JP2006347881A - Triamide derivative and method for producing the same - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a compound useful as an antimalarial agent. <P>SOLUTION: By culturing a microorganism belonging to the genus Streptomyces sp., a triamide derivative serving as an active ingredient is collected from the culture medium. This triamide derivative or its salt has a favorable antimalarial activity while showing only a weak cytotoxicity on cultured mammalian cells and little activity on bacteria and fungi including pathogens. Therefore, this compound is useful in preventing or treating malaria as a selective and highly safe antimalarial agent. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

（式中の記号は下記の意味を有する。
Ｒ¹：水素原子又はエチル基、
Ｒ²：メチル又はヒドロキシメチル基、
Ｒ³：水素原子、
ただし、Ｒ²及びＲ³は一体となってメチレン又はヒドロキシメチレン基を形成してもよい、
Ｒ⁴及びＲ⁵：同一又は異なって、水素原子又はメチル基。）
【０００９】
また、本発明は、ストレプトミセス（Streptomyces）属に属し、かつ前記式（Ｉ）で表されるトリアミド誘導体又はその製薬学的に許容される塩を生産する能力を有する微生物を培養し、その培養物から該トリアミド誘導体又はその製薬学的に許容される塩を単離することを特徴とする該トリアミド誘導体又はその製薬学的に許容される塩の生産方法に関する。前記式（Ｉ）で表されるトリアミド誘導体又はその製薬学的に許容される塩を生産する能力を有するストレプトミセス（Streptomyces）属に属する微生物として、ストレプトミセス エスピー（Streptomyces sp.）Q41697株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９３８２号）が挙げられ、これは本発明において最も有効に使用される菌株の１つである。本発明は、当該ストレプトミセス エスピー（Streptomyces sp.）Q41697株にも関する。
更に、本発明は、前記式（Ｉ）で表されるトリアミド誘導体又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物、殊に、マラリア疾患の予防又は治療剤並びに殺マラリア原虫剤に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明化合物は、幾何異性体や互変異性体が存在するが、本発明にはこれらの異性体の分離したもの、あるいは混合物が包含される。更に本発明化合物は、不斉炭素原子を有しており、当該不斉炭素原子に基づく異性体が存在する。本発明はこれら光学異性体の混合物や単離されたものを包含する。
本発明化合物の塩としては、製薬学的に許容される塩であり、具体的にはナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等の金属を含む無機塩基、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、リジン、オルニチン等の有機塩基との塩等を挙げることができる。
本発明は、前記式（Ｉ）で表されるトリアミド誘導体又はその製薬学的に許容される塩の各種の水和物や溶媒和物及びこれらの結晶並びにその結晶多形の物質をも包含する。なお、本発明化合物には、生体内において代謝されて該トリアミド誘導体又はその製薬学的に許容される塩に変換される化合物、いわゆるプロドラッグもすべて包含される。本発明のプロドラッグを形成する基としては、Prog. Med. 5:2157-2161(1985)に記載されている基や廣川書店1990年刊「医薬品の開発」第７巻 分子設計163-198に記載されている基が挙げられる。
【００１１】
（生産方法）
本発明のトリアミド誘導体は、ストレプトミセス属に属しかつ該トリアミド誘導体又はその製薬学的に許容される塩の生産能を有する微生物を用いて製造することができる。このような微生物として好ましくは、沖縄県西表島で採取された土壌より分離されたストレプトミセス（Streptomyces）属に属するストレプトミセス エスピー（Streptomyces sp.）Q41697株である。本菌株の菌学的性状は次の通りである。
【００１２】
１．各種寒天培地における性状
本菌株の各種寒天培地における性状は、表１に示す通りである。特に記載しない限り、２８℃で２１日間培養し、常法にしたがって観察したものである。色調の記載については色の標準（日本色彩研究所）による。表中の略号は、Ｇ：生育程度、Ａ：気菌糸の着生及びその色相、Ｒ：裏面の色相、Ｓ：可溶性色素をそれぞれ示す。
【００１３】
【表１】

【００１４】
２．生理学的性質
本菌株の各種生理学的性質を表２に、また炭素源の資化性を表３に示す。表２において、生育温度は各温度（5, 10, 15, 20, 24, 28, 32, 37, 40, 45, 50℃）で、7〜21日までの観察結果、ミルクに対する作用は37℃で3〜21日までの観察結果、それ以外は特に指摘のないかぎり、28℃で２週間後の観察結果を示す。また、表３における略号は、＋：資化する、−：資化しない、をそれぞれ示す。
【００１５】
【表２】

【００１６】
【表３】

【００１７】
３．形態的特徴
本菌株は各種有機及び無機培地において良く生育し、基生菌糸の色調はうす黄茶〜黄味灰色を呈する。気菌糸は、無機塩・スターチ寒天培地、オートミール寒天培地において最も良く形成され、白〜うす黄茶色を呈する。気菌糸はよく発達した基生菌糸上に着生し、単純分岐で、その先端に最大５０個程度の胞子が連鎖し、成熟に従って螺旋状になる。液体培養で基生菌糸の断片化は見られない。電子顕微鏡による観察では、胞子の形状は円筒形、大きさは０．８〜１．１μｍ×０．５〜０．７μｍで、その表面構造はトゲ状である。胞子嚢、運動性胞子等の特殊な器官は観察されない。
【００１８】
４．菌体成分の化学分析
Lechvalierらの方法（Lechvalier, MP. et al; PP277-338 in DIETZ, A et al ed., Actinomycete Taxonomy, SIM Special Publication No. 6, 1980）に従い本菌株の酸加水分解物の分析を行った結果、LL-ジアミノピメリン酸が検出された（細胞壁タイプI）。
【００１９】
上記諸性状より、本菌株はストレプトミセス (Streptomyces) 属に属する菌株と判断された。そこで、本菌株をストレプトミセス エスピー (Streptomyces sp.) Q41697株と命名した。本菌株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３８２号として寄託されている。また、微生物は人工的に又は自然に変異を起こすので、本発明のストレプトミセス エスピー (Streptomyces sp.) Q41697株は、天然から分離された微生物の他に、これを紫外線、X線、化学薬剤などで人工的に変異させたもの及びそれらの天然変異株についても包含する。
【００２０】
本発明のトリアミド誘導体は、ストレプトミセス属に属しかつ該トリアミド誘導体生産能を有する微生物、好ましくはストレプトミセス エスピーQ41697株を、栄養源を含有する培地に接種し好気的に発育させることにより得ることが出来る。
培養に用いられる培地は、使用する微生物が生育可能な培地であればよく、合成培地、半合成培地あるいは天然培地を用いることができる。
栄養物としては、本発明の菌株が資化する栄養源を使用すればよい。例えば、窒素源としては、ペプトン、肉エキス、コーン・スティープリカー、綿実粉、落花生粉、大豆粉、酵母エキス、ＮＺ−アミン、カゼインの水解物、魚粉、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム等の無機または有機の窒素源が使用できる。炭素源としては、糖蜜、澱粉、デキストリン、蔗糖、グルコース、マルトース、フラクトース、キシロース、ラムノース、マンニトール、グリセリン等の炭水化物あるいは脂肪等が使用できる。
【００２１】
また金属塩として、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｚｎ、Ｆｅ等の硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩、燐酸塩、炭酸塩等が必要に応じて添加される。さらに必要に応じてバリン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、リジン、アルギニン、システイン、シスチン等の他、通常知られているアミノ酸類や、オレイン酸メチル、ラード油、シリコン油、界面活性剤等の生成促進化合物または消泡剤が適宜使用される。これらのもの以外でも、該生産菌が利用し、本発明化合物の生産に役立つものであれば所望により使用することができる。
培養は、一般の抗生物質製造における培養と同様に行えばよく、その培養方法は固体培養でも液体培養でもよい。液体培養の場合は静置培養、振とう培養、攪拌培養のいずれを実施してもよいが、特に通気攪拌培養が望ましい。培養条件として、培養温度は生産菌が発育し、本発明の化合物を生産しうる温度、すなわち１５〜３７℃の範囲で適宜適用できるが約２４〜３２℃が好ましい。pHは４〜９の範囲で適宜適用できるが、６〜８が好ましい。培養時間は種々の条件によって異なり、通常１〜３０日程度である。
【００２２】
培養物から目的とする化合物を単離するには、微生物の代謝産物を単離する際に用いる通常の抽出、分離、精製の手段が適宜利用できる。培養物中の該物質は培養液をそのままか、又は遠心分離あるいは培養物に濾過助剤を加えて濾過して得られた培養濾液に酢酸エチル、クロロホルム、ベンゼン、トルエン等の水と混和しない有機溶剤を加えて抽出する。また、培養濾液を適宜の担体に接触させ、濾液中の生産物質を吸着させ、次いで適当な溶媒で溶出することにより該物質を分離することができる。例えば、アンバーライト（登録商標）XAD2、ダイヤイオン（登録商標、以下同じ）HP20、ダイヤイオンCHP20P、又はダイヤイオンSP850のような多孔性吸着樹脂に接触させて該物質を吸着させる。次いでメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル等の有機溶媒と水の混合液を用いて該物質を溶出させる。所望によりｐＨ調節のためトリフルオロ酢酸等を加えてもよい。このときの有機溶媒の混合比率を低濃度より段階的に又は連続的に高濃度まで上げていくことにより、該物質を含む画分を効率よく得ることができる場合がある。
【００２３】
更に、上記の各操作法を用いて得た該物質含有画分を、常用の吸着担体、例えば、活性炭、アルミナ、シリカゲル、セルロース等を用いたカラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィ−、シリカゲル系ＯＤＳ逆相担体のカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）や逆相固相抽出及び遠心液々分配クロマトグラフィー等の常法の分離精製法に付すことにより、より純粋な目的物質を得ることができる。
【００２４】
本発明の該トリアミド誘導体又はその製薬学的に許容される塩の１種又は２種以上を有効成分として含有する本発明の医薬組成物は、当分野において通常用いられている薬剤用担体、賦形剤等を用いて通常使用されている方法によって調製することができる。投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、又は、静注、筋注等の注射剤、坐剤、点眼剤、眼軟膏、経皮用液剤、軟膏剤、経皮用貼付剤、吸入剤、経粘膜液剤、経粘膜貼付剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。
【００２５】
本発明による経口投与のための固体組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては、一つ又はそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な賦形剤、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な添加剤、例えばステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤やカルボキシメチルスターチナトリウム等の崩壊剤、溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要により糖衣又は胃溶性又は腸溶性コーティング剤で被膜してもよい。
【００２６】
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な溶剤、例えば精製水、エタノールを含む。この組成物は不活性な溶剤以外に可溶化剤、湿潤剤、懸濁化剤のような補助剤、甘味剤、矯味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性又は非水性の液剤、懸濁剤、乳剤を含有する。水性の溶剤としては、例えば注射用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水性の溶剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（商品名）等がある。このような組成物は、さらに等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。また、これらは無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解、懸濁して使用することもできる。
【００２７】
通常、経口投与の場合、成人1日当り経口で0.1〜500mg、非経口で0.01〜100mgがそれぞれ適当であり、これを１日１回乃至複数回に分けて投与する。投与量は症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。投与量は種々の条件で変動するので、上記投与量範囲より少ない量で十分な場合もある。
【００２８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によって何等限定されるものではない。
【００２９】
実施例１
グルコース 10g、ポテトスターチ 20g、ポリペプトン 5g、イーストエキス 5g、炭酸カルシウム 4g、蒸留水1 Lを含む培地（pH 7.0）を100 mlずつ500 ml容の三角フラスコに分注し、120℃で20分間滅菌した。ベネット寒天培地に充分に生育させたQ41697株をかき取って接種し、28℃、220回転／分の条件で4日間、振とう培養した。その培養液を同じ組成の培地の入った三角フラスコ3本に2 mlずつ種菌し、同条件で4日間培養したものを種培養液とした。同じ組成の培地100 mlが入った500 ml容三角フラスコ200本に前記の種培養液を各フラスコに2 mlずつ接種し、28 ℃、220回転／分の条件下で9日間、振とう培養を行い本培養とした。
【００３０】
上記培養方法により得られた培養液20 Lを吸引濾過し、上清液と菌体画分に分離した。菌体画分には80％（^V/_V）アセトン水溶液20Lを添加し、3時間攪拌後、ラヂオライト＃６００（昭和化学工業社製）を加えて濾過し、減圧条件下得られた濾液からアセトンを留去した。この菌体抽出濃縮液は、樹脂量800mlのダイヤイオン HP20（三菱化学社製）カラムに通液させた。上清液は樹脂量2LのダイヤイオンHP20を用いた。その後、それぞれのカラムについて水洗し、次いで10%（^V/_V）アセトン水で洗浄後、70％（^V/_V）アセトン水溶液で活性画分を溶出した。この時用いた水洗液及び70％（^V/_V）アセトン水溶液は、それぞれ樹脂量の3倍量分を使用した。
【００３１】
このカラムから得られた活性画分を減圧下で濃縮し、得られた残渣（28.0g）をディーイーエーイー セファデックス（DEAE Sephadex^TM）A-25 (Cl^-)（アマシャムファルマシアバイオテック社製）の陰イオン交換樹脂（樹脂量 400 ml）に供し、蒸留水1.2 Lで洗浄後、2％、3％及び4%（^V/_V）の塩化ナトリウム水溶液、それぞれ1.2 Lを用いて溶出した。次に、活性成分が含まれる溶出液（約3.6L）をダイヤイオンHP20カラムクロマトグラフィー（樹脂量250ml）に通液し、750mlの蒸留水で洗浄後、750mlの95%（^V/_V）アセトン水溶液で溶出した。
【００３２】
この溶出画分を減圧下で濃縮乾固して活性画分（11.0 g）を得た。本活性画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Wakosil C-300,：和光純薬工業社製 220ｇ）に供した。クロロホルム :メタノール溶液（混合比 2:1）1.4 L、同液（混合比 1:1）1.4 L及びメタノ−ル1.4 L用いて溶出させ、分画により２つの活性画分（2.73g及び2.64ｇ）を得た。
【００３３】
化合物Ａ、Ｂ、Ｇ、Ｈ及びＪの単離・精製
前記のシリカゲルカラムクロマトグラフィーから得られた活性画分のうち一方(2.73g)を、PEGASIL PREP Glass Column (ODS- G3-300 ; 37×300mmセンシュ−科学社製)に供し、55％（^V/_V）アセトニトリル水溶液（トリフルオロ酢酸 0.05%（^V/_V）含有）で溶出後、分取することで３つの活性画分を得た。溶出画分液のアセトニトリルを減圧下留去した後、得られた残渣を固相抽出用カートリッジOasis^TMHLB（Waters社製）を用いて脱塩し、それぞれの画分を濃縮乾固し、画分１（539 mg）、画分２ (271 mg)及び画分３（104 mg）を得た。画分１、画分２及び画分３は個々にHPLC ( L-column ODS ; 20.0×250mm （財）化学物質評価研究機構製) に供し、55％（^V/_V）アセトニトリル水溶液（トリフルオロ酢酸 0.05%（^V/_V）含有）で溶出し、分取を行った。
【００３４】
画分1から得られた3つの活性画分は、再度HPLC （ L-column ODS ; 20.0×250mm） に供し、55％（^V/_V）アセトニトリル水溶液（トリフルオロ酢酸 0.05％（^V/_V）含有）で溶出し、分取した。得られた活性画分についてアセトニトリルを減圧下留去した後、Oasis^TMHLBで脱塩して、化合物Ｈ(15.2 mg) 、化合物Ｂ(145.0 mg)、及び化合物Ｊ（39.3ｍｇ）を得た。
画分２から得られた活性画分は、再度HPLC （L-column ODS ; 20.0×250mm）に供し、55％（^V/_V）アセトニトリル水溶液（トリフルオロ酢酸 0.05％（^V/_V）含有）で溶出し、分取した。得られた活性画分についてアセトニトリルを減圧下留去した後、Oasis^TMHLBで脱塩して、化合物Ａ(184.0 mg)を得た。
【００３５】
画分３から得られた活性画分は、再度 HPLC (L-column ODS; 20.0×250mm) に供し、65％（^V/_V）アセトニトリル水溶液（トリフルオロ酢酸 0.05％（^V/_V）含有）で溶出し、分取した。得られた活性画分についてアセトニトリルを減圧下留去した後、Oasis^TMHLBで脱塩した。更に HPLC (SUPELCOSIL^TMABZ+Plus column ; 10.0×250mmスペルコ社製) に供し、45％（^V/_V）アセトニトリル水溶液（トリフルオロ酢酸 0.05％（^V/_V）含有）で溶出し、分取した。得られた活性画分についてアセトニトリルを減圧下留去した後、Oasis^TMHLBで脱塩して、化合物Ｇ(7.8 mg)を得た。
【００３６】
化合物Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦの単離・精製
前記のシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Wakosil C-300）から得られた活性画分のうち他方(2.64g)を、PEGASIL PREP分取用ガラスカラム(ODS-G3-300 ; 37×300mmセンシュー科学社製)に供し、45％（^V/_V）アセトニトリル水溶液（トリフルオロ酢酸 0.05％（^V/_V）含有）で溶出し、目的物を含む溶出画分のアセトニトリルを減圧下留去し、得られた残渣をOasis^TMHLBで脱塩して、濃縮乾固して活性画分(328.7 mg)を得た。
この活性画分を更にHPLC (L-column ODS; 20.0×250mm)に供し、45％（^V/_V）アセトニトリル水溶液（トリフルオロ酢酸 0.05％（^V/_V）含有）で溶出し、３つの活性ピークを分取した。得られた各活性画分液のアセトニトリルを減圧下留去した後、得られた残渣をOasis^TMHLBで脱塩し、画分４（105 mg）、画分５（41 mg）及び画分６（103 mg）を得た。
【００３７】
得られた画分４は、更にHPLC（SUPELCOSIL^TMABZ+Plus column ; 20.0×250mm スペルコ社製）に供し、45％（^V/_V）アセトニトリル水溶液（トリフルオロ酢酸 0.05%（^V/_V）含有）で溶出し、分取した。得られた活性画分からアセトニトリルを減圧下留去した後、Oasis^TMHLBで脱塩して、化合物Ｃ（45.3 mg）を得た。
同様に画分５（41 mg）を更に、HPLC (L-column ; 20.0×250mm) に供し、45％（^V/_V）アセトニトリル水溶液（トリフルオロ酢酸 0.05％（^V/_V）含有）で溶出し、分取した。活性画分をアセトニトリルを減圧下留去した後、Oasis^TMHLBで脱塩し、化合物Ｅ（5.4 mg）及び化合物Ｆ (2.8 mg ) を得た。
同様に画分６（103 mg）を更に、HPLC (L-column ; 20.0×250mm) に供し、55％（^V/_V）アセトニトリル水溶液（トリフルオロ酢酸 0.05％（^V/_V）含有）で溶出し、分取した。活性画分をアセトニトリルを減圧下除去した後、Oasis^TMHLBで脱塩し、化合物Ｄ (24.8 mg) を得た。
【００３８】
上記抽出、分離、精製された化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＪは以下のの物理化学的性質を有する。
（１）化合物Ａ
１）色及び形状：白色粉末。
２）酸性、中性、塩基性の区分：酸性。
３）溶解性：メタノ−ル、ジメチルスルホキシドには溶けるが、ヘキサンにはほとんど溶けない。
４）紫外部吸収スペクトル（溶剤：メタノール）：図１の通り。
５）高分解能ＦＡＢ−マススペクトル：実測値 582.3021［Ｍ-Ｈ］^-
理論値 582.3027［Ｍ-Ｈ］^-
６）分子式：Ｃ₂₈Ｈ₄₅ N₃Ｏ₁₀
７）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，DMSO）：図２の通り。
８）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ，DMSO）：図３の通り。
【００３９】
（２）化合物Ｂ
１）色及び形状：白色粉末。
２）酸性、中性、塩基性の区分：酸性。
３）溶解性：メタノ−ル、ジメチルスルホキシドには溶けるが、ヘキサンにはほとんど溶けない。
４）紫外部吸収スペクトル：図４の通り（溶剤：メタノール）。
５）高分解能ＦＡＢ−マススペクトル：実測値 556.2877［Ｍ+Ｈ］⁺
理論値 556.2870［Ｍ+Ｈ］⁺
６）分子式：Ｃ₂₆Ｈ₄₁ N₃Ｏ₁₀
７）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，DMSO）：図５の通り。
８）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ，DMSO）：図６の通り。
【００４０】
（３）化合物Ｃ
１）色及び形状：白色粉末。
２）酸性、中性、塩基性の区分：酸性。
３）溶解性：メタノ−ル、ジメチルスルホキシドには溶けるが、ヘキサンにはほとんど溶けない。
４）紫外部吸収スペクトル：図７の通りである（溶剤：メタノール）。
５）高分解能ＦＡＢ−マススペクトル：実測値 570.3026［Ｍ+Ｈ］⁺
理論値 570.3027［Ｍ+Ｈ］⁺
６）分子式：Ｃ₂₇Ｈ₄₃ N₃Ｏ₁₀
７）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，DMSO）：図８の通り。
８）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ，DMSO）：図９の通り。
【００４１】
（４）化合物Ｄ
１）色及び形状：白色粉末。
２）酸性、中性、塩基性の区分：酸性。
３）溶解性：メタノ−ル、ジメチルスルホキシドには溶けるが、ヘキサンにはほとんど溶けない。
４）紫外部吸収スペクトル：図１０の通り（溶剤：メタノール）。
５）高分解能ＦＡＢ−マススペクトル：実測値 584.3189［Ｍ+Ｈ］⁺
理論値 584.3183［Ｍ+Ｈ］⁺
６）分子式：Ｃ₂₈Ｈ₄₆ N₃Ｏ₁₀
７）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，DMSO）：図１１の通りである。
８）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ，DMSO）：図１２の通りである。
【００４２】
（５）化合物Ｅ
１）色及び形状：白色粉末。
２）酸性、中性、塩基性の区分：酸性。
３）溶解性：メタノ−ル、ジメチルスルホキシドには溶けるが、ヘキサンにはほとんど溶けない。
４）紫外部吸収スペクトル：図１３の通りである（溶剤：メタノール）。
５）高分解能ＦＡＢ−マススペクトル：実測値 600.3140［Ｍ+Ｈ］⁺
理論値 600.3132［Ｍ+Ｈ］⁺
６）分子式：Ｃ₂₈Ｈ₄₆ N₃Ｏ₁₁
７）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，DMSO）：図１４の通りである。
８）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ，DMSO）：図１５の通りである。
【００４３】
（６）化合物Ｆ
１）色及び形状：白色粉末。
２）酸性、中性、塩基性の区分：酸性。
３）溶解性：メタノ−ル、ジメチルスルホキシドには溶けるが、ヘキサンにはほとんど溶けない。
４）紫外部吸収スペクトル：図１６の通りである（溶剤：メタノール）。
５）高分解能ＦＡＢ−マススペクトル：実測値 582.3040［Ｍ+Ｈ］⁺
理論値 582.3027［Ｍ+Ｈ］⁺
６）分子式：Ｃ₂₈Ｈ₄₄ N₃Ｏ₁₀
７）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，DMSO）：第１７図の通りである。
８）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ，DMSO）：第１８図の通りである。
【００４４】
（７）化合物Ｇ
１）色及び形状：白色粉末。
２）酸性、中性、塩基性の区分：酸性。
３）溶解性：メタノ−ル、ジメチルスルホキシドには溶けるが、ヘキサンにはほとんど溶けない。
４）紫外部吸収スペクトル：図１９の通りである（溶剤：メタノール）。
５）高分解能ＦＡＢ−マススペクトル：実測値 598.2963［Ｍ+Ｈ］⁺
理論値 598.2976［Ｍ+Ｈ］⁺
６）分子式：Ｃ₂₈Ｈ₄₄ N₃Ｏ₁₀
７）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，DMSO）：図２０の通りである。
８）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ，DMSO）：図２１の通りである。
【００４５】
（８）化合物Ｈ
１）色及び形状：白色粉末。
２）酸性、中性、塩基性の区分：酸性。
３）溶解性：メタノ−ル、ジメチルスルホキシドには溶けるが、ヘキサンにはほとんど溶けない。
４）紫外部吸収スペクトル：図２２の通りである（溶剤：メタノール）。
５）高分解能ＦＡＢ−マススペクトル：実測値 556.2879［Ｍ+Ｈ］⁺
理論値 556.2870［Ｍ+Ｈ］⁺
６）分子式：Ｃ₂₆Ｈ₄₂ N₃Ｏ₁₀
７）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，DMSO）：図２３の通りである。
８）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ，DMSO）：図２４の通りである。
【００４６】
（９）化合物Ｊ
１）色及び形状：白色粉末。
２）酸性、中性、塩基性の区分：酸性。
３）溶解性：メタノ−ル、ジメチルスルホキシドには溶けるが、ヘキサンにはほとんど溶けない。
４）紫外部吸収スペクトル：図２５の通りである（溶剤：メタノール）。
５）高分解能ＦＡＢ−マススペクトル：実測値 542.2733［Ｍ+Ｈ］⁺
理論値 542.2714［Ｍ+Ｈ］⁺
６）分子式：Ｃ₂₇Ｈ₄₃N₃Ｏ₁₀
７）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，DMSO）：図２６の通りである。
８）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ，DMSO）：図２７の通りである。
【００４７】
前記の物理化学的性質から化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＪの化学構造式は、下記のように決定された。表中の略号は、Ｈ：水素原子、Ｍｅ：メチル基、Ｅｔ：エチル基をそれぞれ示す。
【表４】

【００４８】
実施例２
本発明化合物の抗マラリア活性を以下の方法で確認した。
（１）熱帯熱マラリア原虫の培養
プラスモジウム属の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum ATCC 30932）株を被検マラリア原虫として用いた。in vitro 培養法に用いる培地として、ヒト血清入り培養法では Trager & Jensen の方法（Trager, W. & Jensen, J.B. (1976) Human malaria parasites in continuous culture. Science 193, 673-5） に従い、無血清培地を用いた培養法では 朝日らの方法を用いた（Asahi, H. & Kanazawa, T. (1994) Continuous cultivation of intraerythrocytic Plasmodium falciparum in a serum-free medium with the use of a growth-promoting factor. Parasitology 109, 397-401、 及びAsahi, H. et al. (1996) Hypoxanthine: a low molecular weight factor essential for growth of erythrocytic Plasmodium falciparum in a serum-free medium. Parasitology 113, 19-23）。培地のpHは7.4に調整後、赤血球を含むヒト血清を10%となるように添加した。マラリア原虫の培養は、酸素濃度5.0%、炭酸ガス濃度5.0〜7.5%、窒素濃度87.5〜90%の環境下で、35℃の温度で行った。ヘマトクリット値（赤血球浮遊液中に占める赤血球の体積の割合）は、5%に調整してから使用した。培養開始時の熱帯熱マラリア原虫の初期感染率は0.1%とした。24穴培養プレートを用いて上記の環境下で赤血球と共にマラリア原虫を培養し、培地は毎日交換しながら、マラリア原虫による赤血球の感染率が4%の時期に継代を行った。感染率は赤血球の薄層塗末標本を作成し、ギムザ染色を行った後に、顕微鏡（油浸、1,000×）下でマラリア原虫による感染赤血球の個数を計測した。
【００４９】
（２）マラリア原虫の増殖阻害の試験方法
継代培養している感染赤血球を非感染赤血球 懸濁液で希釈して寄生赤血球（Parasitemia）の率を0.4％に調節した。培養液として、ヒト血清添加培地 （10%HSRPMI：10% heat-inactivated human serum + Basal medium (RPMI-1640)）あるいは無血清培地（HGRPMI：3g/l growth promoting factor from adult bovine serum (under the trade name of Daigo's GF) + Basal medium (RPMI-1640) + 150 microM Hypoxanthine）を用い、培養液中の赤血球量はヘマトクリット値 が2％になるように調整した。被験化合物は最終濃度1×10^-4〜1×10^-8 Mになるように希釈し、5〜10μl添加した。次に熱帯熱マラリア原虫培養液を各ウエルに990〜995μlずつ加え、静かにピペッティングを行い培地に一様に懸濁させた。
陰性対照としては滅菌水、あるいはDMSOを10μlずつウエルに加え、陽性対象としてはクロロキンを用いた。培養条件は炭酸ガス5％、5〜7.5%酸素、87.5〜90％窒素ガス下で35℃にて、2〜4日保持した。
その後、培養２日目と４日目に薄層塗抹標本を作製し、ギムザ染色後に感染率を測定した。薬剤無添加区での増殖度を100%として50％の増殖を抑制する濃度をIC₅₀値とした。
【００５０】
（３）結果
本発明化合物は、良好にマラリア原虫の増殖を阻害し、化合物Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧの熱帯熱マラリアに対する増殖阻害活性（IC₅₀値）はそれぞれ、2.35、0.77、7.55、7.18、5.85及び10.4μMであった。
【００５１】
実施例３
本発明化合物のヒト培養細胞ヒーラ・エス・サン（HeLa SIII）に対する細胞障害活性を以下の方法で評価した。
ES培地に非働化した胎児牛血清を2%となるように添加した培地を試験培地として、CO₂濃度5%、37℃で培養した。対数増殖期に入ったHeLa SIII細胞を、5×10⁴cells/mlになるように培地で希釈した。供試化合物の溶液は、マラリア原虫を用いた抗マラリア活性測定時に調製した溶液を用いた。
９６穴テストプレート中に、5×10⁴個／mLに調製したHeLa SIII細胞を200μl、種々の濃度の供試化合物を2μl加え、CO₂インキュベーター中で37℃、３日間培養した。培養後、細胞増殖度をCell Counting Kit（DOJINDO製）を用いて測定し、各濃度における増殖抑制率を求め、HeLa SIII細胞の増殖を50％抑制する濃度をIC₅₀ 値とした。本発明化合物のIC₅₀値は、化合物Ｅが21 μg/ml、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＪはいずれも100 μg/ml以上であり、ヒト培養細胞に対する細胞障害活性は抗マラリア活性に比して弱いものであった。
【００５２】
実施例４
本発明化合物をペーパーディスク法で抗菌及び抗真菌活性の試験に供した。バシラス ズブチリス（Bacillus subtilis） ATCC 6633、スタフィロコッカス アウレウス（Staphyrococcus aureus） FDA 209P、エシェリシア コリ（Escherichia coli ）K-12及びカンヂダ アルビカンス（Candida albicans ）、YFC 48、サッカロマイセス セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae） YFC 250、アスペルギルス ニガー（Aspergilus niger ）YFC 36に対し、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＪは、100 μg/mlの濃度において抗菌及び抗真菌活性を示さなかった。
【００５３】
【発明の効果】
本発明のトリアミド誘導体又はその塩は、前記実施例に示すように、良好な抗マラリア活性を有する。一方、哺乳動物の培養細胞に対する細胞障害活性は弱く、また細菌、真菌種にはほとんど活性を示さないことから、本発明化合物は選択的で安全性の高い抗マラリア剤として、マラリア疾患の予防または治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 化合物Ａの紫外部吸収スペクトルを示す
【図２】 化合物Ａの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図３】 化合物Ａの¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図４】 化合物Ｂの紫外部吸収スペクトルを示す。
【図５】 化合物Ｂの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図６】 化合物Ｂの¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図７】 化合物Ｃ紫外部吸収スペクトルを示す。
【図８】 化合物Ｃの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図９】 化合物Ｃの¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１０】 化合物Ｄの紫外部吸収スペクトルを示す。
【図１１】 化合物Ｄの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１２】 化合物Ｄの¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１３】 化合物Ｅの紫外部吸収スペクトルを示す。
【図１４】 化合物Ｅの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１５】 化合物Ｅの¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１６】 化合物Ｆの紫外部吸収スペクトルを示す。
【図１７】 化合物Ｆの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１８】 化合物Ｆの¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１９】 化合物Ｇの紫外部吸収スペクトルを示す。
【図２０】 化合物Ｇの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２１】 化合物Ｇの¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２２】 化合物Ｈの紫外部吸収スペクトルを示す。
【図２３】 化合物Ｈの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２４】 化合物Ｈの¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２５】 化合物Ｊの紫外部吸収スペクトルを示す。
【図２６】 化合物Ｊの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２７】 化合物Ｊの¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a triamide derivative useful as an agent for preventing or treating malaria disease, a method for producing the same, and a pharmaceutical composition containing the triamide derivative as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
Malaria is caused by infection with four types of Plasmodium malaria parasites of P. falciparum, P. falciparum malaria, P. falciparum malaria, and oval malaria parasite mediated by Anopheles It is a general term for diseases. It occurs widely in the tropics and subtropics, and it is said that the annual number of affected people is 300-500 million and the number of deaths is 1.5-2.7 million. The reasons why it is difficult to eradicate malaria include technical reasons such as the complexity of the life cycle of the malaria parasite, resistance to various protozoan drugs, resistance to mosquito insecticides, and lack of effective therapeutic agents.
[0003]
On the other hand, the region where malaria occurs is expanding to temperate regions due to global warming, and there is concern about the epidemic in a wider area in the near future. Development of vaccines for the eradication of malaria, elucidation of the ecophysiology of mosquito vectors, physiological mechanisms and life cycle of malaria parasites, elucidation of related genetic information, analysis of human immune response, pathopathological analysis, novel antimalarial agents Many research activities such as the development of
[0004]
Drugs currently used in the treatment of malaria include quinine, chloroquine, pyrimethamine, mefloquine, artemisinin and the like. Since these drugs are reported as side effects such as vomiting, gastrointestinal symptoms, cranial nerve symptoms, and QTc prolongation, further improvement in safety is desired. In addition, a decrease in sensitivity due to the emergence of drug-resistant protozoa to these drugs has been reported, and a new type of anti-malarial agent is required.
Meanwhile, microorganism-derived polyether antibiotics such as monensin, nigericin (see, for example, Non-Patent Document 1), salinomycin (see, for example, Non-Patent Document 2), and the like are antimalarial. It has been reported as a substance exhibiting activity. However, since all of them have high acute oral toxicity and weak antimalarial effect, they have not been put into practical use until now.
[0005]
[Non-Patent Document 1] "Life Sciences" vol. 59 (20), 309-315 (1996)
[Non-Patent Document 2] “Zentralbl. Bakteriol., Mikrobiol. Hyg.,” Ser A 256 (3), pp. 305-313 (1984)
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The creation of a new type of preventive or therapeutic agent for malaria that has high antimalarial activity and high safety is eagerly desired.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies on substances produced by many naturally occurring microorganisms, the present inventors have found that Streptomyces actinomycetes Q41697 strain produces a novel compound having excellent antimalarial activity. The compound is a compound that clearly differs in structure from the antimalarial agents reported or used to date. The present inventors show that although the compound exhibits a strong antimalarial activity, it has a very weak cytotoxic activity against cultured mammalian cells and has no activity against bacterial and fungal species. Thus, the present invention was completed based on the knowledge that it can be an antimalarial agent having high safety. Since most of the substances previously reported as antimalarial agents have cytotoxicity, antibacterial and antifungal activities, it is speculated that the compound of the present invention has a mechanism of action different from that of conventional antimalarial agents. It is expected as a preventive and therapeutic agent for malaria diseases.
[0008]
That is, the present invention relates to a triamide derivative represented by the following formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
[Chemical formula 2]

(The symbols in the formula have the following meanings.
R¹: Hydrogen atom or ethyl group,
R²: Methyl or hydroxymethyl group,
R^Three: Hydrogen atom,
However, R²And R^ThreeTogether may form a methylene or hydroxymethylene group,
R^FourAnd R^Five: The same or different, a hydrogen atom or a methyl group. )
[0009]
The present invention also includes culturing a microorganism belonging to the genus Streptomyces and having the ability to produce a triamide derivative represented by the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, The triamide derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof is characterized by isolating the triamide derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof from a product. As a microorganism belonging to the genus Streptomyces having the ability to produce the triamide derivative represented by the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, Streptomyces sp. Q41697 strain (FERM) P-19382), which is one of the strains most effectively used in the present invention. The present invention also relates to the Streptomyces sp. Q41697 strain.
Furthermore, the present invention relates to a pharmaceutical composition containing the triamide derivative represented by the above formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, in particular, a prophylactic or therapeutic agent for malaria disease, and malaria killing. Regarding protozoan agents.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The compound of the present invention has geometrical isomers and tautomers, but the present invention includes separated or mixed mixtures of these isomers. Furthermore, the compound of the present invention has an asymmetric carbon atom, and isomers based on the asymmetric carbon atom exist. The present invention includes a mixture or an isolated form of these optical isomers.
The salt of the compound of the present invention is a pharmaceutically acceptable salt, specifically, an inorganic base containing a metal such as sodium, potassium, magnesium, calcium, aluminum, methylamine, ethylamine, ethanolamine, lysine, And salts with organic bases such as ornithine.
The present invention also includes various hydrates and solvates of the triamide derivative represented by the above formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and crystals thereof and polymorphic substances thereof. . The compounds of the present invention include all compounds that are metabolized in vivo and converted to the triamide derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof, so-called prodrugs. Examples of the group that forms the prodrug of the present invention include those described in Prog. Med. 5: 2157-2161 (1985) and those described in Yodogawa Shoten 1990 “Development of Drugs”, Volume 7, Molecular Design 163-198. Group which is made.
[0011]
(Production method)
The triamide derivative of the present invention can be produced using a microorganism belonging to the genus Streptomyces and having the ability to produce the triamide derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Such a microorganism is preferably Streptomyces sp. Q41697 strain belonging to the genus Streptomyces isolated from soil collected in Iriomote Island, Okinawa Prefecture. The bacteriological properties of this strain are as follows.
[0012]
1. Properties in various agar media
Properties of this strain in various agar media are as shown in Table 1. Unless otherwise specified, the cells were cultured at 28 ° C. for 21 days and observed according to a conventional method. Color descriptions are based on color standards (Japan Color Research Institute). The abbreviations in the table indicate G: degree of growth, A: aerial mycelium formation and hue, R: hue on the back surface, and S: soluble pigment.
[0013]
[Table 1]

[0014]
2. Physiological properties
Table 2 shows the various physiological properties of this strain, and Table 3 shows the assimilability of the carbon source. In Table 2, the growth temperature is at each temperature (5, 10, 15, 20, 24, 28, 32, 37, 40, 45, 50 ° C). The observation results from 7 to 21 days, the effect on milk is 37 ° C The observation results for 3 to 21 days are shown, and the observation results after 2 weeks at 28 ° C. are shown unless otherwise indicated. The abbreviations in Table 3 indicate +: assimilate,-: not assimilate, respectively.
[0015]
[Table 2]

[0016]
[Table 3]

[0017]
3. Morphological features
This strain grows well in various organic and inorganic media, and the color of the basic mycelium is light yellow brown to yellowish gray. The aerial mycelium is best formed in inorganic salt / starch agar and oatmeal agar, and exhibits white to light yellowish brown color. The aerial hyphae grow on the well-developed basic hyphae, and are simply branched. Up to about 50 spores are linked to the tip of the aerial hyphae. There is no fragmentation of the basic mycelium in liquid culture. When observed with an electron microscope, the spore has a cylindrical shape, a size of 0.8 to 1.1 μm × 0.5 to 0.7 μm, and its surface structure is thorn-like. Special organs such as sporangia and motile spores are not observed.
[0018]
4). Chemical analysis of bacterial cell components
Results of analysis of acid hydrolyzate of this strain according to the method of Lechvalier et al. (Lechvalier, MP. Et al; PP277-338 in DIETZ, A et al ed., Actinomycete Taxonomy, SIM Special Publication No. 6, 1980) , LL-diaminopimelic acid was detected (cell wall type I).
[0019]
Based on the above properties, this strain was determined to be a strain belonging to the genus Streptomyces. Therefore, this strain was designated as Streptomyces sp. Q41697 strain. This strain is deposited under the accession number FERM P-19382 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary. In addition, since microorganisms artificially or naturally mutate, the Streptomyces sp. Q41697 strain of the present invention is not limited to microorganisms that have been isolated from nature, such as ultraviolet rays, X-rays, chemical agents, etc. It also includes those artificially mutated with and natural mutants thereof.
[0020]
The triamide derivative of the present invention can be obtained by inoculating a microorganism belonging to the genus Streptomyces and having the ability to produce the triamide derivative, preferably Streptomyces sp. I can do it.
The medium used for the culture may be a medium in which the microorganism to be used can grow, and a synthetic medium, a semi-synthetic medium, or a natural medium can be used.
As the nutrient, a nutrient source assimilated by the strain of the present invention may be used. For example, nitrogen sources include inorganic or organic such as peptone, meat extract, corn steep liquor, cottonseed flour, peanut flour, soybean flour, yeast extract, NZ-amine, casein hydrolyzate, fish meal, sodium nitrate, ammonium nitrate Any nitrogen source can be used. As the carbon source, molasses, starch, dextrin, sucrose, glucose, maltose, fructose, xylose, rhamnose, mannitol, glycerin and other carbohydrates or fats can be used.
[0021]
As metal salts, sulfates such as Na, K, Mg, Ca, Zn and Fe, hydrochlorides, nitrates, phosphates, carbonates and the like are added as necessary. In addition to valine, leucine, isoleucine, threonine, phenylalanine, tryptophan, methionine, lysine, arginine, cysteine, cystine, etc., as well as other commonly known amino acids, methyl oleate, lard oil, silicone oil, interface A production promoting compound such as an activator or an antifoaming agent is appropriately used. Other than these, any microorganisms that can be used by the producing bacteria and useful for the production of the compound of the present invention can be used as desired.
The culture may be performed in the same manner as the culture in general antibiotic production, and the culture method may be solid culture or liquid culture. In the case of liquid culture, stationary culture, shaking culture, or stirring culture may be performed, but aeration stirring culture is particularly desirable. As the culture conditions, the culture temperature can be suitably applied within the temperature range in which the producing bacteria grow and can produce the compound of the present invention, that is, in the range of 15 to 37 ° C, but preferably about 24 to 32 ° C. The pH can be appropriately applied in the range of 4 to 9, but 6 to 8 is preferable. The culture time varies depending on various conditions and is usually about 1 to 30 days.
[0022]
In order to isolate the target compound from the culture, usual means for extraction, separation, and purification used in isolating the metabolite of the microorganism can be appropriately used. The substance in the culture is an organic material that is not miscible with water such as ethyl acetate, chloroform, benzene, toluene, etc. in the culture filtrate obtained by filtering the culture solution as it is or by adding a filter aid to the culture. Extract with solvent. Further, the substance can be separated by contacting the culture filtrate with an appropriate carrier, adsorbing the produced substance in the filtrate, and then eluting with a suitable solvent. For example, the substance is adsorbed by contacting with a porous adsorption resin such as Amberlite (registered trademark) XAD2, Diaion (registered trademark, the same shall apply hereinafter) HP20, Diaion CHP20P, or Diaion SP850. Next, the substance is eluted using a mixed solution of water such as methanol, ethanol, acetone, acetonitrile and water. If desired, trifluoroacetic acid or the like may be added for pH adjustment. In some cases, the fraction containing the substance can be efficiently obtained by increasing the mixing ratio of the organic solvent to a high concentration stepwise or continuously from a low concentration.
[0023]
Furthermore, the substance-containing fraction obtained by using each of the above operating methods is subjected to column chromatography, ion exchange chromatography or gel filtration chromatography using a conventional adsorption carrier such as activated carbon, alumina, silica gel, cellulose, etc. By pursuing conventional separation and purification methods such as high-performance liquid chromatography (HPLC) using reversed-phase silica gel column, reversed-phase solid-phase extraction, and centrifugal liquid-liquid partition chromatography, a purer target substance can be obtained. Can be obtained.
[0024]
The pharmaceutical composition of the present invention containing one or more of the triamide derivative of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient is a pharmaceutical carrier, an excipient usually used in the art. It can be prepared by a commonly used method using a shape agent or the like. Administration is orally by tablets, pills, capsules, granules, powders, solutions, etc., or injections such as intravenous injections, intramuscular injections, suppositories, eye drops, ophthalmic ointments, transdermal solutions, ointments, Any form of parenteral administration using a transdermal patch, inhalant, transmucosal liquid, transmucosal patch and the like may be used.
[0025]
As the solid composition for oral administration according to the present invention, tablets, powders, granules and the like are used. In such solid compositions, one or more active substances are present in at least one inert excipient such as lactose, mannitol, glucose, hydroxypropylcellulose, microcrystalline cellulose, starch, polyvinylpyrrolidone, metasilicate. Mixed with magnesium aluminate acid. The composition may contain an inert additive, for example, a lubricant such as magnesium stearate, a disintegrant such as sodium carboxymethyl starch, and a solubilizing agent according to a conventional method. If necessary, tablets or pills may be coated with a sugar coating or a gastric or enteric coating agent.
[0026]
Liquid compositions for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs, etc., and include commonly used inert solvents such as purified water, ethanol, etc. . In addition to the inert solvent, the composition may contain adjuvants such as solubilizers, wetting agents, and suspending agents, sweeteners, corrigents, fragrances, and preservatives.
Injections for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions. Examples of the aqueous solvent include distilled water for injection and physiological saline. Examples of the non-aqueous solvent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, alcohols such as ethanol, polysorbate 80 (trade name), and the like. Such a composition may further contain isotonic agents, preservatives, wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers, and solubilizing agents. These are sterilized by, for example, filtration through a bacteria-retaining filter, blending with a bactericide or irradiation. These can also be used by producing a sterile solid composition and dissolving and suspending it in sterile water or a sterile solvent for injection before use.
[0027]
In general, in the case of oral administration, 0.1 to 500 mg per day for adults and 0.01 to 100 mg for parenterals are appropriate, and these are administered once to several times a day. The dose is appropriately determined according to individual cases in consideration of symptoms, age, sex, and the like. Since the dosage varies depending on various conditions, an amount smaller than the above dosage range may be sufficient.
[0028]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited at all by these Examples.
[0029]
Example 1
Dispense 100 ml of medium (pH 7.0) containing 10 g of glucose, 20 g of potato starch, 5 g of polypeptone, 5 g of yeast extract, 4 g of calcium carbonate and 1 L of distilled water into a 500 ml Erlenmeyer flask and sterilize at 120 ° C for 20 minutes did. The strain Q41697 sufficiently grown on Bennett agar medium was scraped and inoculated, and cultured with shaking at 28 ° C. and 220 rpm for 4 days. 2 ml each of the culture solution was inoculated into three Erlenmeyer flasks containing a medium having the same composition, and cultured for 4 days under the same conditions as a seed culture solution. 200 ml Erlenmeyer flasks containing 100 ml of the same composition are inoculated into 200 ml Erlenmeyer flasks each with 2 ml of the above seed culture solution, and shake-cultured for 9 days at 28 ° C and 220 rpm. The main culture was performed.
[0030]
20 L of the culture solution obtained by the above culture method was subjected to suction filtration, and separated into a supernatant and a cell fraction. 80% of the bacterial cell fraction (^V/_VAcetone aqueous solution 20L was added and stirred for 3 hours. Radiolite # 600 (manufactured by Showa Chemical Industry Co., Ltd.) was added and filtered, and acetone was distilled off from the filtrate obtained under reduced pressure. This concentrated cell extract was passed through a Diaion HP20 (Mitsubishi Chemical Corporation) column with a resin volume of 800 ml. As the supernatant, Diaion HP20 having a resin amount of 2 L was used. Each column is then washed with water and then 10% (^V/_V) 70% after washing with acetone water (^V/_V) The active fraction was eluted with an aqueous acetone solution. The washing solution used at this time and 70% (^V/_V) Acetone aqueous solution used was 3 times the amount of resin.
[0031]
The active fraction obtained from this column was concentrated under reduced pressure, and the resulting residue (28.0 g) was converted to DEAE Sephadex (DEAE Sephadex).^TM) A-25 (Cl^-) (Amersham Pharmacia Biotech) anion exchange resin (resin amount 400 ml), washed with 1.2 L of distilled water, 2%, 3% and 4% (^V/_V) And sodium chloride aqueous solution (1.2 L each). Next, the eluate (approximately 3.6 L) containing the active ingredient is passed through Diaion HP20 column chromatography (resin amount 250 ml), washed with 750 ml of distilled water, and then 750 ml of 95% (^V/_V) Elution with aqueous acetone.
[0032]
The eluted fraction was concentrated to dryness under reduced pressure to obtain an active fraction (11.0 g). This active fraction was subjected to silica gel column chromatography (Wakosil C-300, 220 g manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Chloroform : Elution with 1.4 L of methanol solution (mixing ratio 2: 1), 1.4 L of the same solution (mixing ratio 1: 1) and 1.4 L of methanol, and two active fractions (2.73 g and 2.64 g) by fractionation Got.
[0033]
Isolation and purification of compounds A, B, G, H and J
One of the active fractions obtained from the silica gel column chromatography (2.73 g) was subjected to a PEGASIL PREP Glass Column (ODS-G3-300; 37 × 300 mm Senshu-Science) and 55% (^V/_V) Acetonitrile aqueous solution (trifluoroacetic acid 0.05% (^V/_V) Contained) and then fractionated to obtain three active fractions. The acetonitrile in the elution fraction was distilled off under reduced pressure, and the resulting residue was removed from the solid phase extraction cartridge Oasis.^TMDesalting was performed using HLB (manufactured by Waters), and each fraction was concentrated and dried to obtain fraction 1 (539 mg), fraction 2 (271 mg) and fraction 3 (104 mg). Fraction 1, Fraction 2 and Fraction 3 were individually subjected to HPLC (L-column ODS; 20.0 × 250mm, manufactured by Chemical Substances Evaluation and Research Institute) and 55% (^V/_V) Acetonitrile aqueous solution (trifluoroacetic acid 0.05% (^V/_V) Containing) and fractionated.
[0034]
The three active fractions obtained from fraction 1 were again subjected to HPLC (L-column ODS; 20.0 × 250mm) and 55% (^V/_V) Acetonitrile aqueous solution (trifluoroacetic acid 0.05% (^V/_V) Containing) and fractionated. After the acetonitrile was distilled off under reduced pressure for the obtained active fraction, Oasis^TMDesalting with HLB gave Compound H (15.2 mg), Compound B (145.0 mg), and Compound J (39.3 mg).
The active fraction obtained from fraction 2 was again subjected to HPLC (L-column ODS; 20.0 × 250 mm) and 55% (^V/_V) Acetonitrile aqueous solution (trifluoroacetic acid 0.05% (^V/_V) Containing) and fractionated. After the acetonitrile was distilled off under reduced pressure for the obtained active fraction, Oasis^TMDesalting with HLB gave Compound A (184.0 mg).
[0035]
The active fraction obtained from fraction 3 was again subjected to HPLC (L-column ODS; 20.0 × 250 mm) and 65% (^V/_V) Acetonitrile aqueous solution (trifluoroacetic acid 0.05% (^V/_V) Containing) and fractionated. After the acetonitrile was distilled off under reduced pressure for the obtained active fraction, Oasis^TMDesalted with HLB. Further HPLC (SUPELCOSIL^TMABZ + Plus column; 10.0 × 250mm made by Sperco), 45% (^V/_V) Acetonitrile aqueous solution (trifluoroacetic acid 0.05% (^V/_V) Containing) and fractionated. After the acetonitrile was distilled off under reduced pressure for the obtained active fraction, Oasis^TMDesalting with HLB gave Compound G (7.8 mg).
[0036]
Isolation and purification of compounds C, D, E and F
Of the active fractions obtained from the silica gel column chromatography (Wakosil C-300), the other (2.64 g) was used as a PEGASIL PREP preparative glass column (ODS-G3-300; manufactured by Senshu Scientific Co., Ltd.) 45% (^V/_V) Acetonitrile aqueous solution (trifluoroacetic acid 0.05% (^V/_V) Containing), the acetonitrile of the elution fraction containing the target product was distilled off under reduced pressure, and the resulting residue was recovered as Oasis.^TMDesalting with HLB and concentration to dryness gave an active fraction (328.7 mg).
This active fraction was further subjected to HPLC (L-column ODS; 20.0 × 250 mm) and 45% (^V/_V) Acetonitrile aqueous solution (trifluoroacetic acid 0.05% (^V/_VElution), and three active peaks were collected. After the acetonitrile in each of the obtained active fractions was distilled off under reduced pressure, the resulting residue was removed with Oasis.^TMDesalting with HLB gave fraction 4 (105 mg), fraction 5 (41 mg) and fraction 6 (103 mg).
[0037]
The obtained fraction 4 was further purified by HPLC (SUPELCOSIL^TMABZ + Plus column; 20.0 × 250mm made by Sperco), 45% (^V/_V) Acetonitrile aqueous solution (trifluoroacetic acid 0.05% (^V/_V) Containing) and fractionated. Acetonitrile was distilled off from the obtained active fraction under reduced pressure, and then Oasis was removed.^TMDesalting with HLB gave Compound C (45.3 mg).
Similarly, fraction 5 (41 mg) was further subjected to HPLC (L-column; 20.0 × 250 mm), and 45% (^V/_V) Acetonitrile aqueous solution (trifluoroacetic acid 0.05% (^V/_V) Containing) and fractionated. After the active fraction was distilled off of acetonitrile under reduced pressure, Oasis^TMDesalting with HLB gave Compound E (5.4 mg) and Compound F (2.8 mg).
Similarly, fraction 6 (103 mg) was further subjected to HPLC (L-column; 20.0 × 250 mm) to obtain 55% (^V/_V) Acetonitrile aqueous solution (trifluoroacetic acid 0.05% (^V/_V) Containing) and fractionated. After removing the acetonitrile from the active fraction under reduced pressure, Oasis^TMDesalting with HLB gave Compound D (24.8 mg).
[0038]
The compounds A, B, C, D, E, F, G, H, and J extracted, separated and purified have the following physicochemical properties.
(1) Compound A
1) Color and shape: white powder.
2) Acidic, neutral and basic categories: acidic.
3) Solubility: Soluble in methanol and dimethyl sulfoxide, but hardly soluble in hexane.
4) Ultraviolet absorption spectrum (solvent: methanol): As shown in FIG.
5) High resolution FAB-mass spectrum: Measured value 582.3021 [MH]^-
Theoretical value 582.3027 [MH]^-
6) Molecular formula: C₂₈H₄₅N_ThreeO_Ten
7)¹1 H-NMR spectrum (500 MHz, DMSO): As shown in FIG.
8)¹³C-NMR spectrum (125 MHz, DMSO): As shown in FIG.
[0039]
(2) Compound B
1) Color and shape: white powder.
2) Acidic, neutral and basic categories: acidic.
3) Solubility: Soluble in methanol and dimethyl sulfoxide, but hardly soluble in hexane.
4) Ultraviolet absorption spectrum: as shown in FIG. 4 (solvent: methanol).
5) High resolution FAB-mass spectrum: measured value 556.2877 [M + H]⁺
Theoretical value 556.2870 [M + H]⁺
6) Molecular formula: C₂₆H₄₁N_ThreeO_Ten
7)¹H-NMR spectrum (400 MHz, DMSO): As shown in FIG.
8)¹³C-NMR spectrum (100 MHz, DMSO): As shown in FIG.
[0040]
(3) Compound C
1) Color and shape: white powder.
2) Acidic, neutral and basic categories: acidic.
3) Solubility: Soluble in methanol and dimethyl sulfoxide, but hardly soluble in hexane.
4) Ultraviolet absorption spectrum: as shown in FIG. 7 (solvent: methanol).
5) High resolution FAB-mass spectrum: measured value 570.3026 [M + H]⁺
Theoretical value 570.3027 [M + H]⁺
6) Molecular formula: C₂₇H₄₃N_ThreeO_Ten
7)¹H-NMR spectrum (400 MHz, DMSO): As shown in FIG.
8)¹³C-NMR spectrum (100 MHz, DMSO): As shown in FIG.
[0041]
(4) Compound D
1) Color and shape: white powder.
2) Acidic, neutral and basic categories: acidic.
3) Solubility: Soluble in methanol and dimethyl sulfoxide, but hardly soluble in hexane.
4) Ultraviolet absorption spectrum: as shown in FIG. 10 (solvent: methanol).
5) High-resolution FAB-mass spectrum: measured value 584.3189 [M + H]⁺
Theoretical value 584.3183 [M + H]⁺
6) Molecular formula: C₂₈H₄₆N_ThreeO_Ten
7)¹H-NMR spectrum (400 MHz, DMSO): as shown in FIG.
8)¹³C-NMR spectrum (100 MHz, DMSO): as shown in FIG.
[0042]
(5) Compound E
1) Color and shape: white powder.
2) Acidic, neutral and basic categories: acidic.
3) Solubility: Soluble in methanol and dimethyl sulfoxide, but hardly soluble in hexane.
4) Ultraviolet absorption spectrum: as shown in FIG. 13 (solvent: methanol).
5) High-resolution FAB-mass spectrum: measured value 600.3140 [M + H]⁺
Theoretical value 600.3132 [M + H]⁺
6) Molecular formula: C₂₈H₄₆N_ThreeO₁₁
7)¹H-NMR spectrum (400 MHz, DMSO): as shown in FIG.
8)¹³C-NMR spectrum (100 MHz, DMSO): as shown in FIG.
[0043]
(6) Compound F
1) Color and shape: white powder.
2) Acidic, neutral and basic categories: acidic.
3) Solubility: Soluble in methanol and dimethyl sulfoxide, but hardly soluble in hexane.
4) Ultraviolet absorption spectrum: as shown in FIG. 16 (solvent: methanol).
5) High resolution FAB-mass spectrum: measured value 582.3040 [M + H]⁺
Theoretical value 582.3027 [M + H]⁺
6) Molecular formula: C₂₈H₄₄N_ThreeO_Ten
7)¹H-NMR spectrum (400 MHz, DMSO): As shown in FIG.
8)¹³C-NMR spectrum (100 MHz, DMSO): As shown in FIG.
[0044]
(7) Compound G
1) Color and shape: white powder.
2) Acidic, neutral and basic categories: acidic.
3) Solubility: Soluble in methanol and dimethyl sulfoxide, but hardly soluble in hexane.
4) Ultraviolet absorption spectrum: as shown in FIG. 19 (solvent: methanol).
5) High resolution FAB-mass spectrum: measured value 598.2963 [M + H]⁺
Theoretical value 598.2976 [M + H]⁺
6) Molecular formula: C₂₈H₄₄N_ThreeO_Ten
7)¹H-NMR spectrum (500 MHz, DMSO): as shown in FIG.
8)¹³C-NMR spectrum (125 MHz, DMSO): as shown in FIG.
[0045]
(8) Compound H
1) Color and shape: white powder.
2) Acidic, neutral and basic categories: acidic.
3) Solubility: Soluble in methanol and dimethyl sulfoxide, but hardly soluble in hexane.
4) Ultraviolet absorption spectrum: as shown in FIG. 22 (solvent: methanol).
5) High resolution FAB-mass spectrum: measured value 556.2879 [M + H]⁺
Theoretical value 556.2870 [M + H]⁺
6) Molecular formula: C₂₆H₄₂N_ThreeO_Ten
7)¹H-NMR spectrum (400 MHz, DMSO): As shown in FIG.
8)¹³C-NMR spectrum (100 MHz, DMSO): as shown in FIG.
[0046]
(9) Compound J
1) Color and shape: white powder.
2) Acidic, neutral and basic categories: acidic.
3) Solubility: Soluble in methanol and dimethyl sulfoxide, but hardly soluble in hexane.
4) Ultraviolet absorption spectrum: as shown in FIG. 25 (solvent: methanol).
5) High resolution FAB-mass spectrum: measured value 542.2733 [M + H]⁺
Theoretical value 542.2714 [M + H]⁺
6) Molecular formula: C₂₇H₄₃N_ThreeO_Ten
7)¹H-NMR spectrum (500 MHz, DMSO): As shown in FIG.
8)¹³C-NMR spectrum (125 MHz, DMSO): As shown in FIG.
[0047]
From the above physicochemical properties, the chemical structural formulas of the compounds A, B, C, D, E, F, G, H and J were determined as follows. The abbreviations in the table represent H: hydrogen atom, Me: methyl group, Et: ethyl group, respectively.
[Table 4]

[0048]
Example 2
The antimalarial activity of the compound of the present invention was confirmed by the following method.
(1) Culture of Plasmodium falciparum
Plasmodium falciparum ATCC 30932 strain was used as the test malaria parasite. As a culture medium used for in vitro culture, serum-free culture with human serum follows the method of Trager & Jensen (Trager, W. & Jensen, JB (1976) Human malaria parasites in continuous culture. Science 193, 673-5). Asahi, H. & Kanazawa, T. (1994) Continuous cultivation of intraerythrocytic Plasmodium falciparum in a serum-free medium with the use of a growth-promoting factor. Parasitology 109, 397-401, and Asahi, H. et al. (1996) Hypoxanthine: a low molecular weight factor essential for growth of erythrocytic Plasmodium falciparum in a serum-free medium. Parasitology 113, 19-23). After adjusting the pH of the medium to 7.4, human serum containing red blood cells was added to 10%. The malaria parasite was cultured at a temperature of 35 ° C. in an environment with an oxygen concentration of 5.0%, a carbon dioxide concentration of 5.0 to 7.5%, and a nitrogen concentration of 87.5 to 90%. The hematocrit value (ratio of the volume of red blood cells in the red blood cell suspension) was adjusted to 5% before use. The initial infection rate of P. falciparum at the start of culture was 0.1%. The malaria parasite was cultured with erythrocytes using the 24-well culture plate in the above environment, and subculture was performed at a time when the infection rate of erythrocytes by the malaria parasite was 4% while changing the medium every day. The infection rate was measured by counting the number of infected red blood cells caused by malaria parasites under a microscope (oil immersion, 1,000 ×) after making a thin red blood cell sample and staining with Giemsa.
[0049]
(2) Test method for inhibition of malaria parasite growth
Infected erythrocytes in subculture were diluted with a non-infected erythrocyte suspension to adjust the rate of parasitic erythrocytes (Parasitemia) to 0.4%. As a culture medium, human serum supplemented medium (10% HSRPMI: 10% heat-inactivated human serum + Basal medium (RPMI-1640)) or serum-free medium (HGRPMI: 3g / l growth promoting factor from adult bovine serum (under the trade name of Daigo's GF) + Basal medium (RPMI-1640) + 150 microM Hypoxanthine), and the amount of red blood cells in the culture solution was adjusted so that the hematocrit value was 2%. Test compound final concentration 1 x 10^-Four~ 1 × 10^-8Dilute to M and add 5-10 μl. Next, 990-995 μl of P. falciparum culture solution was added to each well and gently pipetted to suspend uniformly in the medium.
As a negative control, 10 μl of sterilized water or DMSO was added to each well, and chloroquine was used as a positive control. The culture conditions were maintained at 35 ° C. for 2 to 4 days under 5% carbon dioxide, 5 to 7.5% oxygen, and 87.5 to 90% nitrogen gas.
Thereafter, thin-layer smears were prepared on the second and fourth days of culture, and the infection rate was measured after Giemsa staining. IC is the concentration that suppresses 50% growth, with the degree of growth in the drug-free zone as 100%.₅₀Value.
[0050]
(3) Results
The compound of the present invention inhibits malaria parasite growth well, and the compounds A, C, D, E, F, and G have antiproliferative activity against IC fever (IC₅₀Values) were 2.35, 0.77, 7.55, 7.18, 5.85 and 10.4 μM, respectively.
[0051]
Example 3
The cytotoxic activity of the compound of the present invention against human cultured cell HeLa SIII (HeLa SIII) was evaluated by the following method.
A medium supplemented with 2% fetal calf serum deactivated in ES medium was used as the test medium, CO.₂The cells were cultured at a concentration of 5% and 37 ° C. HeLa SIII cells in the logarithmic growth phase^FourDilute with medium to cells / ml. As a solution of the test compound, a solution prepared at the time of measuring the antimalarial activity using a malaria parasite was used.
5 x 10 in 96-well test plate^FourAdd 200 μl of HeLa SIII cells prepared to cells / mL, 2 μl of test compounds of various concentrations, and add CO₂The cells were cultured at 37 ° C. for 3 days in an incubator. After incubation, the degree of cell proliferation is measured using the Cell Counting Kit (manufactured by DOJINDO) to determine the growth inhibition rate at each concentration.₅₀ Value. IC of the compound of the present invention₅₀Values are 21 μg / ml for compound E, 100 μg / ml for compounds A, B, C, D, F, G, H and J, and the cytotoxic activity against cultured human cells is antimalarial. It was weaker than that.
[0052]
Example 4
The compounds of the present invention were subjected to antibacterial and antifungal activity tests by the paper disk method. Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphyrococcus aureus FDA 209P, Escherichia coli K-12, Candida albicans YFC 48, Saccharomyces cerevisiae In contrast to Aspergilus niger YFC 36, compounds A, B, C, D, E, F, G, H and J showed no antibacterial and antifungal activity at a concentration of 100 μg / ml.
[0053]
【The invention's effect】
The triamide derivative of the present invention or a salt thereof has good antimalarial activity as shown in the above Examples. On the other hand, since the cytotoxic activity against cultured cells of mammals is weak and hardly shows activity against bacterial and fungal species, the compound of the present invention is a selective and highly safe antimalarial agent for preventing or preventing malaria diseases. Useful for treatment.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the ultraviolet absorption spectrum of Compound A.
FIG. 2: Compound A¹H-NMR spectrum is shown.
FIG. 3: Compound A¹³A C-NMR spectrum is shown.
FIG. 4 shows an ultraviolet absorption spectrum of Compound B.
FIG. 5: Compound B¹H-NMR spectrum is shown.
FIG. 6: Compound B¹³A C-NMR spectrum is shown.
FIG. 7 shows a compound C ultraviolet absorption spectrum.
FIG. 8: Compound C¹H-NMR spectrum is shown.
FIG. 9: Compound C¹³A C-NMR spectrum is shown.
FIG. 10 shows an ultraviolet absorption spectrum of Compound D.
FIG. 11: Compound D¹H-NMR spectrum is shown.
FIG. 12: Compound D¹³A C-NMR spectrum is shown.
FIG. 13 shows an ultraviolet absorption spectrum of Compound E.
FIG. 14: Compound E¹H-NMR spectrum is shown.
FIG. 15: Compound E¹³A C-NMR spectrum is shown.
FIG. 16 shows an ultraviolet absorption spectrum of Compound F.
FIG. 17: Compound F¹H-NMR spectrum is shown.
FIG. 18: Compound F¹³A C-NMR spectrum is shown.
FIG. 19 shows an ultraviolet absorption spectrum of Compound G.
FIG. 20: Compound G¹H-NMR spectrum is shown.
FIG. 21: Compound G¹³A C-NMR spectrum is shown.
FIG. 22 shows an ultraviolet absorption spectrum of Compound H.
FIG. 23: Compound H¹H-NMR spectrum is shown.
FIG. 24: Compound H¹³A C-NMR spectrum is shown.
FIG. 25 shows an ultraviolet absorption spectrum of Compound J.
FIG. 26: Compound J¹H-NMR spectrum is shown.
FIG. 27: Compound J¹³A C-NMR spectrum is shown.

Claims (6)

A triamide derivative represented by the following formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

(The symbols in the formula have the following meanings.
R ¹ : hydrogen atom or ethyl group,
R ² : methyl or hydroxymethyl group,
R ³ : hydrogen atom
However, R ² and R ³ together may form a methylene or hydroxymethylene group,
R ⁴ and R ^{5 are the} same or different and are a hydrogen atom or a methyl group. ) A microorganism belonging to the genus Streptomyces and having the ability to produce the triamide derivative represented by the above formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is cultured, and the triamide derivative or A method for producing the triamide derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof, comprising isolating the pharmaceutically acceptable salt. The production method according to claim 2, wherein the microorganism belonging to the genus Streptomyces is Streptomyces sp. Q41697 strain (FERM P-19382). A pharmaceutical composition comprising the triamide derivative represented by the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. The pharmaceutical composition according to claim 4, which is a preventive or therapeutic agent for malaria disease. 6. The pharmaceutical composition according to claim 5, which is a malarial protozoan agent.

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