JP2006317204A - サンプル中のリガンドの分析方法およびサンプル中のリガンドを分析する装置 - Google Patents

Abstract

【課題】試薬に含まれている不純物等の測定対象外物質の影響が低減され、感度及び選択性の高い分析が可能な、サンプルの分析方法を提供する。
【解決手段】サンプルの分析方法において、リガンド及び試薬に含まれている不純物等の測定対象外物質と異なる電気的応答性を有するスペーサー分子を添加し、交流電場を印加する前に直流電場を印加することで、試薬に含まれている不純物等の測定対象外物質の影響を低減するだけでなく、リガンドが濃縮され高感度な測定装置にする事ができる。
【選択図】図1

Description

本発明は、生化学的反応の対象になる液体試料の微量な質量変化を検出するサンプル中のリガンドの分析方法およびサンプル中のリガンドを分析する装置に関するものである。

本発明は、サンプル中のリガンドを分析する装置に関し、より詳細には表面プラズモン共鳴及び共振振動の原理を用い、リガンドとレセプターの結合による誘電率の変化を測定する技術である。

本発明は、表面プラズモン共鳴装置に関わり、より詳細には外部より交流電界を印加する事で、ノイズの影響が低減され高感度な測定だけでなく、従来同時に評価できなかった物性の評価が実現する技術である。

本発明は、外部より交流電界を印加する表面プラズモン共鳴装置に関わり、より詳細には交流電界を印加する前に直流電界を印加することで試料に含まれている成分毎に分離し、測定対象物のみの純度の高い測定が実現する技術である。

生化学的反応においては、レセプターとリガンドとの結合という反応が重要である。例えば抗原抗体反応では、レセプターとして抗体が、リガンドとして抗原と結合する。また、例えば酵素反応では、レセプターとして酵素が、リガンドとして酵素基体と結合する。このような反応を利用すれば、サンプル中に含まれるリガンドを検出することが可能である。

例えば、金属薄膜表面にレセプターを結合させておき、リガンドがレセプターに結合すると、その金属薄膜近傍の誘電率が変化する。表面プラズモン共鳴現象を利用して、その変化を検出し、リガンドとレセプターの結合量を分析する方法が知られている。（例えば、非特許文献１参照）。この方法ではまず、前記のような金属薄膜に、レセプターが結合されている表面の裏から、全反射条件を満たす角度で光を照射する。その入射光により励起された表面プラズモンの波数と、励起光に由来するエバネッセント波の波数が一致する特定の入射角の時だけに、入射光の光量の一部が表面プラズモンの励起に使われ、反射光の光量が減少する。金属薄膜近傍の誘電率の変化を、例えば、入射光の角度を変化させて反射光を計測し、吸収が最大になる反射光の角度を求める方法が知られている。また、レセプターが固定されている金属薄膜の裏面に電気的振動である電界を印加する事で金属薄膜に試料の分離及び移動制御する技術（例えば、特許文献１参照）やレセプターに外部振動を印加する事でレセプターの追従周波数を測定する技術が提案されている。
Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８８，７０，２０１９−２０２４ 特開２００３−６５９４７号公報

従来のレセプターに外部より交流電場を印加する方法は、レセプターの電荷や質量等といったレセプターが有する固有の物性から誘導される金属薄膜近傍の誘電率の変化、つまり交流電場に対して変化する表面プラズモン共鳴角の周波数特性を読取っていた。そのため、試薬に含まれている不純物等の測定対象外物質が存在すると、レセプターに非特異的に吸着してしまう事や金属薄膜表面への吸着が生じ、サンプル中のリガンドのみの分析を行うことは困難であるという課題を有していた。

本発明は、従来の課題を解決するもので、レセプター領域に外部より交流電場を印加する前に直流電場を印加することにより、溶液中の成分毎に分離、つまり試薬に含まれている不純物等の測定対象外物質の影響だけでなく濃縮が起こり、検出可能な試料濃度下限が向上する。また、リガンド及び試薬に含まれている不純物等の測定対象外物質と異なる電気的応答性を有するスペーサー分子を添加することでレセプター領域の幅を任意に設定できるようにするだけでなく、分離が達成された後の試料ゾーンの拡散の影響が緩和される。さらに、レセプター領域に設置した電極と対となる電極の近傍に測定対象物とそれと同様な電荷を有する物質を集めた後にレセプター領域に向かい電場を印加し、分離させる事によって交流電場を印加する前に直流電場を印加する時よりも試薬に含まれている不純物等の測定対象外物質の影響が低減されることで、感度及び選択性の高いサンプル中のリガンドを分析する装置の提供を目的とする。

従来の課題を解決するために、本発明の交流電場の印加する前に直流電場を印加するサンプル中のリガンドを分析する装置は、計測光を照射する手段と、計測光の反射光あるいは透過光を受光する手段と、固定したレセプター領域に直流電場及び交流電場を印加する手段と、レセプターの方向転換の周波数特性を計測する手段とを備えたもので、交流電場を印加する前に直流電場を印加することで、溶液中の成分毎に分離、つまり試薬に含まれている不純物等の測定対象外物質の影響だけでなく、試料領域の幅を短くできることで濃縮が起こり、検出可能な試料濃度下限が向上する。

また、リガンド及び試薬に含まれている不純物等の測定対象外物質と異なる電気的応答性を有するスペーサー分子を添加することでレセプター領域の位置を任意に設定できるようにするだけでなく、分離が達成された後の試料領域の拡散の影響が緩和される。

さらに、直流電場を印加することによりレセプター領域に設置した電極と対となる電極の近傍に測定対象物とそれと同様な電荷を有する物質を泳動させ集めたことを電気的信号より検知し、直流電場の向きを反対に切り替え印加することにより、レセプター領域に向かい泳動させると同時に分離させる事により交流電場を印加する前に直流電場を印加する時よりも試薬に含まれている不純物等の測定対象外物質の影響が緩和され、感度及び選択性の高いサンプル中のリガンドを分析する装置を提供することができる。

本発明の交流電場の印加する前に直流電場を印加するサンプル中のリガンドを分析する装置によれば、溶液中の成分毎に分離、つまり試薬に含まれている不純物等の測定対象外物質の影響だけでなく濃縮が起こり、検出可能な試料濃度下限が向上され、感度及び精度の高い測定が実現する。また、リガンド及び試薬に含まれている不純物等の測定対象外物質と異なる電気的応答性を有するスペーサー分子を添加することでレセプター領域の位置を任意に設定できるようにするだけでなく、分離が達成された後の試料領域の拡散の影響が緩和され、選択性及び感度の高い測定が実現する。

本発明の分析方法および装置において、レセプターとリガンドとしては、前記金属薄膜表面の誘電率が変化しやすくなるため、少なくとも一方が、電荷を帯びているのが好ましい。レセプターとリガンドの組み合わせとしては、例えば、抗原と抗体、抗体と抗原、ホルモンとホルモン受容体、ホルモン受容体とホルモン、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド受容体、ポリヌクレオチド受容体とポリヌクレオチド、酵素阻害剤と酵素、酵素と酵素阻害剤、酵素基質と酵素、酵素と酵素基質が挙げられる。

本発明者は、直流電場を印加することによるメカニズムを以下のように推察している。前記サンプルに直流電場を印加すると、物質が有する電荷と大きさに依存する電気的応答性の違いからサンプル中に含まれている不純物等の測定対象外物質とリガンドが分離されると推察している。

本発明の分析方法において、前記電気的振動は、直流電場および交流電場であるのが好ましい。この際、前記直流電場および前記交流電場は、第一に金属薄膜から対向に配置された面に前記サンプル中のリガンドが泳動するように直流電界を印加し、検知手段により前記リガンドが前記対向に配置された面に泳動した事を検知した後、前記対向に配置された面から前記金属薄膜に前記リガンドが泳動するように前記直流電界とは反対の直流電界を印加し、前記検知手段で前記リガンドが前記金属薄膜に到達した事を検知した後に、交流電界を印加するのが好ましい。前記サンプル中に含まれている不純物等の測定対象物外物質とリガンドとが分離される。前記サンプル中に含まれている不純物等の測定対象物外物質とリガンドを分離することにより、測定対象外物質の影響を除去できるだけでなく、濃縮が起こり、検出可能な試料濃度下限が向上され、測定の精度及び感度の高い結果を得ることができるからである。

本発明の分析方法において、前記サンプル中に含まれている不純物等の測定対象外物質と異なる電気的応答性を有するスペーサー分子を添加することが好ましい。レセプター領域の位置を任意に設定できるようにするだけでなく、分離が達成された後の試料領域の拡散の影響が緩和され、選択性及び感度の高い結果を得ることができるからである。

本実施形態では、本発明の装置の好ましい一形態について説明する。図１は、本発明の装置の一例の模式図である。

図１において、１は光源、２はプリズム、３は計測光、４は受光装置、５は反射光、６はプラズモンの励起により光量の一部が減少した反射光暗部、７は金属薄膜兼上側電極、８は下側電極、９は交流源、１０は交流源９の周波数を１／ｎに変換する分周器、１１は直流源、１２はスイッチ回路、１３及び１６は外部クロック周波数に比例して特定周波数のみを通す帯域通過型アクティブフィルター、１４はコンデンサー、１５は増幅器、１７は外部振動の位相（θ０）と、反射光に含まれる外部振動の信号成分の位相（θ１）を比較する検出器、１８は検出器１７により得られたアナログ信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバーター、１９は金属薄膜兼上側電極７に固定されたレセプター、２０はリガンド、２１は電場、２２は金属薄膜兼上側電極７と下側電極８との間に流れる電流を計測する電流計、θは入射角である。

光源１は、そこから発せられた計測光３が、金属薄膜兼上側電極７に照射できる位置に配置される。その照射される金属薄膜兼上側電極７の照射面の裏側には、レセプター１９が固定されている。受光装置４は、金属薄膜兼上側電極７で反射された反射光５を受光できる位置に配置される。下側電極は８、金属薄膜兼上側電極７に固定されたレセプター１９に外部振動２１を印加しうるように配置される。下側電極８は、分周器１０を介した交流源９と直流源１１をスイッチ素子１２と接続しており、アクティブフィルター１３を介して接続しており、さらに別のアクティブフィルター１６と接続している。このアクティブフィルター１６は、受光装置４と、コンデンサー１４および増幅器１５をこの順で介して接続されている。アクティブフィルター１６とアクティブフィルター１３の両方は、検出器１７を介して、Ａ／Ｄコンバーター１８と接続している。図１においては、金属薄膜兼上側電極７を装置の上側、下側電極８を装置の下側に配置したが、その上下を逆転しても、または装置の左右側に配置しても有効であることは言うまでもない。また、直流電源１１及び交流電源９それぞれ別ユニットに配置したが、直流及び交流を発生可能なユニットを配置しても有効であることは言うまでもない。

光源１から発せられた計測光３は、ビームスプリッター（図示せず）によりｐ偏向の光のみで、入射角θを変化させながらプリズム（例えば、日本電子レーザー社製のプリズム）を通して金属薄膜兼上側電極７に照射される。金属薄膜兼上側電極７に照射された計測光３は、金属薄膜兼上側電極７で全反射し、反射光５が生じる。ある特定の入射角θで金属薄膜兼上側電極７に計測光３が照射されると、エバネッセント波が発生し、表面プラズモン共鳴と言われるプラズモン波の励起に光量の一部が使われ、光量が減少した反射光暗部６が発生する。反射光５の強度を電圧に変換する受光装置４を用いて、反射光暗部６を含むその反射光５の強度を検出する。

さらに金属薄膜兼上側電極７及び下側電極８に、スイッチ素子１２と分周器１０を介した交流源９及び直流源１１からなる電源ユニットを接続する。直流源１１により電圧を印加し、下側電極８により電圧の特性をもった電場が、金属薄膜兼上側電極７に印加される。その結果、サンプルの成分は電場に応答し、電極に向かって泳動する。ここで、電場に対する電気的応答性を支配しているのは、分子が有する電荷及び大きさである。電場により、金属薄膜兼上側電極７に泳動すれば、電場に対する電気的応答性の違いから、リガンドと試薬に含まれている不純物等の測定対象外物質とに分離する。また、サンプルにリガンドと試薬に含まれている不純物等の測定対象外物質と異なる電気的応答性を有するスペーサー分子を添加することでレセプターの領域の位置を任意に設定できるようにするだけでなく、分離が達成された後のリガンド領域の拡散の影響が緩和される。

リガンドと試薬に含まれている不純物等の測定対象外物質とが分離された後に、金属薄膜兼上側電極７及び下側電極８に交流源９と分周器１０からなるユニットを接続する。交流源９によりｎｆの周波数が発生され、分周器１０によりｆの周波数に変換され、下側電極８によりｆの周波数を持った電場２１が印加される。その結果、リガンド１９は分子の方向転換により振動する。ここでエバネッセント波領域の計測光に対する誘電率を支配しているのはレセプターが有する電子分極成分である。電場２１により金属薄膜兼上側電極７表面のエバネッセント領域のレセプター１９が方向転換すれば、電子の密度中心も変化するので誘電率が変わり、よってプラズモン共鳴が生じる反射光暗部６の特定の角度も受光装置４を囲む範囲で変化する。

また、金属薄膜兼上側電極７近傍のレセプター１９にリガンドが結合すると、リガンド２０の分子量だけ、レセプター１９の分子量が増大する。その結果、レセプター１９とリガンド２０の結合体の誘電率は、レセプター１９のみの誘電率から変化する。このリガンド２０が結合したレセプター１９に電場２１を印加すると、電場２１に対するレセプター１９の方向転換により、振動の周波数特性が変化する。

反射光暗部６を含む反射光５は光検出器４で検出され、その交流成分が増幅器１５を通し増幅される。アクティブフィルター１６で外部振動の信号成分以外が除去され、検出器１７で外部振動の位相と反射光に含まれる外部振動の信号成分の位相が比較される。得られたアナログ信号はＡ／Ｄコンバーター１８によりデジタル信号に変換される。

本発明の装置において、直流電場を印加すれば、サンプル中に含まれている不純物等の測定対象物外物質とリガンドとが分離される。サンプル中に含まれている不純物等の測定対象物外物質とリガンドを分離することにより、測定対象外物質の影響を除去できるだけでなく、濃縮が起こり、検出可能な試料濃度下限が向上され、測定の精度及び感度の高い結果を得ることが可能である。さらに、サンプル中に含まれている不純物等の測定対象外物質とレセプターと異なる電気的応答性を有するスペーサー分子を添加することで、レセプター領域の位置を任意に設定できるようにするだけでなく、分離が達成された後の試料領域の拡散の影響が緩和され、選択性及び感度の高い結果を得ることが可能である。

さらに、表面プラズモン共鳴角の周波数特性を計測すれば、レセプターへ結合したリガンドを分析、例えばレセプターに結合したリガンドの量を分析することができる。このように、本発明の装置においては、反射光暗部６の微小な角度変化を読む必要がないので、プリズム２、金属薄膜兼上側電極７等の測定冶具の光学的平面度が緩和される。さらに、受光素子４の設置位置は反射光暗部６の変化範囲内にあればよいのでノイズの影響が低減され高感度な測定が実現可能である。

また、測定治具の光学的平面度、部品精度、光学軸の精度の緩和により、本発明の装置の低価格化が実現するだけでなく、振動に強い携帯型の小型化が可能である。さらに、外部より交流電場を印加することにより、従来同時に評価できなかったリガンドの物理学的物性、例えば電荷数、電気抵抗値等の評価が実現可能である。例えば、交流源１０から発生される周波数を変化させながら、金属薄膜兼上側電極７と下側電極８との間に一定の電圧を印加し、その時流れる電流を計測することで図２（ａ）に示すインピーダンスの周波数特性が得られる。サンプルに含まれているリガンドは、図２（ｂ）に示すような抵抗（Ｒ）及び容量（Ｃ）等といった等価回路の組み合わせに置き換えが可能で、インピーダンスＺは、直列に配置された形では、Ｚ＝Ｒ＋ｊＸ、並列に配置された形では、Ｚ＝ＲＸ^２／（Ｒ^２＋Ｘ^２）＋ｊＲ^２Ｘ／（Ｒ^２＋Ｘ^２）と表される（前記式中、Ｘ＝―１／（２πｆＣ））。例えば、図２（ａ）に示されたインピーダンスの周波数特性に、これらの式を当てはめ、解析することで、それぞれの物性の評価を実現することができる。なお、交流源１０から発生される周波数を変化させながら、金属薄膜兼上側電極７と下側電極８との間に一定の電圧を印加し、その時流れる電流を計測する方法を例示したが、交流源１０から発生される周波数を変化させながら、金属薄膜兼上側電極７と下側電極８との間に一定の電圧を印加し、その時加わる電圧を計測することによっても、前記方法を行うことができる。なお、図２（ｂ）において、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３は、リガンド内、リガンド間および電極のそれぞれの抵抗、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３は、リガンド内、リガンド間および電極のそれぞれの容量である。

なお、光源１としては、Ｈｅ−Ｎｅレーザー、Ａｒレーザー、色素レーザー等を用いることができ、例えば、ＡｌＧａＡｓダブルへテロ接合可視光レーザー（例えばＲＯＨＭ社製）、コリメートレンズ（例えば、松下日東社製）及び偏向ビームスプリッター（例えば、シグマ光機社製）から構成されていてもよい。入射角を変化させる方法としては、光源を駆動させ、計測光を金属薄膜兼上側電極上に走査させてもよいし、光源を固定させてポリゴンミラースキャナー等の反射鏡を駆動させて計測光を走査させてもよい。

プリズム２としては、円錐形状、半球形状等を用いることができる。

金属薄膜兼上側電極７としては、表面プラズモン共鳴を起こしうるものであれば、限定されず、例えば、白金、金等の金属薄膜、好ましくは金の金属薄膜（例えば、日本電子レーザー社製）を用いることができる。レセプターは、前述のものを用いることができる。例えば、レセプターを、金属薄膜に直接的または結合用修飾分子により間接的に固定することにより、レセプターがその片面上に固定された金属薄膜を製造することができる。

受光素子４はＣＣＤ、Ｓｉ ＰＩＮ フォトダイオード（例えば、浜松フォトニクス社製）等にオペアンプ（例えば、ナショナルセミコンダクター社製）及び抵抗素子を用いて反射光の強度を電圧に変換する装置であってもよい。

図３（ａ）から（ｂ）に、本発明の装置の一例中、電界印加手段を切り替えるタイミングを検知するために測定した電流の時間変化の一例を示す。図３（ａ）は、金属薄膜から対向に配置された面に前記サンプル中のリガンドが泳動するように一定の直流電界を印加し、前記リガンドが前記対向に配置された面に泳動した場合、図３（ｂ）は前記対向に配置された面から前記金属薄膜に前記リガンドが泳動するように前記直流電界とは反対の直流電界を印加し、前記検知手段で前記リガンドが前記金属薄膜に到達した場合である。一定の直流電界を印加することで、溶液中の物質が電極に泳動し電流が流れる。物質が電極に到達し終わる事により、電流が安定し電流Ｉ１が得られる。その後、前記直流電界とは反対の直流電界を印加し、溶液中の物質を分離し電極に到達する。その際、図３（ｂ）のような階段状の結果が得られる。目的物質が電極に到着することにより、電流Ｉ２が発生する。すなわち、本発明の装置の一例中により、電界印加手段を切り替えるタイミングを検知することが示されている。なお、電界印加手段の切り替えるタイミングとして一定の直流電界を印加し、電流値を計測する方法を用いて説明したが、一定の電流における電圧値を計測する方法に対しても、類似の原理が適用できることは言うまでもない。

図４（ａ）から（ｂ）に、本発明の装置の一例中、金属薄膜上にレセプターを設置せずに測定した表面プラズモン共鳴曲線と、レセプターとして水を設置して測定した表面プラズモン共鳴曲線の一例を示す。それぞれの図において、横軸は計測光３の入射角度であり、横軸は、反射光５の強度を示す。図４（ａ）はレセプター無しの場合、図４（ｂ）はレセプターとして水を用いた場合の表面プラズモン共鳴曲線である。なお、この測定においては電場を印加していない。図４（ａ）及び（ｂ）に示されるように、レセプターの有無により、表面プラズモン共鳴の生じる角度が変化する。すなわち、本発明の装置の一例により、金属薄膜近傍の誘電率の変化に伴う表面プラズモン共鳴角の変化を測定できることが示されている。

図５に本発明の装置の一例中、直流電場を印加した時に受けるリガンドの力の一例を示す模式図を示す。２４は電荷ｑ、半径aを有する球状のリガンド、２３は電極、２７は直流電源である。直流電源２７に電場Eを印加すると、リガンド２４はクーロン力２５（＝ｑＥ）を受けリガンド２４が有する電荷と反する電極方向に速度ｖで泳動する。また、速度ｖで泳動しているリガンド２４は溶液から摩擦抵抗力２６（＝６πμ・a・ｖ）を受ける。クーロン力２５及び摩擦抵抗力２６が釣り合った平衡状態における速度ｖ（＝ｍＥ：ｍ＝ｑ／６πμａ）は移動度と呼ばれるリガンド２４の電荷及び大きさに依存した物質固有の電気応答性を示す。そのため、電場を印加することにより電気応答性の違いから物質毎に分離が達成する。

図６（ａ）から（ｅ）に、本発明の装置の一例中、直流電場及び交流電場を印加した溶液中の状態の一例を示す模式図を示す。図６（ａ）は電場がゼロの状態、図６（ｂ）は直流電場を下側電極方向に印加した状態、図６（ｃ）は金属薄膜兼上側電極方向に直流電場を印加した状態、図６（ｄ）は交流電場を下側電極方向に印加した状態、図６（ｅ）は交流電場を金属薄膜兼上側電極方向に印加した状態での溶液中の物質の泳動の一例を示す模式図である。それぞれの図において、２８、３３、３８、４４及び５１はレセプターとして金属薄膜兼上側電極の片面上に固定されている抗アルブミンウシ血清抗体（シグマアルドリッチ社製）、２９、３４、３９、４５及び５２は測定対象外物質としてフェリチン（シグマアルドリッチ社製）、３０、３５、４０、４６及び５３はリガンドとしてウシ血清アルブミン（シグマアルドリッチ社製）である。電場がゼロの状態では、図６（ａ）に示すように、溶液の成分は溶液全体を均一に存在している。直流電場を金属薄膜兼上側電極から下側電極に印加すると、図６（ｂ）に示すように、リガンドであるウシ血清アルブミン及び測定対象外物質であるフェリチンが下側電極近傍に密集した領域３６が形成される。その後、直流電場を下側電極から金属薄膜兼上側電極に印加すると、図６（ｃ）に示すように、電気的応答性の違いからリガンドであるウシ血清アルブミン４０、サンプル中に含まれている不純物等の測定対象外物質であるフェリチン３９に分離される。リガンドであるウシ血清アルブミンの分離が達成後、交流電場を下側電極と金属薄膜兼上側電極の間に印加すると、図６（ｄ）及び（ｅ）に示すように、レセプターである抗アルブミンウシ血清抗体４４、５１近傍でリガンドであるウシ血清アルブミン４６、５３が泳動し、逐次結合する。このように、従来の表面プラズモン共鳴装置では、サンプル中に含まれている不純物等の測定対象物外物質であるフェリチンとリガンドであるウシ血清アルブミンが均一混合した状態で存在していたが、直流電場を印加することにより、サンプル中に含まれている不純物等の測定対象外物質であるフェリチンとリガンドであるウシ血清アルブミンに分離することができ、測定対象外物質であるフェリチンの影響を除去できる。さらにリガンドであるウシ血清アルブミンは溶液全体を泳動していたが、直流電場によって金属薄膜兼上側電極近傍にリガンドを集めることで、泳動距離を短くすることができ濃縮が起こり、検出可能な試料濃度下限が向上する。そのため、分析の精度及び感度の高い結果になる。

図７（ａ）から（ｃ）に、本発明の装置の一例中、サンプルにスペーサー分子を添加し、直流電場を印加した時のスペーサー分子の役割の一例を示す模式図を示す。図７（ａ）は電場を印加する前の混合された一例を示す図、図７（ｂ）はスペーサー分子が無い場合、図７（ｃ）はスペーサー分子としてサイログロブリン（シグマアルドリッチ社製）、乳酸脱水素酵素（シグマアルドリッチ社製）及びトリプシンインヒビター（シグマアルドリッチ社製）を添加し、電場を印加した一例を示す模式図である。電場を印加する前は、図７（ａ）に示すように、フェリチン（シグマアルドリッチ社製）そしてウシ血清アルブミン（シグマアルドリッチ社製）を混合したサンプル領域６４のみ存在する。スペーサー分子が添加されていないサンプル領域５６に電場を印加すると、図７（ｂ）に示すように、電場により成分毎の分子量及び電荷に依存した電気応答性の違いによりフェリチン５７、ウシ血清アルブミン５９に分離される。分離が達成された後にさらに電場を印加し続けると拡散が起こり、フェリチンとウシ血清アルブミンの混合した領域５８が生じる。しかし、サンプル領域５６にフェリチン、ウシ血清アルブミンと異なる電気的応答性を有するスペーサー分子を添加し電場を印加することで、図７（ｃ）に示すように、分離が達成された後のフェリチン６１、ウシ血清アルブミン６３の他にスペーサー分子であるサイログロブリン６０、乳酸脱水素酵素６２、トリプシンインヒビター６４の領域が形成され、それらの領域が壁となり、フェリチン６１、ウシ血清アルブミン６３の領域を狭めるだけでなく、拡散が起こりにくくなる。また、適した電気応答性を有する物質を添加することにより、リガンド領域の位置を任意に設定できるようになる。そのため、分析の選択性及び感度の高い結果になる。なお、スペーサー分子としてサイロブログリン、乳酸脱水素酵素、トリプシンインヒビターを用いて説明したが、試料と異なる電気応答性を有する物質に対しても、類似の原理が適用できることは言うまでもない。

図８（ａ）から（ｃ）に、本発明の装置中、交流電界の強度に応じた金属薄膜近傍の状態の一例を示す模式図を示す。図８（ａ）は、交流電界強度がゼロの状態、図８（ｂ）は、交流電界強度が弱い状態、図８（ｃ）は、交流電界強度が強い状態での表面プラズモン共鳴の一例を示す模式図である。それぞれの図において、金属薄膜兼上側電極６７、７２および７８の片面上には、レセプター６８、７３および７９が、それぞれ固定されている。計測光６５、７０および７６は、それぞれ金属薄膜兼上側電極６７、７２および７８の表面で反射され、反射光暗部６６、７１および７７が生じる。それぞれの場合、表面プラズモン共鳴角は、θ_１、θ_２およびθ_３である。図８（ａ）から（ｃ）において、６９、７４および８０は、下側電極、７５および８１は交流電界である。

すなわち、交流電界の強度がゼロの状態では、図８（ａ）に示すように、計測光６５を前記金属薄膜兼上側電極６７のレセプター６８が固定された面と逆の面に、照射すると、金属薄膜兼上側電極６７の表面で反射し、反射光暗部６６が発生する。この際、レセプター６８は金属薄膜兼上側電極６７に追従しておらず、表面プラズモン共鳴角は、θ_１である。

交流電界の強度が弱い状態では、レセプター７３は金属薄膜兼上側電極７２側にわずかに追従し、図８（ｂ）に示すように、レセプター７３が金属薄膜兼上側電極７２の表面に密集する。そのため、金属薄膜兼上側電極７２におけるエバネッセント領域の分子密度が変化する。従って、計測光７０を前記金属薄膜兼上側電極７２のレセプター７３が固定された面と逆の面に照射すると、金属薄膜兼上側電極７２の表面で反射し、反射光暗部７１が発生する。この領域の分子密度が変わる事で、エバネッセント領域の誘電率も変化し、表面プラズモン共鳴が生じる角度が変化する。この際、表面プラズモン共鳴角は、θ_２である。

交流電界の強度が強い状態では、レセプター７９は金属薄膜兼上側電極７８側に追従し、図８（ｃ）に示すように、レセプター７９が金属薄膜兼上側電極７８の表面に密集する。そのため、表面プラズモン共鳴が生じる反射光暗部７７の角度が変化し、表面プラズモン共鳴角は、θ_３である。このように、従来の表面プラズモン計測装置では、表面プラズモン共鳴は１つの角度でのみ生じていたが、外部振動を印加する事により、１つではなく経時的に複数の角度でプラズモン共鳴が生じる。よって、表面プラズモン共鳴による暗線が幅を有するようになる。なお、交流電界にし、印加する電界の向きを反転させることでレセプター７９が金属薄膜兼上側電極７８近傍から離れる。そのため、プラズモン共鳴が生じる反射光暗部７７角度は電界を印加していない場合と同様の表面プラズモン共鳴曲線になる。

表面プラズモン共鳴角の周波数特性を得る一具体例として、交流電界の位相と、反射光に含まれる交流電界の信号成分の位相とを比較して、リガンドの周波数特性の変極点を検出する例を以下に説明する。図９（ａ）から（ｄ）は、本発明において、外部振動と、レセプターおよびリガンドの結合との関係を説明する図である。図９（ａ）は、分周器で得られるスイープした交流電界の時間変化を示す図である。図９（ｂ）は、金属薄膜兼上側電極表面上でのリガンドとレセプターの結合量の時間変化を示す図である。図９（ｃ）は、印加した交流電界の位相とプラズモン共鳴が生じた反射光の位相の和を示す図であり、検出器の出力の時間変化を示す。図９（ｄ）は、図９（ｃ）で得られたアナログ信号をＡ／Ｄコンバーターによってデジタル変換した信号を示す図である。

図９（ｃ）に示すように、印加した交流電界の位相と、表面プラズモン共鳴が生じた反射光の位相の和を、時間の変化について測定する。その際、得られた曲線の変極点が、周波数特性の変極点である。例えば、結合率がＣ１、Ｃ２およびＣ３と増加するにつれ、この変極点における周波数は、ｆ_１、ｆ_２およびｆ_３と低下している。従って、周波数特性の変極点の時間変化を計測することにより、リガンドとレセプターの結合の進行度合を計測することが可能になる。

本発明者らは、この結果は以下のメカニズムにより生じたものと推察している。交流電界２１を、金属薄膜兼上側電極７上に固定されたレセプター１９に印加すると、交流電界にレセプター１９は追従しようとする。低周波数領域ではレセプター１９は交流電界２１の位相に遅れることなく追従でき、エバネッセント領域の誘電率が変化するため、表面プラズモン共鳴が生じる角度は幅を持つ。さらに交流電界の周波数を上げていくと、次第にレセプター１９は交流電界２１の位相に遅れが生じながら追従し、遂にレセプター１９は全く追従できなくなる。レセプター１９が追従しなくなれば、金属薄膜兼上側電極７のエバネッセント領域の誘電率が一定になり、表面プラズモン共鳴が生じる角度は１つのみになる。つまり図１の装置においては、追従に遅れが生じた時点で、交流電界２１の位相と表面プラズモン共鳴により生じた反射光５の位相にずれが生じ、交流電界２１の位相及び前記プラズモン共鳴が生じた反射光５の位相の合成波の振幅は減少する。前記周波数特性の変極点とは、すなわち、前記追従に遅れが生じた時点である。リガンドとレセプターの結合量が増加すれば、交流電界にさらされる質量が増え、追従しなくなる周波数（変極点における周波数）は低下するのである（図９（ａ）および（ｂ）参照）。

また、出力された合成波の振幅のアナログ信号を、Ａ／Ｄコンバーター１８によってデジタル信号に変換し検出することで、周波数特性の変極点までの時間を、得ることが可能である。この変極点までの時間ｔ_１、ｔ_２およびｔ_３から、従来プラズモン共鳴が生じる角度で検出していたレセプター１９に結合したリガンドの量を、周波数特性を用いて検出できるようになる（図９（ｄ）参照）。

以上のように、本発明の分析方法及び装置は、交流電場を印加する前に直流電場を印加するので、試薬に含まれている不純物等の測定対象外物質の影響を受けず、かつ濃縮が起こり、検出可能な試料濃度下限が向上され、感度及び精度の高い分析が可能となる。従って、本発明の分析方法及び装置は、サンプル中のリガンドを分析するのに有用であり、例えば、生物学、医学、薬学、農学等の分野に有用である。

本発明の装置の一例を示した模式図 本発明の装置における交流電界を印加することによる、物理学的物性の評価方法を説明する図、（ａ）測定したリガンドのインピーダンスの周波数特性を示す図、（ｂ）リガンドを等価回路の組み合わせとして置き換えた模式図 本発明の装置における直流電界を印加することにより得られる電流値変化の一例を示した模式図、（ａ）下側電極にリガンドを泳動させる場合の電流値変化を示した模式図、（ｂ）下側電極から金属薄膜兼電極にリガンドを泳動させた場合の電流値変化を示した模式図 本発明の装置における金属薄膜上にレセプターを設置せずに測定した表面プラズモン共鳴曲線と、レセプターとして水を設置して測定した表面プラズモン共鳴曲線の一例を示す図、（ａ）レセプター無しの場合の表面プラズモン共鳴曲線を示す図、（ｂ）レセプターとして水を用いた場合の表面プラズモン共鳴曲線を示す図 本発明の装置における直流電場を印加した時に受けるリガンドの力の一例を示す模式図 本発明の装置における直流電場及び交流電場を印加した溶液中の状態の一例を示す模式図、（ａ）電場がゼロの状態での溶液中の物質の泳動の一例を示す模式図、（ｂ）直流電場を下側電極方向に印加した状態での溶液中の物質の泳動の一例を示す模式図、（ｃ）金属薄膜兼上側電極方向に直流電場を印加した状態での溶液中の物質の泳動の一例を示す模式図、（ｄ）交流電場を下側電極方向に印加した状態での溶液中の物質の泳動の一例を示す模式図、（ｅ）交流電場を金属薄膜兼上側電極方向に印加した状態での溶液中の物質の泳動の一例を示す模式図 本発明の装置におけるサンプルにスペーサー分子を添加し、直流電場を印加した時のスペーサー分子の役割の一例を示す模式図、（ａ）電場を印加する前の混合された一例を示す図、（ｂ）スペーサー分子無しの場合の電場による分離の一例を示す模式図、（ｃ）スペーサー分子有りの場合の電場による分離の一例を示す模式図 本発明の装置中、交流電界の強度に応じた金属薄膜近傍の状態の一例を示す模式図、（ａ）交流電界強度がゼロの状態での表面プラズモン共鳴の一例を示す模式図、（ｂ）交流電界強度が弱い状態での表面プラズモン共鳴の一例を示す模式図（ｃ）交流電界強度が強い状態での表面プラズモン共鳴の一例を示す模式図 本発明における交流電界と、レセプターおよびリガンドとの関係を説明する図、（ａ）印加した交流電界の周波数の時間変化を示す図、（ｂ）リガンドとレセプターの結合量の時間変化を示す図、（ｃ）印加した交流電界の位相とプラズモン共鳴が生じた反射光の位相の和を示す図、（ｄ）図９ｃで得られたアナログ信号をＡ／Ｄコンバーターによってデジタル変換した信号を示す図

符号の説明

１ 光源
２ プリズム
３、６５、７０、７６ 計測光
４ 受光装置
５ 反射光
６、６６、７１、７７ プラズモンの励起により光量の一部が減少した反射光暗部
７、６７、７２、７８ 金属薄膜兼上側電極
８、６９、７４、８０ 下側電極
９ 交流電源
１０ 交流電源の周波数を分ける分周器
１１、２７ 直流電源
１２ スイッチ回路
１３、１６ 特定周波数のみを通すアクティブフィルター
１４ コンデンサー
１５ 増幅器
１７ 外部振動の位相（θ１）と、反射した計測光に含まれる外部振動の信号成分の位相（θ０）を比較する検出器
１８ 検出器１７により得られたアナログ信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバーター
１９、２８、３３、３８、４４、５１、６８、７３、７９ 金属薄膜兼上側電極に固定されたレセプター
２０、２４、３０、３５、４０、４６、５３ リガンド
２１、３２、３７、４３、５０、７５、８１ 交流電界
２２ 電流計
２３ 電極
２５ クーロン力
２６ 摩擦抵抗力
３６、４８、５６、５８ 混合したサンプル領域
４１、４２、４７、４９、５４、５５、５７、５９、６１、６３ 試料成分領域
６０、６２、６４ スペーサー分子領域
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３ リガンド内、リガンド間および電極の抵抗
Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３ リガンド内、リガンド間および電極の容量
Ｉ１、Ｉ２ 電界印加手段の切り替えるための電流値
Ｔ１、Ｔ２ 電界印加手段の切り替えるための時間
θ 入射角
θ_１、θ_２、θ_３ 表面プラズモン共鳴角
ｔ_１、ｔ_２、ｔ_３ 変極点までの時間
ｆ_１、ｆ_２、ｆ_３ 周波数

Claims (12)

1. リガンドを含むサンプルと前記リガンドと特異的に結合しうるレセプターがその片面上に固定化され、その裏面に光学プリズムが配置された、表面プラズモン共鳴を起こしうる金属薄膜と、計測光を照射する照射手段と、前記計測光の反射光を受光する受光手段と、
   前記レセプターと結合したリガンドを分析する分析手段と、前記レセプターが固定された領域に直流電界及び交流電界の電気的振動を印加する印加手段と、前記電気的振動による信号を検知する検知手段を有し、前記サンプルと前記金属薄膜とを接触させて前記サンプル中の前記リガンドを前記レセプターに結合させ、前記照射手段により、前記金属薄膜の前記レセプターが固定された面と逆の面に、計測光を照射し、
   前記受光手段により、前記金属薄膜の面上で反射された前記計測光の反射光を受光し、
   前記分析手段により、前記反射光から、前記金属薄膜近傍の誘電率の変化により生じた表面プラズモン共鳴角の変化を検出し、
   前記照射手段により前記計測光を照射しながら、前記印加手段により、前記金属薄膜の前記レセプターが固定された面に電気的振動を印加し、
   前記分析手段により、さらに、外部振動に対する表面プラズモン共鳴角の周波数特性を得、その周波数特性から前記レセプターと結合した前記サンプル中のリガンドを分析することを特徴とした分析方法。
2. 前記直流電界及び交流電界を用いた電気的振動を印加する手段において、直流電界を印加し、前記検知手段で分離を達成したことを検知した後に交流電界を印加することを特徴とした請求項１記載の分析方法。
3. 前記直流電界として、前記金属薄膜から対向に配置された面に前記リガンドが泳動するように印加し、前記検知手段により前記リガンドが前記対向に配置された面に泳動した事を検知した後、前記対向に配置された面から前記金属薄膜に前記リガンドが泳動するように前記直流電界とは反対の直流電界を印加することを特徴とした請求項２記載の分析方法。
4. レセプターとリガンドの少なくとも一方が電荷を帯びていることを特徴とした請求項１〜３に記載の分析方法。
5. 前記分析手段が、前記反射光から、前記リガンドの物理学的物性を分析することを更に含むことを特徴とした請求項４に記載の分析方法。
6. 前記サンプルの中に電気応答性の異なる物質を加えることを特徴とした請求項５に記載の分析方法。
7. 請求項１〜６のいずれかに記載の方法であって、前記レセプターと結合した前記サンプル中のリガンドの量を分析することを特徴とした分析方法。
8. 前記分析手段が、前記外部振動の位相と、前記反射光に含まれる前記外部振動の信号成分の位相とを比較する比較手段を更に含む請求項１〜７のいずれかに記載の方法であって、
   前記周波数特性を得る工程が、前記比較手段により、前記外部振動の位相と、前記反射光に含まれる前記外部振動の信号成分の位相とを比較して、前記周波数特性の変極点を検出することにより行われることを特徴とした分析方法。
9. 前記周波数特性の変極点の時間変化を計測する計測手段を更に準備し、
   前記計測手段により前記周波数特性の変極点の時間的変化を計測することにより、前記レセプターと前記リガンドとの結合の度合いを検出することを特徴とした請求項８に記載の分析方法。
10. 前記金属薄膜の前記レセプターが固定された面上で反射された前記計測光の反射光を、前記面に複数回照射させる光学手段を更に準備し、前記光学手段により、前記金属薄膜の前記レセプターが固定された面上で反射された前記計測光の反射光を、更に前記面に複数回照射させる請求項１〜９のいずれかに記載の方法であって、
    前記受光手段により受光される前記計測光の反射光が、前記光学手段により前記金属薄膜の前記面上で複数回反射された前記計測光の反射光であることを特徴とした分析方法。
11. レセプターとリガンドとの組み合わせが、抗原と抗体、抗体と抗原、ホルモンとホルモン受容体、ホルモン受容体とホルモン、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド受容体、ポリヌクレオチド受容体とポリヌクレオチド、酵素阻害剤と酵素、酵素と酵素阻害剤、酵素基質と酵素、酵素と酵素基質であることを特徴とした請求項１〜１０のいずれかに記載の分析方法。
12. 請求項１〜１１に記載の方法を用いることを特徴としたサンプル中のリガンドを分析する装置。

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