JP2007051076A - Myoglobin complex - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヘム蛋白質複合体に関するものであり、更に詳しくは、シリカ系メソ多孔体の細孔内部にミオグロビン等のヘム蛋白質を備えるヘム蛋白質内包複合体及びその用途に関するものである。本発明は、シリカ系メソ多孔体の細孔内部にミオグロビン等のヘム蛋白質の活性を安定に保持して、その機能を発揮することが可能な新規ヘム蛋白質−シリカ系メソ多孔体複合体及びその機能性部材としての用途に関する新技術・新製品を提供するものである。 The present invention relates to a heme protein complex, and more particularly, to a heme protein inclusion complex having a heme protein such as myoglobin in the pores of a silica-based mesoporous material and its use. The present invention relates to a novel heme protein-silica mesoporous material complex capable of stably maintaining the activity of a heme protein such as myoglobin in the pores of a silica based mesoporous material and exhibiting its function, and It provides new technologies and new products related to applications as functional members.
ヘム蛋白質の一種であるミオグロビンなどの酸素運搬蛋白質は、合成錯体では得られない特有の酸素、一酸化炭素、及び一酸化窒素を結合させる機能を有しており、また、環境に負荷を与える心配のない安全な蛋白質であることから、その多様な用途が期待される。しかし、蛋白質は、一般的に、光、酸素、熱、ｐＨ、溶媒等に対して敏感であり、それらに晒されるとすぐに変性を起こすなど、生体から取り出し、純粋な化合物にすると、不安定になる傾向がある。 Oxygen-carrying proteins such as myoglobin, a type of heme protein, have the function of binding specific oxygen, carbon monoxide, and nitric oxide, which cannot be obtained with synthetic complexes, and are concerned about the burden on the environment. Because it is a safe protein without any problems, its various uses are expected. However, proteins are generally sensitive to light, oxygen, heat, pH, solvents, etc., and when exposed to them, they are denatured immediately. Tend to be.
蛋白質は、アミノ酸が連結されてなるポリペプチドが一定の形態に折りたたまれて立体構造を形成し、その立体構造中に活性部位を形成している。例えば、このような構造を有する酵素が不活性化する機構としては、蛋白質分解酵素により、酵素を構成するポリペプチド鎖が切断される場合や、熱、ｐＨ等の外部環境変化により、蛋白質の立体構造が変化し、活性部位が破壊される場合などがある。 In a protein, a polypeptide formed by linking amino acids is folded into a certain form to form a three-dimensional structure, and an active site is formed in the three-dimensional structure. For example, the mechanism of inactivation of an enzyme having such a structure is as follows. When the polypeptide chain constituting the enzyme is cleaved by a proteolytic enzyme, or when the external environment such as heat and pH changes, In some cases, the structure changes and the active site is destroyed.
これらの酵素の不活性化を防止する方法として、蛋白質分子内に、Ｓ−Ｓ結合や、グルタルアルデヒド等による架橋を新たに導入し、蛋白質分子自身の構造をｒｉｇｉｄにする試みがなされている。しかし、これらの改変は、各酵素ごとにその方法が異なり、十分な安定性が得られない場合も多く、汎用性が低いという問題点がある。 As a method for preventing the inactivation of these enzymes, attempts have been made to introduce a bridging structure such as SS bond or glutaraldehyde into the protein molecule so that the structure of the protein molecule itself is rigid. However, these modifications have a problem in that their methods are different for each enzyme, and sufficient stability cannot be obtained in many cases, resulting in low versatility.
また、様々な蛋白質の安定化に応用される方法として、種々の固定化酵素が提案されている。しかし、従来の固定化酵素では、蛋白質を直接樹脂等に固定させているため、蛋白質分解酵素により分解されたり、外部環境の変化により立体構造が変化することを防止できない。また、酵素をゲルに封じ込める包括固定化法や半透性のポリマー被膜により被覆するマイクロカプセル法が提案されている。そして、これらの方法によれば、酵素は、蛋白質分解酵素による分解を受けることがなく、安定性の向上が期待される。 In addition, various immobilized enzymes have been proposed as methods applied to the stabilization of various proteins. However, in the conventional immobilized enzyme, since the protein is directly immobilized on a resin or the like, it cannot be prevented from being decomposed by a proteolytic enzyme or from changing the three-dimensional structure due to a change in the external environment. In addition, a entrapping immobilization method in which an enzyme is contained in a gel and a microcapsule method in which the enzyme is coated with a semipermeable polymer film are proposed. According to these methods, the enzyme is not subject to degradation by a proteolytic enzyme, and an improvement in stability is expected.
しかしながら、これらの方法においては、酵素と外部を覆う構造体とは、一般的に分子サイズに合致した形では固定されていないため、酵素をゲル格子や、カプセル内にしっかりと固定できず、酵素が漏出し、失活するという不具合が生じる（特許文献１）。また、これらの方法では、外部環境の変化に伴う酵素の立体構造変化を防止する効果も低い。 However, in these methods, the enzyme and the outer structure are generally not fixed in a form that matches the molecular size, so the enzyme cannot be fixed firmly in the gel lattice or in the capsule. Leaks and deactivates (Patent Document 1). In addition, these methods have a low effect of preventing changes in the three-dimensional structure of the enzyme accompanying changes in the external environment.
一方、ポリエチレングリコール（特許文献２）や、糖脂質（非特許文献１）で、蛋白質の表面を修飾することにより、酵素の安定化を行う方法が提案されている。しかしながら、これらの方法では、酵素を覆う構造体は分子サイズに合致しておらず、構造安定性が不十分であるため、外部環境の変化に伴い酵素の立体構造が変化することを十分に防止することは困難である。 On the other hand, a method for stabilizing an enzyme by modifying the surface of a protein with polyethylene glycol (Patent Document 2) or glycolipid (Non-Patent Document 1) has been proposed. However, in these methods, the structure that covers the enzyme does not match the molecular size and the structural stability is insufficient, so that the three-dimensional structure of the enzyme is sufficiently prevented from changing due to changes in the external environment. It is difficult to do.
他方、いわゆる人工酵素が提案されており、例えば、金属フタロシアニンを高分子物質に結合させて酵素活性を発現させたもの（特許文献３、特許文献４）、ポルフィリンにイミダゾール基を導入して配位させ、触媒機能を高めようとするもの（非特許文献２）、等が提案されている。これらの手段によれば、酵素の安定性は向上するが、その特異性は天然の酵素にはるかに及ばない。そこで、当技術分野においては、蛋白質を安定に保持してその活性を有効に利用することが可能な新しい蛋白質高度利用技術の開発が強く要請されていた。 On the other hand, so-called artificial enzymes have been proposed. For example, metal phthalocyanine is bound to a polymer substance to express enzyme activity (Patent Documents 3 and 4), and an imidazole group is introduced into porphyrin for coordination. To improve the catalytic function (Non-Patent Document 2), and the like have been proposed. These measures improve the stability of the enzyme, but its specificity is far below that of the natural enzyme. Therefore, in this technical field, there has been a strong demand for the development of a new advanced protein utilization technique that can stably retain a protein and effectively use its activity.
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、ヘム蛋白質を安定に担持することが可能なヘム蛋白質複合体を開発することを目標として鋭意研究を重ねた結果、特定のシリカ系メソ多孔体の細孔内部に、特定の状態でヘム蛋白質を吸着させ、ヘム蛋白質複合体を形成させることにより所期の目的を達成できことを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成させるに至った。本発明は、上記従来技術の問題点に鑑みてなされたものであり、ミオグロビン等のヘム蛋白質を、安定に、高機能性を保持して、且つ大きな吸着量で吸着担持させた新規ヘム蛋白質複合体及びその用途を提供することを目的とするものである。 Under such circumstances, the present inventors, in view of the above prior art, as a result of intensive research aimed at developing a heme protein complex capable of stably supporting a heme protein, We have found that the intended purpose can be achieved by adsorbing heme protein in a specific state inside the pores of a specific silica-based mesoporous material to form a heme protein complex. The invention has been completed. The present invention has been made in view of the above problems of the prior art, and is a novel heme protein complex in which a heme protein such as myoglobin is adsorbed and supported with a large amount of adsorption while maintaining high functionality stably. It is intended to provide a body and its use.
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）シリカ系メソ多孔体の細孔内部にヘム蛋白質を備えるヘム蛋白質内包複合体であって、１）前記ヘム蛋白質は、前記細孔内部で多量体を形成している、２）該多量体は、高密度集積した蛋白質として、前記シリカ系メソ多孔体の細孔内壁に吸着されている、ことを特徴とするヘム蛋白質複合体。
（２）前記ヘム蛋白質が、ミオグロビンである、前記（１）に記載の複合体。
（３）前記シリカ系メソ多孔体が、１）ケイ素原子と酸素原子を必須成分として含む化合物の多孔体である、（）細孔のサイズがメソ孔であり、その中心細孔直径が２〜５０ｎｍである、３）細孔容積が０．１〜１．５ｍＬである、４）比表面積が２００〜１５００ｍ２である、５）表面にシラノール基（−ＳｉＯＨ基）を有する、前記（１）に記載の複合体。
（４）シリカ系メソ多孔体において、全細孔容積に占める、中心細孔直径の±４０％の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合が６０％以上である、及び／又は１ｎｍ以上のｄ値に相当する回折角度に１本以上のピークを有するＸ線回折パターンを示す、前記（１）に記載の複合体。
（５）前記シリカ系メソ多孔体に吸着させるミオグロビンの重量が、シリカメソ多孔体１００重量部当たり、０．５〜５０重量部である、前記（１）に記載の複合体。
（６）前記シリカ系メソ多孔体の中心細孔直径が、３〜６ｎｍである、前記（１）に記載の複合体。
（７）前記シリカ系メソ多孔体のｐＫａが、５〜１４である、前記（１）に記載の複合体。
（８）前記シリカ系メソ多孔体の細孔内部に、酸化触媒が更に担持されている、前記（１）に記載の複合体。
（９）前記（１）から（９）のいずれか１項に記載のヘム蛋白質複合体を機能性成分として含むことを特徴とするヘム蛋白質の活性を安定に有する機能性部材。
（１０）ミオグロビン複合体を機能性成分として含み、ミオグロビンに吸着する酸素、一酸化炭素、又は一酸化窒素を濃縮する作用を有する、前記（９）に記載の機能性部材。
（１１）ミオグロビン複合体を機能性成分として含み、有機溶媒中での触媒能を有する、前記（９）に記載の機能性部材。
The present invention for solving the above-described problems comprises the following technical means.
(1) A heme protein-encapsulating complex having a heme protein inside pores of a silica-based mesoporous material, wherein 1) the heme protein forms a multimer inside the pore; A heme protein complex characterized in that the body is adsorbed on the inner walls of the pores of the silica-based mesoporous material as a highly concentrated protein.
(2) The complex according to (1), wherein the heme protein is myoglobin.
(3) The silica-based mesoporous material is a porous material of a compound containing 1) a silicon atom and an oxygen atom as essential components. () The pore size is a mesopore, and the central pore diameter is 2 to 2. 3) The pore volume is 0.1 to 1.5 mL, 4) the specific surface area is 200 to 1500 m 2 , and 5) the surface has silanol groups (—SiOH groups) (1) The complex described in 1.
(4) In the silica-based mesoporous material, the ratio of the total volume of pores having a diameter in the range of ± 40% of the central pore diameter in the total pore volume is 60% or more and / or 1 nm. The composite according to (1), which shows an X-ray diffraction pattern having one or more peaks at a diffraction angle corresponding to the d value.
(5) The composite according to (1), wherein the weight of myoglobin adsorbed on the silica mesoporous material is 0.5 to 50 parts by weight per 100 parts by weight of the silica mesoporous material.
(6) The composite according to (1), wherein the silica-based mesoporous material has a center pore diameter of 3 to 6 nm.
(7) The composite according to (1), wherein the pKa of the silica-based mesoporous material is 5 to 14.
(8) The composite according to (1), wherein an oxidation catalyst is further supported inside pores of the silica-based mesoporous material.
(9) A functional member stably having a heme protein activity, comprising the heme protein complex according to any one of (1) to (9) as a functional component.
(10) The functional member according to (9), wherein the functional member contains a myoglobin complex as a functional component and has an action of concentrating oxygen, carbon monoxide, or nitric oxide adsorbed on myoglobin.
(11) The functional member according to (9), which includes a myoglobin complex as a functional component and has catalytic ability in an organic solvent.
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、シリカ系メソ多孔体の細孔内部にヘム蛋白質を備えるヘム蛋白質内包複合体であって、（１）前記ヘム蛋白質は、前記細孔内部で多量体を形成している、（２）該多量体は、高密度集積した蛋白質として、前記シリカ系メソ多孔体の細孔内壁に吸着されている、ことを特徴とするものである。
Next, the present invention will be described in more detail.
The present invention is a heme protein-encapsulating complex comprising a heme protein inside the pores of a silica-based mesoporous material, wherein (1) the heme protein forms a multimer inside the pores, (2 The multimer is characterized in that it is adsorbed on the pore inner wall of the silica-based mesoporous material as a highly concentrated protein.
本発明のヘム蛋白質複合体を、ミオグロビン複合体を代表例として説明する。しかし、本発明で用いられるヘム蛋白質は、ミオグロビンに限定されるものではなく、ミオグロビン複合体に準じて、他のヘム蛋白質についても同様に作製及び利用することが可能である。本発明は、シリカ系メソ多孔体の細孔内部にミオグロビンを備えるミオグロビン複合体であって、前記ミオグロビンは前記細孔内部で多量体を形成しており、該多量体は、高密度に集積して前記シリカ系メソ多孔体の細孔内壁に吸着していることを特徴とするものである。 The heme protein complex of the present invention will be described using a myoglobin complex as a representative example. However, the heme protein used in the present invention is not limited to myoglobin, and other heme proteins can be similarly produced and used according to the myoglobin complex. The present invention is a myoglobin complex comprising myoglobin inside pores of a silica-based mesoporous material, wherein the myoglobin forms a multimer inside the pore, and the multimer accumulates at a high density. The silica-based mesoporous material is adsorbed on the inner walls of the pores.
本発明のミオグロビン複合体は、多孔質で表面積の非常に大きいシリカ系メソ多孔体を使用し、該メソ多孔体の細孔内部にミオグロビンを吸着させたものであるために、ミオグロビンの吸着量を増大させることができる。また、このミオグロビン複合体では、シリカ系メソ多孔体の細孔中でミオグロビンの多量体を形成させ、更に、その立体構造を、メソ多孔体の細孔内壁によって保持できるために、ミオグロビンの安定性を顕著に向上させることが可能になる。 The myoglobin complex of the present invention uses a porous silica-based mesoporous material having a very large surface area and adsorbs myoglobin inside the pores of the mesoporous material. Can be increased. In this myoglobin complex, a myoglobin multimer is formed in the pores of the silica-based mesoporous material, and the three-dimensional structure can be retained by the pore inner wall of the mesoporous material. Can be significantly improved.
本発明のミオグロビン複合体においては、前記立体構造が、前記シリカ系メソ多孔体の細孔内壁に囲まれる状態で維持されることにより、ミオグロビンの安定性をより向上させることができる。ミオグロビンは、前記シリカ系メソ多孔体の細孔内に効率よく吸着され、また、その立体構造が、シリカ系メソ多孔体の細孔内で保持されるため、特に安定化される傾向となる。 In the myoglobin complex of the present invention, the three-dimensional structure is maintained in a state surrounded by the pore inner walls of the silica-based mesoporous material, whereby the stability of myoglobin can be further improved. Since myoglobin is efficiently adsorbed in the pores of the silica-based mesoporous material, and its three-dimensional structure is retained in the pores of the silica-based mesoporous material, it tends to be particularly stabilized.
また、本発明では、シリカ系メソ多孔体における細孔の中心細孔直径は、３〜６ｎｍであることが好ましい。細孔の中心細孔直径を３〜６ｎｍとすることにより、ミオグロビンの立体構造の維持が容易となるため、よりミオグロビンを安定化することができる。 In the present invention, the center pore diameter of the pores in the silica-based mesoporous material is preferably 3 to 6 nm. By setting the center pore diameter of the pores to 3 to 6 nm, it is easy to maintain the three-dimensional structure of myoglobin, so that myoglobin can be further stabilized.
また、本発明では、シリカ系メソ多孔体は、ｐＫａ５〜１４のシリカ系メソ多孔体であることが好ましい。シリカ系メソ多孔体のｐＫａが、上記範囲内である場合は、蛋白質の変性が起こらない。 In the present invention, the silica-based mesoporous material is preferably a silica-based mesoporous material having a pKa of 5 to 14. When the pKa of the silica-based mesoporous material is within the above range, protein denaturation does not occur.
本発明のミオグロビン複合体においては、前記シリカ系メソ多孔体の細孔内部に酸化触媒が更に担持されていることが好ましい。このように、ミオグロビン複合体に更に酸化触媒を担持せしめることにより、これを、例えば、濃縮された酸素、一酸化炭素、及び一酸化窒素などを効率よく酸化するための反応に用いることができる。更に、本発明のミオグロビン複合体においては、酸化触媒を担持させることにより、有機溶媒（ベンゼン、トルエン等）中で、過酸化脂質を効率よく酸化する酵素活性を付与することができる。 In the myoglobin complex of the present invention, it is preferable that an oxidation catalyst is further supported inside the pores of the silica-based mesoporous material. Thus, by further supporting an oxidation catalyst on the myoglobin complex, it can be used for a reaction for efficiently oxidizing, for example, concentrated oxygen, carbon monoxide, and nitric oxide. Furthermore, in the myoglobin complex of the present invention, an enzyme activity for efficiently oxidizing lipid peroxide can be imparted in an organic solvent (benzene, toluene, etc.) by supporting an oxidation catalyst.
次に、本発明で使用されるシリカ系メソ多孔体について説明すると、本発明において、シリカ系メソ多孔体とは、ケイ素原子と酸素原子を必須成分として含む化合物の多孔体であり、細孔のサイズがメソ孔であるものを意味するものとして定義される。ここで、メソ孔とは、中心細孔直径が２〜５０ｎｍであるものをいう。なお、中心細孔直径とは、シリカ系メソ多孔体の細孔容積（Ｖ）を細孔直径（Ｄ）で微分した値（ｄＶ／ｄＤ）を細孔直径（Ｄ）に対してプロットした曲線（細孔径分布曲線）の最大ピークにおける細孔直径を意味する。 Next, the silica-based mesoporous material used in the present invention will be described. In the present invention, the silica-based mesoporous material is a porous material of a compound containing silicon atoms and oxygen atoms as essential components. Defined as meaning that the size is mesopores. Here, the mesopore means one having a central pore diameter of 2 to 50 nm. The central pore diameter is a curve obtained by plotting the value (dV / dD) obtained by differentiating the pore volume (V) of the silica-based mesoporous material with the pore diameter (D) against the pore diameter (D). It means the pore diameter at the maximum peak of (pore diameter distribution curve).
そして、この細孔分布曲線は、シリカ系メソ多孔体を、液体窒素温度（−１９６℃）に冷却して窒素ガスを導入し、定容量法によりその吸着量を求め、次いで、導入する窒素ガスの圧力を徐々に増加させ、各平衡圧に対する窒素ガス吸着量をプロットして吸着等温線を得た後に、Cranston−Inklay法を適用して求めることができる曲線である。 The pore distribution curve shows that the silica-based mesoporous material is cooled to a liquid nitrogen temperature (−196 ° C.), nitrogen gas is introduced, the adsorption amount is determined by a constant volume method, and then the introduced nitrogen gas Is a curve that can be obtained by applying the Cranston-Inklay method after plotting the nitrogen gas adsorption amount for each equilibrium pressure to obtain an adsorption isotherm.
本発明において、上記シリカ系メソ多孔体の中心細孔直径は、特に、３〜６ｎｍであることが好ましい。中心細孔直径が３ｎｍ未満では、ミオグロビンの細孔内への吸着が不充分となる傾向があり、中心細孔直径が６ｎｍを超えると、ミオグロビンが効率よく立体構造が保持されない傾向がある。すなわち、シリカ系メソ多孔体の中心細孔直径を上記範囲内にすることにより、ミオグロビンの吸着を効率化でき、立体構造の保持も容易となるため、ミオグロビンを更に安定化することができる。 In the present invention, the center pore diameter of the silica-based mesoporous material is particularly preferably 3 to 6 nm. If the central pore diameter is less than 3 nm, the myoglobin tends to be insufficiently adsorbed into the pores, and if the central pore diameter exceeds 6 nm, the myoglobin tends not to have a three-dimensional structure efficiently. That is, by making the central pore diameter of the silica-based mesoporous material within the above range, the myoglobin can be efficiently adsorbed and the three-dimensional structure can be easily maintained, so that the myoglobin can be further stabilized.
本発明において、上記シリカ系メソ多孔体は、０．１〜１．５ｍＬ／ｇの細孔容積を有するものであることが好ましく、また、２００〜１５００ｍ２の比表面積を有するものであることが好ましい。そして、上記シリカ系メソ多孔体は、全細孔容積に占める、中心細孔直径の±４０％の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合が６０％以上の多孔体であることが好ましい。 In the present invention, the silica-based mesoporous material preferably has a pore volume of 0.1 to 1.5 mL / g, and has a specific surface area of 200 to 1500 m 2. preferable. The silica-based mesoporous material is a porous material in which the ratio of the total volume of pores having a diameter within a range of ± 40% of the center pore diameter in the total pore volume is 60% or more. preferable.
ここで、全細孔容積に占める、中心細孔直径の±４０％の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合が６０％以上とは、例えば、中心細孔直径が３．００ｎｍである場合、この３．００ｎｍの±４０％、すなわち、１．８０〜４．２０ｎｍの範囲にある細孔の容積の合計が、全細孔容積の６０％以上を占めていることを意味する。 Here, the ratio of the total volume of pores having a diameter in the range of ± 40% of the center pore diameter in the total pore volume is 60% or more, for example, the center pore diameter is 3.00 nm. In some cases, this means that the total volume of pores in the range of ± 40% of 3.00 nm, ie, 1.80 to 4.20 nm, occupies 60% or more of the total pore volume.
この条件を満たす多孔体は、細孔の直径が非常に均一であることを意味し、このような細孔配列構造を有するシリカ系メソ多孔体にヘム蛋白質を吸着させることにより、ヘム蛋白質の安定性及び吸着量をより向上させることができる。なお、細孔容積は、上述のように、シリカ系メソ多孔体を液体窒素温度に冷却して窒素ガスを導入する方法（窒素吸着法）により算出することができる。 A porous material satisfying this condition means that the diameter of the pores is very uniform, and the heme protein is stabilized by adsorbing the heme protein to the silica-based mesoporous material having such a pore arrangement structure. And the adsorption amount can be further improved. As described above, the pore volume can be calculated by a method (nitrogen adsorption method) in which the silica-based mesoporous material is cooled to a liquid nitrogen temperature and nitrogen gas is introduced.
本発明において、上記シリカ系メソ多孔体は、１ｎｍ以上のｄ値に相当する回折角度に１本以上のピークを有するＸ線回折パターンを示す多孔体であることが好ましい。Ｘ線回折パターンでピークが現われる場合は、そのピーク角度に相当するｄ値の周期構造がシリカ系メソ多孔体中にあることを意味する。 In the present invention, the silica-based mesoporous material is preferably a porous material that exhibits an X-ray diffraction pattern having one or more peaks at a diffraction angle corresponding to a d value of 1 nm or more. When a peak appears in the X-ray diffraction pattern, it means that a periodic structure having a d value corresponding to the peak angle is present in the silica-based mesoporous material.
したがって、１ｎｍ以上のｄ値に相当する回折角度に１本以上のピークがあることは、細孔が１ｎｍ以上の間隔で規則的に配列していることを意味する。このように、非常に規則的な細孔配列構造を有するシリカ系メソ多孔体にヘム蛋白質を吸着させることにより、ヘム蛋白質の安定性及び吸着量をより向上させることが可能になる。 Therefore, having one or more peaks at a diffraction angle corresponding to a d value of 1 nm or more means that the pores are regularly arranged at intervals of 1 nm or more. In this way, it is possible to further improve the stability and the amount of adsorption of heme protein by adsorbing heme protein to a silica-based mesoporous material having a very regular pore arrangement structure.
本発明では、上述のシリカ系メソ多孔体における、細孔の配列状態（細孔配列構造）は、特に制限されない。シリカ系メソ多孔体としては、例えば、ヘキサゴナルの細孔配列構造を有するものや、キュービックやディスオーダの細孔配列構造を有するものが例示される。 In the present invention, the arrangement state of pores (pore arrangement structure) in the above-mentioned silica-based mesoporous material is not particularly limited. Examples of the silica-based mesoporous material include those having a hexagonal pore arrangement structure and those having a cubic or disordered pore arrangement structure.
ここで、シリカ系メソ多孔体がヘキサゴナルの細孔配列構造を有するとは、シリカ系メソ多孔体の細孔の配置が六方構造であることを意味する（Inagaki, et. al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 69, 1449 (1996); Q. Huo et.
al., Science, 268, 1324 (1995)参照）。ヘキサゴナルの細孔配列構造としては、２ｄ−ヘキサゴナル（２次元ヘキサゴナル）及び３ｄ−ヘキサゴナル（３次元ヘキサゴナル）が挙げられる。本発明において好適に用いることのできる２次元ヘキサゴナルの細孔配列構造を有するシリカ系メソ多孔体は、２次元ヘキサゴナル配列構造に基づいて、六角柱状の細孔が互いに平行に規則的に形成されている。
Here, the fact that the silica-based mesoporous material has a hexagonal pore arrangement structure means that the arrangement of the pores of the silica-based mesoporous material is a hexagonal structure (Inagaki, et. Al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 69, 1449 (1996); Q. Huo et.
al., Science, 268, 1324 (1995)). Examples of the pore arrangement structure of hexagonal include 2d-hexagonal (two-dimensional hexagonal) and 3d-hexagonal (three-dimensional hexagonal). In the silica-based mesoporous material having a two-dimensional hexagonal pore arrangement structure that can be suitably used in the present invention, hexagonal columnar pores are regularly formed in parallel with each other based on the two-dimensional hexagonal arrangement structure. Yes.
シリカ系メソ多孔体がキュービックの細孔配列構造を有するとは、シリカ系メソ多孔体中の細孔の配置が立方構造であることを意味する（J. C. Vartuli et. al., Chem. Mater., 6, 2317, 1994； Q. Huo et.al.,
Nature, 368, 317, 1994参照）。そして、シリカ系メソ多孔体がディスオーダの細孔配列構造を有するとは、細孔の配置が不規則であることを意味する（P.
T. Tanev et. al., Science, 267, 865, 1995； S. A. Bagshaw et. al., Science, 269,
1242, 1995； R. Ryoo et. al., J. Phys. Chem., 100, 17718, 1996参照）。
A silica-based mesoporous material having a cubic pore arrangement structure means that the arrangement of pores in the silica-based mesoporous material is a cubic structure (JC Vartuli et. Al., Chem. Mater., 6, 2317, 1994; Q. Huo et.al.,
Nature, 368, 317, 1994). And that the silica-based mesoporous material has a disordered pore arrangement structure means that the arrangement of the pores is irregular (P.
T. Tanev et. Al., Science, 267, 865, 1995; SA Bagshaw et. Al., Science, 269,
1242, 1995; see R. Ryoo et. Al., J. Phys. Chem., 100, 17718, 1996).
シリカ系メソ多孔体が、ヘキサゴナルやキュービック等の規則的細孔配列構造を有する場合は、細孔の全てがこれらの規則的細孔配列構造である必要はない。すなわち、シリカ系メソ多孔体は、ヘキサゴナルやキュービック等の規則的細孔配列構造とディスオーダの不規則的細孔配列構造の両方を有していることが可能である。しかしながら、全ての細孔のうち、８０％以上は、ヘキサゴナルやキュービック等の規則的細孔配列構造となっていることが好ましい。 When the silica-based mesoporous material has a regular pore arrangement structure such as hexagonal or cubic, it is not necessary that all the pores have these regular pore arrangement structures. That is, the silica-based mesoporous material can have both a regular pore arrangement structure such as hexagonal and cubic and a disordered irregular pore arrangement structure. However, 80% or more of all the pores preferably have a regular pore arrangement structure such as hexagonal or cubic.
本発明において、上記シリカ系メソ多孔体としては、有機基を有するシリカ系メソ多孔体、有機基を有しないシリカ系メソ多孔体が例示される。そして、いずれの多孔体の場合においても、ケイ素以外の金属元素（例えば、Ａｌ、Ｚｒ、Ｔｉ等）を更に含むことができる。なお、いずれのシリカ系メソ多孔体であっても、表面にはシラノール基（−ＳｉＯＨ基）が存在している。 In the present invention, examples of the silica-based mesoporous material include a silica-based mesoporous material having an organic group and a silica-based mesoporous material having no organic group. And in any porous body, metal elements other than silicon (for example, Al, Zr, Ti, etc.) can further be included. In any silica-based mesoporous material, silanol groups (—SiOH groups) are present on the surface.
有機基を有するシリカ系メソ多孔体とは、シリカ系メソ多孔体を構成するケイ素原子の少なくとも一部に、有機基が、炭素−ケイ素結合を形成することによって結合しているものをいう。有機基としては、例えば、アルカン、アルケン、アルキン、ベンゼン、シクロアルカン等の炭化水素から１以上の水素がとれて生じる炭化水素基や、アミド基、アミノ基、イミノ基、メルカプト基、スルフォン基、カルボキシル基、エーテル基、アシル基、ビニル基等が挙げられる。 The silica-based mesoporous material having an organic group refers to a material in which an organic group is bonded to at least a part of silicon atoms constituting the silica-based mesoporous material by forming a carbon-silicon bond. As the organic group, for example, a hydrocarbon group formed by removing one or more hydrogen from a hydrocarbon such as alkane, alkene, alkyne, benzene, cycloalkane, amide group, amino group, imino group, mercapto group, sulfone group, A carboxyl group, an ether group, an acyl group, a vinyl group, etc. are mentioned.
シリカ系メソ多孔体は、後記する実施例１に記載されるように、好適には、例えば、乾燥水ガラスを空気中で焼成し、ジケイ酸ソーダに結晶化させ、この結晶を水に分散させ、その後、濾過して固形分を回収することでカネマイトとして合成される。 As described in Example 1 to be described later, the silica-based mesoporous material is preferably obtained by, for example, calcining dry water glass in air, crystallizing it into sodium disilicate, and dispersing the crystals in water. Then, it is synthesize | combined as kanemite by filtering and collect | recovering solid content.
次に、本発明で使用されるヘム蛋白質について説明すると、本発明においては、ヘム蛋白質が使用されるが、ここではミオグロビンを代表例として説明すると、ミオグロビンの構造は、図２で表すことができる。シリカ系メソ多孔体に吸着させるミオグロビンの重量は、シリカ系メソ多孔体１００重量部当たり、０．５〜５０重量部であることが好ましく、２０〜５０重量部であることがより好ましい。ミオグロビンの吸着量が上記範囲である場合、ミオグロビンのシリカ系メソ多孔体への吸着が効率的に生じ、安定化の程度が向上する。 Next, the heme protein used in the present invention will be described. In the present invention, a heme protein is used. Here, when myoglobin is described as a representative example, the structure of myoglobin can be represented by FIG. . The weight of myoglobin adsorbed on the silica-based mesoporous material is preferably 0.5 to 50 parts by weight and more preferably 20 to 50 parts by weight per 100 parts by weight of the silica-based mesoporous material. When the amount of myoglobin adsorbed is in the above range, myoglobin is efficiently adsorbed on the silica-based mesoporous material, and the degree of stabilization is improved.
次に、本発明のミオグロビン複合体について説明すると、本発明のミオグロビン複合体は、シリカ系メソ多孔体の細孔内部にミオグロビンを備えており、前記ミオグロビンは、前記細孔内部で多量体を形成しており、更に、該多量体は、前記シリカ系メソ多孔体の細孔内壁に吸着して複合体を形成している。 Next, the myoglobin complex of the present invention will be described. The myoglobin complex of the present invention has myoglobin inside the pores of the silica-based mesoporous material, and the myoglobin forms a multimer inside the pores. Furthermore, the multimer is adsorbed on the pore inner wall of the silica mesoporous material to form a composite.
ここで、ミオグロビンの多量体とは、２以上のヘム蛋白質が、直接に又は水などの低分子を介して、結合してなる化合物をいい、結合には、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合が含まれる。しかし、これらの結合の種類は、特に制限されない。 Here, a multimer of myoglobin refers to a compound in which two or more heme proteins are bonded directly or via a small molecule such as water. The bond includes a covalent bond, an ionic bond, a hydrogen bond, Coordination bonds are included. However, the type of these bonds is not particularly limited.
図２は、図１に示すシリカ系メソ多孔体の細孔内部にミオグロビンを備える、ミオグロビン複合体を模式的に示す斜視図である。なお、図２は、図１のシリカ系メソ多孔体の中心部分の細孔のみを拡大して示したものである。 FIG. 2 is a perspective view schematically showing a myoglobin complex including myoglobin inside pores of the silica-based mesoporous material shown in FIG. FIG. 2 is an enlarged view showing only the pores in the central portion of the silica-based mesoporous material of FIG.
図２に示すミオグロビン複合体において、シリカ系メソ多孔体の細孔内には、ミオグロビンが存在している。それらは、図２の構造に限定されるものではなく、例えば、多量体を形成している場合もあり得る。 In the myoglobin complex shown in FIG. 2, myoglobin exists in the pores of the silica-based mesoporous material. They are not limited to the structure of FIG. 2, and may form a multimer, for example.
また、本発明のミオグロビン複合体においては、前記シリカ系メソ多孔体の細孔内部に酸化触媒が更に担持されていることが好ましい。このような酸化触媒としては、酸化ルテニウム、酸化マンガン、酸化鉄、酸化チタン等が挙げられ、これらは、例えば、濃縮された酸素、一酸化炭素、一酸化窒素の酸化反応に用いることができる。 In the myoglobin complex of the present invention, it is preferable that an oxidation catalyst is further supported inside the pores of the silica-based mesoporous material. Examples of such an oxidation catalyst include ruthenium oxide, manganese oxide, iron oxide, titanium oxide, and the like, and these can be used for, for example, an oxidation reaction of concentrated oxygen, carbon monoxide, and nitric oxide.
酸化触媒は、０．１〜５重量％程度が一般的である。更に、このような酸化触媒を担持させる方法も、特に制限されないが、例えば、シリカ系メソ多孔体を、酸化触媒又はその前駆体の溶液中に入れて攪拌した後、減圧乾燥し、更に必要に応じて、加熱等により前駆体を酸化させることにより、酸化触媒を担持したミオグロビン複合体を得ることが可能である。上述のように、本発明では、ミオグロビン複合体を代表例として説明したが、本発明は、上記ミオグロビン複合体に限定されるものではなく、他のヘム蛋白質についても同様の手法でヘム蛋白質複合体を作製し、提供することが可能である。 The oxidation catalyst is generally about 0.1 to 5% by weight. Further, the method for supporting such an oxidation catalyst is not particularly limited. For example, a silica-based mesoporous material is stirred in an oxidation catalyst or a precursor solution, and then dried under reduced pressure. Accordingly, it is possible to obtain a myoglobin complex carrying an oxidation catalyst by oxidizing the precursor by heating or the like. As described above, in the present invention, the myoglobin complex has been described as a representative example. However, the present invention is not limited to the above myoglobin complex, and other heme proteins can also be treated in the same manner. Can be made and provided.
本発明により、（１）ミオグロビンを安定に、且つ大きな吸着量で吸着させたミオグロビン複合体を提供することができる、（２）ミオグロビン複合体と同様に、他のヘム蛋白質を同様の手法で複合化することができる、（３）ヘム蛋白質を安定に保持して、その活性を安定、且つ高活性で発揮させることが可能なヘム蛋白質の高度利用技術を提供することができる、（４）ヘム蛋白質の活性を維持して安定、且つ有効に発揮することが可能な新規機能性部材を提供することができる、という効果が奏される。 According to the present invention, (1) a myoglobin complex in which myoglobin is stably adsorbed with a large adsorption amount can be provided. (2) Similar to the myoglobin complex, other heme proteins are complexed in the same manner. (3) It is possible to provide a technique for highly utilizing a heme protein that can stably hold a heme protein and exhibit its activity stably and with high activity. (4) Heme There is an effect that it is possible to provide a novel functional member that can stably and effectively exhibit the protein activity.
次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although this invention is demonstrated concretely based on an Example, this invention is not limited to these Examples.
本実施例では、シリカ系メソ多孔体の合成を行った。
（１）合成例１
乾燥水ガラス（ＳｉＯ２／Ｎａ２Ｏ＝２．００）を７００℃で６時間、空気中で焼成し、ジケイ酸ソーダ（δ−Ｎａ２Ｓｉ２Ｏ５）に結晶化させた。この結晶５０ｇを５００ｍＬの水に分散させ、３時間攪拌した。その後、濾過して固形分を回収してカネマイトを得た。
In this example, a silica-based mesoporous material was synthesized.
(1) Synthesis example 1
Dry water glass (SiO 2 / Na 2 O = 2.00) was baked in air at 700 ° C. for 6 hours and crystallized in sodium disilicate (δ-Na 2 Si 2 O 5 ). 50 g of this crystal was dispersed in 500 mL of water and stirred for 3 hours. Thereafter, the solid content was collected by filtration to obtain kanemite.
こうして得られたカネマイト５０ｇを、０．１Ｍのドコシルトリメチルアンモニウムクロライド水溶液１０００ｍＬに分散させ、７０℃で３時間攪拌しながら加熱した。加熱初期の分散液のｐＨは１２．３であった。その後、７０℃で加熱、攪拌しながら２Ｎの塩酸を添加して、分散液のｐＨを８．５に下げた。そして、更に、７０℃で３時間加熱した後、室温まで放冷した。固形生成物をいったん濾過し、再び１０００ｍＬのイオン交換水に分散させ、攪拌した。この濾過・分散攪拌を５回繰り返してから風乾した。風乾して得られた試料を、窒素中４５０℃で３時間加熱した後、空気中で５５０℃で６時間焼成することにより、中心細孔直径４ｎｍのシリカ系メソ多孔体を得た。得られたシリカ系メソ多孔体を、以下「ＦＳＭ−２２」とする。 50 g of kanemite thus obtained was dispersed in 1000 mL of a 0.1 M aqueous solution of docosyltrimethylammonium chloride and heated at 70 ° C. with stirring for 3 hours. The pH of the dispersion at the initial stage of heating was 12.3. Then, 2N hydrochloric acid was added while heating and stirring at 70 ° C., and the pH of the dispersion was lowered to 8.5. And after heating at 70 degreeC for 3 hours, it stood to cool to room temperature. The solid product was once filtered, dispersed again in 1000 mL of ion exchange water, and stirred. This filtration / dispersion stirring was repeated 5 times and then air-dried. A sample obtained by air drying was heated in nitrogen at 450 ° C. for 3 hours and then calcined in air at 550 ° C. for 6 hours to obtain a silica-based mesoporous material having a center pore diameter of 4 nm. The obtained silica-based mesoporous material is hereinafter referred to as “FSM-22”.
ＦＳＭ−２２について、粉末Ｘ線回折及び窒素吸着等温線の測定を行った。粉末Ｘ線回折は、理学ＲＡＤ−Ｂ装置を用いて測定し、窒素吸着等温線は、液体窒素温度において、定容積法により求めた。Ｘ線回折パターンにより、ＦＳＭ−２２は、２次元ヘキサゴナルの細孔配列構造を有していることが分かった。また、窒素吸着等温線からCranston−Inklay法で計算した細孔分布曲線によると、全細孔容積に占める、中心細孔直径の±４０％の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合は、６０％以上であることが分かった。 For FSM-22, powder X-ray diffraction and nitrogen adsorption isotherm were measured. X-ray powder diffraction was measured using a RAD-B instrument, and the nitrogen adsorption isotherm was determined by the constant volume method at liquid nitrogen temperature. From the X-ray diffraction pattern, it was found that FSM-22 had a two-dimensional hexagonal pore arrangement structure. Further, according to the pore distribution curve calculated by the Cranston-Inklay method from the nitrogen adsorption isotherm, the ratio of the total volume of pores having a diameter within the range of ± 40% of the central pore diameter in the total pore volume Was found to be 60% or more.
（２）合成例２
合成例１におけるドコシルトリメチルアンモニウムクロライド水溶液を、同一濃度及び容量のヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド水溶液に代えた他は、合成例１と同様にして、中心細孔直径２．７ｎｍのシリカ系メソ多孔体を得た。得られたシリカ系メソ多孔体を、以下「ＦＳＭ−１６」とする。合成例１と同様の測定を行った結果、ＦＳＭ−１６は、２次元ヘキサゴナルの細孔配列構造を有しており、全細孔容積に占める中心細孔直径の±４０％の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合は、６０％以上であった。
(2) Synthesis example 2
A silica-based mesoporous material having a central pore diameter of 2.7 nm in the same manner as in Synthesis Example 1 except that the aqueous docosyltrimethylammonium chloride solution in Synthesis Example 1 was replaced with an aqueous solution of hexadecyltrimethylammonium chloride having the same concentration and volume. Got. The obtained silica-based mesoporous material is hereinafter referred to as “FSM-16”. As a result of the same measurement as in Synthesis Example 1, FSM-16 has a two-dimensional hexagonal pore arrangement structure, and a diameter within a range of ± 40% of the central pore diameter in the total pore volume. The ratio of the total volume of the pores having s was 60% or more.
本実施例では、ヘム蛋白質複合体の合成を行った。
ＦＳＭ−２２の粉末１００ｇと、ミオグロビンの水溶液（リン酸バッファｐＨ６．９）５ｍＬ（ミオグロビンのモル濃度：６ｍｇ／ｍｌ）とを混合し、２５℃で５時間震盪させた。その後、７０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行い、沈殿物を凍結乾燥した。これにより、ミオグロビンとＦＳＭ−２２との複合体（以下、「複合体１」という。）を得た。
In this example, a heme protein complex was synthesized.
100 g of FSM-22 powder and 5 mL of an aqueous solution of myoglobin (phosphate buffer pH 6.9) (molar concentration of myoglobin: 6 mg / ml) were mixed and shaken at 25 ° C. for 5 hours. Thereafter, centrifugation was performed at 7000 rpm for 20 minutes, and the precipitate was freeze-dried. Thereby, a complex of myoglobin and FSM-22 (hereinafter referred to as “complex 1”) was obtained.
ＦＳＭ−２２に代えて、ＦＳＭ−１６を用いた他は、実施例１と同様にして、ミオグロビンとＦＳＭ−１６との複合体（以下「複合体２」という。）を得た。図１に、ミオグロビンを模式的に示した説明図を示す。また、図２に、シリカ系メソ多孔体の細孔内部にミオグロビンを備える、ミオグロビン複合体（Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ−ＦＳＭ）を模式的に示した説明図を示す。 A complex of myoglobin and FSM-16 (hereinafter referred to as “complex 2”) was obtained in the same manner as in Example 1 except that FSM-16 was used instead of FSM-22. FIG. 1 is an explanatory diagram schematically showing myoglobin. FIG. 2 is an explanatory diagram schematically showing a myoglobin complex (Myoglobin-FSM) having myoglobin inside the pores of the silica-based mesoporous material.
（１）吸着量の測定
複合体１と２に対するミオグロビンの吸着量を測定した。吸着量の測定は、上記遠心分離で得られた上澄みを用いて行った。測定の結果を図３に示す。図３の左の縦軸は、それぞれのシリカ系メソ多孔体１００ｍｇに対するミオグロビンの吸着量、横軸は、吸着平衡濃度を示す。ＡがＦＳＭ−２２、ＢがＦＳＭ−１６、そして、ＣがＭＣＭ４１である。ＡのＦＳＭ−２２には、蛋白質が吸着していく様子が伺えるが、ＦＳＭ−１６、ＭＣＭ４１では、蛋白質の吸着量がＦＳＭ−２２に比べて少ないのが分かる。
(1) Measurement of adsorption amount The adsorption amount of myoglobin with respect to the composites 1 and 2 was measured. The amount of adsorption was measured using the supernatant obtained by the above centrifugation. The measurement results are shown in FIG. The vertical axis on the left in FIG. 3 represents the amount of myoglobin adsorbed on 100 mg of each silica-based mesoporous material, and the horizontal axis represents the adsorption equilibrium concentration. A is FSM-22, B is FSM-16, and C is MCM41. It can be seen that the FSM-22 of A shows that the protein is adsorbed, but the FSM-16 and MCM41 show that the amount of protein adsorbed is smaller than that of FSM-22.
（２）細孔分布の測定
図４に、窒素吸着等温線から求めたＦＳＭ−２２とＦＳＭ−１６、及び複合体１と２の細孔分布曲線を示す。
(2) Measurement of pore distribution FIG. 4 shows pore distribution curves of FSM-22 and FSM-16 and composites 1 and 2 obtained from nitrogen adsorption isotherms.
（３）窒素吸着の測定
図５に、複合体１の、窒素吸着曲線ａ）、及び細孔分布曲線ｂ）を示す。ＦＳＭ−２２に対し、ミオグロビンの吸着量の異なる５種類の複合体（ＦＳＭ−２２ １００ｍｇに対し、ミオグロビンが、それぞれ、Ａ:０ｍｇ Ｂ：２．２ｍｇ Ｃ：９ｍｇ Ｄ:１６ｍｇ Ｅ:２４ｍｇの吸着量）を作り、それぞれについて、窒素吸着特性について調べた。縦軸は、窒素の吸着量を示し、横軸に、そのときの相対圧力を示す。Ａでは、Ｐ／Ｐ０＝０．４付近で急激に立ち上がっている。このことは、規則正しい孔が綺麗に開いていること示している。一方、ミオグロビンが吸着したＦＳＭ−２２では、ミオグロビンの吸着量が増えるに従い、非表面積及び細孔容量が減少していることが分かる。このことは、孔の中にミオグロビンが導入されていることを示している。
(3) Measurement of nitrogen adsorption FIG. 5 shows a nitrogen adsorption curve a) and a pore distribution curve b) of the composite 1. 5 types of complex with different myoglobin adsorption amount against FSM-22 (myoglobin with respect to 100 mg of FSM-22, A: 0 mg B: 2.2 mg C: 9 mg D: 16 mg E: 24 mg, respectively) ) And investigated the nitrogen adsorption characteristics of each. The vertical axis represents the amount of nitrogen adsorbed, and the horizontal axis represents the relative pressure at that time. In A, it rises sharply around P / P 0 = 0.4. This indicates that the regular holes are cleanly opened. On the other hand, in FSM-22 in which myoglobin is adsorbed, it can be seen that the non-surface area and pore volume decrease as the amount of myoglobin adsorbed increases. This indicates that myoglobin has been introduced into the pores.
図５のｂ）に、窒素吸着等温線から求めた細孔分布曲線を示す。ＡがＦＳＭ−２２、Ｂ〜Ｅ（ＦＳＭ−２２ １００ｍｇに対し、ミオグロビンが、それぞれ、Ｂ：２４ｍｇ Ｃ：１６ｍｇ Ｄ：９ｍｇ Ｅ：２．２ｍｇの吸着量）がミオグロビン−ＦＳＭ−２２を示す。Ａでは、６ｎｍ付近にシャープなピークが見られる。一方、ミオグロビンが吸着したＦＳＭ−２２（Ｂ〜Ｅ）では、ミオグロビンの吸着量が増えるに従って、細孔容量が減少していることが分かる。 FIG. 5 b) shows the pore distribution curve obtained from the nitrogen adsorption isotherm. A is FSM-22, and B to E (myoglobin is 100 mg of FSM-22, B: 24 mg, C: 16 mg, D: 9 mg, E: 2.2 mg, respectively) are myoglobin-FSM-22. In A, a sharp peak is seen around 6 nm. On the other hand, in FSM-22 (B to E) in which myoglobin is adsorbed, it can be seen that the pore volume decreases as the amount of adsorbed myoglobin increases.
（４）一酸化炭素の吸着
（一酸化炭素吸着量評価試験）
ミオグロビン複合体４５ｍｇを水１０ｍｌに分散させた分散液を調製した。このミオグロビン複合体に、一酸化炭素を５分間バブリングした。一酸化炭素をバブリングした後の、ミオグロビン複合体について、スペクトルを測定した。その結果を図６に示す。
(4) Adsorption of carbon monoxide (carbon monoxide adsorption evaluation test)
A dispersion was prepared by dispersing 45 mg of myoglobin complex in 10 ml of water. Carbon monoxide was bubbled through this myoglobin complex for 5 minutes. The spectrum was measured for the myoglobin complex after bubbling carbon monoxide. The result is shown in FIG.
図６によれば、一酸化炭素をバブリングすることでスペクトルが変化しており、一酸化炭素がミオグロビン複合体に吸着されていることが確認された。これらの結果から、本発明のヘム蛋白質複合体が、一酸化炭素吸着剤として十分に利用できることが分かった。 According to FIG. 6, the spectrum was changed by bubbling carbon monoxide, and it was confirmed that carbon monoxide was adsorbed to the myoglobin complex. From these results, it was found that the heme protein complex of the present invention can be sufficiently used as a carbon monoxide adsorbent.
（５）有機溶媒中での過酸化脂質の酸化
（ペルオキシダーゼ反応の試験）
図７に、有機溶媒中でのミオグロビン−ＦＳＭとミオグロビンの吸収スペクトルを示す。実線がミオグロビン−ＦＳＭ、破線がミオグロビンである。このスペクトルは、ミオグロビン−ＦＳＭが有機溶媒中で安定に存在していることを示している。次に、有機溶媒中での過酸化脂質の酸化について検討した。図８に、その触媒反応を示す。
(5) Oxidation of lipid peroxide in organic solvent (peroxidase reaction test)
FIG. 7 shows absorption spectra of myoglobin-FSM and myoglobin in an organic solvent. The solid line is myoglobin-FSM and the broken line is myoglobin. This spectrum shows that myoglobin-FSM is stably present in organic solvents. Next, the oxidation of lipid peroxide in an organic solvent was examined. FIG. 8 shows the catalytic reaction.
その反応は、以下の様に行われた。トルエン３ｍｌに、ミオグロビン複合体を４ｍｇ（ミオグロビン含有率３０％）加え、反応色素としてロイコクリスタルバイオレットを６ｍｇ加え、過酸化脂質であるベンゾイルオキシド０．４ｍｇを加え、２５℃で反応させた。ロイコクリスタルバイオレットは、ベンゾイルオキシドが酸化されると６０４ｎｍに吸収が現れることから、それを指標とした。その結果を図９に示す。 The reaction was performed as follows. To 3 ml of toluene, 4 mg of myoglobin complex (myoglobin content 30%) was added, 6 mg of leuco crystal violet was added as a reactive dye, 0.4 mg of benzoyl oxide as lipid peroxide was added, and the mixture was reacted at 25 ° C. Since leuco crystal violet absorbs at 604 nm when benzoyl oxide is oxidized, it was used as an index. The result is shown in FIG.
縦軸がロイコクリスタルバイオレットが反応したときに現れる吸収である６０４ｎｍを、横軸に反応時間を示している。Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ−ＦＳＭはミオグロビン複合体、Ｎａｔｉｖｅはミオグロビンを示している。図１０によると、Ｎａｔｉｖｅはほとんど反応が進まないのに対し、Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ−ＦＳＭは効率よく反応が進行するのが分かる。これは、ミオグロビンは有機溶媒中で蛋白質が変性してしまうのに対し、ＦＳＭに入ったミオグロビンは変性せずに活性を維持していることを示している。 The vertical axis represents absorption at 604 nm that appears when leuco crystal violet reacts, and the horizontal axis represents the reaction time. Myoglobin-FSM represents a myoglobin complex, and Native represents myoglobin. According to FIG. 10, it can be seen that the reaction hardly proceeds with Native, whereas the reaction proceeds efficiently with Myoglobin-FSM. This indicates that myoglobin is denatured in an organic solvent, whereas myoglobin contained in FSM maintains its activity without being denatured.
（６）酸素の吸着
リン酸緩衝液（ｐＨ６．９）中でミオグロビン複合体に酸素を供給してデオキシミオグロビンのオキシミオグロビンへの変換を行い、スペクトル変化を測定した。その結果を図１０に示す。波長３８８、４５５、５１５、５２５、５４７、５７７及び５８８ｎｍにおいてｉｓｏｂｅｓｔｉｃ ｐｏｉｎｔが観察され、デオキシミオグロビンからオキシミオグロビンへの変換に伴って、酸素の吸着の過程でスペクトル変化が測定された。これらの結果から、本発明のヘム蛋白質複合体が、酸素吸着剤及び酸素濃縮材料として利用できることが分かった。
(6) Adsorption of oxygen Oxygen was supplied to the myoglobin complex in a phosphate buffer (pH 6.9) to convert deoxymyoglobin into oxymyoglobin, and the change in spectrum was measured. The result is shown in FIG. Isobestic points were observed at wavelengths of 388, 455, 515, 525, 547, 577 and 588 nm, and spectral changes were measured during the adsorption of oxygen with the conversion of deoxymyoglobin to oxymyoglobin. From these results, it was found that the heme protein complex of the present invention can be used as an oxygen adsorbent and an oxygen-enriched material.
以上説明したように、本発明は、ミオグロビン複合体に係るものであり、本発明によれば、ミオグロビンを安定的に十分な吸着量で吸着させた、酸素等の吸着剤として十分に活用することが可能なヘムタンパク複合体を提供することが可能となる。また、本発明のミオグロビン複合体の製造方法によれば、ミオグロビンを安定的に十分な吸着量で吸着させた本発明のミオグロビン複合体を、効率的且つ確実に製造することができる。本発明は、ミオグロビン等のヘム蛋白質の活性を安定、且つ有効に保持して、その多様な機能性を発揮させることが可能な新規機能性部材を提供することができることから、ヘム蛋白質を利用した新しいヘム蛋白質高度利用技術を実現するものとして有用である。 As described above, the present invention relates to a myoglobin complex, and according to the present invention, the myoglobin is sufficiently utilized as an adsorbent such as oxygen, which is stably adsorbed with a sufficient adsorption amount. It is possible to provide a hemoprotein complex capable of Moreover, according to the method for producing a myoglobin complex of the present invention, the myoglobin complex of the present invention in which myoglobin is stably adsorbed with a sufficient adsorption amount can be produced efficiently and reliably. Since the present invention can provide a novel functional member capable of stably and effectively maintaining the activity of a heme protein such as myoglobin and exhibiting various functions thereof, heme protein is used. It is useful for realizing a new advanced technology for heme protein.
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