパーオキシドアニオンの発光分析用試薬を提供する。さらには、スーパーオキシドアニオンの発光分析法を提供する。 The present invention provides a luminescent compound having a long emission wavelength and capable of emitting red and red, and further, by increasing the emission wavelength, the permeability from the analyte is increased, the emission intensity is high, and the detection is high. Provided is a reagent for luminescence analysis of superoxide anion having sensitivity. Furthermore, a method for analyzing the emission of superoxide anion is provided.
本発明者は、上述のような背景において、従来の化合物よりも発光波長の長い発光試薬を創出するために鋭意検討した結果、紅色〜赤色発光を示し、高い発光強度を示し、且つ高い検出感度でスーパーオキシドアニオンを検出する化合物を合成し、本発明を完成したものである。
すなわち本発明は、まず第１には、ローダミン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類がシクロデキストリンを介して共有結合してなる下記の化式（１）で示されるローダミン-シクロデキストリン-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン結合化合物（ただし、式中、R1は水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシル基、カルボキシル基、ホルミル基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基または複素環であり、R2は、水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシル基、カルボキシル基、ホルミル基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基または複素環であり、R3は、水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシル基、カルボキシル基、ホルミル基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基または複素環であり、R4は、水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシル基、カルボキシル基、ホルミル基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基または複素環であり、R1、R2、R3、R4のいずれかにローダミン類が共有結合している。ローダミン類とは、例えば、ローダミン123、ローダミンB、ローダミン6G、ローダミン19、ローダミン110、ローダミン575、スルホローダミン101、スルホローダミンB、スルホローダミンG等およびローダミン誘導体を示す）。シクロデキストリンとしては、グルコピラノースが6分子から16分子結合した環状性オリゴ糖を用いることができる。
That is, the present invention firstly includes rhodamine represented by the following chemical formula (1), wherein rhodamines and imidazo [1,2-a] pyrazin-3-ones are covalently bonded via cyclodextrin. -Cyclodextrin-imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one linked compound (wherein R 1 is a hydrogen atom, alkyl group, aryl group, halogen atom, alkoxyl group, carboxyl group, formyl group, alkyl) An oxycarbonyl group, an aryloxycarbonyl group, an alkylcarbonyl group, an arylcarbonyl group or a heterocyclic ring, and R 2 is a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, a halogen atom, an alkoxyl group, a carboxyl group, a formyl group, an alkyloxycarbonyl A group, an aryloxycarbonyl group, an alkylcarbonyl group, an arylcarbonyl group or a heterocyclic ring, and R 3 is hydrogen An atom, an alkyl group, an aryl group, a halogen atom, an alkoxyl group, a carboxyl group, a formyl group, an alkyloxycarbonyl group, an aryloxycarbonyl group, an alkylcarbonyl group, an arylcarbonyl group or a heterocyclic ring, and R 4 is a hydrogen atom, An alkyl group, an aryl group, a halogen atom, an alkoxyl group, a carboxyl group, a formyl group, an alkyloxycarbonyl group, an aryloxycarbonyl group, an alkylcarbonyl group, an arylcarbonyl group or a heterocyclic ring; R 1 , R 2 , R 3 , Rhodamines are covalently bonded to any of R 4. Examples of rhodamines include rhodamine 123, rhodamine B, rhodamine 6G, rhodamine 19, rhodamine 110, rhodamine 575, sulforhodamine 101, sulforhodamine B, sulforhodamine. G etc. and rhodamine induction Shows the body). As the cyclodextrin, a cyclic oligosaccharide in which 6 to 16 molecules of glucopyranose are bonded can be used.
本発明の代表的な例として次の化式２、化式３、化式４および化式５で表わされるスルホローダミン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類がシクロデキストリンを介して共有結合してなるスルホローダミン-シクロデキストリン-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン結合化合物を例示できる。ただし化式３および化式５におけるｍは０から６の整数である。
次に本発明は、上述のローダミン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類がシクロデキストリンを介して共有結合してなるローダミン-シクロデキストリン-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン結合化合物を有効成分として含有することを特徴とするスーパーオキシドアニオンの発光検出試薬に関わる。 Next, the present invention provides a rhodamine-cyclodextrin-imidazo [1,2-a] pyrazine obtained by covalently bonding the above rhodamines and imidazo [1,2-a] pyrazin-3-ones via a cyclodextrin. The present invention relates to a superoxide anion luminescence detection reagent comprising a -3-one binding compound as an active ingredient.
さらに本発明は、上述の発光試薬を検体溶液と接触させた後、発光強度を測定することを特徴とするスーパーオキシドアニオンの分析方法である。
なお、本明細書中で「アルキル基」とは、置換基を有していてもよい炭素数1〜20個の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基をいい、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、イコサニルなどの直鎖の基または、分岐状に結合した基をいう。
Furthermore, the present invention is a method for analyzing a superoxide anion, wherein the luminescence intensity is measured after contacting the above-mentioned luminescent reagent with a sample solution.
In the present specification, the “alkyl group” means a linear or branched alkyl group having 1 to 20 carbon atoms which may have a substituent, for example, methyl, ethyl, propyl , Butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, nonadecyl, icosanyl, or a group bonded in a branched manner.
本明細書で「アルコキシル基」とは、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、メチキシエトキシ、メトキシプロポキシ、エトキシエトキシ、エトキシプロポキシ、メトキシエトキシエトキシ基などの炭素数1〜20個のアルコキシル基が直鎖上にまたは分岐状に結合したものなどをあげることができる。又、本明細書で「アリール基」とは、フェニル、ナフチルなどの炭素数6〜20個の芳香族炭化水素をあげることができる。 In the present specification, the term “alkoxyl group” means, for example, methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, pentyloxy, hexyloxy, methoxyethoxy, methoxypropoxy, ethoxyethoxy, ethoxypropoxy, methoxyethoxyethoxy group, etc. And those in which the alkoxyl group is linearly or branchedly bonded. Further, in the present specification, the “aryl group” includes aromatic hydrocarbons having 6 to 20 carbon atoms such as phenyl and naphthyl.
さらに、本明細書で「複素環」とは、例えば、フラン、チオフェン、ピロール、オキサゾール、イソオキサゾール、トリアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、ピラゾール、フラザン、ピラン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジンなどをあげることができる。又、本明細書で「ハロゲン原子」とは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などをあげることができる。次に、本明細書で「ローダミン類」とは、例えば、ローダミン123、ローダミンB、ローダミン6G、ローダミン19、ローダミン110、ローダミン575、スルホローダミン101、スルホローダミンB、スルホローダミンG等およびそれらの誘導体をあげることができる。
本明細書で「シクロデキストリン」とは，D-グルコピラノースがa-1,4結合した非還元性の環状オリゴ糖であり、グルコピラノース6分子、7分子、８分子からなるものをa-、b-、g-シクロデキストリンと称す。本発明のシクロデキストリンとしては、これらのシクロデキストリンの他に、グルコピラノースが9分子から16分子結合した環状性オリゴ糖を用いることができる。
Further, in the present specification, “heterocycle” includes, for example, furan, thiophene, pyrrole, oxazole, isoxazole, triazole, isothiazole, imidazole, pyrazole, furazane, pyran, pyridine, pyridazine, pyrimidine, pyrazine and the like. Can do. In the present specification, examples of the “halogen atom” include fluorine, chlorine, bromine, iodine and the like. Next, in the present specification, “rhodamines” means, for example, rhodamine 123, rhodamine B, rhodamine 6G, rhodamine 19, rhodamine 110, rhodamine 575, sulforhodamine 101, sulforhodamine B, sulforhodamine G, and their derivatives. Can give.
In the present specification, “cyclodextrin” is a non-reducing cyclic oligosaccharide in which D-glucopyranose is bonded to a-1,4, and is composed of 6 molecules, 7 molecules and 8 molecules of glucopyranose. It is called b-, g-cyclodextrin. As the cyclodextrin of the present invention, in addition to these cyclodextrins, cyclic oligosaccharides in which 9 to 16 molecules of glucopyranose are bonded can be used.
本発明によって、従来の化合物よりも発光波長が長く紅色〜赤色の発光を誘導する化合物を開発し、さらには、紅色〜赤色発光を示し、高い発光強度を示し且つ高い感度でスーパーオキシドアニオンを検出する試薬およびその製造法さらには分析方法が提供される。この発明のスーパーオキシドアニオンの分析用試薬は、スーパーオキシドアニオンと反応して高い発光強度を示し、最大発光波長約610nmであり効率的なスーパーオキシドアニオンの分析が可能となる。 According to the present invention, a compound that has a longer emission wavelength than conventional compounds and induces red to red light emission, and further exhibits red to red light emission, exhibits high light emission intensity, and detects superoxide anion with high sensitivity. And a method for producing the same, as well as an analytical method are provided. The superoxide anion analysis reagent of the present invention reacts with the superoxide anion to exhibit high emission intensity, has a maximum emission wavelength of about 610 nm, and enables efficient analysis of the superoxide anion.
本発明の紅色〜赤色の発光を誘導する発光化合物は、少なくとも、ローダミン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類がシクロデキストリンを介して共有結合してなるローダミン-シクロデキストリン-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン結合化合物を含有することを特徴とするものである。この時、ローダミン類とシクロデキストリンおよびシクロデキストリンとイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類は、直接共有結合しているもののみならず、適当なスペーサー分子鎖を介して共有結合しているものであってもよい。さらに本発明のスーパーオキシドアニオンの発光分析用試薬は、ローダミン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類がシクロデキストリンを介して共有結合してなるローダミン-シクロデキストリン-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン結合化合物を有効成分として含有することを特徴とする発光試薬である。 The light-emitting compound for inducing red to red light emission of the present invention is at least rhodamine-cyclodextrin-, wherein rhodamines and imidazo [1,2-a] pyrazin-3-ones are covalently bonded via cyclodextrin. It is characterized by containing an imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one binding compound. At this time, rhodamines and cyclodextrin and cyclodextrin and imidazo [1,2-a] pyrazin-3-ones are not only directly covalently bonded but also covalently bonded through an appropriate spacer molecular chain. It may be. Furthermore, the reagent for luminescence analysis of superoxide anion according to the present invention comprises a rhodamine-cyclodextrin-imidazo [1] wherein rhodamines and imidazo [1,2-a] pyrazin-3-ones are covalently bonded via cyclodextrin. , 2-a] pyrazine-3-one-binding compound as an active ingredient.
具体的には、本発明のスーパーオキシドアニオンの分析用試薬に用いられるローダミン-シクロデキストリン-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン結合化合物としては、上述の化式２、化式３、化式４および化式５のものが好ましい。なお、化式３および化式５におけるｍは０から６の整数である。 Specifically, the rhodamine-cyclodextrin-imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one-binding compound used for the reagent for analyzing the superoxide anion of the present invention includes the above-mentioned Formula 2 and Formula 3 , Formula 4 and Formula 5 are preferred. In Formula 3 and Formula 5, m is an integer from 0 to 6.
本発明においてスーパーオキシドアニオンの分析用試薬の有効成分として使用されるこれらのローダミン-シクロデキストリン-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン結合化合物は、以上のとおりのものであり、その合成法等はとくに限定されない。例えば、下記の例をあげることができる。
工程1は、次の化式６および化式７で示されるシクロデキストリン化合物の混合物と市販のスルホローダミンクロリド；化式８およびスルホローダミンクロリド；化式９との混合物を反応させることによって化式１０、化式１１、化式１２および化式１３を製造するものである。なお、化式６および化式７で示されるシクロデキストリン化合物は、公知の化合物であり（例えばAnal. Biochem.,
325, 185-195 (2004)）、位置異性体の混合物あるいは一種のみの異性体のみでもよい。化式７におけるｍは０から６の整数である。化式８および化式９で示されるスルホローダミンクロリドは、市販のものあるいは独自に製造したものであり、化式８および化式９で示される位置異性体の混合物あるいは一種のみの異性体のみでもよい。化式１０、化式１１、化式１２および化式１３で示される化合物は、位置異性体の混合物あるいは一種のみの異性体のみでもよい。第１工程において使用しうる反応溶媒は四塩化炭素，クロロホルム，塩化メチレン，ベンゼン，トルエン，キシレン，クロロベンゼン，ピリジン，THF，エーテル、DMFのごときハロゲン系溶媒，芳香族炭化水素，エーテル系溶媒，アセトアミド系溶媒、および水、あるいはこれらの混合溶媒から適宜選択されるが、これに限定されるものではない。反応温度は−78℃から溶媒の還流温度の間で選択されるが，好ましくは0℃から６０℃である。反応時間は使用する反応溶媒，反応温度などにより異なるが，1分から12時間の間で適宜選択される。
In the present invention, these rhodamine-cyclodextrin-imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one-binding compounds used as active ingredients of the superoxide anion analysis reagent are as described above, and A synthesis method and the like are not particularly limited. For example, the following examples can be given.
Step 1 comprises reacting a mixture of a cyclodextrin compound represented by Formula 6 and Formula 7 below with a commercially available sulforhodamine chloride; Formula 8 and sulforhodamine chloride; Formula 9 Chemical formula 11, chemical formula 12 and chemical formula 13 are produced. The cyclodextrin compounds represented by Chemical Formula 6 and Chemical Formula 7 are known compounds (for example, Anal. Biochem.,
325, 185-195 (2004)), a mixture of positional isomers or only one isomer. M in Formula 7 is an integer from 0 to 6. The sulforhodamine chloride represented by Chemical Formula 8 and Chemical Formula 9 is commercially available or independently produced, and a mixture of positional isomers represented by Chemical Formula 8 and Chemical Formula 9 or only one isomer alone may be used. Good. The compounds represented by Chemical Formula 10, Chemical Formula 11, Chemical Formula 12 and Chemical Formula 13 may be a mixture of positional isomers or only one isomer. Reaction solvents that can be used in the first step are carbon tetrachloride, chloroform, methylene chloride, benzene, toluene, xylene, chlorobenzene, pyridine, THF, ether, DMF, halogenated solvents, aromatic hydrocarbons, ether solvents, acetamide. The solvent is appropriately selected from a system solvent, water, or a mixed solvent thereof, but is not limited thereto. The reaction temperature is selected between −78 ° C. and the reflux temperature of the solvent, preferably 0 ° C. to 60 ° C. The reaction time varies depending on the reaction solvent used, reaction temperature, etc., but is appropriately selected between 1 minute and 12 hours.
工程２では、化式１０、化式１１、化式１２および化式１３で示される化合物を、位置異性体の混合物あるいは一種のみの異性体として、アンモニア水と反応することにより、化式１４、化式１５、化式１６および化式１７で示される化合物を製造する。化式１４、化式１５、化式１６および化式１７で示される化合物は、位置異性体の混合物あるいは一種の異性体のみでもよい。ここで、化式１５および化式１７におけるｍは０から６の整数である。第２工程において使用しうる反応溶媒は四塩化炭素，クロロホルム，塩化メチレン，ベンゼン，トルエン，キシレン，クロロベンゼン，ピリジン，THF，エーテル、DMFのごときハロゲン系溶媒，芳香族炭化水素，エーテル系溶媒，アセトアミド系溶媒、あるいは水、あるいはこれらの混合溶媒から適宜選択されるが，これに限定されるものではない。反応温度は−78℃から溶媒の還流温度の間で選択されるが，好ましくは0℃から６０℃である。反応時間は使用する反応溶媒，反応温度などにより異なるが，1分から１０日間の間で適宜選択される。 In step 2, the compound represented by the chemical formula 10, the chemical formula 11, the chemical formula 12 and the chemical formula 13 is reacted with ammonia water as a mixture of regioisomers or only one isomer, thereby obtaining the chemical formula 14, The compounds represented by Chemical Formula 15, Chemical Formula 16, and Chemical Formula 17 are produced. The compounds represented by Chemical Formula 14, Chemical Formula 15, Chemical Formula 16 and Chemical Formula 17 may be a mixture of positional isomers or only one kind of isomer. Here, m in Chemical Formula 15 and Chemical Formula 17 is an integer from 0 to 6. Reaction solvents that can be used in the second step are carbon tetrachloride, chloroform, methylene chloride, benzene, toluene, xylene, chlorobenzene, pyridine, THF, ether, DMF, halogen solvents, aromatic hydrocarbons, ether solvents, acetamide. The solvent is appropriately selected from a system solvent, water, or a mixed solvent thereof, but is not limited thereto. The reaction temperature is selected between −78 ° C. and the reflux temperature of the solvent, preferably 0 ° C. to 60 ° C. The reaction time varies depending on the reaction solvent to be used, reaction temperature, etc., but is appropriately selected between 1 minute and 10 days.
工程３は、化式１４、化式１５、化式１６および化式１７で示される化合物と、化式１８で示される化合物とを脱水縮合することにより化式２、化式３、化式４および化式５を製造するものである。化式１４、化式１５、化式１６および化式１７で示される化合物は、位置異性体の混合物あるいは一種の異性体のみでもよい。化式１８で示される化合物は公知の化合物（例えば、Carbohydr Res 1998;306:177-187）であり、化式２、化式３、化式４および化式５で示される化合物は位置異性体であり、混合物あるいは一種の異性体のみでもよい。第3工程において使用しうる反応溶媒は四塩化炭素，クロロホルム，塩化メチレン，ベンゼン，トルエン，キシレン，クロロベンゼン，ピリジン，DFM，THF，エーテル、DMFのごときハロゲン系溶媒，芳香族炭化水素，エーテル系溶媒，アセトアミド系溶媒、あるいは水、あるいはこれらの混合溶媒から適宜選択されるが，これに限定されるものではない。反応温度は−78℃から溶媒の還流温度の間で選択されるが，好ましくは−20℃から100℃の間で選ばれる。縮合剤としては1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド，DCC，6-メチル-2-ニトロ安息香酸無水物などが挙げられるが，これに限定されるものではない。反応時間は使用する反応溶媒，反応温度，縮合剤などにより異なるが，1分から48時間で適宜選択される。 In Step 3, the compounds represented by Formula 14, Formula 15, Formula 16, and Formula 17 and the compound represented by Formula 18 are subjected to dehydration condensation to form Formula 2, Formula 3, and Formula 4 And Formula 5 is produced. The compounds represented by Chemical Formula 14, Chemical Formula 15, Chemical Formula 16 and Chemical Formula 17 may be a mixture of positional isomers or only one kind of isomer. The compound represented by Formula 18 is a known compound (for example, Carbohydr Res 1998; 306: 177-187), and the compounds represented by Formula 2, Formula 3, Formula 4, and Formula 5 are positional isomers. It may be a mixture or only one kind of isomer. The reaction solvents that can be used in the third step are carbon tetrachloride, chloroform, methylene chloride, benzene, toluene, xylene, chlorobenzene, pyridine, DFM, THF, ether, DMF, halogen solvents, aromatic hydrocarbons, ether solvents. , An acetamide-based solvent, water, or a mixed solvent thereof, but is not limited thereto. The reaction temperature is selected between −78 ° C. and the reflux temperature of the solvent, but is preferably selected between −20 ° C. and 100 ° C. Examples of the condensing agent include, but are not limited to, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, DCC, 6-methyl-2-nitrobenzoic anhydride. The reaction time varies depending on the reaction solvent used, reaction temperature, condensing agent, etc., but is appropriately selected from 1 minute to 48 hours.
さらに、本発明のスーパーオキシドアニオンの分析用試薬は、以上のとおりのローダミン-シクロデキストリン-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン結合化合物を有効成分とするものであれば、その他の物質、例えば、溶剤、緩衝剤、安定剤、界面活性剤等を含有してもよい。
そして本発明は、スーパーオキシドアニオンを検出する方法をも提供する。すなわち、本発明のスーパーオキシドアニオンの分析方法では、前記のローダミン-シクロデキストリン-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン結合化合物によって発せられる光の強度を測定することによりスーパーオキシドアニオンを簡便に分析することが可能となるのである。
この時、添加する分析試薬の量等の分析条件は特に限定されない。具体的には、分析試薬の濃度は、分析系に影響を与えない程度であればよい。また、分析は、被検体に影響を与えない温度範囲で行なえばよい。例えば、一般に生体を被検体とし、水溶液中で分析を行なう場合には、約10〜40℃の温度範囲が好ましく例示される。
さらに本発明のローダミン-シクロデキストリン-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン結合化合物によって発せられる光の発光波長は、最大波長約610nmであるため他成分による消光は少なく被検体からの透過性がよい。さらに、従来の緑色発光するFCLAより発光強度が高く、且つ高い感度でスーパーオキシドアニオンを検出することができる
Further, the reagent for analyzing superoxide anion of the present invention is not limited as long as it contains the rhodamine-cyclodextrin-imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one binding compound as described above as an active ingredient. Substances such as solvents, buffers, stabilizers, surfactants and the like may be contained.
The present invention also provides a method for detecting a superoxide anion. That is, in the method for analyzing a superoxide anion of the present invention, the superoxide anion is measured by measuring the intensity of light emitted by the rhodamine-cyclodextrin-imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one binding compound. This makes it possible to analyze simply.
At this time, analysis conditions such as the amount of analysis reagent to be added are not particularly limited. Specifically, the concentration of the analysis reagent may be a level that does not affect the analysis system. The analysis may be performed in a temperature range that does not affect the subject. For example, in general, when a living body is used as a subject and analysis is performed in an aqueous solution, a temperature range of about 10 to 40 ° C. is preferably exemplified.
Furthermore, since the emission wavelength of the light emitted by the rhodamine-cyclodextrin-imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one binding compound of the present invention is a maximum wavelength of about 610 nm, it is less quenched by other components. Good permeability. Furthermore, superoxide anion can be detected with higher sensitivity and higher sensitivity than conventional FCLA emitting green light.
以下に本発明のローダミン-シクロデキストリン-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン結合化合物[化学式]（１）の代表例であるローダミン-シクロデキストリン-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン結合化合物[化式２、化式３、化式４および化式５で示される化合物は位置異性体]を用いるスーパーオキシドアニオンの分析を実施例にて示し，本発明の有用性をさらに明らかにする。 The rhodamine-cyclodextrin-imidazo [1,2-a] pyrazine which is a representative example of the rhodamine-cyclodextrin-imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one binding compound [chemical formula] (1) of the present invention is shown below. Analysis of superoxide anion using a 3-one-bonded compound [compounds represented by Formula 2, Formula 3, Formula 4 and Formula 5 are positional isomers] is shown in the Examples, and the utility of the present invention To further clarify.
「モノ-6-N-(ローダミン)-2,3-モノマンノエポキシ γ-CD [化学式(１０)、化学式（１１）、化学式（１２）および化学式（１３）]の混合物の合成」
モノ-6-アミノ-2,3-モノマンノエポキシ γ-CD
[化学式(６)および化学式（７）]の混合物（0.11 g）を、0.1 M リン酸緩衝液(pH7.0)(3.0 mL)に溶解し、氷冷下でスルホローダミンクロリド［化学式(8)および化学式(9)］の位置異性体混合物(0.061g)を加え、アセトン(7 mL)を加え氷冷下で５０分間攪拌を行った。その後、アセトニトリルを加え、シリカゲルカラムに供し、アセトニトリルおよびアセトニトリル-水混合溶液で溶出し、溶出液を減圧濃縮しモノ-6-N-(ローダミン)-2,3-モノマンノエポキシ γ-CD化合物[化学式（１０）、化学式（１１）、化学式（１２）、および化学式（１３）]の位置異性体混合物（0.078 g）を得た。
青紫色粉末1H
NMR (500MHz, 23℃, 5%D2O/DMSO-d6):
1.7-2.1 (8H, m), 2.5-2.7 (4H, m), 2.9-3.2 (4H, m), 3.2-5.2 (m), 6.1-8.5 (5H, m)
ppm.IR(KBr): 3423, 2933,
1598, 1498, 1300 cm-1
UV-vis(MeOH):268 (e 22000), 298 (e 13900), 369 (e
5700), 424 (e 2170), 583 (e 82100) nm
“Synthesis of a mixture of mono-6-N- (rhodamine) -2,3-monomannoepoxy γ-CD [chemical formula (10), chemical formula (11), chemical formula (12) and chemical formula (13)]”
Mono-6-amino-2,3-monomannoepoxy γ-CD
A mixture (0.11 g) of [Chemical Formula (6) and Chemical Formula (7)] was dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) (3.0 mL), and sulforhodamine chloride [Chemical Formula (8) And a regioisomer mixture (0.061 g) of the chemical formula (9)] were added, acetone (7 mL) was added, and the mixture was stirred for 50 minutes under ice cooling. Acetonitrile is then added to a silica gel column and eluted with a mixed solution of acetonitrile and acetonitrile-water. The eluate is concentrated under reduced pressure to give mono-6-N- (rhodamine) -2,3-monomannoepoxy γ-CD compound A regioisomer mixture (0.078 g) of [Chemical Formula (10), Chemical Formula (11), Chemical Formula (12), and Chemical Formula (13)] was obtained.
Blue purple powder 1 H
NMR (500MHz, 23 ° C, 5% D 2 O / DMSO-d 6 ):
1.7-2.1 (8H, m), 2.5-2.7 (4H, m), 2.9-3.2 (4H, m), 3.2-5.2 (m), 6.1-8.5 (5H, m)
ppm.IR (KBr): 3423, 2933,
1598, 1498, 1300 cm -1
UV-vis (MeOH): 268 (e 22000), 298 (e 13900), 369 (e
5700), 424 (e 2170), 583 (e 82100) nm
「化合物[化学式（１４）、化学式（１５）、化学式（１６）、および化学式（１７）]の合成」
モノ-6-N-(ローダミン)-2,3-モノマンノエポキシ γ-CD化合物[化学式（１０）、化学式（１１）、化学式（１２）、および化学式（１３）]の位置異性体混合物（0.070 g）を28%アンモニア水(12 mL)に溶解し、３０℃で４日間放置し、減圧濃縮を行った。残渣に水を加えSephadex CM-25Cカラムに供し、水および1M アンモニア水で溶出し、溶出液を減圧濃縮し、残渣を少量の水に溶解し、アセトン(10 mL)に加え粉体化を行い、遠心分離により粉体[化学式（１４）、化学式（１５）、化学式（１６）および化学式（１７）の位置異性体混合物](0.050 g)を得た。
青紫色粉末
1H NMR(500MHz, 23℃, 5%D2O/DMSO-d6) 1.7-2.1 (8H, m), 2.6-2.7 (4H,
m), 2.8-5.0 (m), 6.2-8.4 (5H, m)ppm. IR(KBr): 3398, 2932, 1597, 1498, 1300 cm-1
UV-vis(MeOH):268 (e 28400), 298 (e 18000), 369 (e 7120), 428 (e 2360), 583 (e 110000) nm
“Synthesis of Compound [Chemical Formula (14), Chemical Formula (15), Chemical Formula (16), and Chemical Formula (17)]”
Mono-6-N- (rhodamine) -2,3-monomannoepoxy γ-CD compound [chemical formula (10), chemical formula (11), chemical formula (12), and chemical formula (13)] regioisomer mixture ( 0.070 g) was dissolved in 28% aqueous ammonia (12 mL), allowed to stand at 30 ° C. for 4 days, and concentrated under reduced pressure. Add water to the residue, apply to Sephadex CM-25C column, elute with water and 1M ammonia water, concentrate the eluate under reduced pressure, dissolve the residue in a small amount of water, add to acetone (10 mL) and pulverize. The powder [Chemical Formula (14), Chemical Formula (15), Chemical Formula (16) and Regioisomer Mixture of Chemical Formula (17)] (0.050 g) was obtained by centrifugation.
Blue purple powder
1 H NMR (500MHz, 23 ° C, 5% D 2 O / DMSO-d 6 ) 1.7-2.1 (8H, m), 2.6-2.7 (4H,
m), 2.8-5.0 (m), 6.2-8.4 (5H, m) ppm. IR (KBr): 3398, 2932, 1597, 1498, 1300 cm -1
UV-vis (MeOH): 268 (e 28400), 298 (e 18000), 369 (e 7120), 428 (e 2360), 583 (e 110000) nm
「化合物[化学式（２）、化学式（３）、化学式（４）、および化学式（５）]の合成」
化合物[化学式（１４）、化学式（１５）、化学式（１６）および化学式（１７）の混合物](0.020
g)、化合物[化学式（１８）](0.005 g)、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩(0.015 g), ピリジン(0.6 mL)、および水（0.2 mL）の混合物をアルゴンガス下で室温で2.5時間攪拌し、その後、減圧濃縮した。残渣を0.1%トルフルオロ酢酸-40%メタノール-10%N,N-ジメチルホルムアミド水溶液で溶解しODSカラムに供し、0.1%トルフルオロ酢酸-メタノール-水溶液で溶出し、溶出液を減圧濃縮し、アセトンを用いて粉体化し、遠心分離により粉体 [化学式（２）、化学式（３）、化学式（４）および化学式（５）の位置異性体混合物]
(0.019 g)を得た。
青紫色粉末
1H NMR(500MHz, 23 oC,
0.5％TFA/D2O-DMSO-d6
= 10:1): 1.6-2.0 (8H, m), 2.5-2.6 (4H, m), 2.8-5.0 (m),
6.5-8.4 (11H, m) ppm.
IR(KBr): 3397, 2931, 1597, 1497, 1299 cm-1.
UV-vis(MeOH): 268 (e 51200), 369 (e 13900), 428 (e 10200), 583
(e 111000) nm.
“Synthesis of Compound [Chemical Formula (2), Chemical Formula (3), Chemical Formula (4), and Chemical Formula (5)]”
Compound [Chemical Formula (14), Chemical Formula (15), Chemical Formula (16), and Mixture of Chemical Formula (17)] (0.020
g), Compound [Chemical Formula (18)] (0.005 g), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (0.015 g), pyridine (0.6 mL), and water (0.2 mL) The mixture was stirred at room temperature for 2.5 hours under argon gas, and then concentrated under reduced pressure. Dissolve the residue in 0.1% trifluoroacetic acid-40% methanol-10% N, N-dimethylformamide aqueous solution, apply to ODS column, elute with 0.1% trifluoroacetic acid-methanol-aqueous solution, concentrate the eluate under reduced pressure, and use acetone. And then powdered by centrifugation [Positional isomer mixture of chemical formula (2), chemical formula (3), chemical formula (4) and chemical formula (5)]
(0.019 g) was obtained.
Blue purple powder
1 H NMR (500MHz, 23 o C,
0.5% TFA / D 2 O-DMSO-d 6
= 10: 1): 1.6-2.0 (8H, m), 2.5-2.6 (4H, m), 2.8-5.0 (m),
6.5-8.4 (11H, m) ppm.
IR (KBr): 3397, 2931, 1597, 1497, 1299 cm -1 .
UV-vis (MeOH): 268 (e 51200), 369 (e 13900), 428 (e 10200), 583
(e 111000) nm.
スーパーオキシドアニオンは、ヒポキサンチンにキサンチンオキシダーゼを作用させ，キサンチンを尿酸に変化させる過程で生じる。この系に下記の実施例3で得たローダミン-シクロデキストリン-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン結合化合物[化学式（２）、化学式（３）、化学式（４）および化学式（５）の位置異性体混合物]を共存させ，スーパーオキシドアニオン検出の性能を明らかにする。また，従来用いられているスーパーオキシドアニオン発光分析用試薬の中で最も発光波長が長く高い感度を有するFCLAと比較した。
KCl(0.2M)、EDTA(0.1mM)、3-モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)(20mM)を含む緩衝水溶液 (pH 7.2、0.5ml)に25℃で、ヒポキサンチン水溶液(0.3mM，0.5ml)、ローダミン-シクロデキストリン-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン結合化合物[化学式（２）、化学式（３）、化学式（４）および化学式（５）の位置異性体混合物]水溶液(2.5x10-5M，40μl)およびキサンチンオキシダーゼ水溶液(0.37unit/ml，40μl)を加え、アトー社ルミネッセンサーPSNを用いて発光強度を測定した（発光波長による発光量の補正はせず）。発光はキサンチンオキシダーゼ水溶液の添加後、すぐに最高強度を示した。比較のためローダミン-シクロデキストリン-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン結合化合物[化学式（２）、化学式（３）、化学式（４）および化学式（５）の位置異性体混合物]に代えてFCLAを用いた。得られた相対発光強度はローダミン-シクロデキストリン-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン結合化合物[化学式（２）、化学式（３）、化学式（４）および化学式（５）の位置異性体混合物]が1.5x107 counts
であり，FCLAは1.4x106
countsであった。
The superoxide anion is generated in the process of causing xanthine oxidase to act on hypoxanthine and changing xanthine to uric acid. In this system, the rhodamine-cyclodextrin-imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one binding compound obtained in Example 3 below [chemical formula (2), chemical formula (3), chemical formula (4) and chemical formula (5 ) And the position isomer mixture] coexist to clarify the performance of superoxide anion detection. It was also compared with FCLA, which has the longest emission wavelength and high sensitivity among the conventional superoxide anion emission analysis reagents.
Hypoxanthine aqueous solution (0.3 mM, 0.5 ml) at 25 ° C in a buffer aqueous solution (pH 7.2, 0.5 ml) containing KCl (0.2 M), EDTA (0.1 mM), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) (20 mM) , Rhodamine-cyclodextrin-imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one conjugated compound [reaction isomer mixture of chemical formula (2), chemical formula (3), chemical formula (4) and chemical formula (5)] aqueous solution (2.5 x10 −5 M, 40 μl) and an aqueous xanthine oxidase solution (0.37 unit / ml, 40 μl) were added, and the luminescence intensity was measured using an ATTO luminescence sensor PSN (the luminescence amount was not corrected by the luminescence wavelength). Luminescence showed the highest intensity immediately after addition of the xanthine oxidase aqueous solution. For comparison, a rhodamine-cyclodextrin-imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one linked compound [a mixture of positional isomers of chemical formula (2), chemical formula (3), chemical formula (4) and chemical formula (5)] Instead, FCLA was used. The relative luminescence intensity obtained is the rhodamine-cyclodextrin-imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one binding compound [chemical formula (2), chemical formula (3), chemical formula (4) and chemical formula (5) positional isomerism Body mixture] is 1.5x10 7 counts
FCLA is 1.4x10 6
It was counts.
KCl(0.2M)、EDTA(0.1mM)、3-モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)(20mM)を含む緩衝水溶液(pH 7.2、0.5ml)に25℃で、ヒポキサンチン水溶液(0.3mM，0.5ml)、ローダミン-シクロデキストリン-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン結合化合物[化学式（２）、化学式（３）、化学式（４）および化学式（５）の位置異性体混合物]水溶液(2.5x10-5M，40μl) およびキサンチンオキシダーゼ水溶液(0.37unit/ml，40μl)を加え、蛍光分光光度計を用いて発光スペクトルを測定した（ただし，励起光は使用しない）。発光スペクトルは最大発光波長約610nmを示した。発光スペクトルを図１に示した。 Hypoxanthine aqueous solution (0.3 mM, 0.5 ml) at 25 ° C. in a buffered aqueous solution (pH 7.2, 0.5 ml) containing KCl (0.2 M), EDTA (0.1 mM), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) (20 mM) , Rhodamine-cyclodextrin-imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one conjugated compound [reaction isomer mixture of chemical formula (2), chemical formula (3), chemical formula (4) and chemical formula (5)] aqueous solution (2.5 x10 -5 M, 40 μl) and an aqueous xanthine oxidase solution (0.37 unit / ml, 40 μl) were added, and the emission spectrum was measured using a fluorescence spectrophotometer (however, excitation light was not used). The emission spectrum showed a maximum emission wavelength of about 610 nm. The emission spectrum is shown in FIG.
KCl(0.2M)、EDTA(0.1mM)、3-モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)(20mM)を含む緩衝水溶液(pH 7.2、0.5ml)に25℃で、ヒポキサンチン水溶液(0.3mM，0.5ml)、ローダミン-シクロデキストリン-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン結合化合物[化学式（２）、化学式（３）、化学式（４）および化学式（５）の位置異性体混合物]水溶液（最終濃度が2.4x10-7Mから1.8x10-5Mになるように加える）およびキサンチンオキシダーゼ水溶液(0.37unit/ml，40μl)を加え、アトー社ルミネッセンサーPSNを用いてローダミン-シクロデキストリン-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン結合化合物[化学式（２）、化学式（３）、化学式（４）および化学式（５）の位置異性体混合物]の各種濃度における発光強度を測定した。発光はキサンチンオキシダーゼ水溶液の添加後，すぐに最高強度を示した。比較のためローダミン-シクロデキストリン-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン結合化合物[化学式（２）、化学式（３）、化学式（４）および化学式（５）の位置異性体混合物]の代わりに従来用いられているスーパーオキシドアニオン発光分析用試薬のなかでもっとも発光波長が長く高い感度を有するFCLAも同様にして実験を行なった。得られた相対発光強度の結果を図２に示した。
Hypoxanthine aqueous solution (0.3 mM, 0.5 ml) at 25 ° C. in a buffered aqueous solution (pH 7.2, 0.5 ml) containing KCl (0.2 M), EDTA (0.1 mM), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) (20 mM) , Rhodamine-cyclodextrin-imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one conjugated compound [reaction isomer mixture of chemical formula (2), chemical formula (3), chemical formula (4) and chemical formula (5)] aqueous solution (final Concentrate from 2.4x10 -7 M to 1.8x10 -5 M) and xanthine oxidase aqueous solution (0.37 unit / ml, 40 μl). Add rhodamine-cyclodextrin-imidazo using Atto Luminescent Sensor PSN [ The luminescence intensity at various concentrations of the 1,2-a] pyrazin-3-one bonded compound [the regioisomer mixture of chemical formula (2), chemical formula (3), chemical formula (4) and chemical formula (5)] was measured. Luminescence showed the highest intensity immediately after the addition of an aqueous xanthine oxidase solution. For comparison, a rhodamine-cyclodextrin-imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one linked compound [a mixture of positional isomers of chemical formula (2), chemical formula (3), chemical formula (4) and chemical formula (5)] Instead, FCLA having the longest emission wavelength and high sensitivity among the conventionally used superoxide anion emission analysis reagents was also tested in the same manner. The obtained relative light emission intensity results are shown in FIG.
Claims (4)
A method for analyzing superoxide anion, comprising measuring the luminescence intensity after contacting the reagent for analyzing superoxide anion according to claim 3 with a sample solution.
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