JP2006325588A - Method for producing plant modified to induce dedifferentiation, plant obtained thereby and use thereof - Google Patents

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知嗣 小山
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for producing a plant modified to induce dedifferentiation (callus formation). <P>SOLUTION: A plant modified to induce dedifferentiation is produced by introducing a recombinant expression vector containing a gene encoding a transcription factor controlled in a DST-dependent mRNA degradation pathway and participating in dedifferentiation into a plant cell and producing the transcription factor in the plant cell. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、脱分化が誘導されるように改変された植物体の生産方法及びこれを用いて得られる植物体、並びにその利用に関するものである。 The present invention, production methods and plants obtained using the same modified plants as dedifferentiation are derived, as well as use thereof.

植物は分化全能性を持ち、高度に分化した体細胞からカルスを形成(脱分化)させることができ、また、カルスを一定条件下で培養すれば、不定胚や不定芽および不定根の分化を経て、植物個体を再生させることができる。 Plants have totipotency, highly callus can be formed (dedifferentiation) from differentiated somatic cells, also be cultured calli under constant conditions, through the differentiation of an adventitious embryo and adventitious buds and adventitious roots , it is possible to reproduce the plant individual. カルス培養は、1)無限増殖能を有し、2)カルスの細胞塊から様々な組織や個体へ分化させることができる、3)植物体では得にくい増殖細胞を均一かつ多量に得られる、4)細胞の質や量に季節変動がなく実験材料として適している、5)培地に加えた物質の植物に対する影響を直接に見ることができる、6)植物によってはカルス化を経ることにより遺伝子の変異が誘発されやすく育種などに利用できる等の点で優れている。 Callus cultures 1) has unlimited proliferation ability, 2) can be differentiated from the cell mass of callus into various tissues or individuals, 3) uniformly and be large amounts to obtain a hard proliferating cells resulting in plants, 4 ) cells are suitable as quality and quantity in the experiment material without seasonal variation, 5) can be seen directly affects for substances of plants added to the culture medium, 6) of the gene through the callus by plants mutation is superior in terms of such available like induced easily bred. そのため、カルス培養は、有用物質の生産、新品種の開発、植物体への遺伝子導入および形質転換体の再生、人工種子の生産等に広く利用されている。 Therefore, callus cultures, production of useful substances, development of new varieties, regeneration of transgenic and transformants into plants are widely used for production or the like of the artificial seeds.

一般的に植物の分化・脱分化は、オーキシンやサイトカイニン等の植物ホルモンの組成と培地への添加量によって制御することができる。 Generally differentiation and dedifferentiation of the plant can be controlled by the addition amount of the composition and the medium of the plant hormones, such as auxin and cytokinin. 一般的に、培地に与えたオーキシンの比率が高いと不定根の形成(分化)、サイトカイニンの比率が高いと不定芽の形成(分化)、両者の適当な存在比ではカルス(脱分化)が維持されることが知られている。 Generally, formation of the ratio of auxin given to medium high adventitious roots (differentiation), the formation of high and adventitious buds ratio of cytokinin (differentiation), callus (dedifferentiation) is maintained at an appropriate abundance of both Rukoto is known.

また、脱分化(カルス化)の誘導は、植物ホルモンによるほか、ウイルスや細菌の感染、傷害(UV、X線、物理的傷害などを含む)によっても低頻度であるが起こることが知られている。 Further, the induction of de-differentiation (callus), in addition by plant hormones, infectious viruses and bacteria, injuries (UV, X-ray, and the like physical injury) also is known to happen is a low frequency by there.

細菌感染によるものとしては、例えば、Agrobacterium tumefaciensの感染によるクラウンゴールの生成が知られている。 As bacterial infections, for example, production of crown gall by infection of Agrobacterium tumefaciens are known. これは、Tiプラスミド中のT−DNA領域に含まれるオーキシン合成遺伝子およびサイトカイニン合成遺伝子の発現によって感染した植物の細胞中で両植物ホルモンが生産され植物組織に腫瘍細胞(カルス)が生じるためである。 This is because the tumor cells (callus) occurs in infected produced is both plant hormones in cells of a plant plant tissue by expression of auxin synthesis gene and the cytokinin synthesis gene contained in the T-DNA region in the Ti plasmid . 生じたカルスは外部からの植物ホルモンの添加なし(植物ホルモンフリー)で培養可能である。 The resulting callus can be cultured without the addition of a plant hormone from the outside (a plant hormone-free).

また、脱分化はウィルスによっても起こることが知られている。 In addition, de-differentiation is known to be caused by a virus. 2本鎖RNAを有する腫瘍ウィルス(Aureogenus magnivena)をクローバー類(Trifolium)やヒメスイバ(Rumex acetosella)の傷を付けた部分に接種すると葉の奇形や根の腫瘍を生じる。 Resulting in tumor virus (Aureogenus magnivena) the clover acids (Trifolium) and sheep's sorrel (Rumex acetosella) wound to inoculate with the portion on which the and leaf deformities and roots of the tumor with a double-stranded RNA. このウイルス腫瘍は動物のRNA腫瘍ウィルスとは異なり宿主に形質転換を起こさない。 This virus tumor does not cause a transformation in different host animals of RNA tumor viruses.

また、親植物には見られないが特定の組み合わせの種間雑種だけにみられる遺伝的腫瘍が知られている。 In addition, although not seen genetic tumor found only in interspecific hybrids of specific combinations are known to the parent plant. この遺伝的腫瘍は、Brassica(アブラナ)属、Datura(チョウセンアサガオ)属、Lilium(ユリ)属、Nicotiana(タバコ)属などで生じることが報告されている。 The genetic tumor, Brassica (Brassica) species, Datura (Datura) genus Lilium (lily) genus, has been reported to occur in Nicotiana (tobacco) genus like. 生じる腫瘍細胞はオーキシンに対して自律的に増殖する。 Tumor cells resulting autonomously proliferate against auxin. Nicotiana(タバコ)属の研究から、ゲノム間の不和合と特定の染色体の機能とが結びついて腫瘍の形成を引き起すことが示されている。 Studies of Nicotiana (tobacco) genus, coupled with the incompatibility between the genome and the function of a particular chromosome has been shown to cause the formation of tumors. 遺伝的腫瘍の形成は、外的ストレス(傷害、X線、機械的刺激、化学物質など)とともに、内的ストレス(側根の形成、頂芽優勢の減少、葉の喪失、密植など)によっても誘発される。 Formation of genetic tumors, external stress (injury, X-rays, mechanical stimulation, chemical, etc.) with, internal stress (formation of lateral roots, a decrease in apical dominance, loss of leaves, dense planting etc.) induced by It is.

さらに、遺伝子組み換え技術により植物細胞の脱分化が誘導および促進された例がいくつか報告されている。 Further, examples of dedifferentiated plant cells is induced and promoted there have been several reports by gene recombination technology. これらは主に植物ホルモン応答機構に関与する遺伝子の解析から偶発的に脱分化が誘導および促進された例であり、いずれも植物ホルモンへの応答経路が増幅されたことが原因となっていると考えられる。 These are mainly an example in which accidental de-differentiation was induced and accelerated from the analysis of genes involved in plant hormone response mechanism, when it has become a cause of any response pathway into plant hormones were amplified Conceivable. しかし、これらの報告では、生じた脱分化した細胞が継代可能であるかについては言及されていない。 However, in these reports, de-differentiated cells produced no mention is made of whether it is possible passages.

シロイヌナズナcDNAのファンクショナルスクリーニングにより、ESR1(Enhancer of Shoot Regeneration)遺伝子が単離されている(例えば、非特許文献1等参照)。 The functional screening of Arabidopsis cDNA, ESR1 (Enhancer of Shoot Regeneration) genes have been isolated (e.g., see Non-Patent Document 1 and the like). ESR1遺伝子は、アグロバクテリウムを用いて根片にcDNAライブラリを形質転換し、選択マーカーとなる抗生物質を含むサイトカイニンフリーの茎葉誘導培地(オーキシンは含まれる)でシュートまたは緑色カルスを形成するものから単離された。 ESR1 gene from which the cDNA library was transformed into the root pieces using Agrobacterium, to form a chute or green callus foliage induction medium cytokinin free with antibiotics as a selection marker (auxin is included) isolated. この遺伝子を根の外植片で発現させると、サイトカイニン非依存的にシュートを分化する。 When this gene is expressed in explants of roots, differentiating chute cytokinin-independent manner. また、低いサイトカイニン濃度でもシュートの形成が促進される。 The formation of the chute is accelerated even at a low cytokinin concentration. ESR1遺伝子を過剰発現させた植物体(35S:ESR1植物体)をMS培地(植物ホルモンフリー)で培養すると、正常な発達が見られず、濃緑色のカルスが茎頂分裂組織周辺で形成される。 ESR1 gene plants overexpressing: When the (35S ESR1 plants) cultured in MS medium (plant hormone free), not observed normal development, callus dark green are formed around shoot apical meristem .

また、サイトカイニンに対する初発応答遺伝子の転写活性化を担う転写因子であるARR1(Arabidopsis Response Regulator1)タンパク質についての報告がある(例えば、非特許文献2等参照。)。 Also, there are reports of ARR1 (Arabidopsis Response Regulator1) protein is a transcription factor responsible for transcriptional activation of initial response genes to the cytokinin (for example, see Non-Patent Document 2 and the like.). このARR1タンパク質はシロイヌナズナのタイプBレスポンスレギュレーターに属する。 This ARR1 protein belongs to a type B response regulator of Arabidopsis thaliana. 胚軸断片を用いた緑色カルスの誘導実験では、機能欠損型の突然変異体で、サイトカイニンに対する感受性の低下が起こり、逆に過剰発現体では感受性の増加が見られることが報告されている。 The induction experiments green calli using hypocotyl fragments, with loss-of-function mutants, occur reduced susceptibility to cytokinin in overexpressing Conversely it has been reported that increased sensitivity is observed. ARR1タンパク質のリン酸レシーバードメインを欠損させたタンパク質を過剰発現させた植物体は、子葉からの異所的なシュート形成や茎頂のカルス化などの著しい形態変化が見られる。 Proteins deficient phosphate receiver domains of ARR1 proteins were overexpressed plants, significant morphological changes, such as ectopic shoot formation and shoot of callus from cotyledons are seen.

さらに、細胞周期におけるG 期からS期への移行を制御する転写因子であるE2Faタンパク質について報告されている(例えば、非特許文献3等参照。)。 Furthermore, E2Fa proteins have been reported for a transcription factor that controls the transition to S phase G 1 phase in the cell cycle (e.g., Non-Patent Document 3, etc. refer.). E2Faタンパク質は、E2Fa−DPa複合体となることで、DNAへのより親和性の高い、配列特異的な結合が可能となる。 E2Fa protein, by the E2Fa-DPa complex, higher-affinity to DNA, it is possible to sequence-specific binding. シロイヌナズナのE2FaとDPaをタバコで過剰発現させると、細胞分裂が促進し、核内倍加が起こる。 When the E2Fa and DPa in Arabidopsis thaliana is overexpressed in tobacco, cell division is accelerated, endoreduplication occurs. またカルス誘導培地で葉片から誘導したカルスは、植物ホルモン無添加の培地でもしばらくは増殖を続けることが報告されている。 The callus induced from leaf callus induction medium, it has been reported that for some time continue to grow even in a medium of the plant hormone-free additive. またシュートを分化させるための植物ホルモン組成培地でも、シュートへの分化は見られず、胚性カルス(embryonic callus)の状態が維持される。 Also plant hormones chemically defined medium for the differentiation of shoots, differentiation into shoots was not observed, the state of embryonic calli (embryonic callus) is maintained.

また、RAP2.4タンパク質は、RAP2タンパク質ファミリーに属するタンパク質であることが知られている(例えば、非特許文献4等参照。)。 Further, RAP2.4 proteins, RAP2 It is known that proteins are a family belonging to a protein (e.g., see Non-Patent Document 4 and the like.). このRAP2.4タンパク質は、他のRAP2ファミリータンパク質と同様、野生型(Ler)の花、葉、茎及び根で発現が見られていることが報告されている。 The RAP2.4 protein, like other RAP2 family proteins, wild-type (Ler) flowers, leaves, expressed in stems and roots have been reported to be seen. また、本発明者らの基礎的な実験から、植物体に比べて複数のカルス株で発現が上昇している転写活性化因子の遺伝子であることが明らかになっている。 Also, the basic experiments of the inventors of the present invention, it is a gene transcription activator expression is elevated by a plurality of callus lines as compared to plants has been clarified. しかし、このタンパク質の機能についてはほとんどわかっていない。 However, little is known about the function of this protein.

上述したように、従来から種々の脱分化(カルス化)の方法が知られているが、従来の方法でカルスを誘導できない植物も多く、かかる脱分化しにくい植物についても、カルスを誘導できるように、従来法とは異なるカルス誘導方法の開発が望まれている。 As described above, although various methods for dedifferentiation from conventional (callus) is known, many plants can not induce callus in a conventional manner, for consuming dedifferentiated hard plant, to be able to induce callus to, it has been desired to develop different callus induction method and the conventional method. また、無限増殖能を有するカルスを用いて有用物質生産を行う研究がこれまで数多くなされているが、カルスの有用物質生産能の不安定さにより工業化した例はほんの数例しかなく、従来法とは異なる安定した有用物質生産能を有するカルスを用いた有用物質生産法の開発が望まれている。 Although studies of performing useful substance produced using callus with an infinite proliferation ability have been made numerous heretofore, examples of industrially by instability of callus useful substance-producing ability is only few examples, and the conventional method It is desired to develop a useful substance production method using the callus with different stable useful materials producing ability.

本発明の目的は、脱分化しにくい植物でもカルスを誘導できるような、脱分化が誘導されるように改変された植物体を生産する方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a method for producing a modified plant as in dedifferentiated hard plants like can induce callus and dedifferentiation is induced. また、そのように脱分化が誘導されるように改変された植物体を用いて、安定した有用物質生産法を提供することにある。 Furthermore, so using a modified plant as dedifferentiation is induced to provide a stable production of useful substances method.

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、植物体に比べ複数のカルス株で発現が促進していた転写因子であって、その機能が明らかにされていない転写因子をコードする遺伝子を植物体内で機能するプロモーターにつないで植物体に導入し発現させたところ、得られた植物体は、植物ホルモン非存在下でも、茎、葉、根などの器官の正常な分化が抑制されカルス状になることを見出した。 The present inventor has conducted intensive studies to solve the above problems, a transcription factor whose expression was promoted by a plurality of callus lines than in plants, a transcription factor whose function has not been elucidated was then introduced into plants expressing a gene encoding connect to a promoter that functions in a plant body, resulting plants, even in the absence of plant hormones, stem, leaf, the normal differentiation of organs, such as roots inhibited was found to become a callus form. なお、本明細書において、「植物ホルモン非存在下」とは、特に規定する場合を除き、「植物ホルモン無添加」と同じ意味である。 In this specification, the term "plant hormones absence", unless otherwise specified, it has the same meaning as "plant hormones additive-free". また、得られたカルス細胞は植物ホルモン無添加の培地でも増殖し、脱分化状態を維持したまま継代培養が可能であることを見出した。 Moreover, callus cells obtained were grown in medium of the plant hormone-free additive was found that it is possible to leave subcultured maintaining the dedifferentiated state. そして、これらの知見から、かかる転写因子は脱分化に関与する転写因子であることを初めて見出し、これらの転写因子をコードする遺伝子を用いることにより、脱分化が誘導されるように改変された植物体を生産することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。 Then, for the first time it found that from these findings, such transcription factor is a transcription factor involved in dedifferentiation, by using the genes encoding these transcription factors, modified plant as dedifferentiation is induced It found that it is possible to produce the body, thereby completing the present invention.

すなわち、本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体の生産方法は、以下の(a)〜(e)のいずれかに記載の遺伝子が発現するように、該遺伝子を含む組換え発現ベクターを植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることを特徴としている。 That is, the method of producing modified plant material as dedifferentiation of the present invention are derived are to express genes described in any one of the following (a) ~ (e), containing the gene the recombinant expression vector is characterized in that it contains transformed step of introducing into a plant cell.
(a)脱分化に関与する転写因子をコードする遺伝子、 (A) a gene encoding a transcription factor involved in dedifferentiation,
(b)配列番号1、3または5に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、 (B) a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 5,
(c)配列番号1、3または5に示されるアミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、脱分化に関与するタンパク質をコードする遺伝子、 (C) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 5, wherein one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence, and is involved in dedifferentiation the gene encoding the protein,
(d)配列番号2、4または6に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子、 (D) genes having a base sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6 as an open reading frame region,
(e)配列番号2、4または6に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有し、且つ、脱分化に関与するタンパク質をコードする遺伝子。 (E) has a hybridizing nucleotide sequence in the gene under stringent conditions comprising a base sequence complementary to the gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6 as an open reading frame region, and, de genes encoding proteins involved in differentiation.

また、本発明にかかる植物体の生産方法は、さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいてもよい。 Further, a method for producing a plant according to the present invention may further comprise an expression vector constructing step of constructing the recombinant expression vector.

また、本発明にかかる植物体は、上記生産方法により生産され、脱分化が誘導されるように改変されていることを特徴としている。 Furthermore, plants according to the present invention is produced by the above production method is characterized in that it is modified to dedifferentiation is induced.

本発明にかかる植物体においては、植物体内の内因性のオーキシンの濃度が、脱分化が誘導されるように改変される前と比較して、有意に増加していないことが好ましい。 In the plant according to the present invention, the concentration of endogenous auxin plants, compared to before being modified to dedifferentiation is induced, it is preferred not significantly increased.

上記植物体には、成育した植物個体、植物組織、植物細胞、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれることが好ましい。 Above plants, grown plants individuals, plant tissue, plant cell, callus, may include at least one of seeds preferred.

また、上記植物体は、カルスであって、当該カルス培養条件をコントロールすることにより表面が一部分化し、表面が一部分化した状態のまま増殖させることができるカルスであってもよい。 Moreover, the plant is a callus surface is a portion of by controlling the callus culture conditions, the surface may be a callus can be grown while a portion of the state. さらに、上記植物体は、上記形質転換工程で選択マーカーとして薬剤耐性遺伝子を用いて得られた植物体を、当該選択マーカーの試薬である抗生物質を添加せずに培養して得られたカルスであってもよい。 Furthermore, the plants, the resulting plants using a drug resistance gene as a selectable marker in the transforming step, callus obtained by culturing without the addition of antibiotics is a reagent of the selected marker it may be.

また、本発明にかかる植物体の脱分化誘導キットは、上記の生産方法を行うためのキットであって、上記(a)〜(e)のいずれかに記載の遺伝子と、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴としている。 Also, the set dedifferentiation induction kit plant according to the present invention, including a kit for performing the method of production, the gene according to any one of the above (a) ~ (e), and a promoter It is characterized in that it comprises at least a recombinant expression vector.

また、上記植物体の脱分化誘導キットは、さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいてもよい。 Furthermore, dedifferentiation induction kit of said plant further the recombinant expression vectors may contain a reagent group for introduction into plant cells.

また、本発明にかかる有用物質の生産方法は、本発明にかかる植物体を、植物ホルモンの添加なしで培養し、二次代謝産物を生産させることを特徴としている。 Further, a method for producing a useful substance according to the present invention, the plant according to the present invention, cultured without addition of plant hormones, it is characterized in that to produce secondary metabolites.

また、本発明にかかる有用物質の生産方法は、表面が一部分化し、表面が一部分化した状態のまま増殖するカルス、または、上記形質転換工程で選択マーカーとして薬剤耐性遺伝子を用いて得られた植物体を当該選択マーカーの試薬である抗生物質を添加せずに培養して得られたカルスを、上記選択マーカーの試薬である抗生物質および植物ホルモンの添加なしで培養し、二次代謝産物を生産させる方法であってもよい。 Further, a method for producing a useful substance according to the present invention, the surface is a portion of, the surface of callus proliferation remains that a portion of or, obtained by using a drug resistance gene as a selectable marker in the transforming step plants the callus obtained body was cultured without the addition of antibiotics is a reagent of the selected markers, cultured without addition of antibiotics and plant hormone is a reagent of the selected markers, production of secondary metabolites or a method for.

すなわち、本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体の生産方法は、以上のように上記(a)〜(e)のいずれかに記載の遺伝子が発現するように、該遺伝子を含む組換え発現ベクターを植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることを特徴としている。 That is, the method of producing modified plant material as dedifferentiation of the present invention are derived are to express genes described in any one of the above (a) ~ (e) As described above, the a recombinant expression vector comprising a gene is characterized by containing the transforming step of introducing into a plant cell. これにより、得られる植物体は、植物ホルモン非存在下でも、茎、葉、根などの器官の正常な分化が抑制されカルス状になる。 Thus, the resulting plants, even in the absence of plant hormones, stem, leaf, is suppressed normal differentiation of organs, such as roots become callus shape. また、得られたカルス細胞は植物ホルモン無添加の培地でも増殖し、脱分化状態を維持したまま継代培養が可能である。 Moreover, callus cells obtained were grown in medium phytohormone not added, it is possible to leave subcultured maintaining the dedifferentiated state. また、特に、かかる方法により得られる植物体は、脱分化が誘導されるように改変されているという効果を奏する。 In particular, a plant body obtained by such a method, an effect that has been modified to dedifferentiation is induced.

本発明にかかる植物体の生産方法、植物体及びその利用について説明すると以下の通りである。 The method for producing a plant according to the present invention, is described below with the plant and its use.

上述したように、本発明者らは、植物体に比べ複数のカルス株で発現が促進されていた転写因子をコードする遺伝子を含むベクターを、該遺伝子が植物体内で発現するように植物体に導入することにより、脱分化が誘導されるように改変された植物体を生産することができることを見出した。 As described above, the present inventors, the vector comprising a gene encoding a transcription factor which expression was promoted by a plurality of callus lines compared to plants, the plants as the gene is expressed in plants by introducing, we found that it is possible to produce a modified plant as dedifferentiation is induced. また、この知見より、上記転写因子は、脱分化に関与し、脱分化を誘導する転写因子であることを初めて見出した。 Also, from this finding, the transcription factor is involved in dedifferentiated, found for the first time that a transcription factor that induces dedifferentiation. したがって、この脱分化に関与する転写因子をコードする遺伝子を含むベクターを植物体に導入することによって、脱分化が誘導されるように改変された植物体を生産することができる。 Thus, a vector comprising a gene encoding a transcription factor involved in the de-differentiation by introducing into plants, capable of producing modified plant material as dedifferentiation is induced.

すなわち、本発明にかかる植物体の生産方法は、この脱分化に関与する転写因子をコードする遺伝子を含むベクターを植物細胞に導入するものであればよい。 That is, the method for producing a plant according to the present invention, a vector comprising a gene encoding a transcription factor involved in the de-differentiation as long as it is introduced into plant cells. これにより、この脱分化に関与する転写因子が植物体内で過剰に生産される。 Accordingly, transcription factors involved in the de-differentiation is overproduced in plants.

かかる転写因子を植物体で過剰に生産させることによって得られる植物体では、上記転写因子の標的遺伝子の転写が促進されると考えられ、脱分化が誘導されるように改変された植物体を生産することができる。 The plants obtained by such transcription factor by overproduced in plants are considered transcription of target genes of the transcription factor is promoted, production of modified plants as dedifferentiation is induced can do. その結果、得られる植物体を脱分化が誘導されるように改変させることができる。 As a result, it is possible to alter the resulting plant body as dedifferentiation is induced.

本発明の生産方法で生産される脱分化が誘導されるように改変された植物体とは、分化が抑制されるように改変された植物体であるということもできる。 The modified plant as dedifferentiation is induced produced by the production method of the present invention, differentiation can be said that a modified plant as is suppressed. また、改変されたとは形質転換前と比較して改変されたことをいう。 Furthermore, means that the modified modified as compared to before transformation.

ここで、植物体が分化するとは、1つの単純な系又は細胞集団が2つ以上の互いに異質な系又は細胞集団に分かれることをいう。 Herein, the plant is differentiation, refers to a single simple system or cell population divides into two or more mutually heterogeneous systems or cell population. 例えば、植物体の表皮細胞やカルスからの不定胚の分化が知られており、この不定胚から子葉、頂芽、幼根等が再生する。 For example, it is known differentiation of somatic embryos from the epidermal cells or callus of a plant, cotyledons from the somatic embryos, apical, radicle like to play. また、脱分化とは、分化した組織や器官の細胞が再びより未分化性の高い状態に戻ることをいい、分化とは逆のプロセスである。 Moreover, the de-differentiation, cells differentiated tissues and organs is good to return to the state from high undifferentiated again, the differentiation is a reverse process. 言い換えれば、器官、組織などの機能分化・形態分化している細胞が、分裂を開始して、カルス化する現象をいう。 In other words, organ, cell functioning differentiation morphological differentiation, such as tissue, the start of the division, a phenomenon that callus.

また、脱分化が誘導されるように改変された植物体(すなわち分化が抑制されるように改変された植物体)とは、言い換えれば、脱分化しやすくなる(分化しにくくなる)ように改変された植物体をいう。 Further, the modified plants as dedifferentiation is induced (i.e. differentiation modified plants as inhibited), in other words, it tends to de-differentiation (hardly differentiate) so modified It has been referred to the plant. かかる植物体は、例えばオーキシンやサイトカイニン等の植物ホルモン非存在下で、通常は脱分化しない条件下でも、脱分化するか、分化のレベルが低くなるように改変された植物体であるということもできる。 Such plants, for example, a plant hormone absence of auxin and cytokinin like, usually even under conditions which do not de-differentiated, or dedifferentiation, also referred to the level of differentiation is modified plants to be lower it can. かかる植物体は、また、オーキシンやサイトカイニン等の植物ホルモンに対する感受性が高くなるように改変された植物体であるともいえる。 Such plants may also be said to be a modified plants as sensitive increases to plant hormones, such as auxin and cytokinin. なお、ここで植物ホルモンとは、植物の脱分化を制御するために用いられうるものであれば、オーキシンやサイトカイニンに限定されるものではなく、ジベレリン、エチレン、アブシジン酸、ジャスモン酸、ブラシノステロイド等も含まれる。 Here, the plant hormones, as long as it can be used to control the de-differentiation of plant, is not limited to auxin and cytokinin, gibberellin, ethylene, abscisic acid, jasmonic acid, brassinosteroids etc. are also included.

通常、カルスの誘導および維持(継代培養)には培地に上記植物ホルモンのうち特にオーキシンを添加する必要がある。 Usually, the induction and maintenance of callus (subculture), it is necessary to add a particular auxin of the plant hormone to the culture medium. しかしながら、本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体では、誘導および維持において外因性の植物ホルモンを必要としない。 However, in the modified plants as dedifferentiation of the present invention is derived, it does not require exogenous plant hormones in the induction and maintenance. すなわち、本発明の植物体では植物ホルモン非存在下でカルスの誘導と維持が可能である。 That is, in the plant of the present invention are possible induction and maintenance of callus in the absence of phytohormones.

なお、ここで、外因性の植物ホルモンとは培地に添加する植物ホルモンのことをいう。 Here, it refers to a plant hormone to be added to the medium and exogenous plant hormones. 一方、植物体内部で作られる植物ホルモンを内因性の植物ホルモンという。 On the other hand, the plant hormone produced within plants that endogenous plant hormones.

従来から誘導および維持に外因性の植物ホルモンを必要としないカルスとしては、クラウンゴールが知られている。 The callus that do not require exogenous plant hormones in induction and maintenance of conventional crown gall are known. また馴化したカルスにおいても維持に外因性の植物ホルモンを必要としなくなる。 The longer needs the exogenous plant hormones maintained in conditioned callus. この原因として、内因性の植物ホルモンであるオーキシンの濃度が高くなっていることがこれまでに報告されている。 As this reason, the concentration of auxin an endogenous plant hormone is high have been reported so far.

そこで、本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体でも内因性のオーキシンの濃度が高くなっていることが予想された。 Therefore, it was expected that modified concentrations of endogenous auxin in plants as dedifferentiation of the present invention are derived is high. このため、本発明者らは、オーキシン応答エレメントを配置したプロモーターにレポーター遺伝子としてβ―グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子を結合させたキメラ遺伝子を導入した植物体を、本発明にかかる植物体の生産方法を用いて、脱分化が誘導されるように改変し、内因性の植物ホルモンが過剰に生産されているか否かを調べた。 Therefore, the present inventors, a promoter placed auxin response element as a reporter gene β- glucuronidase (GUS) plant by introducing a chimeric gene by binding the gene, a method for producing a plant according to the present invention used, modified to dedifferentiation is induced, it was investigated whether endogenous plant hormone is overproduced. その結果、驚くべきことに、本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体では、オーキシンが過剰に生産されていないことが見出された。 As a result, surprisingly, in the modified plants as according to the present invention dedifferentiation is derived, it has been found that auxin is not overproduced. また、GC−MSを用いた、本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体の内因性のオーキシン(インドール酢酸)濃度の測定によっても、ベクターコントロール植物体と比べて内因性のオーキシン濃度が同程度か、むしろ低いことが見出された。 Further, using GC-MS, by measuring the endogenous auxin (indoleacetic acid) concentration of the modified plants as dedifferentiation of the present invention are derived, endogenous compared to the vector control plants of auxin concentration or the same degree, it was found to be rather low.

本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体では、このように、植物体内の内因性のオーキシンの濃度が、脱分化が誘導されるように改変される前と比較して、有意に増加していないことが好ましい。 The modified plants as according to the present invention dedifferentiation is induced, thus, the concentration of endogenous auxin plants, compared to before being modified to dedifferentiation is induced , it is preferable that does not increase significantly. なお、ここで、「有意に増加していない」とは、オーキシンの作用による遺伝子の変異や染色体の欠損などにより植物体の形態や代謝に影響を与える程度にまで増加していないことをいう。 Here, "not increased significantly" it means that not increased to an extent which affects the form and metabolism of plants due deficient mutations and chromosomal genes by the action of auxin. かかる増加量としては、脱分化が誘導されるように改変される前のオーキシンの濃度に対して、50%以下であることが好ましく、30%以下であることがより好ましく、20%以下であることがさらに好ましく、10%以下であることが特に好ましい。 Such increase, relative to the concentration before the auxin is modified to dedifferentiation is induced, preferably 50% or less, more preferably 30% or less, is 20% or less it is more preferable, and particularly preferably 10% or less. また、言い換えれば、本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体では、植物体内で内因性のオーキシンが過剰生産されていないことが好ましい。 Further, in other words, in the modified plants as dedifferentiation of the present invention are derived, it is preferred that the endogenous auxin is not overproduced in plants. また、植物体内の内因性のオーキシンの濃度は、脱分化が誘導されるように改変される前と比較して、同じであるか、または、減少していることがより好ましい。 The concentration of endogenous auxin plant body, as compared to before being modified to dedifferentiation is induced, the same or, more preferably is decreasing.

有用物質生産へのカルス培養の応用において、植物培養細胞であるカルスが有用物質生産能を失ってしまう大きな原因の一つとして、外因性のオーキシンの作用による遺伝子の変異や染色体の欠損などが関与していることがよく知られている。 In applications of callus culture to useful substance production, as one of the major causes of callus is cultured plant cells lose useful substance-producing ability, defects such as the involvement of mutations and chromosomal genes by the action of exogenous auxin it is well known that. 本発明にかかる植物体の生産方法により脱分化が誘導されるように改変された植物体で誘導されたカルスでは、かかる作用を有する外因性のオーキシンを添加する必要がないため、遺伝子の変異や染色体の欠損などが起こりにくいと考えられる。 The callus was induced in a modified plant as dedifferentiation is induced by the method for producing a plant according to the present invention, since it is not necessary to add exogenous auxin having such effect, Ya gene mutation such as the loss of the chromosome is considered unlikely to occur. 加えて、内因性のオーキシンが過剰に増加していないため、過剰な内因性のオーキシンによる同様の遺伝子の不活性化が起きにくいと考えられる。 In addition, since the endogenous auxin has not increased excessively, inactivation of similar genes by excess endogenous auxin is considered less likely to occur. それゆえ、本発明にかかる植物体は、有用物質生産に好適に用いることができると考えられる。 Therefore, a plant according to the present invention is believed to be able to be suitably used for the production of useful substances.

以降の説明では本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体の生産方法、これらの生産方法により得られる植物体とその有用性、並びにその利用についてそれぞれ説明する。 Modified method of producing a plant as dedifferentiation of the present invention are derived in the following description, these plants obtainable by production methods and their usefulness, as well as respectively described its use.

(I)脱分化が誘導されるように改変された植物体の生産方法 上述したように、本発明にかかる植物体の生産方法は、脱分化に関与する転写因子をコードする遺伝子を含むベクターを植物細胞に導入する。 As mentioned above the method of producing modified plants as (I) dedifferentiation is induced, the method for producing a plant according to the present invention, a vector comprising a gene encoding a transcription factor involved in dedifferentiation It is introduced into a plant cell. 以下、(I−1)脱分化に関与する転写因子、(I−2)本発明にかかる植物体の生産方法の一例の順に説明する。 Hereinafter will be described (I-1) transcription factors involved in dedifferentiation, in the order of an example of (I-2) a method for producing a plant according to the present invention.

(I−1)脱分化に関与する転写因子 本発明で用いられる転写因子は、脱分化に関与する転写因子であれば特に限定されるものではない。 Transcription factors used in the (I-1) transcription factor present invention involved in the de-differentiation, is not particularly limited as long as a transcription factor involved in the de-differentiation. かかる転写因子は、植物界で広く保存されている。 Such a transcription factor, which is widely conserved in the plant kingdom. したがって、本発明で用いられる転写因子には、種々の植物に保存されている同様の機能を有する転写因子が含まれる。 Thus, the transcription factor used in the present invention include transcription factors having similar functions that are stored in various plants.

本発明で用いられる転写因子の代表的な一例としては、例えば、シロイヌナズナのRAP2.4タンパク質(MIPS(Munich Information Center for Protein Sequence) No:At1g78080)及びこれらのホモログである、At1g22190タンパク質、At1g36060タンパク質等を挙げることができる。 As a typical example of the transcription factor used in the present invention, for example, RAP2.4 protein of Arabidopsis (MIPS (Munich Information Center for Protein Sequence) No: At1g78080) and is these homologs, At1g22190 protein, At1g36060 proteins, etc. it can be mentioned. RAP2.4タンパク質は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。 RAP2.4 protein is a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. At1g22190タンパク質は、配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。 At1g22190 protein is a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. At1g36060タンパク質は、配列番号5に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。 At1g36060 protein is a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.

また、本発明で用いられる転写因子としては、配列番号1、3または5にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するRAP2.4タンパク質、At1g22190タンパク質、またはAt1g36060タンパク質に限定されるものではなく、配列番号1、3または5に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の変異体であって、且つ、脱分化に関与するタンパク質であってもよい。 As the transcription factor used in the present invention, RAP2.4 protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 5, is not limited to At1g22190 protein or At1g36060 protein, SEQ ID NO: 1, a variant of the protein comprising the amino acid sequence shown in 3 or 5, and may be a protein involved in dedifferentiation. かかる変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、及び置換を含む変異体を挙げることができる。 Such mutants include deletions, insertions, reverse, repeat, and can be exemplified mutants comprising a substitution. 特に、タンパク質における「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのタンパク質の活性にほとんど影響しない。 Particularly, "neutral" amino acid substitutions in proteins, almost does not affect the generally the protein activity.

タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このタンパク質の構造又は機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。 Some amino acids in the amino acid sequence of the protein, is it can be easily modified without significantly affecting the structure or function of this protein, are well known in the art. さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造又は機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。 Furthermore, not only in artificially modified, in natural proteins, it is also known variants which do not significantly alter the structure or function of the protein.

当業者は、周知技術を使用してタンパク質のアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。 Those skilled in the art can easily mutate one or more amino acids in the amino acid sequence of the protein using well known techniques. 例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。 For example, according to mutagenesis known point, it is possible to mutate any base of a polynucleotide encoding the polypeptide. また、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体又は付加変異体を作製することができる。 Further, it is possible to primers corresponding to optional sites of the polynucleotide encoding the protein was designed to produce a deletion mutant or an addition mutant.

上記変異体は特に限定されるものではないが、タンパク質の活性を変化させない変異であることが好ましい。 The mutant is not particularly limited, but is preferably mutations that do not alter the activity of the protein. 具体的には、サイレント変異や保存性置換等が挙げられる。 Specifically, like silent mutations and conservative substitution or the like.

代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ala、Val、Leu、及びIleの中での1つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換;ヒドロキシル残基Ser及びThrの交換、酸性残基Asp及びGluの交換、アミド残基Asn及びGlnの間の置換、塩基性残基Lys及びArgの交換、ならびに芳香族残基Phe、Tyrの間の置換である。 That seen with typically conservative substitutions are aliphatic amino acids Ala, Val, Leu, and another substituent to an amino acid of one amino acid in the Ile; interchange of the hydroxyl residues Ser and Thr, the acidic residues replacement of Asp and Glu, substitution between the amide residues Asn and Gln, exchange of the basic residues Lys and Arg, and the aromatic residues Phe, substitution between the Tyr. また、サイレント置換は、アミノ酸が置換、添加又は欠失してもタンパク質活性に影響の無い変異である。 Further, silent substitutions, amino acid substitutions are added or deleted without mutations affect the protein activity also.

上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか(すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか)に関するさらなるガイダンスは、Bowie,JUら「Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions」,Science 247:1306-1310 (1990)(本明細書中に参考として援用される)に見出され得る。 As shown in detail in the above, which amino acid changes are likely to be phenotypically silent (i.e., not likely to have a significantly adverse effect on the function) further guidance on the, Bowie, JU Luo "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science 247: 1306-1310 (1990) can be found in (which is incorporated by reference herein).

また、上記転写因子は、脱分化に関与するタンパク質であって、配列番号1、3または5に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列であってもよい。 Further, the transcription factor is a protein involved in dedifferentiation, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 5, one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or addition it may be an amino acid sequences.

なお、上記の「配列番号1、3または5に示されるアミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列」における「1個又は数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、1から20個、好ましくは1から10個、より好ましくは1から7個、さらに好ましくは1個から5個、特に好ましくは1個から3個を意味する。 Incidentally, the above "in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 5, one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence," "one or several of the range "is not particularly limited, for example, 1 to 20, preferably 10 from 1, 1 from seven more preferably, further preferably 1 to 5, particularly preferably 3 amino acids from one to.

また、上記転写因子には、配列番号1、3または5に示されるアミノ酸配列との相同性が70%以上、好ましくは90%以上であるアミノ酸配列を有し、脱分化に関与するタンパク質も含まれる。 Included also in the transcription factor homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 5 70% or more, preferably has an amino acid sequence at least 90%, proteins involved in de-differentiate It is. このようなタンパク質におけるアミノ酸配列の相同性は、70%以上であればよいが、90%以上が好ましく、95%以上がより好ましく、98%以上がさらに好ましく、99%以上が特に好ましい。 Amino acid sequence homology in such proteins may if 70% or more, preferably 90%, more preferably at least 95%, more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more.

なお、本明細書における上記「相同性」とは、BLAST(Basic local alignment search tool;Altschul, SF et al,J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990)検索により得られた値を意味するものであり、アミノ酸配列の相同性は、BLAST検索アルゴリズムにより決定することができる。 Incidentally, the above-mentioned "homology" in the present specification, BLAST (Basic local alignment search tool;... Altschul, SF et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990) the value obtained by the search are those meaning, amino acid sequence homology can be determined by the BLAST search algorithm. 具体的には、BLASTパッケージ(sgi32bit版、ver. 2.0.12;NCBIより入手)のbl2seqプログラム(Tatiana A. Tatusova及びThomas L. Madden, FEMS Microbiol. Lett., 174, 247-250, 1999)を用い、デフォルトパラメーターにしたがって算出することができる。 Specifically, BLAST package; bl2seq program (Sgi32bit version, ver 2.0.12. Obtained from NCBI) (.. Tatiana A. Tatusova and Thomas L. Madden, FEMS Microbiol Lett, 174, 247-250, 1999) and used can be calculated according to the default parameters. ペアワイズ・アラインメント・パラメーターとして、プログラム名「blastp」を用い、Gap挿入Cost値を「0」とし、Gap伸長Cost値を「0」とし、Query配列のフィルターとして「SEG」を、Matrixとして「BLOSUM62」をそれぞれ用いる。 As a pairwise alignment parameter, using the program name "blastp", a Gap insertion Cost value is "0", the Gap extension Cost value is "0", the "SEG" as a filter for a Query sequence, as Matrix "BLOSUM62" used, respectively.

また、本発明で用いられる、脱分化に関与する転写因子のアミノ酸配列は、種の異なる数多くの植物間において、保存性が高いものと考えられる。 Also used in the present invention, the amino acid sequence of the transcription factors involved in de-differentiation between a number of plants of different species, it is considered that highly conserved. そのため、脱分化を誘導させたい個々の植物体において、脱分化に関与する転写因子やその遺伝子を必ずしも単離する必要はない。 Therefore, in each of the plants is desired to induce dedifferentiation, it is not always necessary to isolate the transcription factors and their genes involved in dedifferentiation. すなわち、後述する実施例で示す、シロイヌナズナ由来の上記転写因子を、他の植物で発現させることで、さまざまな種の植物において簡便に脱分化が誘導されるように改変された植物体を生産できることが予想される。 That is, shown in examples described later, the transcription factors from Arabidopsis thaliana, by expression in other plants, can be produced a modified plant so that easily de-differentiation in various species of plants derived There is expected.

本発明で用いられる転写因子を生産する際には、後述するように、公知の遺伝子組換え技術を好適に用いることができる。 In producing the transcription factor used in the present invention, as described below, it can be preferably used known genetic recombination techniques. そこで、本発明にかかる植物体の生産方法には、上記転写因子をコードする遺伝子も好適に用いることができる。 Therefore, the method for producing a plant according to the present invention can be suitably used a gene encoding the transcription factor.

上記転写因子をコードする遺伝子としては特に限定されるものではないが、具体的な一例としては、例えば、転写因子としてRAP2.4タンパク質を用いる場合には、このRAP2.4タンパク質をコードする遺伝子(説明の便宜上、RAP2.4遺伝子と称する)を、転写因子としてAt1g22190タンパク質を用いる場合には、このAt1g22190タンパク質をコードする遺伝子(説明の便宜上、At1g22190遺伝子と称する)を、転写因子としてAt1g36060タンパク質を用いる場合には、このAt1g36060タンパク質をコードする遺伝子(説明の便宜上、At1g36060遺伝子と称する)を挙げることができる。 Gene is not particularly limited as the gene encoding the transcription factor, as a specific example, for example, in the case of using RAP2.4 protein as a transcription factor, which encodes the RAP2.4 protein ( for convenience of description, is referred to as RAP2.4 gene), in the case of using the At1g22190 protein as a transcription factor, a gene encoding this At1g22190 protein (for convenience of explanation, referred to as At1g22190 gene), used At1g36060 protein as a transcription factor in this case, (for convenience of explanation, it referred to as At1g36060 gene) gene encoding this At1g36060 protein can be exemplified. RAP2.4タンパク質、At1g22190タンパク質、またはAt1g36060タンパク質の具体的な一例としてはそれぞれ、例えば、配列番号2、4または6に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム(ORF)として含むポリヌクレオチドを挙げることができる。 RAP2.4 proteins include a polynucleotide comprising each a specific example of the At1g22190 protein or At1g36060 protein, for example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6 as an open reading frame (ORF) .

もちろん、本発明で用いられる転写因子をコードする遺伝子としては、上記の例に限定されるものではなく、配列番号2、4または6に示される塩基配列と相同性を有する遺伝子であってもよい。 Of course, as the gene encoding a transcription factor for use in the present invention, is not limited to the above example, it may be a gene having a nucleotide sequence homologous of SEQ ID NO: 2, 4 or 6 . 具体的には、例えば、配列番号2、4または6に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、上記転写因子をコードする遺伝子等を挙げることができる。 Gene Specifically, for example, a gene that hybridizes under stringent conditions with a nucleotide sequence complementary to a gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6, and encoding the transcription factor and the like can be given. なお、ここでストリンジェントな条件でハイブリダイズするとは、60℃で2×SSC洗浄条件下で結合することを意味する。 Here, hybridizing under stringent conditions is meant binding with 2 × SSC washing conditions at 60 ° C..

上記ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。 The hybridization, J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Like the method described in Cold Spring Harbor Laboratory (1989), can be performed by a conventionally known method. 通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる(ハイブリダイズしにくくなる)。 Normally, the higher the temperature, the lower the salt concentration stringency (less likely to hybridize) becomes higher.

また、本発明で用いられる転写因子をコードする遺伝子としては、上記転写因子をコードする遺伝子の変異体であってもよい。 As the gene encoding a transcription factor for use in the present invention, it may be a variant of the gene encoding the transcription factor. 変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。 Variants, such as a natural allelic variants may occur naturally. 「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の1つが意図される。 By "allelic variant", one of several alternate forms of a gene occupying a given locus on a chromosome of an organism is intended. 天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。 Non-naturally occurring variants, for example may be produced using well-known mutagenesis techniques in the art. かかる変異体は特に限定されるものではないが、コードするタンパク質の活性を変化させない変異であることが好ましい。 Such variants is not particularly limited, but is preferably a mutant which does not alter the code of proteins activity.

このような変異体としては、上記転写因子をコードするポリヌクレオチドの塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換、又は付加した変異体が挙げられる。 Such variants, one or more nucleotides in the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the transcription factor is deleted, substituted, or added variants thereof. 変異体は、コードもしくは非コード領域、又はその両方において変異され得る。 Mutant coding or non-coding regions, or may be mutated in both. コード領域における変異は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸欠失、置換、又は付加を生成し得る。 Mutations in the coding regions, conservative or non-conservative amino acid deletions, to produce a substitution, or addition.

上記転写因子をコードする遺伝子を取得する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法により、多くの植物から単離することができる。 How to get the gene encoding the transcription factor is not limited in particular, by a conventionally known method can be isolated from many plants. 例えば、既知の転写因子をコードする遺伝子の塩基配列に基づき作製したプライマー対を用いることができる。 For example, it is possible to use based on the nucleotide sequence prepared primer pairs of the genes encoding the known transcription factor. このプライマー対を用いて、植物のcDNA又はゲノミックDNAを鋳型としてPCRを行うこと等により上記遺伝子を得ることができる。 Using this primer pair, a cDNA or genomic DNA of a plant can be obtained the gene such as by performing PCR as a template. また、上記転写因子をコードする遺伝子は、従来公知の方法により化学合成して得ることもできる。 Furthermore, the gene encoding the transcription factor may also be obtained by chemical synthesis by a conventionally known method.

本発明では、上記転写因子をコードする遺伝子を用いれば、上記転写因子を植物体で過剰に生産することができる。 In the present invention, the use of the gene encoding the transcription factor, the transcription factor may be excessively produced in plants. 具体的には、上記転写因子をコードする遺伝子を、当該遺伝子が発現するように植物体に導入する。 Specifically, a gene encoding the transcription factor is introduced into plant such that the gene is expressed. これにより、上記転写因子を過剰に生産することができる。 Thus, it is possible to over-production of the transfer factor. なお、過剰に生産するとは、上記転写因子をコードする外因性の遺伝子を導入し発現させることによって、外因性の遺伝子を導入しない場合と比較して、上記転写因子の発現量が多くなっていればよい。 Note that the excessive production is by introducing an exogenous gene encoding the transcription factor expression, as compared with the case of not introducing the exogenous gene, if an increasing number of the expression level of the transcription factor Bayoi.

(I−2)本発明にかかる植物体の生産方法の一例 本発明にかかる植物体の生産方法は、上記(I−1)で説明した転写因子を植物体で過剰に生産させる過程を含んでいれば特に限定されるものではないが、本発明にかかる植物体の生産方法を具体的な工程で示せば、例えば、発現ベクター構築工程、形質転換工程、選抜工程等の工程を含む生産方法として挙げることができる。 (I-2) a method for producing a plant according to one example the present invention of a method for producing a plant according to the present invention, comprises a process for over-producing the transcription factor described in the above (I-1) in plants is not particularly limited so placed, if Shimese a method for producing a plant according to the present invention in a specific process, for example, the expression vector constructing step, transforming step, as a production method comprising the steps such as screening step it can be mentioned. このうち、本発明では、少なくとも形質転換工程が含まれていればよい。 Among them, in the present invention may be contained at least transformation process. 以下、各工程について具体的に説明する。 It will be specifically described respective steps.

(I−2−1)発現ベクター構築工程 本発明において行われる発現ベクター構築工程は、上記(I−1)で説明した転写因子をコードする遺伝子と、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを構築する工程であれば特に限定されるものではない。 (I-2-1) expression vector constructing step executed in the expression vector constructing step The present invention builds a gene encoding a transcription factor described in the above (I-1), a recombinant expression vector comprising a promoter it is not particularly limited as long as it is a process.

上記組換え発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。 Examples of the vector becomes a base of the recombinant expression vector may be a conventionally known various vectors. 例えば、プラスミド、ファージ、又はコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。 For example, a plasmid can be used phage, or cosmid, etc., it can be appropriately selected depending on the plant cell or introducing method is introduced. 具体的には、例えば、pBR322、pBR325、pUC19、pUC119、pBluescript、pBluescriptSK、pBI系のベクター等を挙げることができる。 Specifically, for example, it can be mentioned pBR322, pBR325, pUC19, pUC119, pBluescript, pBluescriptSK, pBI vectors or the like. 特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、pBI系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。 In particular, when the method for introducing the vector into a plant body is a method using Agrobacterium, it is preferable to use a binary vector pBI system. pBI系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、pBIG、pBIN19、pBI101、pBI121、pBI221等を挙げることができる。 The pBI binary vector, specifically, for example, can be cited pBIG, pBIN19, pBI101, pBI121, pBI221, and the like.

上記プロモーターは、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。 The promoter is not particularly limited as long as the promoter capable of expressing the gene in plants, can be preferably used known promoters. かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(CaMV35S)、アクチンプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター、タバコのPR1a遺伝子プロモーター、トマトのリブロース1,5−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニットプロモーター等を挙げることができる。 Examples of such promoter include a cauliflower mosaic virus 35S promoter (CaMV35S), actin promoter, a promoter of nopaline synthase, PR-1a gene promoter of tobacco, tomato ribulose 1,5-diphosphate carboxylase-oxidase small subunit promoter it can be mentioned. この中でも、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター又はアクチンプロモーターをより好ましく用いることができる。 Among these, it can be used more preferably cauliflower mosaic virus 35S promoter or the actin promoter. 上記各プロモーターを用いれば、得られる組換え発現ベクターでは、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。 The use of each of the above promoters, the recombinant expression vector obtained, it is possible to strongly express any gene when introduced into a plant cell.

上記プロモーターは、転写因子をコードする遺伝子を発現しうるように連結され、ベクター内に導入されていればよく、組換え発現ベクターとしての具体的な構造は特に限定されるものではない。 The promoter is linked such capable of expressing a gene encoding a transcription factor, need only be introduced into the vector, the specific structure of the recombinant expression vector is not particularly limited.

上記組換え発現ベクターは、上記プロモーター及び上記転写因子をコードする遺伝子に加えて、さらに他のDNAセグメントを含んでいてもよい。 The recombinant expression vector, in addition to a gene encoding the promoter and the transcription factor may further contain other DNA segments. 当該他のDNAセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネーター、選択マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。 The other DNA segment is not particularly limited, it may be mentioned terminators, selectable markers, an enhancer, and a nucleotide sequence for enhancing translation efficiency. また、上記組換え発現ベクターは、さらにT−DNA領域を有していてもよい。 Further, the recombinant expression vector may further have a T-DNA region. T−DNA領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。 The T-DNA region, especially the recombinant expression vector using Agrobacterium can enhance the efficiency of gene transfer when introduced into plants.

ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。 Terminator is not limited in particular as long as it has a function as a transcription termination site, it may be of known. 例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域(Nosターミネーター)、カリフラワーモザイクウイルス35Sの転写終結領域(CaMV35Sターミネーター)等を好ましく用いることができる。 For example, specifically, transcriptional termination region (the Nos terminator) of a nopaline synthase gene transcription termination region (CaMV35S terminator) of cauliflower mosaic virus 35S and the like can be preferably used. この中でもNosターミネーターをより好ましく用いることができる。 It can be used more preferably Nos terminator in this.

上記形質転換ベクターにおいては、ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモーターがプラスミドのコピー数を減少させたりするような現象の発生を防止することができる。 In the transformation vector, by placing a terminator in place, after being introduced into a plant cell, or synthesized unnecessarily long transcripts, a strong promoter or decrease the plasmid copy number it is possible to prevent the occurrence of phenomena such as.

上記選択マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。 As the selection marker, can be used, for example a drug resistance gene. かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。 Such a specific example of a drug resistance gene, for example, can be cited hygromycin, bleomycin, kanamycin, gentamicin, a drug resistance gene against chloramphenicol. これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。 Thus, by selecting the plants that grow in media containing the antibiotic, it can be easily selected plants that have been transformed.

上記翻訳効率を高めるための塩基配列としては、例えばタバコモザイクウイルス由来のomega配列を挙げることができる。 The base sequence for improving the translation efficiency is an omega sequence from tobacco mosaic virus. このomega配列をプロモーターの非翻訳領域(5'UTR)に配置させることによって、上記転写因子をコードする遺伝子の翻訳効率を高めることができる。 The omega sequence is located in the untranslated region of the promoter (5'UTR), it is possible to increase the translation efficiency of the gene encoding the transcription factor. このように、上記形質転換ベクターには、その目的に応じて、さまざまなDNAセグメントを含ませることができる。 Thus, the above-mentioned transformation vector, depending on the purpose, it is possible to contain various DNA segments.

上記組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター及び転写因子をコードする遺伝子、並びに必要に応じて上記他のDNAセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。 There is no particular limitation on the method of constructing the recombinant expression vector, the vector comprising a suitably selected base, the gene encoding the promoter and transcription factors, as well as the other DNA segments as required predetermined it may be introduced so as to order. 例えば、転写因子をコードする遺伝子とプロモーターと(必要に応じてターミネーター等)とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。 For example, by connecting the gene promoter encoding a transcription factor and (optionally terminator) to construct an expression cassette may be introduced into a vector.

発現カセットの構築では、例えば、各DNAセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素で反応させることで、当該DNAセグメントの順序を規定することが可能となる。 The construction of expression cassettes, for example, leave the mutually complementary cohesive ends cleavage sites of each DNA segment, is reacted with ligation enzymes, it is possible to define the order of the DNA segment. なお、発現カセットにターミネーターが含まれる場合には、上流から、プロモーター、上記転写因子をコードする遺伝子、ターミネーターの順となっていればよい。 Incidentally, in the case that contains the terminator in the expression cassette, the upstream promoter, the gene encoding the transcription factor, it is sufficient that the forward terminator. また、組換え発現ベクターを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。 Further, reagents for constructing the recombinant expression vector, i.e. there is no particular limitation on the kind of such restriction enzymes and ligation enzymes, it may be selected and used commercially available ones as appropriate.

また、上記組換え発現ベクターの増殖方法(生産方法)も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。 Moreover, the growth method (producing method) of the recombinant expression vector is not particularly limited, it may be a conventionally known method. 一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌内で増殖させればよい。 In general, it is sufficient to grow in the E. coli as a host. このとき、ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。 At this time, depending on the type of vector may be selected type of preferred E. coli.

(I−2−2)形質転換工程 本発明において行われる形質転換工程は、上記(I−2−1)で説明した組換え発現ベクターを植物細胞に導入して、上記(I−1)で説明した転写因子を生産させるようになっていればよい。 (I-2-2) transformation step performed in the transformation process the present invention, the recombinant expression vector described in the above (I-2-1) was introduced into the plant cell, at the (I-1) the transcription factors described need only adapted to produce.

上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入する方法(形質転換方法)は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。 The recombinant expression vector method of introducing into a plant cell (transformation method) is not particularly limited, it is possible to use an appropriate known method according to the plant cells. 具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接植物細胞に導入する方法を用いることができる。 Specifically, for example, it is possible to use a method of introducing the method or direct plant cells using Agrobacterium. アグロバクテリウムを用いる方法としては、例えば、Transformation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration(http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)を用いることができる。 As a method using Agrobacterium, for example, can be used Transformation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration (http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm).

組換え発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法(電気穿孔法)、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。 As a method for introducing directly into plant cells a recombinant expression vector, for example, microinjection, electroporation method (electroporation), polyethylene glycol method, a particle gun method, the protoplast fusion method, the use of calcium phosphate method or the like it can.

上記組換え発現ベクターが導入される植物細胞としては、例えば、花、葉、根等の植物器官における各組織の細胞、カルス、懸濁培養細胞等を挙げることができる。 The plant cells the recombinant expression vector is introduced, for example, can be cited flowers, leaves, each tissue in plant organs roots such cells, callus, suspension culture cells.

ここで、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記組換え発現ベクターは、生産しようとする種類の植物体に合わせて適切なものを適宜構築してもよいが、汎用的な組換え発現ベクターを予め構築しておき、それを植物細胞に導入してもよい。 Here, in the method for producing a plant according to the present invention, the recombinant expression vector may be suitably constructed with appropriate depending on the type of plant to be produced, general recombinant the expression vector constructed in advance, it may be introduced into plant cells. すなわち、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記(I−2−1)で説明した組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。 That is, in the method for producing a plant according to the present invention, the may be included recombinant expression vector constructing step described in (I-2-1), it may not be contained.

(I−2−3)その他の工程、その他の方法 本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記形質転換工程が含まれていればよく、さらに上記組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいが、さらに他の工程が含まれていてもよい。 (I-2-3) other steps in other methods the method for producing a plant according to the present invention, may be contained the transforming step is, it contains further the recombinant expression vector constructing step it may be, but may include still other steps. 具体的には、形質転換後の植物体から適切な形質転換体を選抜する選抜工程等を挙げることができる。 Specifically, mention may be made of a selection process such as selecting a suitable transformant from plants after transformation.

選抜の方法は特に限定されるものではなく、例えば、ハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性を基準として選抜してもよいし、形質転換体を育成した後に、オーキシンやサイトカイニン等の植物ホルモン非存在下で通常脱分化が起こらないような条件下で、脱分化が起こる植物体から選抜してもよい。 The method of selection is not particularly limited, for example, drug resistance such as hygromycin resistance may be selected as a reference, after growing the transformant, a plant hormone absence of such auxin and cytokinin under conditions such that the normal de-differentiation does not occur, it may be selected from a plant that de-differentiation occurs.

本発明にかかる植物体の生産方法では、上記転写因子をコードする遺伝子を植物体に導入することにより、該植物体から、有性生殖又は無性生殖により単に、脱分化が誘導されるように改変された子孫を得ることが可能となる。 In the method for producing a plant according to the present invention, by a gene encoding the transcription factor is introduced into plants, the plant body, simply by sexual or asexual reproduction, as dedifferentiation is induced it is possible to obtain a modified progeny. また、該植物体やその子孫から植物細胞や、種子、果実、株、カルス、塊茎、切穂、塊等の繁殖材料を得て、これらを基に該植物体を量産することも可能となる。 Moreover, and plant cells from plants can be mass-produced, seeds, obtained fruits, strains, callus, tubers, cuttings, propagation material mass such, it is possible to mass-produce the plant body on the basis of these . したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、選抜後の植物体を繁殖させる繁殖工程(量産工程)が含まれていてもよい。 Therefore, in the method for producing a plant according to the present invention, breeding process (production process) to breed plants after selection may be included.

なお、本発明における植物体とは、成育した植物個体、植物組織、植物細胞、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれる。 Here, the plants of the present invention, grown plant individuals, plant tissue, plant cell, callus, at least one of seeds. つまり、本発明では、最終的に植物個体まで成育させることができる状態のものであれば、全て植物体と見なす。 That is, in the present invention, finally as long as the condition that can be grown to a plant individual, regarded as all plants. また、上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞が含まれる。 The aforementioned plant cells include plant cells of various forms. かかる植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。 Such plant cells, for example, suspension culture cells, protoplasts, leaf slices and the like. これらの植物細胞を増殖・分化させることにより植物体を得ることができる。 It is possible to obtain a plant body by proliferation and differentiation of these plant cells. なお、植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、従来公知の方法を用いて行うことができる。 The reproduction of the plant body from the plant cell, depending on the type of plant cells can be performed using a conventionally known method. したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、植物細胞から植物体を再生させる再生工程が含まれていてもよい。 Therefore, in the method for producing a plant according to the present invention may include a reproduction step of regenerating plants from plant cells.

また、本発明者らは、本発明にかかる植物体を、上記形質転換工程で用いられた選択マーカーの試薬であるハイグロマイシンを添加せずに培養したところ、カルス表面が分化し、この状態のまま植物ホルモン無添加の培地でも活発に増殖をすることを見出した。 Further, the present inventors, the plant according to the present invention, was cultured without the addition of hygromycin a reagent selection marker used in the transformation process, differentiated callus surface, in this state Mom in medium phytohormone not added was found to actively proliferating. そして、この状態で、シロイヌナズナで計測可能なモデル二次代謝産物として用いられるアントシアニンを誘導培地培養することにより、シロイヌナズナにおいて従来法で誘導されたカルスではほとんど生産されないアントシアニンを高濃度に生産する現象を見出した。 Then, in this state, by inducing medium culture anthocyanin used as measurable model secondary metabolites in Arabidopsis, a phenomenon that produces anthocyanins it is hardly produced in the callus induced by conventional methods in Arabidopsis high concentration heading was.

このように、形質転換体の選択マーカーの試薬である抗生物質を培地から除くと、本発明の植物体であるカルスは、カルスの表面が一部分化し、この状態のまま植物ホルモン無添加で増殖することができる。 Thus, except for the antibiotic is a reagent selection marker transformants from the culture medium, callus is a plant of the present invention, the surface of the callus is a portion of, proliferate while plant hormone-free addition of this state be able to. かかるカルスは、特に、特定の分化した組織で生合成が行われる二次代謝産物の生産に好適に用いることができる。 Such callus, particularly, can be suitably used for the production of secondary metabolites biosynthesis takes place in certain differentiated tissue. それゆえ、本発明にかかる植物体には、表面が一部分化し、表面が一部分化した状態のまま増殖するカルスも含まれる。 Therefore, the plant according to the present invention, the surface is a portion of, the surface also includes callus to grow in the state that a part of. また、本発明にかかる植物体は、上記形質転換工程で選択マーカーとして薬剤耐性遺伝子を用いて得られた植物体を、当該選択マーカーの試薬である抗生物質を添加せずに培養したカルスでありうる。 Furthermore, plants according to the present invention, the resulting plants using a drug resistance gene as a selectable marker in the transforming step, be callus cultured without the addition of antibiotics is a reagent of the selected marker sell.

ここで、上記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性遺伝子であり、より具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。 Here, the selectable marker, for example, a drug resistance gene, as a more specific example, for example, can be cited hygromycin, bleomycin, kanamycin, gentamicin, a drug resistance gene against chloramphenicol. 中でも、上記選択マーカーは、ハイグロマイシンに対する薬剤耐性遺伝子であることが好ましい。 Among them, the selection marker is preferably a drug resistance gene to hygromycin. また、上記選択マーカーの試薬である抗生物質としては、例えばハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等を挙げることができ、中でもハイグロマイシンをより好適に用いることができる。 As the antibiotic is a reagent of the selected markers, for example hygromycin, there may be mentioned bleomycin, kanamycin, gentamicin, chloramphenicol, etc., it can be used inter alia hygromycin more preferably.

(II)本発明により得られる植物体とその有用性、並びにその利用 本発明にかかる植物体の生産方法は、上記転写因子を植物体で過剰に生産させることによる。 (II) The present invention by a plant body obtained and their usefulness, as well as methods for producing a plant according to the use the present invention is by excess production of the transcription factor in plants. これにより、当該転写因子が標的とする標的遺伝子の転写が促進されると考えられる。 Thus, considered transcription of target genes in which the transcription factor is targeted is promoted. その結果、得られる植物体の脱分化が誘導されるように改変された植物体を生産することができる。 As a result, it is possible to de-differentiation of the resulting plant to produce a modified plant as induced. したがって、本発明には、上記植物体の生産方法により得られる植物体も含まれる。 Accordingly, the present invention provides plants obtainable by the method for producing the plant are also included.

(II−1)本発明にかかる植物体の具体例 ここで、本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体の具体的な種類は特に限定されるものではなく、かかる脱分化の誘導によりその有用性が高まる植物を挙げることができる。 Specific examples of (II-1) plant according to the present invention, where specific types of modified plants as dedifferentiation of the present invention are derived is not particularly limited, such de by induction of differentiation can be given its usefulness is enhanced plant. かかる植物は、被子植物であってもよいし裸子植物であってもよい。 Such plants can be the angiosperms may be gymnosperms. また、被子植物としては、単子葉植物であってもよいし、双子葉植物であってもよいが、双子葉植物であることがより好ましい。 As the angiosperms, may be a monocot, it may be a dicotyledonous plant, more preferably a dicotyledonous plant. 双子葉植物としては、離弁花亜綱であってもよいし、合弁花亜綱であってもよい。 The dicotyledonous plants, may be a Hanareben flower subclass, it may be a joint venture flower subclass. 合弁花亜綱としては、例えば、リンドウ目、ナス目、シソ目、アワゴケ目、オオバコ目、キキョウ目、ゴマノハグサ目、アカネ目、マツムシソウ目、キク目を挙げることができる。 The joint venture flower subclass, for example, gentianales, eggplant eyes, lamiales, callitrichales, plantaginales, campanulales, figwort eyes, Rubiales, mention may be made of dipsacales, the asterales. また、離弁花亜綱としては、例えば、ビワモドキ目、ツバキ目、アオイ目、サガリバナ目、ウツボカズラ目、スミレ目、ヤナギ目、フウチョウソウ目、ツツジ目、イワウメ目、カキノキ目、サクラソウ目等を挙げることができる。 In addition, as the Hanareben flower subclass, for example, dilleniales, theales, malvales, barringtonia eyes, nepenthales, violet eyes, willow eyes, capparales, ericales, Diapensia Lapponica eyes, ebenales, cited primrose eyes, etc. be able to.

本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体の具体例をさらに挙げると、ナタネ、ジャガイモ、ホウレンソウ、大豆、キャベツ、レタス、トマト、カリフラワー、さやいんげん、かぶ、大根、ブロッコリー、メロン、オレンジ、スイカ、ネギ、ゴボウなどの各種の食用植物、あるいはバラ、キク、あじさい、カーネーションなどの観葉植物またあるいは、ニチニチソウ、イチイ、オウレン、ハナビシソウ、キハダ、オタネニンジン、ケシ、イカリソウ、ベラドンナ、チョウセンアサガオ、Cephaelis ipecacuanhaなどの薬用植物を挙げることができる。 Taking a specific example of the modified plants as dedifferentiation of the present invention are derived further, rapeseed, potato, spinach, soybean, cabbage, lettuce, tomatoes, cauliflower, green beans, turnip, radish, broccoli, melons , orange, watermelon, green onions, a variety of edible plants such as burdock or roses, chrysanthemums, hydrangeas, and ornamental plants such as carnation, or,, periwinkle, yew, Coptis, California poppy, yellowfin tuna, Asian ginseng, poppy, Epimedium, belladonna, Datura , mention may be made of medicinal plants such as Cephaelis ipecacuanha.

(II−2)本発明の有用性 本発明では、植物体を脱分化が誘導されるように改変することができるが、本発明の有用性は特に限定されるものではなく、そのような脱分化の誘導により効果がある分野であればよい。 In (II-2) usefulness invention of the present invention, it can be modified so that induces dedifferentiation plants, utility of the present invention is not limited in particular, such a de it may be a field which has the effect by induction of differentiation. かかる分野としては、例えば、脱分化が誘導されるように改変されることによるカルス化が困難な植物のカルス化、カルスを用いた有用物質生産、カルスからの再分化系を利用した育種分野等を挙げることができる。 Such areas, for example, callus of callus are difficult plants by being modified to dedifferentiation is induced, useful substance production using callus, breeding areas using regeneration system from callus etc. it can be mentioned.

まず、カルス化が困難な植物のカルス化への応用例について説明すると、例えば、カルス化には用いる植物ホルモンの種類や濃度の検討が必要であり、例えばユーカリ、スギ等の木本類、ゴム、コムギ等のようにカルス化が困難な植物もある。 First, the callus will be described an example of application to callus difficult plants, for example, consider the type and concentration of plant hormone used in callus are required, for example eucalyptus, woody plants such as cedar, rubber , callus is also difficult to plant as such as wheat. このような、カルス化が困難な植物に、本発明に係る植物体の生産方法を用いて、脱分化を誘導することにより、カルス化を促進することができると考えられ、応用価値が高い。 Such a difficult plant callus, using the plant producing process according to the present invention, by inducing dedifferentiation, considered can promote callus, high application value.

また、有用物質生産への応用について説明すると、カルス培養において、植物培養細胞であるカルスが有用物質生産能を失ってしまう大きな原因の一つとして、過剰濃度のオーキシンの作用による遺伝子のメチル化などのエピジェネティックな変異(Lambe et al., In Vitro Cell.Dev.Biol.Plant . 33 .155-162(1997))や染色体の欠損などが関与していることがよく知られている。 Referring also to its application to producing useful substances in callus cultures, as one of the major causes of callus is cultured plant cells lose useful substance-producing ability, such as methylation of genes by the action of auxin excessive concentrations epigenetic mutations (Lambe et al., in Vitro Cell.Dev.Biol.Plant. 33 .155-162 (1997)) such as or chromosomal defects are well known to be involved. 有用物質生産においては、増殖能を有しつつ有用物質も安定して生産する(二次代謝も安定に発現させる)植物培養細胞が必要である。 In producing a useful substance, while having the ability to grow useful substances produced stably (secondary metabolism stably expressed) are required cultured plant cells. しかし、オーキシンは、形態を脱分化させ、細胞の増殖を促進するが、同時に二次代謝を抑制することが多い。 However, auxin, is dedifferentiated form, promotes the growth of cells, often inhibit secondary metabolic simultaneously.

本発明にかかる植物体の生産方法により脱分化が誘導されるように改変された植物体で誘導されたカルスでは、外因性のオーキシンを必要としないことに加え、アグロバクテリウムによって生ずる腫瘍細胞(クラウンゴール)等とは異なり、内因性のオーキシン(インドール酢酸)量が過剰に増加していないことが、実験的に明らかになっている。 The callus was induced in a modified plant as dedifferentiation is induced by the method for producing a plant according to the present invention, in addition to not require exogenous auxin, tumor cells caused by Agrobacterium ( Unlike crown gall), and the like, endogenous auxin (indoleacetic acid) amount that does not increase excessively, has been revealed experimentally. すなわち、培地に添加する外因性のオーキシンや、過剰な内因性のオーキシンによる遺伝子の不活性化が起きにくいと考えられる。 That, and exogenous auxin to be added to the medium, inactivation of genes by excess endogenous auxin is considered less likely to occur. それゆえ、本発明にかかる植物体は、有用物質の生産に好適に用いることができる。 Therefore, a plant according to the present invention can be suitably used for the production of useful substances.

また、本発明の植物体を選択マーカーの試薬であるハイグロマイシンを添加せずに培養すると、カルス表面が分化し、この状態のまま植物ホルモン無添加の培地でも活発に増殖をする。 Further, when culturing a plant of the present invention without addition of reagent and is hygromycin selectable marker, callus surface differentiation, the actively growing in medium phytohormone no additive remains in this state. この状態で、シロイヌナズナで計測可能なモデル二次代謝産物として用いられるアントシアニンを誘導培地培養することにより、シロイヌナズナにおいて従来法で誘導されたカルスではほとんど生産されない二次代謝産物(アントシアニン)を高濃度に生産する現象が見られている。 In this state, by inducing medium culture anthocyanin used as measurable model secondary metabolites in Arabidopsis, a high concentration of secondary metabolites (anthocyanins) which is hardly produced in the induced callus in a conventional manner in Arabidopsis phenomenon of production have been observed. このことから、本発明によって得られるカルスはホルモンの作用による二次代謝の不活性化が起こりにくいばかりか、部分的に再分化させることで二次代謝産物をより積極的に生産させることが可能であると考えられる。 Therefore, callus obtained by the present invention can be produced not only less prone to inactivation of secondary metabolites by the action of hormones, the secondary metabolites be partially regenerated more aggressively it is considered to be. この機能を有用で付加価値の高い物質(アルカロイドなど)をつくる薬用植物で応用できることが示されれば、これまでにない新しいタイプの細胞による新規な有用物質生産システムの構築が提案できる。 If shown to be able to apply this feature in medicinal plants produce useful, high-value-added material (such as alkaloids), it can be proposed to construct a new useful substance production system with a new type of cell unprecedented. さらに転写誘導系を利用(グルココルチコイド、estradiol、ガラクトース等)することで、培養環境因子と1対1の遺伝子発現制御が可能となり、脱分化状態(誘導系ON)で細胞量を増やし、再分化状態(誘導系OFF)で二次代謝産物を生産させることができ、より効率的な有用物質生産が可能になると考えられる。 Further use of the transcriptional induction system by (glucocorticoids, Estradiol, galactose, etc.), it is possible to gene expression control of the culture environment factors and one-to-one, increasing the amount of cells in a dedifferentiated state (induction system ON), redifferentiation in state (induction system OFF) can be produced secondary metabolites believed to allow more efficient production of useful substances.

また、育種分野への応用についても同様に、得られたカルスは選択マーカーであるハイグロマイシンを添加せずに培養すると組織化、特にシュートへの分化が起こりやすく、固体培養では発根し親植物体に戻る現象もみられることから、これらの再分化のメカニズムや分化誘導条件を研究および利用して行くことで、カルスの状態で細胞を増殖させ、その後再分化させることで大量の苗が生産可能であると考えられる。 Similarly, for the application to breeding areas, resulting callus is organized and cultured without the addition of hygromycin selection marker, it tends to occur particularly differentiation into shoots, rooted parental plants in solid culture from that seen also phenomenon back to the body, by going to research and use of these re-differentiation of mechanisms and differentiation-inducing conditions, cells were grown in the state of callus, the subsequent large number be to re-differentiation seedlings can be produced it is considered to be.

なお、上述したように、上記転写因子をコードする遺伝子のアンチセンス鎖を含むベクターやRNAiベクターを植物細胞に導入することによって、導入された植物体または細胞において脱分化を抑制することも可能と考えられる。 As described above, the vector or RNAi vector containing the antisense strand of the gene encoding the transcription factor by introducing into a plant cell, can be suppressed dedifferentiation in the introduced plants or cells and Conceivable. かかる方法により、脱分化が抑制されるように改変されることによる除草剤耐性植物の作製等への応用が可能となる。 Such methods, application to produce such a herbicide-tolerant plants due to dedifferentiation is modified so as to be suppressed becomes possible. すなわち、脱分化が抑制されるように改変された植物体は、オーキシン等の植物ホルモン感受性が低い。 That is, plant dedifferentiation has been modified to be suppressed is less plant hormone sensitive auxin like. それゆえ、オーキシン等の存在下でも生育可能な植物、つまりオーキシン等を利用した除草剤に対する除草剤耐性植物の作製に寄与できる。 Thus, viable plants in the presence of auxin like, can contribute to making the herbicide-tolerant plants that is to herbicides utilizing auxin like.

(II−3)本発明の利用 本発明の利用分野、利用方法は特に限定されるものではないが、一例として、上述したように、本発明にかかる植物体の生産方法により脱分化が誘導されるように改変された植物体は、有用物質の生産に好適に用いることができる。 (II-3) Field of Use The present invention of the present invention, but usage is not particularly limited, as an example, as described above, de-differentiation was induced by the method for producing a plant according to the present invention plant that has been modified to so that may be suitably used for the production of useful substances. それゆえ、本発明には、本発明の植物体を、植物ホルモンの添加なしで培養し、二次代謝産物を生産させる有用物質の生産方法も含まれる。 Therefore, the present invention is a plant of the present invention, cultured without addition of plant hormones, also includes a method for producing a useful substance to produce secondary metabolites.

本発明にかかる有用物質の生産方法は、本発明の植物体を培養し二次代謝産物を生産させる方法であれば、特に限定されるものではなく、従来公知のあらゆる方法を用いることができる。 The method for producing a useful substance according to the present invention, as long as it is a method for producing a cultured secondary metabolites plants of the present invention, is not particularly limited, and may be a conventionally known any method.

また、本発明にかかる有用物質の生産方法には、表面が一部分化し、表面が一部分化した状態のまま増殖するカルス、または、上記形質転換工程で選択マーカーとして薬剤耐性遺伝子を用いて得られた植物体を当該選択マーカーの試薬である抗生物質を添加せずに培養して得られたカルスを、上記選択マーカーの試薬である抗生物質および植物ホルモンの添加なしで培養し、二次代謝産物を生産させる方法も含まれる。 Further, the method for producing a useful substance according to the present invention, the surface is part of, callus proliferation remain surface has a portion of or, obtained by using a drug resistance gene as a selectable marker in the transforming step calli resulting plants are cultured without the addition of antibiotics is a reagent of the selected markers, cultured without addition of antibiotics and plant hormone is a reagent of the selected markers, secondary metabolites a method of production is also included.

また、本発明の利用分野、利用方法の他の一例としては、本発明にかかる植物体の生産方法を行うためのキット、すなわち脱分化誘導キットを挙げることができる。 Further, utilization field of the present invention, the another example of usage, a kit for performing the method for producing a plant according to the present invention, i.e., can be cited dedifferentiation induction kit.

この脱分化誘導キットの具体例としては、上記転写因子をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを少なくとも含んでいるものを挙げることができる。 The specific examples of the dedifferentiation induction kit may include those that include at least a recombinant expression vector comprising a gene encoding the transcription factor. また、本発明にかかる脱分化誘導キットは、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいればより好ましい。 Also, de-differentiation inducing kit according to the present invention, the recombinant expression vectors and more preferably if it contains a reagent group for introduction into plant cells. 上記試薬群としては、形質転換の種類に応じた酵素やバッファー等を挙げることができる。 As the reagent group, it may be mentioned enzymes and buffers and the like depending on the type of transformation. その他、必要に応じてマイクロ遠心チューブ等の実験用素材を添付してもよい。 Other, it may be accompanied by laboratory materials such as a micro centrifuge tubes if necessary.

以下、実施例及び図1ないし図6に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Figures 1-6, the present invention is not limited to the following examples.

〔実施例1〕 Example 1
以下の実施例1においては、シロイヌナズナ由来のRAP2.4遺伝子(At1g78080)をカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(以下の説明では、便宜上、CaMV35Sと称する)の下流につないで組換え発現ベクターを構築し、これをシロイヌナズナにアグロバクテリウム法を用いて導入することにより、シロイヌナズナを形質転換し、RAP2.4遺伝子を過剰発現させた形質転換植物体を生産した。 In Example 1 below, RAP2.4 gene from Arabidopsis thaliana (At1g78080) (In the following description, for convenience, referred to as CaMV35S) cauliflower mosaic virus 35S promoter to construct a recombinant expression vector by connecting downstream of which the by introducing by the Agrobacterium method to Arabidopsis, Arabidopsis was transformed to produce transformed plants overexpressing RAP2.4 gene.

<形質転換用ベクター構築用ベクターの構築> <Construction of transformation vector construction for the vector>
形質転換用ベクター構築用ベクターであるp35SGを、図1に示すように、以下の工程(1)〜(4)のとおりに構築した。 The p35SG a transformation vector construct vectors, as shown in FIG. 1, was constructed as follows steps (1) to (4).

(1)インビトロジェン社製pENTRベクター上のattL1、attL2のそれぞれの領域をプライマーattL1−F(配列番号7)、attL1−R(配列番号8)、attL2−F(配列番号9)、attL2−R(配列番号10)を用いてPCRにて増幅した。 (1) Invitrogen pENTR vectors on attL1, each region primer attL2 attL1-F (SEQ ID NO: 7), attL1-R (SEQ ID NO: 8), attL2-F (SEQ ID NO: 9), attL2-R ( It was amplified by PCR using SEQ ID NO: 10). 得られたattL1断片を制限酵素HindIII、attL2断片をEcoRIで消化し、精製した。 Limiting the resulting attL1 fragment enzyme HindIII, the attL2 fragment was digested with EcoRI, and purified. PCR反応の条件は、変性反応94℃1分、アニール反応47℃2分、伸長反応74℃1分を1サイクルとして、25サイクル行った。 The PCR reaction conditions, denaturation 94 ° C. 1 min, annealing reaction 47 ° C. 2 minutes, the elongation reaction 74 ° C. 1 minute as one cycle was conducted 25 cycles. 以下すべてのPCR反応は同じ条件で行った。 All of the PCR reaction the following was carried out under the same conditions.

(2)クローンテック社製(Clontech社、USA)のプラスミドpBI221を制限酵素XbaIとSacIで切断した後、アガロースゲル電気泳動でGUS遺伝子を除き、CaMV35Sとノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域(以下の説明では、便宜上、Nos−terと称する)を含む35S−Nosプラスミド断片DNAを得た。 (2) Clontech (Clontech Inc., USA) was digested with restriction enzymes XbaI and SacI of plasmid pBI221 of, except for GUS gene by agarose gel electrophoresis, transcription termination region (following the CaMV35S and nopaline synthase gene in the description, for convenience, to obtain a 35S-the Nos plasmid fragment DNA containing the called Nos-ter).

(3)以下の配列番号11、12の配列を有するDNA断片を合成し、90℃で2分間加熱した後、60℃で1時間加熱し、その後室温(25℃)で2時間静置してアニーリングさせ2本鎖を形成させた。 (3) The following were synthesized DNA fragment having the sequence of SEQ ID NO: 11 and 12, was heated 2 min at 90 ° C., then heated for 1 hour at 60 ° C., then allowed to stand for 2 hours at room temperature (25 ° C.) annealed to form a double-stranded. これを上記35S−Nosプラスミド断片DNAのXbaI−SacI領域にライゲーションし、p35S−Nosプラスミドを完成させた。 This was ligated to the XbaI-SacI region of the 35S-the Nos plasmid fragment DNA, thus completing the p35S-the Nos plasmid. 配列番号11、12の配列を有するDNA断片には、5'末端にBamHI制限酵素部位、翻訳効率を高めるタバコモザイクウイルス由来のomega配列、及び制限酵素部位SmaI、SalI、SstIがこの順に含まれる。 The DNA fragment having the sequence of SEQ ID NO: 11, 12, BamHI restriction enzyme site at the 5 'end, omega sequence from tobacco mosaic virus enhancing the translation efficiency, and restriction enzyme sites SmaI, SalI, SstI are included in this order.
5'-ctagaggatccacaattaccaacaacaacaaacaacaaacaacattacaattacagatcccgggggtaccgtcgacgagctc-3'(配列番号11) 5'-ctagaggatccacaattaccaacaacaacaaacaacaaacaacattacaattacagatcccgggggtaccgtcgacgagctc-3 '(SEQ ID NO: 11)
5'-cgtcgacggtacccccgggatctgtaattgtaatgttgtttgttgtttgttgttgttggtaattgtggatcct-3'(配列番号12) 5'-cgtcgacggtacccccgggatctgtaattgtaatgttgtttgttgtttgttgttgttggtaattgtggatcct-3 '(SEQ ID NO: 12)
(4)このp35S−Nosプラスミドを制限酵素HindIIIで消化し、上記attL1断片を挿入した。 (4) was digested with the p35S-the Nos plasmid with the restriction enzyme HindIII, and inserted the attL1 fragment. さらにこれをEcoRIで消化し、attL2断片を挿入して、ベクターp35SGを完成させた。 Furthermore it was digested with EcoRI, insert the attL2 fragment, to complete the vector P35SG.

<形質転換用ベクターの構築> <Construction of the vector for transformation>
構築用ベクターのatt部位で挟まれたDNA断片と組換えるための、2つのatt部位を有する植物形質転換用ベクターであるpBIGCKHを、図2に示すように、以下の工程(1)から(3)のとおりに構築した。 For changing DNA fragments and assembled sandwiched by att site of construction vector, the pBIGCKH a plant transformation vector with two att sites, as shown in FIG. 2, the following steps (1) (3 ) were constructed as described.

(1)米国ミシガン州立大学より譲渡されたpBIG(Becker, D. Nucleic Acids Res. 18:203,1990)を制限酵素HindIII、EcoRIで消化し、GUS、Nos領域を電気泳動で除いた。 (1) U.S. been assigned from Michigan State University pBIG (Becker, D. Nucleic Acids Res 18:. 203,1990) restriction enzyme HindIII, it was digested with EcoRI, and except GUS, the Nos region by electrophoresis.

(2)インビトロジェン社から購入したGateway(登録商標)ベクターコンバージョンシステムのFragmentAをプラスミドpBluscriptのEcoRVサイトに挿入した。 (2) The FragmentA of the Gateway (R) vector conversion system purchased from Invitrogen was inserted into the EcoRV site of the plasmid pBluscript. これをHindIII−EcoRIで消化し、FragmentA断片を回収した。 This was digested with HindIII-EcoRI, was recovered FragmentA fragment.

(3)回収したFragmentA断片を上記のpBIGプラスミド断片とライゲーションを行い、pBIGCKHを構築した。 (3) The recovered FragmentA fragment performs pBIG plasmid fragment ligation described above to construct PBIGCKH. これらは大腸菌DB3.1(インビトロジェン社)でのみ増殖可能で、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性である。 These are only capable of growing in E. coli DB3.1 (Invitrogen), chloramphenicol resistance, kanamycin resistance.

<構築用ベクターへのRAP2.4遺伝子の組み込み> <Built-in RAP2.4 gene to construct a vector for>
上記構築用ベクターp35SGにシロイヌナズナ由来の転写因子RAP2.4タンパク質をコードする遺伝子を以下の工程(1)〜(3)のとおりに組み込み、p35SRAP2.4Gを得た。 The construction vector p35SG follows a gene encoding a transcription factor RAP2.4 protein from Arabidopsis thaliana step (1) built as ~ (3), to obtain a P35SRAP2.4G.

(1)シロイヌナズナ葉から調整したmRNAを用いて作成したcDNAライブラリーから、以下のプライマーを用いて、シロイヌナズナRAP2.4遺伝子の終止コドンを含むコード領域のみを含むDNA断片をPCRにて増幅した。 (1) from the cDNA library made using mRNA was prepared from Arabidopsis, using the following primers, a DNA fragment containing only the coding region including the stop codon of the Arabidopsis RAP2.4 gene was amplified by PCR.
プライマー1(RAP2.4−F)5'-ATGGCAGCTGCTATGAATTTGTAC-3'(配列番号13) Primer 1 (RAP2.4-F) 5'-ATGGCAGCTGCTATGAATTTGTAC-3 '(SEQ ID NO: 13)
プライマー2(RAP2.4−R)5'-CTAAGCTAGAATCGAATCCCAATC-3'(配列番号14) Primer 2 (RAP2.4-R) 5'-CTAAGCTAGAATCGAATCCCAATC-3 '(SEQ ID NO: 14)
RAP2.4遺伝子の塩基配列及びコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号2及び1に示す。 RAP2.4 gene nucleotide sequence and encoded amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and 1.

(2)得られたRAP2.4コード領域のDNA断片を、図3に示すように、予め制限酵素SmaIで消化しておいた構築用ベクターp35SGのSmaI部位にライゲーションした。 (2) a DNA fragment of RAP2.4 coding regions obtained, as shown in FIG. 3, and ligated into the SmaI site of construction vector p35SG previously digested with restriction enzyme SmaI.

(3)このプラスミドで大腸菌を形質転換し、プラスミドを調整して、塩基配列を決定し、順方向に挿入されたクローンを単離した。 (3) E. coli was transformed with this plasmid, by adjusting the plasmid, sequenced, and inserted cloned in the forward direction was isolated.

<組換え発現ベクターの構築> <Construction of recombinant expression vector>
上記構築用ベクター上にあるCaMV35Sプロモーター、RAP2.4遺伝子、Nos−ter等を含むDNA断片を、植物形質転換用ベクターpBIGCKHに組換えることにより、植物を宿主とする発現ベクターを構築した。 CaMV35S promoter located on the construct vector, RAP2.4 gene, a DNA fragment containing such the Nos-ter, by recombining the plant transformation vector PBIGCKH, to construct an expression vector for a plant with host. 組換え反応はインビトロジェン社のGateway(登録商標)LR clonase(登録商標)を用いて以下の工程(1)〜(3)のとおりに行った。 Recombination reaction was carried out as follows steps (1) - using the Invitrogen Gateway (R) LR clonase (TM) (3).

(1)まず、RAP2.4コード領域のDNA断片が順方向に挿入されたp35SRAP2.4G 1.5μL(約150ng)とpBIGCKH4.0μL(約400ng)に5倍希釈したLR buffer 4.0μLとTE緩衝液(10mM TrisCl pH7.0、1mM EDTA)5.5μLを加えた。 (1) First, RAP2.4 p35SRAP2.4G DNA fragment of the coding region was inserted in the forward direction 1.5 .mu.L (approximately 150 ng) and PBIGCKH4.0MyuL (approximately 400 ng) in 5-fold diluted LR buffer 4.0μL and TE buffer It was added (10mM TrisCl pH7.0,1mM EDTA) 5.5μL.

(2)この溶液にLR clonase4.0μLを加えて25℃で60分間インキュベートした。 (2) was incubated with LR clonase4.0μL 25 ℃ in 60 minutes to the solution. 続いて、proteinaseK4.0μLを加えて37℃で10分間インキュベートした。 Followed by incubation with proteinaseK4.0μL 37 ℃ for 10 minutes.

(3)その後、この溶液1〜2μLを大腸菌(DH5a等)に形質転換し、カナマイシンで選択した。 (3) Thereafter, the solution 1~2μL was transformed into E. coli (DH5a, etc.) and selected on kanamycin.

<組換え発現ベクターにより形質転換した植物体の生産> <Production of plants transformed with the recombinant expression vector>
次に、以下の工程(1)〜(3)に示すように、上記RAP2.4遺伝子を含むDNA断片をpBIGCKHに組み込んだプラスミドであるpBIG−RAP2.4(35S::RAP2.4)で、シロイヌナズナの形質転換を行い、形質転換植物体を生産した。 Next, the following steps (1) to (3) as shown in, pBIG-RAP2.4 a plasmid incorporating a DNA fragment containing the RAP2.4 gene pBIGCKH (35S :: RAP2.4), performs a transformation of Arabidopsis thaliana, they produced a transformed plant. シロイヌナズナ植物の形質転換は、Transformation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration(http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)に従った。 The transformation of Arabidopsis plants, according to the Transformation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration (http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm). ただし、感染させるのにバキュウムは用いないで、浸すだけにした。 However, not Bakyuumu is used to infect, was only to soak.

(1)まず得られたプラスミド、pBIG−RAP2.4を、土壌細菌((Agrobacterium tumefaciens strain GV3101(C58C1Rifr)pMP90(Gmr)(koncz and Sahell 1986))株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を、抗生物質(カナマイシン(Km)50μg/ml、ゲンタマイシン(Gm)25μg/ml、リファンピシリン(Rif)50μg/ml)を含む1リットルのLB培地でOD600が1になるまで培養した。次いで、培養液から菌体を回収し、1リットルの感染用培地(Infiltration medium、下表1)に懸濁した。 (1) First the resulting plasmid, the pBIG-RAP2.4, introduced in soil bacteria ((Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 (C58C1Rifr) pMP90 (Gmr) (koncz and Sahell 1986)) electroporation method to strain. Introduced bacteria were cultured until antibiotic OD600 with 1 liter of LB medium containing (kanamycin (Km) 50 [mu] g / ml, gentamycin (Gm) 25 [mu] g / ml, rifampicin (Rif) 50μg / ml) to 1. then, the culture the cells were collected from the liquid, and suspended in infection medium 1 liter (Infiltration medium, the following table 1).

(2)この溶液に、14日間育成したシロイヌナズナを2分間浸し感染させた後、再び育成させ結種させた。 (2) to the solution and allowed to soak for 2 minutes infect Arabidopsis thaliana grown for 14 days, it was sintered species was again grown. 回収した種子を25%ブリーチ(有効次亜塩素酸濃度1.5%)、0.02%Triton X-100溶液で7分間滅菌した後、滅菌水で3回リンスし、滅菌したハイグロマイシン選択培地(下表2)に蒔種した。 Collected seeds 25% bleach (effective hypochlorous acid concentration of 1.5%), was sterilized for 7 minutes with 0.02% Triton X-100 solution, rinsed three times with sterile water, sterile hygromycin selection medium They were seeded in (table 2 below).

(3)蒔種した約2000粒の種子から平均して20ないし30個体のハイグロマイシン耐性植物である形質転換植物体を得た。 (3) 20 to on average from seeded were approximately 2000 seeds were obtained a transformed plant body is 30 individual hygromycin-resistant plants. これらの植物から全RNAを調整し、RT−PCRを用いてRAP2.4遺伝子が導入されていることを確認した。 Adjust the total RNA from these plants, RAP2.4 gene using RT-PCR has confirmed that it is introduced. 得られた形質転換植物体は著しく分化が抑制され、次第に茎頂、胚軸および根がカルス化した。 The resulting transformed plants is distinctly differentiated suppressed, shoot apex, the hypocotyl and roots were callus gradually.

<植物ホルモン非存在下でのカルス化> <Callus in the presence of non-plant hormone>
得られた形質転換植物体の芽生えを、植物ホルモン(オーキシン及びサイトカイニン)非存在のハイグロマイシンを含むCIM培地で生育させた。 The seedlings obtained transformed plant were grown in the CIM medium containing plant hormones (auxins and cytokinins) the absence of hygromycin. 下表3にCIM培地の組成を、下表4にB5培地の組成を示す。 The composition of CIM medium in Table 3 below, shows the composition of the B5 medium in Table 4 below. なお、本実施例において用いた植物ホルモン非存在のCIM培地は、表3中、オーキシン(「2,4−D」と表示。)とサイトカイニンの一種であるカイネチンとを加えていない培地である。 Incidentally, CIM medium phytohormones absence used in this example, in Table 3, (indicated as "2,4-D".) Auxin as a medium with no added and kinetin is a kind of cytokinin. また、CIM培地に加えたハイグロマイシンの量は、CIM培地1lに対し30 mgであった。 The amount of hygromycin was added to the CIM medium was 30 mg to CIM medium 1l.

35S−RAP2.4を用いてRAP2.4遺伝子を過剰発現させた形質転換植物体を上記植物ホルモン非存在のCIM培地で生育させた結果を図4に示す。 The results of the overexpressed transformed plant the RAP2.4 gene were grown in CIM medium of the plant hormone absence using 35S-RAP2.4 shown in FIG. 通常植物体をカルス化させるには、植物ホルモンが存在する培地で生育させなければならないが、図4に示すように、35S−RAP2.4(35S::RAP2.4)で形質転換されたシロイヌナズナの幼植物は、植物ホルモン非存在下でも、茎、葉、根などの器官分化が抑制されカルス状の植物体となった。 To callus normal plants, it must be grown in a medium the presence of plant hormones, as shown in FIG. 4, transformed with 35S-RAP2.4 (35S :: RAP2.4) Arabidopsis the seedlings, even in the absence of plant hormones, were stems, leaves, organs differentiation such as roots is inhibited callus-like plant. なお、図4(a)中スケールバーは3mmを、図4(b)中スケールバーは5mmを示す。 Incidentally, a medium scale bar 3mm FIG. 4 (a), the FIG. 4 (b) medium scale bars indicate 5 mm. このように、35S−RAP2.4でRAP2.4遺伝子を過剰発現させたシロイヌナズナ形質転換体では、オーキシン及びカイネチン不存在下でも、これらが存在するのと同様に脱分化が誘導された。 Thus, in a 35S-RAP2.4 RAP2.4 gene overexpressed Arabidopsis transformants in auxin and kinetin absence, it was induced Similarly dedifferentiation and that these are present. このことから、RAP2.4遺伝子でコードされる転写因子は、脱分化に関与する転写因子であることが確認された。 Therefore, transcription factors encoded by RAP2.4 gene was confirmed to be a transcription factor involved in dedifferentiation.

〔実施例2〕 Example 2
シロイヌナズナ由来のRAP2.4遺伝子(At1g78080)の代わりにシロイヌナズナ由来の遺伝子(At1g22190)を用いた以外は実施例1と同様にして、シロイヌナズナを形質転換し、At1g22190遺伝子を過剰発現させた形質転換植物体を生産した。 Except for using the Arabidopsis genes from (At1g22190) instead of RAP2.4 gene from Arabidopsis thaliana (At1g78080) in the same manner as in Example 1, Arabidopsis thaliana was transformed transgenic plant overexpressing At1g22190 gene was production.

なお、At1g22190遺伝子の終止コドンを含むコード領域のみを含むDNA断片をPCRにて増幅するにあたり以下のプライマーを用いた。 Incidentally, the following primers were used Upon amplifying a DNA fragment containing only the coding region including the termination codon of the At1g22190 gene in PCR.
プライマー1(At1g22190−F)5'-ATGACAACTTCTATGGATTTTTACAG-3'(配列番号15) Primer 1 (At1g22190-F) 5'-ATGACAACTTCTATGGATTTTTACAG-3 '(SEQ ID NO: 15)
プライマー2(At1g22190−R)5'-CTAATTTACAAGACTCGAACACTG-3'(配列番号16) Primer 2 (At1g22190-R) 5'-CTAATTTACAAGACTCGAACACTG-3 '(SEQ ID NO: 16)
また、At1g22190遺伝子の塩基配列及びコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号4及び3に示す。 The amino acid sequence and the nucleotide sequence encoding the At1g22190 gene in SEQ ID NO: 4 and 3.

得られた形質転換植物体の芽生えの一部を切り取り、実施例1と同様にして植物ホルモン非存在下のCIM培地で生育させた結果を図5に示す。 The resulting cut portion of the seedlings of transformed plants, Figure 5 shows the results grown in CIM medium phytohormones absence in the same manner as in Example 1. 図5中AおよびBは、個別の2ラインの形質転換体の結果を示す。 Figure 5 A and B show the results of the transformants separate two lines. 図5に示すように、35S::At1g22190で形質転換されたシロイヌナズナの幼植物は、植物ホルモン非存在下でも、正常な植物体にならず脱分化(カルス化)した。 As shown in FIG. 5, seedlings Arabidopsis thaliana transformed in 35S :: At1g22190, even in the absence of plant hormones, it was not normal plant dedifferentiation (callus). なお、図5中スケールバーは3mmを示す。 Incidentally, the scale bar in FIG. 5 shows a 3 mm.

〔実施例3〕 Example 3
シロイヌナズナ由来のRAP2.4遺伝子(At1g78080)の代わりにシロイヌナズナ由来の遺伝子(At1g36060)を用いた以外は実施例1と同様にして、シロイヌナズナを形質転換し、At1g36060遺伝子を過剰発現させた形質転換植物体を生産した。 Except for using the Arabidopsis genes from (At1g36060) instead of RAP2.4 gene from Arabidopsis thaliana (At1g78080) in the same manner as in Example 1, Arabidopsis thaliana was transformed transgenic plant overexpressing At1g36060 gene was production.

なお、At1g36060遺伝子の終止コドンを含むコード領域のみを含むDNA断片をPCRにて増幅するにあたり以下のプライマーを用いた。 Incidentally, the following primers were used Upon amplifying a DNA fragment containing only the coding region including the termination codon of the At1g36060 gene in PCR.
プライマー1(At1g36060−F)5'-ATGGCGGATCTCTTCGGTGG-3'(配列番号17) Primer 1 (At1g36060-F) 5'-ATGGCGGATCTCTTCGGTGG-3 '(SEQ ID NO: 17)
プライマー2(At1g36060−R)5'-TCACGATAAAATTGAAGCCCAATC-3'(配列番号18) Primer 2 (At1g36060-R) 5'-TCACGATAAAATTGAAGCCCAATC-3 '(SEQ ID NO: 18)
また、At1g36060遺伝子の塩基配列及びコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号6及び5に示す。 Also, it is shown in SEQ ID NO: 6 and 5 the amino acid sequence and the nucleotide sequence encoding the At1g36060 gene.

得られた形質転換植物体の芽生えの一部を切り取り、実施例1と同様にして植物ホルモン非存在のCIM培地で生育させた結果を図6に示す。 Cut a part of the seedlings obtained transformed plant, shown in FIG. 6 the results grown in CIM medium phytohormones absence in the same manner as in Example 1. 図6中AおよびBは、個別の2ラインの形質転換体の結果を示す。 6 in A and B show the results of the transformants separate two lines. 図6に示すように、35S::At1g36060で形質転換されたシロイヌナズナの幼植物は、植物ホルモン非存在下でも、正常な植物体にならず脱分化(カルス化)した。 As shown in FIG. 6, seedlings Arabidopsis thaliana transformed in 35S :: At1g36060, even in the absence of plant hormones, it was not normal plant dedifferentiation (callus). なお、図6中スケールバーは3mmを示す。 Incidentally, scale bars in FIG. 6 shows a 3 mm.

〔実施例4〕 Example 4
以下の実施例4においては、本発明の植物体のカルス化が内因性のオーキシンの過剰生産に起因するものであるのか否かを、DR5::GUS植物体でRAP2.4遺伝子を過剰発現させることにより調べた。 In the following Examples 4, whether the callus of a plant is due to the overproduction of endogenous auxin present invention, overexpression of RAP2.4 gene DR5 :: GUS plants It was examined by.

DR5::GUSはオーキシン応答エレメント(TGTCTC)を7個タンデムに配置したプロモーターにレポーター遺伝子としてGUS遺伝子を融合させたものである(Ulmasov, T. et al., Plant Cell, 9, 1963-1971,1997)。 DR5 :: GUS is one that combines the GUS gene as a reporter gene to a promoter placed auxin response element a (TGTCTC) to seven tandem (Ulmasov, T. et al., Plant Cell, 9, 1963-1971, 1997). このプロモーターレポーターを導入したシロイヌナズナでは、GUS活性を検出することにより、内因性のオーキシンの生合成部位や外因性のオーキシンに応答している部位を特定することができる(Aloni,R. et al., Planta 216,841-853, 2003)。 In Arabidopsis thaliana introducing the promoter reporter, by detecting GUS activity, the site that is responsive to the biosynthesis site and exogenous auxin endogenous auxin can be identified (Aloni, R. Et al. , Planta 216,841-853, 2003). このため、このプロモーターレポーターを導入した植物体であるDR5::GUS植物体はオーキシンの生合成やオーキシンと形態形成の関連における研究によく用いられている。 Therefore, the promoter reporter is a plant introduced with DR5 :: GUS plants is often used in the study in the context of the biosynthesis and auxin and morphogenesis auxin.

このDR5::GUS植物体でRAP2.4を過剰発現させる(35SRAP2.4NOS/DR5::GUS)ことにより、DR5::GUS植物体を脱分化が誘導されるように改変することができる。 By this DR5 :: overexpress RAP2.4 in GUS plants (35SRAP2.4NOS / DR5 :: GUS), it may be modified to be induced dedifferentiation DR5 :: GUS plants. こうして誘導されるカルス(以下、RAP2.4カルスと略称することがある。)のカルス化が、内因性のオーキシンの過剰生産に起因するのであれば、このRAP2.4カルスで高いGUS活性が見られるはずである。 Thus callus induced (hereinafter, sometimes abbreviated as RAP2.4 callus.) Callus of, if due to the overproduction of endogenous auxin, high GUS activity observed in this RAP2.4 callus it should be.

そこで、図7の右側の流れのように、DR5::GUS植物体に、実施例1で構築したRAP2.4を過剰発現させる組換え発現ベクター(35SRAP2.4NOS)を、実施例1と同様にして、アグロバクテリウムを用いて形質転換した。 Therefore, as shown in the right side of the flow of FIG. 7, the DR5 :: GUS plants, the recombinant expression vectors overexpressing RAP2.4 constructed in Example 1 (35SRAP2.4NOS), in the same manner as in Example 1 Te, it was transformed with the Agrobacterium. 得られた形質転換第一世代(T1)の種子を、上述したハイグロマイシン選択培地に播種し、形質転換体を選抜した後、上述した植物ホルモン非存在のCIM培地(ハイグロマイシン(Hm)を含む)に移植し、RAP2.4カルスを得た。 Seeds obtained transformant first generation (T1) were seeded in hygromycin selection media described above, after the selected transformants, containing the above-described plant hormone absence of CIM medium (hygromycin (Hm) transplanted into) to give the RAP2.4 callus. 実験の対照(コントロール)として図7の左側の流れのように、DR5::GUS植物体にRAP2.4を含まないベクター(ベクターコントロール;35SNOS)を形質転換し、得られる形質転換第一世代(T1)の芽生えからオーキシン(2,4−D)を含む培地(上記CIM培地)でカルスを誘導した。 As a control experiment (control) as the left side of the flow of FIG. 7, DR5 :: GUS plants in vector without RAP2.4; a (vector control 35SNOS) was transformed, resulting transformant first generation ( induced callus in media (above CIM medium) containing auxin (2, 4-D) from the seedlings of T1). なお、DR5::GUS植物体は、Dr. T. Guilfoyle (Department of Biochemistry,. University of Missouri, Columbia)よりDR5::GUSを含む形質転換用ベクターを分譲してもらい、このベクターを予めシロイヌナズナに形質転換して用いた。 Incidentally, DR5 :: GUS plants, Dr. T. Guilfoyle (Department of Biochemistry ,. University of Missouri, Columbia) asked to sale the transformation vector, containing the DR5 :: GUS than, in advance Arabidopsis this vector It was used to transform.

得られた2種類のカルスをGUS染色した。 Two types of callus obtained was GUS staining. GUS染色の方法は下表5に示す試薬を混合して調製したGUS染色用バッファを用いて以下のように行った。 The method of GUS staining with GUS staining buffer was prepared by mixing the reagents shown below in Table 5 was performed as follows.

上記GUS染色用バッファ0.5-1.5 mLにサンプリングした試料を全体が浸るように入れた。 The whole sample was sampled to the GUS staining buffer 0.5-1.5 mL was placed so immersed. 30℃で60分脱気処理を行い、その後37℃、オーバーナイトで(18時間)インキュベートした。 For 60 minutes deaerated at 30 ° C., then 37 ° C., overnight (18 hours) were incubated. 次に70%エタノールでバッファと置き換える処理を数回行って脱色した。 It was then decolorized by performing several times the process of replacing the buffer with 70% ethanol. その後、蒸留水で置換し、実体顕微鏡または顕微鏡で観察を行った。 Then, was replaced with distilled water, it was observed with a stereoscopic microscope or a microscope.

この結果、図8に示すベクターコンロールのカルス(図8中、「Vector Control/DR5::GUS callus(+auxin)」と表示。)はGUS染色後(図中B)は青く染まりGUS活性が見られた。 As a result, (in FIG. 8, labeled "Vector Control / DR5 :: GUS callus (+ auxin)".) Vector con role of callus shown in FIG. 8 is observed GUS staining (figure B) is blue stained GUS activity obtained. これは、培地中に添加してある外因性のオーキシン(2,4−D)にDR5::GUSが応答したためである。 This, DR5 :: GUS to exogenous auxin that is added to the medium (2, 4-D) is due to a response.

一方、RAP2.4カルスでは、外因性のオーキシンがなくても(図8中、「RAP2.4/DR5::GUS callus(auxin free)」と表示。)、図中Cのようにカルスの形態を保っているが、GUS染色後(図中D)ではGUS活性が見られなかった。 On the other hand, in the RAP2.4 callus, (in FIG. 8, labeled "RAP2.4 / DR5 :: GUS callus (auxin free)".) Even without exogenous auxin, form callus as in the drawing C and kept it, GUS staining (figure D) in GUS activity was observed. この結果は、DR5::GUS遺伝子のエピジェネティクなサイレンシンング(メチル化など)に起因していることも考えられたため、RAP2.4カルスを、オーキシン(2,4−D)を含む培地で48時間培養した後にGUS染色したところ(図8中、「RAP2.4/DR5::GUS callus(+auxin after 48 hours)」と表示。)、GUS染色後(図中F)は青く染まり、ベクターコントロールのカルス同様にGUS活性が見られた。 Medium The results include for also considered that due to DR5 :: GUS gene epigenetic silencing thin ring (such as methylation), and RAP2.4 callus, auxin and (2, 4-D) in (in FIG. 8, displayed as "RAP2.4 / DR5 :: GUS callus (+ auxin after 48 hours)".) was GUS staining after cultured for 48 hours, GUS staining (in the figure F) is dyed blue, callus Similarly, GUS activity of the vector control was observed. この結果は、RAP2.4カルスが有するDR5::GUS遺伝子がオーキシンによって正常に機能していることを示している。 This result indicates that DR5 :: GUS gene having the RAP2.4 callus is functioning properly by auxin.

これらの結果から、RAP2.4カルスでは、内因性のオーキシンの過剰生産が起こっているのではないことが示された。 These results, in RAP2.4 callus, overproduction of endogenous auxin has been shown that not is going. また図8中Cで見られるようなRAP2.4カルスの形態が、外因性のオーキシンに起因するものでないことを示している(実際に植物ホルモン非存在下の培地でカルス化していることを示している)。 Also shows that form of RAP2.4 callus as seen in FIG. 8 C has been callus with it are (actually phytohormones absence medium indicates that it is not due to the exogenous auxin ing).

〔実施例5〕 [Example 5]
次にRAP2.4カルスの内因性オーキシン(IAA)濃度の測定を試みた。 Then it attempts to measure the endogenous auxin (IAA) concentration RAP2.4 callus. 方法はGas Chromatography-Mass Spectrometry(GC−MS)を用いたNakamuraらの方法 (Nakamura, A. et al. Plant Physiology, 133, 1843-1853, 2003) に基づいた。 Methods Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) Nakamura et al method using (Nakamura, A. et al. Plant Physiology, 133, 1843-1853, 2003) was based on. 方法の手順を以下に示す。 Showing the procedure of the method is described below.

1−10mgの組織を1.5mLのマイクロチューブに採り、液体窒素中でホモジナイズした。 Taken 1-10mg tissues in 1.5mL microtube was homogenized in liquid nitrogen. このマイクロチューブに500μLの50mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7, 0.02%(w/v)ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムを含む)を加えて組織を良く懸濁し、200pgの13 C6IAAとを加えた。 The microtube 500μL of 50mM sodium phosphate buffer (pH7, 0.02% (w / v) containing sodium diethyldithiocarbamate) were added and well suspended tissue, plus the 13 C6IAA of 200 pg. 4℃で1時間振とうしながら抽出を行い、1M HCl25μLでpHを2.6に調整した。 4 ° C. was extracted with shaking for 1 hour, the pH was adjusted to 2.6 with 1M HCl25μL. 50mgのXAD7−HPを加え30分間マイルドシェーカーで懸濁および平衡化し、バッファを除去した後、XAD7−HPを500μLの1%酢酸で2回洗浄し、500μLのジクロロメタンで30分間抽出した(2回)。 Suspended and equilibrated for 30 min mild shaker added XAD7-HP of 50mg, after removal of the buffer, washed twice XAD7-HP in 500μL of 1% acetic acid and extracted (2 times 30 minutes with 500μL of dichloromethane ). ジクロロメタンフラクションを合わせて、スピードバックで乾燥し、試料を誘導化してGC−MS分析に供した。 The combined dichloromethane fractions were dried up with a SpeedVac, and subjected to GC-MS analysis and derivatized samples.

RAP2.4カルスをサンプルに用いた際には、内部標準(13C6IAA)と重なるピークが存在し、定量が不可能であった。 When using RAP2.4 callus samples, there are peaks overlapped with internal standard (13C6IAA), quantification was impossible. そこで、播種後7日目のRAP2.4遺伝子を過剰発現させた形質転換植物体の芽生えをサンプルとして用いた。 Therefore, using the seedlings of transformed plants overexpressing RAP2.4 gene 7 days after seeding as a sample. コントロールとして、ベクターコントロール植物体の芽生えを用いた。 It was used as a control seedlings vector control plants. 芽生えを用いた場合、カルスで見られた内部標準と重なるピークは存在せず定量が可能であった。 When using the seedlings, peaks overlapping the internal standard observed in calli was possible quantitative absent. また、播種後7日目においては、RAP2.4遺伝子を過剰発現させた形質転換植物体とベクターコントロール植物体とにおいて形態の差は明瞭であり、導入した遺伝子の影響が出ている。 In the 7 days after sowing, the difference in the form in and the vector control plants transformed plants overexpressing RAP2.4 gene is clear, it has been affected the introduced gene.

図9に、内因性オーキシン(IAA)濃度(図中「IAA concentration」と表示。単位はpg/mgF.W.(FW:fresh weight ; 組織の生重量))の測定結果を示す。 9, endogenous auxin (IAA) concentration (in the figure indicated as "IAA Concentration" unit pg / mgF.W (FW:.. Fresh weight; fresh weight) of tissue) show the measurement results of the. 結果として、RAP2.4遺伝子を過剰発現させた形質転換植物体の芽生え(図中、「RAP2.4 seedling」と表示。)では内因性のオーキシン濃度が、ベクターコントロール植物体の芽生え(図中、「Vector control seedling」と表示。)と比べて同程度か、むしろ低いことが明らかとなった。 As a result, (in the figure, labeled "RAP2.4 seedling".) Seedlings of transformed plants overexpressing RAP2.4 gene in the auxin concentration of endogenous, in seedlings (Figure vector control plant, display the "Vector control seedling.") and whether the same level compared, it was revealed rather low.

実施例4、実施例5の実験結果より、RAP2.4遺伝子の過剰発現によるカルス化は、内因性のオーキシンの過剰生産によって引き起こされるのではないことが明らかとなった。 Example 4, the experimental results of Example 5, callus by overexpression of RAP2.4 gene was found not caused from being by overproduction of endogenous auxin.

〔実施例6〕 Example 6
以下の実施例6においては、RAP2.4カルスの培養において、形質転換体の選択マーカーの試薬であるハイグロマイシン(Hm)を培地から除き、カルスの変化を観察した。 In the following Example 6, in the culture of RAP2.4 callus were removed from the culture medium hygromycin (Hm) a reagent of a selectable marker of transformants were observed changes in the callus.

実施例1<植物ホルモン非存在下でのカルス化>と同様に植物ホルモンを含まないCIM培地にハイグロマイシンを加えたもの(Hm(+))と、植物ホルモンを含まないCIM培地にハイグロマイシンを加えないもの(Hm(−))とを準備した。 Example 1 <callus in the presence of non-plant hormones> and plus hygromycin CIM medium without Similarly plant hormone and (Hm (+)), the hygromycin CIM medium without phytohormones In addition not those (Hm (-)) and were prepared.

それぞれの培地に、RAP2.4カルスの一部を植え継ぎ、光照射条件下で培養した。 In their respective media, subcultured part of RAP2.4 calli were cultured in the light irradiation conditions. 植え継ぎ後、40日目のRAP2.4カルスの観察結果を図10に示す。 After subculture, in FIG. 10 shows the observation result of RAP2.4 callus 40 days. なお、図10中、スケールバーは5mmを示す。 In FIG. 10, the scale bar indicates 5 mm. 図10中Aに示すようにHm(+)では脱分化した形態を維持したのに対し、Bに示すようにHm(−)ではカルスの表面に葉が分化しているのが観察された。 While maintaining the Hm (+) in the form of dedifferentiated as shown in FIG. 10 A, Hm as shown in B - the leaves are differentiated were observed on the surface of the callus ().

また、それぞれの培地に、RAP2.4カルスの一部を植え継ぎ、光を照射しないで培養した。 Further, each of the media, subcultured part of RAP2.4 calli were cultured without irradiated with light. 植え継ぎ後、40日目のRAP2.4カルスの観察結果を図10に示す。 After subculture, in FIG. 10 shows the observation result of RAP2.4 callus 40 days. 図10中Cに示すようにHm(+)では脱分化した形態を維持したのに対し、Dに示すようにHm(−)ではカルスの表面に葉および根が分化しているのが観察された。 In Hm (+) as shown in FIG. 10 C while maintaining the dedifferentiated form, Hm as shown in D - the leaves and roots are differentiated were observed on the surface of the callus () It was.

さらに、RAP2.4カルスは、図11中Eに示すように、Hm(−)の植物ホルモンを含まない液体のCIM培地において、カルスの表面を一部分化させたままで継代培養が可能であることが確認された。 Furthermore, RAP2.4 callus, as shown in FIG. 11 E, Hm - that in CIM medium free liquid plant hormones, it is possible subcultured while keeping a portion of the surface of the callus () There has been confirmed.

なお、カルスの表面を一部分化させた状態で、再び植物ホルモンを含まないCIM培地をHm(+)にしたところ、図11中Fに示すように、カルスの表面の一部分化していた組織は白化し枯死した。 Incidentally, in a state of being partially the surface of the callus, was in Hm the CIM medium without phytohormones again (+), as shown in FIG. 11 F, tissue which has been part of the surface of the callus white It was turned into death. これは、ハイグロマイシンによる作用であることが判る。 This proves to be acting by hygromycin. すなわち、カルス表面の一部分化してきた細胞組織は、ハイグロマイシン感受性になっており、これはRAP2.4カルスに導入されているハイグロマイシン耐性遺伝子が何らかの影響で作用しなくなっていることに起因していると考えられる。 That is, tissue which has been part of the callus surface is adapted to hygromycin sensitivity, which is due to the hygromycin resistance gene that has been introduced into RAP2.4 callus is no longer act for some reason It is considered to have. ハイグロマイシン耐性遺伝子は、RAP2.4遺伝子とともにRAP2.4カルスに導入されているために、この実験系においてハイグロマイシン耐性遺伝子と同様に、RAP2.4遺伝子の発現も何らかの理由で抑制されていることが考えられる。 Hygromycin resistance gene, since it is introduced into RAP2.4 callus with RAP2.4 gene, like the hygromycin resistance gene in this experimental system, it is suppressed for some reason the expression of RAP2.4 gene It can be considered. 言い換えると、何らかの影響でRAP2.4遺伝子の発現が抑制された細胞が分化してきたことが予想される。 In other words, it is expected that cells whose expression was suppressed in RAP2.4 gene for some reason have been differentiated.

〔実施例7〕 [Example 7]
以下の実施例7においては、実施例6で得られた、表面が一部分化し、表面が一部分化した状態のまま増殖するRAP2.4カルスを用いて、本発明にかかる植物体が有用物質を安定して生産する(二次代謝を安定に発現させる)ことを検証した。 In Example 7 below, were obtained in Example 6, the surface is a portion of a surface by using a RAP2.4 callus proliferation remain a part of a state, a plant according to the present invention is stable useful materials to produce was verified (secondary metabolites stably express) the. なお、二次代謝産物としては、シロイヌナズナで計測可能なモデル二次代謝産物とてアントシアニンを選び、シロイヌナズナの植物体、培養細胞および表面が一部分化した状態のまま増殖するRAP2.4カルスにおける二次代謝産物生産能の比較を行った。 As the secondary metabolites, the Arabidopsis and the measurable model secondary metabolites select anthocyanins, plants of Arabidopsis, the secondary in RAP2.4 calli cultured cells and surface proliferating leave a portion of state a comparison was made of the metabolite-producing ability.

シロイヌナズナの植物体としては、野生株(Col−0)を植物ホルモンを含まないCIM培地に播種し、芽生えから14日間培養した植物体全体(根を含む)を用いた。 The plants of Arabidopsis wild strain (Col-0) were seeded in CIM medium without plant hormones, using whole plant cultured 14 days seedlings (including roots). シロイヌナズナの培養細胞としては、新規に誘導したLI株(葉由来)およびRI株(根由来)および理化学研究所バイオリソースセンターから分譲されたT87培養細胞を用いた。 The cell culture of Arabidopsis thaliana were used T87 cultured cells sale from newly induced the LI strain (leaves from) and RI strains (from roots) and RIKEN Bioresource Center. この3種類の培養細胞を、植物ホルモンを含むCIM培地で予め14日間培養したものを実験に用いた。 The three types of cultured cells were used in experiments which were cultured in advance for 14 days in the CIM medium containing plant hormones. RAP2.4カルスは、Hm(−)の植物ホルモンを含まないCIM培地で予め14日間培養したものを実験に用いた。 RAP2.4 callus, Hm (-) used in the experiments those cultured in CIM medium without phytohormones advance 14 days.

シロイヌナズナは、高濃度のスクロース培地で光照射を行うことによりアントシアニン誘導することが知られている。 Arabidopsis has been known to anthocyanins derived by performing light irradiation at a high concentration of sucrose medium. そこでアントシアニン誘導培地として6%のスクロースを含む液体のCIM培地(植物ホルモンを含まない)を用いた。 So using CIM medium liquid containing 6% sucrose as anthocyanins induction medium (without plant hormones).

アントシアニン誘導培地における誘導前後の各細胞を凍結乾燥し、単位乾燥重量あたりのアントシアニン含有量を530nmでの吸光度で比較した。 Each cell before and after induction in anthocyanin induction medium was lyophilized, to compare the anthocyanin content per unit dry weight absorbance at 530 nm. アントシアニンの抽出は以下の手順で行った。 Extraction of anthocyanins was carried out by the following procedure. 5%(v/v)酢酸を含む45%(v/v)メタノール溶液中で細胞をホモジナイザーで破砕後、12000rpmで10min遠心した。 5% (v / v) 45% containing acetic acid (v / v) crushed cells with homogenizer in methanol solution and 10min centrifugation at 12000 rpm. 上清をさらに12000rpmで5min遠心しその上清をアントシアニン抽出液とした。 5min centrifugation and the supernatant was used as anthocyanin extract was further 12000rpm supernatant. アントシアニン含有量はLaby らの方法(Laby RJ et al. The Arabidopsis sugar-insensitive mutants sis4 and sis5 are defective in abscisic acid synthesis and response. Plant Jounal 23:587-596(2000))を参考に以下の式によって算出した。 Anthocyanin content Laby et al's method (Laby RJ et al The Arabidopsis sugar-insensitive mutants sis4 and sis5 are defective in abscisic acid synthesis and response Plant Jounal 23:.. 587-596 (2000)) by the following formula in reference to calculated.
アントシアニン含有量(Abs 530 / g DCW) Anthocyanin content (Abs 530 / g DCW)
= [Abs 530 −(0.25×Abs 657 )]×extraction volume(mL) / dry cell weight = [Abs 530 - (0.25 × Abs 657)] × extraction volume (mL) / dry cell weight
なお、上記式中、「DCW」は「dry cell weight 」すなわち細胞乾燥重量を表す。 In the formula, "DCW" represents "dry cell weight" or cell dry weight.

図12に結果を示す。 The results are shown in Figure 12. アントシアニン誘導培地による培養前後の比較において植物体、3つの培養細胞および表面が一部分化した状態のまま増殖するRAP2.4カルスのアントシアニン合成能に明瞭な差が現れた。 Plants in comparison before and after incubation with anthocyanins induction medium, clear difference appeared to anthocyanin synthesis ability of growing RAP2.4 callus remain three cultures and surfaces were partially of. 植物体と培養細胞を比べると、アントシアニンの誘導前には植物体と培養細胞にアントシアニン蓄積に関してほとんど差はなかった。 Comparing plants and cultured cells prior to induction of anthocyanin was little difference with respect to anthocyanin accumulation in cultured cells and plants. しかし、誘導後には植物体では誘導前の約8倍にアントシアニン含有量が増加しているのに対し、3つの培養細胞では誘導前と変化はなかった。 However, after induction while anthocyanin content is increased to about 8 times the pre-induction in plants, there was no induction before a change in the three cultures. 一方、今回用いた培養細胞および表面が一部分化した状態のまま増殖するRAP2.4カルスでは、他の細胞(植物体および3つの培養細胞)に比べ誘導前からアントシアニンの蓄積が見られた上に、誘導後にはさらにアントシアニンが蓄積された。 On the other hand, in the RAP2.4 calli cultured cells and surfaces used this time to grow while a portion of the state, on the accumulation of anthocyanin was observed from the front induction compared to other cells (plants and three cultures) , after induction it was further accumulated anthocyanins. このことから、今回用いた培養細胞および表面が一部分化した状態のまま増殖するRAP2.4カルスは3つの培養細胞にはみられないアントシアニン合成能を有していることが明らかとなった。 Therefore, cultured cells and the surface used in this study it was revealed that have anthocyanin synthesis ability not found in RAP2.4 calli three cultured cells grown while a portion of the state.

このように、本発明では、脱分化に関与する転写因子を過剰に発現させることによって、脱分化が誘導されるように改変された植物体を得ることができる。 Thus, in the present invention, it is possible by overexpression of transcription factors involved in dedifferentiation obtain modified plants as dedifferentiation is induced. このように改変された植物体および誘導されたカルスは、有用物質の生産、新品種の開発、植物体への遺伝子導入後の形質転換体の再生、人工種子等に広く利用が可能である。 Such modified plants and induced callus, production of useful substances, development of new varieties, regeneration of transformants after gene introduction into a plant, it is possible to widely used artificial seeds. それゆえ、本発明は、植物由来の化合物を原料とする製薬業、品種改良を必要とする園芸業、林業、各種農業およびアグリビジネス、さらには農産物を加工する産業や食品産業等に利用可能であり、しかも非常に有用であると考えられる。 Therefore, the present invention, the pharmaceutical industry that the plant-derived compounds as raw materials, gardening industry that requires breeding, forestry, various types of agriculture and agribusiness, and more is available to industry and the food industry or the like for processing agricultural products There is, moreover is considered to be very useful.

実施例において用いる組換え発現ベクターを構築するための構築用ベクターの構築方法を示す工程図である。 It is a process diagram showing a method of constructing building vector for constructing the recombinant expression vector used in the examples. 形質転換用ベクターpBIGCKHの構築方法を示す工程図である。 It is a process diagram showing a method of constructing vector for transformation PBIGCKH. 実施例において用いる構築用ベクターp35SGに、RAP2.4遺伝子を組み込む工程図である。 The construction vector p35SG used in the examples, is a process diagram incorporating RAP2.4 gene. カリフラワーモザイクウイルス35SプロモーターでAt1g22190遺伝子を過剰発現させたシロイヌナズナ形質転換植物体を植物ホルモン非存在下で生育させた結果を示す図である。 Arabidopsis transgenic plants overexpressing At1g22190 gene with the Cauliflower mosaic virus 35S promoter is a diagram showing results grown in the absence of phytohormones. カリフラワーモザイクウイルス35SプロモーターでAt1g36060遺伝子を過剰発現させたシロイヌナズナ形質転換植物体を植物ホルモン非存在下で生育させた結果を示す図である。 Arabidopsis transgenic plants overexpressing At1g36060 gene with the Cauliflower mosaic virus 35S promoter is a diagram showing results grown in the absence of phytohormones. カリフラワーモザイクウイルス35SプロモーターでRAP2.4遺伝子を過剰発現させたシロイヌナズナ形質転換植物体を植物ホルモン非存在下で生育させた結果を示す図である。 Arabidopsis transgenic plants overexpressing RAP2.4 gene in cauliflower mosaic virus 35S promoter is a diagram showing results grown in the absence of phytohormones. 実施例4において、DR5::GUS植物体でRAP2.4遺伝子を過剰発現させることにより本発明の植物体のカルス化が内因性のオーキシンの過剰生産に起因するものであるか否かを調べた手順を示す図である。 In Example 4, it was examined whether or not the callus of a plant of the present invention is due to overproduction of endogenous auxin by overexpressing RAP2.4 gene DR5 :: GUS plants procedure is a diagram showing a. 実施例4において、DR5::GUS植物体でRAP2.4遺伝子を過剰発現させることにより本発明の植物体のカルス化が内因性のオーキシンの過剰生産に起因するものであるか否かを調べた結果を示す図である。 In Example 4, it was examined whether or not the callus of a plant of the present invention is due to overproduction of endogenous auxin by overexpressing RAP2.4 gene DR5 :: GUS plants result is a diagram showing a. 実施例5において、RAP2.4カルスの内因性オーキシン(IAA)濃度を測定した結果を示す図である。 In Example 5, a diagram showing the results of measuring the endogenous auxin (IAA) concentration RAP2.4 callus. 形質転換体の選択マーカーの試薬であるハイグロマイシンを加えた培地(Hm(+))と、ハイグロマイシンを加えない培地(Hm(−))とでRAP2.4カルスを培養した結果を示す図である。 A diagram showing the results of culturing RAP2.4 callus out with - a medium supplemented with hygromycin a reagent selection marker transformants (Hm (+)), medium without adding hygromycin () Hm () is there. カルスの表面を一部分化させたままでRAP2.4カルスを継代培養した結果を示す図である。 The RAP2.4 callus surface of the callus remained was part of a diagram showing the results of subculture. アントシアニンをモデル二次代謝産物として、シロイヌナズナの植物体、培養細胞および表面が一部分化した状態のまま増殖するRAP2.4カルスにおける二次代謝産物生産能の比較を行った結果を示すグラフである。 As anthocyanins model secondary metabolites, plants of Arabidopsis thaliana is a graph showing the results of the cultured cells and the surface was compared secondary metabolite producing ability in RAP2.4 callus proliferation remain a part of the state.

Claims (11)

  1. 以下の(a)〜(e)のいずれかに記載の遺伝子が発現するように、該遺伝子を含む組換え発現ベクターを植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることを特徴とする脱分化が誘導されるように改変された植物体の生産方法: To express genes described in any one of the following (a) ~ (e), de-differentiation recombinant expression vector containing the gene, characterized in that it contains transformed step of introducing into plant cells modified plant method for producing such but are derived:
    (a)脱分化に関与する転写因子をコードする遺伝子、 (A) a gene encoding a transcription factor involved in dedifferentiation,
    (b)配列番号1、3または5に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、 (B) a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 5,
    (c)配列番号1、3または5に示されるアミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、脱分化に関与するタンパク質をコードする遺伝子、 (C) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 5, wherein one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence, and is involved in dedifferentiation the gene encoding the protein,
    (d)配列番号2、4または6に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子、 (D) genes having a base sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6 as an open reading frame region,
    (e)配列番号2、4または6に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有し、且つ、脱分化に関与するタンパク質をコードする遺伝子。 (E) has a hybridizing nucleotide sequence in the gene under stringent conditions comprising a base sequence complementary to the gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6 as an open reading frame region, and, de genes encoding proteins involved in differentiation.
  2. さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいることを特徴とする請求項1に記載の植物体の生産方法。 Further, a method for producing a plant body according to claim 1, characterized in that it contains an expression vector constructing step of constructing the recombinant expression vector.
  3. 請求項1または2に記載の生産方法により生産された、脱分化が誘導されるように改変された植物体。 Claim 1 or produced by the method of production according to 2, modified plants as dedifferentiation is induced.
  4. 植物体内の内因性のオーキシンの濃度が、脱分化が誘導されるように改変される前と比較して、有意に増加していないことを特徴とする請求項3に記載の植物体。 The concentration of endogenous auxin plants, compared to before being modified to dedifferentiation is induced, the plant body according to claim 3, characterized in that it does not increase significantly.
  5. 植物体には、成育した植物個体、植物組織、植物細胞、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれることを特徴とする請求項3または4に記載の植物体。 The plants, grown plants individuals, plant tissue, plant cell, callus, plant according to claim 3 or 4, characterized in that comprises at least one of seeds.
  6. 上記植物体は、カルスであって、当該カルスは培養条件をコントロールすることにより表面が一部分化し、表面が一部分化した状態のまま増殖させることができるカルスであることを特徴とする請求項3ないし5のいずれか1項に記載の植物体。 Said plant is a callus, the callus surface by controlling the culture conditions to a portion of, to have no claim 3, characterized in that a callus can be grown while a portion of state surface plant according to any one of 5.
  7. 上記植物体は、上記形質転換工程で選択マーカーとして薬剤耐性遺伝子を用いて得られた植物体を、当該選択マーカーの試薬である抗生物質を添加せずに培養して得られたカルスであることを特徴とする請求項3ないし6のいずれか1項に記載の植物体。 It said plant, it the resulting plants using a drug resistance gene as a selectable marker in the transforming step, a callus obtained by culturing without the addition of antibiotics is a reagent of the selected marker plant according to any one of claims 3 to 6, characterized in.
  8. 請求項1または2に記載の生産方法を行うためのキットであって、 A kit for performing the method of production according to claim 1 or 2,
    上記(a)〜(e)のいずれかに記載の遺伝子と、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴とする植物体の脱分化誘導キット。 Above (a) ~ the gene according to any one of (e), dedifferentiation induction kit plant which comprises at least a recombinant expression vector comprising a promoter.
  9. さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含むことを特徴とする請求項8に記載の植物体の脱分化誘導キット。 Furthermore, dedifferentiation induction kit plant according to claim 8, characterized in that it comprises a reagent group for introducing the recombinant expression vector into plant cells.
  10. 請求項3ないし5のいずれか1項に記載の植物体を、植物ホルモンの添加なしで培養し、二次代謝産物を生産させることを特徴とする有用物質の生産方法。 The plant according to any one of claims 3 to 5, cultured without the addition of phytohormones, a method for producing a useful substance, characterized in that to produce secondary metabolites.
  11. 請求項6または7に記載の植物体を、上記選択マーカーの試薬である抗生物質および植物ホルモンの添加なしで培養し、二次代謝産物を生産させることを特徴とする有用物質の生産方法。 The plant according to claim 6 or 7, cultured without addition of antibiotics and plant hormone is a reagent of the selected markers, the method for producing a useful substance, characterized in that to produce secondary metabolites.
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