JP2006501851A5

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Publication number: JP2006501851A5
Application number: JP2004543360A
Authority: JP
Filing date: 2003-10-03
Publication date: 2011-03-03
Anticipated expiration: 2023-10-03

Description

第一の側面において、本発明は、実質的に同じ条件下で培養した場合に、PTS宿主細胞内の対応する同じ代謝経路と比較して、形質転換宿主細胞の代謝経路への炭素流量が増えることを特徴とし、a)プロモーター及びグルコース同化タンパク質の上流(5’)領域に対応するDNAフランキング領域を含むDNA構築物を用いたPTS^-/Glu^-宿主細胞の形質転換による、宿主細胞内のグルコース同化タンパク質をエンコードする核酸と作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾；b)Glu+表現型を復元するためのDNA構築物の組込み、及びc)形質転換された宿主細胞の適切な条件下の培養を含む、糖質輸送に対するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を利用する能力を本来有するPTS^-/Glu^-宿主細胞の代謝経路への炭素流量を増やす方法に関係する。本方法のある態様においては、プロモーターは非宿主細胞プロモーター、又は、修飾された内生プロモーターである。第2の態様では、グルコース同化タンパク質はグルコーストランスポーター、好ましくは、大腸菌由来ガラクトパーミアーゼ、又はこれらと少なくとも80％配列が相同であるグルコーストランスポーターである。第3の態様では、グルコース同化タンパク質は、リン酸タンパク質、好ましくは、大腸菌由来グルコキナーゼ又はこれと少なくとも80％配列が相同であるグルコキナーゼである。第4の態様では、細菌宿主細胞は、大腸菌細胞、バシルス細胞及びパンテア細胞の群より選択される。第5の態様では、PTS^-/Glu^-宿主細胞は、ptsl、ptsH及びcrrよりなる群から選択される1以上の遺伝子が欠失されたPTS細胞から得られる。第6の態様では、PTS^-/Glu^-宿主細胞は、トランスアルドラーゼ、フォスフォエノールピリビン酸シンターゼ、DAHPシンターゼ、DHQシンターゼ、DHQデデハイドラターゼ、シキメイトデハイドロゲナーゼ、シキメイトキナーゼEPSPシンターゼ及びコリスメイトシンターゼからなる群より選択されるタンパク質をエンコードしているポリヌクレオチドにより形質転換される。 In a first aspect, the present invention increases the carbon flux into the metabolic pathway of transformed host cells when cultured under substantially the same conditions as compared to the corresponding metabolic pathway in a PTS host cell. A) glucose in a host cell by transformation of a PTS ⁻ / Glu ⁻ host cell with a DNA construct comprising a DNA flanking region corresponding to the upstream (5 ′) region of the promoter and glucose assimilation protein Modification of the endogenous chromosomal regulatory region operably linked to the nucleic acid encoding the anabolic protein; b) integration of the DNA construct to restore the Glu + phenotype, and c) the appropriate conditions of the transformed host cell. It relates to a method of increasing the carbon flux into the metabolic pathway of PTS ⁻ / Glu ⁻ host cells, which inherently has the ability to utilize the Phosphotransferase Transport System (PTS) for carbohydrate transport , including lower culture. In some embodiments of the method, the promoter is a non-host cell promoter or a modified endogenous promoter. In a second aspect, the glucose assimilation protein is a glucose transporter, preferably a galactopermease from E. coli, or a glucose transporter that is at least 80% homologous to these. In a third aspect, the glucose assimilation protein is a phosphate protein, preferably E. coli derived glucokinase or glucokinase that is at least 80% homologous in sequence. In a fourth aspect, the bacterial host cell is selected from the group of E. coli cells, Bacillus cells, and Pantea cells. In a fifth embodiment, the PTS ⁻ / Glu ⁻ host cell is obtained from a PTS cell from which one or more genes selected from the group consisting of ptsl, ptsH and crr have been deleted. In a sixth aspect, the PTS ⁻ / Glu ⁻ host cell comprises transaldolase, phosphoenolpyruvate synthase, DAHP synthase, DHQ synthase, DHQ dedehydratase, shikimate dehydrogenase, shikimate kinase EPSP synthase and It is transformed with a polynucleotide encoding a protein selected from the group consisting of chorismate synthase.

第二の側面では、本発明は、第一の側面で述べた方法及び、さらに、プロモーター及びグルコキナーゼの上流(5’)領域に対応するDNAフランキング領域を含む第二DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードする核酸配列と作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾を含む方法に関係する。 PTS In a second aspect, the present invention is a method described in the first aspect and further, using a second DNA construct comprising a DNA flanking regions corresponding to the upstream (5 ') region of the promoter and glucokinase -/ Glu- host cell transformation involves a method involving modification of an endogenous chromosomal regulatory region operably linked to a nucleic acid sequence encoding glucokinase in a PTS- / Glu-host cell.

第三の側面では、本発明は、目的とするタンパク質が、ピルビン酸、PEP、乳酸塩、酢酸、グリセロール、スクシニル、エタノール及びコリスミ酸からなる群より選択され、a) DNA構築物が、グルコース同化タンパク質をエンコードしている核酸と作動可能に連結している内生プロモータと置換され、 PTS^-/Glu^-宿主細胞の染色体上に組み込まれることを特徴とする、プロモーターを含むDNA構築物を用いるPTS^-/Glu^-表現型細菌宿主細胞の形質転換、b)該形質転換された宿主細胞の適切な条件下での培養 c)PTS^-/Glu⁺表現型を得るためのグルコース同化タンパク質の発現をさせること、及びd) 実質的に同じ培養条件で培養された対応するPTS宿主細胞内で生産される目的生成物の量と比較して、増量された目的生成物の量を形質転換された宿主細胞内で得ることを含む、糖質輸送に対する、本来PTSを利用する能力を有しているPTS^-/Glu^-細菌宿主細胞内で目的生成物の生産を増やす方法に関係する。ある態様では、宿主細胞は、大腸菌細胞、バシルス細胞及びパンテア細胞からなる群より選択される。第2の態様では、グルコース同化タンパク質は、大腸菌由来のガラクトースパーミアーゼ又はそれらと少なくとも80％配列相同性を有するグルコーストランスポーターである。第3の態様では、グルコース同化タンパク質は大腸菌由来グルコキナーゼ又は少なくともそれらと70％の配列相同性を有するグルコキナーゼである。 In a third aspect, the invention provides that the protein of interest is selected from the group consisting of pyruvate, PEP, lactate, acetic acid, glycerol, succinyl, ethanol and chorismate, and a) the DNA construct is a glucose anabolic protein substituted raw promoter inner operably linked with a nucleic acid encoding a, PTS ^- / Glu ^- characterized in that it is incorporated into the chromosome of the host cell, a DNA construct comprising a promoter PTS ^- / Transformation of a Glu ⁻ phenotypic bacterial host cell, b) culturing the transformed host cell under appropriate conditions c) allowing expression of a glucose anabolic protein to obtain a PTS ⁻ / Glu ⁺ phenotype, And d) increasing the amount of target product in transformed host cells compared to the amount of target product produced in corresponding PTS host cells cultured under substantially the same culture conditions. Gain Includes, for carbohydrate transport, PTS originally have the ability to utilize PTS ^- / Glu ^- relates to a method of increasing the production of the target product in a bacterial host cell. In some embodiments, the host cell is selected from the group consisting of an E. coli cell, a Bacillus cell, and a pantea cell. In a second aspect, the glucose assimilation protein is a galactose permease from E. coli or a glucose transporter having at least 80% sequence homology with them. In a third aspect, the glucose assimilation protein is E. coli derived glucokinase or glucokinase having at least 70% sequence homology with them.

第四の側面では、本発明は、a)プロモーター及び、ガラクトースパーミアーゼの上流(5’)領域に対応するDNAフランキング領域を含む第一DNA構築物を有するPTS^-/Glu^-宿主細胞形質転換による、PTS^-/Glu^-宿主細胞内のガラクトパーミアーゼをエンコードしている核酸と作動可能に結合している、内生染色体調節領域の修飾、b)プロモーター及びグルコキナーゼの上流(5’)領域に対応するDNAフランキング領域を含む第二DNA構築物を有するPTS^-/Glu^-宿主細胞の形質転換による、PTS^-/Glu^-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードしている核酸と作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾、c)第一DNA構築物が、ガラクトースパーミアーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置換され、第二DNA構築物が、グルコキナーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置換され、ガラクトースパーミアーゼ及びグルコキナーゼの両者が、宿主細胞内で発現し、両発現が、形質転換された宿主細胞内への炭素流量が、組換えが起こっていないPTS^-/Glu^-細菌細胞に対応する同じ代謝経路内への炭素流量と比較して、増えることを特徴とする、第一DNA及び第二DNAの組換えを含む、本来糖質輸送に対するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を利用する能力を有するPTS^-/Glu^-細菌宿主細胞の代謝経路内への炭素流量を増やす方法に関係する。ある態様では、この代謝経路は、芳香環経路である。第二の態様では、この方法は、さらにトランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ及びフォスフォエノールピルビン酸シンターゼから選択されるタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを有する形質転換PTS^-/Glu^-宿主細胞を含む。 In a fourth aspect, the invention relates to PTS ⁻ / Glu ⁻ host cell transformation with a) a first DNA construct comprising a promoter and a DNA flanking region corresponding to the upstream (5 ′) region of galactose permease. , PTS ^- / Glu ^- is operably linked to a nucleic acid encoding a galactosyltransferase Topa Mi ATPase in the host cell, modification of the endogenous chromosomal regulatory region, b) upstream of the promoter and glucokinase (5 ') in the region PTS has a second DNA construct comprising a corresponding DNA flanking regions ^- / Glu ^- host cell by transformation, PTS ^- / Glu ^- operably linked to a nucleic acid encoding a glucokinase in the host cell C) modification of the endogenous chromosomal regulatory region, c) the first DNA construct is replaced with the endogenous promoter of the nucleic acid encoding galactose permease, and the second DNA construct encodes glucokinase Both galactose permease and glucokinase are expressed in the host cell, and the carbon flux into the transformed host cell is not recombined. PTS ^- / Glu ^- as compared to the carbon flow rate into the same metabolic pathway that corresponds to the bacterial cells, characterized in that the increase, including recombinant first DNA and a second DNA, phospho originally for carbohydrate transport It relates to a method of increasing the carbon flux into the metabolic pathway of PTS ⁻ / Glu ⁻ bacterial host cells with the ability to utilize the transferase transport system (PTS). In some embodiments, the metabolic pathway is an aromatic ring pathway. In a second aspect, the method further comprises a transformed PTS ⁻ / Glu ⁻ host cell having a polynucleotide encoding a protein selected from transketolase, transaldolase and phosphoenolpyruvate synthase.

第五の側面では、本発明は、a)プロモーター及びグルコーストランスポーターの上流(5’)領域に対応するDNAフランキング領域を含む第一DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換による、PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコーストランスポーターをエンコードしている核酸と、作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾、b)グルコーストランスポーターをエンコードしている核酸の内生のプロモーターを置換するDNA構築物の組換え及び、c)PTS-/Glu-宿主細胞へGlu+表現型を復元させる、グルコーストランスポーターの発現を含む、糖質輸送に対するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を利用する能力を本来有するPTS-/Glu-細菌宿主細胞へGlu+表現型を復元させる方法に関係する。好ましい態様では、この方法は、第五の側面に応じた方法に、プロモーター及びグルコキナーゼの上流(5’)領域に対応するDNAフランキング領域を含む第二DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、このPTS-/Glu-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードしている核酸に作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾；第二DNAグルコキナーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置換される第二DNA構築物の組換えをさせること；及びグルコキナーゼを発現させることを、さらに含む。ある態様では、Glu+表現型を復元した細胞は少なくとも約0.4hr-1の特定の成長速度を有する。他の態様では、グルコーストランスポーターは、ガラクトースパーミアーゼである。 In a fifth aspect, the present invention provides a) transformation of PTS- / Glu-host cells with a first DNA construct comprising a DNA flanking region corresponding to the upstream (5 ') region of the promoter and glucose transporter. The nucleic acid encoding the glucose transporter in the PTS- / Glu-host cell and modification of the operably linked endogenous chromosome regulatory region, b) of the nucleic acid encoding the glucose transporter Phosphotransferase transport system (PTS) for carbohydrate transport , including recombination of DNA constructs that replace the raw promoter and c) expression of the glucose transporter that restores the Glu + phenotype to PTS- / Glu-host cells It relates to a method for restoring the Glu + phenotype to PTS- / Glu-bacterial host cells that originally have the ability to utilize. In a preferred embodiment, the method comprises a PTS− / Glu− using a second DNA construct comprising a DNA flanking region corresponding to the upstream (5 ′) region of the promoter and glucokinase in a method according to the fifth aspect. Modification of the endogenous chromosomal regulatory region operably linked to the nucleic acid encoding glucokinase in this PTS- / Glu-host cell by transformation of the host cell; encoding a second DNA glucokinase Recombination of a second DNA construct that is replaced with the endogenous promoter of the nucleic acid; and expressing glucokinase. In certain embodiments, the cells that have restored the Glu + phenotype have a specific growth rate of at least about 0.4 hr-1. In other embodiments, the glucose transporter is a galactose permease.

第六の側面においては、本発明は、a)糖質輸送に関するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を利用する能力を有する、PTS^-/Glu^-表現型を有する細菌宿主細胞の選択；b) DAN構築物が、グルコース同化タンパク質をエンコードする核酸と作動可能に結合している内生プロモーターと置き換わるように宿主細胞内へ組み込まれることを特徴とする、プロモーターを含む、DNA構築物を用いた、前記細菌宿主細胞の形質転換を含む、選択された細菌宿主細胞の内生染色体調節領域の修飾；c)適切な環境下における形質転換された細菌宿主細胞の培養；及びd) PEPの利用度が、実質的に同じ培養条件で培養された非形質転換PTS宿主細胞に対応するPEP利用度と比較して、増加していることを特徴とする、PTS^-/Glu⁺表現型を有する形質転換された宿主細胞を得るための、グルコース同化タンパク質の発現をさせること、を含む、細菌宿主細胞内のフォスフォエノールピルビン酸(PEP)利用能を増加させる方法に関係する。一の態様では、グルコース同化タンパク質は、ガラクトースパーミアーゼ及びグルコースパーミアーゼの内生プロモーターと置き換わる外来プロモーターを含むDNA構築物である。他の態様では、グルコース同化タンパク質は、グルコキナーゼ及びグルコキナーゼの内生プロモーターと置き換わる外来プロモーターを含むDNA構築物である。 In a sixth aspect, the present invention provides: a) selection of a bacterial host cell having a PTS ⁻ / Glu ⁻ phenotype capable of utilizing a phosphotransferase transport system (PTS) for carbohydrate transport; b) DAN Said bacterial host using a DNA construct comprising a promoter, characterized in that the construct is integrated into the host cell so as to replace an endogenous promoter operably linked to a nucleic acid encoding a glucose assimilation protein Modification of the endogenous chromosomal regulatory region of the selected bacterial host cell, including transformation of the cell; c) culture of the transformed bacterial host cell in an appropriate environment; and d) the availability of PEP is substantially a compared to PEP utilization corresponding to the non-transformed PTS host cells cultured in the same culture conditions, characterized in that it increases, PTS ^- / Glu ⁺ host transformed with a phenotype For obtaining the cells, thereby the expression of the glucose assimilation protein, including, it relates to a method of increasing the phosphoenolpyruvate pyruvate (PEP) availability of a bacterial host cell. In one aspect, the glucose assimilation protein is a DNA construct comprising a foreign promoter that replaces the endogenous promoter of galactose permease and glucose permease. In other embodiments, the glucose assimilation protein is a DNA construct comprising glucokinase and a foreign promoter that replaces the endogenous promoter of glucokinase.

第八の側面では、a)外来プロモーター及びガラクトースパーミアーゼの上流(5’)領域に対応するDNAフランキング領域を含む第一DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換による、PTS^-/Glu^-宿主細胞内のガラクトースパーミアーゼをエンコードしている核酸と作動可能に結合する内生染色体調節領域の修飾、b)外来プロモーター及びグルコキナーゼの上流(5’)領域に対応するDNAフランキング領域を含む第二DNA構築物を用いたPTS^-/Glu^-宿主細胞の形質転換による、PTS^-/Glu^-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードしている核酸と作動可能に結合する内生染色体調節領域の修飾、c)第一DNA構築物がガラクトパーミアーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置き換わり、第二DNA構築物が、グルコキナーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置き換わる、第一及び第二DNA構築物の組込み、d)適切な環境下における形質転換宿主細胞の培養及びe)実質的に同じ培養条件で培養された対応する非形質転換PTS細菌宿主細胞の成長速度と比較して、速い特定の成長速度を有する形質転換された細菌細胞を得るために、修飾された調節領域から、ガラクトースパーミアーゼ及びグルコキナーゼの発現をさせること、を含む、糖質輸送に対する、フォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を利用する能力を本来有している、PTS-/Glu-宿主細胞の成長速度を増加させる方法に関係す
る。 In an eighth aspect, a) PTS by transformation of a PTS- / Glu-host cell with a first DNA construct comprising a foreign flanking promoter and a DNA flanking region corresponding to the upstream (5 ') region of the galactose permease. ^- / Glu ^- modifying an endogenous chromosomal regulatory region operably linked with a nucleic acid encoding a galactose permease in a host cell, b) DNA corresponding to the upstream (5 ') region of a foreign promoter and glucokinase off PTS using a second DNA construct comprising a ranking region ^- / Glu ^- host cell by transformation, PTS ^- / Glu ^- raw chromosomal regulatory which is operably linked to a nucleic acid encoding a glucokinase in the host cell Modification of the region, c) the first DNA construct replaces the endogenous promoter of the nucleic acid encoding galactopermease, and the second DNA construct is endogenous to the nucleic acid encoding glucokinase. Integration of the first and second DNA constructs to replace the promoter, d) culture of the transformed host cell in an appropriate environment, and e) the corresponding non-transformed PTS bacterial host cell cultured in substantially the same culture conditions. Carbohydrate transport comprising allowing expression of galactose permease and glucokinase from a modified regulatory region to obtain transformed bacterial cells with a specific growth rate that is fast compared to the growth rate To a method of increasing the growth rate of PTS- / Glu-host cells, which inherently has the ability to utilize a phosphotransferase transport system (PTS).

第九の側面は、本発明は、a)外来プロモーター及びガラクトースパーミアーゼの上流(5’)領域に対応するDNAフランキング領域を含む、第一DNA構築物を用いた大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞の形質転換によって、大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞内のガラクトースパーミアーゼをエンコードする核酸と作動可能に結合している、内生染色体調節領域の修飾；b)外来プロモーター及びグルコキナーゼの上流(5’)領域に対応するDNAフランキング領域を含む、第二DNA構築物を用いた大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードする核酸と作動可能に結合している、内生染色体調節領域の修飾；c)ガラクトースパーミアーゼの発現及びグルコキナーゼの発現をさせるための、形質転換された大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞の適切な環境下における培養；及びd)目的生成物がエタノール、コリスミ酸又はコハク酸であり、実質的に同じ培養条件において培養された対応する大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞内の目的物質の量と比較して、増量された、形質転換された大腸菌内の目的生成物を得ることを含む、糖質輸送に対する、PTSを利用する能力を本来有するPTS-/Glu-大腸菌宿主細胞内の目的生成物の生産を増やす方法に関係する。 According to a ninth aspect, the present invention provides an E. coli PTS- / Glu-host cell using a first DNA construct comprising a) a foreign promoter and a DNA flanking region corresponding to the upstream (5 ′) region of galactose permease. A modification of the endogenous chromosomal regulatory region operably linked to the nucleic acid encoding galactose permease in E. coli PTS- / Glu- host cells; b) upstream of the foreign promoter and glucokinase (5 ') Transformation of E. coli PTS- / Glu-host cells with a second DNA construct containing a DNA flanking region corresponding to the region, and a nucleic acid encoding glucokinase in E. coli PTS- / Glu-host cells Modification of the endogenous chromosomal regulatory region operably linked; c) the appropriate cycle of transformed E. coli PTS- / Glu-host cells for expression of galactose permease and glucokinase And d) the target product is ethanol, chorismic acid or succinic acid, compared to the amount of the target substance in the corresponding E. coli PTS- / Glu-host cells cultured under substantially the same culture conditions. Production of the desired product in a PTS- / Glu-E. Coli host cell that originally has the ability to utilize PTS for carbohydrate transport , including obtaining an increased amount of the desired product in transformed E. coli Related to how to increase.

KLpts7/pMCGG内のグルコース輸送システムをエンコードしているプラスミドは、この系統に高い細胞密度(図10A)とグリセロール及び1,3-プロパンジオールの生産(図10B)をさせた。しかしながら、細胞質量に対するグリセロール及び1,3-プロパンジオールの量は、OD₆₀₀が194のときに、1,3-プロパンジオールが約7g/Lと、低かった。対照的に図11に示すように、KLgaIP-ptrcは、発酵における細胞質量は少なかったが、生成物は、OD₆₀₀が70（図１１Ａ）であるときに、約61g/Lの1,3-プロパンジオール及び36g/Lのグリセロール（図１１Ｂ）を生産した。 KLpts7 / PMCG G plasmid encoding a glucose transport system, were the high cell density in this lineage (Figure 10A) and production of glycerol and 1,3-propanediol (Figure 10B). However, the amount of glycerol and 1,3-propanediol relative to the cell mass was as low as about 7 g / L for 1,3-propanediol when the OD ₆₀₀ was 194. In contrast, as shown in FIG. 11, KLgaIP-ptrc had less cell mass in the fermentation, but the product was about 61 g / L of 1,3-, when OD ₆₀₀ was 70 (FIG. 11A). Propanediol and 36 g / L glycerol (FIG. 11B) were produced.