JP2006340694A - Method for synthesizing protein by in vitro transcription/translation system using molecular chaperone - Google Patents

Method for synthesizing protein by in vitro transcription/translation system using molecular chaperone Download PDF

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Takashi Kanamori
崇 金森
Sachiko Takami
幸子 高見
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for synthesizing a protein by an in vitro transcription/translation system, capable of solving such problems that a molecular chaperone is originally contained in conventional in vitro transcription/translation systems, because the conventional systems use an overall cell extract, such as an Escherichia coil extract, and therefore it is difficult to strictly control a kind, an amount, and other conditions of the molecular chaperone so as to suit with a protein to be synthesized. <P>SOLUTION: In this method for synthesizing the protein, the kind and the amount of the molecular chaperone to be added is optimized, by using a reconstituted in vitro transcription/translation system comprising only such factors as to be necessary to transcription/translation. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明はタンパク質のin vitro転写・翻訳系による合成方法に関し、更に詳しくは、分子シャペロンを添加したin vitro転写・翻訳系による活性を有したタンパク質の効率的な合成方法に関するものである。   The present invention relates to a method for synthesizing a protein by an in vitro transcription / translation system, and more particularly to an efficient method for synthesizing a protein having activity by an in vitro transcription / translation system to which a molecular chaperone is added.

タンパク質は、細胞内のリボソーム上で合成されるアミノ酸のポリマーであるが、機能を果たすためには、特定の正しい高次構造を形成（フォールディング）し、さらにその高次構造を維持することが必要である。このような高次構造の形成・維持に関与する一連のタンパク質として「分子シャペロン」が知られている。分子シャペロンには様々なグループがあるが、主なものとして、(1)Hsp70ファミリー，(2)Hsp60ファミリー，(3)Hsp100ファミリー，(4)Hsp90ファミリー，(5)低分子量Hspがある。これらHspファミリーは、大腸菌からヒトまで非常によく保存されており、また、その機能は、アデノシン3リン酸（ATP）の加水分解により制御されている。また、このほかにも、プロリン残基のシス・トランスの異性化に関与する酵素（ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ（PPIase）など）や、ジスルフィド結合の形成に関与する酵素（プロテインジスルフィドイソメラーゼ（PDI）など）などのイソメラーゼ類も分子シャペロンに含まれる。   Proteins are polymers of amino acids synthesized on ribosomes in the cell, but in order to function, it is necessary to form (fold) certain correct higher-order structures and maintain those higher-order structures. It is. “Molecular chaperones” are known as a series of proteins involved in the formation and maintenance of such higher-order structures. There are various groups of molecular chaperones, but the main ones are (1) Hsp70 family, (2) Hsp60 family, (3) Hsp100 family, (4) Hsp90 family, and (5) low molecular weight Hsp. These Hsp families are very well conserved from E. coli to humans, and their function is controlled by hydrolysis of adenosine triphosphate (ATP). In addition, enzymes involved in cis-trans isomerization of proline residues (such as peptidylprolyl cis-trans isomerase (PPIase)) and enzymes involved in disulfide bond formation (protein disulfide isomerase (PDI)) Is also included in the molecular chaperone.

分子シャペロンに関する研究では、Hsp70ファミリーとHsp60ファミリーについて、それぞれの大腸菌のホモログを使用した研究が先行して行なわれてきた（非特許文献1：Bukau&Horwich (1998) Cell, 92, 351-366）。   In studies on molecular chaperones, studies using the homologues of the respective E. coli for the Hsp70 family and the Hsp60 family have been conducted in advance (Non-patent Document 1: Bukau & Horwich (1998) Cell, 92, 351-366).

Hsp70の大腸菌のホモログは、DnaKであり、補助因子としてDnaJとGrpEが必要である。DnaJはDnaKのATPからアデノシン2リン酸（ADP）への加水分解を促進し、GrpEはDnaK上のADPをATPに交換する反応を担っていると考えられている。DnaKは、タンパク質の高次構造が崩れて露出した疎水領域に結合することによって、タンパク質が凝集するのを防ぐと考えられている。   The homologue of Hsp70 E. coli is DnaK, which requires DnaJ and GrpE as cofactors. DnaJ promotes the hydrolysis of DnaK from ATP to adenosine diphosphate (ADP), and GrpE is thought to be responsible for exchanging ADP on DnaK for ATP. DnaK is thought to prevent proteins from aggregating by binding to hydrophobic regions exposed by disruption of protein conformation.

一方、Hsp60の大腸菌のホモログはGroELであり、7量体のリング構造が背中合わせになった14量体の複合体として存在している。高次構造がほどけたタンパク質がリング構造内の空洞に入り、GroESの7量体からなるフタがされることによって、周りから隔離された環境で正しい高次構造形成を促進することができると考えられている。   On the other hand, the Hsp60 Escherichia coli homolog is GroEL, which exists as a 14-mer complex in which the heptamer ring structure is back-to-back. It is thought that the formation of a correct higher-order structure can be promoted in an environment isolated from the surroundings by allowing the protein with the higher-order structure to enter the cavity in the ring structure and forming a lid made of the GroES heptamer. It has been.

また、Hsp70とHsp60の両者は、リボソーム上で合成された新生ポリペプチドの正しい高次構造形成にも関与していることが知られている（非特許文献２:Young et al. (2004) Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 5, 781）。大腸菌において、新生ペプチドの大部分は、まずトリガーファクター（TF）と呼ばれる分子シャペロンに結合すると考えられている。トリガーファクターは、プロリンのシス・トランス異性化を促進する活性をもつ分子シャペロンである。その後、ほとんどは、自発的にフォールディングするが、一部が、DnaKやGroELの助けを借りて正しい構造を形成すると考えられている。新しく合成されたポリペプチドに分子シャペロンがどのように作用しているかについては、in vitroでも、in vitro翻訳系を用いて様々な研究が行なわれてきた。この場合、内在する分子シャペロンの影響をできるだけ排除するため、希釈した大腸菌抽出液を使用するなどして実験を実施していた（非特許文献３：Agashe VR et al. (2004) Cell, 117, 199-209）。
一方、タンパク質を生産するためにも分子シャペロンは使用されてきた。大腸菌で組換えタンパク質を生産する場合、不溶性の凝集体を形成して活性型が入手できないことも多かった。そこで、分子シャペロンを大量に発現させた大腸菌を使用することによって、目的のタンパク質の凝集を防ぐ試みが行なわれてきた（特許文献１：WO 03/057897）。 It is also known that both Hsp70 and Hsp60 are involved in the formation of correct higher-order structures of nascent polypeptides synthesized on ribosomes (Non-patent Document 2: Young et al. (2004) Nat). Rev. Mol. Cell Biol., 5, 781). In E. coli, the majority of nascent peptides are thought to first bind to a molecular chaperone called trigger factor (TF). The trigger factor is a molecular chaperone having an activity of promoting cis / trans isomerization of proline. After that, most fold spontaneously, but some are thought to form the correct structure with the help of DnaK and GroEL. Various studies have been conducted on in vitro translation systems using in vitro translation systems as to how molecular chaperones act on newly synthesized polypeptides. In this case, in order to eliminate as much as possible the influence of the molecular chaperone that is inherent, an experiment was carried out by using a diluted E. coli extract (Non-patent Document 3: Agashe VR et al. (2004) Cell, 117, 199-209).
On the other hand, molecular chaperones have also been used to produce proteins. When producing recombinant proteins in E. coli, the active form was often not available due to the formation of insoluble aggregates. Thus, attempts have been made to prevent aggregation of the target protein by using E. coli in which a large amount of molecular chaperone is expressed (Patent Document 1: WO 03/057897).

WO 03/057897WO 03/057897 Bukau&Horwich (1998) Cell, 92, 351-366Bukau & Horwich (1998) Cell, 92, 351-366 Young et al. (2004) Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 5, 781Young et al. (2004) Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 5, 781 Agashe VR et al. (2004) Cell, 117, 199-209Agashe VR et al. (2004) Cell, 117, 199-209

近年、タンパク質を合成する方法として、細胞の抽出液を利用したin vitro転写・翻訳系が開発・改良され、その実用性が高まってきている。in vitro転写・翻訳系は、無細胞タンパク質合成系とよばれる場合もある。また、RNAから合成する場合は、in vitro翻訳系であるが、本願におけるin vitro転写・翻訳系は、in vitro翻訳系を含める。in vitro転写・翻訳系を用いたタンパク質合成の場合も、上述の大腸菌を使用したタンパク質合成の場合と同様、分子シャペロン量を増やすことによって合成したタンパク質が不溶化するのを防ぐ試みが行なわれてきた（特開平7-194374，WO 03/025116，特開2002-335959）。しかし、従来のin vitro転写・翻訳系は、大腸菌抽出液のように細胞全体の抽出液を使用するため、もともと分子シャペロンが含まれており、合成するタンパク質に合わせて分子シャペロンの種類、量を厳密に調節することは困難であった。上述したように、当然、分子シャペロンの機能解析を行なう際にもその点を考慮する必要があった。   In recent years, in vitro transcription / translation systems using cell extracts have been developed and improved as methods for protein synthesis, and their practicality is increasing. An in vitro transcription / translation system is sometimes called a cell-free protein synthesis system. Further, in the case of synthesis from RNA, an in vitro translation system is used, but the in vitro transcription / translation system in this application includes an in vitro translation system. In the case of protein synthesis using an in vitro transcription / translation system, as in the case of protein synthesis using E. coli described above, attempts have been made to prevent insolubilization of the synthesized protein by increasing the amount of molecular chaperone. (JP-A-7-194374, WO03 / 025116, JP-A-2002-335959). However, since conventional in vitro transcription / translation systems use whole cell extracts such as E. coli extracts, they originally contain molecular chaperones, and the type and amount of molecular chaperones according to the protein to be synthesized. It was difficult to adjust precisely. As described above, naturally, it was necessary to consider this point when conducting functional analysis of molecular chaperones.

このような状況下において、翻訳に必要な因子のみからなる再構成in vitro転写・翻訳系であるPURESYSTEM（商標）が開発された（特開2003-102495，Shimizu et al (2001) Nat. Biotechnol., 19, 751-755）。PURESYSTEMは再構成系のため、分子シャペロンもほとんど検出されない（Ying B., et al (2004) Biochem. Biophys. Res. Com., 320, 1359-1364）。現在までに、PURESYSTEMに分子シャペロンを添加してタンパク質合成を行ない、分子シャペロンの添加が可溶性の向上に効果があることが報告されている（Ying et al (2004) Biochem. Biophys. Res. Com, 320, 1359-1364，Ying et al (2005) J. Biol. Chem., 280, 12035-12040）。しかしながら、添加する分子シャペロンの種類や添加量等の最適化は行なわれていない。   Under such circumstances, PURESYSTEM ™, which is a reconstituted in vitro transcription / translation system consisting only of factors necessary for translation, has been developed (JP 2003-102495, Shimizu et al (2001) Nat. Biotechnol. , 19, 751-755). Since PURESYSTEM is a reconstitution system, molecular chaperones are hardly detected (Ying B., et al (2004) Biochem. Biophys. Res. Com., 320, 1359-1364). To date, it has been reported that protein synthesis is performed by adding molecular chaperones to PURESYSTEM, and the addition of molecular chaperones is effective in improving solubility (Ying et al (2004) Biochem. Biophys. Res. Com, 320, 1359-1364, Ying et al (2005) J. Biol. Chem., 280, 12035-12040). However, the type and amount of molecular chaperone to be added have not been optimized.

再構成したin vitro転写・翻訳系を用いることにより、分子シャペロンの添加条件の最適化ができることをはじめて見出し、本願発明を完成させた。   The inventors found for the first time that the addition conditions of molecular chaperones can be optimized by using a reconstituted in vitro transcription / translation system, and completed the present invention.

本願発明により、in vitro転写・翻訳系でタンパク質を合成する際、合成するそれぞれのタンパク質について、どの分子シャペロンを、どれだけの濃度、合成反応液に添加すればよいか等の、最適な合成の設計できるようになった。本発明により、従来十分な活性を得ることができなかった、種々のタンパク質について、活性を持ったタンパク質として合成できるようになるという優れた効果を奏するものである。   According to the present invention, when synthesizing a protein in an in vitro transcription / translation system, the optimal synthesis such as which molecular chaperone should be added to the synthesis reaction solution for each protein to be synthesized, etc. It became possible to design. According to the present invention, it is possible to synthesize various proteins, which have not been able to obtain sufficient activity in the past, to be synthesized as active proteins.

１．本願発明の概要
１−１．タンパク質合成方法
本願発明は、フォールディングの制御が可能なin vitro転写・翻訳系によるタンパク質合成方法を包含する。具体的には、in vitro転写・翻訳系としては、（１）例えば、90%以上の純度など、高純度のリボソーム、開始因子類、延長因子類、終結因子類、アミノアシルtRNAシンテターゼ類、メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ類、tRNA類、アミノ酸類、リボヌクレオシド3リン酸類、10-フォルミル5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸(FD)、塩類及び水を成分として含み、更に、（２）90%以上の純度の1または複数の分子シャペロンを含む再構成in vitro転写・翻訳系を用いることが、特に好適であることを見出し、本発明を完成させた。 1. 1. Outline of the present invention 1-1. Protein Synthesis Method The present invention includes a protein synthesis method using an in vitro transcription / translation system capable of controlling folding. Specifically, in vitro transcription / translation systems include: (1) high purity ribosomes such as 90% or more, initiation factors, elongation factors, termination factors, aminoacyl tRNA synthetases, methionyl tRNA Contains transformylases, tRNAs, amino acids, ribonucleoside triphosphates, 10-formyl 5,6,7,8-tetrahydrofolic acid (FD), salts and water, and (2) 90% or more It has been found that it is particularly suitable to use a reconstituted in vitro transcription / translation system comprising one or more molecular chaperones of the purity of the present invention.

すなわち本発明は、従来法とは異なり、細胞抽出液を使わずに、存在量及び純度がそれぞれ特定されているリボソーム、開始因子類、延長因子類、終結因子類、アミノアシルtRNAシンテターゼ類、メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ類、tRNA類、アミノ酸類、リボヌクレオシド3リン酸類、10-フォルミル5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸(FD)、塩類及び水をタンパク質合成基本試薬として再構成し、この再構成in vitro転写・翻訳系において、分子シャペロンを用いて、フォールディングの制御をすることにより、活性を有したタンパク質の高効率な合成方法を提供する。   That is, the present invention differs from conventional methods in that ribosomes, initiation factors, elongation factors, termination factors, aminoacyl tRNA synthetases, methionyl tRNAs, each of which is specified in abundance and purity without using a cell extract. Transformylases, tRNAs, amino acids, ribonucleoside triphosphates, 10-formyl 5,6,7,8-tetrahydrofolate (FD), salts and water are reconstituted as basic protein synthesis reagents. In an in vitro transcription / translation system, by using a molecular chaperone to control folding, a highly efficient synthesis method of an active protein is provided.

なお、好適には、上記の再構成したタンパク質合成基本試薬は、高度に精製された90%以上の純度のリボソーム、開始因子類、延長因子類、終結因子類、アミノアシルtRNAシンテターゼ類、メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ類、tRNA類、アミノ酸類、リボヌクレオシド3リン酸類、10-フォルミル5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸(FD)、塩類及び水を、それぞれ予め決められた量だけ含有するように再構成されているタンパク質合成基本試薬としては、たとえば、PURESYSTEM(ポストゲノム社製、商標)を利用することができる。
なお、本発明のタンパク質合成方法をタンパク質製造方法と呼ぶこともある。 Preferably, the reconstituted basic protein synthesis reagent is a highly purified ribosome having a purity of 90% or more, initiation factors, elongation factors, termination factors, aminoacyl tRNA synthetases, methionyl tRNA transfectants. Formylase, tRNAs, amino acids, ribonucleoside triphosphates, 10-formyl 5,6,7,8-tetrahydrofolic acid (FD), salts and water are reconstituted to each contain a predetermined amount. As the constructed protein synthesis basic reagent, for example, PURESYSTEM (trademark, manufactured by Post Genome) can be used.
Note that the protein synthesis method of the present invention may be referred to as a protein production method.

１−２．タンパク質活性測定法、及びそれを利用したタンパク質合成方法
さらに本発明は、製造されるタンパク質の活性度、及び分子シャペロンの添加量相関を測定する試験方法を提供する。存在量及び純度がそれぞれ特定されているリボソーム、開始因子類、延長因子類、終結因子類、アミノアシルtRNAシンテターゼ類、メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ類、tRNA類、アミノ酸類、リボヌクレオシド3リン酸類、10-フォルミル5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸(FD)、塩類及び水は、それぞれ予め決められた特定の量を再構成して、タンパク質合成基本試薬とする。該タンパク質合成基本試薬に対して、種々の分子シャペロンの濃度を変化させることができることが好ましい。このようにして種々の分子シャペロンの濃度を変化させることのできる分子シャペロン試薬群を、再構成in vitro 転写・翻訳系に所望の最終濃度となるように添加することにより、製造されるタンパク質のフォールディングの制御をすることを可能とした。 1-2. Protein activity measurement method and protein synthesis method using the same Furthermore, the present invention provides a test method for measuring the activity of the protein to be produced and the added amount of molecular chaperone. Ribosomes, initiation factors, elongation factors, termination factors, aminoacyl tRNA synthetases, methionyl tRNA transformylases, tRNAs, amino acids, ribonucleoside triphosphates, 10- Formyl 5,6,7,8-tetrahydrofolic acid (FD), salts and water are each reconstituted in a predetermined amount to be a basic protein synthesis reagent. It is preferable that the concentration of various molecular chaperones can be changed with respect to the protein synthesis basic reagent. In this way, the molecular chaperone reagent group that can change the concentration of various molecular chaperones is added to the reconstituted in vitro transcription / translation system so as to obtain a desired final concentration, thereby folding the produced protein. It was possible to control.

すなわち本発明により所望のフォールディングの制御を必要とするタンパク質を製造するのに必要な条件を、再構成in vitro転写・翻訳系において正確に知ることができるようになった。このようにして得られた情報は、前記タンパク質合成の条件として用いることが可能である。   That is, the present invention makes it possible to accurately know the conditions necessary for producing a protein that requires the desired folding control in a reconstituted in vitro transcription / translation system. Information thus obtained can be used as conditions for the protein synthesis.

分子シャペロンの添加は、タンパク質合成反応開始前、反応中または反応後のいずれの時点において行なっても良い。   The molecular chaperone may be added before starting the protein synthesis reaction, during the reaction, or after the reaction.

複数濃度の試薬をあらかじめ作製しておいて、それぞれの反応系に対して、タンパク質合成反応開始前（鋳型核酸添加前）、反応開始後、又は反応終了後に添加することが可能である。   Multiple concentrations of reagents can be prepared in advance and added to each reaction system before the start of the protein synthesis reaction (before the addition of the template nucleic acid), after the start of the reaction, or after the end of the reaction.

１−３．キット
さらに本発明は、以下のa）及びｂ）からなるキットが包含される。
ａ) 存在量および純度がそれぞれ特定されている成分からなり、鋳型核酸を添加することにより鋳型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じるタンパク質合成反応基本試薬、
ｂ) 存在量及び純度が特定されている1または複数の分子シャペロン
具体的には、ａ) 存在量および純度がそれぞれ特定されているリボソーム、開始因子類、延長因子類、終結因子類、アミノアシルtRNAシンテターゼ類、メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ類、tRNA類、アミノ酸類、リボヌクレオシド3リン酸類、10-フォルミル5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸(FD)、塩類及び水からなり、鋳型核酸を添加することにより鋳型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じるタンパク質合成反応基本試薬、並びに
ｂ) 分子シャペロンがHsp60ファミリー、Hsp70ファミリー、Hsp90ファミリー、Hsp100ファミリー、低分子量Hspファミリー、イソメラーゼ類、および，これらの補助因子から選ばれるキットを提供する。 1-3. Kit The present invention further includes a kit comprising the following a) and b).
a) a basic reagent for a protein synthesis reaction comprising components each having a specified abundance and purity, wherein a synthesis reaction of a protein encoded by the template nucleic acid is generated by adding the template nucleic acid;
b) One or more molecular chaperones whose abundance and purity are specified. Specifically, a) Ribosomes, initiation factors, elongation factors, termination factors, aminoacyl tRNAs whose abundance and purity are specified respectively. Consists of synthetases, methionyl tRNA transformylases, tRNAs, amino acids, ribonucleoside triphosphates, 10-formyl 5,6,7,8-tetrahydrofolate (FD), salts and water, with template nucleic acid added A basic protein synthesis reaction reagent in which a synthesis reaction of a protein encoded by a template nucleic acid occurs, and b) a molecular chaperone is Hsp60 family, Hsp70 family, Hsp90 family, Hsp100 family, low molecular weight Hsp family, isomerases, and their assistance Provide a kit selected from factors.

２．タンパク質合成方法
以下、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。 2. Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the following preferred embodiments, and can be freely modified within the scope of the present invention.

本発明におけるin vitroでのDNA転写・翻訳系又はRNA翻訳系は、mRNA又はcDNA等の目的とするタンパク質をコードする鋳型を添加することでタンパク質を合成させるための基本的成分からなるタンパク質合成基本試薬、並びにタンパク質のフォールディングを人為的調整するための１又は複数の分子シャペロンからなる。   The in vitro DNA transcription / translation system or RNA translation system in the present invention is a basic protein synthesis comprising basic components for synthesizing a protein by adding a template encoding the target protein such as mRNA or cDNA. It consists of reagents, as well as one or more molecular chaperones for artificially adjusting protein folding.

［分子シャペロンを用いたin vitro 転写・翻訳系によるタンパク質合成方法］
本発明の方法は、下記a)、b)及びc)からなる反応系分子を用いたタンパク質合成方法を包含している。
a) 目的とするタンパク質をコードする１または複数の鋳型核酸、
b) 存在量および純度がそれぞれ特定されている複数の成分からなり、鋳型核酸を添加することにより鋳型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じる、タンパク質合成反応基本試薬、
c) 存在量及び純度が特定されている1または複数の分子シャペロン [Protein synthesis by in vitro transcription / translation system using molecular chaperone]
The method of the present invention includes a protein synthesis method using a reaction system molecule comprising the following a), b) and c).
a) one or more template nucleic acids encoding the protein of interest,
b) a basic reagent for protein synthesis reaction, comprising a plurality of components each having an abundance and purity specified, wherein the synthesis reaction of the protein encoded by the template nucleic acid occurs by adding the template nucleic acid;
c) one or more molecular chaperones whose abundance and purity are specified

２−１.タンパク質合成基本試薬
タンパク質合成基本試薬は、その成分として、リボソーム、開始因子類、延長因子類、終結因子類、アミノアシルtRNAシンテターゼ類、メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ類、tRNA類、アミノ酸類、リボヌクレオシド3リン酸類、10-フォルミル5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸(FD)、塩類及び水をそれぞれ予め決められた純度の成分を決められた量だけ含むことを特徴とするが、全ての成分が必要でなく、成分は適宜選択することができる。 2-1. Basic Protein Synthesis Reagents Basic components of protein synthesis include ribosomes, initiation factors, elongation factors, termination factors, aminoacyl tRNA synthetases, methionyl tRNA transformylases, tRNAs, amino acids, Ribonucleoside triphosphates, 10-formyl 5,6,7,8-tetrahydrofolic acid (FD), salts and water each contain a predetermined amount of components of a predetermined purity, all These components are not necessary, and the components can be appropriately selected.

系を構成するこれらの成分は、細胞抽出液又はその粗画分を用いないことはもちろんであるが、含有分子シャペロン濃度を算出可能であることが望ましい。   For these components constituting the system, it is desirable that the concentration of the molecular chaperone contained can be calculated, as well as the cell extract or the crude fraction thereof is not used.

本発明の再構成in vitro 転写・翻訳系は、系を構成する全ての成分を再構成するため、このような成分を特定し、その含有量を計算することは容易である。   Since the reconstituted in vitro transcription / translation system of the present invention reconstitutes all components constituting the system, it is easy to identify such components and calculate their contents.

本発明におけるタンパク質合成反応基本試薬は、DNAからの転写・翻訳、或は、RNAの翻訳を行わせるタンパク質合成のための反応系として使用できる。本発明に言うタンパク質とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したものを言い、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドを含む。本発明に言うRNAは化学合成されたRNA及びmRNAを含み、DNAは、化学合成されたDNA、DNAベクター、ゲノムDNA、PCR産物及びcDNAを含む。   The basic reagent for protein synthesis reaction in the present invention can be used as a reaction system for protein synthesis for transcription / translation from DNA or RNA translation. The protein referred to in the present invention refers to a protein in which two or more amino acids are linked by peptide bonds, and includes peptides, oligopeptides and polypeptides. RNA according to the present invention includes chemically synthesized RNA and mRNA, and DNA includes chemically synthesized DNA, DNA vectors, genomic DNA, PCR products, and cDNA.

本発明におけるタンパク質合成反応基本試薬において、存在量および純度がそれぞれ特定されている成分を含むとは、それぞれの成分について、個々に精製され、その純度が測定可能であり、かつ定量可能であることを意味している。本発明では、存在量および純度がそれぞれ特定された複数の成分とは、予め塩析、クロマトグラフィー、電気泳動、溶解度の差、再結晶、遠心等の物質の精製法により、それぞれが精製された物質であって、クロマトグラフィー、電気泳動、質量分析、遠心等の分析方法により、それぞれの純度がおおむね80％以上、好適には90％以上である物質を言う。例えば、タンパク質であれば、主にクロマトグラフィーにより精製され、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により純度が決定され、リボソームであれば、主に超遠心法により精製され、超遠心分離による沈降分析により純度が決定される。リボソームは複数のRNA分子（原核生物では、23S，5S，及び16Sの３つ、真核生物では28S，5.8S，5S，18Sの4つのRNA分子）と複数のリボソーマルタンパク質（原核生物では約50個、真核生物では約80個のタンパク質）とからなる分子量数百万の集合体分子であるが、沈降分析によって集合体分子として分子を同定し純度を測定することが可能である。tRNA類はほとんどが74から94ヌクレオチドから成り、複数の塩基配列をもつ分子であるが、電気泳動などにより分子を分離・同定し、260nm及び280nmの吸光度測定により純度を測定することが可能である。その他、アミノ酸や塩等の低分子の物質はいずれもクロマトグラフィー、融点測定、元素分析、質量分析等の常法により、物質を同定し純度を測定することが可能である。   In the basic reagent for protein synthesis reaction in the present invention, the phrase “containing components whose abundance and purity are respectively specified” means that each component is individually purified, and its purity can be measured and quantified. Means. In the present invention, a plurality of components whose abundance and purity are respectively specified are previously purified by purification methods of substances such as salting out, chromatography, electrophoresis, difference in solubility, recrystallization, and centrifugation. A substance, which is approximately 80% or more, preferably 90% or more in purity by an analysis method such as chromatography, electrophoresis, mass spectrometry, or centrifugation. For example, protein is mainly purified by chromatography, purity is determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and ribosome is mainly purified by ultracentrifugation and ultracentrifugation. Purity is determined by sedimentation analysis. Ribosomes are composed of multiple RNA molecules (three RNAs, 23S, 5S, and 16S in prokaryotes, and four RNA molecules 28S, 5.8S, 5S, and 18S in eukaryotes) and multiple ribosomal proteins (in prokaryotes, It is an aggregate molecule with a molecular weight of several millions consisting of about 50 proteins (about 80 proteins in eukaryotes), and it is possible to identify the molecules as aggregate molecules by sedimentation analysis and measure the purity. Most tRNAs are composed of 74 to 94 nucleotides and have multiple base sequences, but they can be separated and identified by electrophoresis, etc., and purity can be measured by measuring absorbance at 260nm and 280nm. . In addition, any low-molecular substance such as an amino acid or salt can be identified and measured for purity by conventional methods such as chromatography, melting point measurement, elemental analysis, and mass spectrometry.

タンパク質合成基本試薬としての転写・翻訳のための因子・酵素としては、大腸菌等の原核細胞由来のものに限らず、真核細胞由来のものも使用でき、(１)RNAからの翻訳の場合は、リボソーム、開始因子類、延長因子類、終結因子類、アミノアシルtRNAシンテターゼ類、tRNA類、アデノシン3リン酸（ATP）,グアノシン3リン酸（GTP）,アミノ酸類、10-フォルミル5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸(FD)、塩類及び水であり、大腸菌等の原核細胞由来の反応系である場合は更にメチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ類を含む;(２）DNAからの転写・翻訳の場合は、(１)に加えウリジン3リン酸（UTP）,シチジン3リン酸（CTP）及びRNAポリメラーゼ類、例えばT7RNAポリメラーゼを含む。   Factors and enzymes for transcription and translation as basic protein synthesis reagents are not limited to those derived from prokaryotic cells such as Escherichia coli, but those derived from eukaryotic cells can also be used. (1) When translating from RNA , Ribosomes, initiation factors, elongation factors, termination factors, aminoacyl tRNA synthetases, tRNAs, adenosine triphosphate (ATP), guanosine triphosphate (GTP), amino acids, 10-formyl 5,6,7 , 8-tetrahydrofolic acid (FD), salts and water, and in the case of a reaction system derived from prokaryotic cells such as E. coli, further contains methionyl tRNA transformylase; (2) In the case of transcription / translation from DNA In addition to (1), uridine triphosphate (UTP), cytidine triphosphate (CTP) and RNA polymerases such as T7 RNA polymerase are included.

本発明の反応系を構成する各種因子・酵素は、大腸菌、カビ、酵母、及び培養細胞等全ての生物が本来備えているものであるから、これをそれぞれ高度に精製し、成分として用いることもできるが、各タンパク質が多量に得られ、未知の不要又は阻害成分が反応系内に持ち込まれる可能性が低くなることから、組換え生産されたものを用いることがより好ましい。   Since the various factors / enzymes constituting the reaction system of the present invention are originally provided in all living organisms such as Escherichia coli, mold, yeast, and cultured cells, they can be highly purified and used as components. However, it is more preferable to use recombinantly produced proteins because a large amount of each protein is obtained and the possibility that unknown unnecessary or inhibitory components are brought into the reaction system is reduced.

具体的には開始因子類、延長因子類、終結因子類、アミノアシルtRNAシンテターゼ類、メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ類、又はRNAポリメラーゼ類をコードする遺伝子を適切なベクターにつなぎ、大腸菌、枯草菌、カビ、又は酵母等に形質転換し、発現誘導を行い、該タンパク質を精製し、本発明の反応系を構成する成分とすることができる。組換え体により、各種因子・酵素を生産する場合、インタクトな状態でそのタンパク質を発現させても良いが、融合タンパク質として発現しても良い。そのような融合タンパク質として、ヒスチジンタグ(以下His-Tag)、ストレプトタグ、GSTタグ、及びFLAGタグ等ラベル化されたものを例示することができる。(Terpe K. (2003)Appl Microbiol Biotechnol. 60(5),523-533)   Specifically, genes encoding initiation factors, elongation factors, termination factors, aminoacyl tRNA synthetases, methionyl tRNA transformylases, or RNA polymerases are connected to appropriate vectors, E. coli, Bacillus subtilis, molds, Alternatively, it can be transformed into yeast, induced to induce expression, and the protein can be purified to be a component constituting the reaction system of the present invention. When various factors / enzymes are produced by recombinants, the protein may be expressed in an intact state, or may be expressed as a fusion protein. Examples of such fusion proteins include those labeled with a histidine tag (hereinafter referred to as His-Tag), a strep tag, a GST tag, and a FLAG tag. (Terpe K. (2003) Appl Microbiol Biotechnol. 60 (5), 523-533)

一例として、His-Tagとニッケルカラムを利用した、His-Tagを付したタンパク質成分の精製方法の概略を示せば次の通りである。これ以外にも様々なバリエーションが知られており、適宜選択して使用できる。
（１）．遺伝子工学的手法により、目的タンパク質のN末端にHis-Tag（6個のHisよりなる）を結合させた融合タンパク質を得る。
（２）．タグをつけたタンパク質が発現している細胞を氷中で超音波処理し、ローディングバッファー(300 mM NaCl，50 mM NaH2PO4 pH 8.0）に懸濁させる。
（３）．細胞の溶解物を遠心分離する(30,000g、4℃で30分間）。
（４）．上記で得られた上清に、氷で冷やしたローディングバッファーの中 で平衡化した50%のNi2+-NTA slurry (Qiagen社製)を加える。4℃で1時間撹拌する。
（５）．樹脂をカラムにロードし、カラム容量の20倍のローディングバッファーで、４℃でカラムの洗浄を行う。
（６）．カラム容量の20倍のローディングバッファー(10 mM imidazole pH 8.0を含む)で、４℃でカラムの洗浄を行う。
（７）．カラム容量の20倍のローディングバッファーを用いて、imidazoleの濃度勾配を10から250 mMになるように設定し、カラムから目的タンパク質の溶出を行わせ、1 mlずつフラクションを集める。SDS-PAGEで目的タンパク質を確認する。 As an example, an outline of a method for purifying a protein component with a His-Tag using a His-Tag and a nickel column is as follows. Various other variations are known and can be selected and used as appropriate.
(1). A fusion protein in which a His-Tag (consisting of 6 Hiss) is bound to the N-terminus of the target protein is obtained by genetic engineering techniques.
(2). Cells expressing the tagged protein are sonicated in ice and suspended in loading buffer (300 mM NaCl, 50 mM NaH 2 PO 4 pH 8.0).
(3). Centrifuge cell lysate (30,000g, 30 min at 4 ° C).
(4). To the supernatant obtained above, 50% Ni 2+ -NTA slurry (Qiagen) equilibrated in a loading buffer cooled with ice is added. Stir at 4 ° C for 1 hour.
(5). The resin is loaded onto the column, and the column is washed at 4 ° C. with a loading buffer 20 times the column volume.
(6). Wash the column at 4 ° C. with 20 times the column volume of loading buffer (containing 10 mM imidazole pH 8.0).
(7). Using a loading buffer 20 times the column volume, set the concentration gradient of imidazole to 10 to 250 mM, elution of the target protein from the column, and collect 1 ml fractions. Confirm the target protein by SDS-PAGE.

また、反応系を構成する各種因子・酵素として、直接タンパク質の合成反応には関わらないが、クレアチンキナーゼ類、ミオキナーゼ類又はヌクレオシドジフォスフェートキナーゼ類といったエネルギー再生に関わる酵素、及び無機ピロフォスファターゼ類といった、転写・翻訳反応で生じる無機ピロリン酸の分解のための酵素類も、同様な方法で該タンパク質を精製し、本発明の反応系に加えることがより好ましい。   In addition, as various factors and enzymes constituting the reaction system, they are not directly involved in protein synthesis reactions, but enzymes such as creatine kinases, myokinases or nucleoside diphosphate kinases, and inorganic pyrophosphatases It is more preferable that enzymes for decomposing inorganic pyrophosphate generated in the transcription / translation reaction are purified by the same method and added to the reaction system of the present invention.

なお、上記したように、タンパク質合成基本試薬の内、タンパク質からなる成分は、ヒスチジンタグ(以下His-Tag)、ストレプトタグ、GSTタグ、及びFLAGタグ等でラベルすることにより、目的のタンパク質を合成後、当該ラベルを用いて、これら成分を除去することができる。これにより、目的タンパク質を高精製度で得ることができるものである。   As described above, among the basic protein synthesis reagents, the protein component is labeled with a histidine tag (hereinafter, His-Tag), strept tag, GST tag, FLAG tag, etc. to synthesize the target protein. The label can then be used to remove these components. Thereby, the target protein can be obtained with high purity.

塩類としては、転写・翻訳に必須な陽イオン・陰イオンを含むことが必須であり、グルタミン酸カリウム、塩化アンモニウム、酢酸マグネシウム、塩化カルシウム等が通常使用される。なお、上記以外にも適宜選択して使用できることは言うまでもない。水はイオンや微生物類、酵素類を含まないもので、例えばミリポア社製のミリQ水製造装置によって製造される水や市販の純水を挙げることができる。   As the salts, it is essential to contain cations and anions essential for transcription and translation, and potassium glutamate, ammonium chloride, magnesium acetate, calcium chloride and the like are usually used. Needless to say, those other than the above can be appropriately selected and used. Water does not contain ions, microorganisms, and enzymes. Examples thereof include water produced by a Milli Q water production apparatus manufactured by Millipore and commercially available pure water.

リボソームは、ペプチド合成の場であり、mRNAと結合し、アミノアシルtRNAをA部位に、フォルミルメチオニルtRNA又はペプチジルtRNAをP部位にそれぞれ配位してペプチド結合を形成させる反応を行う(Nissen et al. (2000) Science289, 920-930)。本発明においては、かかる機能を有するものであれば、由来を問わず使用することが可能である。例えば、大腸菌由来のリボソームが使用されるが、真核細胞由来のものも使用できる。本発明において用いられるリボソームの好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌A19株、MRE600株から得られるものを挙げることができる。   Ribosome is a place for peptide synthesis, binds to mRNA, and coordinates aminoacyl tRNA to A site and formylmethionyl tRNA or peptidyl tRNA to P site to form a peptide bond (Nissen et al. al. (2000) Science 289, 920-930). In this invention, if it has such a function, it can be used regardless of origin. For example, ribosomes derived from E. coli are used, but those derived from eukaryotic cells can also be used. Preferred examples of the ribosome used in the present invention are those derived from E. coli, such as those obtained from E. coli A19 strain and MRE600 strain.

本発明のin vitro転写・翻訳系で使用される開始因子類には、翻訳開始複合体の形成に必須であるか、又は、これを著しく促進する因子であり、大腸菌由来のものとして、IF1、IF2及びIF3が知られている(Claudio O et al. (1990) Biochemistry, 29, 5881-5889)。開始因子IF3は、翻訳の開始に必要な段階である、70Sリボソームの30Sサブユニットと50Sサブユニットへの解離を促進し、また、翻訳開始複合体の形成の際に、フォルミルメチオニルtRNA以外のtRNAのP部位への挿入を阻害する。開始因子IF2は、フォルミルメチオニルtRNAと結合し、30SリボソームサブユニットのP部位へフォルミルメチオニルtRNAを運び、翻訳開始複合体を形成する。開始因子IF1は開始因子IF2，IF3の機能を促進する。本発明において用いられる開始因子の好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌K12株から得られるものを挙げることができるが、真核細胞由来のものも使用できる。   The initiation factors used in the in vitro transcription / translation system of the present invention are essential for the formation of a translation initiation complex or are factors that significantly promote this. IF2 and IF3 are known (Claudio O et al. (1990) Biochemistry, 29, 5881-5889). The initiation factor IF3 promotes dissociation of the 70S ribosome into 30S and 50S subunits, a step necessary for initiation of translation, and other than formylmethionyl tRNA during the formation of the translation initiation complex Inhibits the insertion of tRNA into the P site. Initiation factor IF2 binds to formylmethionyl tRNA and carries formylmethionyl tRNA to the P site of the 30S ribosomal subunit to form a translation initiation complex. Initiation factor IF1 promotes the functions of initiation factors IF2 and IF3. Preferable examples of the initiation factor used in the present invention are those derived from E. coli, for example, those obtained from E. coli K12 strain, but those derived from eukaryotic cells can also be used.

延長因子EF-Tuは、GTP型とGDP型の2種類があり、GTP型はアミノアシルtRNAと結合してこれをリボソームのA部位へ運ぶ。EF-Tuがリボソームから離れる際にGTPが加水分解され、GDP型へ転換する(Pape T et al, (1998) EMBOJ.17:7490-7497)。延長因子EF-Tsは、EF-Tu（GDP型）に結合し、GTP型への転換を促進する(Hwang YW et al. (1997) Arch Biochem Biophys 348, 157-162)。延長因子EF-Gは、ペプチド鎖伸長過程において、ペプチド結合形成反応の後の転位（translocation）反応を促進する(Agrawal RK et al, (1999) Nat Struct Biol 6, 643-647, Rodnina MW. et al, (1999) FEMS Microbiology Reviews 23, 317-333)。本発明において用いられる延長因子の好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌K12株から得られるものを挙げることができるが、真核細胞由来のものも使用できる。   There are two types of elongation factor EF-Tu, GTP type and GDP type. GTP type binds aminoacyl-tRNA and carries it to the A site of ribosome. When EF-Tu leaves the ribosome, GTP is hydrolyzed and converted to the GDP type (Pape T et al, (1998) EMBOJ. 17: 7490-7497). Elongation factor EF-Ts binds to EF-Tu (GDP type) and promotes conversion to GTP type (Hwang YW et al. (1997) Arch Biochem Biophys 348, 157-162). Elongation factor EF-G promotes the translocation reaction after peptide bond formation in the process of peptide chain elongation (Agrawal RK et al, (1999) Nat Struct Biol 6, 643-647, Rodnina MW. Et al. al, (1999) FEMS Microbiology Reviews 23, 317-333). Preferred examples of the elongation factor used in the present invention are those derived from E. coli, such as those obtained from E. coli K12 strain, but those derived from eukaryotic cells can also be used.

終結因子はタンパク質合成の終結、翻訳されたペプチド鎖の解離、更に次のmRNAの翻訳開始へのリボソームの再生に必須である。これを含まない反応系でタンパク質合成を行った場合は、終始コドンの手前で反応が止まり、リボソーム・ペプチド・mRNAの安定な3者複合体の形成が容易に行われる（ポリソームディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、インビトロバイラス法）。またペプチド鎖への非天然アミノ酸の導入は、RF1及び/又はRF2を反応系から省くことにより行われる。即ち、RF1を省いた場合はUAGコドン、RF2を省いた場合はUGAコドンへの非天然アミノ酸の導入が高い効率で行われる。   Terminators are essential for termination of protein synthesis, dissociation of the translated peptide chain, and regeneration of the ribosome to initiate translation of the next mRNA. When protein synthesis is performed in a reaction system that does not include this, the reaction stops before the termination codon, and the formation of a stable ternary complex of ribosome, peptide, and mRNA is facilitated (polysome display method, ribosome display) Method, in vitro viral method). In addition, introduction of an unnatural amino acid into a peptide chain is performed by omitting RF1 and / or RF2 from the reaction system. That is, when RF1 is omitted, the UAG codon is introduced, and when RF2 is omitted, the unnatural amino acid is introduced into the UGA codon with high efficiency.

終結因子RF1及びRF2は、リボソームのA部位に終止コドン（UAA,UAG,UGA）が来た時、A部位に入ってぺプチジルtRNA（P部位にある）からのペプチド鎖の解離を促進する。RF1は終止コドンのうちUAAおよびUAGを認識し、RF2はUAAおよびUGAを認識する。終結因子RF3は、RF1,RF2によるペプチド鎖の解離反応後の、RF1,RF2のリボソームからの解離を促進する。リボソーム再生因子（RRF）は、タンパク質合成の停止後、P部位に残っているtRNAの脱離と、次のタンパク質合成へのリボソームの再生を促進する。本発明においては、RRFも終結因子類の一つとして取扱うことにする。なお、終結因子RF1,RF2,RF3及びRRFの機能については、Freistroffer DV et al, (1997)EMBOJ.16,4126-4133、Pavlov MY et al. (1997) EMBOJ.16:4134-4141に解説されている。本発明において用いられる終結因子の好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌K12株から得られるものを挙げることができるが、真核細胞由来のものも使用できる。   Termination factors RF1 and RF2 enter the A site and promote the dissociation of the peptide chain from the peptidyl tRNA (located in the P site) when a stop codon (UAA, UAG, UGA) comes to the A site of the ribosome. RF1 recognizes UAA and UAG among the stop codons, and RF2 recognizes UAA and UGA. The termination factor RF3 promotes the dissociation of RF1 and RF2 from the ribosome after the peptide chain dissociation reaction by RF1 and RF2. Ribosome regeneration factor (RRF) promotes detachment of tRNA remaining in the P site after protein synthesis is stopped and ribosome regeneration for the next protein synthesis. In the present invention, RRF is treated as one of the termination factors. The functions of termination factors RF1, RF2, RF3 and RRF are explained in Freistroffer DV et al, (1997) EMBOJ. 16, 4126-4133, Pavlov MY et al. (1997) EMBOJ. 16: 4134-4141. ing. Preferable examples of the termination factor used in the present invention are those derived from E. coli, for example, those obtained from E. coli K12 strain, but those derived from eukaryotic cells can also be used.

アミノアシルtRNAシンテターゼは、ATPの存在下でアミノ酸とtRNAを共有結合させ、アミノアシルtRNAを合成する酵素である(Francklyn C et al, (1997) RNA 3, 954-960, 蛋白質核酸酵素39, 1215-1225(1994))。本発明において用いられるアミノアシルtRNAシンテターゼの好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌K12株から得られるものを挙げることができるが、真核細胞由来のものも使用できる。また、非天然アミノ酸を認識する人工アミノアシルtRNAシンテターゼ（特許2668701号）を用いることもできる。   Aminoacyl-tRNA synthetase is an enzyme that synthesizes aminoacyl-tRNA by covalently binding an amino acid and tRNA in the presence of ATP (Francklyn C et al, (1997) RNA 3, 954-960, protein nucleic acid enzyme 39, 1215-1225. (1994)). Preferable examples of aminoacyl-tRNA synthetase used in the present invention are those derived from E. coli, for example, those obtained from E. coli K12 strain, but those derived from eukaryotic cells can also be used. In addition, an artificial aminoacyl-tRNA synthetase that recognizes an unnatural amino acid (Japanese Patent No. 2668701) can also be used.

メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ（MTF）は原核生物におけるタンパク質合成においてメチオニルtRNAのアミノ基にフォルミル基がついたN-フォルミルメチオニル(fMet)tRNAを合成する酵素である。即ち、メチオニルtRNAトランスフォルミラ―ゼは、N10‐フォルミルテトラヒドロ葉酸のフォルミル基を、開始コドンに対応するメチオニルtRNAのN末端に転移させ、fMet-tRNAにする(Ramesh V et al, (1999) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96, 875-880)。付加されたフォルミル基は開始因子IF2により認識され、タンパク質合成の開始シグナルとして作用する。真核生物の細胞質における合成系にはMTFはないが、真核生物のミトコンドリア及び葉緑体における合成系には存在する。本発明において用いられるMTFの好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌K12株から得られるものである。   Methionyl tRNA transformylase (MTF) is an enzyme that synthesizes N-formylmethionyl (fMet) tRNA having a formyl group in the amino group of methionyl tRNA in protein synthesis in prokaryotes. That is, methionyl tRNA transformylase transfers the formyl group of N10-formyltetrahydrofolate to the N-terminus of methionyl tRNA corresponding to the start codon to form fMet-tRNA (Ramesh V et al, (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 875-880). The added formyl group is recognized by the initiation factor IF2 and acts as an initiation signal for protein synthesis. There is no MTF in the synthetic system in the eukaryotic cytoplasm, but it exists in the synthetic system in eukaryotic mitochondria and chloroplasts. Preferred examples of MTF used in the present invention are those derived from E. coli, such as those obtained from E. coli K12.

RNAポリメラーゼは、DNA配列をRNAに転写する酵素であり、様々な生物に存在することが知られている。その一例として、T7ファージ由来の、T7RNAポリメラーゼを挙げることができ、このポリメラーゼはT7プロモーターと呼ばれる特異的なDNA配列に結合してその下流のDNA配列をRNAに転写する酵素である。本発明者等は、T7RNAポリメラーゼのN末端にHis-Tagを付加して、融合タンパク質として大腸菌BL21株において大量発現を行い、ニッケルカラムを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより精製を行った。本発明においては、T7RNAポリメラーゼ以外にも種々のRNAポリメラーゼを用いることができる。例えば、T3RNAポリメラーゼやSP6RNAポリメラーゼが市販されており、これ等を利用することもできる。   RNA polymerase is an enzyme that transcribes a DNA sequence into RNA, and is known to exist in various organisms. One example is T7 RNA polymerase derived from T7 phage, which is an enzyme that binds to a specific DNA sequence called T7 promoter and transcribes the downstream DNA sequence into RNA. The present inventors added a His-Tag to the N-terminus of T7 RNA polymerase, expressed it in large quantities in E. coli BL21 as a fusion protein, and purified it by affinity chromatography using a nickel column. In the present invention, various RNA polymerases can be used in addition to T7 RNA polymerase. For example, T3 RNA polymerase and SP6 RNA polymerase are commercially available, and these can also be used.

アミノ酸類としては天然型又は非天然型アミノ酸、天然型又は非天然型アミノ酸でチャージされたtRNAが挙げられる。非天然アミノ酸でチャージされたtRNAを用いることで、タンパク質に非天然アミノ酸を導入することが可能となる。   Examples of amino acids include natural or non-natural amino acids, and tRNA charged with natural or non-natural amino acids. By using tRNA charged with an unnatural amino acid, it is possible to introduce the unnatural amino acid into the protein.

tRNA類としては、大腸菌、酵母等の細胞から精製したtRNAを用いることができる。またアンチコドンやその他の塩基を任意に変更した人工tRNAも用いることができる（Hohsaka, T et al. (1996) J. Am. Chem. Soc. 121:34-40, Hirao I et al (2002), Nature Biotech. 20: 177-182）。例えば、CUAをアンチコドンとして持つtRNAに非天然のアミノ酸をチャージすることで、本来終止コドンであるUAGコドンを非天然アミノ酸に翻訳することが可能である。また，4塩基コドンをアンチコドンとして持つtRNAに非天然アミノ酸をチャージした人工アミノアシルtRNAを用いることにより、天然には存在しない4塩基コドンを非天然アミノ酸に翻訳することが可能である（Hohsaka et al. (1999),J.Am.Chem.Soc., 121, 12194-12195）。このような人工tRNAを作製する方法としては，RNAを用いる方法も使用できる（特表２００３−５１４５７２）。これらの方法により部位特異的に非天然アミノ酸を導入したタンパク質を合成することができる。   As tRNAs, tRNA purified from cells such as Escherichia coli and yeast can be used. Artificial tRNA in which the anticodon and other bases are arbitrarily changed can also be used (Hohsaka, T et al. (1996) J. Am. Chem. Soc. 121: 34-40, Hirao I et al (2002), Nature Biotech. 20: 177-182). For example, by charging an unnatural amino acid to a tRNA having CUA as an anticodon, it is possible to translate a UAG codon that is originally a stop codon into an unnatural amino acid. In addition, by using an artificial aminoacyl-tRNA in which a tRNA having a 4-base codon as an anticodon is charged with an unnatural amino acid, a non-naturally occurring 4-base codon can be translated into an unnatural amino acid (Hohsaka et al. (1999), J. Am. Chem. Soc., 121, 12194-12195). As a method for producing such an artificial tRNA, a method using RNA can also be used (Special Table 2003-514572). By these methods, a protein into which an unnatural amino acid has been introduced can be synthesized in a site-specific manner.

その他、緩衝液としては、リン酸カリウム緩衝液 (pH7.3)などが通常使用される。
また、上記された各成分の純度については、測定法を以下に例示する。 In addition, potassium phosphate buffer (pH 7.3) is usually used as the buffer.
Moreover, about the purity of each above-mentioned component, a measuring method is illustrated below.

上記した開始因子類、延長因子類、終結因子類、メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ類などタンパク質からなる成分は、例えば、前記した、His-Tagとニッケルカラムを利用した、His-Tagを付したタンパク質成分の精製方法により精製した後、SDS-PAGEで目的タンパク質を確認し、各レーンの泳動パターンをデンシトメーターで読み取って算出することができる。
精製したリボソームは、ショ糖密度勾配による分析で純度を測定できる。 Protein components such as the above-mentioned initiation factors, elongation factors, termination factors, methionyl tRNA transformylases, for example, protein components with His-Tag using the His-Tag and nickel columns described above, for example. After purifying by the above purification method, the target protein can be confirmed by SDS-PAGE, and the migration pattern of each lane can be read by a densitometer and calculated.
The purity of the purified ribosome can be measured by analysis with a sucrose density gradient.

tRNA類、アミノ酸類、リボヌクレオチド3リン酸類及びFD、その他緩衝液、DTTなど通常試薬として市販されている試薬は、市販試薬の純度で使用可能である。なお、市販の試薬はいずれも、純度はいずれも80％以上であった。   Reagents commercially available as normal reagents such as tRNAs, amino acids, ribonucleotide triphosphates and FD, other buffer solutions, and DTT can be used at the purity of commercially available reagents. All the commercially available reagents had a purity of 80% or more.

２−２．分子シャペロン
分子シャペロンは、既に種々のものが知られているが、タンパク質のフォールディングや不可逆的変性の抑制に関与している一連のタンパク質を包含する。 2-2. Molecular chaperones Various molecular chaperones are already known, but include a series of proteins involved in protein folding and suppression of irreversible denaturation.

分子シャペロンとしては、具体的には、例えば、Hsp70ファミリー、Hsp60ファミリー、Hsp90ファミリー、Hsp100ファミリー、低分子量Hspファミリー、イソメラーゼ類、および，これらの補助因子をあげることができる。   Specific examples of molecular chaperones include Hsp70 family, Hsp60 family, Hsp90 family, Hsp100 family, low molecular weight Hsp family, isomerases, and cofactors thereof.

Hsp70ファミリーは、大腸菌からヒトまで非常に保存されたタンパク質ファミリーでATP加水分解（ATPase）活性を有する。タンパク質の変性時や翻訳（合成）途中に露出する疎水ペプチド領域に結合し，疎水ペプチド間で凝集するのを防ぐことにより、タンパク質の構造形成を助ける。この変性タンパク質との結合・解離のステップは，Hsp70へのATPの結合，ADPへの加水分解，ADPの脱離というサイクルで制御されている。DnaKは，大腸菌のHsp70であり、補助因子としてDnaJ，GrpEを必要とする。DnaJは、DnaKのATP加水分解を促進し、GrpEは、DnaK上のADPをATPへ交換する。   The Hsp70 family is a highly conserved protein family from E. coli to humans and has ATP hydrolysis (ATPase) activity. It binds to hydrophobic peptide regions exposed during protein denaturation and translation (synthesis) and prevents aggregation between hydrophobic peptides, thereby helping to form protein structures. The step of binding / dissociating with the denatured protein is controlled by a cycle of binding of ATP to Hsp70, hydrolysis to ADP, and elimination of ADP. DnaK is Hsp70 of E. coli and requires DnaJ and GrpE as cofactors. DnaJ promotes ATP hydrolysis of DnaK, and GrpE exchanges ADP on DnaK for ATP.

Hsp60ファミリーは、7量体のリング構造が背中合わせになった14量体として存在し、ATPase活性を有している。Hsp60は、大きく2つのファミリーに分けられ、そのシャペロン活性に、Hsp10ファミリーを必要とするものとしないものとに分けられる。Hsp10ファミリーは7量体のリング構造をとる。変性タンパク質は、Hsp60の7量体リングが形成する「かご」の中に隔離されることによって正しい高次構造をとることができると考えられている。その際、Hsp10は「かご」の「フタ」の役割を果たしていると考えられている。GroELは大腸菌のHsp60であり、補助因子としてHsp10ファミリーのGroESを必要とする。なお、Hsp70ファミリーとHsp60ファミリーについては、参考文献：Bukau B and Horwich AL (1998) Cell, vol.92, 351-366に解説されている。   The Hsp60 family exists as a 14-mer in which a 7-mer ring structure is back-to-back, and has ATPase activity. Hsp60 is roughly divided into two families, and its chaperone activity is divided into those that do not require the Hsp10 family and those that do not. The Hsp10 family has a heptameric ring structure. It is believed that the denatured protein can assume the correct higher order structure by being sequestered in the “cage” formed by the Hsp60 heptamer ring. At that time, Hsp10 is thought to play the role of the “lid” of the “cage”. GroEL is Hsp60 of Escherichia coli and requires Hsp10 family GroES as a cofactor. The Hsp70 family and Hsp60 family are described in the reference: Bukau B and Horwich AL (1998) Cell, vol. 92, 351-366.

Hsp90ファミリーは、主として真核生物で機能解析がされており、サイトゾルのタンパク質の１％近くを占める。Hsp90は、変性タンパク質の凝集を抑制できることが示されている（Freeman BC (1996) EMBO, 15,2969-2979）。また、真核生物のHsp90は、ホルモンレセプターなどの情報伝達タンパク質の機能制御に重要な役割を果たしていることが明らかにされている（Buchner J (1999)Trends. Biochem. Sci., 24, 136-141）。大腸菌のホモログはHtpGだが、機能についてはほとんど分かっていない。   The Hsp90 family has been elucidated primarily in eukaryotes and accounts for nearly 1% of cytosolic proteins. Hsp90 has been shown to be able to suppress denatured protein aggregation (Freeman BC (1996) EMBO, 15,2969-2979). In addition, eukaryotic Hsp90 has been shown to play an important role in regulating the function of signal transduction proteins such as hormone receptors (Buchner J (1999) Trends. Biochem. Sci., 24, 136- 141). The homologue of E. coli is HtpG, but little is known about its function.

Hsp100ファミリーには、様々な機能を持つタンパク質が含まれ、ClpBは、大腸菌のホモログのひとつである。ClpBはATPase活性を有し、GroELと同様の14量体構造をとる。DnaKと共同して凝集したタンパク質をほどく活性があることが示されている（Motohashi K et al.(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 96, 7184-7189）。   The Hsp100 family includes proteins with various functions, and ClpB is one of E. coli homologs. ClpB has ATPase activity and has a 14-mer structure similar to GroEL. It has been shown to be active in unwinding aggregated proteins in conjunction with DnaK (Motohashi K et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 7184-7189).

低分子量Hspは、分子量15-30kDaのATPase活性をもつ熱ショックタンパク質ファミリーで、様々な分子種が含まれる。真核生物の低分子量Hspのなかには、in vitroでシャペロン活性があることが示されているものもある。また、細胞骨格への結合も示され、細胞骨格の機能制御に関与している可能性がある低分子量Hspもある。大腸菌では、IbpAおよびIbpBが低分子量Hspとして知られている。その機能については未解明の部分が多いが、大腸菌で外来タンパク質を大量発現させたときに生じるインクルージョンボディに含まれることが示されている（Allen SP et al. (1992) J. Bacteriol., 174, 6938-6947）。
イソメラーゼ類の主なものとして、プロリン残基のシス・トランスの異性化に関与する酵素（ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ（PPIase）など）や、ジスルフィド結合の形成に関与する酵素（プロテインジスルフィドイソメラーゼ （PDI）など）が知られている。PDIは、タンパク質の正しいジスルフィド結合形成に関与する。PPIaseは、タンパク質のプロリン残基のcis型とtrans型の間での異性化を促進する。大腸菌のトリガーファクターは、PPIase活性を持ち、さらに新生ポリペプチドに結合し、フォールディングに関与していると考えられている（Agashe et al. (2004) Cell, 117, 199-209）。
本発明においては、分子シャペロンとして、具体的には、例えば、（１）GroEL及びGroES、（２）DnaK、DnaJ及びGrpE、（３）TF、（４）GroEL及びGroES、並びにDnaK、DnaJ及びGrpE、（５）TF並びにGroEL及びGroES、（６）TF並びにDnaK、DnaJ及びGrpE、及び（７）TF並びにGroEL及びGroES並びにDnaK、DnaJ及びGrpE、からなるグループから選択して用いることができる。 Low molecular weight Hsp is a family of heat shock proteins having an ATPase activity with a molecular weight of 15-30 kDa, and includes various molecular species. Some eukaryotic low molecular weight Hsps have been shown to have chaperone activity in vitro. There is also a low molecular weight Hsp that has been shown to bind to the cytoskeleton and may be involved in the control of the function of the cytoskeleton. In E. coli, IbpA and IbpB are known as low molecular weight Hsp. There are many unexplained functions, but it has been shown to be contained in inclusion bodies that are produced when a large amount of foreign protein is expressed in E. coli (Allen SP et al. (1992) J. Bacteriol., 174 , 6938-6947).
The main isomerases include enzymes involved in cis-trans isomerization of proline residues (such as peptidylprolyl cis-trans isomerase (PPIase)) and enzymes involved in disulfide bond formation (protein disulfide isomerase (PDI)). Etc.) are known. PDI is involved in the correct disulfide bond formation of proteins. PPIase promotes isomerization between cis and trans forms of protein proline residues. The trigger factor of E. coli has PPIase activity, further binds to a nascent polypeptide, and is thought to be involved in folding (Agashe et al. (2004) Cell, 117, 199-209).
In the present invention, specific examples of molecular chaperones include (1) GroEL and GroES, (2) DnaK, DnaJ and GropE, (3) TF, (4) GroEL and GroES, and DnaK, DnaJ and GrpE. (5) TF and GroEL and GroES; (6) TF and DnaK, DnaJ and GrpE; and (7) TF and GroEL and GroES and DnaK, DnaJ and GrpE.

なお、好適には、分子シャペロンは、ラベル化することができ、ラベルとしては、His-Tagを用いることができる。目的とするタンパク質の合成後、該ラベルを用いて、ラベル化された分子シャペロンを反応系から除去することができる。   Preferably, the molecular chaperone can be labeled, and His-Tag can be used as the label. After the synthesis of the target protein, the labeled molecular chaperone can be removed from the reaction system using the label.

３．タンパク質活性測定法、及びそれを利用したタンパク合成方法
本発明のタンパク質活性測定方法は、上記した２．タンパク質合成方法［分子シャペロンを用いたin vitro 転写・翻訳方法］の反応系を用いることができる。 3. Protein activity measuring method and protein synthesis method using the same The protein activity measuring method of the present invention is the above-mentioned 2. A reaction system of a protein synthesis method [in vitro transcription / translation method using molecular chaperone] can be used.

本発明の分子シャペロン濃度及び合成されたタンパク質の活性の相関を測定する試験方法は、次のa),b)及びｃ）からなる反応系によることができる。
ａ）１または複数の鋳型核酸、
ｂ) 存在量および純度がそれぞれ特定されている成分からなり、鋳型核酸を添加することにより鋳型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じるタンパク質合成反応基本試薬、
ｃ) 存在量及び純度が特定されている1または複数の分子シャペロン
以上の反応系で合成されたタンパク質の活性を測定し、添加したc)分子シャペロンとの相関を求める。ここで測定されるタンパク質の活性は酵素活性に限らず、例えばタンパク質と別の分子種との結合活性、可溶化等を含む。 The test method for measuring the correlation between the molecular chaperone concentration of the present invention and the activity of the synthesized protein can be based on a reaction system comprising the following a), b) and c).
a) one or more template nucleic acids,
b) a protein synthesis reaction basic reagent comprising components each having an abundance and purity specified, wherein a synthesis reaction of a protein encoded by the template nucleic acid is generated by adding the template nucleic acid;
c) One or more molecular chaperones whose abundance and purity are specified The activity of the protein synthesized in the above reaction system is measured, and the correlation with the added c) molecular chaperone is determined. The protein activity measured here is not limited to enzyme activity, but includes, for example, binding activity between protein and another molecular species, solubilization, and the like.

より具体的には、まず濃度を様々に変化させたｃ）分子シャペロンを準備する。その際、ｃ）は単独の物質でも良いが、複数の物質の混合物であっても良い。このような分子シャペロンの例として、例えば、Hsp70ファミリー、Hsp60ファミリー、Hsp90ファミリー、Hsp100ファミリー、低分子量Hspファミリー、イソメラーゼ類、および、これらの補助因子をあげることができる。続いて、タンパク質の合成反応を開始するが、ｃ）はタンパク質の合成反応の最初に加えても良いが、合成反応の途中で加えても良く、更に合成反応が終了してから加えても良い。合成反応が終了してから加える場合には、添加後更に数十分から１時間程度静置するのが好ましい。このようにして合成したそれぞれの場合について、反応液中の合成されたタンパク質の活性を測定する。ここで合成されるタンパク質は、いずれのタンパク質でもよく、タンパク質を同じ反応液中で合成しヘテロオリゴマー等を形成させ活性を測定することも可能である。   More specifically, first, c) molecular chaperones having various concentrations are prepared. In this case, c) may be a single substance or a mixture of a plurality of substances. Examples of such molecular chaperones include, for example, the Hsp70 family, Hsp60 family, Hsp90 family, Hsp100 family, low molecular weight Hsp family, isomerases, and cofactors thereof. Subsequently, the protein synthesis reaction is started. C) may be added at the beginning of the protein synthesis reaction, but may be added during the synthesis reaction, or may be added after the synthesis reaction is completed. . When adding after completion | finish of a synthesis reaction, it is preferable to leave still for about several tens of minutes to 1 hour after addition. For each case synthesized in this way, the activity of the synthesized protein in the reaction solution is measured. The protein synthesized here may be any protein, and the activity can be measured by synthesizing the protein in the same reaction solution to form a hetero-oligomer or the like.

このようにして、タンパク質の活性と、ｃ）分子シャペロンの濃度との相関関係を明らかにすることができる。   In this way, the correlation between protein activity and c) molecular chaperone concentration can be clarified.

こうして得た相関関係を利用し、予め決められた値の活性（所望の活性値）を得るために必要なｃ）分子シャペロンの種類と濃度を決定し、当該所望の活性を奏する濃度になるようにb)タンパク質合成反応基本試薬にｃ）分子シャペロンを添加し、更にa）目的タンパク質をコードする鋳型核酸を添加した反応系で、効率的に目的タンパク質を合成することができる。   Using the correlation obtained in this manner, c) the type and concentration of the molecular chaperone necessary for obtaining a predetermined value of activity (desired activity value) are determined so that the concentration exhibits the desired activity. The target protein can be efficiently synthesized in a reaction system in which c) a molecular chaperone is added to b) a protein synthesis reaction basic reagent, and a) a template nucleic acid encoding the target protein is further added.

４．キット
本願発明には、以下のa）及びｂ）からなるタンパク質のフォールディングを制御することが可能なin vitro 転写・翻訳キットが含まれる。
ａ) 存在量および純度がそれぞれ特定されている成分からなり、鋳型核酸を添加することにより鋳型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じるタンパク質合成反応基本試薬、
ｂ) 存在量及び純度が特定されている1または複数の分子シャペロン
なお、タンパク質合成基本試薬としては、上記２−１.タンパク質合成基本試薬を、分子シャペロンとしては、上記２−２．分子シャペロン記載のものを使用することができる。 4). Kit The present invention includes an in vitro transcription / translation kit capable of controlling protein folding comprising the following a) and b).
a) a basic reagent for a protein synthesis reaction comprising components each having a specified abundance and purity, wherein a synthesis reaction of a protein encoded by the template nucleic acid is generated by adding the template nucleic acid;
b) One or more molecular chaperones whose abundance and purity are specified. As the protein synthesis basic reagent, the above-mentioned 2-1. Protein synthesis basic reagent is used, and as the molecular chaperone, 2-2. Those described in the molecular chaperone can be used.

また、好適には、分子シャペロンをラベル化することができ、ラベル化された分子シャペロンが翻訳反応終了後に反応系から除去するために使用することができる。ラベルとしては、His-Tagを用いることができる。更に好適には、タンパク質合成基本試薬中、タンパク質を成分とする因子及び酵素については、ラベル化された前記因子及び前記酵素を用いることができ、好適には、His-Tagでラベルすることができる。   Preferably, the molecular chaperone can be labeled, and the labeled molecular chaperone can be used to remove from the reaction system after completion of the translation reaction. As a label, His-Tag can be used. More preferably, for the factor and enzyme having protein as a component in the protein synthesis basic reagent, the labeled factor and enzyme can be used, and preferably, the label can be labeled with His-Tag. .

以下に、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、もとよりこれらは例示であり、本発明はこれらに限定されるものではない。   The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these are examples only, and the present invention is not limited to these examples.

分子シャペロン高発現用プラスミドの構築と形質転換体の作成
大腸菌A19株より抽出したゲノムを鋳型としてGroESをコードする遺伝子配列をPCR法により増幅し、5'端にNdeI、3'端にXhoIが認識する配列を持ったDNA断片を得た。得られたDNA断片をあらかじめNdeI及びXhoIで切断したベクターpET-21a(+)（Novagen社製）に挿入し、C末端にHis-Tagが融合したGroESを高発現させるためのプラスミドを得た。得られたプラスミドで大腸菌 BLR(DE3)株を形質転換した。DnaK, DnaJ, GrpEを高発現するプラスミドも同様の手法で構築し、形質転換体を作成した。GroELおよびトリガーファクターを高発現する形質転換体は、GroEL遺伝子をpET-21ベクターに導入したプラスミド（Sekikawa C., et al. (1999) J. Biol. Chem., 274, 21251-21256），およびトリガーファクターをpET-29ベクターに導入したプラスミド（Ying B., et al (2004) Biochem. Biophys. Res. Com., 320, 1359-1364）で大腸菌 BLR(DE3)株を形質転換することにより作成した。 Construction of plasmid for high expression of molecular chaperone and creation of transformant Gene sequence encoding GroES is amplified by PCR using genome extracted from Escherichia coli A19 as a template, and NdeI is recognized at 5 'end and XhoI is recognized at 3' end A DNA fragment having the sequence to be obtained was obtained. The obtained DNA fragment was inserted into a vector pET-21a (+) (manufactured by Novagen) previously cleaved with NdeI and XhoI to obtain a plasmid for highly expressing GroES in which His-Tag was fused to the C-terminus. Escherichia coli BLR (DE3) strain was transformed with the obtained plasmid. Plasmids that highly express DnaK, DnaJ, and GrpE were also constructed in the same manner to prepare transformants. A transformant that highly expresses GroEL and a trigger factor includes a plasmid (Sekikawa C., et al. (1999) J. Biol. Chem., 274, 21251-21256) in which a GroEL gene is introduced into a pET-21 vector, and Created by transforming E. coli BLR (DE3) strain with a plasmid (Ying B., et al (2004) Biochem. Biophys. Res. Com., 320, 1359-1364) with trigger factor introduced into pET-29 vector did.

分子シャペロンの高発現と精製
His-Tagが付加されたGroESを高発現させるために、実施例1で作成した形質転換体をLB培地で600 nmの吸光度が0.7になるまで37℃で培養した。この培養液に終濃度が0.1 mMになるようにイソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトシド(IPTG)を添加し、更に37℃で4時間培養した。この培養液を遠心分離し、得られた大腸菌細胞を懸濁緩衝液 (pH8の50 mM Tris-HCl，100 mM KCl，5 mM MgCl2)に懸濁した。この懸濁液を超音波処理し、細胞を破壊した。超音波処理した懸濁液を遠心分離（20,000g,4℃で30分間）し，細胞破砕物を除いた。得られた上清画分にイミダゾールを10 mMになるように加えた後、Ni-NTA Superflow（Qiagen社製）を充填したカラムに供し、(1) 10 mM、(2) 50 mMのイミダゾールを含むNi緩衝液 (pH8の20 mM Tris-HCl，100 mM KCl)で順に洗浄した。200 mMのイミダゾールを含むNi緩衝液で、His-Tagが付加されたGroESを溶出した。溶出画分を保存緩衝液(pH7.6の20 mM HEPES-KOH，50 mM KCl，7 mM β-メルカプトエタノール，10% グリセロール)で透析した。精製したHis-Tagが付加されたGroESの濃度は、波長260 nmの吸光度から算出した。精製したHis-Tagが付加されたGroESは液体窒素で急速冷凍した後、-80℃で保存した。その他のHis-Tagが付加されたDnaK，DnaJ，GrpE，トリガーファクターも同様の手法で精製を行った。また、His-Tagが付加されていないGroELは、文献（Sekikawa C., et al. (1999) J. Biol. Chem., 274, 21251-21256，US 5,776,724）に従って調製した。精製した分子シャペロンの精製度は、10%-20% SDS-PAGEによる分離(クマシーブリリアントブルーで染色)により判別し、それぞれ90%以上の純度であることを確認した。実際の泳動結果を図1に示す。 High expression and purification of molecular chaperones
In order to highly express GroES to which His-Tag was added, the transformant prepared in Example 1 was cultured at 37 ° C. in LB medium until the absorbance at 600 nm reached 0.7. To this culture solution, isopropyl-1-thio-β-D-galactoside (IPTG) was added to a final concentration of 0.1 mM, and further cultured at 37 ° C. for 4 hours. This culture solution was centrifuged, and the resulting E. coli cells were suspended in a suspension buffer (pH 8 50 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 5 mM MgCl 2). This suspension was sonicated to disrupt the cells. The sonicated suspension was centrifuged (20,000 g, 4 ° C. for 30 minutes) to remove cell debris. After adding imidazole to the resulting supernatant fraction to 10 mM, it was applied to a column packed with Ni-NTA Superflow (Qiagen), and (1) 10 mM and (2) 50 mM imidazole were added. The sample was sequentially washed with a Ni buffer solution (pH 8: 20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl). GroES added with His-Tag was eluted with Ni buffer containing 200 mM imidazole. The eluted fraction was dialyzed against a storage buffer (20 mM HEPES-KOH, pH 7.6, 50 mM KCl, 7 mM β-mercaptoethanol, 10% glycerol). The concentration of GroES to which the purified His-Tag was added was calculated from the absorbance at a wavelength of 260 nm. GroES to which the purified His-Tag was added was snap frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C. DnaK, DnaJ, GrpE, and trigger factors with other His-Tags were purified in the same manner. Moreover, GroEL to which His-Tag is not added was prepared according to the literature (Sekikawa C., et al. (1999) J. Biol. Chem., 274, 21251-21256, US 5,776,724). The degree of purification of the purified molecular chaperone was determined by separation by 10% -20% SDS-PAGE (stained with Coomassie Brilliant Blue), and it was confirmed that each purity was 90% or more. The actual migration results are shown in FIG.

精製DnaK，DnaJ，GrpEの活性測定
蛍ルシフェラーゼ（Sigma社製）を変性緩衝液（6 M 塩酸グアニジン，pH7.6の20 mM HEPES-KOH，5 mM ジチオスレイトール（DTT））で500 ng/μlになるように希釈し、室温で30分間放置した。実施例2で精製したHis-Tag付きDnaK，DnaJ，GrpEをそれぞれ(1)2，0.4，0.8，(2)0，0.4，0.8，(3)2，0，0.8，(4)0，0.4，0，(5)0，0，0 μM含む再生緩衝液（pH7.6の20 mM HEPES-KOH，50 mM 塩化カリウム，1 mM DTT，1 mM ATP，5 mM 酢酸マグネシウム）50 μlに、上記変性ルシフェラーゼ0.5 μlを加えて30℃で30分間放置した。放置後の各再生緩衝液内のルシフェラーゼ活性をLuciferase Assay System（Promega社製）で測定した。図2に変性前のルシフェラーゼ活性を100%としたときの活性を示す。この結果から、精製したHis-Tag付きDnaK，DnaJ，GrpE.は、変性したタンパク質を正しく巻き戻す活性を有していることが確認された。 Activity measurement of purified DnaK, DnaJ, GrpE 500 ng / μl of firefly luciferase (manufactured by Sigma) with denaturing buffer (6 M guanidine hydrochloride, 20 mM HEPES-KOH, pH 7.6, 5 mM dithiothreitol (DTT)) And diluted at room temperature for 30 minutes. DnaK, DnaJ, and GrpE with His-Tag purified in Example 2 were (1) 2, 0.4, 0.8, (2) 0, 0.4, 0.8, (3) 2, 0, 0.8, (4) 0, 0.4, respectively. , 0, (5) 0, 0, 0 μM regeneration buffer (pH 7.6 20 mM HEPES-KOH, 50 mM potassium chloride, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 5 mM magnesium acetate) 0.5 μl of denatured luciferase was added and left at 30 ° C. for 30 minutes. The luciferase activity in each regeneration buffer after standing was measured by Luciferase Assay System (Promega). FIG. 2 shows the activity when the luciferase activity before denaturation is 100%. From this result, it was confirmed that the purified His-Tag-attached DnaK, DnaJ, and GrpE. Have the activity of correctly unwinding the denatured protein.

精製GroEL，GroESの活性測定
クエン酸合成酵素（Citrate Synthase (CS) Sigma社製）を変性緩衝液（6 M 塩酸グアニジン，pH7.6の20 mM HEPES-KOH，5 mM DTT）で40 μMになるように希釈し、室温で1時間放置した。実施例2で精製したGroELおよびHis-Tag付きGroESをそれぞれ(1)0.5，1，(2)0.5，0，(3)0，1，(4)0，0 μM含む再生緩衝液（pH7.6の20 mM HEPES-KOH，50 mM 塩化カリウム，1 mM DTT，1 mM ATP，5 mM 酢酸マグネシウム）50 μlに、上記変性クエン酸合成酵素0.71 μlを加えて37℃で30分間放置した。放置後の各再生緩衝液内のクエン酸合成酵素活性をDavid L. et al., J. Biol. Chem., 273, 33961-33971 (1998)に従って測定した。図3に変性前のクエン酸合成酵素活性を100%としたときの活性を示す。この結果から、精製したGroELおよび、His-Tag付きGroESは、変性したタンパク質を正しく巻き戻す活性を有していることが確認された。 Measurement of purified GroEL and GroES activity Citrate synthase (CS) manufactured by Sigma is 40 μM in denaturation buffer (6 M guanidine hydrochloride, pH 7.6, 20 mM HEPES-KOH, 5 mM DTT) And diluted at room temperature for 1 hour. Regeneration buffer (pH 7.5) containing GroEL and His-Tag GroES purified in Example 2 (1) 0.5, 1, (2) 0.5, 0, (3) 0, 1, (4) 0, 0 μM, respectively. 6 of 20 mM HEPES-KOH, 50 mM potassium chloride, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 5 mM magnesium acetate) 50 μl was added with the above-mentioned denatured citrate synthase 0.71 μl and left at 37 ° C. for 30 minutes. The citrate synthase activity in each regeneration buffer after standing was measured according to David L. et al., J. Biol. Chem., 273, 33961-33971 (1998). FIG. 3 shows the activity when the citrate synthase activity before denaturation is 100%. From this result, it was confirmed that purified GroEL and His-Tag-attached GroES have the activity of correctly unwinding the denatured protein.

翻訳実験（一般的方法）
タンパク質合成反応基本試薬の組成は以下のとおりである。pH7.6の50 mM HEPES-KOH，2 mM ATP，2 mM GTP，1 mM CTP, 1 mM UTP, 20 mM クレアチンリン酸（Creatine phosphate），56 A260 units/ml tRNA mix，0.01 μg/μl FD，0.3 mM 各アミノ酸，13 mM 酢酸マグネシウム，100 mM グルタミン酸カリウム，2 mM スペルミジン（spermidine），1 mM ジチオスレイトール（DTT），1.2 μMリボソーム，0.02 μg/μl IF1，0.04 μg/μl IF2，0.015 μg/μl IF3，0.02 μg/μl EF-G，0.04 μg/μl EF-Tu，0.02 μg/μl EF-Ts，0.01 μg/μl RF1，0.01 μg/μl RF2，0.01 μg/μl RF3，0.01 μg/μl RRF，0.6-6 units/μl各アミノアシルtRNA合成酵素（ARS）及びメチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ（MTF），0.004 μg/μl クレアチンキナーゼ（CK;creatine kinase)，0.003 μg/μlミオキナーゼ（MK;myokinase），0.001 μg/μl ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（NDK;nucleoside diphosphate kinase)，0.0356 units/μl PPiase及び0.01 μg/μl T7 RNAポリメラーゼ。このタンパク質合成反応基本試薬に、鋳型DNAを最終濃度が0.02 μMになるように添加して、30℃もしくは37℃で1-2時間反応を行なった。なお、上記組成のうち、リボソーム及びタンパク質因子は特許公開2003-102495に従って調製され、純度が測定されたものを、その他の成分は市販の精製試薬を使用した。 Translation experiment (general method)
The composition of the basic protein synthesis reaction reagent is as follows. pH 7.6 50 mM HEPES-KOH, 2 mM ATP, 2 mM GTP, 1 mM CTP, 1 mM UTP, 20 mM Creatine phosphate, 56 A260 units / ml tRNA mix, 0.01 μg / μl FD, 0.3 mM each amino acid, 13 mM magnesium acetate, 100 mM potassium glutamate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1.2 μM ribosome, 0.02 μg / μl IF1, 0.04 μg / μl IF2, 0.015 μg / μl IF3, 0.02 μg / μl EF-G, 0.04 μg / μl EF-Tu, 0.02 μg / μl EF-Ts, 0.01 μg / μl RF1, 0.01 μg / μl RF2, 0.01 μg / μl RF3, 0.01 μg / μl RRF , 0.6-6 units / μl aminoacyl tRNA synthetase (ARS) and methionyl tRNA transformylase (MTF), 0.004 μg / μl creatine kinase (CK), 0.003 μg / μl myokinase (MK), 0.001 μg / μl nucleoside diphosphate kinase (NDK), 0.0356 units / μl PPiase and 0.01 μg / μl T7 RNA polymerase. Template DNA was added to the protein synthesis reaction basic reagent so that the final concentration was 0.02 μM, and the reaction was performed at 30 ° C. or 37 ° C. for 1-2 hours. In the above composition, ribosome and protein factor were prepared according to Patent Publication 2003-102495 and purity was measured, and other components were commercially available purification reagents.

DnaK，DnaJ，GrpE存在下での蛍ルシフェラーゼの合成
実施例5のタンパク質合成反応基本試薬に、実施例2で調製した分子シャペロンDnaK，DnaJ，GrpEを最終濃度が，(1)0，0，0，(2)0.5，0.25，0.25，(3)1，0.5，0.5，(4)2，1，1，(5)4，2，2，(6)8，4，4，(7)12，6，6 μMとなるようにそれぞれ添加した。これらの反応溶液に、ルシフェラーゼ（luciferase）の鋳型DNAを最終濃度が0.02 μMになるように添加した。30℃で1時間反応した後、各タンパク質合成反応液内のルシフェラーゼ活性をLuciferase Assay System（Promega社製）で測定した。図4に、反応系に添加した各分子シャペロン濃度における合成されたルシフェラーゼの活性を示す。この結果から、DnaK，DnaJ，GrpEをそれぞれ2，1，1 μM以上添加した場合に、合成ルシフェラーゼの活性が明らかに上昇することが分かった。 Synthesis of firefly luciferase in the presence of DnaK, DnaJ, GrpE The final concentration of molecular chaperone DnaK, DnaJ, GrpE prepared in Example 2 was used as the basic reagent for the protein synthesis reaction of Example 5 (1) 0, 0, 0 , (2) 0.5, 0.25, 0.25, (3) 1, 0.5, 0.5, (4) 2, 1, 1, (5) 4, 2, 2, (6) 8, 4, 4, (7) 12 , 6 and 6 μM, respectively. To these reaction solutions, luciferase template DNA was added to a final concentration of 0.02 μM. After reacting at 30 ° C. for 1 hour, the luciferase activity in each protein synthesis reaction mixture was measured by Luciferase Assay System (Promega). FIG. 4 shows the activity of synthesized luciferase at each molecular chaperone concentration added to the reaction system. From these results, it was found that the activity of the synthetic luciferase was clearly increased when 2, 1, 1 μM or more of DnaK, DnaJ, and GrpE was added.

GroEL，GroES存在下での酵母リンゴ酸脱水素酵素の合成
実施例5のタンパク質合成反応基本試薬に、実施例2で調製した分子シャペロンGroEL，GroESを最終濃度が，(1)0，0，(2) 0.063，0.125，(3) 0.125，0.25，(4) 0.25，0.5，(5) 0.5，1，(6) 1，2，(7) 2，4，(8) 3.6，7.2 μMとなるようにそれぞれ添加した。これらの反応溶液に、リンゴ酸脱水素酵素（Malate dehydrogenase (MDH)）の鋳型DNAを最終濃度が0.02 μMになるように添加した。37℃で2時間反応した後、各タンパク質合成反応液内のMDH活性をDiamant S. et al., J. Biol. Chem., 270, 28387-28391 (1995)に従って測定した。図5に、反応系に添加した各分子シャペロン濃度における合成されたMDHの活性を示す。この結果から、GroEL，GroESをそれぞれ0.5，1 μM以上添加した場合に、合成MDHの活性が最大となることが分かった。 Synthesis of yeast malate dehydrogenase in the presence of GroEL and GroES The final concentration of the molecular chaperone GroEL and GroES prepared in Example 2 was (1) 0, 0, ( 2) 0.063, 0.125, (3) 0.125, 0.25, (4) 0.25, 0.5, (5) 0.5, 1, (6) 1, 2, (7) 2, 4, (8) 3.6, 7.2 μM Were added respectively. To these reaction solutions, malate dehydrogenase (MDH) template DNA was added to a final concentration of 0.02 μM. After reacting at 37 ° C. for 2 hours, the MDH activity in each protein synthesis reaction solution was measured according to Diamant S. et al., J. Biol. Chem., 270, 28387-28391 (1995). FIG. 5 shows the activity of synthesized MDH at each molecular chaperone concentration added to the reaction system. From these results, it was found that the activity of synthetic MDH was maximized when GroEL and GroES were added at 0.5 and 1 μM or more, respectively.

ルシフェラーゼ活性上昇における分子シャペロンの種類特異性
実施例5のタンパク質合成反応基本試薬に、実施例2で調製した分子シャペロンDnaK，DnaJ，GrpE，GroEL，GroES，およびトリガーファクターを，最終濃度が(1)0，0，0，0，0，0，(2)4，2，2，0，0，0，(3)0，0，0，1，1，0，(4)0，0，0，0，0，5，(5)4，2，2，1，1，0，(6)4，2，2，0，0，5，(7)0，0，0，1，1，5，(8)4，2，2，1，1，5 μMとなるようにそれぞれ添加した。これらの反応溶液に、ルシフェラーゼの鋳型DNAを最終濃度が0.02 μMになるように添加した。30℃で1時間反応した後、各タンパク質合成反応液内のルシフェラーゼ活性をLuciferase Assay System（Promega社製）で測定した。図6に、反応系に添加した各分子シャペロン添加時の合成されたルシフェラーゼの活性を示す。この結果から、ルシフェラーゼの合成においては、GroEL，GroESの添加は阻害的に働くことが分かった。また、トリガーファクターの添加は、わずかに阻害的に働くことが分かった。 Specificity of type of molecular chaperone in increasing luciferase activity The molecular chaperone DnaK, DnaJ, Grop, GroEL, GroES, and trigger factor prepared in Example 2 were added to the basic reagent for the protein synthesis reaction of Example 5, and the final concentration was (1) 0, 0, 0, 0, 0, 0, (2) 4, 2, 2, 0, 0, 0, (3) 0, 0, 0, 1, 1, 0, (4) 0, 0, 0 , 0, 0, 5, (5) 4, 2, 2, 1, 1, 0, (6) 4, 2, 2, 0, 0, 5, (7) 0, 0, 0, 1, 1, 5, (8) 4, 2, 2, 1, 1, and 5 μM were added, respectively. To these reaction solutions, luciferase template DNA was added to a final concentration of 0.02 μM. After reacting at 30 ° C. for 1 hour, the luciferase activity in each protein synthesis reaction mixture was measured by Luciferase Assay System (Promega). FIG. 6 shows the activity of the synthesized luciferase when each molecular chaperone added to the reaction system is added. From this result, it was found that the addition of GroEL and GroES acts inhibitory in the synthesis of luciferase. It was also found that the addition of the trigger factor works slightly inhibitory.

リンゴ酸脱水素酵素活性上昇における分子シャペロンの種類特異性
実施例5のタンパク質合成反応基本試薬に、実施例2で調製した分子シャペロンDnaK，DnaJ，GrpE，GroEL，GroES，およびトリガーファクターを，最終濃度が(1)0，0，0，0，0，0，(2)4，2，2，0，0，0，(3)0，0，0，1，1，0，(4)0，0，0，0，0，5，(5)4，2，2，1，1，0，(6)4，2，2，0，0，5，(7)0，0，0，1，1，5，(8)4，2，2，1，1，5 μMとなるようにそれぞれ添加した。これらの反応溶液に、リンゴ酸脱水素酵素（MDH）の鋳型DNAを最終濃度が0.02 μMになるように添加した。37℃で1時間反応した後、各タンパク質合成反応液内のMDH活性をDiamant S. et al., J. Biol. Chem., 270, 28387-28391 (1995)に従って測定した。図6に、反応系に添加した各分子シャペロン添加時の合成された合成されたMDHの活性を示す。この結果から、リンゴ酸脱水素酵素の合成においては、DnaK，DnaJ，GrpE，トリガーファクターの添加はGroEL，GroESの添加効果に対して阻害的に働くことが分かった。一方、それぞれを単独で添加した場合は効果を示さなかった。 Specificity of molecular chaperone in increasing malate dehydrogenase activity The final concentration of the molecular chaperone DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL, GroES, and trigger factor prepared in Example 2 was used as the basic protein synthesis reaction reagent in Example 5. Is (1) 0, 0, 0, 0, 0, 0, (2) 4, 2, 2, 0, 0, 0, (3) 0, 0, 0, 1, 1, 1, 0, (4) 0 , 0, 0, 0, 0, 5, (5) 4, 2, 2, 1, 1, 0, (6) 4, 2, 2, 0, 0, 5, (7) 0, 0, 0, 1, 1, 5, (8) 4, 2, 2, 1, 1, and 5 μM were added, respectively. To these reaction solutions, malate dehydrogenase (MDH) template DNA was added to a final concentration of 0.02 μM. After reacting at 37 ° C. for 1 hour, the MDH activity in each protein synthesis reaction solution was measured according to Diamant S. et al., J. Biol. Chem., 270, 28387-28391 (1995). FIG. 6 shows the activity of the synthesized MDH when each molecular chaperone added to the reaction system is added. From this result, it was found that in the synthesis of malate dehydrogenase, the addition of DnaK, DnaJ, GrpE, and trigger factor acts to inhibit the effects of addition of GroEL and GroES. On the other hand, there was no effect when each was added alone.

蛍ルシフェラーゼの合成反応後にDnaK，DnaJ，GrpEを添加したときの蛍ルシフェラーゼ活性
実施例5のタンパク質合成反応基本試薬に、実施例2で調製した分子シャペロンDnaK，DnaJ，GrpEを最終濃度が、(1)0，0，0，(2)0，0，0，(3)4，2，2 μMとなるようにそれぞれ添加した。これらの反応溶液に、ルシフェラーゼ（luciferase）の鋳型DNAを最終濃度が0.02 μMになるように添加して30℃で1時間反応した。各反応液にクロラムフェニコールを最終濃度が35 μg/mlになるように添加して合成反応を停止させた後、(2)の反応液に分子シャペロンDnaK，DnaJ，GrpEを最終濃度が，それぞれ4，2，2 μMとなるように添加した。(1)〜(3)の反応液を30℃でさらに1時間反応した。合成直後および合成後1時間反応させた後の、各合成反応液内のルシフェラーゼ活性をLuciferase Assay System（Promega社製）で測定した。各反応液の合成直後および合成後1時間反応させた後の合成ルシフェラーゼの活性を図7に示す。この結果から，DnaK，DnaJ，GrpEを合成反応停止後に添加した場合でも，合成ルシフェラーゼの活性が明らかに上昇することが分かった。 Firefly luciferase activity when DnaK, DnaJ, GrpE was added after the synthesis reaction of firefly luciferase The final concentration of molecular chaperone DnaK, DnaJ, GrpE prepared in Example 2 was added to the basic protein synthesis reaction reagent of Example 5 (1 ) 0, 0, 0, (2) 0, 0, 0, (3) 4, 2, and 2 μM, respectively. To these reaction solutions, luciferase template DNA was added to a final concentration of 0.02 μM and reacted at 30 ° C. for 1 hour. After adding chloramphenicol to each reaction solution to a final concentration of 35 μg / ml and stopping the synthesis reaction, the molecular chaperones DnaK, DnaJ, and GrpE were added to the reaction solution in (2). They were added to 4, 2, and 2 μM, respectively. The reaction solutions (1) to (3) were further reacted at 30 ° C. for 1 hour. The luciferase activity in each synthesis reaction solution was measured with a Luciferase Assay System (Promega) immediately after synthesis and after reaction for 1 hour after synthesis. FIG. 7 shows the activity of synthetic luciferase immediately after synthesis of each reaction solution and after reaction for 1 hour after synthesis. From these results, it was found that the activity of synthetic luciferase was clearly increased even when DnaK, DnaJ, and GrpE were added after the synthesis reaction was stopped.

分子シャペロン存在下で合成したルシフェラーゼの反応液からの精製
実施例5のタンパク質合成反応基本試薬に、実施例2で調製した分子シャペロンDnaK，DnaJ，GrpEをそれぞれ最終濃度が4，2，2 μMとなるように添加した反応液および添加していない反応液に、ルシフェラーゼ（luciferase）の鋳型DNAを最終濃度が0.02 μMになるように添加した。30℃で1時間反応した後、20,000xgで30分間の遠心を行なって不溶性画分を沈殿させた。遠心の上清画分から、分子量100 kDa以下の物質を透過する限外ろ過膜（Millipore社製）を用いてリボソームを除去後、分子シャペロンを含む全てのHis-Tagが付加された反応刑構成成分をNi-NTA agarose（Qiagen社製）で吸着除去した。反応後、遠心の沈殿画分、遠心の上清画分、限外ろ過膜透過後、His-Tag付き成分除去後の反応液をそれぞれ10% SDS-PAGEに供し、SyproOrangeで染色した結果を図8に示す。左側が分子シャペロンを添加して合成した場合、右側が分子シャペロン非添加で合成した場合の結果であり、レーン6には、三角で示した合成ルシフェラーゼのバンドが確認できるのに対し、レーン10ではバンドがほとんど確認できない。この結果は、分子シャペロン添加反応液で合成した場合のみ、ルシフェラーゼが簡単に精製できることを示している。 Purification from the reaction solution of luciferase synthesized in the presence of molecular chaperone The molecular chaperones DnaK, DnaJ, and GrpE prepared in Example 2 were added to the basic reagents for the protein synthesis reaction of Example 5 at final concentrations of 4, 2, and 2 μM, respectively. The luciferase template DNA was added to the reaction solution added and not added so that the final concentration was 0.02 μM. After reacting at 30 ° C. for 1 hour, the insoluble fraction was precipitated by centrifugation at 20,000 × g for 30 minutes. A reaction component that contains all His-Tags including molecular chaperones after removing ribosomes from the supernatant fraction of the centrifugation using an ultrafiltration membrane (Millipore) that permeates a substance with a molecular weight of 100 kDa or less. Was removed by adsorption with Ni-NTA agarose (manufactured by Qiagen). After the reaction, the centrifugal precipitate fraction, the centrifugal supernatant fraction, the ultrafiltration membrane permeation, and the reaction solution after removing the component with His-Tag were each subjected to 10% SDS-PAGE and stained with SyproOrange. Shown in 8. When the left side is synthesized with the addition of a molecular chaperone, the right side is the result when synthesized without the addition of a molecular chaperone. In lane 6, the synthetic luciferase band indicated by a triangle can be confirmed, while in lane 10, I can hardly confirm the band. This result shows that luciferase can be easily purified only when synthesized in a reaction solution containing a molecular chaperone.

分子シャペロン存在下で合成したリンゴ酸脱水素酵素の反応液からの精製
実施例5のタンパク質合成反応基本試薬に、実施例2で調製した分子シャペロンGroEL，GroESをそれぞれ最終濃度が1，1 μMとなるように添加した反応液および添加していない反応液に、リンゴ酸脱水素酵素（MDH）の鋳型DNAを最終濃度が0.02 μMになるように添加した。37℃で2時間反応した後、20,000xgで30分間の遠心を行なって不溶性画分を沈殿させた。遠心の上清画分から、分子量100 kDa以下の物質を透過する限外ろ過膜（Millipore社製）を用いてリボソームを除去後、分子シャペロンを含む全てのHis-Tagが付加された反応系構成成分をNi-NTA agarose（Qiagen社製）で吸着除去した。反応後、遠心の沈殿画分、遠心の上清画分、限外ろ過膜透過後、His-Tag付き成分除去後の反応液をそれぞれ10% SDS-PAGEに供し、SyproOrangeで染色した結果を図9に示す。左側が分子シャペロンを添加して合成した場合、右側が分子シャペロン非添加で合成した場合の結果であり、レーン6には、三角で示した合成MDHのバンドが明瞭に確認できるのに対し、レーン10ではバンドがわずかしか確認できない。この結果は、分子シャペロン添加反応液で合成した場合に、MDHがより効率的に精製できることを示している。 Purification from the reaction solution of malate dehydrogenase synthesized in the presence of molecular chaperone The molecular chaperones GroEL and GroES prepared in Example 2 were added to the basic reagent for the protein synthesis reaction of Example 5 at a final concentration of 1, 1 μM, respectively. The template DNA of malate dehydrogenase (MDH) was added to the reaction solution added and not added so that the final concentration was 0.02 μM. After reacting at 37 ° C. for 2 hours, the insoluble fraction was precipitated by centrifugation at 20,000 × g for 30 minutes. Components of the reaction system in which all His-Tags including molecular chaperones are added after removing the ribosome from the supernatant fraction of the centrifugation using an ultrafiltration membrane (Millipore) that permeates a substance with a molecular weight of 100 kDa or less Was removed by adsorption with Ni-NTA agarose (manufactured by Qiagen). After the reaction, the centrifugal precipitate fraction, the centrifugal supernatant fraction, the ultrafiltration membrane permeation, and the reaction solution after removing the component with His-Tag were each subjected to 10% SDS-PAGE and stained with SyproOrange. Shown in 9. When the left side is synthesized with the addition of a molecular chaperone, the right side is the result when synthesized without the addition of a molecular chaperone, and the lane 6 clearly shows the synthetic MDH band indicated by the triangle, while the lane 6 10 shows only a few bands. This result shows that MDH can be purified more efficiently when synthesized in a reaction solution containing a molecular chaperone.

精製分子シャペロンの電気泳動図Electrophoretic diagram of purified molecular chaperone 精製分子シャペロンによる変性ルシフェラーゼの巻き戻し活性Unwinding activity of denatured luciferase by purified molecular chaperones 精製分子シャペロンによる変性クエン酸合成酵素の巻き戻し活性Unwinding activity of denatured citrate synthase by purified molecular chaperone 精製分子シャペロンの存在下でインビトロ合成されたルシフェラーゼの活性Activity of luciferase synthesized in vitro in the presence of purified molecular chaperone 精製分子シャペロンの存在下でインビトロ合成された酵母リンゴ酸脱水素酵素の活性Activity of yeast malate dehydrogenase synthesized in vitro in the presence of purified molecular chaperone ルシフェラーゼおよびリンゴ酸脱水素酵素活性上昇における分子シャペロンの種類特異性。なお、図面中のK/J/Eは、4 μM DnaK/2 μM DnaJ/2 μM GrpEを、EL/ESは、1 μM GroEL/1 μM GroESを、TFは、5 μM トリガーファクターを示す。-および+は、それぞれ各分子シャペロンの添加、未添加を示す。Specificity of molecular chaperones in luciferase and malate dehydrogenase activity. In the drawings, K / J / E represents 4 μM DnaK / 2 μM DnaJ / 2 μM GrpE, EL / ES represents 1 μM GroEL / 1 μM GroES, and TF represents a 5 μM trigger factor. -And + show the addition and non-addition of each molecular chaperone, respectively. 合成反応後に分子シャペロンを添加した場合のルシフェラーゼの活性Luciferase activity when a molecular chaperone is added after the synthesis reaction. 分子シャペロン存在下で合成したルシフェラーゼの反応液からの精製Purification of luciferase synthesized in the presence of molecular chaperone from the reaction mixture 分子シャペロン存在下で合成したリンゴ酸脱水素酵素の反応液からの精製Purification from malate dehydrogenase synthesized in the presence of molecular chaperones

Claims (24)

下記ａ）及びｂ）及びｃ）からなる反応系を用いたタンパク質のフォールディングを制御することが可能なin vitro転写・翻訳系によるタンパク質合成方法。
ａ） 目的とするタンパク質をコードする１または複数の鋳型核酸、
ｂ） 存在量及び純度がそれぞれ特定されている複数の成分からなり、鋳型核酸を添加することにより鋳型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じる、タンパク質合成反応基本試薬、
ｃ） 存在量及び純度が特定されている1または複数の分子シャペロン A protein synthesis method using an in vitro transcription / translation system capable of controlling protein folding using a reaction system comprising the following a), b) and c).
a) one or more template nucleic acids encoding the protein of interest,
b) a basic reagent for protein synthesis reaction, comprising a plurality of components each having an abundance and purity specified, wherein the synthesis reaction of the protein encoded by the template nucleic acid occurs by adding the template nucleic acid;
c) One or more molecular chaperones whose abundance and purity are specified タンパク質合成基本試薬が、リボソーム、開始因子類、延長因子類、終結因子類、アミノアシルtRNAシンテターゼ、メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ類、tRNA類、アミノ酸類、リボヌクレオチド３リン酸類、10-フォルミル5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸（FD）、塩類、及び水を含むことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質合成方法。   Basic reagents for protein synthesis include ribosomes, initiation factors, elongation factors, termination factors, aminoacyl tRNA synthetases, methionyl tRNA transformylases, tRNAs, amino acids, ribonucleotide triphosphates, 10-formyl 5,6, The protein synthesis method according to claim 1, comprising 7,8-tetrahydrofolic acid (FD), salts, and water. 分子シャペロンがタンパク質のフォールディングや不可逆的変性の抑制に関与している一連のタンパク質であることを特徴とする請求項１及び２に記載のタンパク質合成方法。   3. The protein synthesis method according to claim 1 or 2, wherein the molecular chaperone is a series of proteins involved in suppression of protein folding and irreversible denaturation. 分子シャペロンがHsp60ファミリー、Hsp70ファミリー、Hsp90ファミリー、Hsp100ファミリー、低分子量Hspファミリー及びイソメラーゼ類及びこれらの補助因子から選ばれることを特徴とする請求項１〜３記載のタンパク質合成方法。   4. The protein synthesis method according to claim 1, wherein the molecular chaperone is selected from the Hsp60 family, the Hsp70 family, the Hsp90 family, the Hsp100 family, the low molecular weight Hsp family, isomerases and their cofactors. 分子シャペロンが次の（１）〜（７）から選ばれることを特徴とする請求項１〜４記載のタンパク質合成方法。
（１）GroEL及びGroES、
（２）DnaK、DnaJ及びGrpE、
（３）TF、
（４）GroEL及びGroES、並びにDnaK、DnaJ及びGrpE、
（５）TF並びにGroEL及びGroES、
（６）TF並びにDnaK、DnaJ及びGrpE、
（７）TF並びにGroEL及びGroES並びにDnaK、DnaJ及びGrpE 5. The protein synthesis method according to claim 1, wherein the molecular chaperone is selected from the following (1) to (7).
(1) GroEL and GroES,
(2) DnaK, DnaJ and GrpE,
(3) TF,
(4) GroEL and GroES, and DnaK, DnaJ and GrpE,
(5) TF, GroEL and GroES,
(6) TF and DnaK, DnaJ and GrpE,
(7) TF, GroEL and GroES, DnaK, DnaJ and GrpE 分子シャペロンが（１）GroEL及びGroES、並びに（２）DnaK、DnaJ及びGrpE、並びに（３）TFからなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜４記載のタンパク質合成方法。   5. The protein synthesis method according to claim 1, wherein the molecular chaperone is selected from the group consisting of (1) GroEL and GroES, (2) DnaK, DnaJ and GrpE, and (3) TF. 分子シャペロンの濃度がそれぞれ０．０１〜１５μMであることを特徴とする請求項５〜６記載のタンパク質合成方法。   The protein synthesis method according to claim 5, wherein the concentration of the molecular chaperone is 0.01 to 15 μM. タンパク質合成反応基本試薬には分子シャペロンが含まれないことを特徴とする請求項１〜７いずれか1項に記載のタンパク質合成方法。   The protein synthesis method according to any one of claims 1 to 7, wherein the protein synthesis reaction basic reagent does not contain a molecular chaperone. 分子シャペロンがラベル化されていることを特徴とする請求項1〜８いずれか1項に記載のタンパク質合成方法。   The protein synthesis method according to any one of claims 1 to 8, wherein a molecular chaperone is labeled. ラベル化された分子シャペロンが次の（１）〜（７）から選ばれることを特徴とする請求項９記載のタンパク質合成方法。
（１）GroEL及びGroES、
（２）DnaK、DnaJ及びGrpE、
（３）TF、
（４）GroEL及びGroES、並びにDnaK、DnaJ及びGrpE、
（５）TF並びにGroEL及びGroES、
（６）TF並びにDnaK、DnaJ及びGrpE、
（７）TF並びにGroEL及びGroES並びにDnaK、DnaJ及びGrpE 10. The protein synthesis method according to claim 9, wherein the labeled molecular chaperone is selected from the following (1) to (7).
(1) GroEL and GroES,
(2) DnaK, DnaJ and GrpE,
(3) TF,
(4) GroEL and GroES, and DnaK, DnaJ and GrpE,
(5) TF, GroEL and GroES,
(6) TF and DnaK, DnaJ and GrpE,
(7) TF, GroEL and GroES, DnaK, DnaJ and GrpE ラベル化された分子シャペロンがタンパク質合成終了後に反応系から除去できる、請求項９〜１０記載のタンパク質合成方法。   The protein synthesis method according to claim 9 to 10, wherein the labeled molecular chaperone can be removed from the reaction system after completion of protein synthesis. 下記a)及びb)及びc)からなる反応系において、分子シャペロンの種類及び/または濃度及び/または添加条件を変化させて、フォールディングが制御されるタンパク質を合成し、当該タンパク質の活性を測定することにより当該タンパク質の活性と分子シャペロンの相関を検証する方法。
ａ）目的とするタンパク質をコードする１または複数の鋳型核酸、
ｂ）存在量及び純度がそれぞれ特定されている複数の成分からなり、鋳型核酸を添加することにより鋳型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じる、タンパク質合成反応基本試薬、
ｃ）存在量及び純度が特定されている1または複数の分子シャペロン In the reaction system consisting of a) and b) and c) below, the type and / or concentration and / or addition conditions of the molecular chaperone are changed to synthesize a protein whose folding is controlled, and measure the activity of the protein. To verify the correlation between the activity of the protein and the molecular chaperone.
a) one or more template nucleic acids encoding the protein of interest,
b) a protein synthesis reaction basic reagent comprising a plurality of components each having an abundance and purity specified, wherein a synthesis reaction of the protein encoded by the template nucleic acid occurs by adding the template nucleic acid;
c) one or more molecular chaperones whose abundance and purity are specified タンパク質合成基本試薬が、リボソーム、開始因子類、延長因子類、終結因子類、アミノアシルtRNAシンテターゼ、メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ類、tRNA類、アミノ酸類、リボヌクレオチド３リン酸類、10-フォルミル5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸（FD）、塩類、及び水を含むことを特徴とする請求項１２記載の検証方法。   Basic reagents for protein synthesis include ribosomes, initiation factors, elongation factors, termination factors, aminoacyl tRNA synthetases, methionyl tRNA transformylases, tRNAs, amino acids, ribonucleotide triphosphates, 10-formyl 5,6, The verification method according to claim 12, comprising 7,8-tetrahydrofolic acid (FD), salts, and water. 分子シャペロンがタンパク質のフォールディングや不可逆的変性の抑制に関与している一連のタンパク質であることを特徴とする請求項１２又は１３記載の検証方法。   14. The verification method according to claim 12 or 13, wherein the molecular chaperone is a series of proteins involved in suppression of protein folding and irreversible denaturation. 分子シャペロンがHsp60ファミリー、Hsp70ファミリー、Hsp90ファミリー、Hsp100ファミリー、低分子量Hspファミリー及びイソメラーゼ類及びこれらの補助因子から選ばれることを特徴とする請求項１２〜１４記載の検証方法。   15. The verification method according to claim 12, wherein the molecular chaperone is selected from the Hsp60 family, the Hsp70 family, the Hsp90 family, the Hsp100 family, the low molecular weight Hsp family and isomerases and their cofactors. 分子シャペロンが次の（１）から（７）から選択されることを特徴とする請求項１２〜１５いずれか1項記載の検証方法。
（１）GroEL及びGroES、
（２）DnaK、DnaJ及びGrpE、
（３）TF、
（４）GroEL及びGroES、並びにDnaK、DnaJ及びGrpE、
（５）TF並びにGroEL及びGroES、
（６）TF並びにDnaK、DnaJ及びGrpE、
（７）TF並びにGroEL及びGroES並びにDnaK、DnaJ及びGrpE The verification method according to any one of claims 12 to 15, wherein the molecular chaperone is selected from the following (1) to (7).
(1) GroEL and GroES,
(2) DnaK, DnaJ and GrpE,
(3) TF,
(4) GroEL and GroES, and DnaK, DnaJ and GrpE,
(5) TF, GroEL and GroES,
(6) TF and DnaK, DnaJ and GrpE,
(7) TF, GroEL and GroES, DnaK, DnaJ and GrpE 分子シャペロンが（１）GroEL及びGroES並びに（２）DnaK、DnaJ及びGrpE並びに（３）TFからなる群から選ばれることを特徴とする請求項1２〜１５いずれか1項記載の検証方法。   16. The verification method according to any one of claims 12 to 15, wherein the molecular chaperone is selected from the group consisting of (1) GroEL and GroES, (2) DnaK, DnaJ and GrpE, and (3) TF. 分子シャペロンの濃度がそれぞれ０．０１〜１５μMであることを特徴とする請求項１２〜１７いずれか1項記載の検証方法。   18. The verification method according to claim 12, wherein the concentration of the molecular chaperone is 0.01 to 15 μM. タンパク質合成反応基本試薬には分子シャペロンが含まれないことを特徴とする請求項１２〜１８いずれか1項記載の検証方法。   19. The verification method according to any one of claims 12 to 18, wherein the protein synthesis reaction basic reagent does not contain a molecular chaperone. 以下のa）及びｂ）からなるタンパク質のフォールディングを制御することが可能なin vitro転写・翻訳キット。
ａ) 存在量および純度がそれぞれ特定されている成分からなり、鋳型核酸を添加することにより鋳型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じるタンパク質合成反応基本試薬、
ｂ) 存在量及び純度が特定されている1または複数の分子シャペロン An in vitro transcription / translation kit capable of controlling protein folding comprising the following a) and b).
a) a basic reagent for a protein synthesis reaction comprising components each having a specified abundance and purity, wherein a synthesis reaction of a protein encoded by the template nucleic acid is generated by adding the template nucleic acid;
b) one or more molecular chaperones whose abundance and purity are specified 分子シャペロンがラベル化されていることを特徴とする請求項２０記載のin vitro転写・翻訳キット。   The in vitro transcription / translation kit according to claim 20, wherein the molecular chaperone is labeled. ラベル化された分子シャペロンが次の（１）から（７）から選ばれることを特徴とする請求項２１記載のin vitro転写・翻訳キット。
（１）GroEL及びGroES、
（２）DnaK、DnaJ及びGrpE、
（３）TF、
（４）GroEL及びGroES、並びにDnaK、DnaJ及びGrpE、
（５）TF並びにGroEL及びGroES、
（６）TF並びにDnaK、DnaJ及びGrpE、
（７）TF並びにGroEL及びGroES並びにDnaK、DnaJ及びGrpE The in vitro transcription / translation kit according to claim 21, wherein the labeled molecular chaperone is selected from the following (1) to (7).
(1) GroEL and GroES,
(2) DnaK, DnaJ and GrpE,
(3) TF,
(4) GroEL and GroES, and DnaK, DnaJ and GrpE,
(5) TF, GroEL and GroES,
(6) TF and DnaK, DnaJ and GrpE,
(7) TF, GroEL and GroES, DnaK, DnaJ and GrpE ラベル化された分子シャペロンがGroEL、GroES、DnaK、DnaJ、GrpE及びTFからなる群から選ばれることを特徴とする請求項２１記載のin vitro転写・翻訳キット。   The in vitro transcription / translation kit according to claim 21, wherein the labeled molecular chaperone is selected from the group consisting of GroEL, GroES, DnaK, DnaJ, GrpE and TF. ラベル化された分子シャペロンがタンパク質の合成後に反応系から除去できる、請求項２０〜２３いずれか１項記載のin vitro転写・翻訳キット。   The in vitro transcription / translation kit according to any one of claims 20 to 23, wherein the labeled molecular chaperone can be removed from the reaction system after protein synthesis.
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Cited By (3)

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JP2017532063A (en) * 2013-09-25 2017-11-02 イデア ツリー， リミテッド ライアビリティ カンパニー Protein isolation
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015025865A1 (en) * 2013-08-21 2015-02-26 独立行政法人科学技術振興機構 Enzyme storage solution and reaction solution for reconstructed cell-free translation system using same
JP2017532063A (en) * 2013-09-25 2017-11-02 イデア ツリー， リミテッド ライアビリティ カンパニー Protein isolation
EP3197922A4 (en) * 2013-09-25 2018-02-28 Idea Trea, LLC Protein isolation
JP7426764B1 (en) 2023-06-05 2024-02-02 ＮＵＰｒｏｔｅｉｎ株式会社 Protein production methods, cultured meat production methods, additives used in cultured meat production methods, and kits used in protein production methods

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