JP2007029017A - Method for producing optically active carboxylic acid using luciferase - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、医薬品、農薬および機能性材料の原料、光学分割剤等として有用な光学活性カルボン酸を、ルシフェラーゼを用いて製造する方法に関する。 The present invention relates to a method for producing an optically active carboxylic acid useful as a raw material for pharmaceuticals, agricultural chemicals and functional materials, an optical resolving agent and the like using luciferase.
カルボン酸は、各種の産業分野で利用されている有機化合物であり、特にそれらの光学活性体は医薬品、農薬および機能性材料の原料等として有用な化合物である。カルボン酸の光学異性体混合物については容易に合成することが可能であり（非特許文献１、２参照）、異性体を簡便かつ安全に分離して光学活性なカルボン酸を製造する方法が求められている。 Carboxylic acids are organic compounds used in various industrial fields. In particular, their optically active substances are useful compounds as raw materials for pharmaceuticals, agricultural chemicals and functional materials. A mixture of optical isomers of carboxylic acids can be easily synthesized (see Non-Patent Documents 1 and 2), and a method for producing optically active carboxylic acids by separating isomers simply and safely is required. ing.
ルシフェラーゼはＡＴＰ、２価金属イオン（Ｍｇ２＋やＭｎ２＋等）および酸素の存在下、ルシフェリンを発光基質として、発光反応を触媒する酵素であり、その反応式は、以下の通りである。 Luciferase is an enzyme that catalyzes a luminescent reaction using luciferin as a luminescent substrate in the presence of ATP, divalent metal ions (Mg 2+ , Mn 2+, etc.) and oxygen, and its reaction formula is as follows.
ルシフェラーゼの代表的なものとして甲虫由来のルシフェラーゼがあり、例えばゲンジホタル（Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ）、ヘイケホタル（Ｌｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ）、アメリカホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）を由来とする酵素が知られている。ルシフェラーゼは、組換え体の製造方法が確立しており（例えば、特許文献１、２参照。）、微生物や食品残渣由来のＡＴＰ量を測定する清浄度検査や微生物由来のＡＴＰ量を測定する菌数検査等の衛生検査分野で利用されるとともに、玩具、遊具、演出装置の発光材料等にも利用されている（非特許文献３参照）。
A typical example of luciferase is beetle-derived luciferase. For example, enzymes derived from luciferase, Luciola lateralis, and firefly (Pintinus pyralis) are known. Luciferase has established a method for producing a recombinant (see, for example, Patent Documents 1 and 2), a cleanliness test for measuring the amount of ATP derived from microorganisms and food residues, and a bacterium for measuring the amount of ATP derived from microorganisms. In addition to being used in the field of hygiene inspection such as number inspection, it is also used for toys, playground equipment, luminescent materials for production devices, and the like (see Non-Patent Document 3).
またビオチン化されたルシフェラーゼについても、ビオチン・アビジンを利用した高感度検出系を原理として臨床検査、衛生検査の分野で使用されている（非特許文献３、４参照）。 Biotinylated luciferase is also used in the field of clinical examination and hygiene examination based on the principle of a highly sensitive detection system using biotin / avidin (see Non-patent Documents 3 and 4).
また従来から、ホタルルシフェラーゼが、アデノシン３リン酸（以下「ＡＴＰ」ともいう）およびマグネシウムイオン存在下にて、脂肪酸とコエンザイムＡ（以下「ＣｏＡ」ともいう）の反応を触媒する酵素であるアシルＣｏＡシンターゼと、アミノ酸配列において相同性を示すことが知られている。近年、ホタルルシフェラーゼがルシフェリン以外の脂肪酸を基質とするアシルＣｏＡシンターゼ活性を有することが示され（非特許文献５参照）、ルシフェラーゼを用いる脂肪酸ＣｏＡの製造方法について報告されており（特許文献３参照）、その反応は以下の通りである。 Conventionally, firefly luciferase is an enzyme that catalyzes the reaction between fatty acid and coenzyme A (hereinafter also referred to as “CoA”) in the presence of adenosine triphosphate (hereinafter also referred to as “ATP”) and magnesium ions. It is known to show homology with synthase in amino acid sequence. In recent years, it has been shown that firefly luciferase has acyl CoA synthase activity using fatty acids other than luciferin as a substrate (see Non-Patent Document 5), and a method for producing fatty acid CoA using luciferase has been reported (see Patent Document 3). The reaction is as follows.
しかしながら、ホタルルシフェラーゼがルシフェリン以外の脂肪酸を基質とするときの立体認識能についてはこれまでに知見がなく、本酵素を光学活性な各種カルボン酸の製造に利用した例はこれまでに報告されていなかった。 However, there has been no knowledge of the ability of firefly luciferase to recognize steric recognition when fatty acids other than luciferin are used as substrates, and no examples of using this enzyme for the production of various optically active carboxylic acids have been reported so far. It was.
本発明が解決しようとする課題は、簡便かつ安全な光学活性カルボン酸の製造方法を提供することにある。 The problem to be solved by the present invention is to provide a simple and safe method for producing an optically active carboxylic acid.
そこで本発明者らは鋭意検討した結果、ルシフェラーゼを用いる生化学的手法が、上記課題を解決し得ることを見出し、これらの知見に基づき本発明を完成するに至った。 Thus, as a result of intensive studies, the present inventors have found that a biochemical method using luciferase can solve the above problems, and have completed the present invention based on these findings.
すなわち、本発明は、
１．（Ｒ）体及び（Ｓ）体のカルボン酸を含む光学異性体混合物に、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、２価金属イオン及びＣｏＡを反応させた後、チオエステル化反応により生成した一方のカルボン酸光学異性体のＣｏＡエステルと、他方のカルボン酸光学異性体とを分離することを特徴とする、光学活性カルボン酸の製造方法。
２．カルボン酸が、下記の化学式で示される、α−置換カルボン酸であることを特徴とする、上記１記載の光学活性なカルボン酸の製造方法。
That is, the present invention
1. The mixture of optical isomers containing the (R) and (S) carboxylic acids is reacted with luciferase, ATP, divalent metal ion and CoA, and then one of the carboxylic acid optical isomers produced by the thioesterification reaction. A method for producing an optically active carboxylic acid, comprising separating a CoA ester and the other carboxylic acid optical isomer.
2. 2. The method for producing an optically active carboxylic acid according to 1 above, wherein the carboxylic acid is an α-substituted carboxylic acid represented by the following chemical formula.
（化学式中、Ｒ１は置換または無置換のアリール基、置換または無置換のアリールオキシ基、置換または無置換の複素環基を表し、Ｒ２は置換または無置換のアルキル基を表す。）
３．ルシフェラーゼが、甲虫由来であることを特徴とする、上記１記載の光学活性なカルボン酸の製造方法。
に関する。
(In the chemical formula, R 1 represents a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted aryloxy group, or a substituted or unsubstituted heterocyclic group, and R 2 represents a substituted or unsubstituted alkyl group.)
3. 2. The method for producing an optically active carboxylic acid according to 1 above, wherein the luciferase is derived from a beetle.
About.
本発明によれば、操作が煩雑でなく、安全性にも優れた生化学的手法による、光学活性なカルボン酸の製造方法が提供された。 According to the present invention, there is provided a method for producing an optically active carboxylic acid by a biochemical method which is not complicated in operation and excellent in safety.
本発明は、（Ｒ）体及び（Ｓ）体のカルボン酸を含む光学異性体混合物に、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、２価金属イオン及びＣｏＡを反応させた後、チオエステル化反応により生成した一方のカルボン酸光学異性体のＣｏＡエステルと、他方のカルボン酸光学異性体とを分離することを特徴とする、光学活性カルボン酸の製造方法に関する。 In the present invention, a mixture of optical isomers containing (R) and (S) carboxylic acids is reacted with luciferase, ATP, divalent metal ion and CoA, and then one carboxylic acid produced by thioesterification reaction. The present invention relates to a method for producing an optically active carboxylic acid, which comprises separating a CoA ester of an optical isomer and the other carboxylic acid optical isomer.
カルボン酸は、特に限定されないが、α−置換カルボン酸が好ましく、例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、プラノプロフェン、フェノプロフェン、チアプロフェン酸、ロキソプロフェン、２−フェニルプロピオン酸、スプロフェン、インドプロフェン、プロチジン酸、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ミロプロフェン、フルノキサプロフェン、２−（ヒドロキシメチル）フェニル酢酸（トロパ酸）、２−フェニル酪酸、４−クロロ−２−（１−メチルエチル）フェニル酢酸、２−フェノキシプロピオン酸、２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸、２−（２−メチル−４−クロロフェノキシ）プロピオン酸、２−（２，４−ジクロロフェノキシ）プロピオン酸、２−メチル−３−フェニルプロピオン酸、３−メチル−２−フェニル酪酸、２−フェニルペンタン酸等が挙げられる。 The carboxylic acid is not particularly limited, but α-substituted carboxylic acid is preferable. For example, ibuprofen, naproxen, ketoprofen, flurbiprofen, pranoprofen, fenoprofen, thiaprofenic acid, loxoprofen, 2-phenylpropionic acid, suprofen , Indoprofen, Protidic acid, Aluminoprofen, Benoxaprofen, Miroprofen, Flunoxaprofen, 2- (hydroxymethyl) phenylacetic acid (tropic acid), 2-phenylbutyric acid, 4-chloro-2- (1 -Methylethyl) phenylacetic acid, 2-phenoxypropionic acid, 2- (4-chlorophenoxy) propionic acid, 2- (2-methyl-4-chlorophenoxy) propionic acid, 2- (2,4-dichlorophenoxy) propion Acid, 2-methyl-3- Enirupuropion acid, 3-methyl-2-phenylbutyric acid, and 2-phenyl-pentanoic acid.
カルボン酸の光学異性体混合物における（Ｒ）体と（Ｓ）体との混合比は任意であり、１：１のラセミ体でもよく、一方の比率が高いものであってもよい。当該ラセミ体は市販品を用いることができるが、例えば、非特許文献１、２記載の方法で合成することも可能である。
カルボン酸の一例は、下記の化学式で示される、α−置換カルボン酸である。
The mixing ratio of the (R) isomer and the (S) isomer in the optical isomer mixture of carboxylic acid is arbitrary, and may be a 1: 1 racemate, or one having a high ratio. A commercially available product can be used as the racemate, but it can also be synthesized by the methods described in Non-Patent Documents 1 and 2, for example.
An example of the carboxylic acid is an α-substituted carboxylic acid represented by the following chemical formula.
（化学式中、Ｒ１は置換または無置換のアリール基、置換または無置換のアリールオキシ基、置換または無置換の複素環基を表し、Ｒ２は置換または無置換のアルキル基を表す。）
化学式中のＲ１のアリール基、アリールオキシ基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基、フェニルオキシ基、ナフチルオキシ基等が挙げられる。複素環基としては、異種原子として、窒素、酸素、硫黄の少なくとも１種を１個から３個含み、３から１５の炭素から構成される複素環からなるものが好ましい。このような複素環としては、例えば、チオフェン、インドール等が挙げられる。化学式中のＲ２のアルキル基は炭素数１から８のものが望ましく、炭素数１から３のものが特に好ましい。これらのアリール基、アリールオキシ基、複素環基、アルキル基の炭素および窒素に結合している水素は、各種の置換基によって置換されていてもよい。かかる置換基としては、例えば、フッ素、塩素、ヨウ素、臭素等のハロゲン、ヒドロキシ基、チオール基、ニトロ基、アミノ基、フェニル基やナフチル基のようなアリール基、フェニルオキシ基やナフチルオキシ基のようなアリールオキシ基、異種原子として窒素、酸素、硫黄の少なくとも１種を１個から３個含み、３から１５個の炭素から構成される複素環および炭素数が１から８のアルキル基、ベンジル基、炭素数が１から８のアルコキシ基、炭素数１から１０のアシル基等が挙げられる。これらの置換基中の炭素および窒素に結合した水素が、さらに、上述の置換基で置換されていてもよい。
(In the chemical formula, R 1 represents a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted aryloxy group, or a substituted or unsubstituted heterocyclic group, and R 2 represents a substituted or unsubstituted alkyl group.)
Examples of the aryl group and aryloxy group represented by R 1 in the chemical formula include a phenyl group, a naphthyl group, a phenyloxy group, and a naphthyloxy group. The heterocyclic group is preferably a heterocyclic group composed of 3 to 15 carbons containing 1 to 3 of at least one of nitrogen, oxygen and sulfur as hetero atoms. Examples of such a heterocyclic ring include thiophene and indole. The alkyl group represented by R 2 in the chemical formula preferably has 1 to 8 carbon atoms, and particularly preferably has 1 to 3 carbon atoms. The hydrogen bonded to carbon and nitrogen of these aryl group, aryloxy group, heterocyclic group and alkyl group may be substituted with various substituents. Examples of such substituents include halogens such as fluorine, chlorine, iodine and bromine, hydroxy groups, thiol groups, nitro groups, amino groups, aryl groups such as phenyl groups and naphthyl groups, phenyloxy groups and naphthyloxy groups. An aryloxy group such as this, a heterocycle composed of 3 to 15 carbons containing 1 to 3 of at least one of nitrogen, oxygen and sulfur as hetero atoms and an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, benzyl Group, an alkoxy group having 1 to 8 carbon atoms, an acyl group having 1 to 10 carbon atoms, and the like. The hydrogen bonded to carbon and nitrogen in these substituents may be further substituted with the above-described substituents.
ルシフェラーゼとは、ＡＴＰ、２価金属イオン（Ｍｇ２＋やＭｎ２＋等）および酸素の存在下、ルシフェリンを発光基質として、発光反応を触媒する酵素であり、本発明においてはさらにＡＴＰ、２価金属イオン及びＣｏＡの存在下で、カルボン酸の一方の光学異性体を選択的に認識してチオエステル化し、カルボン酸のＣｏＡエステルに変換する活性も有する酵素である。ルシフェラーゼがカルボン酸の（Ｒ）体と（Ｓ）体のどちらをチオエステル化するかは、カルボン酸の種類により異なる。 A luciferase is an enzyme that catalyzes a luminescent reaction using luciferin as a luminescent substrate in the presence of ATP, divalent metal ions (Mg 2+ , Mn 2+, etc.) and oxygen. And an enzyme also having an activity of selectively recognizing and thioesterifying one optical isomer of a carboxylic acid and converting it to a CoA ester of the carboxylic acid in the presence of CoA. Whether the luciferase thioesterifies the (R) or (S) form of carboxylic acid depends on the type of carboxylic acid.
ルシフェラーゼとして好適なものとしては甲虫、例えばゲンジホタル（Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ）、ヘイケホタル（Ｌｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ）、アメリカホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）を由来とするルシフェラーゼが挙げられ、上記の甲虫の発光器に含まれるもの、クローニングされたルシフェラーゼ遺伝子を含有する組換え体により生産されたものが挙げられる。組換え体の宿主として、大腸菌等の微生物、植物、動物細胞等を用いることができる。また、ルシフェラーゼは天然型ルシフェラーゼに限定されず、変異型ルシフェラーゼであってもよい。 Suitable luciferases include beetles such as luciferases derived from beetle firefly (Luciola cruciata), Heike firefly (Luciola lateralis), American firefly (Photinus pyralis), and those included in the above-mentioned beetle luminophores are cloned. And those produced by recombinants containing the luciferase gene. As a recombinant host, microorganisms such as E. coli, plants, animal cells and the like can be used. The luciferase is not limited to natural luciferase, and may be a mutant luciferase.
本発明のルシフェラーゼは、それ自体を含有する上記の甲虫の発光器又は細胞、組換え体生産微生物もしくは組換え体生産細胞等の形で反応に利用しても良いが、当該ルシフェラーゼを含有する組織、培養物から分離して粗酵素や精製酵素等の形で反応に利用しても良い。このような粗酵素や精製酵素等は、例えば、１）超音波処理、２）ガラスビーズ又はアルミナを用いる摩砕処理、３）フレンチプレス処理、４）リゾチーム等の酵素処理、５）ワーリングブレンダー処理等により細胞、組織または菌体等を破砕し、得られた破砕物から６）硫安などを用いる塩析、７）有機溶媒、ポリエチレングリコール等の有機ポリマーによる沈澱、８）イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種のクロマトグラフィー、９）電気泳動等の通常の方法により調製することができる。さらにまた、ルシフェラーゼを、共有結合、イオン結合、吸着などにより担体に結合させる担体結合法、高分子の網目構造の中に閉じ込める包括法等の固定化の方法によって不溶化し、反応液から容易に分離可能な状態に加工した固定物の形で利用することもできる。 The luciferase of the present invention may be used for the reaction in the form of the above-mentioned beetle luminescent device or cell containing itself, a recombinant-producing microorganism or a recombinant-producing cell, etc., but the tissue containing the luciferase Alternatively, it may be separated from the culture and used for the reaction in the form of a crude enzyme, a purified enzyme or the like. Such crude enzymes and purified enzymes include, for example, 1) ultrasonic treatment, 2) grinding treatment using glass beads or alumina, 3) French press treatment, 4) enzyme treatment such as lysozyme, and 5) Waring blender treatment. 6) Salting out using ammonium sulfate, etc. 7) Precipitation with organic solvents, organic polymers such as polyethylene glycol, etc. 8) Ion exchange chromatography, hydrophobicity It can be prepared by various methods such as chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography and the like, and 9) ordinary methods such as electrophoresis. Furthermore, the luciferase is insolubilized by the immobilization method such as the carrier binding method in which the luciferase is bound to the carrier by covalent bond, ionic bond, adsorption, etc., or the inclusion method confined in the polymer network structure, and easily separated from the reaction solution. It can also be used in the form of a fixed object that has been processed into a possible state.
本発明のＡＴＰは市販のＡＴＰでも、ＡＴＰ産生酵素によって試料中のほかの化合物から生成されたものでもよい。ＡＴＰ産生酵素としてはアセテートキナーゼ、ピルベートオルトフォスフェートジキナーゼ（ＰＰＤＫ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 The ATP of the present invention may be a commercially available ATP or one produced from another compound in a sample by an ATP producing enzyme. Examples of ATP-producing enzymes include acetate kinase, pyruvate orthophosphate dikinase (PPDK), and the like, but are not limited thereto.
本発明のＣｏＡは市販のＣｏＡでも、ＣｏＡ産生酵素によって試料中のほかの化合物から生成されたものでもよい。組換え体でルシフェラーゼを発現させる場合、ＡＴＰ産生酵素やＣｏＡ産生酵素を共発現させ、ＡＴＰやＣｏＡを生合成させることもできる。 The CoA of the present invention may be a commercially available CoA or one produced from another compound in a sample by a CoA producing enzyme. When luciferase is expressed in a recombinant, ATP-producing enzyme or CoA-producing enzyme can be co-expressed to biosynthesize ATP or CoA.
本発明において、以下に示すように、ルシフェラーゼにより生成するカルボン酸のＣｏＡエステルを化学的もしくは酵素的にラセミ化し、加水分解させて、一方の光学活性カルボン酸に収束させる（デラセミ化させる）こともできる。組換え体でルシフェラーゼを発現させる場合、ラセミ化酵素や加水分解酵素を共発現させてデラセミ化を行うことも可能である。 In the present invention, as shown below, the CoA ester of the carboxylic acid produced by luciferase may be chemically or enzymatically racemized and hydrolyzed to converge to one optically active carboxylic acid (deracemized). it can. When luciferase is expressed in a recombinant, deracemization can be performed by co-expressing a racemase or a hydrolase.
本発明の２価金属イオンは、好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋等であるが、特にこれらに限定されない。
カルボン酸の光学異性体混合物、ルシフェラーゼ、２価金属イオン及びＣｏＡの反応温度は、１０〜７０℃が可能であるが、酵素の至適温度と安定性の点から、２０〜５０℃の範囲がより好ましい。温度３０℃における、チオエステル化反応を図１に示した。
The divalent metal ion of the present invention is preferably Mg 2+ , Mn 2+ or the like, but is not particularly limited thereto.
The reaction temperature of the optical isomer mixture of carboxylic acid, luciferase, divalent metal ion and CoA can be 10-70 ° C, but in the range of 20-50 ° C from the optimum temperature and stability of the enzyme. More preferred. The thioesterification reaction at a temperature of 30 ° C. is shown in FIG.
本発明の反応は通常緩衝液中で行うが、必要に応じ、エチレングリコールやグリセロール等の酵素の安定化剤や基質を溶解するためにエタノール等の有機溶媒や界面活性剤を添加してもよい。緩衝液としては、ｐＨ５〜９の通常の緩衝液、例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、各種グッドバッファー等を挙げることができる。酵素の至適ｐＨと安定性の点から、ｐＨ６〜８で反応を行うことがさらに好ましい。
本発明の反応時間はいかなる時間でもよいが、１分間から１週間、さらに具体的には３０分間から３日間程度で反応を停止させるのが好ましい。
The reaction of the present invention is usually carried out in a buffer solution. If necessary, an organic solvent such as ethanol or a surfactant may be added to dissolve an enzyme stabilizer or substrate such as ethylene glycol or glycerol. . Examples of the buffer include normal buffers having a pH of 5 to 9, such as phosphate buffer, acetate buffer, Tris-HCl buffer, and various good buffers. It is more preferable to carry out the reaction at pH 6 to 8 from the viewpoint of the optimum pH and stability of the enzyme.
The reaction time of the present invention may be any time, but it is preferable to stop the reaction in about 1 minute to 1 week, more specifically about 30 minutes to 3 days.
上記のチオエステル化反応により、ＣｏＡチオエステル化合物として、一方のカルボン酸光学異性体のＣｏＡエステルが生成する。他方のカルボン酸光学異性体は、未反応のまま、反応系に残される。反応終了後の反応系から、生成した一方のカルボン酸光学異性体のＣｏＡエステルと、他方のカルボン酸光学異性体とを分離する方法は任意である。分離法としては、例えば、反応液のｐＨを塩酸等の酸で酸性にした後にジエチルエーテルや酢酸エチル等の有機溶媒を用いて抽出する方法、シリカゲルやイオン交換樹脂等を用いるクロマトグラフィーの方法、再結晶等を適宜用いることができる。 By the thioesterification reaction, a CoA ester of one carboxylic acid optical isomer is generated as a CoA thioester compound. The other carboxylic acid optical isomer is left unreacted in the reaction system. A method for separating the produced CoA ester of one carboxylic acid optical isomer and the other carboxylic acid optical isomer from the reaction system after completion of the reaction is arbitrary. Examples of the separation method include, for example, a method in which the pH of the reaction solution is acidified with an acid such as hydrochloric acid and then extracted using an organic solvent such as diethyl ether or ethyl acetate, a chromatography method using silica gel or an ion exchange resin, Recrystallization or the like can be used as appropriate.
未反応のまま残ったカルボン酸光学異性体については、反応液を塩酸酸性とした後、ジエチルエーテルを用いて抽出後、有機溶媒を減圧濃縮し、適宜、各種クロマトグラフィーで精製すればよい。また反応生成物であるカルボン酸のＣｏＡエステルについては、塩酸酸性条件下にてジエチルエーテルを用いて抽出操作を十分に行った水相に含まれているので、これを濃縮し、各種クロマトグラフィーで精製すればよい。 The unreacted carboxylic acid optical isomer may be acidified with hydrochloric acid, extracted with diethyl ether, concentrated under reduced pressure, and appropriately purified by various chromatography. The CoA ester of carboxylic acid, which is a reaction product, is contained in an aqueous phase that has been sufficiently extracted using diethyl ether under acidic conditions of hydrochloric acid. What is necessary is just to refine.
なお、カルボン酸のＣｏＡエステルは、それを含む水相に水酸化ナトリウム等のアルカリを添加し、アルカリ性条件下にて加水分解反応を行って生成するカルボン酸を、塩酸酸性条件下にてジエチルエーテルを用いて抽出後、有機溶媒を減圧濃縮して、適宜、各種クロマトグラフィーで精製して、カルボン酸の形で回収することも可能である。この方法により、カルボン酸のＣｏＡエステルは、光学活性なカルボン酸として回収することができる。カルボン酸のＣｏＡエステルはエピメリ化されやすいため、これを意図的にエピメリ化させる条件下で加水分解してラセミ体のカルボン酸に変換し、これをルシフェラーゼによる光学分割反応の原料として再利用することも可能である。 The CoA ester of carboxylic acid is obtained by adding an alkali such as sodium hydroxide to an aqueous phase containing the carboxylic acid, and performing a hydrolysis reaction under alkaline conditions to produce diethyl ether under hydrochloric acid acidic conditions. After extraction using, the organic solvent can be concentrated under reduced pressure, and purified by various chromatography as appropriate, and recovered in the form of carboxylic acid. By this method, the CoA ester of carboxylic acid can be recovered as an optically active carboxylic acid. Since the CoA ester of carboxylic acid is easily epimerized, it must be hydrolyzed under the conditions to intentionally epimerize it to convert it into a racemic carboxylic acid, which can be reused as a raw material for the optical resolution reaction by luciferase. Is also possible.
以下、実施例を示し、本発明を説明するが、本発明の技術的範囲はこれによって何ら限定されることはない。
〔光学活性カルボン酸の製造方法〕
５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４，５００μｌ）に、表１記載の各種カルボン酸のラセミ体（０．２５ｍＭ）、ＡＴＰ（１０ｍＭ）、ＣｏＡ （２ｍＭ）、塩化マグネシウム（１０ｍＭ）及びエチレングリコール（３％ｖ／ｖ）となるように溶解した。３０℃にて３分間保温した後に、ルシフェラーゼ溶液（ヘイケホタル由来、キッコーマン社製、１４２μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を添加し、反応を開始した。６０分後、２Ｍ塩酸（１００μｌ）およびジエチルエーテル（１ｍｌ）を加えて撹拌し、１５，０００ｒｐｍにて５分間遠心した。直ちに−８０℃にて水相を凍結し有機相を回収し、遠心濃縮機にて溶媒を留去し、未反応のカルボン酸を回収した。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is shown and this invention is demonstrated, the technical scope of this invention is not limited at all by this.
[Method for producing optically active carboxylic acid]
In a 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.4, 500 μl), various racemic carboxylic acids listed in Table 1 (0.25 mM), ATP (10 mM), CoA (2 mM), magnesium chloride (10 mM) and ethylene glycol (3 % V / v). After incubating at 30 ° C. for 3 minutes, a luciferase solution (derived from Heike firefly, manufactured by Kikkoman Corporation, 142 μg protein) was added to initiate the reaction. After 60 minutes, 2M hydrochloric acid (100 μl) and diethyl ether (1 ml) were added and stirred, followed by centrifugation at 15,000 rpm for 5 minutes. Immediately, the aqueous phase was frozen at −80 ° C. to recover the organic phase, and the solvent was distilled off with a centrifugal concentrator to recover unreacted carboxylic acid.
カルボン酸のＣｏＡエステルを含有する凍結した水相については、室温に放置して融解し、未回収のカルボン酸を完全に取り除くためジエチルエーテルによる上記の抽出操作をさらに２回行った。その後２Ｍ水酸化ナトリウム（１２０μｌ）を添加し、室温にてカルボン酸のＣｏＡエステルの加水分解を行った。３０分後、２Ｍ塩酸（１２０μｌ）にて再度酸性とし、上記と同様にジエチルエーテルによる抽出、溶媒の留去を行い、カルボン酸として回収した。
得られたカルボン酸は、ヘキサン：イソプロピルアルコール＝９：１で溶解し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて鏡像体過剰率（ｅｅ）を決定した。
表１に各種カルボン酸のＨＰＬＣの分析条件（カラム、溶媒、流速、検出波長）と保持時間（ｔＲ）を示す。
The frozen aqueous phase containing the CoA ester of carboxylic acid was allowed to thaw at room temperature, and the above extraction operation with diethyl ether was further performed twice to completely remove unrecovered carboxylic acid. Thereafter, 2M sodium hydroxide (120 μl) was added, and the CoA ester of carboxylic acid was hydrolyzed at room temperature. After 30 minutes, the mixture was acidified again with 2M hydrochloric acid (120 μl), extracted with diethyl ether, and the solvent was distilled off in the same manner as described above to recover the carboxylic acid.
The obtained carboxylic acid was dissolved in hexane: isopropyl alcohol = 9: 1, and the enantiomeric excess (ee) was determined by high performance liquid chromatography (HPLC).
Table 1 shows the HPLC analysis conditions (column, solvent, flow rate, detection wavelength) and retention time (t R ) of various carboxylic acids.
表２に、未反応のカルボン酸および反応生成物のチオエステルを加水分解して得たカルボン酸の鏡像体過剰率の分析結果を示す。表２に示される基質を用いた場合、図１に示されるとおり、（Ｒ）体が優先的にチオエステルに変換されていることがわかった。中でもイブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、フルルビプロフェンについては（Ｒ）体の反応速度が大きく、（Ｓ）体のカルボン酸を高い鏡像体過剰率で回収することができた。特にイブプロフェン、ナプロキセンを基質とした場合は反応の立体選択性が高く、（Ｒ）体についても比較的高い鏡像体過剰率で得ることができた。トロパ酸については、反応速度は小さいものの、立体選択性が高かったため、（Ｒ）体を高い鏡像体過剰率で得ることができた。 Table 2 shows the analysis results of the enantiomeric excess of the carboxylic acid obtained by hydrolyzing the unreacted carboxylic acid and the thioester of the reaction product. When the substrates shown in Table 2 were used, it was found that the (R) isomer was preferentially converted to a thioester as shown in FIG. Among them, ibuprofen, naproxen, ketoprofen, and flurbiprofen had a high reaction rate of the (R) isomer, and the (S) carboxylic acid could be recovered with a high enantiomeric excess. In particular, when ibuprofen and naproxen were used as substrates, the stereoselectivity of the reaction was high, and the (R) isomer could be obtained with a relatively high enantiomeric excess. With regard to tropic acid, although the reaction rate was low, the stereoselectivity was high, so that the (R) isomer could be obtained with a high enantiomeric excess.
本発明は、カルボン酸の光学活性体を簡便、かつ安全に提供するものである。本発明により得られるカルボン酸は医薬品等の原料として広い分野で有効に利用される。 The present invention provides a carboxylic acid optically active substance simply and safely. The carboxylic acid obtained by the present invention is effectively used in a wide field as a raw material for pharmaceuticals and the like.
Claims (3)
One carboxylic acid optical isomer produced by thioesterification reaction after reacting luciferase, ATP, divalent metal ion and coenzyme A to a mixture of optical isomers containing (R) and (S) carboxylic acids A method for producing an optically active carboxylic acid, comprising separating the coenzyme A ester from the other carboxylic acid optical isomer.
（化学式中、Ｒ１は置換または無置換のアリール基、置換または無置換のアリールオキシ基、置換または無置換の複素環基を表し、Ｒ２は置換または無置換のアルキル基を表す。）
The method for producing an optically active carboxylic acid according to claim 1, wherein the carboxylic acid is an α-substituted carboxylic acid represented by the following chemical formula.
(In the chemical formula, R 1 represents a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted aryloxy group, or a substituted or unsubstituted heterocyclic group, and R 2 represents a substituted or unsubstituted alkyl group.)
The method for producing an optically active carboxylic acid according to claim 1, wherein the luciferase is derived from a beetle.
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