JP2006506998A

JP2006506998A - 癌の治療のためのｇｓｔａ３−３およびｇｓｔａ１−１の阻害剤

Info

Publication number: JP2006506998A
Application number: JP2004555203A
Authority: JP
Inventors: ベングト・マンネルヴィク
Original assignee: Biovitrum AB
Current assignee: Swedish Orphan Biovitrum AB
Priority date: 2002-11-22
Filing date: 2003-11-24
Publication date: 2006-03-02
Also published as: EP1567645A1; WO2004048577A1; US20060148020A1; CA2506411A1; SE0203479D0; AU2003279691A1

Abstract

本発明は、ステロイドホルモン生成阻害に応答性の癌および他の疾患の治療のためのターゲットとしての、新しい薬物ターゲットである、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、好ましくはＧＳＴＡ３−３に関連する。加えて本発明は、ＧＳＴ活性を調節する、好ましくは阻害する化合物或いは薬物候補のスクリーニング方法に関連するものであり、当該方法においてＧＳＴは薬物ターゲットとして用いられる。さらに本発明は例えば、癌、好ましくは前立腺癌或いは乳癌の治療のための、ステロイドホルモン依存性疾患の治療用の薬の製造のための、ＧＳＴＡ３−３の阻害剤の使用に関連する。加えて本発明は、例えば、ＧＳＴＡ３−３の組織濃度を調節する、或いは、ＧＳＴＡ３−３の酵素活性を阻害する非ステロイド性化合物を、治療が必要なヒトに投与することを含む、癌或いはステロイドホルモン依存性疾患の治療方法に関連する。

Description

発明の詳細な説明

発明の分野
本発明は新しい薬物ターゲットに関連する。より正確に言えば、ステロイドホルモン生成阻害に応答性の癌および他の疾患の治療のためのターゲットとしてのグルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である。好ましくは、ＧＳＴはステロイドイソメラーゼ活性を有するＧＳＴＡ３−３である。

発明の背景
前立腺癌および乳癌は悪性疾患の２つの主要な型であり、人口比率に重大な影響を及ぼす。両症例における腫瘍の増殖は多くの場合ステロイドホルモンに依存し、重要な治療上の取り組みとしてはホルモン生成物の除去およびホルモンレセプターの遮断を含む。

ステロイドホルモンの生合成は、一連の代謝中間体を経て、コレステロールからアンドロゲン（例えばテストステロンおよびジヒドロテストステロン）およびエストロゲン（例えばプロゲステロンおよびエストラジオール）へ進行する。各々のホルモンを導く各々の経路においての必須段階は、ステロイド構造におけるΔ^５−２重結合のΔ^４−２重結合への異性化を含む。異性化は、３β−ヒドロキシ化合物の３−ケトステロイドへの酸化により先行され、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼにより触媒される。当該デヒドロゲナーゼは関連するステロイドイソメラーゼ活性を有することが示されている。

グルタチオントランスフェラーゼ、ＧＳＴｓは多様な形態で存在し、すべての細胞分画に存在する（１）。哺乳類のＧＳＴｓは可溶性および膜結合酵素に分類されうる。伝統的にそれらは、突然変異、癌および他の変性疾患を引き起こす求電子性化合物に対する主要な細胞防御を構成している解毒酵素とみなされている。しかしながら、ヒトを含む真核生物細胞中のＧＳＴ相同遺伝子の数は、３０を超えると推定され、いくつかのＧＳＴｓは生理学的に重要な基質に関して、他の特異的な役割を有するということが明らかになっている。それゆえ、いくつかのＧＳＴｓは十分に限定した細胞基質の代謝において役割を有するので、ＧＳＴｓを求電子性化合物の一般的な解毒に限定するものとみなすことは語弊がある。最近発見されたＧＳＴＡ３−３は明らかに、ホルモンの生合成におけるステロイドの２重結合の異性化において、かかる異なる役割を有し、正確には、解毒酵素ではなくむしろステロイドイソメラーゼとみなされるべきである（２）。

該酵素は精巣、卵巣、胎盤および副腎のようなステロイド産生器官に存在するが、肝臓、胸腺、骨格筋および脳のような他の組織においては意味のある量ではない（２）。ヒト副腎株化細胞Ｈ２９５Ｒにおける推定上のＧＳＴは明らかに、ステロイドホルモン合成を刺激する下垂体ペプチドである副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）により誘発される（３）。

細胞解毒酵素としてのＧＳＴｓ作用はin vitroにおいて、広い範囲にわたる種々の作用剤により阻害されることが知られている（１）。異なるＧＳＴｓは阻害剤に対する感受性において甚だしく異なり、あるＧＳＴは、他のＧＳＴに全く効力のない化合物によって強く阻害される場合がある。あるＧＳＴｓ阻害剤は細胞組織および臨床試験において効力があることが示されている。しかしながら、最近発見されたＧＳＴＡ３−３／ステロイドイソメラーゼに対する阻害データはこれまで得られておらず（２）、既知の阻害剤はステロイドイソメラーゼ反応において効力がないかもしれない。

発明の概要
本発明によれば、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、好ましくはＧＳＴＡ３−３／ステロイドイソメラーゼは、ステロイド生合成において、２重結合の異性化への寄与に基づく化学療法のための新しいターゲットとして提供されている。ＧＳＴＡ３−３は選択的組織分布を有し、Δ^５−アンドロステン−３，１７−ジオンおよびΔ^５−プレグネン−３，２０−ジオンの異性化において高い触媒活性を示す（図１）。本発明は、ＧＳＴＡ３−３の触媒効率が、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼのステロイドイソメラーゼ活性の２００倍も高いことを示している。本発明は主に前立腺における癌に関連しているが、加えてステロイドホルモン生成阻害の原理は胸部および他の器官におけるステロイド応答性の癌に応用できる。さらに、クッシング症候群のようなステロイドホルモン依存性疾患に応用できる。

それゆえ第１の態様において、本発明は、癌、好ましくは前立腺癌および乳癌の治療のためのような、ステロイドホルモン依存性疾患の治療のための、ＧＳＴ活性を阻害する化合物のスクリーニングのための薬物ターゲットとしてのグルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の使用に関連する。加えて活性阻害は、該生合成阻害或いは該分解促進による触媒的活性を有するＧＳＴタンパク質の組織レベルの低下を含むことを意味している。

好ましくは、ＧＳＴはＧＳＴＡ３−３である。好ましくは、ＧＳＴＡ３−３或いはＧＳＴＡ１−１の活性を阻害する、医薬上許容される化合物がスクリーニングされる。それゆえ本発明は、ＧＳＴを調節する、好ましくは、阻害する化合物或いは薬物候補のスクリーニング方法に関連するものであり、当該方法においてＧＳＴは薬物ターゲットとして用いられる。かかるスクリーニングアッセイは例えば、ハイスループットスクリーニングとして実行される。

第２の態様において、本発明は、該スクリーニング方法により同定可能な、ＧＳＴＡ３−３或いはＧＳＴＡ１−１の阻害剤の薬剤としての使用に関連する。該薬は癌の治療、好ましくは、癌が前立腺癌或いは乳癌であるような、ステロイドホルモン依存性疾患の治療のために使用することができる。

本発明により使用されうる化合物の例は次の式：

［式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４はメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルのようなアルキル基；フェニル或いは置換された、好ましくは低級アルキル、ヒドロキシル、或いはアルコキシ基で置換されたフェニルのようなアリル基；或いはこれらの基の化学誘導体或いは組み合わせであってよく；該Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４基は直鎖状；低級アルキル、ヒドロキシル或いはアルコキシ基で置換されたような枝分かれ状；或いはシクロペンチルおよびシクロヘキシルのような環状であってもよく；該Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４基はＯ、ＳおよびＮのようなヘテロ原子を含んでもよい。該阻害剤はＸの周りの基の性質および空間的な配向性によっては立体異性体であってよく；該Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４基の２つ、３つ或いは４つが一緒になって連結し、中心のＸ原子との２座、３座、或いは４座配位子を有してもよく；或いは、該Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４基の１つ、２つ、３つ或いは４つがＣｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、アセテートイオンのようなカルボキシレートイオンのイオンおよび相同体、或いはＸと配位する電子供与基を有する他の化学リガンドであってもよい。
ＸはＧｅ、Ｓｎ、Ｐｂ或いは類似な求電子性原子である。］
を有するＧＳＴ阻害剤を含む。

好ましくは、ＧＳＴ阻害剤は求電子性原子としてスズ（Ｓｎ）を含み、というのも、かかる化合物は適度な毒性とターゲット酵素の強力な阻害を兼ね備えているからである。阻害剤中のスズ原子はＳｎ（II）或いはＳｎ（IV）のように異なる酸化状態を有してよく、およびリガンドの配位数は２、３、４、５或いは６であってよい。

好ましくは、Ｒ_１ないしＲ_４の１つはＣｌ、Ｂｒ或いはアセテートイオン、もう１つの置換基はエチル、ブチル或いはフェニルである。

阻害剤の第２のグループはステロイド、ステロイド誘導体或いはステロイド擬態化合物である。

阻害剤の第３のグループはペプチド、ペプチド誘導体或いはグルタチオン（γ−グルタミル−システイニル−グリシン）と構造的に類似なペプチド擬態化合物である。

第３の態様において、本発明は、治療の必要があるヒトに対して、ＧＳＴＡ３−３／ステロイドイソメラーゼ（および／或いはＧＳＴＡ１−１）の酵素活性を阻害する化合物を投与することを含む、癌或いはステロイドホルモン依存性疾患の治療方法に関連する。加えて、かかる阻害は活性化したＧＳＴＡ３−３／ステロイドイソメラーゼタンパク質（および／或いはＧＳＴＡ１−１タンパク質）の組織レベルの低下も含む。当該低下は、ＧＳＴタンパク質の遺伝子発現および生合成に影響を有する、オリゴヌクレオチド、抑制性ＲＮＡ（ＳｉＲＮＡ或いはＲＮＡｉ）或いはＰＮＡ（ペプチド核酸）のような抑制性核酸により達成されうる。ターゲット遺伝子或いは対応ＲＮＡに特異的に結合することによって遺伝子発現を抑制する方法は該分野内では十分に確立されており、当該目的のための試薬は商業的に入手可能である。

上述した治療が必要なヒトは、ステロイドホルモン依存性癌の治療或いはクッシング症候群のような他のステロイドホルモン依存性疾患の治療の必要がある個体であってもよい。

１つの具体例において、該ヒトは前立腺癌にかかっている男性である。別の具体例において、該ヒトは乳癌にかかっている女性である。

さらに、ステロイドホルモン抑制の必要のある家畜（例えばウマ、イヌ）は、本発明が適用する生物種のもう１つのグループである。

本発明は下記のいくつかの非限定的な実施例および図を参照することでより綿密に説明されるだろう。

発明の詳細な記述
実験手順
材料−１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）および還元型グルタチオン（ＧＳＨ）はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、フェネチルイソチオシアナートはＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、およびΔ^５−アンドロステン−３，１７−ジオンはＳｔｅｒａｌｏｉｄｓＩｎｃ．（Ｎｅｗｐｏｒｔ，ＲＩ）から購入できる。

ＧＳＴｓの発現および精製−ヒトＧＳＴＡ３−３およびアルファクラス(Alpha class)の相同ＧＳＴタンパク質が、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ−２１（ＤＥ３）においてｐＥＴ−２１ａ（＋）ベクターにより担持されている対応ｃＤＮＡから発現された（２）。該細胞はＯＤ_６００＝０．７まで培養し、発現は１ｍＭＩＰＴＧの添加により誘導した。該細胞は４時間培養し、遠心分離により収集し、その後超音波処理により溶解した。該溶解物はＰＤ−１０ゲル濾過カラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で脱塩し、次いで該タンパク質は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０において溶出し、その後ＨｉＴｒａｐＳＰ陽イオン交換体（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に負荷した。該タンパク質は塩勾配を使用して溶出した。この１段階精製工程は、クーマシーブリリアントブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認されるように、高く精製された酵素を産出した。

比活性測定−ＧＳＴＡ３−３の比活性はΔ^５−ＡＤの異性化反応（図２Ａ）、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）とＧＳＨの接合(conjugation)反応（図２Ｂ）、およびＧＳＨのフェネチルイソチオシアナートへの付加（図２Ｃ）によって決定される。該反応は３０℃で分光測光法により測定した。１００μＭ Δ^５−ＡＤの異性化は１ｍＭＧＳＨの存在において、ｐＨ８．０、２５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中、２４８ｎｍで追跡した。該生成物Δ^４−ＡＤの吸光係数は１６，３００Ｍ^−１ｃｍ^−１である。比活性測定は記述されているように１ｍＭＧＳＨの存在において、１ｍＭＣＤＮＢと共に（４）、および、１ｍＭＧＳＨの存在においては、０．１ｍＭフェネチルイソチオシアナートと共に（２）、ｐＨ６．５、０．１Ｍリン酸ナトリウム中で実施した。

アルファクラスＧＳＴｓの特異的阻害剤の例
酵素活性は標準分析システムにより決定し、次いで、活性の５０％阻害を与える阻害剤の濃度（ＩＣ_５０）を決定した。

たとえ化合物がいくつかのＧＳＴｓを阻害していても、ある阻害剤は特定のＧＳＴに高い選択性を示す（１）。本発明者はこのことが同様のＧＳＴクラスの相同体にもまた適用できることを示している（表１）。選択的阻害はターゲットでないＧＳＴが触媒する反応の干渉を回避し、ならびに、起こりうる毒性の副作用を最小にすることが望ましい。拡張スクリーニングがなくても、ナノモル濃度範囲において効力のあるＧＳＴＡ３−３の阻害剤はすでに同定されている。加えて、これらの阻害剤はＧＳＴＡ３−３および他のヒトアルファクラスメンバー間で選択性を示す（表１）。しかしながら、関連するＧＳＴＡ１−１はアンドロステンジオンの異性化において、ＧＳＴＡ３−３の比活性の約５％を有し（２）、ＧＳＴＡ３−３に加えて、ＧＳＴＡ１−１を阻害することは有利であるかもしれない。阻害データの多変量群解析を使用することにより、酵素間の識別を最適化することが可能である。

表１．有機金属化合物を使用することにより示されたアルファクラスのグルタチオントランスフェラーゼの異なる阻害。ＩＣ_５０値はＧＳＴが触媒する反応における５０％阻害を与える阻害剤濃度である。

Ｅｔ、ＢｕおよびＰｈはそれぞれエチル、ｎ−ブチル、およびフェニルであり；Ｎｄ＝測定されていない。

ＧＳＴＡ３−３を阻害する化合物の他の例はΔ⁵-アンドロステン−３β−オール−１７−オンのようなステロイド、或いは構造的に類似な化合物である。

ＧＳＴＡ３−３を阻害する他のありうる阻害剤は、ペプチド、ペプチド誘導体、或いはグルタチオン（すなわち、γ−グルタミル−システイニル−グリシン）、およびＳが置換された、或いは他の様式で置換されたグルタチオン誘導体と構造的に類似性を有するペプチド擬態化合物の中で、発見されうる。

参照文献
1. B. Mannervik and U.H. Danielson (1988) Glutathione transferases - structure and catalytic activity, CRC Crit. Rev. Biochem. 23, 283-337.

2. A.-S. Johansson and B. Mannervik (2001) Human glutathione transferase A3-3, a highly efficient catalyst of double-bond isomerization in the biosynthetic pathway of steroid hormones, J. Biol. Chem. 276, 33061-33065.

3. T. Stark, L. Mankowitz and J.W. DePierre (2002) Expression of glutathione transferase isoenzymes in the human H295R adrenal cell line and the effect of forskolin, J. Biochem. Mol. Toxicol. 16, 169-173.

4. B. Mannervik and P. Jemth (1999) Measurement of glutathione transferases, in "Current Protocols in Toxicology" (M.D. Maines, L.G. Costa, D.J. Reed, S. Sassa, and I.G. Sipes, eds.), pp. 6.4.1-6.4.10, John Wiley & Sons, New York.

図１はコレステロールからテストステロン（およびさらにはジヒドロテストステロン）およびプロゲステロン（およびさらにはエストラジオール）のようなステロイドホルモンを導く代謝経路である。該ホルモンはアンドロゲンおよびエストロゲンレセプターにそれぞれ結合することにより作用し、ホルモン応答性の前立腺および乳癌の増殖を促進する。ＧＳＴＡ３−３はそれぞれの経路において必須であるステロイド異性化を触媒し、本発明はホルモン応答性疾患に対するターゲットとしての当該酵素を含む。図２はin vitro におけるＧＳＴＡ３−３の阻害測定のための代替反応である。３つの反応はすべて精製酵素およびグルタチオン（ＧＳＨ）を使用して分光測光法により測定されうる。：（Ａ）Δ^５−アンドロステン−３，１７−ジオン；（Ｂ）１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン；および（Ｃ）フェネチルイソチオシアナート阻害剤の添加により、ＧＳＴＡ３−３により触媒される反応の速度が低下するだろう。

Claims

活性のあるグルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質の濃度を抑制する、或いは、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のステロイドイソメラーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が薬物ターゲットとして使用される方法。
使用するＧＳＴがＧＳＴＡ３−３である、請求項１に記載の方法。
使用するＧＳＴがＧＳＴＡ１−１である、請求項１に記載の方法。
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法により同定されうる、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のステロイドイソメラーゼ活性を阻害する阻害剤。
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法により同定されうる、活性のあるグルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の組織濃度を低下する阻害剤。
次の式：

［式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４はメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルのようなアルキル基；フェニル或いは置換された、好ましくは低級アルキル、ヒドロキシル或いはアルコキシ基で置換されたフェニルのようなアリル基；或いはこれらの基の化学誘導体或いは組み合わせであってよく；該Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４基は直鎖状；低級アルキル、ヒドロキシル或いはアルコキシ基で置換されたような枝分かれ状；或いはシクロペンチルおよびシクロヘキシルのような環状であってよく；該Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４基はＯ、ＳおよびＮのようなヘテロ原子を含んでよく;或いは、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４の１つ、２つ、３つ或いは４つがＣｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、アセテートイオンのようなカルボキシレートイオンおよび相同体、或いはＸと配位する電子供与基を有する他の化学リガンドであってよく；
ＸはＧｅ、Ｓｎ、Ｐｂ或いは類似の求電子性原子であってよい］
を有する化合物である請求項４に記載の阻害剤；
ならびに該阻害剤の立体異性体。
ＸがＳｎである、請求項６に記載の阻害剤。
Ｒ_１ないしＲ_４の１つがＣｌ、Ｂｒ或いはアセテートイオンであり、もう１つの置換基がエチル、ブチル或いはフェニルである、請求項６或いは７に記載の阻害剤。
ステロイド、ステロイド誘導体或いはステロイド擬態化合物である、請求項４に記載の阻害剤。
Δ⁵−アンドロステン−３β−オール−１７−オン或いは構造的に類似な化合物である、請求項９に記載の阻害剤。
ペプチド、ペプチド誘導体或いはグルタチオンに構造的な類似性を有するペプチド擬態化合物である、請求項４に記載の阻害剤。
Ｓが置換された、および／または、他の様式で置換されたグルタチオン誘導体であって、置換基がアルキル、アリルおよびアラルキル基であってよい、請求項１１に記載の阻害剤。
Ｓ−ヘキシル−グルタチオン或いはＳ−ｐ−ブロモベンジル−グルタチオンである、請求項１２に記載の阻害剤。
オリゴヌクレオチド、抑制性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ或いはＲＮＡｉ）或いはＰＮＡ（ペプチド核酸）のような抑制性核酸である、請求項５に記載の阻害剤。
医薬として使用される、請求項４ないし１４に記載の阻害剤。
哺乳類において、ステロイドホルモン依存性疾患の治療に使用される、請求項１５に記載の薬剤。
ステロイドホルモン依存性癌の治療に使用される、請求項１６に記載の薬剤。
前立腺癌の治療に使用される、請求項１７に記載の薬剤。
乳癌の治療に使用される、請求項１７に記載の薬剤。
クッシング症候群の治療に使用される、請求項１６に記載の薬剤。
活性のあるグルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質の濃度を抑制する、或いは、ＧＳＴＡ３−３および／或いはＧＳＴＡ１−１のグルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のステロイドイソメラーゼ活性を阻害する化合物を、治療が必要であるヒトに対して投与することを含む、癌、或いはステロイドホルモン依存性疾患の治療方法。
ヒトが前立腺癌にかかっている男性である、請求項２１に記載の方法。
ヒトが乳癌にかかっている女性である、請求項２１に記載の方法。
ヒトがクッシング症候群にかかっている、請求項２１に記載の方法。