JP2006327991A - New method for purifying recombinant protein - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、組換えタンパク質を精製する方法、例えばカイコを用いて産生させた組換えタンパク質をカイコ体液から精製する方法に関し、硫酸エステルを結合させたクロマトグラフィー担体を用いたアフィニティークロマトグラフィー精製、または陽イオン交換クロマトグラフィーを用いた精製工程に次いで硫酸エステルを結合させたクロマトグラフィー担体を用いたアフィニティークロマトグラフィー精製の両方より精製する方法に関する。 The present invention relates to a method for purifying a recombinant protein, for example, a method for purifying a recombinant protein produced using a silkworm from a silkworm body fluid, affinity chromatography purification using a chromatographic carrier to which a sulfate ester is bound, or The present invention relates to a purification method using both a purification step using cation exchange chromatography and affinity chromatography purification using a chromatographic carrier to which sulfate ester is bound.
現在バキュロウイルスベクターによる組換えタンパク質の発現系が広く医薬品等の有用タンパク質の生産方法として利用されている。バキュロウイルス系は、培養昆虫細胞のみならず、昆虫の個体そのものを用いても有用な組換えタンパク質を発現させることが可能である。昆虫個体を用いた場合、培養細胞を用いた場合に比べ、より低コストでかつ効率的に組換えタンパク質を生産することができる。特に、カイコは大量飼育の技術が確立しているため、有用な組換えタンパク質を生産する昆虫工場として用いられている（特許文献１参照）。 Currently, recombinant protein expression systems using baculovirus vectors are widely used as methods for producing useful proteins such as pharmaceuticals. The baculovirus system can express useful recombinant proteins not only using cultured insect cells but also using insect individuals themselves. When an insect individual is used, a recombinant protein can be produced more efficiently and at a lower cost than when cultured cells are used. In particular, silkworms are used as insect factories that produce useful recombinant proteins because they have established techniques for mass breeding (see Patent Document 1).
カイコ個体を用いて生産した組換えタンパク質は、カイコの体液から精製する必要がある。しかし、カイコの体液は粘性が高くまた不純物も非常に多く含まれているため、精製に多数の工程を要し、最終的な収率を高くすることも容易ではなかった。特に、肝細胞増殖因子（以下、HGFと略す）をはじめとする有用タンパク質については、カイコ由来の夾雑タンパク質の影響により医薬品として使用するために十分な高度な精製方法は確立されていなかった。
本発明は、少ない工程数で組換えタンパク質を精製し、例えば組換えタンパク質を含むカイコ体液から少ない工程数で組換えタンパク質を精製し、医薬品として使用するために充分な純度の高い組換えタンパク質を高収率で得る方法を提供する。 The present invention purifies a recombinant protein with a small number of steps, for example, purifies a recombinant protein with a small number of steps from a silkworm body fluid containing the recombinant protein, and provides a recombinant protein with a sufficiently high purity for use as a pharmaceutical product. A method for obtaining a high yield is provided.
本発明者らは、組換えHGFを精製する方法について鋭意検討を行い、先にヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いた精製、ヘパリンカラムクロマトグラフィーを用いた精製を組合せた精製法により、高純度の組換えタンパク質を高収率で得ることができることを見出した（特願2003-412122）。しかし、市販のヘパリンカラムは、ブタ小腸由来のヘパリンを用いているものが多く、精製工程でヘパリンがカラム担体から脱落し、精製品に混入するおそれがあった。BSEの問題等から、医薬品製造に生物由来物質を用いることも困難であり、生物由来物質を用いずにHGFを精製する方法が望まれていた。 The present inventors have intensively studied a method for purifying recombinant HGF, and by using a purification method that combines the purification using hydroxyapatite chromatography and the purification using heparin column chromatography, It was found that protein can be obtained in high yield (Japanese Patent Application 2003-412122). However, many commercially available heparin columns use heparin derived from porcine small intestine, and there is a possibility that heparin may fall off from the column carrier in the purification process and be mixed into the purified product. Due to problems of BSE and the like, it is difficult to use biological materials for pharmaceutical production, and a method for purifying HGF without using biological materials has been desired.
本発明者らは、鋭意検討の結果、硫酸エステルを結合させたクロマトグラフィー担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製すると上記の問題点なしに、高純度でHGF（組換えタンパク）を精製し得ること、さらに陽イオン交換クロマトグラフィーを用いた精製を組み合せることにより、さらに高純度で精製し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies, the inventors of the present invention purified HGF (recombinant protein) with high purity without the above-mentioned problems when purified using affinity chromatography using a chromatographic support to which sulfate ester was bound. In addition, the inventors have found that it can be further purified with a higher purity by combining purification using cation exchange chromatography, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] 少なくとも硫酸エステルを結合させたクロマトグラフィー担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製する工程を含む、組換えタンパク質を精製する方法。
[２] さらに、陽イオンクロマトグラフィーを用いて精製する工程を含む[１]の方法。
[３] 陽イオンクロマトグラフィーを用いて精製する工程に次いで、硫酸エステルを結合させたクロマトグラフィー担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製する工程を含む組換えタンパク質を精製する方法。
[４] 組換えタンパク質がHGFである、[１]から[３]のいずれかの方法。
[５] 組換えタンパク質が、昆虫虫体を用いて作製されたものである、[１]から[４]のいずれかの方法。
[６] 昆虫がカイコである[５]の方法。
[７] 組換えタンパク質が、細菌を用いて製造される、[１]から[４]のいずれかの方法。
[８] 組換えタンパク質が、動物細胞を用いて製造される、[１]から[４]のいずれかの方法。
That is, the present invention is as follows.
[1] A method for purifying a recombinant protein, comprising a step of purification using affinity chromatography using a chromatography carrier to which at least a sulfate ester is bound.
[2] The method according to [1], further comprising a step of purification using cation chromatography.
[3] A method for purifying a recombinant protein, comprising a step of purifying using affinity chromatography using a chromatographic carrier to which sulfate ester is bound following the step of purifying using cation chromatography.
[4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the recombinant protein is HGF.
[5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the recombinant protein is produced using an insect worm.
[6] The method according to [5], wherein the insect is a silkworm.
[7] The method according to any one of [1] to [4], wherein the recombinant protein is produced using bacteria.
[8] The method according to any one of [1] to [4], wherein the recombinant protein is produced using animal cells.
本発明の硫酸エステルを結合させたクロマトグラフィー担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる精製法により、組換えタンパク質を、生物由来物質を混入させることなく、低コストかつ高収率で精製することができる。また、さらに、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いる精製法を用いることにより、さらに高収率で組換えタンパク質を精製することができる。 By the purification method using affinity chromatography using the chromatography carrier to which the sulfate ester of the present invention is bound, the recombinant protein can be purified at a low cost and in a high yield without contaminating biological substances. . Furthermore, by using a purification method using cation exchange chromatography, the recombinant protein can be purified at a higher yield.
本発明は、組換えタンパク質を、硫酸エステルを結合させたクロマトグラフィー担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製する方法である。本発明はさらに、組換えタンパク質を、陽イオン交換クロマトグラフィーならびに硫酸エステルを結合させたクロマトグラフィー担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製する方法である。 The present invention is a method for purifying a recombinant protein using affinity chromatography using a chromatographic support to which a sulfate ester is bound. The present invention is further a method for purifying a recombinant protein using cation exchange chromatography and affinity chromatography using a chromatographic carrier to which sulfate ester is bound.
本発明の精製方法が対象とするタンパク質としてHGF、上皮細胞増殖因子（EGF）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）等のタンパク質が挙げられる。該タンパク質は、例えばカイコを用いて産生され、カイコから抽出した体液中に含まれている組換えタンパク質であるが、組換えタンパク質の製造法や由来は限定されない。例えば、ここでHGFは、ヒト、ラット、マウス、イヌ、ネコ等HGFを発現しているいずれの動物由来であってもよい。また、HGFは、シグナルペプチドを含むHGF、血清中の活性化酵素等の作用により活性化されるHGF前駆体（pro型HGF）、活性型HGF、NK4等のHGFの断片などであってもよい。さらに、その一部のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。また、組換えタンパク質の製造法も限定されず、公知の遺伝子工学的手法を用いて、大腸菌、枯草菌等の細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、昆虫虫体、動物体、植物体を利用して作製した組換えタンパク質が含まれる。 Proteins targeted by the purification method of the present invention include proteins such as HGF, epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF) and the like. The protein is a recombinant protein produced using, for example, silkworm and contained in a body fluid extracted from the silkworm, but the production method and origin of the recombinant protein are not limited. For example, here, HGF may be derived from any animal expressing HGF, such as human, rat, mouse, dog, cat and the like. The HGF may be HGF including a signal peptide, an HGF precursor activated by the action of an activating enzyme in serum (pro-type HGF), an HGF fragment such as activated HGF or NK4. . Further, some of the amino acids may be deleted, substituted or added. Also, the production method of the recombinant protein is not limited, and using known genetic engineering techniques, bacteria such as E. coli and Bacillus subtilis, yeast, animal cells, insect cells, insect worms, animal bodies, and plants are used. The recombinant protein produced in this way is included.
本発明の一つの方法で精製しようとする組換えタンパク質のカイコを用いた製造は公知の方法で行うことができる。すなわち、バキュロウイルス等を用いた昆虫ウイルス遺伝子発現ベクターに産生させようとする目的のタンパク質をコードする遺伝子を導入し、該ベクターウイルスを昆虫個体に感染させることにより昆虫体内で、組換えタンパク質を産生させることができる。 Production of a recombinant protein to be purified by one method of the present invention using silkworms can be performed by a known method. That is, a recombinant protein is produced in an insect body by introducing a gene encoding a target protein to be produced into an insect virus gene expression vector using baculovirus or the like, and infecting the insect with the vector virus. Can be made.
このようにして組換えタンパク質をカイコ生体内で産生させ、組換えタンパク質を含むカイコ体液を抽出する。カイコからのカイコ体液の抽出は、カイコを切開し、回収またはリン酸緩衝液、酢酸緩衝液等の適当な緩衝液に浸漬する。この際、カイコ体内のタンパク質分解酵素と目的の組換えタンパク質が接触することにより、目的タンパク質が分解されてしまうおそれがあるので、浸漬の際には、PMSF（フェニルメタンスルホニルフルオリド）、DFP（ジイソプロピルフルオロリン酸）等のタンパク質分解酵素阻害剤を添加することもできる。さらに、カイコ個体より得られた体液中には、バキュロウイルスが含まれているため、バキュロウイルスを不活性化する必要がある。バキュロウイルスの不活性化は、例えば、塩化ベンゾルコニウム等の逆性石鹸等の界面活性剤を用いることによって処理すればよい。 In this way, a recombinant protein is produced in the silkworm organism, and a silkworm body fluid containing the recombinant protein is extracted. The silkworm body fluid is extracted from the silkworm by incising the silkworm and collecting or immersing it in an appropriate buffer such as a phosphate buffer or an acetate buffer. At this time, there is a possibility that the target protein may be degraded due to the contact between the protease in the silkworm body and the target recombinant protein. Therefore, PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride), DFP ( Proteolytic enzyme inhibitors such as diisopropylfluorophosphate can also be added. Furthermore, since the body fluid obtained from the silkworm individual contains baculovirus, it is necessary to inactivate the baculovirus. The inactivation of baculovirus may be treated by using a surfactant such as an inverted soap such as benzoluconium chloride.
本発明の精製工程により、カイコ体液から組換えタンパク質を精製する前にカイコ体液から固形分等を除去する必要がある。固形分の除去は、遠心分離により行うことができるし、またフィルターを用いて濾過してもよい。固形分の除去のための遠心分離の条件として、例えば10,000〜20,000Gで10〜30分という条件が挙げられる。また、濾過のためのフィルターとしては、適当なポアサイズのグラスフィルター、メンブランフィルター等を用いればよい。 By the purification process of the present invention, it is necessary to remove solids and the like from the silkworm body fluid before purifying the recombinant protein from the silkworm body fluid. The solid content can be removed by centrifugation, or may be filtered using a filter. Examples of the centrifugation conditions for removing the solid content include a condition of 10,000 to 20,000 G and 10 to 30 minutes. Further, as a filter for filtration, a glass filter or a membrane filter having an appropriate pore size may be used.
このようにしてカイコ個体から抽出し、固形分を除去した組換えタンパク質を含むカイコ体液または種々の方法で得た組換えタンパク質を硫酸エステルを結合させたクロマトグラフィー担体を用いたアフィニティークロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィーおよび硫酸エステルを結合させたクロマトグラフィー担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーの両方を用いて精製する。 The silkworm body fluid containing the recombinant protein extracted from the silkworm individual as described above, or the recombinant protein obtained by various methods, or affinity chromatography using a chromatographic carrier to which sulfate ester is bound or positive reaction. Purification is carried out using both ion exchange chromatography and affinity chromatography using a chromatographic carrier to which sulfate ester is bound.
陽イオン交換クロマトグラフィーに用いる陽イオン交換担体としては、公知のものを用いることができる。カラム作製のためのイオン交換クロマトグラフィー用樹脂として、イオン交換基を結合させたSepharose、Sephadex、Cellulofine等のセルロース、アガロース、デキストラン、シリカ、合成ポリマー等の樹脂を用いることができ、陽イオン交換基としては、カルボキシメチル(CM)基や、それより酸性度の強いスルホプロピル(SP)基、リン酸基等を選択すればよい。これらの陽イオン交換担体をカラムに充填することにより、陽イオン交換クロマトグラフィー用カラムを製造することができる。また、市販の陽イオン交換カラムを用いることもできる。市販の陽イオン交換カラムとしては、東ソー社製TOYOPEARL SP 550C、Amersham Biosciences社製SP Sepharose FF、CM Sepharose FF、Applied Biosystems社製Poros 50 HS等がある。 A well-known thing can be used as a cation exchange support | carrier used for a cation exchange chromatography. As resins for ion exchange chromatography for column preparation, resins such as cellulose, agarose, dextran, silica, synthetic polymers such as Sepharose, Sephadex, Cellulofine, etc., to which ion exchange groups are bonded can be used. For example, a carboxymethyl (CM) group, a sulfopropyl (SP) group having a higher acidity, a phosphate group, or the like may be selected. A column for cation exchange chromatography can be produced by filling the column with these cation exchange carriers. Commercially available cation exchange columns can also be used. Examples of commercially available cation exchange columns include TOYOPEARL SP 550C manufactured by Tosoh Corporation, SP Sepharose FF and CM Sepharose FF manufactured by Amersham Biosciences, and Poros 50 HS manufactured by Applied Biosystems.
硫酸エステルを結合させたクロマトグラフィー担体は、クロマトグラフィー担体に硫酸エステル（ROSO3HまたはROSO3R’；RおよびR’は炭水化物である）を結合させた、すなわち硫酸エステル化したものである。クロマトグラフィー担体への硫酸エステルの結合は公知の方法で行うことができる。クロマトグラフィー担体は、限定されないが種々のクロマトグラフィーにおいて担体として用い得るセルロース、アガロースやデキストランなどのポリサッカライド、シリカ、ビニルポリマー、アクリルアミドポリマー等が含まれる。クロマトグラフィー担体は、市販のものを用いればよく、例えば、Sephadex、Sephacel、Sepharose（以上、Pharmacia社）、Bio-Gel、Macro-Prep、Affi-Gel（以上、Bio Rad社）、セルロファイン（チッソ社）、アビセル（旭化成工業社）等がある。例えば、セルロース硫酸エステルは、セルロースを硫酸エステル化することにより得られ、セロビオース基の６位の炭素に硫酸基がエステル結合した構造を有する。セルロースは、球状の結晶セルロースまたは結晶領域および非結晶領域からなるセルロースを用いればよい。また、架橋ポリサッカライド硫酸エステルは、デキストラン、セルロース類、アガロースなどのポリサッカライドを、例えばエピクロルヒドリン、ジクロルヒドリン、ジブロムヒドリン、エチレングリコールビスエポキシプロピルエーテルなどの架橋剤で架橋して得られる架橋ポリサッカライドを硫酸エステル化することにより得られる。架橋ポリサッカライドをピリジン等の有機溶媒の存在下にクロルスルホン酸、無水酢酸等で処理することにより架橋ポリサッカライド硫酸エステルを得ることができる。また、硫酸エステル化されたクロマトグラフィー用ゲルも市販されており、例えば、硫酸化セルファイン（セルファインサルフェイト）（ミリポア社製）、硫酸化−セルロファイン(チッソ社製)等を用いることができる。 The chromatographic carrier to which the sulfate ester is bound is one in which a sulfate ester (ROSO 3 H or ROSO 3 R ′; R and R ′ are carbohydrates) is bound to the chromatographic carrier, that is, sulfated. The binding of the sulfate ester to the chromatography carrier can be performed by a known method. Chromatographic carriers include, but are not limited to, cellulose, polysaccharides such as agarose and dextran, silica, vinyl polymers, acrylamide polymers and the like that can be used as carriers in various chromatography. A commercially available chromatography carrier may be used. For example, Sephadex, Sephacel, Sepharose (Pharmacia), Bio-Gel, Macro-Prep, Affi-Gel (Bio Rad), Cellulofine (Chisso) And Avicel (Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.). For example, cellulose sulfate ester is obtained by subjecting cellulose to sulfate ester, and has a structure in which a sulfate group is ester-bonded to the 6-position carbon of a cellobiose group. As the cellulose, spherical crystalline cellulose or cellulose composed of a crystalline region and an amorphous region may be used. The crosslinked polysaccharide sulfate ester is a sulfate ester of a crosslinked polysaccharide obtained by crosslinking a polysaccharide such as dextran, celluloses or agarose with a crosslinking agent such as epichlorohydrin, dichlorohydrin, dibromohydrin or ethylene glycol bisepoxypropyl ether. Can be obtained. A crosslinked polysaccharide sulfate ester can be obtained by treating the crosslinked polysaccharide with chlorosulfonic acid, acetic anhydride or the like in the presence of an organic solvent such as pyridine. In addition, sulfate esterified gels for chromatography are also commercially available. For example, sulfated cellufine (cellufine sulfate) (manufactured by Millipore), sulfated-cellulofine (manufactured by Chisso) or the like can be used. it can.
上記の硫酸エステルを結合させたクロマトグラフィー担体をカラムに充填することにより硫酸エステルを結合させたクロマトグラフィー担体を用いたアフィニティークロマトグラフィー用カラムを製造することができる。 A column for affinity chromatography using a chromatographic carrier to which sulfate ester is bound can be manufactured by filling the column with the chromatographic carrier to which sulfate ester is bound.
以下、組換えタンパク質として、HGFを用いた場合のクロマトグラフィー条件について記載する。但し、本発明はこの例に限定されることはなく、当業者ならば精製しようとする目的のタンパク質に応じて、用いる緩衝液等の種類、吸着・溶出条件等を適宜決定することができる。特に以下の例ではカイコ体液から組換えタンパク質を精製する条件を記載しているが、精製しようとする組換えタンパク質を含む試料の性状に応じて適宜変更を加えることができる。この際、例えば、新生化学実験講座１ タンパク質I 分離・精製・性質 日本生化学会編、東京化学同人 第１版1990年２月26日発行 等の記載を参考に条件を決定することが可能である。 Hereinafter, the chromatography conditions when HGF is used as a recombinant protein will be described. However, the present invention is not limited to this example, and those skilled in the art can appropriately determine the type of buffer solution used, adsorption / elution conditions, and the like according to the target protein to be purified. In particular, in the following examples, conditions for purifying a recombinant protein from a silkworm body fluid are described, but changes can be appropriately made according to the properties of a sample containing the recombinant protein to be purified. In this case, for example, it is possible to determine the conditions with reference to the description of the New Chemistry Experiment Course 1 Protein I Separation / Purification / Properties edited by the Japanese Biochemical Society, Tokyo Kagaku Doujin, 1st Edition, February 26, 1990. .
まず、組換えHGFを含むカイコ体液を適当な緩衝液でpH4.0〜9.0、好ましくは6.0〜8.0に調整する。緩衝液は、0.1〜0.5 Mの塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含むリン酸カリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液等のリン酸緩衝液を用いればよく、緩衝液の濃度は10〜100 mMが好ましい。また、用いる緩衝液にはTween20、Tween80、TritonX100等の界面活性剤を0.001〜0.1％添加するのが好ましい。カイコ体液に対する緩衝液の容積比は、カイコ体液のpHが4.0〜9.0、好ましくは6.0〜8.0に調整され、かつカイコ体液の粘度が低くなりクロマトグラフィー担体と充分な接触が可能になるような比であり、例えば50 mMリン酸緩衝液pH6.5を用いる場合、カイコ体液１に対して、緩衝液を5〜20添加すればよい。 First, a silkworm body fluid containing recombinant HGF is adjusted to pH 4.0 to 9.0, preferably 6.0 to 8.0 with an appropriate buffer. As the buffer, a phosphate buffer such as a potassium phosphate buffer containing 0.1 to 0.5 M sodium chloride or potassium chloride or a sodium phosphate buffer may be used, and the concentration of the buffer is preferably 10 to 100 mM. Moreover, it is preferable to add 0.001-0.1% of surfactants, such as Tween20, Tween80, TritonX100, to the buffer solution to be used. The volume ratio of the buffer to the silkworm body fluid is such that the pH of the silkworm body fluid is adjusted to 4.0 to 9.0, preferably 6.0 to 8.0, and the viscosity of the silkworm body fluid is lowered to allow sufficient contact with the chromatography carrier. For example, when using 50 mM phosphate buffer pH 6.5, 5 to 20 buffers may be added to the silkworm body fluid 1.
このようにして緩衝液を添加してpHを調整したカイコ体液を陽イオン交換クロマトグラフィー担体と接触させ、カイコ体液中の組換えタンパク質を陽イオン交換クロマトグラフィー担体に吸着させる。この際、カイコ体液と陽イオン交換クロマトグラフィー担体は、ビーカ等の容器を用いてバッチ法で接触させてもよいし、陽イオン交換クロマトグラフィー担体を充填したカラムに緩衝液を添加したカイコ体液を添加してもよい。陽イオン交換クロマトグラフィー担体は、カイコ体液と接触させる前にあらかじめ適当な緩衝液で平衡化しておく。平衡化には、カイコ体液に添加した緩衝液を用いればよく、バッチ法で精製する場合は、陽イオン交換クロマトグラフィー担体の10〜100倍量の緩衝液で1分〜24時間平衡化を行えばよい。また、カラム法で精製する場合は、陽イオン交換クロマトグラフィー担体を充填したカラムに陽イオン交換クロマトグラフィー担体の2〜100倍量の緩衝液を流せばよい。 The silkworm body fluid whose pH has been adjusted by adding the buffer in this manner is brought into contact with the cation exchange chromatography carrier, and the recombinant protein in the silkworm body fluid is adsorbed onto the cation exchange chromatography carrier. At this time, the silkworm body fluid and the cation exchange chromatography carrier may be contacted by a batch method using a container such as a beaker, or a silkworm body fluid obtained by adding a buffer solution to a column packed with a cation exchange chromatography carrier. It may be added. The cation exchange chromatography carrier is equilibrated in advance with an appropriate buffer before contacting with the silkworm body fluid. For the equilibration, the buffer added to the silkworm body fluid may be used.When purifying by the batch method, equilibrate for 1 minute to 24 hours with 10 to 100 times as much buffer as the cation exchange chromatography carrier. Just do it. In addition, when purifying by the column method, a buffer solution of 2 to 100 times the amount of the cation exchange chromatography carrier may be passed through a column packed with the cation exchange chromatography carrier.
陽イオン交換クロマトグラフィー担体とカイコ体液の接触は、バッチ法の場合は、緩衝液を添加したカイコ体液に陽イオン交換クロマトグラフィー担体を添加することにより行う。添加する陽イオン交換クロマトグラフィー担体の量は、容積比でカイコ体液１に対して、0.1〜10である。接触は、静置することにより行ってもよいが、好ましくは、陽イオン交換クロマトグラフィー担体粒子が沈殿しない程度の速度で攪拌する。攪拌はスターラーを用いても、振とう装置を用いてもよい。接触時間は、１時間以上が好ましい。カラム法の場合は、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに緩衝液を添加したカイコ体液を添加することにより行う。この際、カイコ体液の流速は、カラムサイズにもよるが、例えば内径4.4 cm長さ10 cmのカラムを用いる場合、緩衝液を添加したカイコ体液5,000 mLを10 mL/分の速度で流せばよい。 In the case of the batch method, the cation exchange chromatography carrier and the silkworm body fluid are contacted by adding the cation exchange chromatography carrier to the silkworm body fluid to which the buffer solution has been added. The amount of the cation exchange chromatography carrier to be added is 0.1 to 10 with respect to the silkworm body fluid 1 by volume ratio. The contact may be carried out by standing, but is preferably stirred at a speed at which the cation exchange chromatography carrier particles do not precipitate. Stirring may be performed using a stirrer or a shaking device. The contact time is preferably 1 hour or longer. In the case of the column method, it is carried out by adding a silkworm body fluid to which a buffer solution is added to a cation exchange chromatography column. At this time, the flow rate of the silkworm body fluid depends on the column size. For example, when a column having an inner diameter of 4.4 cm and a length of 10 cm is used, 5,000 mL of the silkworm body fluid to which a buffer solution has been added may flow at a rate of 10 mL / min. .
次いで、バッチ法の場合は、遠心分離により組換えタンパク質が吸着した陽イオン交換クロマトグラフィー担体粒子を沈降または濾過回収する。このときの遠心分離は6,000〜12,000Gで５〜10分行えばよく、濾過はガラスフィルターなどを用いればよい。 Next, in the case of the batch method, the cation exchange chromatography carrier particles to which the recombinant protein has been adsorbed are centrifuged or collected by filtration. Centrifugation at this time may be performed at 6,000 to 12,000 G for 5 to 10 minutes, and filtration may be performed using a glass filter or the like.
その後、組換えタンパク質を吸着した陽イオン交換クロマトグラフィー担体を適当な緩衝液で洗浄する。緩衝液は、平衡化に用いた緩衝液を用いればよい。バッチ法の場合は、陽イオン交換クロマトグラフィー担体に洗浄用緩衝液を添加して、攪拌し再度遠心分離または濾過により陽イオン交換クロマトグラフィー担体を回収する。遠心操作は1〜5回繰り返すのが好ましい。カラム法の場合は、カラムに緩衝液を流速1〜50 mL/分で陽イオン交換クロマトグラフィー担体の３〜５倍量流すことにより洗浄を行う。 Thereafter, the cation exchange chromatography carrier adsorbing the recombinant protein is washed with an appropriate buffer. What is necessary is just to use the buffer solution used for equilibration as a buffer solution. In the case of the batch method, a washing buffer is added to the cation exchange chromatography carrier, and the mixture is stirred and then recovered again by centrifugation or filtration. The centrifugation operation is preferably repeated 1 to 5 times. In the case of the column method, washing is performed by flowing a buffer solution through the column at a flow rate of 1 to 50 mL / min 3 to 5 times the amount of the cation exchange chromatography carrier.
次いで、陽イオン交換クロマトグラフィー担体に吸着した組換えタンパク質を溶出する。溶出は溶出用緩衝液を用いて行う。溶出は、塩濃度を上げることにより行うことができ、リン酸緩衝液濃度を上げるか、添加する塩化ナトリウムまたは塩化カリウム濃度を上げればよい。例えば、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム濃度を0.8〜2.0 Mの緩衝液を用いればよい。バッチ法の場合は、組換えタンパク質の吸着した陽イオン交換クロマトグラフィー担体に3〜10倍量の溶出用緩衝液を添加し、1〜30分間攪拌した後、遠心分離またはフィルター濾過により陽イオン交換クロマトグラフィー担体を分離させ上清を回収すればよい。カラム法の場合は、陽イオン交換クロマトグラフィー担体の3〜10倍量の溶出用緩衝液をカラムに1〜50 mL/分の流速で流せばよい。回収した上清または溶出液は、適当な緩衝液でpHを6.0〜8.0に調整する。 Next, the recombinant protein adsorbed on the cation exchange chromatography carrier is eluted. Elution is performed using elution buffer. Elution can be performed by increasing the salt concentration, and it is sufficient to increase the phosphate buffer concentration or the concentration of sodium chloride or potassium chloride to be added. For example, a buffer solution having a sodium chloride or potassium chloride concentration of 0.8 to 2.0 M may be used. In the case of the batch method, add 3 to 10 volumes of the elution buffer to the cation exchange chromatography carrier to which the recombinant protein has been adsorbed, and stir for 1 to 30 minutes. The supernatant may be recovered by separating the chromatographic carrier. In the case of the column method, 3 to 10 times the volume of elution buffer of the cation exchange chromatography carrier may be passed through the column at a flow rate of 1 to 50 mL / min. The collected supernatant or eluate is adjusted to pH 6.0 to 8.0 with an appropriate buffer.
硫酸エステルを結合させたクロマトグラフィー担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる精製において、硫酸エステルは、非常に高い負荷電を有し血液凝固因子や核酸関連酵素等のある種のタンパク質が強く吸着する。硫酸エステルを結合させたクロマトグラフィー担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行う際に用いる緩衝液の種類、濃度、pHも精製しようとする組換えタンパク質に応じて、適宜決定することができる。以下では、HGFの精製の場合について述べる。 In purification using affinity chromatography using a chromatography carrier to which sulfate ester is bound, sulfate ester has a very high negative charge and strongly adsorbs certain proteins such as blood coagulation factors and nucleic acid-related enzymes. The type, concentration, and pH of the buffer solution used in the affinity chromatography using the chromatographic carrier to which sulfate ester is bound can also be appropriately determined according to the recombinant protein to be purified. In the following, the case of HGF purification will be described.
上記の陽イオン交換クロマトグラフィーにより得られた上清を、10〜500 mM、好ましくは10〜100 mMのリン酸カリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液等のリン酸緩衝液で2〜5倍に希釈する。この際、上清中に界面活性剤が含まれる場合は蒸留水に界面活性剤が同濃度で含まれるように界面活性剤を添加しておく。次いで、濃度を調整した溶液を硫酸エステルを結合させたクロマトグラフィー担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーカラムに1〜50 mL/分の流速で添加する。次いで、調整後の緩衝液の濃度と同じ濃度の緩衝液をカラムに1〜50 mL/分の流速で流し、洗浄する。この際流す量はカラムサイズの3〜5倍量である。その後、吸着した組換えタンパク質を、溶出緩衝液により溶出回収する。この際、塩濃度の高い緩衝液を用いることにより、吸着した組換えタンパク質を溶出することができる。例えば、吸着の際に用いた緩衝液に0.5〜2.0 Mの塩化ナトリウム、塩化カリウム等を添加したものを用いればよい。この際の、流速は1〜50 mL/分であり、流す溶出液の量はカラムサイズの3〜10倍量である。 The supernatant obtained by the cation exchange chromatography is 10 to 500 mM, preferably 2 to 5 times with a phosphate buffer such as 10 to 100 mM potassium phosphate buffer or sodium phosphate buffer. Dilute. At this time, when a surfactant is contained in the supernatant, the surfactant is added so that the surfactant is contained in distilled water at the same concentration. Next, the solution with the adjusted concentration is added to an affinity chromatography column using a chromatography carrier to which sulfate ester is bound at a flow rate of 1 to 50 mL / min. Next, a buffer having the same concentration as that of the adjusted buffer is passed through the column at a flow rate of 1 to 50 mL / min and washed. The flow amount at this time is 3 to 5 times the column size. Thereafter, the adsorbed recombinant protein is recovered by elution with an elution buffer. At this time, the adsorbed recombinant protein can be eluted by using a buffer solution having a high salt concentration. For example, what added 0.5-2.0 M sodium chloride, potassium chloride, etc. to the buffer solution used at the time of adsorption may be used. At this time, the flow rate is 1 to 50 mL / min, and the amount of the eluate to flow is 3 to 10 times the column size.
フラクションを回収し、各クラクション中の組換えタンパク質の量を測定し、高濃度のフラクションを回収・プールすることにより高純度の組換えタンパク質を得ることができる。 Fractions are collected, the amount of recombinant protein in each fraction is measured, and high-concentration recombinant proteins can be obtained by collecting and pooling high-concentration fractions.
また、上記陽イオン交換クロマトグラフィーと同様に、ビーカ等の容器を用いてバッチ法で精製することもできる。 Moreover, it can also refine | purify with a batch method using containers, such as a beaker, like the said cation exchange chromatography.
さらに、陽イオン交換クロマトグラフィーを行うことなく、硫酸エステルを結合させたクロマトグラフィー担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーのみで精製することもできる。この場合緩衝液は、100〜500 mMの塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含むリン酸カリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液等のリン酸緩衝液を用いればよく、緩衝液の濃度は10〜100 mMが好ましい。また、用いる緩衝液にはTween20、Tween80、TritonX100等の界面活性剤を0.001〜0.1％添加するのが好ましい。組換えHGFを含むカイコ体液を適当な緩衝液でpH6.0〜8.0に調整して、硫酸エステルを結合させたクロマトグラフィー担体と接触させる。カイコ体液に対する緩衝液の容積比は、カイコ体液のpHが6.0〜9.0、好ましくは6.5〜7.5に調整され、かつカイコ体液の粘度が低くなりクロマトグラフィー担体と充分な接触が可能になるような比であり、例えば50 mMリン酸緩衝液pH6.5を用いる場合、カイコ体液１に対して、緩衝液を5〜20添加すればよい。 Further, it can be purified only by affinity chromatography using a chromatographic carrier to which sulfate ester is bound without performing cation exchange chromatography. In this case, the buffer solution may be a phosphate buffer solution such as potassium phosphate buffer solution or sodium phosphate buffer solution containing 100 to 500 mM sodium chloride or potassium chloride, and the buffer solution concentration is 10 to 100 mM. preferable. Moreover, it is preferable to add 0.001-0.1% of surfactants, such as Tween20, Tween80, TritonX100, to the buffer solution to be used. The silkworm body fluid containing the recombinant HGF is adjusted to pH 6.0 to 8.0 with an appropriate buffer and brought into contact with a chromatographic carrier to which sulfate ester is bound. The volume ratio of the buffer to the silkworm body fluid is such that the pH of the silkworm body fluid is adjusted to 6.0-9.0, preferably 6.5-7.5, and the viscosity of the silkworm body fluid is lowered to allow sufficient contact with the chromatography carrier. For example, when using 50 mM phosphate buffer pH 6.5, 5 to 20 buffers may be added to the silkworm body fluid 1.
各ステップ後の純度や、収率はさらにHPLC分析にかけたり、SDS-PAGE等の電気泳動手法、およびウエスタンブロッティング等の手法により測定することができる。 The purity and yield after each step can be further measured by HPLC analysis, electrophoresis techniques such as SDS-PAGE, and techniques such as Western blotting.
陽イオンクロマトグラフィーによる精製後の純度は、80％以上であり、さらに、硫酸エステルを結合させたクロマトグラフィー担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによる精製後の純度は、85〜95％である。最終的にカイコ体液中の組換えタンパク質の20〜70％を回収することができる。比活性としては、陽イオンクロマトグラフィーによる精製後の比活性は、カイコ体液中の10倍以上であり、さらに、セルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いたアフィニティークロマトグラフィーによる精製後の比活性は、カイコ体液中の千〜数万倍である。 The purity after purification by cation chromatography is 80% or more, and the purity after purification by affinity chromatography using a chromatographic carrier bound with sulfate ester is 85 to 95%. Finally, 20-70% of the recombinant protein in the silkworm body fluid can be recovered. As specific activity, the specific activity after purification by cation chromatography is more than 10 times that in silkworm body fluid, and the specific activity after purification by affinity chromatography using cellulose sulfate ester or crosslinked polysaccharide sulfate ester Is one thousand to several tens of thousands of times in the silkworm body fluid.
なお、本発明の精製方法は、高速液体クロマトグラフィーや中圧液体クロマトグラフィー等の分取機器を用いることにより、自動化することが可能である。 The purification method of the present invention can be automated by using a preparative device such as high performance liquid chromatography or medium pressure liquid chromatography.
WO 01/092332に記載した方法により、ネコHGF組換えバキュロウイルスを感染させたカイコ体液より、組換えネコHGFを精製した。 Recombinant feline HGF was purified from silkworm body fluids infected with feline HGF recombinant baculovirus by the method described in WO 01/092332.
<組換えネコHGFの生物活性測定>
得られた組換えネコHGFの活性は、イヌ腎由来細胞（MDCK細胞）の遊走活性を指標として測定した。MDCK細胞は、10％ウシ胎児血清（Moregate社製）、0.3％Tryptose Phosphate broth（DIFCO社製）を含むE-MEM（日水製薬社製）培地中で、37℃、5％CO2存在下で継代を行った。飽和細胞密度まで増殖させたMDCK細胞を、PBS緩衝液で洗浄後、トリプシン-EDTA溶液を加え、37℃で約5分間静置した。次いで上記の増殖用培地を加え細胞を良く懸濁した後、1,200 rpm、4℃にて5分間遠心した。上清を除き、再度増殖用培地に懸濁した後、常法に従い細胞数を測定し、3×104個/mLとなるように細胞数を調整した。この細胞懸濁液を96穴プレート（FALCON社製）１ウェルあたり100 μLずつ分注した。次いで、増殖用培地を用いて2倍階段希釈された組換えネコHGFを含む被験試料を50 μLずつ細胞上清に加え、インキュベーター内で培養を行った。24時間後、15 μLの25％グルタルアルデヒド溶液（和光純薬社製）を各ウェルに加え細胞を固定し、次いでギムザ染色を行い顕微鏡下で細胞の運動性、形態について観察した。なお、本明細書中においてHGF活性を単位（U）で示す場合は、被験試料を2倍階段希釈し、MDCK細胞遊走活性が最大となる希釈倍率数を単位として定義する。
<Bioactivity measurement of recombinant cat HGF>
The activity of the obtained recombinant feline HGF was measured using the migration activity of canine kidney-derived cells (MDCK cells) as an index. MDCK cells are in E-MEM (Nissui Pharmaceutical) medium containing 10% fetal bovine serum (Moregate) and 0.3% Tryptose Phosphate broth (DIFCO) in the presence of 37 ° C and 5% CO 2. At the passage. MDCK cells grown to a saturated cell density were washed with PBS buffer, added with trypsin-EDTA solution, and allowed to stand at 37 ° C. for about 5 minutes. Next, the above growth medium was added to well suspend the cells, and then centrifuged at 1,200 rpm at 4 ° C. for 5 minutes. After removing the supernatant and suspending in the growth medium again, the number of cells was measured according to a conventional method, and the number of cells was adjusted to 3 × 10 4 cells / mL. This cell suspension was dispensed at 100 μL per well in a 96-well plate (FALCON). Next, 50 μL each of a test sample containing recombinant feline HGF diluted 2-fold using a growth medium was added to the cell supernatant and cultured in an incubator. After 24 hours, 15 μL of a 25% glutaraldehyde solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to each well to fix the cells, then Giemsa staining was performed, and the motility and morphology of the cells were observed under a microscope. In the present specification, when the HGF activity is expressed in units (U), the test sample is diluted 2-fold stepwise, and the dilution factor that maximizes the MDCK cell migration activity is defined as a unit.
<陽イオン交換クロマトグラフィーの操作>
カイコ体液500 mLに0.01％Tween 80を含む50 mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5) 4,500 mLを加え、よく混和した。これを0.3 M塩化ナトリウムおよび0.01％Tween 80を含む50 mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)で平衡化した陽イオン交換カラム（TOYOPEARL SP-550C、東ソー社製、カラムサイズ内径4.4cm、高さ10 cm）にかけた。カラムを平衡化緩衝液、次いで約0.6 M塩化ナトリウムおよび0.01％ Tween 80を含む50 mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5) 450 mLで各々洗浄した後、約1.2 M塩化ナトリウムおよび0.01％ Tween80を含む50 mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)を用いて溶出させた。
<Operation of cation exchange chromatography>
To 500 mL of silkworm body fluid, 4,500 mL of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5) containing 0.01% Tween 80 was added and mixed well. Cation exchange column (TOYOPEARL SP-550C, manufactured by Tosoh Corporation, column size inner diameter 4.4 cm, high) equilibrated with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5) containing 0.3 M sodium chloride and 0.01% Tween 80 10 cm). After washing the column with equilibration buffer and then 450 mL each of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5) containing about 0.6 M sodium chloride and 0.01% Tween 80, about 1.2 M sodium chloride and 0.01% Tween 80 were added. Elution was carried out using 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5).
得られた画分について、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）およびクマシー染色を行い、分子量約85 kDaの位置にバンドが確認された画分を混合し、0.01％ Tween 80を含む50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.5）を用いて3倍希釈した。 The obtained fraction was subjected to SDS-polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE) and Coomassie staining, and the fraction in which a band was confirmed at a molecular weight of about 85 kDa was mixed, and 50 mM containing 0.01% Tween 80 The solution was diluted 3-fold with potassium phosphate buffer (pH 6.5).
<セルロース硫酸エステルクロマトグラフィーの操作>
希釈を行った陽イオン交換クロマトグラフィー溶出液を、0.3 M塩化ナトリウムおよび0.01％ Tween 80を含む10 mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.5）で平衡化した硫酸化セルロファインカラム（チッソ社製、カラムサイズ内径2.6 cm、高さ5 cm）に流速4 mL/分で添加した。平衡化緩衝液、次いで約0.5 M塩化ナトリウムおよび0.01％ Tween 80を含む10 mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.5）で各々洗浄後、約1.2 M塩化ナトリウムおよび0.01％ Tween 80を含む10m Mリン酸カリウム緩衝液（pH6.5）を用いて流速2 mL/分で溶出を行い、2 mLずつフラクションを回収した。各画分からサンプルの一部を取り、SDS-PAGEおよびクマシー染色を行い、組換えネコHGFのバンドが確認された画分を混合し、硫酸エステル溶出液とした。
<Operation of cellulose sulfate ester chromatography>
The diluted cation exchange chromatography eluate was equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5) containing 0.3 M sodium chloride and 0.01% Tween 80 (manufactured by Chisso Corporation). Column size ID 2.6 cm, height 5 cm) at a flow rate of 4 mL / min. After washing with equilibration buffer, then 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5) containing about 0.5 M sodium chloride and 0.01% Tween 80, respectively, 10 mM phosphorus containing about 1.2 M sodium chloride and 0.01% Tween 80 Elution was performed with potassium acid buffer (pH 6.5) at a flow rate of 2 mL / min, and fractions were collected in 2 mL portions. A part of the sample was taken from each fraction, subjected to SDS-PAGE and Coomassie staining, and the fraction in which the recombinant feline HGF band was confirmed was mixed to obtain a sulfate ester eluate.
＜ゲル濾過クロマトグラフィーの操作>
ゲル濾過クロマトグラフィーは、装置はAKTA exploler 100を、カラムは、HiLoad 26/60 Superdex 200 pg（両者ともアマシャムバイオサイエンス社製）を用いた。展開液には、0.15 M塩化ナトリウムおよび0.01％ Tween 80を含む10 mMクエン酸緩衝液（pH6.0）を用いた。流速は2.5 mL/分とし、ピークの検出は280 nmの吸光度を測定することで行った。サンプル添加から約75分前後にネコHGFのメインピークが現れ、これらのフラクションを回収した。
<Operation of gel filtration chromatography>
For gel filtration chromatography, the apparatus used was
<SDS-PAGEの操作>
上記3段階のクロマトグラフィーで精製された組換えネコHGFを2-メルカプトエタノール還元下でSDS-PAGEを行い、次いで銀染色を行った（銀染色キットIIワコー、和光純薬社製）。結果を図１に示す。精製組換えネコHGFは、分子量（約85kDa）相当領域に単一のバンドが認められた。この精製物は抗ネコHGFモノクローナル抗体（日本全薬工業株式会社中央研究所において樹立）を用いたウエスタンブロッティングにより、組換えネコHGFであることが確認された。この結果を図２に示す。
<SDS-PAGE operation>
Recombinant feline HGF purified by the above three-stage chromatography was subjected to SDS-PAGE under 2-mercaptoethanol reduction and then silver staining (silver staining kit II Wako, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The results are shown in FIG. The purified recombinant feline HGF showed a single band in the region corresponding to the molecular weight (about 85 kDa). This purified product was confirmed to be recombinant feline HGF by Western blotting using an anti-cat HGF monoclonal antibody (established by Central Research Laboratory, Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.). The result is shown in FIG.
以上の結果から、本精製法によりカイコ体液中の夾雑物が効率よく除去され、高純度の組換えネコHGFが製造できることが明らかとなった。各工程による精製過程を表１に示した。 From the above results, it was clarified that impurities in the silkworm body fluid were efficiently removed by this purification method, and high purity recombinant feline HGF could be produced. The purification process by each step is shown in Table 1.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008257178A (en) * | 2007-03-12 | 2008-10-23 | Olympus Imaging Corp | Imaging optical system and electronic imaging apparatus having the same |
| CN114410613A (en) * | 2022-01-06 | 2022-04-29 | 合肥巅峰生物科技有限公司 | Purification method and application of recombinant proteinase K |
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|---|---|---|---|---|
| WO1991013976A1 (en) * | 1990-03-14 | 1991-09-19 | Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. | Process for producing purified tissue plasminogen activator or its derivative |
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2005
- 2005-05-26 JP JP2005154433A patent/JP2006327991A/en active Pending
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