JP2006340610A - Method for testing inhibition of transportation ability of transporter substrate of medicine transportation - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、被験化合物が有する、複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターを介した薬物相互作用を評価するための、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害試験方法等に関する。 The present invention relates to a method for testing inhibition of drug transport transporter substrate transport ability in cells in the presence of a test compound, for evaluating drug interaction via a drug transport transporter having a plurality of Km values possessed by the test compound Etc.
一般に、医薬品等の薬物の有効成分となる新規化学物質においては、その薬効評価と同時にその安全性評価に際して、薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害に関する試験を実施し、当該化学物質が与える、薬物輸送トランスポーターによる当該トランスポーター基質を輸送する能力への影響を評価することが求められている。これは、新規化学物質が有する、薬物輸送トランスポーターを介した薬物相互作用を評価するためである（例えば、非特許文献１及び２等参照）。 In general, in the case of a new chemical substance that is an active ingredient of a drug, such as a pharmaceutical product, a drug transport transporter substrate transport ability test is conducted at the same time as the safety evaluation of the drug, and the drug given by the chemical substance. There is a need to evaluate the impact of transport transporters on the ability to transport the transporter substrate. This is for evaluating the drug interaction through the drug transport transporter possessed by the novel chemical substance (see, for example, Non-Patent Documents 1 and 2).
しかしながら、従来の試験方法では、このような化学物質の薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害に係る評価において、薬物輸送トランスポーターの種類によっては必ずしも十分な評価結果が得られるものではなく、より一層精密な評価結果を得るための試験方法が求められていた。 However, in the conventional test method, in the evaluation relating to the inhibition of the drug transport transporter substrate transport ability of such a chemical substance, a sufficient evaluation result is not necessarily obtained depending on the type of the drug transport transporter, and much more. There has been a demand for a test method for obtaining precise evaluation results.
本発明者等は、かかる状況下において鋭意検討した結果、被験化合物が有する、複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターを介した薬物相互作用を評価するための、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定する手法を確立することに成功し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．被験化合物が有する、複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターを介した薬物相互作用を評価するための、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害試験方法であって、
（１）細胞における薬物輸送トランスポーター基質の濃度の数を前記トランスポーターが有するＫｍ値の数に一致するように設定する第一工程、及び
（２）前記基質の濃度別に、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定する第二工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明試験方法と記すこともある。）；
２．第一工程において、細胞における薬物輸送トランスポーター基質の濃度を、当該濃度が濃度順にＫｍ値と交互に順列されるように設定することを特徴とする前項１記載の方法；
３．薬物輸送トランスポーターがＯＡＴＰ−Ｃであることを特徴とする前項１又は２記載の方法；
４．薬物輸送トランスポーター基質がestrone-3-sulfateであることを特徴とする前項１、２又は３記載の方法；
５．複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターにおける反応部位での被験化合物が有する阻害能を評価する方法であって、
（１）細胞における薬物輸送トランスポーター基質の濃度の数を前記トランスポーターが有するＫｍ値の数に一致するように設定する第一工程、
（２）前記基質の濃度別に、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定する第二工程、及び
（３）前記工程で測定された濃度別での阻害度に基づき、各Ｋｍ値に対応する反応部位での被験化合物が有する前記阻害能を評価する第三工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明評価方法と記すこともある。）；
６．第一工程において、細胞における薬物輸送トランスポーター基質の濃度を、当該濃度が濃度順にＫｍ値と交互に順列されるように設定することを特徴とする前項５記載の方法；
７．薬物輸送トランスポーターがＯＡＴＰ−Ｃであることを特徴とする前項５又は６記載の方法；
８．薬物輸送トランスポーター基質がestrone-3-sulfateであることを特徴とする前項５、６又は７記載の方法；
等を提供するものである。
As a result of intensive studies under such circumstances, the present inventors have found that the test compound has a plurality of Km values in a cell in the presence of the test compound for evaluating the drug interaction via the drug transport transporter. The present inventors have succeeded in establishing a technique for measuring the degree of inhibition of drug transport transporter substrate transport ability, and have reached the present invention.
That is, the present invention
1. A test method for evaluating a drug transport transporter substrate transport ability in a cell in the presence of a test compound for evaluating a drug interaction through a drug transport transporter having a plurality of Km values possessed by the test compound,
(1) a first step of setting the number of drug transport transporter substrate concentrations in the cell to match the number of Km values of the transporter, and (2) depending on the substrate concentration, in the presence of a test compound. A method having a second step of measuring the degree of inhibition of the drug transporter transporter substrate transport ability in the cells (hereinafter also referred to as the test method of the present invention);
2. The method according to item 1 above, wherein in the first step, the concentration of the drug transport transporter substrate in the cell is set so that the concentration is alternately permuted with the Km value in the order of concentration;
3. 3. The method according to item 1 or 2 above, wherein the drug transporter is OATP-C;
4). [4] The method according to [1], [2] or [3] above, wherein the drug transport transporter substrate is estrone-3-sulfate;
5. A method for evaluating the inhibitory ability of a test compound at a reaction site in a drug transport transporter having a plurality of Km values,
(1) a first step of setting the number of drug transport transporter substrate concentrations in a cell to match the number of Km values possessed by the transporter;
(2) a second step of measuring the degree of inhibition of drug transport transporter substrate transport ability in cells in the presence of the test compound for each concentration of the substrate, and (3) the degree of inhibition by concentration measured in the step And a third step of evaluating the inhibitory ability of the test compound at the reaction site corresponding to each Km value (hereinafter, sometimes referred to as the evaluation method of the present invention);
6). 6. The method according to item 5 above, wherein in the first step, the concentration of the drug transport transporter substrate in the cell is set so that the concentration is alternately permuted with the Km value in the order of concentration;
7). The method according to 5 or 6 above, wherein the drug transporter is OATP-C;
8). 8. The method according to 5, 6, or 7 above, wherein the drug transport transporter substrate is estrone-3-sulfate;
Etc. are provided.
本発明により、被験化合物が有する、複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターを介した薬物相互作用を評価するための、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定することが可能となる。 According to the present invention, the degree of inhibition of drug transport transporter substrate transport ability in a cell in the presence of a test compound for evaluating drug interaction via a drug transport transporter having a plurality of Km values possessed by the test compound. It becomes possible to measure.
本発明試験方法は、被験化合物が有する、複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターを介した薬物相互作用を評価するための、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害試験方法であって、
（１）細胞における薬物輸送トランスポーター基質の濃度の数を前記トランスポーターが有するＫｍ値の数に一致するように設定する第一工程、及び
（２）前記基質の濃度別に、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定する第二工程
を有することを特徴とする試験方法であり、当該試験方法では、薬物輸送トランスポーターにおける各反応部位での被験化合物が有する阻害能を区別して測定することができ、さらにはそれを評価することができるという新規な知見に基づいて見出されたものである。
The test method of the present invention is to inhibit the drug transport transporter substrate transport ability in cells in the presence of a test compound in order to evaluate the drug interaction through the drug transport transporter having a plurality of Km values possessed by the test compound. A test method,
(1) a first step of setting the number of drug transport transporter substrate concentrations in the cell to match the number of Km values of the transporter, and (2) depending on the substrate concentration, in the presence of a test compound. A test method characterized by having a second step of measuring the degree of inhibition of the drug transport transporter substrate transport ability in the cells of the test substance, wherein the test compound at each reaction site in the drug transport transporter has It has been found based on the novel finding that the ability to distinguish and measure the inhibitory ability can be further evaluated.
本発明試験方法で測定の対象となる被験化合物は、いかなる化合物であってもよいが、好ましくは、例えば、薬物輸送トランスポーター基質輸送能に対しての阻害作用を有するような化合物等を挙げることができる。具体的には例えば、薬物輸送トランスポーターがＯＡＴＰ−Ｃ（Organic Anion Transporting Polypeptide-C、薬物輸送トランスポーターの一種であり、肝臓特異的に発現し、様々な物質の肝臓内への取り込みに関与している膜輸送タンパク質である。LST-1、OATP2、SLC21A6、SLCO1B1、OATP1B1とも称される。）である場合には、estrone-3-sulfate（エストラジオールの代謝産物であり、エストラジオールの３位に硫酸が抱合した物質である。）と類似する化学構造、立体構造等を有するような化合物、を挙げることができる。 The test compound to be measured by the test method of the present invention may be any compound, but preferably includes, for example, a compound having an inhibitory action on the drug transport transporter substrate transport ability. Can do. Specifically, for example, a drug transporter is OATP-C (Organic Anion Transporting Polypeptide-C, a kind of drug transporter), which is expressed specifically in the liver and is involved in the incorporation of various substances into the liver. LST-1, OATP2, SLC21A6, SLCO1B1, and OATP1B1. And a compound having a chemical structure, a three-dimensional structure, and the like similar to those in (1).
「複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーター」（以下、本トランスポーターと記すこともある。）とは、複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターであれば、いかなるものであってもよい。ここで「薬物輸送トランスポーター」とは、内在性物質や生体異物等を細胞外から細胞内へ、又は、細胞内から細胞外へ運搬する膜輸送タンパク質を意味し、また「Ｋｍ値」とは、酵素と基質との解離平衡の式における定数であり、ミカエリス定数とも呼ばれているものを意味する。Ｋｍ値は、反応速度Ｖを以下の式で表したときの、Ｖ＝Ｖmax／２となるときの基質濃度であり、Ｋｍが小さいほど、その酵素が作用する基質との親和性が高いことを示している。
Ｖ＝Ｖmax／（１＋Ｋｍ／Ｃ）（Ｖmax：最大速度、Ｃ：基質濃度）
例えば、２つのＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターの場合には、２つの反応部位を有しており、当該反応部位のうち一方の反応部位が高いaffinityかつ低いcapacityであり、他方の反応部位が低いaffinityかつ高いcapacityであることが一般的である。
薬物輸送トランスポーターの代表例としては、ＯＡＴＰ−Ｃ（２種のＫｍ値を有する）等を挙げることができる。
The “drug transporter having a plurality of Km values” (hereinafter sometimes referred to as the present transporter) may be any drug transporter having a plurality of Km values. Here, “drug transporter” means a membrane transport protein that transports endogenous substances, xenobiotics, etc. from the outside of the cell to the inside of the cell, or from the inside of the cell to the outside of the cell, and “Km value” means , Which is a constant in the equation of dissociation equilibrium between the enzyme and the substrate, and is also called the Michaelis constant. The Km value is the substrate concentration when V = Vmax / 2 when the reaction rate V is expressed by the following equation. The smaller the Km, the higher the affinity with the substrate on which the enzyme acts. Show.
V = Vmax / (1 + Km / C) (Vmax: maximum speed, C: substrate concentration)
For example, in the case of a drug transport transporter having two Km values, it has two reaction sites, one of the reaction sites has high affinity and low capacity, and the other reaction site has It is common to have low affinity and high capacity.
A typical example of the drug transporter is OATP-C (having two Km values).
本発明において「トランスポーターを介した薬物相互作用」（以下、本薬物相互作用と記すこともある。）とは、例えば、ある薬物の薬物輸送トランスポーターによる輸送活性が、別の薬物の存在により低下する現象を意味する。
本薬物相互作用を評価するための、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害試験とは、被験化合物の存在下において、細胞への基質の取り込みを測定し、測定された値を対照と比較することにより、当該被験化合物による前記取り込みに係る阻害度を算出するための試験である。
In the present invention, “drug interaction via transporter” (hereinafter sometimes referred to as “drug interaction”) means, for example, that the transport activity of a drug by the drug transport transporter depends on the presence of another drug. It means a phenomenon that decreases.
Inhibition test of drug transport transporter substrate transport ability in cells in the presence of test compound to evaluate this drug interaction is measured by measuring substrate uptake into cells in the presence of test compound. This is a test for calculating the degree of inhibition related to the uptake by the test compound by comparing the measured value with the control.
本発明試験方法の第一工程では、細胞における薬物輸送トランスポーター基質の濃度の数を前記トランスポーターが有するＫｍ値の数に一致するように設定する。
本発明において「細胞における薬物輸送トランスポーター基質」（以下、本基質と記すこともある。）とは、細胞における薬物輸送トランスポーターが認識することにより、細胞外から細胞内へ、又は、細胞内から細胞外へ輸送される化合物を意味する。
薬物輸送トランスポーター基質の代表例としては、例えば、薬物輸送トランスポーターがＯＡＴＰ−Ｃである場合には、estrone-3-sulfate等を挙げることができる。
本濃度の数を本トランスポーターが有するＫｍ値の数に一致するように設定するには、例えば、本トランスポーターが有するＫｍ値の数を当該技術分野における通常の方法に従って測定することにより決定し、決定されたＫｍ値の数に一致するように薬物輸送トランスポーター基質の濃度の数を設定すればよい。
具体的には例えば、２つのＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターの場合には、前記の如く、２つの反応部位を有しており、当該反応部位のうち一方の反応部位（以下、ポケットＡと記す。）が高いaffinityかつ低いcapacityであり、他方の反応部位（以下、ポケットＢと記す。）が低いaffinityかつ高いcapacityであることが一般的である。ポケットＡにおけるＫｍ値、Ｖmax値をＫｍ1、Ｖmax1とし、またポケットＢにおけるＫｍ値、Ｖmax値をＫｍ2、Ｖmax2とした場合には、ポケットＡにおける反応速度はＶ1＝（Ｖmax1×Ｃ）／（Ｋｍ1＋Ｃ）となり、またポケットＢにおける反応速度はＶ2＝（Ｖmax2×Ｃ）／（Ｋｍ2＋Ｃ）となり、さらにトータルの反応速度はＶtotal＝［Ｖmax1／（Ｋｍ1＋Ｃ）＋Ｖmax2／（Ｋｍ2＋Ｃ）］×Ｃと表される。ここでＫｍ値の数「２」に一致するように薬物輸送トランスポーター基質の濃度の数を「２」に設定し、それぞれをＣ1及びＣ2とすればよい。
In the first step of the test method of the present invention, the number of drug transport transporter substrate concentrations in the cell is set to match the number of Km values possessed by the transporter.
In the present invention, “drug transport transporter substrate in a cell” (hereinafter sometimes referred to as “the substrate”) refers to a drug transport transporter in a cell that recognizes the cell from outside the cell or inside the cell. Means a compound that is transported from the cell to the outside of the cell.
As a typical example of the drug transport transporter substrate, for example, when the drug transport transporter is OATP-C, estrone-3-sulfate and the like can be mentioned.
In order to set the number of this concentration to match the number of Km values possessed by this transporter, for example, the number of Km values possessed by this transporter is determined by measuring according to a usual method in the art. The number of drug transport transporter substrate concentrations may be set to coincide with the determined number of Km values.
Specifically, for example, in the case of a drug transporter having two Km values, as described above, it has two reaction sites, and one of the reaction sites (hereinafter referred to as pocket A and the like). In general, it is high affinity and low capacity, and the other reaction site (hereinafter referred to as pocket B) has low affinity and high capacity. When the Km value and Vmax value in pocket A are Km1 and Vmax1, and the Km value and Vmax value in pocket B are Km2 and Vmax2, the reaction rate in pocket A is V1 = (Vmax1 × C) / (Km1 + C). The reaction rate in pocket B is V2 = (Vmax2 × C) / (Km2 + C), and the total reaction rate is expressed as Vtotal = [Vmax1 / (Km1 + C) + Vmax2 / (Km2 + C)] × C. Here, the number of drug transport transporter substrate concentrations may be set to “2” so as to coincide with the number of Km values “2”, and each may be C1 and C2.
第一工程において、細胞における薬物輸送トランスポーター基質の濃度を、当該濃度が濃度順にＫｍ値と交互に順列されるように設定することが好ましい。
具体的には例えば、２つのＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターの場合には、前記のＣ1を「Ｃ1＜Ｋｍ1」となるように設定し、かつ、前記のＣ2を「Ｋｍ1＜Ｃ2＜Ｋｍ2」となるように設定すればよい。
In the first step, the concentration of the drug transport transporter substrate in the cell is preferably set so that the concentration is alternately permuted with the Km value in the order of concentration.
Specifically, for example, in the case of a drug transporter having two Km values, the C1 is set to satisfy “C1 <Km1”, and the C2 is set to “Km1 <C2 <Km2”. Should be set to be.
本発明試験方法の第二工程では、前記基質の濃度別に、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定する。
本発明において「被験化合物存在下」とは、当該阻害度を検討する際、薬物輸送トランスポーターによる前記基質の輸送能に与える被験化合物の影響を検討するために、前記基質と被験化合物を系内に共存させる状態を意味する。
細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定するには、適当な濃度の被験物質の存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能を被験物質非存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能とを比較すればよい。尚、ここで「適当な濃度」とは、例えば、被験物質が医薬品開発における新規化合物の場合には、臨床血中濃度を参考に設定すればよい。
In the second step of the test method of the present invention, the degree of inhibition of the drug transport transporter substrate transport ability in the cells in the presence of the test compound is measured for each concentration of the substrate.
In the present invention, “in the presence of a test compound” means that when examining the degree of inhibition, in order to examine the influence of a test compound on the transport ability of the substrate by a drug transport transporter, It means a state of coexisting with.
In order to measure the degree of inhibition of drug transport transporter substrate transport ability in cells, drug transport transporter substrate transport ability in cells in the presence of an appropriate concentration of test substance can be measured as drug transport in cells in the absence of test substance. What is necessary is just to compare with transporter substrate transport ability. Here, the “appropriate concentration” may be set with reference to the clinical blood concentration, for example, when the test substance is a new compound in drug development.
本発明評価方法は、複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターにおける各反応部位での被験化合物が有する阻害能を評価する方法であって、
（１）細胞における薬物輸送トランスポーター基質の濃度の数を前記トランスポーターが有するＫｍ値の数に一致するように設定する第一工程、
（２）前記基質の濃度別に、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定する第二工程、及び
（３）前記工程で測定された濃度別での阻害度に基づき、各Ｋｍ値に対応する反応部位での被験化合物が有する前記阻害能を評価する第三工程
を有することを特徴とする。
本発明評価方法の第一工程及び第二工程は、本発明試験方法の第一工程及び第二工程と同様であり、前記の説明等を参照すればよい。
本発明評価方法の第三工程では、前記工程（即ち、第二工程）で測定された濃度別での阻害度に基づき、各Ｋｍ値に対応する反応部位での被験化合物が有する前記阻害能を評価する。ここで「前記工程で測定された濃度別での阻害度に基づき、各Ｋｍ値に対応する反応部位での被験化合物が有する前記阻害能を評価する」には、各濃度での阻害度の変化の有無又はその程度を評価すればよい。その際には統計学的に有意であるかを検討することが好ましい。
The evaluation method of the present invention is a method for evaluating the inhibitory ability of a test compound at each reaction site in a drug transport transporter having a plurality of Km values,
(1) a first step of setting the number of drug transport transporter substrate concentrations in a cell to match the number of Km values possessed by the transporter;
(2) a second step of measuring the degree of inhibition of drug transport transporter substrate transport ability in cells in the presence of the test compound for each concentration of the substrate, and (3) the degree of inhibition by concentration measured in the step And the third step of evaluating the inhibitory ability of the test compound at the reaction site corresponding to each Km value.
The first step and the second step of the evaluation method of the present invention are the same as the first step and the second step of the test method of the present invention, and the above description and the like may be referred to.
In the third step of the evaluation method of the present invention, the inhibitory ability of the test compound at the reaction site corresponding to each Km value is based on the degree of inhibition for each concentration measured in the step (ie, the second step). evaluate. Here, “based on the degree of inhibition for each concentration measured in the above step, evaluate the inhibitory ability of the test compound at the reaction site corresponding to each Km value” is a change in the degree of inhibition at each concentration. What is necessary is just to evaluate the presence or absence or the degree. In that case, it is preferable to examine whether it is statistically significant.
本発明は、上記の知見や当該知見に基づいた本発明方法等を利用する種々の発明（例えば、被験化合物が有する、複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターを介した薬物相互作用を評価するための、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定するシステムや、そのためのプログラム等）を包含している。 The present invention evaluates drug interactions via a drug transport transporter having a plurality of Km values possessed by the above-described findings and the method of the present invention based on the findings (for example, a test compound having a plurality of Km values). A system for measuring the degree of inhibition of drug transport transporter substrate transport ability in cells in the presence of a test compound, a program therefor, and the like.
以下、本発明をより詳細に説明するため、実施例を挙げて説明するが本発明はこれらの例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
実施例１
OATP-C発現細胞として２つのＫｍ値（「Ｋｍ1」：94.0ｎＭ、「Ｋｍ2」：5.34μＭ）を有する薬物輸送トランスポーター（「Ｖｍax1」：0.151pmol/oocyte/30min、「Ｖｍax2」：0.751pmol/oocyte/30min）であるOATP-Cトランスポートサイト（OATP-Cを発現させたアフリカツメガエル卵母細胞、BD GENTEST社の登録商標）を、またコントロール細胞として水注入コントロール卵母細胞をBD GENTEST（USA）から購入して使用した。購入後はインキュベーター（設定温度：16℃）に入れ保管し、入手後４日以内に試験に使用した。
[３Ｈ]estrone-3-sulfate （PerkinElmer Life Sciences, Inc. (USA)より購入）およびestrone-3-sulfate（SIGMA-ALDRICH Corp. (USA)より購入）を各々Na+ buffer（組成：100mM のNaCl、2mM のKCl、1mM のMgCl２、1mM のCaCl２及び10mM のHEPES、pH 7.4）で希釈した後、これら化合物をモル量として1:100の割合で混合することにより、20mMの[３Ｈ] estrone-3-sulfate溶液を調製した（以下、溶液Ａと記す。）。また、[３Ｈ]estrone-3-sulfateをNa+ bufferで希釈することにより、200nMの[３Ｈ]estrone-3-sulfate溶液を調製した（以下、溶液Ｂと記す。）。
次いで、被験物質（阻害剤）であるプラバスタチン（和光純薬工業株式会社より購入）をNa+ bufferに溶解することにより、5556mMのプラバスタチン溶液を調製した（以下、溶液Ｃと記す。）。また、他の被験物質（阻害剤）であるシクロスポリンＡ（和光純薬工業株式会社より購入）をメタノールに溶解することにより、6667μMのシクロスポリンＡ溶液を調製した後、当該溶液をNa+ bufferで希釈することにより、約33.3μMのシクロスポリンＡ溶液を調製した（以下、溶液Ｄと記す。）。
[３Ｈ]estrone-3-sulfate溶液（溶液Ａまたは溶液Ｂ）と被験物質（阻害剤）溶液（溶液Ｃまたは溶液Ｄ）とを1:9 (v/v) の割合で混合することにより、基質溶液を調製した（[３Ｈ]estrone-3-sulfate濃度は20nM（＝「Ｃ1」）または2μM（＝「Ｃ2」）、プラバスタチン濃度は5mM、シクロスポリン濃度は30μM）。また、被験物質（阻害剤）溶液の代わりにNa+ bufferを用いること以外は同様な操作により、被験物質（阻害剤）を含まない基質溶液を調製した（[３Ｈ]estrone-3-sulfate濃度は20nM（＝「Ｃ1」）または2μM（＝「Ｃ2」））。
約１０個の前記OATP-Cトランスポートサイトを約0.5 mLのND96 medium（96mMのNaCl、2 mMのKCl、1.8mMのCaCl２、1mMのMgCl２、5mMのHepes/Trisおよび50 mg/LのGentamicin、pH 7.4）と共に5mL 容の試験管に移した。試験管内のND96 medium を吸引除去した後、すぐに室温のNa+ Buffer約3mL で3回洗浄した。3回目の洗浄を終えNa+ Bufferを除去した後、これに100μL の前記基質溶液を加えることにより、OATP-C発現細胞への[３Ｈ]estrone-3-sulfateの取り込み、即ち、薬物輸送トランスポーター基質輸送能を開始させた。室温で60分間インキュベートした後、基質溶液を除去することにより、前記取り込みを停止させた。これに約3mL のNa+ Buffer を加えて洗浄した後、再びNa+ Bufferを除去した。この洗浄操作を更に2回繰り返した後、OATP-Cトランスポートサイトを1 個ずつバイアルに取り分けた。各バイアルに 10% SDS sodium buffer を150mLずつ加えて得られる混合物を、室温で30分間以上放置することにより、OATP-Cトランスポートサイトを溶解させた。各バイアルに液体シンチレーションカクテルを約5mL入れ、混合した後、液体シンチレーションカウンターを用いて当該カクテル中の放射能を測定した。ネガティブコントロールとして、被験物質（阻害剤）を含まない基質溶液について、水注入コントロール卵母細胞を用いた前記同様な操作を行った。
OATP-C発現細胞への[３Ｈ]estrone-3-sulfateの取り込みに対する被験化合物（阻害剤）による阻害結果（即ち、細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送の阻害度）を図１および図２に示した。基質濃度が20nM（＝「Ｃ1」）であった場合、OATP-C発現細胞への[３Ｈ]estrone-3-sulfateの取り込みはプラバスタチン（阻害率：５９％）およびシクロスポリンＡ（阻害率：９３％）のいずれによっても阻害された（図１参照）。尚、阻害率は、被験物質（阻害剤）なしのときの当該取り込み活性と比較した値である。
基質濃度が2μM（＝「Ｃ2」）であった場合、OATP-C発現細胞への[３Ｈ]estrone-3-sulfateの取り込みはシクロスポリンＡによって阻害されたが（阻害率：86%）、プラバスタチンによっては阻害されなかった（図2参照）。即ち、シクロスポリンＡでは両濃度（＝「Ｃ1」及び「Ｃ2」）において前記取り込みが阻害されたことから、シクロスポリンＡはestrone-3-sulfateの高親和性反応部位（＝「ポケットＡ」）と低親和性反応部位（＝「ポケットＢ」）との両部位での阻害能を持つことが判明した。また、プラバスタチンは、基質濃度が20nM（＝「Ｃ1」）の場合に前記取り込みを阻害したが、一方、基質濃度が2μM（＝「Ｃ2」）の場合に前記取り込みを何ら阻害することなく影響を与えることはなかったことから、プラバスタチンはestrone-3-sulfateの高親和性反応部位（＝「ポケットＡ」）のみで阻害能を持つことが明らかとなった。
Example 1
OATP-C expressing cells as drug transport transporters (“Vmax1”: 0.151 pmol / oocyte / 30 min, “Vmax2”: 0.751 pmol /) having two Km values (“Km1”: 94.0 nM, “Km2”: 5.34 μM) oocyte / 30min) OATP-C transport site (Xenopus oocytes expressing OATP-C, registered trademark of BD GENTEST), and water-injected control oocytes as BD GENTEST (USA) ) Purchased from and used. After purchase, it was stored in an incubator (set temperature: 16 ° C.) and used for testing within 4 days after acquisition.
[ 3 H] estrone-3-sulfate (purchased from PerkinElmer Life Sciences, Inc. (USA)) and estrone-3-sulfate (purchased from SIGMA-ALDRICH Corp. (USA)) were each Na + buffer (composition: 100 mM NaCl). , 2 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , 1 mM CaCl 2 and 10 mM HEPES, pH 7.4) and then mixing these compounds in a molar ratio of 1: 100 to give 20 mM [ 3 H] An estrone-3-sulfate solution was prepared (hereinafter referred to as solution A). Further, [ 3 H] estrone-3-sulfate was diluted with Na + buffer to prepare a 200 nM [ 3 H] estrone-3-sulfate solution (hereinafter referred to as solution B).
Next, pravastatin (purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), which is a test substance (inhibitor), was dissolved in Na + buffer to prepare a 5556 mM pravastatin solution (hereinafter referred to as solution C). In addition, a 6667 μM cyclosporin A solution is prepared by dissolving cyclosporin A (purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), another test substance (inhibitor), in methanol, and then diluted with Na + buffer. Thus, an approximately 33.3 μM cyclosporin A solution was prepared (hereinafter referred to as solution D).
By mixing the [ 3 H] estrone-3-sulfate solution (solution A or solution B) and the test substance (inhibitor) solution (solution C or solution D) at a ratio of 1: 9 (v / v), A substrate solution was prepared ([ 3 H] estrone-3-sulfate concentration was 20 nM (= “C1”) or 2 μM (= “C2”), pravastatin concentration was 5 mM, and cyclosporine concentration was 30 μM. A substrate solution containing no test substance (inhibitor) was prepared in the same manner except that Na + buffer was used instead of the test substance (inhibitor) solution (the concentration of [ 3 H] estrone-3-sulfate was 20 nM (= “C1”) or 2 μM (= “C2”)).
About 10 OATP-C transport sites were added to about 0.5 mL of ND96 medium (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 , 5 mM Hepes / Tris and 50 mg / L Gentamicin, pH 7.4) and transferred to a 5 mL test tube. After ND96 medium in the test tube was removed by suction, it was immediately washed 3 times with about 3 mL of Na + Buffer at room temperature. After the third wash, Na + Buffer was removed, and then 100 μL of the substrate solution was added thereto, thereby incorporating [ 3 H] estrone-3-sulfate into OATP-C-expressing cells, that is, a drug transport transporter. The substrate transport ability was initiated. After incubation at room temperature for 60 minutes, the uptake was stopped by removing the substrate solution. About 3 mL of Na + Buffer was added thereto for washing, and then Na + Buffer was removed again. This washing operation was repeated two more times, and the OATP-C transport sites were separated into vials one by one. The mixture obtained by adding 150 mL of 10% SDS sodium buffer to each vial was allowed to stand at room temperature for 30 minutes or more to dissolve the OATP-C transport site. About 5 mL of liquid scintillation cocktail was placed in each vial and mixed, and then the radioactivity in the cocktail was measured using a liquid scintillation counter. As a negative control, a substrate solution containing no test substance (inhibitor) was subjected to the same operation as described above using water-injected control oocytes.
FIG. 1 and FIG. 2 show the results of inhibition by the test compound (inhibitor) on the uptake of [ 3 H] estrone-3-sulfate into OATP-C expressing cells (ie, the degree of inhibition of drug transport transporter substrate transport in the cells). Indicated. When the substrate concentration was 20 nM (= “C1”), uptake of [ 3 H] estrone-3-sulfate into cells expressing OATP-C was pravastatin (inhibition rate: 59%) and cyclosporin A (inhibition rate: 93). %) (See FIG. 1). The inhibition rate is a value compared with the uptake activity when there is no test substance (inhibitor).
When the substrate concentration was 2 μM (= “C2”), uptake of [ 3 H] estrone-3-sulfate into OATP-C-expressing cells was inhibited by cyclosporin A (inhibition rate: 86%), but pravastatin Was not inhibited (see FIG. 2). In other words, cyclosporin A inhibited the uptake at both concentrations (= “C1” and “C2”), so cyclosporin A has a high affinity reaction site (= “pocket A”) of estrone-3-sulfate and is low. It was found to have inhibitory ability at both sites with the affinity reaction site (= “Pocket B”). In addition, pravastatin inhibited the uptake when the substrate concentration was 20 nM (= “C1”), while pravastatin did not inhibit the uptake when the substrate concentration was 2 μM (= “C2”). It was revealed that pravastatin has an inhibitory ability only at the high-affinity reaction site (= “Pocket A”) of estrone-3-sulfate.
本発明により、被験化合物が有する、複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターを介した薬物相互作用を評価するための、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定することが可能となる。 According to the present invention, the degree of inhibition of drug transport transporter substrate transport ability in a cell in the presence of a test compound for evaluating drug interaction via a drug transport transporter having a plurality of Km values possessed by the test compound. It becomes possible to measure.
Claims (8)
（１）細胞における薬物輸送トランスポーター基質の濃度の数を前記トランスポーターが有するＫｍ値の数に一致するように設定する第一工程、
（２）前記基質の濃度別に、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定する第二工程
を有することを特徴とする方法。 A test method for evaluating a drug transport transporter substrate transport ability in a cell in the presence of a test compound for evaluating a drug interaction through a drug transport transporter having a plurality of Km values possessed by the test compound,
(1) a first step of setting the number of drug transport transporter substrate concentrations in a cell to match the number of Km values possessed by the transporter;
(2) A method comprising a second step of measuring the degree of inhibition of a drug transport transporter substrate transport ability in a cell in the presence of a test compound for each concentration of the substrate.
（１）細胞における薬物輸送トランスポーター基質の濃度の数を前記トランスポーターが有するＫｍ値の数に一致するように設定する第一工程、
（２）前記基質の濃度別に、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定する第二工程
（３）前記工程で測定された濃度別での阻害度に基づき、各Ｋｍ値に対応する反応部位での被験化合物が有する前記阻害能を評価する第三工程
を有することを特徴とする方法。 A method for evaluating the inhibitory ability of a test compound at each reaction site in a drug transport transporter having a plurality of Km values,
(1) a first step of setting the number of drug transport transporter substrate concentrations in a cell to match the number of Km values possessed by the transporter;
(2) Second step of measuring the degree of inhibition of drug transport transporter substrate transport ability in cells in the presence of a test compound for each concentration of the substrate (3) Based on the degree of inhibition by concentration measured in the step And a third step of evaluating the inhibitory ability of the test compound at the reaction site corresponding to each Km value.
8. The method of claim 5, 6 or 7, wherein the drug transport transporter substrate is estrone-3-sulfate.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP2005166579A JP2006340610A (en) | 2005-06-07 | 2005-06-07 | Method for testing inhibition of transportation ability of transporter substrate of medicine transportation |
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| JP2006340610A true JP2006340610A (en) | 2006-12-21 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012121261A1 (en) | 2011-03-10 | 2012-09-13 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | Method for screening for compound capable of enhancing or inhibiting oatp1b1 transport activity, and method for determining expression level of oatp1b1 |
-
2005
- 2005-06-07 JP JP2005166579A patent/JP2006340610A/en active Pending
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| WO2012121261A1 (en) | 2011-03-10 | 2012-09-13 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | Method for screening for compound capable of enhancing or inhibiting oatp1b1 transport activity, and method for determining expression level of oatp1b1 |
| US8945865B2 (en) | 2011-03-10 | 2015-02-03 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method for screening for compound capable of enhancing or inhibiting OATP1B1 transport activity, and method for determining expression level of OATP1B1 |
| JP5830085B2 (en) * | 2011-03-10 | 2015-12-09 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | Method for screening a compound that promotes or inhibits transport activity of OATP1B1, and method for measuring OATP1B1 expression level |
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