JP2006505615A - 元素セレンを含有する細胞毒性剤の作製方法および使用 - Google Patents

Abstract

元素セレン（Ｓｅ(０)）、Ｓｅ(０)−キャリア複合体、発色団光産物、該発色団光産物およびキャリア分子の蛍光複合体、またはそれらの混合物を含有する薬学的組成物が開示される。細胞死を誘導することのような上記薬学的組成物を使用する方法も開示される。さらに、薬学的組成物およびそれらの構成成分を作製する方法が開示される。

Description

関連出願の相互参照

本出願は、２００３年１１月６日に出願された米国仮出願第６０／４２４，３５４号の有益性を主張する。

連邦政府により後援を受けている研究または開発に関する記載

本発明は、以下の機関：国立癌研究所により授与された米国政府の支援により行われた（認可番号ＲＯ１−ＣＡ７７３８７）。米国は、本発明において一定の権利を有する。

発明の背景

生物系に対するセレン化合物の影響は、研究者等には非常に興味深いものである。セレンは、高用量で摂取すると有毒であるが、健康食においては必須の微量元素である。様々なセレンベースの化合物、例えば硫化セレンは、ふけ、湿疹および皮膚真菌症用の局所治療における治療上の用途に関して長い間認識されている。研究者等はまた、癌の防止おける正常細胞の保護、老化プロセスの阻害、およびＡＩＤＳ患者におけるＨＩＶの複製に関する栄養補給剤におけるセレンベースの化合物の使用を探究している。より最近では、癌の治療における細胞毒性剤としてのセレン化合物の使用に研究は焦点を集めている。

ほとんどの第VI族元素のように、セレンは、種々の酸化状態（−II、０、＋II、＋IVおよび＋VI）で現存する。これまで、生物学的に活性なセレン化合物は、酸化状態−II、＋II、＋IVまたは＋VIのセレンに由来した。しかしながら、酸化状態０を有するセレン（Ｓｅ(０)）は、生物学的に不活性であると考えられていた。

発明の簡単な概要

一態様では、本発明は、元素セレン（Ｓｅ(０)）粒子および薬学的に許容可能な送達媒質を含有する薬学的組成物に関する。上記組成物は、エンドサイトーシスまたは他のメカニズムを介して生存細胞によりインターナライズ（内部移行：internalize）される能力、および上記組成物中の１つまたはそれ以上のＳｅ(０)粒子と複合体（コンジュゲート：conjugate）を形成する能力を有するキャリア分子をさらに含有することができる。

別の態様では、本発明は、細胞を死亡させる方法、細胞内グルタチオンを低減させる方法、および細胞内グルタチオンの存在に起因して細胞が耐性である細胞毒性剤に、細胞を感作させる方法に関する。これらの方法はすべて、本発明の組成物を用いて、Ｓｅ(０)粒子を標的細胞に導入することを包含する。上記方法の様々な実施態様では、Ｓｅ(０)は、癌治療のために、自己造血幹細胞移植片の体外パージングのために、同種異系幹細胞移植片から同種異系反応性（アロ反応性：alloreactive）リンパ球を除去するために、ヒトまたは非ヒト動物における寄生生物感染を治療するために、血液または血液産物における寄生生物および寄生血球を不活性化するために、自己免疫障害および移植片対宿主病を治療するために、標的細胞に導入される。

別の態様では、本発明は、後述する光化学的方法により作製される蛍光発色団光産物（chromophore photoproduct）−キャリア複合体（conjugate）および薬学的に許容可能な送達媒質を含有する薬学的組成物に関する。蛍光複合体は、同じキャリア分子を有するＳｅ(０)−キャリア複合体と一緒に使用して、標的細胞に進入するＳｅ(０)の進入および量を追跡することができる。蛍光複合体はまた、薬物動態研究、Ｓｅ(０)−キャリア複合体の組織分布研究、およびＳｅ(０)−キャリア複合体感受性の標的細胞の同定にも有用である。さらに、蛍光複合体は、癌のような疾患に関する診断ツールとして使用することができ、ここで疾患細胞は、正常細胞よりも多くのキャリア分子をインターナライズする。

別の態様では、本発明は、Ｓｅ(０)、Ｓｅ(０)−キャリア複合体、発色団光産物、または発色団光産物およびキャリア分子の蛍光複合体を生成する光化学的方法に関する。上記方法は、適切な出発色素を供給すること、Ｓｅ(０)または発色団光産物を形成するために酸素分子の存在下で適切な波長の光に上記色素を曝露させること、およびＳｅ(０)または発色団光産物を精製することを包含する。Ｓｅ(０)−キャリア複合体または発色団光産物およびキャリア分子の蛍光複合体を生成するために、色素を光および酸素に曝露させる前、曝露させると同時、あるいは曝露させた後に、キャリア分子を色素と混合することができる。次いで、形成された複合体を精製することができる。適切な出発色素が使用される場合、Ｓｅ(０)−キャリア複合体および蛍光複合体は、同じ色素から生成させることができる。

別の態様では、本発明は、Ｓｅ(０)−キャリア複合体を生成する化学的方法に関する。上記方法は、キャリア分子の存在下で二酸化セレン、亜セレン酸または亜セレン酸塩を還元することを包含する。

本発明の利点は、標的細胞に特異的なキャリア分子を、Ｓｅ(０)−キャリア複合体を形成するように選択することができ、その結果、複合体は標的特異性を有することである。

本発明の他の目的、特徴および利点は、添付の特許請求の範囲および図面と併せて考慮に入れると、以下の詳細な説明から明らかであろう。

発明の詳細な説明

酸化状態０のセレン（元素セレンすなわちＳｅ(０)）は、細胞に導入されると、細胞毒性活性を有することを本明細書中で開示する。さらに、細胞内グルタチオンの存在に起因して、ある特定の細胞毒性剤（例えば、電離放射線およびアルキル化剤）に耐性である細胞にＳｅ(０)を導入することにより、これらの細胞を細胞毒性剤に感作させることができることを開示する。以下の実施例に記載するように、Ｓｅ(０)は、細胞に進入すると、分子内チオールの酸化を触媒する。理論で限定する意図はないが、本発明者等は、Ｓｅ(０)の細胞毒性活性が、還元されたチオールの欠乏、酸化されたチオールの蓄積、またはその両方に関連し、Ｓｅ(０)の細胞感作活性が還元されたチオールの欠乏に関連すると考える。

一態様では、本発明は、Ｓｅ(０)粒子および薬学的に許容可能な送達媒質を含有する薬学的組成物に関する。上記組成物は、組成物中に１つまたはそれ以上のＳｅ(０)粒子と複合体を形成するキャリア分子をさらに含有することができる。本明細書および特許請求の範囲中で使用する場合「キャリア分子」という用語は、Ｓｅ(０)と複合体を形成する能力、およびエンドサイトーシスまたは他のメカニズムにより標的細胞に進入する能力を有する分子を指す。したがって、キャリア分子は、Ｓｅ(０)と複合体を形成することにより標的細胞にＳｅ(０)を導入するための媒体として作用し得る。様々な標的細胞に適したキャリア分子を同定することは、十分に当業者の手腕内である。かかるキャリア分子の例としては、タンパク質、糖タンパク質およびリポタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。適切なキャリア分子の幾つかの具体例としては、アルブミン、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）および標的細胞のある特定の細胞表面分子に対する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。キャリア分子は、天然に存在する分子である必要はない。例えば、アルブミンは、多数の型の癌細胞に適したキャリアである。天然に存在するアルブミン分子に対するある特定の修飾は、そのＳｅ(０)結合能力および細胞侵入能力を根絶せず、またこれらの修飾アルブミン分子は適切なキャリア分子であることが理解されよう。

薬学的に許容可能な送達媒質は、後にヒトまたは非ヒト動物に戻して導入される細胞サンプルのｅｘ ｖｉｖｏ処理に適切である媒質、あるいはヒトまたは非ヒト動物に投与することができる媒質である。当業者は、かかる媒質に精通している。「薬学的に許容可能な送達媒質」という用語は、同様に当該技術分野で頻繁に使用される「薬学的に許容可能なキャリア」という用語と同義である。しかしながら、「薬学的に許容可能なキャリア」という用語は、Ｓｅ(０)と複合体を形成するのに使用されるキャリア分子とのいかなる混同をも回避するために、本明細書および特許請求の範囲中では避ける。当業者に既知の標準的な薬学的に許容可能な送達媒質のいずれも、本発明の組成物に使用することができる。かかる標準的な送達媒質の例としては、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルジョン（例えば、油／水エマルジョンまたはトリグリセリドエマルジョン）、各種型の湿潤剤、錠剤、コート錠およびカプセルが挙げられるが、これらに限定されない。適切な薬学的に許容される媒質は、選択される投与様式を考慮して選択され得る。例えば、特定用途に応じて、本発明の組成物は、全身的または局部的（例えば、静脈内、腹腔内、非経口的、経口的、局所的、腫瘍組織への注射）に投与され得る。特に、Ｓｅ(０)−キャリア複合体または発色団光産物−キャリア複合体を生成するための光化学反応の最後の混合物から該混合物に含有されるＳｅ(０)−キャリア複合体または発色団光産物−キャリア複合体を差し引いたものは、薬学的に許容可能な媒質の定義から排除される。Ｓｅ(０)−キャリア複合体または発色団光産物−キャリア複合体を生成するための光化学反応は以下の通りである。

好ましくは、本発明におけるＳｅ(０)粒子は、薬学的に許容可能な液体送達媒質のような分散媒質中にＳｅ(０)コロイドを形成する。通常、コロイドＳｅ(０)粒子は、直径０．４〜５０ナノメートル、０．４〜５ナノメートル、または０．４〜１ナノメートルを有する。

別の態様では、本発明は、細胞を死亡させる方法、細胞内グルタチオンを低減させる方法、および細胞が細胞内グルタチオンの存在に起因して耐性である細胞毒性剤に、細胞を感作させる方法に関する。これらの方法はすべて、本発明の組成物を用いて、Ｓｅ(０)粒子を標的細胞に導入することを包含する。好ましくは、標的細胞に導入されるＳｅ(０)粒子は、薬学的に許容可能な媒質に懸濁されると、Ｓｅ(０)コロイドの形成を可能にするサイズを有する。

Ｓｅ(０)を標的細胞に導入することができる多くの方法が存在し、それらの方法のいずれも本発明で使用することができる。一実施態様では、Ｓｅ(０)は、キャリア分子と複合体を形成することにより、適切なキャリア分子を介して標的細胞に導入される。Ｓｅ(０)−キャリア複合体は、Ｓｅ(０)、好ましくはコロイドＳｅ(０)とキャリア分子を混合することにより生成することができる。Ｓｅ(０)またはコロイドＳｅ(０)は、商業的供給源から入手され得るか、または当業者に既知の方法により生成され得る。コロイドＳｅ(０)およびＳｅ(０)−キャリア複合体を形成する光化学的方法および化学的方法の例は、本発明の他の態様として後述する。

別の態様では、本発明は、コロイドＳｅ(０)およびＳｅ(０)−キャリア複合体を作製する光化学的方法である。上記方法は、酸素分子の存在下で、感光性セロン色素を適切な波長の光に曝露させること（光退色）を包含する。使用することができるセロン色素の例としては、セレノメロシアニンおよびセレノオキソノール色素が挙げられる。セレノメロシアニン色素およびセレノオキソノール色素は、（１）米国特許第５，２０８，３３６号、（２）Gunther, W.H.H. et al., Abstracts, 6^th International Conference on the Chemistry of Selenium and Tellurium, Osaka, Japan, OP-11, p. 27 (1991)、（３）Gunther, W.H.H. et al., Abstracts, 20^th Annual Meeting of the International Society for Experimental Hematology, Parma, Italy, July 21-26, 1991、（４）Krieg, M. et al., Cancer Research, Therapy and Control, 4:163-172, 1995（これらはすべて、その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。以下の実施例に記載されるように、感光性セロン色素のバルビツレートの２位のＳｅは、光化学的プロセスによるＳｅ(０)の生成に必須である。このプロセスから形成されるＳｅ(０)は、コロイド形態である。Ｓｅ(０)−キャリア複合体を生成するために、色素を光に曝露させる前、曝露させると同時、または曝露させた後に、キャリア分子を色素と混合することができる。コロイドＳｅ(０)およびＳｅ(０)−キャリア複合体を生成するのに使用することができる適切なセレノメロシアニン色素の例としては、図２に示すようなＭＣ５４、ＭＣ５５、ＭＣ５６およびＭＣ５７が挙げられるが、これらに限定されない。どのようにＳｅ(０)が色素から形成されるかのメカニズムを図１に示す。セレノオキソノール色素は、Ｓｅ(０)を形成するのに引き抜かれ得る２つのセレン基を含有し、Ｓｅ(０)を生成するのにセレノメロシアニン色素の２倍程度効率的である。

本発明の光化学的方法に適した光源は、出発感光性色素の吸収スペクトルと適正に重複するスペクトルを有する光を放出するものである。適切な波長および適切な光源は、当業者に既知であるか、または当業者により容易に確定され得る。例えば、白色蛍光のような広範囲のスペクトルの光源が適切な光源である。

Ｓｅ(０)−キャリア複合体の細胞毒性活性は、複合体のＳｅ(０)：キャリア比を変更することにより調整することができる。高いＳｅ(０)：キャリア比を有する複合体は、低いＳｅ(０)：キャリア比を有する複合体よりも毒性が高い。

光化学的方法により形成されるコロイドＳｅ(０)およびＳｅ(０)−キャリア複合体は、光化学反応の最後の混合物から精製することができる。コロイドＳｅ(０)およびＳｅ(０)−キャリア複合体の精製は、部分的な精製または完全な精製のいずれかを包含する。反応混合物の任意の非Ｓｅ(０)および非Ｓｅ(０)−キャリア複合体構成成分の除去は、部分的な精製とみなされる。当業者は、使用することができる精製方法に精通している。例えば、図１に示すように、可溶性スルホン酸陰イオンを含有する反応生成物は、ＭＣ５４、ＭＣ５５またはＭＣ５７が出発色素として使用される場合に、光退色プロセス中に生成することができる。これらの可溶性生成物は、適切な陽イオン中心を含有する不溶性試薬を用いて、イオン交換により可溶性生成物を不溶性塩生成物に変換することにより除去することができる。次に、不溶性生成物は、濾過により除去することができる。あるいは、光化学反応混合物は、陽イオン試薬を充填したカラムに通すことができる。精製方法に使用することができる陽イオン交換樹脂は、Sigma-Aldrichから市販されている。

サイズベースの方法も、Ｓｅ(０)−キャリア複合体を精製するのに使用することができる。Ｓｅ(０)−キャリア複合体は、光化学反応の最後に形成される様々な色素断片よりも大きい。したがって、反応混合物は、ゲル濾過、限外濾過または透析により部分的に精製することができる。さらに、アフィニティクロマトグラフィおよび疎水性相互作用クロマトグラフィを使用して、Ｓｅ(０)−キャリア複合体を精製することができる。アフィニティクロマトグラフィは、キャリア分子に特異的な親和性を有する材料を利用する。例えば、アフィゲルブルーおよびある特定の抗体は、アルブミンに幾分特異的に結合する。アルブミンをキャリア分子として使用する場合、シバクロンブルーまたは抗アルブミン抗体で誘導体化したマトリックスを用いて、Ｓｅ(０)−アルブミン複合体を精製することができる。疎水性相互作用クロマトグラフィは、Ｓｅ(０)−キャリア複合体と様々な色素断片との間の疎水性の違いを利用し、その結果、Ｓｅ(０)−キャリア複合体および様々な色素断片は、適切な溶液により溶出されると、異なる保持時間を有する。

別の態様では、本発明は、Ｓｅ(０)−キャリア複合体を生成する化学的方法である。Ｓｅ(０)を生成するための化学反応がキャリアの存在下で実施される場合に、Ｓｅ(０)−キャリア複合体が形成され得る。あるいは、Ｓｅ(０)が生成された後に、キャリアを添加して、Ｓｅ(０)−キャリア複合体を形成することができる。Ｓｅ(０)−キャリア複合体は、上述の精製方法の幾つかを用いて精製することができる。コロイドＳｅ(０)を精製する化学的方法の例を表３に示す。

別の態様では、本発明は、発色団光産物、ならびに発色団光産物およびキャリア分子の蛍光複合体を作製する光化学的方法に関する。上記方法は、供与体複素環中に硫黄またはセレン原子を含有するメロシアニン色素を、発色団光産物を生成するために酸素分子の存在下で適切な波長の光に曝露させることを包含する。蛍光複合体を生成するために、色素を光に曝露させる前、曝露させると同時、または曝露させた後に、キャリア分子を色素に添加する。光源の発光スペクトルは、メロシアニン色素および発色団光産物の形成につながる色素の任意の中間類縁体の吸収スペクトルと適正な重複を示さなくてはならない。広範囲のスペクトルの光を使用してもよいが、光源の発光スペクトルと蛍光複合体の吸収スペクトルとの間の重複が、蛍光複合体の退色を引き起こし得るため好ましくない。蛍光複合体の退色は、可視スペクトルの望ましくない部分を排除するフィルタにより、あるいはより好ましくは、狭帯域発光スペクトルを有する発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いて、最小限に抑えることができる。

発色団光産物、ならびに発色団光産物およびキャリアの蛍光複合体を生成するのに使用することができる適切なメロシアニン色素の例としては、図２に示すようなＭＣ７、ＭＣ９、ＭＣ１７、ＭＣ４９、ＭＣ５４、ＭＣ５５およびＭＣ５７が挙げられるが、これらに限定されない。光化学的方法のメカニズムを図１に示す。

発色団光産物と蛍光複合体を生成する方法に適したキャリア分子は、エンドサイトーシスまたは他のメカニズムを介して標的細胞に進入する能力、および発色団光産物と蛍光複合体を形成する能力を有するものである。適切なキャリア分子は、天然に存在する分子に限定されない。以下の実施例は、アルブミンが適切なキャリア分子であり、他の適切なキャリア分子は、当業者により容易にスクリーニングおよび同定され得ることを示す。

Ｓｅ(０)−キャリア複合体、ならびに発色団光産物およびキャリア分子の蛍光複合体は、単一プロセスで共通のセレノメロシアニン色素から作製することができることに留意されたい。共通のセレノメロシアニン色素は、供与体複素環中に硫黄またはセレン原子を含有しなくてはならない。かかるセレノメロシアニン色素の例としては、ＭＣ５４、ＭＣ５５およびＭＣ５７が挙げられるが、これらに限定されない。かかるプロセスに関する提唱されるメカニズムを図１に示す。

蛍光複合体は、Ｓｅ(０)−キャリア複合体を精製するために上述するように、サイズベースの方法、アフィニティクロマトグラフィまたは疎水性相互作用クロマトグラフィを用いて、光化学反応の最後の混合物から精製することができる。

別の態様では、本発明は、上述のような部分的または完全に精製した蛍光複合体および薬学的に許容可能な送達媒質を含有する薬学的組成物に関する。

蛍光複合体は、同じキャリア分子を有するＳｅ(０)−キャリア複合体と一緒に使用して、標的細胞へ進入するＳｅ(０)の進入および量を追跡することができる。これに関して、ＭＣ５４、ＭＣ５５およびＭＣ５７の使用は、これらの色素を光退色させることによりＳｅ(０)−キャリア複合体および蛍光光産物−キャリア複合体の両方を含有する組成物が生成されることから好適である。

蛍光複合体はまた、薬物動態研究、Ｓｅ(０)−キャリア複合体の組織分布研究、およびＳｅ(０)−キャリア複合体感受性標的細胞の同定にも有用である。

蛍光複合体はまた、疾患細胞が正常細胞によりも多くのキャリア分子をインターナライズすることができる場合に、疾患用の診断ツールとしても使用することができる。例えば、多くの癌細胞は、正常細胞よりも多くのアルブミンをインターナライズする。したがって、キャリアとしてのアルブミンとの蛍光複合体を用いて、癌を診断することができる。例えば、患者に複合体を投与して（全身的または局部的）、癌が疑われる組織から得られる細胞の蛍光レベルを分析することができる。細胞が周辺細胞または別の状況で確立された正常レベルよりも高い蛍光レベルを有する場合、細胞は癌性である可能性が高い。このプロセスはまた、固形腫瘍の近傍にある残留腫瘍細胞を同定するのを助長して、外科的切除中に指針を提供することができる。微小転移巣もまた、同様に検出することができる。別の実施態様では、末梢血または自己幹細胞移植片中の腫瘍細胞の同定は、蛍光複合体の静脈内注射により、あるいは血液サンプルをｅｘ ｖｉｖｏで蛍光複合体に曝露させることにより、行うことができる。

本明細書中に開示するＳｅ(０)およびＳｅ(０)−キャリア複合体の細胞毒性活性ならびにチオール欠乏活性は、広範囲の用途を有する。１つの用途は、Ｓｅ(０)、好ましくはコロイドＳｅ(０)を癌細胞に導入することにより、ヒトまたは非ヒト動物において癌を治療する方法である。一実施態様では、Ｓｅ(０)は、ヒトまたは非ヒト動物をＳｅ(０)またはＳｅ(０)−キャリア複合体および薬学的に許容可能な送達媒質を含有する組成物で処理することにより、癌細胞に導入される。使用することができるキャリア分子の例は、アルブミンである。血清アルブミンは、多くの腫瘍細胞のエネルギーおよび窒素代謝で重要な役割を果たすことが知られている。９０％を上回る癌腫が、アルブミン受容体を過剰発現し、正常細胞よりも高い割合でアルブミンをインターナライズおよび代謝する。アルブミンは、トランスサイトーシスを介して、血管系を離れることにより間質腔に接近することができる。固形腫瘍中の間質圧は、標準的な薬物の送達にとって主要な妨害であるのに対して、間質圧は、腫瘍組織中のアルブミンの蓄積を妨げない。さらに、アルブミンは、長期の半減期（およそ１９日）を有する。その存続期間中に、アルブミンは、循環器系を介して約１５，０００回、および血管外腔を介して１５回通過する。さらに、アルブミンは、副腎、肝臓および骨髄中に蓄積されない。したがって、アルブミン−薬物複合体は、比較的一定の薬物レベルを維持するのに十分適している。使用することができるキャリア分子の別の例は、ＬＤＬである。ＬＤＬは、アルブミンよりもさらに特異的にある特定の腫瘍を標的とする。例えば、黒色腫は、相当する正常組織よりも２８倍多くＬＤＬを蓄積する。ＬＤＬがＳｅ(０)用のキャリアとして使用される場合、アルブミンとは異なり、ＬＤＬは、副腎、肝臓および骨髄にも蓄積することを留意すべきである。

Ｓｅ(０)またはＳｅ(０)−キャリア複合体および薬学的に許容可能な送達媒質を含有する組成物は、種々の様式により、ヒトまたは非ヒト動物に投与することができる。例えば、上記組成物は、全身治療のために静脈内注射することができる。腹膜腔中に腹水を形成する傾向にある腫瘍（例えば、卵巣癌）に関しては、腹腔内注射が好まれ得る。上記組成物はまた、局部治療のために、腫瘍、または腫瘍にじかに隣接した組織に注射することができる。

癌治療における主な懸念は、薬物耐性腫瘍細胞の出現である。細胞内グルタチオンの濃度を上昇させることは、癌細胞が治療に耐性となるメカニズムの１つである。Ｓｅ(０)−キャリア複合体は、標準的な化学療法剤に対するこれらの癌細胞の感受性を回復させることができる。グルタチオンの生合成を妨害する作用物質と異なり、Ｓｅ(０)−キャリア複合体は、即効性である。組織培養モデルでは、Ｓｅ(０)−キャリア複合体は通常、１時間程度で、細胞内グルタチオンレベルを５０％〜７５％低減させた。対照的に、グルタチオン生合成の阻害剤は通常、グルタチオンの５０％低減を達成するのに少なくとも１５時間を要した。

別の用途では、Ｓｅ(０)は、自己造血幹細胞移植片の体外パージング（ｅｘ ｖｉｖｏパージング）に使用される。一実施態様では、Ｓｅ(０)は、幹細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏでＳｅ(０)−キャリア（例えば、アルブミン）複合体および薬学的に許容可能な送達媒質を含有する薬学的組成物で処理することにより、幹細胞に導入される。例えば、血液または骨髄サンプルの単核分画を、適切な濃度のＳｅ(０)−アルブミン複合体（例えば、１０〜２０μＭ）を補充した等張培地（例えば、α−改変ダルベッコ培地）中で１ｍｌ当たり１０⁶〜１０⁷の密度で懸濁させることができる。続いて、細胞懸濁液を３７℃で約１時間インキュベートして、過剰の複合体を洗い流し、患者へ再注入が必要とされるまで冷凍保存した。

別の用途では、Ｓｅ(０)は、自己造血幹細胞移植片のｅｘ ｖｉｖｏパージングの様式と類似した様式で、同種異系幹細胞移植片から同種異系反応性リンパ球を除去するのに使用される。別の用途では、ｅｘ ｖｉｖｏプロセスを用いて、血液または血液産物中の寄生生物および寄生血球を不活性化させる。しかしながら、ヒトまたは非ヒト動物において寄生生物感染を治療するために、Ｓｅ(０)含有作用物質は、ヒトまたは非ヒト動物に静脈内投与すべきである。一実施態様では、Ｓｅ(０)含有作用物質は、Ｓｅ(０)−キャリア複合体および薬学的に許容可能な送達媒質を含有する組成物である。

別の用途では、Ｓｅ(０)は、自己免疫障害または移植片対宿主病に関与する免疫細胞に導入されて、これらの免疫細胞を死滅させる。一実施態様では、Ｓｅ(０)−キャリア複合体および薬学的に許容可能な送達媒質を含有する組成物は、障害または疾患を患う患者に静脈内注射される。自己免疫障害を治療するために、同様に上記組成物を局部的に投与してもよい。

本発明は、以下の非限定的な実施例を考慮して、より十分に理解されよう。以下の実施例では、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体のモル濃度に関する言及はすべて、セレン構成成分のモル濃度を指す。

光産物−タンパク質複合体の精製および特徴づけ
この実施例では、本発明者等は、光産物および光産物−タンパク質複合体の構造の決定、ならびにセレノメロシアニン光増感体の光退色中での形成を導く反応経路の説明について記載する。図１は、細胞毒性かつ蛍光光産物−タンパク質複合体の形成に関する反応経路の本発明者等の現段階での理解を概要する。提唱されるスキームを支持する実験的証拠を以下に概要する。

材料および方法
光産物−アルブミン複合体の蛍光発光スペクトルの確定：光産物−アルブミン複合体は、エタノール中の６７倍濃縮したストック溶液からのセレノメロシアニン色素ＭＣ５４を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中のウシ血清アルブミンの２０μＭ溶液に添加することにより生成した。溶液の２ｍｌ分取量を、白色蛍光灯の２つのパネル（パネル１つにつき５個の管）間の回転（３０ｒｐｍ）プレキシグラスディスク上に取り付けた透明な１５ｍｌのポリブタジエンスチレン管に入れ（溶液上の広い空間は、適正な酸素供給を保証した）、６０分間照射した。サンプル部位でのフルエンス率は、モデル２６２検出器を装備したモデル３５１Ａ電力計(United Detector, Hawthorne, CA)により確定する場合、２７Ｗ／ｍ²であった。反応生成物を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で３０倍希釈して、４９０ｎｍの励起波長を用いて蛍光発光スペクトルをＨｉｔａｃｈｉ Ｆ−４５００蛍光分光光度計で記録した（ＨＥＰＥＳ：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸ヘミナトリウム塩）。

蛍光かつ細胞毒性複合体の生成のための最適な色素：タンパク質比：ウシ血清アルブミンを、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中に、１．７５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。セレノメロシアニン色素ＭＣ５４を、エタノール中の１．７５ｍＭストック溶液から添加して、０．２５：１〜５：１の色素：タンパク質モル比を達成した。上述のように、混合物を６０分間白色灯（２７Ｗ／ｍ²）に曝露させた。蛍光複合体形成を評価するために、光照射した混合物を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で３０倍に希釈して、４９０ｎｍの励起波長を用いて、蛍光発光スペクトルをＨｉｔａｃｈｉ Ｆ−４５００蛍光分光光度計で記録した。細胞毒性活性を評価するために、適切量の２倍濃縮したα−培地の添加により、細胞毒性複合体を等張性として、Ｌ１２１０白血病細胞と３７℃で６０分間インキュベートした。Sieber, F. et al., 1984（これは、その全体が参照により援用される）に記載されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏクローン原性白血病細胞の生存分画をｉｎ ｖｉｔｒｏクローンアッセイにより確定した。

結果および論考
構造活性相関：幅を広げた構造活性研究（図２、表１）により、細胞毒性および蛍光活性は独立して調節されることが示された（図２の構造は、Gunther, W.H.H. et al., 1992（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるように合成した）。セレノバルビツル酸類縁体すべてが細胞毒性複合体を形成したが、チオバルビツル酸またはバルビツル酸類縁体は、細胞毒性複合体を形成しなかった。これにより、セロン基が細胞毒性複合体の形成に必須であることが示された。４つのセレノメロシアニン色素および１つのセレノオキソノール色素(Krieg, M. et al., 1995)により生成される複合体の効力の量的比較により、細胞毒性活性は、一重項酸素量子収量の関数ではなく、色素分子１つ当たりのセロン基の数の関数であることが示された。２つのセロン基を有するセレノオキソノール色素は、２つのＳｅ(０)原子を生成することができる。１つのセロン基を有するセレノメロシアニンは、１つのＳｅ(０)原子を生成することができるに過ぎない。オキソノール色素により生成される複合体は、等モル濃度のメロシアニン色素により生成される複合体のほぼ２倍の細胞毒性であった。蛍光光産物−アルブミン複合体は、供与体複素環中にセレンまたは硫黄原子を含有するメロシアニン色素すべてにより形成された（図２、表１）。

反応経路：図１に示す反応スキームは、セロンの酸化、続く酸素によるセレンの置換、セレン０の脱離、および元のセロン色素のバルビツル酸類縁体に一致する発色団光産物（ＭＣ４７、図２）の形成を提唱している。提唱されるスキームの最初の工程は、以下の実験的証拠により支持される。（１）発色団光産物の吸収（データは示さず）および蛍光発光（図３）スペクトルは、ＭＣ５４のスペクトルに対して青色シフトされ、本来のＭＣ４７のスペクトルと区別できなかった。（２）エタノール中で、複合体の形成を妨げるタンパク質の非存在下で反応を実施すると、十分量の光産物（ＭＣ４７）が蓄積され、シリカカラム上での精製、続く薄層クロマトグラフィ、質量分析および元素分析による特徴づけを可能にした。さらに、元素セレンを示す赤い沈着物が、反応容器の壁上に形成した。発色団光産物および本来のＭＣ４７の薄層クロマトグラムは区別できなかった。Ｖｏｙａｇｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ ６００４(PE Biosystems, Foster City, CA)ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザ脱離／イオン化タイム・オブ・フライト法）質量分析計で実施した質量分析により、単離した光産物に関して質量５９６．３が示され（図４）、これは、提唱される構造の算出質量５９６．２（ＭＣ４７から対イオンを引いた質量）と十分一致した。完全なセロン色素（ＭＣ５４）は、セレンの特徴的な同位体分布を示した（図５）。対照的に、完全な発色団光産物も任意のその断片も、セレンの特徴的な同位体分布を示さなかった。発色団光産物の元素分析（Galbraith Laboratories, Knoxville, TNで実施）も提唱される構造と一致した。

提唱される反応スキームの２つの帰結は、光産物の生産は一重項酸素の失活剤により、または酸素分子の欠如により阻害されるはずであること、および一重項酸素に代わって他の酸化剤を置換することが可能であるはずであることである。緩衝液中の酸素をアルゴンで置き換えた場合、緩衝液をアジドまたはグルタチオンで補充した場合、あるいは９０％エタノール（９０％エタノール中の水は酸素供与体として作用する）の代わりに乾燥エタノールを使用した場合に、光産物および蛍光／細胞毒性複合体の生成は、確かに阻害された。ＭＣ５４を、暗所中でヨウ素、過酸化水素、Ｈｇ(ＣＦ₃ＣＯ₂)₂、過塩素酸ナトリウム、またはクロラミンＴに曝露させると、予想通り特徴的な発色団光産物（ＭＣ４７）が形成された。

アルブミンへの発色団光産物（ＭＣ４７）の結合は、光生成される一重項酸素により媒介される少なくとも１つの付加的酸化工程を必要とした。暗所中で、１対１のモル比で、精製光産物またはデノボ合成したＭＣ４７とウシ血清アルブミンとの同時インキュベーションは、緑色蛍光複合体の形成を導かなかった。ヨウ素、過酸化水素またはＨｇ(ＣＦ₃ＣＯ₂)₂のような化学的酸化剤による発色団光産物の処理はいずれも、緑色蛍光複合体の形成を導かなかった。しかしながら、精製光産物またはデノボ合成したＭＣ４７を１対１のモル比でウシ血清アルブミンと混合して、白色蛍光灯（フルエンス率：２７Ｗ／ｍ²）に曝露させると、蛍光光産物−アルブミン複合体が、その特徴的な励起および蛍光発光スペクトルで示されるように容易に形成された。

本発明者等は、供与体複素環中の硫黄またはセレン原子を有する色素のみが蛍光光産物アルブミン複合体を形成した理由をまだ分かっていない。酸素、硫黄およびセレンとの間の明瞭な違いの１つは、硫黄およびセレンのみが、IIを上回る酸化状態に酸化され得ることである。一重項酸素は、カルボニルへと内部転位されるようになり得るエポキシドを形成する発色団中の不飽和を攻撃することが知られている。カルボニルまたはエポキシドのいずれかが、タンパク質のアミノ基と反応することができる。オキサゾール色素は、そのスペクトルが効率的な励起に関してかなり青色へとシフトされるため、非蛍光のように見える場合がある。あるいは、オキサゾール色素は、オキサゾール環がヒドロキシアミドへと加水分解し、それによりナフタレン環に対する共鳴を妨害するため、非蛍光であり得る。

細胞毒性物（cytotoxic entity）が実際に酸化状態０のセレンであることを確立するために、本発明者等は、等モル量のウシ血清アルブミンの存在下で、ＭＣ５４を光退色させて、ウィスコンシン・ミルウォーキー大学のthe Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Laboratoriesで、生じたＳｅ(０)−アルブミン複合体を⁷⁷Ｓｅ−ＮＭＲ分析に付した。⁷⁷Ｓｅ−ＮＭＲ分析は、有機セレン、ならびに酸化状態＋II、＋IV、＋VIおよび（多くの場合）−IIのセレンを検出するが、酸化状態０のセレンは検出されない。５００ＭＨｚ Ｂｒｕｃｋｅｒ ＮＭＲ分光計による５００回以上のスキャン後に、本発明者等は、いかなるセレン共鳴をも検出することができなかった。したがって、この消極的な結果は、セレンがセレン０の形態で存在するという概念と一致した。ＮＭＲ分光法後に、サンプルの１分取量を元素分析用に提示して（Galbraith Laboratories, Knoxville, TNで実施）、サンプルが予想量のセレンを含有することを確証した。サンプルの第２の分取量を水素化ホウ素ナトリウムおよび塩化ベンジル（Ｐｈ−ＣＨ₂−Ｃｌ）で処理して、セレン０を有機セレンに変換した。後者のサンプルを⁷⁷Ｓｅ−ＮＭＲで検査すると、(Ｐｈ−ＣＨ₂)₂Ｓｅを示すシグナルが容易に検出された。

キャリアタンパク質：少なくとも３つの血清高分子、すなわちアルブミン、ＬＤＬおよびＨＤＬは、細胞毒性複合体を形成することが可能であった。血清高分子の１つであるアルブミンのみが、蛍光複合体を形成することが可能であった（表２）。（リポ）タンパク質の役割は、２要素から成り、すなわち（１）コロイドセレンを安定化すること、および（２）細胞毒性物用の送達媒体として作用することであった。Ｌ１２１０白血病モデルでは、ＬＤＬまたはアルブミンにより形成される複合体は、ＨＤＬにより形成される複合体よりも細胞毒性が高かった。これらの研究に使用する血清アルブミン調製物は、ウシまたはヒト由来であったのに対して、リポタンパク質分画はすべて、ヒト由来であった。ヒトおよびウシ血清を用いて複合体を形成して、Ｋ５６２ヒト白血病細胞に対する細胞毒性活性に関して評価すると、２つの調製物は同等であった。ヒトおよびウシ血清アルブミンはともに、蛍光複合体を形成した。

アルブミンのカルボキシメチル化は、細胞毒性複合体の形成を妨げたが、蛍光複合体の形成、または腫瘍細胞による蛍光複合体の結合および取り込みを妨害しなかった。このことは、蛍光物および細胞毒性物が、アルブミン分子の異なるドメインと相互作用することを示唆した。Ｓ−カルボキシメチルアルブミンは、Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)から市販製品として得られた。製造業者により提供される情報は、この製品が、アルブミン１モル当たり０．０２モル未満のスルフィドリルおよびアルブミン１モル当たり１．５モルを超えるＳ−カルボキシメチルシステインを含有することを示していた。

最適な色素対タンパク質比：蛍光複合体の生成のための、色素対タンパク質の最適な比は、２：１である。細胞毒性複合体に関しては、最適な色素対タンパク質比は、約５：１のようである（図７）。蛍光光産物−アルブミン複合体の蛍光収量は、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｆ４５００蛍光分光光度計を用いて確定した。サンプルはすべて、緩衝液で順次希釈して、自己消光に起因するアーチファクトを除外した。Ｌ１２１０マウス白血病細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏクローンアッセイを用いて、細胞毒性活性を評価した。

光産物とキャリアタンパク質との間の結合：本発明者等は当初、蛍光／細胞毒性複合体が有機溶媒、界面活性剤、高濃度の塩およびカオトロピック剤による抽出に耐性であることから、光産物がキャリアタンパク質と共有結合を形成するという見解に賛同していた。細胞毒性物および蛍光物（fluorescent entity）はともに、４倍容量の冷エタノールまたはアセトンの添加によりアルブミンとともに同時沈殿した。さらに、蛍光物は、セファデックスＧ−１００上でクロマトグラフィにかけると、アルブミン単量体および二量体と同時溶出した（図６）。しかしながら、最近の実験により、緑色蛍光部分は、１０倍モル過剰の８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）により、タンパク質から移動させることができることが示されている。発色団とアルブミンとの間のこの非常に強力であるが、おそらくは非共有性の結合に関する説明の１つは、両親媒性発色団光産物が、アルブミンとの親油性結合およびイオン性結合の両方を形成することである。有機溶媒、界面活性剤および濃塩溶液は、あるタイプの結合のみを破壊し、他の結合は損なわれないままにする。他方で、ＡＮＳは、両親媒性分子であり、したがって、アルブミンから発色団光産物をより良好に移動させることが可能であり得る。しかしながら、この段階では、光産物とキャリアタンパク質との間の結合（複数可）の正確な性質は、完全には明らかではない。

コロイドセレンおよびＳｅ(０)−タンパク質複合体の化学的調製方法
二酸化セレンの化学的還元によるコロイドセレンの調製：本発明者等は、ウシ血清アルブミンの存在下で、水素化ホウ素ナトリウムまたはアスコルビン酸により二酸化セレンを還元することに基づいたコロイドセレンの調製のための２つの十分に確立された方法を試行した（表３を参照）。両方の調製物が、細胞毒性であることがわかった。

本発明者等のＳｅ(０)−タンパク質複合体の細胞毒性活性が、混入している二酸化セレンに起因していたという議論を反駁するために、本発明者等は、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体の代わりに、等モル（最大３０μＭ）濃度の二酸化セレンに、対照細胞を曝露させた。二酸化セレンは、試験した濃度で細胞毒性ではなかったのに対して、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体は、４ｌｏｇ以上のＬ１２１０白血病細胞を排除した。

亜セレン酸の化学的還元によるコロイドセレンの調製：本明細書中に提供する方法は、単にｐＨの調整により、順方向および逆方向を実施させることができる反応を包含する。第１の反応は、両方の構成成分を溶解する炭酸水素ナトリウム（または任意の他の適切なｐＨ７の緩衝液）の存在下で、元素セレンおよび元素ヨウ素を含む：Ｓｅ＋２Ｉ₂＋６ＮａＨＣＯ₃→Ｎａ₂ＳｅＯ₃＋４ＮａＩ＋６ＣＯ₂＋３Ｈ₂Ｏ。

続いて、無色の反応混合物を希釈して、任意にキャリアタンパク質と混合することができる。当該混合物を酸性化すると、反応は、反対方向に進み、微細（分化）形態の元素セレンおよび元素ヨウ素を生産する：Ｈ₂ＳｅＯ₃＋４ＨＩ→Ｓｅ＋２Ｉ₂＋３Ｈ₂Ｏ。

かかる酸性化は、ｐＨ３〜４への可溶性の酸の添加によるものであり得るが、同様に好適には、Ｈ⁺型のＤｏｗｅｘ５０イオン交換樹脂のような不溶性の酸を含んでもよい。ヨウ素は、不溶性のデンプン粒子への捕捉（混合またはカラム濾過、さらには紙上でのデンプンサイジングにより）により効果的に除去することができ、その後ｐＨは、生物学的に許容される作用レベルに調整し直すべきである。代替的な実行は、ＳｅＯ₂の水溶液を供給すること、化学量論量のヨウ化ナトリウムまたはカリウムを添加すること、続いて所望の場合希釈すること、および酸供給源で処理すること、ならびにヨウ素除去プロセスである。

本明細書中で提供する方法の利点は、水溶液中でタンパク質および補助剤により十分許容される条件下で、反応を実施することができることである。さらに、両方の反応構成成分が、正確な必要とされる化学量論組成で存在する。さらに、生じたセレンの粒径およびこの第２順の反応の反応速度は、単に希釈を操作することにより、広範囲にわたって変化させることができる。かかる反応のさらなる有益性は、すべて有効な防腐用量のヨウ素に曝露させた材料および容器を有することによる滅菌である。

光産物−タンパク質複合体の結合、取り込み、細胞内局在化、および細胞毒性メカニズム
材料および方法
細胞によるセレノメロシアニン由来のＳｅ(０)−タンパク質複合体の結合およびインターナリゼーション(internalization)：蛍光複合体は、実施例１に記載するように、ウシ胎児血清の存在下で、セレノメロシアニン色素を光退色させることにより調製した。続いて、細胞を、段階的な時間の間（graded periods of time）、蛍光複合体（１３μＭ）とインキュベートして、標準的なフルオレセインフィルタ設定（５２５／３０ｎｍ帯域フィルタ）を用いて、１５ｍＷ アルゴンイオンレーザ（４８０ｎｍ線）を装備したフローサイトメータ（FACStar, Becton Dickinson, Mountainview, CA）により結合／取り込みを測定した。データは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（Bescton Dickinson）ソフトウェアパッケージを用いて処理した。

複合体取り込みおよび複合体媒介性細胞死滅の温度依存性：セレノメロシアニン色素ＭＣ５４を、６７倍ストック溶液（エタノール中）から、１２％ウシ胎児血清を補充したα−培地に添加して、最終色素濃度２６μＭを達成した。混合物を白色灯（フルエンス率：２７Ｗ／ｍ²）に６０分間曝露して、続いて複合体結合／取り込みならびに細胞毒性実験に使用した。Ｌ１２１０白血病細胞（１０⁶／ｍｌ）を、段階的な時間間隔で、０℃乃至３７℃で、複合体溶液とインキュベートした。複合体取り込みは、上述したようにフローサイトメトリーにより測定した。ｉｎ ｖｉｔｒｏクローン原性細胞の生存は、上述のようにクローンアッセイで確定した。

細胞毒性Ｓｅ(０)−タンパク質複合体への１時間曝露によるＬ１２１０／Ｌ−ＰＡＭ１白血病細胞の細胞内チオールのレベル：細胞毒性複合体は、１２％ウシ胎児血清を補充したα−培地中で、６０分間、セレノメロシアニン色素ＭＣ５４を光退色させることにより調製した。HedleyおよびChow（DW Hedley, S Chow：フローサイトメトリーを用いて、細胞グルタチオン含有量を測定する方法の評価(Evaluation of methods for measuring cellular glutathione content using flow cytometry). Cytometry 15:349-358 (1994)）に記載されるように、細胞（１０⁶／ｍｌ）を、複合体と３７℃１時間インキュベートして、洗浄して、蛍光チオールプローブであるモノクロロビマン(Molecular Probes, Eugene, OR)でグルタチオンに関してプローブした。

結果および論考
細胞によるセレノメロシアニン由来のＳｅ(０)−タンパク質複合体の結合およびインターナリゼーション：マウス白血病細胞株Ｌ１２１０、ヒト前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５、およびヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５を用いて試験した場合、セレノメロシアニン由来のＳｅ(０)−タンパク質複合体は、これらの細胞により結合およびインターナライズされた（図８：ａ、Ｌ１２１０白血病細胞、ｂ、ＤＵ−１４５前立腺癌細胞、ｃ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌細胞）。乳癌および前立腺癌細胞で確定されたより高い蛍光値は、これらの細胞のより大きな平均サイズを幾分反映している。

複合体の取り込みおよび複合体媒介性の細胞死滅の温度依存性：低温は、蛍光複合体の取り込みを阻害し、複合体の細胞毒性活性に対して細胞を保護した（図９ａおよび図９ｂ）。この挙動は、エネルギー依存性エンドサイトーシスプロセスと一致する。この挙動はまた、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体が、標的細胞によりインターナライズされない限りは細胞毒性でないという概念とも一致する。複合体の取り込みおよび細胞毒性活性はまた、インキュベーション時間の関数でもあった（図９ａおよび図９ｂ）。

光産物−タンパク質複合体の結合／取り込みおよび細胞内局在化：腫瘍細胞により蛍光／細胞毒性光産物−アルブミン複合体の取り込みおよび細胞毒性作用は、サイトカラシンＢおよび低温（５℃）により阻害され、複合体が、エネルギー依存性エンドサイトーシスプロセスによりインターナライズされることを示唆した。Ｍｍ５ＭＴ乳癌の低密度培養物を、ＭＣ５４由来の緑色蛍光光産物−アルブミン複合体およびＬｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（リソソーム用の赤色蛍光プローブ、Molecular Probes社）とインキュベートすると、出現した画像中の多くのリソソームが黄色蛍光性であり、このことは、Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄおよび蛍光複合体が、同じ細胞器官で同時局在化されたことを示している。

細胞内および細胞外グルタチオンの役割：初期のパイロット実験により、細胞内グルタチオン（ＧＳＨ）の含有量の増加を特徴とするメルファラン耐性突然変異Ｌ１２１０白血病細胞は、相当する野生型細胞よりもＳｅ(０)−タンパク質複合体に対して感受性が高いことが示されている。このことは、インターナライズされた細胞毒性複合体の生理活性化における細胞内ＧＳＨの潜在的な役割に関する考察を助長した。しかしながら、続く実験により、突然変異Ｌ１２１０細胞は、野生型細胞よりも高い割合で細胞毒性複合体をインターナライズするために、突然変異Ｌ１２１０細胞は、複合体に対してより感受性が高いことが示された。ＧＳＨ生合成の阻害は、細胞毒性複合体に対して、細胞をより感受性を高くした。

還元型（ＧＳＨ）または酸化型（ＧＳＳＧ）グルタチオン（１ｍＭ）との同時インキュベーションにより、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体の細胞毒性効果が約５０％低減した。ＧＳＨとの同時インキュベーションは、細胞内グルタチオンレベルの中程度の増加を引き起こした。しかしながら、増加は非常に小さく出現したため、細胞外ＧＳＨの強力な保護効果を完全には説明することはできない。細胞外ＧＳＨは、蛍光複合体の取り込みを阻害しなかった。対比して、ほとんどの実験で、細胞外ＧＳＨは、複合体の取り込みをわずかに高めた。しかしながら、本発明者等は、取り込みを測定した蛍光複合体が依然として細胞毒性物を含有するかどうかについては、いまだ分かっていない。ＧＳＨが、Ｓｅ(０)−アルブミン複合体からのＳｅ(０)の解離を促進するかどうかを判定するために、ＧＳＨ（１ｍＭ）およびアルブミンを含有する緩衝液に対して、複合体を透析した。平衡に達したら、透析バッグの内部および外部のセレン含有量を、定量的元素分析（Galbraith Laboratoriesで実施）により確定した。セレンはすべて、透析バッグの内部で回収され、ＧＳＨは、キャリアタンパク質からＳｅ(０)を解離しないか、あるいは移動したコロイドセレン粒子は、透析膜の５，０００ダルトンの孔を通過することができなかったことを示唆した。ＧＳＨまたはＧＳＳＧによる前処理細胞は保護されていなかった。

インターナライズされたＳｅ(０)−タンパク質複合体による細胞内グルタチオンの迅速な欠乏：高感受性のＬ１２１０またはＬ１２１０／Ｌ−ＰＡＭ１白血病細胞において、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体の取り込みは、細胞内ＧＳＨの迅速な欠乏を引き起こした（図１０）。処理した細胞の上清中のグルタチオンレベルも減少し、細胞内ＧＳＨの損失は、漏出の結果ではなく、酸化事象の結果であることを示唆した。２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（Ｈ₂ＤＣＦＤＡ）は、細胞における酸化的ストレスを評価するためのプローブとして有用である（しかし、あまり特異的ではない）(Oyama, Y. et al., 1994; Trayner, I.D. et al., 1995)。Ｓｅ(０)−タンパク質複合体に曝露させた白血病細胞は、未処理の対照細胞よりも高レベルのＨ₂ＤＣＦを示し、これは、酸化的ストレスを示した。Ｓｅ(０)−タンパク質によるＨ₂ＤＣＦの酸化はまた、ＤＣＦＨ（Ｈ₂ＤＣＦＤＡの緩やかなアルカリ加水分解により生成）、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体、およびＨＥＰＥＳ−緩衝液のみを含有する無細胞系でも実証することができた（図１１）。総括すると、これらのデータは、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体は、チオールの迅速な酸化を触媒する空気酸化触媒として作用することを強く示唆する。

Spallholzとその共同研究者等は、タンパク質およびセレン化合物（０以外の酸化状態のＳｅを含有する）の共有結合付加体が、過酸化水素およびスーパーオキシドアニオンを生成するという証拠を提示している(Lin, Y. et al., 1993; Stewart, M.S. et al., 1997; Davis, R.L. et al., 1998)。Ｓｅ(０)−タンパク質複合体の細胞毒性作用における過酸化水素およびスーパーオキシドアニオンの役割を評価するために、本発明者等は、Ｌ１２１０白血病を、細胞毒性用量の複合体に曝露させて、続いてSpallholzとその共同研究者等により記載されるルミノールおよびルミノゲニンベースの試験(Lin, Y. et al., 1993; Stewart, M.S. et al., 1997; Davis, R.L. et al., 1998)を用いて、細胞をプローブした。両方の試験の結果は陰性であり、過酸化物およびスーパーオキシドアニオンは、本発明者等のＳｅ(０)−タンパク質複合体の重要な細胞毒性媒介物質ではないことを示唆した。

Ｓｅ(０)−タンパク質複合体の細胞毒性経路におけるアポトーシスの役割：ＨＬ−６０白血病細胞をＳｅ(０)−タンパク質複合体（２６μＭ）に３０分間曝露させた場合、アネキシンＶ陽性細胞の濃度は、３．５％から３１％に上昇した。平均細胞容量（前方光散乱により確定される場合）は、複合体曝露に応じて減少した。複合体で処理したＨＬ−６０白血病細胞の電子顕微鏡分析により、核の断片化、アポトーシス体、および膨潤したミトコンドリアの徴候が示された。

本発明者等は、細胞毒性Ｓｅ(０)−タンパク質複合体への曝露後に、Ｌ１２１０白血病細胞におけるカスパーゼ活性をモニタリングするためのOncogene(San Diego, CA)カスパーゼ検出キットを使用した。このキットは、広範囲のカスパーゼを検出する蛍光基質（ＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、フルオロメチルケトンで誘導体化した短ペプチドを有するフルオレセインイソチオシアネートの複合体）を使用する。ＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ＦＭＫを非細胞毒性濃度の特異的ペプチド阻害剤(R&D Systems, Minneapolis, MN)と併用して使用する場合、蛍光シグナルの阻害は、シグナル全体に対するそれぞれのカスパーゼの寄与に対して正比例する。図１２が示すように、特異的阻害剤の中でも、Ｚ−ＬＥＥＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ１３の阻害剤）が最も効果的であり、順に効力が減少して、カスパーゼ１０、４、９、２、６、３、８および１が続いた。予想通り、広範囲のカスパーゼを阻害する非特異的カスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫは、任意の特異的阻害剤よりも蛍光シグナルを低減させた。総括すると、これらのデータは、Ｌ１２１０白血病細胞では、細胞毒性Ｓｅ(０)−タンパク質複合体は、主としてカスパーゼ１０および１３を活性化することを示す。カスパーゼ２、４および９は、中程度の活性化を示すのに対して、カスパーゼ１、３、６および８は、ほとんど活性を示さないか、または全く活性を示さない。低レベルのカスパーゼ８活性は、細胞表面死受容体を包含しない細胞毒性メカニズムと一致する。研究を他の細胞型に拡張する場合、あるいは細胞毒性複合体への曝露後に、種々の時間間隔でカスパーゼ活性を試験する場合、幾らか異なる活性プロフィールが得られると考えられる。

選択的細胞毒性の分子基礎：白血病およびリンパ腫細胞（これらは、偶然同等のサイズである）では、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体に対する感受性は、主として複合体の取り込みと、また二番には細胞内ＧＳＨレベルと相関した。研究を固形腫瘍細胞に拡張する場合、状況はより複雑になり、細胞系によっては、複合体の広い取り込みにもかかわらず、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体に対してほんの中程度の感受性を示すにすぎないものもあった。データの予備分析は、複合体の取り込みおよびＧＳＨ含有量にほかに、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体に対する感受性の第３の決定因子が存在し得ることを示唆する。

メロシアニン−ＰＤＴにおける細胞毒性光産物−タンパク質複合体の役割
材料および方法
細胞毒性Ｓｅ(０)−タンパク質複合体の細胞毒性活性：セレノメロシアニン色素ＭＣ５４は、エタノール中の６７倍濃度のストック溶液から、それぞれ１０％ウシ胎児血清または１０％ヒト血清を補充したα−改変ダルベッコ培地（α−培地）中で最終濃度２６μＭとなるように添加して、白色蛍光灯（フルエンス率：２７Ｗ／ｍ²）に６０分間曝露して、細胞毒性Ｓｅ(０)−タンパク質複合体を生成した。細胞毒性複合体を含有する培地を、様々な比でα−培地と混合して、Ｓｅ(０)−タンパク質濃度０〜２６μＭを達成した。細胞（１０⁶／ｍｌ）をこれらの混合物中にて３７℃で６０分間インキュベートした。ｉｎ ｖｉｔｒｏクローン原性細胞の生存率を、Sieber, F. et al., 1987（これは、その全体が参照により援用される）に記載されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏクローンアッセイにより確定した。

結果
抗腫瘍活性の範囲：本発明者等は、表４に示す腫瘍細胞系のパネルに関して、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体を試験した。白血病およびリンパ腫細胞はすべて、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体に対して高感受性であった（図１３および図１４）。５ｌｏｇ以上の腫瘍細胞減少が、正常な造血幹細胞（ＣＤ３４陽性）および前駆細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）にほとんど損傷なしで、あるいは全く損傷なしで得ることができる。固形腫瘍細胞の応答は、単一腫瘍細胞型内でさえ多様であった。例えば、ある条件組（２６μＭ複合体、６０分）がＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞を９，３４６倍低減させた場合、同条件組は、ＢＴ−２０乳癌細胞をちょうど７倍低減させた。

ほとんどの固形腫瘍細胞が、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体（２６μＭ）との１時間のインキュベーションにより１００〜１，０００倍低減させるに過ぎなかったという事実は、固形腫瘍におけるＳｅ(０)−タンパク質複合体の使用と相反する。固形腫瘍はすべて、用量増大に応答し、ＣＤ３４陽性造血幹細胞が２６μＭを上回る複合体濃度に十分許容であり得ることから、２６μＭを上回る用量は、実現可能であり得る。さらに、ＤＵ１４５前立腺癌細胞を用いたパイロット実験は、より長いインキュベーション時間（最大６時間）は、腫瘍細胞死滅を有意に高めることを示す。

細胞毒性Ｓｅ(０)−タンパク質複合体に対する薬物耐性突然変異腫瘍細胞の感受性：腫瘍細胞株の本発明者等の調査は、数組の薬物耐性細胞および野生型細胞を包含した。メルファラン耐性Ｌ１２１０／Ｌ−ＰＡＭ１およびＬ１２１０／Ｌ−ＰＡＭ２細胞（高いレベルの細胞内グルタチオンを特徴とする(Ahmad, H. et al., 1987)）は、相当する野生型Ｌ１２１０細胞よりもＳｅ(０)−タンパク質複合体に対して感受性が高かった（図１４）。感受性の増加は、ＧＳＨレベルの増加ではなく、複合体の取り込みの増大に関連した。シスプラチン耐性ＰＣ１４／ＣＤＤＰ肺癌細胞（薬物の取り込みが低減されている(Ohmori, T. et al., 1993)）は、野生型ＰＣ１４細胞よりも複合体に対して感受性がわずかに低かった。感受性の低減は、複合体の取り込みの低減に相関した。シスプラチン耐性Ｈ６９／ＣＤＤＰ肺癌細胞（高いレベルのＧＳＨ、メタロチオネイン、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ｐｉを特徴とする(Kasahara, K. et al., 1991)）およびアドリアマイシン耐性Ｐ３８８／ＡＤＲ（Ｐ−糖タンパク質の過剰発現）白血病細胞は、それらの野生型相当物と同程度の感受性であった。アドリアマイシン耐性ＨＬ−６０／ＡＤＲ白血病細胞（ＭＲＰ媒介性薬物流出(Krishnamachary, N. et al., 1993)）は、野生型ＨＬ−６０細胞よりも複合体に対して感受性がわずかに低かった。感受性の低減は、複合体の取り込みの低減と相関した。ＨＬ−６０／ＡＤＲ細胞からグルコースを奪うこと（ＭＲＰ媒介性薬物搬出を阻害するため）は、正常に近いレベルにまで複合体の取り込みを回復させた。総括すると、これらのデータは、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体による治療は、共通の薬物耐性メカニズムによってのみ最低限に影響を受けることを示唆する。

原始造血幹細胞に対する毒性：正常な造血幹細胞および前駆細胞に対するＳｅ(０)−タンパク質複合体の毒性に関する研究を、マウスおよびヒトＣＤ３４陽性細胞に拡張した。ＦＩＴＣ標識した抗ＣＤ３４抗体と光産物−アルブミン複合体との間のスペクトル干渉を回避するために、ＭＣ５４ではなくてＭＣ５６を光退色させることにより、細胞毒性複合体を調製した（ＭＣ５６により形成される複合体は、非蛍光性であるが、ＭＣ５４により形成される複合体と同程度に細胞毒性である）。図１３および図１４が示すように、ヒトおよびマウスＣＤ３４陽性幹細胞はともに、細胞毒性Ｓｅ(０)−タンパク質複合体に対して耐性であった。

光線力学療法におけるＳｅ(０)−タンパク質複合体の役割：図１５は、ある特定の実験条件下で、細胞毒性Ｓｅ(０)−タンパク質複合体が、セレノメロシアニン媒介性光線力学療法（ＰＤＴ）において有力な役割を果たすことができることを示す。室温で記録した生存曲線は、ＭＣ５４−ＰＤＴおよびＭＣ５４由来の光産物−タンパク質複合体の組み合わせた細胞毒性効果を示す。５℃で記録した生存曲線は、ＭＣ５４−ＰＤＴのみの効果を示すに過ぎない。２つの曲線間の大きな違いは、ＭＣ５４０由来の細胞毒性複合体の寄与を反映している。したがって、対象の腫瘍細胞に応じて、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体の取り込みに好都合である条件は、ＰＤＴの治療指数を高め得るか、または低減し得る。標的細胞がＬ１２１０／Ｌ−ＰＡＭ１またはＬ１２１０／Ｌ−ＰＡＭ２細胞である場合、これらの細胞がＰＤＴ（すなわち、原形質膜に対する一重項酸素媒介性の損傷）に対して非常に耐性であるが、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体に対して例外的に感受性が高いため、複合体の取り込みに好都合である実験条件を選択することは、明らかに有利であろう。

Ｓｅ(０)−タンパク質複合体および４−ヒドロペルオキシシクロホスファミド（４−ＨＣ）の細胞毒性活性の比較
方法
細胞毒性Ｓｅ(０)−タンパク質複合体は、ウシ胎児血清（１０％）およびセレノメロシアニン光増感剤ＭＣ５４（２６μＭ）を補充したα−培地を、白色蛍光灯（フルエンス率：２７Ｗ／ｍ²）に６０分間曝露させることにより生成した。野生型Ｌ１２１０白血病細胞、メルファラン耐性突然変異Ｌ１２１０／Ｌ−ＰＡＭ１細胞、または正常マウス顆粒球／マクロファージ前駆体（ｍＣＦＵ−ＧＭ）（１０⁶／ｍｌ）を、細胞毒性複合体中、あるいは４−ＨＣ（１０μｇ／ｍｌ）を補充したα−培地中に懸濁させて、３７℃で４５分間インキュベートした。処理条件は、正常なマウス造血前駆細胞（ｍＣＦＵ−ＧＭ）の同様の回復を達成するように選択した。細胞から余分な複合体または薬物を洗い流して、生存率を、ｉｎ ｖｉｔｒｏクローンアッセイにより確定した。

結果
結果を表５に示す。細胞毒性複合体は、腫瘍細胞を死滅する際に、４−ＨＣより強力かつ選択的であった。４−ＨＣは、腫瘍細胞よりも正常細胞を多く死滅させたのに対して、複合体は、正常細胞よりも腫瘍細胞を多く死滅させた。

全身療法に関する光産物−タンパク質複合体の評価
材料および方法
Ｓｅ(０)−アルブミン複合体の細胞毒性に対する天然アルブミンの影響：正常なヒト血液に、ヒト白血病ＨＬ−６０細胞（１０⁷／ｍｌ）を加えた後、蛍光及びＳｅ(０)−アルブミン複合体(fluorescent and Se(0)-albumin conjugates)と９０分間インキュベートした。タンパク質源であった(The protein source was.)。フローサイトメトリーを用いて、蛍光複合体をインターナライズさせた細胞を同定した。

蛍光および細胞毒性光産物−タンパク質複合体の貯蔵寿命：蛍光および細胞毒性複合体の貯蔵寿命を評価するために、大量のＭＣ５４由来の複合体を２ｍｌのプラスチックバイアルに分取した。バイアルのある組を室温で、ある組を５℃で、ある組を−２０℃で、またある組を−８０℃で保管した。１日後、１週後、１ヶ月後、３ヶ月後、および６ヶ月に、各組からの分取量を回収して、蛍光強度および細胞毒性活性に関してアッセイした。Ｌ１２１０／Ｌ−ＰＡＭ１白血病細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏクローンアッセイを用いて、細胞毒性活性を評価した。

各種光源により生成されるＳｅ(０)−タンパク質複合体の細胞毒性活性の比較：セレノメロシアニン光増感剤ＭＣ５４を、エタノール中の濃縮ストック溶液から、１２％ＦＣＳを含有するα−培地に添加した。混合物を白色蛍光灯（フルエンス率：２７Ｗ／ｍ²）、黄色アクリルフィルタを取り付けた同一の白色蛍光灯源、または橙色ＬＥＤ光源（５７４ｎｍでピーク発光）に曝露させた。続いて、当該培地を用いて、マウスＬ１２１０白血病細胞を培養して、白血病細胞の生存率を確定した。

蛍光複合体の生成に対する各種光源の影響：セレノメロシアニン光増感剤ＭＣ５４を、エタノール中の濃縮ストック溶液から、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４中のウシ血清アルブミン（１．７５ｍｇ／ｍｌ）の溶液に、最終濃度２０μＭとなるように添加して、蛍光灯または橙色ＬＥＤ光源に曝露させた。様々な時間間隔（１０分〜２４時間）で少量の分取量を取り出して、ＨＥＰＥＳ緩衝液で３０倍に希釈して、４９０ｎｍの励起波長を用いて、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｆ ４５００蛍光分光光度計で分析した。蛍光発光ピーク高さを５２０ｎｍで記録した。

結果
Ｓｅ(０)−アルブミン複合体の細胞毒性に対する天然アルブミンの影響：過剰の天然アルブミンは、光産物−アルブミン複合体の取り込みを妨害して、Ｓｅ(０)−アルブミン複合体の細胞毒性効果に対して細胞を保護した（図１８ａおよび図１８ｂ）。しかしながら、全血のアルブミン濃度は、白血病細胞による複合体の優先的な結合および取り込みを防止するには不十分であった（図１９）。

蛍光および毒性複合体の蛍光ならびに毒性に対する保管および光源の影響：蛍光複合体は、保管温度にかかわらず、６ヶ月間安定であった。細胞毒性活性は、複合体を−８０℃で保管した場合に、６ヶ月間安定であった（図１７）。室温、５℃または−２０℃で保管したサンプルは、細胞毒性活性の緩やかな損失を示した（例えば、図１６を参照）。不活性となったサンプルにおいて、本発明者等は、元素セレンの肉眼的な沈殿物を確認した。これは、もともと非常に小さなコロイドＳｅ(０)粒子が、より大きな粒子へと凝集したことを示唆した。

Ｓｅ(０)−タンパク質複合体の細胞毒性活性は、それらを生成するのに使用した光源にかかわらず、非常に類似していた（図２０）。しかしながら、橙色ＬＥＤ光源は、蛍光複合体の生成に好ましかった（図２１）。

臨床用途のために、安定なＳｅ(０)−タンパク質複合体を有する代替法の１つは、使用直前に、個々の用量の細胞毒性複合体を生成するユーザーが利用しやすい光源を有することであろう。本発明者等は、個別に切り替えられる６１２および５７４ｎｍＬＥＤを有する小さなプロトタイプＬＥＤ光源を開発した。ＬＥＤの両セットは、非常に効率的にＭＣ５４を光退色させた。ＬＥＤ光源の有益性の１つは、本発明者等が、光産物−アルブミン複合体の蛍光収率に悪影響を及ぼすことなく、もとの色素および一過性の発色団光産物（ＭＣ４７）を完全に退色させることができることであった。結果として、複合体の蛍光収率は、白色光ボックス中で調製した複合体の蛍光収率よりも約２００％高かった。もとの（赤色蛍）色素および（橙色蛍光）光産物（ＭＣ４７）を完全に含まない高強度の緑色蛍光複合体を調製する能力を有することは、多重蛍光プローブに関与する診断研究に非常に有用であることを証明した。

マウスにおける光産物−タンパク質複合体の急性全身毒性：初期の急性毒性研究では、５匹の雌Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウス群に光産物−タンパク質複合体を腹腔内注射した。光産物−タンパク質複合体は、等モル濃度のウシ血清アルブミンの存在下で、セレノメロシアニンＭＣ５４（２６μＭ）を光退色させることにより生成した。群１には、この複合体の１ｍｌの腹腔内注射を１回施した。群２〜群５は、複合体の同じ注射を、それぞれ２日、３日、４日または５日連続して施した。動物はすべて生存した。動物は、急性毒性または慢性毒性の徴候を示さなかった。

第２の毒性実験は、色素対タンパク質比５：１で調製した複合体を使用した。ＭＣ５４は、エタノール中のストック溶液から添加したため、第２シリーズのマウスは、５倍高い用量のエタノールに曝露させた。マウスはすべて、急性アルコール毒性を示したが、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体に起因する毒性の徴候は示さなかった。

細胞毒性Ｓｅ(０)−タンパク質複合体と電離放射線および標準的な化学療法剤との相互作用：この研究の目的は、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体が、電離放射線または標準的な細胞毒性薬物と併用した場合に相乗的な抗腫瘍活性の徴候を示すかどうかを確定することであった。通常、５または６倍用量の放射線または薬物を、１または２倍濃縮の複合体と併用させた。あるいは、５または６倍用量の複合体を、１または２倍用量の薬物と併用させた。組合せに応じて、２つの作用物質を、順次または同時に適用させた。薬物は、メルファラン、アミフォスチン、シスプラチン、エデルフォシン（ＥＴ−１８−ＯＣＨ₃）、４−ヒドロペルオキシシクロホスファミド（４−ＨＣ）、酸化ヒ素（III）、アンホテリシンＢ、およびブチオニンスルホキシミンを包含した。各組合せに関して、２つまたはそれ以上の標的細胞を、以下の腫瘍細胞株の一団から選択した：Ｌ１２１０およびＨＬ−６０／ＡＤＲ白血病細胞、ＰＣ３およびＤＵ１４５前立腺癌細胞、Ｈ６９肺癌細胞、Ｍｍ５ＭＴ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＣ１２７１乳癌細胞、ならびにＳＫ−ＥＳ−１ユーイング肉腫細胞。

Ｓｅ(０)−タンパク質複合体による前処理は、腫瘍細胞をメルファランおよび電離放射線に対して感作させた（図２２および図２３）。放射線とＳｅ(０)−タンパク質複合体の組合せは、ＤＵ１４５前立腺癌細胞よりもＬ１２１０白血病およびＰＣ３前立腺癌においてより有効であった。複合体およびメルファランは、細胞内ＧＳＨを相乗的に減少させた（図２４）。Ｓｅ(０)−タンパク質複合体と４−ＨＣの組合せは、相加的抗腫瘍効果を有するようであった。

無毒性（３ｍｇ／ｍｌ）濃度のアミフォスチンによる短時間（３０分）の前処理は、腫瘍細胞を細胞毒性複合体に対して感作させた（図２５および図２６）。その効果は、ＤＵ１４５前立腺癌細胞よりもＬ１２１０白血病およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌でより顕著であった。図２６は、アミフォスチンによる前処理が、正常なマウスＣＤ３４陽性造血幹細胞の生存を弱めることなく、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体によるＬ１２１０マウス白血病細胞の死滅を増強したことを示す。ＣＤ３４陽性細胞の完全な回復は、造血幹細胞区画に対して最低限の損傷または損傷なしを示す。アミフォスチンおよび細胞毒性複合体による併用療法に対するＣＤ３４陽性幹細胞の耐性は、ヒト起源の骨髄細胞で確認されている。結合／取り込み実験は、細胞毒性複合体に対するアミフォスチン処理した腫瘍細胞の感受性の増大が、複合体取り込みの増大の結果であることを示す。

Ｓｅ(０)−タンパク質複合体と同時に適用した低用量（６〜１２μｇ／ｍｌ）のシスプラチン（ＣＤＤＰ）は、ＤＵ１４５前立腺性細胞に対する複合体の細胞毒性効果を完全に中和した（図２７）。シスプラチンは、中程度の感受性の前立腺または乳癌細胞による蛍光光産物−アルブミン複合体の結合／取り込みを著しく妨害するようには見えなかった。高感受性のＬ１２１０およびＬ１２１０／Ｌ−ＰＡＭ１白血病細胞、ならびに正常な顆粒球／マクロファージ前駆体にまで実験を拡張した場合、ＣＤＤＰの拮抗作用が確認された。しかしながら、固形腫瘍細胞とは異なり、複合体の取り込みは、白血病細胞では著しく低減した。複合体取り込みの低減の結果として、細胞内グルタチオン（ＧＳＨ）レベル（蛍光プローブであるモノクロロビマンを用いて確定）は、ＣＤＤＰ処理した細胞では最低限に低減したにすぎない。細胞を順次、シスプラチンおよびＳｅ(０)−タンパク質複合体に曝露させた場合、２つの作用物質の抗腫瘍効果は、ＤＵ１４５およびＰＣ３前立腺癌細胞で相加的であるようであった。エデルフォシン（５０μｇ／ｍｌ、６０分）とＳｅ(０)−タンパク質複合体の組合せは、細胞をまずエデルフォシンに曝露させた場合には、中程度に効果的であった。２つの作用物質を逆の順序で、あるいは同時に使用すると、より劣った結果をもたらした。乳癌細胞は、前立腺癌細胞よりもエデルフォシン／複合体の組合せに対してより良好に応答した。ブチオニンスルホキシミン（０．５ｍＭ、２０時間）による前処理は、複合体に対するＤＵ１４５前立腺癌細胞の応答を改善したが、ＰＣ３前立腺癌およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌細胞の応答に対してほとんどまたは全く影響がなかった。

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本発明は、上述の実施例に限定されるものと意図されず、添付の特許請求の範囲内であるような変更および変形をすべて包含する。

図１は、細胞毒性／蛍光複合体の光化学的生成に関する提唱される反応スキームを示す。 図２は、選択したメロシアニン色素の構造を示す。 図３は、ＭＣ５４、光退色させたＭＣ５４（ＭＣ４７）およびＭＣ５４由来の光産物−アルブミン複合体の標準化した蛍光発光スペクトルを示す。 図４は、光退色させたＭＣ５４の質量スペクトルを示す。観察された５９６．２５の質量は、算出した質量５９６．１９と十分一致する。 図５は、無傷ＭＣ５４の質量スペクトルを示す（セレンの特徴的な同位体分布）。 図６は、セファデックスＧ−１００上での蛍光光産物−タンパク質複合体のゲル濾過クロマトグラフィの結果を示す。▼は、３つのマーカータンパク質の溶出ピークを示す：ウシ血清アルブミン二量体（左）、ウシ血清アルブミン単量体（中央）および炭酸脱水酵素（右）。 図７は、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体の細胞毒性活性に対する色素：タンパク質比の影響を示す。研究で使用したタンパク質は、ウシ血清アルブミンであり（Ｓｅ(０)濃度は１０μＭに保持した）、Ｓｅ(０)複合体への細胞曝露時間は、１時間であった。標的細胞は、マウスＬ１２１０／Ｌ−ＰＡＭ１白血病細胞であった。データ点は、４つのプレートの平均±ＳＥ（標準誤差）である。 図８は、Ｌ１２１２０マウス白血病細胞（ａ）、ＤＵ−１４５ヒト前立腺癌細胞（ｂ）およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳癌細胞（ｃ）による蛍光光産物−アルブミン複合体の結合／取り込みを示す。データ点は、４つの培養プレートの平均コロニー計数±ＳＥを表す。 図９は、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体によるＬ１２１０白血病細胞の死滅（ａ）および蛍光セレノメロシアニン由来の光産物−タンパク質複合体の取り込み（ｂ）が温度依存的であることを示す。研究に使用されるタンパク質源は、ウシ胎児血清であり（Ｓｅ(０)濃度は２６μＭであった）、細胞は、Ｌ１２１０白血病細胞であった。

図１０は、Ｌ１２１０／Ｌ−ＰＡＭ１白血病細胞をＳｅ(０)−タンパク質複合体と１時間インキュベートすることにより、細胞への細胞内チオールが低減することを示す。曝露時間は１時間であった。データ点は、４つの測定の平均±ＳＥである。 図１１は、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体によりＤＣＦＨの酸化を示す。タンパク質源は、ウシ胎児血清であった。複合体濃度は、２６μＭであった。データ点は、４つの測定の平均±ＳＥである。 図１２は、細胞をＳｅ(０)−タンパク質複合体（２６μＭ）に３０分間曝露させた後のＬ１２１０白血病細胞におけるカスパーゼ活性の活性化を示す。複合体は、ＭＣ５６に由来して、蛍光カスパーゼ基質によるスペクトル干渉を回避する。タンパク質源は、ウシ胎児血清であった。カスパーゼ阻害剤は、製造業者(R&D Systems)により推奨されるように使用した。すなわち、各サンプルは、１０⁶個の細胞を含有し、阻害剤の最終濃度は、０．１ｍＭであった。インキュベーションは、３７℃で１時間であった。阻害剤名称の「Ｚ」の接頭辞は、細胞透過性を高めるために、ベンジルオキシカルボニル基を用いて阻害剤を合成したことを示す。図１２では、「Ｚ」の接頭辞および「−ＦＭＫ」の接尾辞は、スペースの制限のため省略する。 図１３は、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体に対するマウス正常（ＣＤ３４陽性幹細胞および顆粒球／マクロファージ前駆体（ｍＣＦＵ−ＧＭ））および腫瘍性（野生型Ｌ１２１０白血病細胞およびメルファラン耐性突然変異Ｌ１２１０／Ｌ−ＰＡＭ１およびＬ１２１０／Ｌ−ＰＡＭ２白血病細胞）造血細胞の差次的感受性（１時間の曝露後）を示す。タンパク質源は、ウシ胎児血清であった。ｍＣＦＵ−ＧＭ、Ｌ１２１０、Ｌ１２１０／Ｌ−ＰＡＭ１、およびＬ１２１０／Ｌ−ＰＡＭ２細胞の生存は、ｉｎ ｖｉｔｒｏクローンアッセイにより確定した。ＣＤ３４陽性細胞の収率は、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ３４抗体による染色後にフローサイトメトリーにより確定した。データ点は、４つのプレートまたは測定の平均±ＳＥである。 図１４は、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体に対するヒト正常（ＣＤ３４陽性幹細胞および顆粒球／マクロファージ前駆体（ｈＣＦＵ−ＧＭ））および腫瘍性（ＨＬ−６０およびＫ５６２白血病細胞ならびにダウディリンパ腫細胞）造血細胞の差次的感受性（１時間の曝露後）を示す。タンパク質源は、ウシ胎児血清であった。ＣＤ３４陽性細胞の収率は、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ３４抗体による染色後にフローサイトメトリーにより確定した。ｈＣＦＵ−ＧＭ、ならびにｆＨＬ−６０、Ｋ５６２およびダウディ細胞の生存は、ｉｎ ｖｉｔｒｏクローンアッセイにより確定した。データ点は、４つのプレートまたは測定の平均±ＳＥである。

図１５は、Ｌ１２１０白血病細胞のＭＣ５４で感作される光不活性化に対する温度の影響を示す。色素濃度は、１３μＭであった。データ点は、４つのプレートの平均±ＳＥである。 図１６は、−２０℃で保管した後のＳｅ(０)−タンパク質複合体の細胞毒性活性を示す。タンパク質源は、ウシ胎児血清であった。Ｌ１２１０／Ｌ−ＰＡＭ１細胞は、Ｓｅ(０)タンパク質複合体で１時間処理して、複合体の細胞毒性活性を評価した。データ点は、４つのプレートの平均±ＳＥである。 図１７は、−８０℃で保管した後のＳｅ(０)−タンパク質複合体の細胞毒性活性を示す。タンパク質源は、ウシ胎児血清であった。Ｌ１２１０／Ｌ−ＰＡＭ１細胞は、Ｓｅ(０)タンパク質複合体で１時間処理して、複合体の細胞毒性活性を評価した。データ点は、４つのプレートの平均±ＳＥである。 図１８は、Ｌ１２１０白血病細胞を用いた、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体（ａ）の細胞毒性の影響、および蛍光光産物−アルブミン複合体の結合／取り込み（ｂ）に対する過剰な天然ウシ血清アルブミンの影響を示す。タンパク質源は、ウシ胎児血清であり、Ｓｅ(０)濃度は、２６μＭであった。 図１９は、ＨＬ−６０ヒト白血病細胞を加えた（１０⁷個／ｍｌ）正常ヒト血液による蛍光光産物−アルブミン（ウシ血清アルブミン）複合体の優先的な取り込みを示す。細胞は、光産物−アルブミン複合体と９０分間インキュベートした。アッセイは、フローサイトメータによるものであった。 図２０は、光が、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体の細胞毒性活性に対してほとんど影響を及ぼさないか、または全く影響を及ぼさないことを示す。この研究は、Ｌ１２１０白血病細胞を用いて行った。タンパク質源は、ウシ胎児血清であり、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体を形成するための照射時間は、６０分であった。 図２１は、蛍光光産物−アルブミン複合体の生成に対する光源の影響を示す。 図２２は、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体および電離放射線への順次曝露によるＬ１２１０白血病細胞の減少を示す。複合体濃度は、１５μＭであった。タンパク質源は、ウシ胎児血清であり、データ点は、４つのプレートの平均±ＳＥである。

図２３は、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体およびメルファランによるＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳癌細胞の不活性化を示す。細胞をまず複合体（１５μＭ）に１時間、続いてメルファランに３５分間曝露させた。タンパク質源は、ウシ胎児血清であり、データ点は、４つのプレートの平均±ＳＥである。 図２４は、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体（１５μＭ、６０分）およびメルファラン（５００μＭ、３５分）への順次曝露によるＬ１２１０白血病細胞におけるグルタチオンの相乗作用的枯渇を示す。タンパク質源は、ウシ胎児血清であり、データ点は、４つのプレートの平均±ＳＥである。 図２５は、無毒性用量（３ｍｇ／ｍｌ）のアミフォスチンで３０分間前処理することにより、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体によるＭＤＡ−ＭＢ ４３５ヒト乳癌細胞の不活性化が強化されることを示す。タンパク質源は、ウシ胎児血清であった。データ点は、４つの培養皿の平均コロニー計数±ＳＥを表す。 図２６は、アミフォスチンで前処理することにより、正常マウスＣＤ３４陽性幹細胞の生存を弱めることなくＳｅ(０)−タンパク質複合体による白血病細胞の死滅が強化されることを示す。Ｌ１２１０マウス白血病細胞および正常マウス骨髄細胞を、アミフォスチン（３ｍｇ／ｍｌ）と３７℃で３０分間インキュベートして、過剰のアミフォスチンを洗い流した後、段階的濃度のＳｅ(０)−タンパク質複合体に３７℃で６０分間曝露させた。Ｌ１２１０細胞の生存は、ｉｎ ｖｉｔｒｏクローンアッセイにより確定した。ＣＤ３４陽性細胞は、ＦＩＴＣ結合抗体により同定した。ＦＩＴＣ陽性細胞は、フローサイトメータで数えた。複合体は、ウシ胎児血清およびＭＣ５６を用いて調製した。本発明者等は、ＦＩＴＣ結合抗体による干渉を回避しなくてはならないことから、ＭＣ５４の代わりにＭＣ５６（これは、非蛍光複合体を生成する）を使用した。 図２７は、同時に適用させたシスプラチンは、Ｓｅ(０)−タンパク質複合体の細胞毒性作用に対してアンタゴニスト効果を有することを示す。この研究は、ＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞を用いて行った。タンパク質源は、ウシ胎児血清であり、データ点は、４つのプレートの平均±ＳＥである。

Claims (47)

1. 元素セレン（Ｓｅ(０)）粒子、および
   薬学的に許容可能な送達媒質
   を含む薬学的組成物。
2. 生存細胞によりインターナライズされ得るキャリア分子であって、１つまたはそれ以上のＳｅ(０)粒子と複合体を形成するキャリア分子
   をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
3. 前記Ｓｅ(０)粒子が直径０．４〜５０ナノメーターを有する、請求項１に記載の組成物。
4. 前記Ｓｅ(０)粒子が直径０．４〜５ナノメーターを有する、請求項１に記載の組成物。
5. 前記Ｓｅ(０)粒子が直径０．４〜１ナノメーターを有する、請求項１に記載の組成物。
6. 前記Ｓｅ(０)粒子が分散媒質中でＳｅ(０)コロイドを形成することができる、請求項１に記載の組成物。
7. 前記キャリア分子が標的細胞特異的である、請求項２に記載の組成物。
8. 前記キャリア分子がタンパク質、糖タンパク質およびリポタンパク質からなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
9. 前記キャリア分子がアルブミン、高密度リポタンパク質、低密度リポタンパク質および超低密度リポタンパク質からなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
10. 前記キャリア分子がアルブミンである、請求項２に記載の組成物。
11. 前記生存細胞が癌細胞、自己免疫障害に関与する免疫細胞、移植片対宿主病または拒絶反応に関与する同種異系反応性リンパ球、寄生生物および寄生血球からなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
12. 前記生存細胞が癌細胞である、請求項２に記載の組成物。
13. 細胞を死亡させる方法であって、以下の：
    前記細胞、または前記細胞を有するヒトもしくは非ヒト被験体を、前記細胞を死滅させるのに十分な量で請求項１に記載の組成物で処理する工程
    を含む方法。
14. 前記細胞、または前記細胞を有するヒトもしくは非ヒト被験体を、前記細胞を死滅させるのに十分な量で請求項２に記載の組成物で処理する工程を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記細胞、または前記細胞を有するヒトもしくは非ヒト被験体を、前記細胞を死滅させるのに十分な量で請求項６に記載の組成物で処理する工程を含む、請求項１３に記載の方法。
16. 前記細胞、または前記細胞を有するヒトもしくは非ヒト被験体を、前記細胞を死滅させるのに十分な量で請求項７に記載の組成物で処理する工程を含む、請求項１３に記載の方法。
17. 前記細胞、または前記細胞を有するヒトもしくは非ヒト被験体を、前記細胞を死滅させるのに十分な量で請求項１０に記載の組成物で処理する工程を含む、請求項１３に記載の方法。
18. 前記細胞が、癌細胞、自己免疫障害に関与する免疫細胞、移植片対宿主病または拒絶反応に関与する同種異系反応性リンパ球、寄生生物および寄生血球からなる群から選択され、該方法が、前記細胞、または前記細胞を有するヒトもしくは非ヒト被験体を、前記細胞を死滅させるのに十分な量で請求項１１に記載の組成物で処理する工程を含む、請求項１３に記載の方法。
19. 前記細胞が癌細胞であり、該方法が、前記細胞、または前記細胞を有するヒトもしくは非ヒト被験体を、前記細胞を死滅させるのに十分な量で請求項１２に記載の組成物で処理する工程を含む、請求項１３に記載の方法。
20. 細胞を細胞毒性剤に感作させる方法であって、該細胞が細胞内グルタチオンの存在に起因して前記細胞毒性剤に耐性である方法であって、以下の：
    前記細胞、または前記細胞を有するヒトもしくは非ヒト被験体を、請求項１に記載の組成物で処理する工程
    を含む方法。
21. 細胞を死亡させる方法であって、該細胞が細胞内グルタチオンの存在に起因して前記細胞毒性剤に耐性である方法であって、以下の：
    前記細胞、または前記細胞を有するヒトもしくは非ヒト被験体を、請求項１に記載の組成物で処理する工程、および
    前記細胞を前記細胞毒性剤に曝露させる工程
    を含む方法。
22. 前記細胞、または前記細胞を有するヒトもしくは非ヒト被験体が請求項２に記載の組成物で処理される、請求項２１に記載の方法。
23. 前記細胞が癌細胞である、請求項２１に記載の組成物。
24. 前記細胞毒性剤が電離放射線およびアルキル化剤からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
25. 細胞の細胞内グルタチオンレベルを低減させる方法であって、以下の：
    前記細胞、または前記細胞を有するヒトもしくは非ヒト被験体を、前記細胞の細胞内グルタチオンレベルを低減させるのに十分な量で請求項１に記載の組成物で処理する工程
    を含む方法。
26. Ｓｅ(０)を生成する方法であって、以下の：
    感光性セロン色素を供給する工程、
    前記色素を、酸素分子の存在下で適切な波長の光に曝露させる工程、および
    Ｓｅ(０)を精製する工程
    を含む方法。
27. 前記感光性セロン色素がセレノメロシアニン色素およびセレノオキソノール色素からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
28. 前記セレノメロシアニン色素がＭＣ５４、ＭＣ５５、ＭＣ５６およびＭＣ５７からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
29. 前記Ｓｅ(０)がコロイドＳｅ(０)である、請求項２６に記載の方法。
30. 前記適切な波長の光が発光ダイオード（ＬＥＤ）により発生される、請求項２６に記載の方法。
31. Ｓｅ(０)およびキャリア分子の複合体を生成する方法であって、該キャリア分子が生存細胞によりインターナライズされ得る方法であって、以下の：
    セロン色素を供給する工程、
    前記色素を、Ｓｅ(０)を生成するために酸素分子の存在下で適切な波長の光に曝露させる工程、
    Ｓｅ(０)および前記キャリア分子の前記複合体を生成するために、前記色素を前記光に曝露させる前、曝露させるのと同時、あるいは曝露させた後に、前記キャリア分子を前記色素と混合する工程、および
    Ｓｅ(０)および前記キャリア分子の前記複合体を精製する工程
    を含む方法。
32. 前記感光性セロン色素がセレノメロシアニン色素およびセレノオキソノール色素からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
33. 前記セレノメロシアニン色素がＭＣ５４、ＭＣ５５、ＭＣ５６およびＭＣ５７からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
34. 前記Ｓｅ(０)がコロイドＳｅ(０)である、請求項３１に記載の方法。
35. 前記適切な波長の光が発光ダイオード（ＬＥＤ）により発生される、請求項３１に記載の方法。
36. 前記キャリア分子がタンパク質、糖タンパク質およびリポタンパク質からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
37. 前記キャリア分子がアルブミン、高密度リポタンパク質、低密度リポタンパク質および超低密度リポタンパク質からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
38. 前記キャリア分子がアルブミンである、請求項３１に記載の方法。
39. 発色団光産物およびキャリア分子の複合体を生成する方法であって、該キャリア分子が生存細胞によりインターナライズされ得る方法であって、以下の：
    供与体複素環中に硫黄またはセレン原子を含有するメロシアニン色素を供給する工程、
    前記色素を、前記発色団光産物を生成するために酸素分子の存在下で適切な波長の光に曝露させる工程、
    前記発色団光産物および前記キャリア分子の前記複合体を生成するために、前記色素を前記光に曝露させる前、曝露させるのと同時、あるいは曝露させた後に、前記キャリア分子を前記色素と混合する工程、および
    前記発色団光産物および前記キャリア分子の前記複合体を精製する工程
    を含む方法。
40. 請求項３９により生成される部分的または完全に精製された蛍光複合体、および
    薬学的に許容可能な送達媒質
    を含む薬学的組成物。
41. Ｓｅ(０)−キャリア複合体
    をさらに含む、請求項４０に記載の薬学的組成物。
42. 標的細胞の存在を確定する方法であって、該標的細胞が対照細胞よりも多くのキャリア分子をインターナライズする方法であって、以下の：
    前記標的細胞、または前記標的細胞を有するヒトもしくは非ヒト被験体を、前記標的細胞の存在を確定するのに十分な量で請求項４０に記載の組成物で処理する工程
    を含む方法。
43. 前記標的細胞が癌細胞である、請求項４２に記載の方法。
44. 標的細胞へ進入するＳｅ(０)−キャリア複合体の進入および量をモニタリングする方法であって、以下の：
    前記標的細胞、または前記標的細胞を有するヒトもしくは非ヒト被験体を、請求項４１に記載の組成物で処理する工程を含む方法であって、前記蛍光複合体中の前記キャリア分子および前記Ｓｅ(０)−キャリア複合体中の前記キャリア分子は同じである方法。
45. Ｓｅ(０)および発色団光産物を生成する方法であって、以下の：
    供与体複素環中に硫黄またはセレン原子を含有するセレノメロシアニン色素を供給する工程、
    前記色素を、Ｓｅ(０)および前記発色団光産物を生成するために酸素分子の存在下で適切な波長の光に曝露させる工程、および
    Ｓｅ(０)および前記発色団光産物のうちの少なくとも１つを精製する工程
    を含む方法。
46. Ｓｅ(０)およびキャリア分子の複合体、ならびに発色団光産物および同じキャリア分子の蛍光複合体を生成する方法であって、該キャリア分子が生存細胞によりインターナライズされ得る方法であって、以下の：
    供与体複素環中に硫黄またはセレン原子を含有するセレノメロシアニン色素を供給する工程、
    前記色素を、Ｓｅ(０)および前記発色団光産物を生成するために酸素分子の存在下で適切な波長の光に曝露させる工程、
    Ｓｅ(０)および前記キャリア分子の前記複合体、ならびに前記発色団光産物および前記キャリア分子の前記蛍光複合体を生成するために、前記色素を前記光に曝露させる前、曝露させるのと同時、あるいは曝露させた後に、前記キャリア分子を前記色素と混合する工程、および
    Ｓｅ(０)および前記キャリア分子の前記複合体、ならびに前記発色団光産物および前記キャリア分子の前記蛍光複合体のうちの少なくとも１つを精製する工程
    を含む方法。
47. Ｓｅ(０)−キャリア複合体を生成する方法であって、以下の：
    キャリア分子の存在下で二酸化セレン、亜セレン酸または亜セレン酸塩を還元する工程
    を含む方法。
    

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